CN114761545A

CN114761545A - 具有持续转基因表达的细胞

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Publication number: CN114761545A
Application number: CN202080071410.9A
Authority: CN
Inventors: C-L.苏; M.J.托米西玛; D.C.小威尔金斯; C.B.麦考利夫
Original assignee: Blue Rock Treatment Co ltd
Current assignee: Blue Rock Treatment Co ltd
Priority date: 2019-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2022-07-15
Also published as: CA3156678A1; EP4041864A1; US20240060047A1; JP2022551478A; BR112022005963A2; IL292130A; AU2020364157A1; WO2021072329A1; KR20220108041A; MX2022004107A

Abstract

本文提供了以持续表达水平表达一种或多种转基因的基因工程化哺乳动物(例如人)细胞。还提供了制备和使用细胞的方法。

Description

具有持续转基因表达的细胞

相关申请的交叉引用

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序列表

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发明背景

细胞疗法为多种疾病和病症的治疗提供了巨大的希望。在细胞疗法中，将自体细胞或同种异体细胞移植到患者中以替换或修复有缺陷或受损的组织或细胞。可以使用多种不同类型的细胞，例如多能干细胞(PSC)、专能干细胞(例如，造血干细胞和间充质干细胞)、或分化细胞(例如，多巴胺能神经元、淋巴细胞、心肌细胞和胰岛细胞)。细胞疗法的潜在应用包括癌症、自身免疫性疾病的治疗以及在例如关节、心脏和中枢和/或外周神经系统中的受损组织的再生。

细胞疗法中的治疗性细胞可以用稳定地整合到其基因组中的转基因进行遗传修饰。转基因在表达时可以向所修饰的细胞引入新特征如通常不存在的蛋白质。然而，细胞或生物体内的稳定的长期转基因表达仍然是该领域的挑战。转基因可能受到靶细胞的预先存在的或发育调节的基因表达模式的影响。此类模式可以通过例如基因组的DNA甲基化和组蛋白修饰来覆盖来自转基因调节元件的信号，从而导致染色质重塑和转基因沉默。

将转基因整合到某些普遍表达的基因例如管家基因的基因座中也存在类似的问题。许多基因在所有人体组织中普遍地表达。由于这种表达的一致性，如果期望持续的转基因表达，来自这些基因的启动子似乎是基因工程化改造的首要候选者(Kao等人，Stem CellRep.(2016)9(3):518-26)。然而，已经发现其中一些基因在所有已知细胞表型中并不像以前认为的那样一致地表达(de Jonge等人，PLoS One(2007)2(9):e898)。因此，使用这些管家基因的启动子进行转基因表达可能最终导致低水平的或可忽略水平的转基因表达。

因此，仍然需要鉴定在PSC和PSC衍生细胞中允许持续的转基因表达的转基因整合位点。

发明概述

本公开提供了经遗传修饰的哺乳动物细胞，其包含基因组中的持续转基因表达基因座(STEL)处的转基因，其中该转基因以可检测的水平表达。在一些实施方案中，转基因的表达水平(i)在五次或更多次、十次或更多次、或15次或更多次细胞传代中，或(ii)随着细胞状态改变，未改变超过40％、超过30％、超过20％、或超过10％，其中细胞状态任选地是多能性和/或分化的状态。

STEL位点可以是例如下表1中列出的基因座之一。在一些实施方案中，STEL是如表中列出的具有超过3.30、超过3.50、超过3.75、超过4.00、超过4.10、超过4.20、超过4.30、超过4.50、超过4.60、超过4.70的平均归一化表达的基因座。

在一些实施方案中，STEL是编码参与以下一项或多项的蛋白质的基因座：核糖核蛋白复合物形成、粘着斑、细胞-基底粘附连接、细胞-基底连接、细胞锚定、细胞外外泌体、细胞外囊泡、细胞内细胞器、锚定连接、RNA结合、核酸结合(例如，rRNA或mRNA结合)和蛋白质结合。

在一些实施方案中，STEL是编码核糖体蛋白的基因，例如RPL基因(例如，RPL13A、RPLP0、RPL10、RPL13、RPS18、RPL3、RPLP1、RPL15、RPL41、RPL11、RPL32、RPL18A、RPL19、RPL28、RPL29、RPL9、RPL8、RPL6、RPL18、RPL7、RPL7A、RPL21、RPL37A、RPL12、RPL5、RPL34、RPL35A、RPL30、RPL24、RPL39、RPL37、RPL14、RPL27A、RPLP2、RPL23A、RPL26、RPL36、RPL35、RPL23、RPL4和RPL22)或RPS基因(例如，RPS2、RPS19、RPS14、RPS3A、RPS12、RPS3、RPS6、RPS23、RPS27A、RPS8、RPS4X、RPS7、RPS24、RPS27、RPS15A、RPS9、RPS28、RPS13、RPS、RPS5、RPS16、RPS25、RPS15、RPS20和RPS11)；编码线粒体蛋白的基因(例如，MT-CO1、MT-CO2、MT-ND4、MT-ND1和MT-ND2)；编码肌动蛋白的基因(例如，ACTG1和ACTB)；编码真核翻译因子的基因(例如，EEF1A1、EEF2和EIF1)；编码组蛋白的基因(例如，H3F3A和H3F3B)；或选自FTL、FTH1、TPT1、TMSB10、GAPDH、PTMA、GNB2L1、NACA、YBX1、NPM1、FAU、UBA52、HSP90AB1、MYL6、SERF2和SRP14的基因。在特定实施方案中，STEL是GAPDH、RPL13A、RPL7或RPLP0基因座。

在一些实施方案中，转基因插入到基因座的3’非翻译区。在一些实施方案中，转基因序列通过自切割肽的编码序列与STEL基因序列框内连接。在一些实施方案中，转基因序列通过内部核糖体进入位点(IRES)与STEL基因序列连接。

在一些实施方案中，转基因编码治疗性蛋白、免疫调节蛋白、报告蛋白、或安全开关信号(例如自杀基因)。

在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物细胞是人细胞并且可以是例如PSC(例如胚胎干细胞或诱导的PSC)或分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞是(i)免疫细胞，任选地选自T细胞、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、抑制性T细胞、髓样细胞、树突状细胞和免疫抑制性巨噬细胞；(ii)神经系统中的细胞，任选地选自多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元、脊髓或动眼神经元、肠神经元、基板衍生细胞、施万细胞和三叉神经或感觉神经元；(iii)心血管系统中的细胞，任选地选自心肌细胞、内皮细胞和结细胞；或(iv)代谢系统中的细胞，任选地选自肝细胞、胆管细胞和胰腺β细胞。

在另一方面，本公开提供了治疗有此需要的人患者的方法，其包括引入本发明的经遗传修饰的人细胞。还提供了用于治疗有此需要的人患者的经遗传修饰的人细胞，以及该经遗传修饰的人细胞在制备用于治疗有此需要的人的药物中的用途。

在又一方面，本公开提供了产生本文所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞的方法，其包括提供培养的哺乳动物细胞并将感兴趣的转基因引入该培养细胞的基因组中的STEL位点。在一些实施方案中，通过CRISPR基因编辑(例如，CRISPR-Cas9基因编辑)将转基因引入细胞的基因组。

在一些实施方案中，本公开的工程化细胞是多能干细胞(PSC)，例如胚胎干细胞(例如，人胚胎干细胞)或诱导的PSC(例如，诱导的人PSC)。在一些实施方案中，工程化细胞是分化细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、髓样细胞或树突状细胞)、免疫抑制性细胞(例如，抑制性T细胞、或免疫抑制性巨噬细胞)、神经系统中的细胞(例如，多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元、脊髓或动眼神经元、肠神经元、基板衍生细胞、施万细胞或三叉神经或感觉神经元)、心血管系统中的细胞(例如，心肌细胞、内皮细胞或结细胞)、代谢系统中的细胞(例如，肝细胞、胆管细胞或胰腺β细胞)、或人眼系统中的细胞，任选地选自视网膜色素上皮细胞、感光锥细胞、感光杆细胞、双极细胞和神经节细胞。

在另一方面，本公开提供了治疗有此需要的人患者的方法，其包括将本公开的经遗传修饰的人细胞引入患者。在一些实施方案中，在引入的工程化细胞含有自杀基因的情况下，该方法可以进一步包括在期望的时间施用自杀基因的激活剂。

在一些实施方案中，人患者需要免疫抑制，并且经遗传修饰的免疫细胞是免疫抑制性细胞、抑制性T细胞或免疫抑制性巨噬细胞。在一些实施方案中，人患者需要移植物移植，或患有炎症(例如，神经炎症)、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，人患者需要针对例如受损或退化的组织(例如脑组织、心脏组织、肌肉组织、关节或参与代谢的组织)的细胞疗法。

在又一方面，本公开提供了产生本文所述的经遗传修饰的重组人细胞的方法，其包括提供培养的人细胞并将外源序列和/或自杀基因引入该培养的人细胞的基因组。在一些实施方案中，引入步骤通过具有或不具有核酸酶介导的基因编辑(例如，ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9或CRISPR-cpf1)的同源重组进行。非同源末端连接也可以用于靶向转基因。

本文还提供了如本文所述的经遗传修饰的人细胞，用于在本发明的治疗方法之一中治疗有此需要的人患者。还提供了如本文所述的经遗传修饰的人细胞在制备用于在本发明的治疗方法之一中治疗有此需要的人的药物中的用途。还提供了含有本文所述的经遗传修饰的人细胞的制品例如试剂盒。

本发明的其他特征、目的和优点在以下详细描述中显而易见。然而，应该理解的是，详细描述虽然指示了本发明的实施方案和方面，但仅作为说明而不是限制的方式给出。本发明范围内的各种改变和修改将从详细描述中对本领域技术人员显而易见。

附图说明

图1是一组显示了在分析中包括的细胞类型的背景下，四种不同的推定STEL基因的普遍表达的UMAP图。细胞类型：多巴胺能神经元、小胶质细胞、多能干细胞和心室心肌细胞。图a：显示了分析中包括的四种细胞类型的身份和聚类的UMAP图。图b：显示了GAPDH、RPL7、RPLP0和RPL13A的表达谱的UMAP图。

图2是说明了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因整合到人GAPDH、RP L13A、RPLP0或RPL7基因座中的图。所靶向的内源性基因的编码序列通过自切割PQR肽的编码序列与EGFP编码序列连接。

图3是显示了对靶向GAPDH或RPL13A基因座的EGFP转基因纯合或杂合的PSC中的EGFP表达水平的细胞计数图。未编辑的PSC(不含转基因的PSC)用作阴性对照。

图4是显示了对靶向RPLP0基因座的EGFP转基因杂合的PSC中的EGFP表达水平的细胞计数图。未编辑的PSC(不含转基因的PSC)用作阴性对照。

图5是显示了以周为单位长达八周，在靶向GAPDH的EGFP编辑的杂合和纯合PSC中检测到的但在未编辑的PSC(不含转基因的PSC)中未检测到的EGFP表达的qPCR直方图。

图6是显示了以周为单位长达八周，在靶向RPL13A的EGFP编辑的杂合和纯合PSC中检测到的但在未编辑的PSC不含转基因的PSC)中未检测到的EGFP表达的qPCR直方图。

图7是显示了对靶向GAPDH或RPL13A基因座的EGFP转基因纯合或杂合的PSC衍生细胞中的EGFP表达水平的细胞计数图。基因编辑后，在分化为多巴胺能神经元16天后对细胞进行分析。

图8是一对显示了对靶向GAPDH或RPL13A基因座的EGFP转基因杂合的PSC或PSC衍生细胞中的EGFP表达水平的细胞计数图。基因编辑后，在分化成心肌细胞12天后对细胞进行分析。未编辑的PSC(不含转基因的PSC)用作阴性对照。

图9是说明了HLA-G6转基因整合到人GAPDH或RPL13A基因座中的图。所靶向的内源性基因的编码序列通过自切割PQR肽的编码序列与HLA-G6编码序列连接。

图10是显示了在靶向GAPDH的HLA-G6编辑的PSC和JEG-3细胞(阳性对照)的细胞培养上清液中通过HLA-G5/G6特异性抗体检测到的HLA-G6的蛋白质印迹照片。未编辑的(“野生型”)PSC用作阴性对照。

图11是显示了在靶向GAPDH的HLA-G6编辑的PSC和JEG-3细胞(阳性对照)的细胞培养上清液中检测到的HLA-G6的荧光共振能量转移(FRET)测定直方图。未编辑的(“野生型”)PSC用作阴性对照。

图12是显示了在靶向RPL13A的HLA-G6编辑的PSC但未在未编辑的(“野生型”)PSC的细胞培养上清液中检测到的HLA-G6的FRET测定直方图。

图13是一组显示了针对靶向GAPDH或RPL13A基因座的HLA-G6转基因和B2M敲除(KO)编辑的PSC中的HLA-G表达的细胞计数图。在1周和8周的分析后，HLA-G表达可以在编辑的PSC中检测到，但在未编辑的PSC(不含转基因的PSC)中检测不到。

图14是说明了抗tau scFv转基因整合到人GAPDH基因座中的图。所靶向的内源性基因的编码序列通过自切割PQR肽的编码序列与scFv编码序列连接。SP：信号肽编码序列。PL：肽接头编码序列。HA：血球凝集素A标签编码序列。

图15是显示了在靶向GAPDH的scFv编辑的PSC的纯和浓缩的细胞培养上清液和细胞裂解物中检测到的抗tau scFv的蛋白质印迹照片。未编辑的(“野生型”)PSC用作阴性对照。

图16是说明了RapaCasp9转基因的两种组分整合到人GAPDH基因座中的图。所靶向的内源性基因的编码序列通过自切割PQR肽的编码序列与每个RapaCasp9编码序列连接。L1：FRB肽接头编码序列。L2：FKBP12肽接头编码序列。truncCasp9：去除CARD结构域的截短胱天蛋白酶9。

图17是一组显示了在将5nM或10nM雷帕霉素添加到针对靶向GAP DH基因座的RapaCasp9转基因进行双等位基因编辑的PSC后，检测切割的胱天蛋白酶3的细胞计数点图。在雷帕霉素处理1、2、4或24小时后分析细胞，并与用作阴性对照的未经处理的编辑的PSC进行比较。

图18是一组显示了在针对靶向人GAPDH基因座的基于PD-L1的转基因和基于CD47的转基因进行双等位基因编辑的PSC中检测PD-L1和CD47共染色的两个细胞计数点图。

图19是显示了在三种不同的靶向GAPDH的CSF1编辑的人PSC细胞系但未在未编辑的PSC的细胞培养上清液中检测到的CSF1的ELISA免疫测定直方图。

图20A是显示了AAVS1基因座处的转基因整合位点的图。转基因编码PD-L1和HSV-TK。两种蛋白质的编码序列通过P2A编码序列在框内分离。转基因受EF1α启动子的控制。

图20B是一组显示了来自图20A中所示的转基因在未分化的编辑的人PSC和由PSC分化的心肌细胞中的PD-L1表达水平的两个细胞计数图。

发明详述

本发明基于以下发现：基因组中的某些在本文中称为“持续转基因表达基因座”(STEL)的基因座，比非STEL基因座对沉默具有更多抗性。例如，随着STEL工程化细胞随时间培养(例如，培养数天，任选地包括一次或多次细胞传代)或细胞命运改变(例如，从多能干细胞分化为谱系特异性细胞)，可以观察到对沉默的抗性。当将转基因插入此类基因座时，转基因的表达可以得到维持，从而使转基因依赖性细胞疗法更加有效。

因此，本公开提供了获得经遗传修饰的哺乳动物(例如人)细胞的方法，其中外源引入的转基因在一段时间内或随着细胞分化以稳定、持续的水平表达。这些方法当应用于经工程化改造用于细胞疗法的PSC时特别有利。通过本方法获得的经遗传修饰的PSC随着培养时间的推移和/或随着细胞分化成一种或多种细胞不会丢失转基因表达。

在一些实施方案中，与一次或多次传代前转基因的表达水平相比，转基因的表达水平在修饰细胞中在一次或多次细胞培养传代中未改变超过50％、超过40％、超过35％、超过30％、超过25％、超过20％、超过15％、超过10％或超过5％。一次或多次传代可以是例如两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次、六次或更多次、七次或更多次、八次或更多次、九次或更多次、十次或更多次或15次或更多次传代。

在一些实施方案中，与细胞状态改变前转基因的表达水平相比，转基因的表达水平在修饰细胞中随细胞的细胞状态改变未改变超过50％、超过40％、超过35％、超过30％、超过25％、超过20％、超过15％、超过10％或超过5％。细胞状态可以是例如细胞的多能性、生物活性、表型或分化状态。

基因(例如，转基因或内源性基因)的表达水平可以通过适用于特定基因的任何方法来确定。例如，可以测量从基因表达的RNA(例如，通过RT-PCR)或蛋白质(例如，通过FRET、ELISA、细胞计数分析和蛋白质印迹)的水平。

迄今为止，转基因最常靶向基因组中的安全港位点例如AAVS1基因座。来自安全港基因座的高水平转基因表达通常需要包含外部启动子序列。但是不同的启动子在特定细胞群中维持转基因表达的能力不同。越来越多的证据表明，AAVS1和其他安全港位点的转基因表达在某些细胞谱系(例如多巴胺能神经元、小胶质细胞、巨噬细胞或T细胞)中无法得到支持，并且可能受到启动子沉默的影响。已经观察到经遗传修饰的人多能干细胞在谱系定向分化后丢失转基因表达(参见,例如Klatt等人,Hum Gene Ther.(2020)31(3-4):199-210；Ordovas等人,Stem Cell Rep.(2015)5:918-31)。本公开提供了规避该问题的转基因表达的方法，并将极大地促进细胞疗法的发展。

I.持续转基因表达基因座

本公开的持续转基因表达基因座(STEL)包括但不限于在多种细胞类型中具有活性的某些管家基因，例如参与基因表达(例如转录因子和组蛋白)、细胞代谢(例如GAPDH和NADH脱氢酶)或细胞结构(例如肌动蛋白)的管家基因，或编码核糖体蛋白(例如，大或小核糖体亚基，例如RPL13A、RPLP0和RPL7)的管家基因。STEL的其他示例如下表1所示。这些蛋白质包括形成核糖核蛋白复合物、粘着斑、细胞-基质粘附连接、细胞-基质连接、细胞锚定、细胞外外泌体、细胞外囊泡、细胞内细胞器或锚定连接的蛋白质。所述蛋白质中的一些参与RNA结合、核酸结合(例如rRNA或mRNA结合)或蛋白质结合。

在一些实施方案中，STEL位点是在多能状态以及在分化期间稳健且一致地表达的内源性基因的基因座(例如，如通过单细胞RNA测序(scRNAseq)分析所检查的)。例如，内源性基因的表达水平在五次或更多次、十次或更多次或15次或更多次传代内或随着细胞状态改变(例如，多能性和/或分化状态)未改变(例如，降低)超过50％、超过40％、超过35％、超过30％、超过25％、超过20％、超过15％、超过10％或超过5％。

在一些实施方案中，STEL是核糖体蛋白基因座例如RPL或RPS基因座。RPL基因的实例为RPL10、RPL13、RPS18、RPL3、RPLP1、RPL13A、RPL15、RPL41、RPL11、RPL32、RPL18A、RPL19、RPL28、RPL29、RPL9、RPL8、RPL6、RPL18、RPL7、RPL7A、RPL21、RPL37A、RPL12、RPL5、RPL34、RPL35A、RPL30、RPL24、RPL39、RPL37、RPL14、RPL27A、RPLP2、RPLP0、RPL23A、RPL26、RPL36、RPL35、RPL23、RPL4和RPL22。RPS基因的实例为RPS2、RPS19、RPS14、RPS3A、RPS12、RPS3、RPS6、RPS23、RPS27A、RPS8、RPS4X、RPS7、RPS24、RPS27、RPS15A、RPS9、RPS28、RPS13、RPSA、RPS5、RPS16、RPS25、RPS15、RPS20和RPS11。

在一些实施方案中，STEL是编码线粒体蛋白质的基因座。此类基因座的实例是MT-CO1、MT-CO2、MT-ND4、MT-ND1和MT-ND2。

在一些实施方案中，STEL是编码肌动蛋白的基因座例如ACTG1和ACTB。

在一些实施方案中，STEL是编码真核翻译延伸因子的基因座，例如EEF1A1和EEF2，或编码真核翻译起始因子的基因座，例如EIF1。

在一些实施方案中，STEL是编码组蛋白的基因座例如H3F3A和H3F3B。

在其他实施方案中，STEL是选自FTL、FTH1、TPT1、TMSB10、GAPDH、PTMA、GNB2L1、NACA、YBX1、NPM1、FAU、UBA52、HSP90AB1、MYL6、SERF2和SRP14的基因座。

为了将转基因构建体引入宿主细胞，技术人员可以使用化学方法(例如，磷酸钙转染或脂质转染)、非化学方法(例如，电穿孔或核转染)、基于粒子的方法(例如，磁转染)或病毒递送(例如，通过使用病毒载体例如慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和杂合病毒载体)。转基因可以通过例如由ZFN、TALEN、CRISPR-cas9、CRISPR/cpf1或其他核酸酶引起的单链或双链DNA断裂以位点特异性方式整合到STEL位点。例如，技术人员可以使用各种类型的同源重组基因编辑系统，其中通过宿主基因组和双链DNA供体分子之间的同源重组产生编辑的等位基因。可以通过在宿主基因组中的靶向同源基因座处诱导双链DNA断裂促进同源重组，并导致外源DNA供体序列与内源性宿主基因组序列的交换。参见，例如Hoshijima等人,Methods Cell Biol.(2016)135:121-47。然而，双链DNA断裂并非同源重组所需。

也可以使用其他众所周知的基因编辑系统，例如利用基因组靶向元件的系统，基因组靶向元件包括DNA结合结构域(例如，锌指DNA结合蛋白或TALE DNA结合结构域)、引导RNA元件(例如，CRISPR引导RNA)和引导DNA元件(例如，NgAgo引导DNA)。可编程基因靶向和核酸酶元件通过引入DNA断裂例如特定基因组基因座的双链断裂实现精确的基因组编辑。在一些实施方案中，基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于以转录激活因子样效应子为基础的核酸酶(TALEN)的系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。在一些实施方案中，外源引入的DNA可用于利用细胞修复机制通过同源重组将转基因引入基因组。

在特定实施方案中，基因组编辑系统是基于CRISPR的系统。基于CRISPR的系统包含一种或多种引导RNA元件和一种或多种RNA引导的核酸酶。

在进一步的实施方案中，基于CRISPR的系统是CASPR-Cas系统。“CRISPR-Cas系统”包含：(a)至少一种引导RNA元件或包含编码引导RNA元件的核苷酸序列的核酸，所述引导RNA元件包含包括与在所述一个或多个靶基因组区域的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶RNA以及包括能够与引导RNA杂交的核苷酸序列的激活剂RNA；和(b)包含Cas蛋白或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸的Cas蛋白元件。引导RNA和激活剂RNA可以分离或融合成单个RNA。

在一些实施方案中，基于CRISPR的系统包括1类CRISPR和/或2类CRISPR系统。1类系统使用多种Cas蛋白和作为靶RNA的CRISPR RNA(crRNA)来构建功能性核酸内切酶。2类CRISPR系统使用单个Cas蛋白和作为靶RNA的crRNA。2类CRISPR系统，包括基于II型Cas9的系统，包含介导切割的单个Cas蛋白而非1类系统使用的多亚基复合物。基于CRISPR的系统还包括使用Cpf1蛋白和作为靶RNA的crRNA的2类V型CRISPR系统。

Cas蛋白是CRISPR相关(Cas)双链DNA核酸酶。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶。术语“Cas蛋白”，例如Cas9蛋白，包括野生型Cas蛋白或其功能衍生物(例如具有核酸酶活性的野生型Cas蛋白的截短形式或变体)。

在一些实施方案中，基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统。“CRISPR-Cpf系统”包含：(a)至少一种引导RNA元件或包含编码引导RNA元件的核苷酸序列的核酸，引导RNA包含具有与靶核酸的基因座处的核苷酸序列互补的核苷酸序列的靶RNA；和(b)Cpf蛋白(例如cpf1)元件或包含编码Cpf蛋白元件的核苷酸序列的核酸。

II.转基因

转基因编码可以是例如治疗性蛋白质或基因产物的赋予修饰细胞所需特征的有效载荷。在一些实施方案中，转基因编码报告蛋白，例如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、DsRED、mCherry、mKate2和tdTomato)和酶(例如，萤光素酶和lacZ)。报告基因一旦植入患者体内，就可以帮助跟踪治疗性细胞。

在一些实施方案中，转基因编码例如患者缺乏的蛋白质的治疗性蛋白质。此类治疗性蛋白质的实例包括但不限于溶酶体贮积症缺乏的蛋白质，例如α-L-艾杜糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性鞘磷脂酶和α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶；以及血友病患者缺乏的蛋白质，例如因子VIII和因子IX。治疗性蛋白质的其他实例包括但不限于抗体或抗体片段(例如，scFv)，例如靶向致病蛋白(例如，tau、α-突触核蛋白和β-淀粉样蛋白)和靶向癌细胞(例如，靶向CD19、CD20和肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR))的抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，转基因编码参与免疫调节的蛋白质或免疫调节蛋白质。此类蛋白质的实例是HLA-G、HLA-E、CD47、PD-L1、CTLA-4、M-CSF、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β1，及其各种同种型。举例来说，转基因可以编码HLA-G(例如，HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6或-G7)或HLA-E的同种型；表达此类非经典MHC I类分子的同种异体细胞在移植到不是细胞来源的人类患者中时可能免疫原性更低，耐受性更好，从而使“通用”细胞疗法成为可能。另请参见以下详细描述。

在一些实施方案中，转基因编码安全开关信号。在细胞疗法中，当不预期经遗传修饰的细胞出现在患者体内时，例如，如果细胞功能不正常或已经达到治疗目标，则可以使用安全开关来阻止经遗传修饰的细胞的增殖。例如，安全开关可以是所谓的自杀基因，其在向患者施用药物化合物时将被激活或失活，从而使细胞进入凋亡。自杀基因可以编码在人体中未发现的酶(例如，细菌酶或病毒酶)，该酶在人细胞中将无害物质转化为有毒代谢物。自杀基因的实例包括但不限于胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、细胞内抗体、端粒酶、毒素、胱天蛋白酶(例如，iCaspase9)和HSV-TK和DNA酶的基因。参见，例如Zarogoulidis等人,J GenetSyndr Gene Ther.(2013)doi:10.4172/2157-7412.1000139。在一些实施方案中，自杀基因可以是来自单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)基因，并且该自杀TK基因在向患者施用更昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦等后变得对细胞有毒。

在一些实施方案中，安全开关可以是雷帕霉素诱导的基于人胱天蛋白酶9(RapaCasp9)的细胞自杀开关，其中去除了其CARD结构域的截短胱天蛋白酶9基因在mTOR的FRB(FKBP12-雷帕霉素结合)结构域或FKBP12(FK506结合蛋白12)后连接。药物雷帕霉素的添加使FRB和FKBP12异二聚化，随后导致截短的胱天蛋白酶9的同源二聚化和凋亡的诱导。

在一些实施方案中，转基因编码非多肽的有效载荷。例如，转基因可以编码能够基于基因表达模式选择性地消除细胞的miRNA。转基因还可以编码其他能够以期望方式控制细胞行为的lncRNA或RNA开关。

III.STEL位点的转基因表达

转基因可以在内源性启动子的转录控制下与STEL位点的内源性基因共同转录成一条mRNA，然后每个基因的RNA序列通过使用mRNA中的内部核糖体进入位点(IRES)分别进行翻译。在另一种方法中，转基因可以框内插入内源性基因，例如在内源性基因的3’端插入，但转基因通过翻译时导致核糖体跳跃的自切割肽的编码序列与内源性基因序列分离。这种排列导致产生两种单独的多肽——由转基因编码的有效载荷和由内源性基因编码的多肽。自切割肽的实例是2A肽，其为具有18-22个氨基酸的典型长度的病毒衍生肽。2A肽包括T2A、P2A、E2A、F2A和PQR(Lo等人,Cell Reports(2015)13:2634-2644)。举例来说，P2A是19个氨基酸的肽；切割后，来自P2A的几个氨基酸残基留在上游基因上而脯氨酸留在第二个基因的开端。PQR肽的使用另请参见以下实施例。在其他实施方案中，STEL基因和转基因被转录成单个mRNA并表达为融合蛋白。

在一些实施方案中，转基因构建体可以引入另外的调节序列到靶基因座，调节序列例如转录终止序列(例如，如SV40 polyA位点的多腺苷酸化(polyA)位点)和增强基因表达或RNA稳定性的序列(例如，WPRE元件)。为了进一步确保转基因的持续表达，还可以通过转基因构建体将合适的转录调控元件引入所靶向的STEL位点。此类元件包括但不限于位于启动子上游的普遍存在的染色质开放元件(UCOE)以及产生功能边界的染色质绝缘体。染色质绝缘体(例如，鸡β珠蛋白基因簇(cHS4)和ArsI)可以是防止沉默的异染色质扩散到转基因中的增强子阻断或屏障绝缘体。

IV.经遗传修饰的细胞

本公开提供了在基因组中的一个或多个STEL位点处含有一种或多种转基因的哺乳动物(例如人、非人灵长类动物、啮齿动物或鼠科动物)细胞。例如人细胞的细胞，可以通过如本文描述的那些基因编辑方法在体外、体内或离体进行工程化改造。多种人细胞类型可以经工程化改造以表达感兴趣的转基因。在一些实施方案中，待工程化改造的细胞是多能干细胞，例如人胚胎干细胞(hESC)或人诱导多能干细胞(iPSC)，其随后可被诱导分化成在本文中称为PSC-衍生物、PSC-衍生物细胞或PSC-衍生细胞的期望的细胞类型。在其他实施方案中，待工程化改造的细胞是分化细胞(例如，部分或终末分化的细胞)。部分分化的细胞可以是例如组织特异性祖细胞或干细胞，例如造血祖细胞或干细胞、骨骼肌祖细胞或干细胞、心脏祖细胞或干细胞、神经元祖细胞或干细胞和间充质干细胞。

如本文所用，术语“多能的”或“多能性”是指细胞自我更新和分化成三种胚层(内胚层、中胚层或外胚层)中任一种的细胞的能力。“多能干细胞”或“PSC”包括例如衍生自囊胚内细胞团或通过体细胞核移植衍生的ESC，以及衍生自非多能细胞的iPSC。

如本文所用，术语“胚胎干”、“ES”细胞和“ESC”是指从早期胚胎获得的多能干细胞。在一些实施方案中，该术语不包括涉及破坏人胚胎的干细胞；换言之，ESC获自先前建立的ESC细胞系。

术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指由非多能细胞人工制备的一类多能干细胞，通过将一种或多种重编程因子引入或接触细胞来实现，非多能细胞例如成体体细胞、部分分化细胞或终末分化细胞，例如成纤维细胞、造血谱系的细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。产生iPSC的方法是本领域已知的，包括例如诱导一种或多种基因(例如POU5F1/OCT4(基因ID：5460)与SOX2(基因ID：6657)、KLF4(基因ID：9314)、c-MYC(基因ID：4609、NANOG(基因ID：79923)和/或LIN28/LIN28A(基因ID：79727))组合，但不限于与上述基因组合。重编程因子可以通过多种方式递送(例如，病毒、非病毒、RNA、DNA或蛋白质递送)；或者，可以通过使用例如CRISPR工具将非多能细胞重编程为PSC来激活内源性基因。

用于诱导PSC分化成各种谱系细胞的方法是本领域众所周知的。例如，用于诱导PSC分化为树突状细胞的方法描述于Slukvin等人,J Imm.(2006)176:2924-32；和Su等人,Clin Cancer Res.(2008)14(19):6207-17；和Tseng等人,Regen Med.(2009)4(4):513-26。用于将PSC诱导为造血祖细胞、髓系细胞和T淋巴细胞的方法描述于，例如Kennedy等人,Cell Rep.(2012)2:1722-35。

除了将感兴趣的转基因整合到STEL位点之外，本文中的基因编辑人细胞(例如，iPSC或ESC)可以进一步工程化改造以提高其治疗潜力，包括通过敲除其一个或更多个的MHC I类基因(例如，B2M基因)使其在同种异体细胞疗法中的免疫原性降低。人细胞可以任选地在STEL位点包括安全开关信号(例如自杀基因)。

分离和维持包括ESC和iPSC的PSC的方法是本领域众所周知的。参见，例如Thomson等人,Science(1998)282(5391):1145-7；Hovatta等人,Human Reprod.(2003)18(7):1404-09；Ludwig等人,Nature Methods(2006)3:637-46；Kennedy等人,Blood(2007)109:2679-87；Chen等人,Nature Methods(2011)8:424-9；以及Wang等人,Stem Cell Res.(2013)11(3):1103-16。

在一些实施方案中，PSC或源自PSC的任何成熟或中间细胞类型可经进一步工程化改造(在STEL位点工程化改造之前、同时或之后)以例如添加如有效载荷递送和安全控制的功能。

在一些实施方案中，PSC可以分化成细胞疗法的感兴趣的细胞类型。在一些实施方案中，经工程化改造的细胞是已经分化的感兴趣的细胞类型。以下描述分化细胞类型的非限制性实例。

A.免疫细胞

经遗传修饰的人细胞可以是免疫细胞，包括PSC衍生的免疫细胞，例如淋巴样和淋巴样前体细胞(例如，T细胞和T细胞前体细胞(无论任何特定的T细胞亚型，例如包括调节性T细胞和T效应细胞)、B细胞和NK细胞)、髓样和髓样前体细胞(例如，粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和小胶质细胞)、以及树突状和树突状前体细胞(例如，髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞)。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或CAR T细胞。经遗传修饰的免疫细胞也可以表达如本文所述的那些免疫调节转基因。

工程化改造的免疫细胞，例如免疫抑制性免疫细胞(例如，调节性T细胞和免疫抑制性巨噬细胞)，可以移植到患有自身免疫性疾病的患者体内，自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、炎症性肠病、Goodpasture综合征、系统性红斑狼疮、系统性血管炎、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血和自身免疫性甲状腺疾病。基于免疫细胞的疗法也可用于治疗移植中的移植排斥，包括治疗例如纤维化的与移植相关的症状。

B.神经细胞

经遗传修饰的人细胞可以是神经细胞，包括PSC衍生的神经细胞，包括但不限于神经元和神经元前体细胞(无论任何特定的神经元亚型，例如包括多巴胺能神经元、皮质神经元、脊髓或动眼神经元、肠神经元、中间神经元和三叉神经元或感觉神经元)、小胶质细胞和小胶质细胞前体细胞、神经胶质细胞和神经胶质前体细胞(无论任何特定的神经胶质亚型，例如包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、可能会产生星形胶质细胞和少突胶质细胞的专能少突胶质细胞前体细胞和双能神经胶质前体细胞)、基板衍生细胞、施万细胞。

工程化改造的神经细胞可被移植入包括但不限于患有神经退行性疾病的患者。神经退行性疾病的实例有帕金森病、阿尔茨海默病、痴呆、癫痫、路易体综合征、亨廷顿病、脊髓性肌肉萎缩、弗里德赖希共济失调、肌萎缩侧索硬化、巴顿病、多系统萎缩等。

对于这些疾病中的多种，PSC可能首先由双重SMAD抑制引导采用原始神经细胞的命运(Chambers等人,Nat Biotechnol.(2009)27(3):275-80)。原始神经细胞采用前部特征，因此其他信号的缺乏将提供前部/前脑皮质细胞。尾端信号可以被阻断以防止否则可能会产生具有更多后部特征的培养物的旁分泌信号(例如，XAV939可以阻断WNT且SU5402可以阻断FGF信号)。背侧皮层神经元可以通过阻断SHH激活制备，而腹侧皮层神经元可以通过SHH激活制备。例如5-羟色胺能神经元或脊髓运动神经元的更多尾端细胞类型可以通过添加FGF和/或WNT信号使培养物尾端化来制备。对于某些细胞类型，可以添加视黄酸(另一种尾化剂)来后化培养物。在含有FGF2和/或EGF的培养基中延长培养之前，神经胶质细胞类型的产生通常可以遵循原始神经细胞的相同模式。PNS细胞类型可以遵循相同的通用原则，但在分化过程的早期具有及时的WNT信号。

经遗传修饰的神经细胞可以通过置于所述受损组织中的插管引入患者体内。细胞制剂可以放入支持性培养基中，然后装载到注射器或移液管状装置中，以准确地输送制剂。然后可以将插管放入患者的神经系统中，通常使用立体定向方法以精确定位输送。细胞随后能够以合适的速率排出到组织中。

C.心血管细胞

经遗传修饰的人细胞可以是心血管系统中的细胞，包括源自PSC的心血管细胞，例如心肌细胞、心脏成纤维细胞、心肌平滑肌细胞、心外膜细胞、心脏内皮细胞、浦肯野(Purkinje)纤维和起搏细胞。

在一些实施方案中，通过本公开的方法制备、富集或分离的心肌细胞来源于例如iPSC的PSC。存在多种将PSC分化为心肌细胞的方法，例如如Kattman等人,Cell Stem Cell(2011)8(2):228-40中所示，以及如WO2016131137、WO2018098597和美国专利9,453,201中所示。本领域中的任何合适的方法都可以与本文的方法一起使用以获得经修饰以在STEL处表达转基因的PSC衍生的心肌细胞。

在一些实施方案中，PSC在一种或多种心脏分化培养基中温育。例如，培养基可以含有不同浓度的骨形态发生蛋白(BMP；例如BMP4)和激活素(例如激活素A)。可以进行分化因子浓度的滴定以确定实现期望心肌细胞分化所需的最佳浓度。

在一些实施方案中，分化的心肌细胞表达心肌肌钙蛋白T(cTnT)和/或肌球蛋白轻链2v(MLC2v)中的一种或多种。在一些实施方案中，未成熟心肌细胞表达肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、α肌动蛋白和/或β-肌球蛋白重链中的一种或多种。

D.代谢系统中的细胞

经遗传修饰的人细胞可以与人代谢系统有关。例如，细胞可以是胃肠系统的细胞(例如，肝细胞、胆管细胞和胰腺β细胞)、造血系统的细胞和中枢神经系统的细胞(例如，垂体激素释放细胞)。举例来说，为了产生垂体激素释放细胞，在加入SHH/FGF8和FGF10之前，将PSC与BMP4和SB431542(阻断激活素信号传导)共同培养；然后在FGF8或BMP(或两者)之前，仅使细胞承受长时间的SHH/FGF8和FGF10，以诱导细胞成为特定的激素释放细胞。参见，例如Zimmer等人,Stem Cell Reports(2016)6:858-72。

E.眼系统中的细胞

经遗传修饰的人细胞可以是眼系统中的细胞。例如，细胞可以是视网膜祖细胞、视网膜色素上皮(RPE)祖细胞、RPE细胞、神经视网膜祖细胞、感光祖细胞、感光细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、Mueller神经胶质细胞、视锥细胞或杆细胞。将iPSC分化为RPE细胞的方法描述于例如WO 2017/044483中。分离RPE细胞的方法描述于例如WO2017/044488中。将iPSC分化为神经视网膜祖细胞的方法描述于WO2019/204817中。鉴定和分离视网膜祖细胞和RPE细胞的方法描述于例如WO 2011/028524中。

V.药物组合物和用途

本文所述的基因工程化改造细胞可以通过包含细胞和药学上可接受的载体的药物组合物的形式提供。药学上可接受的载体可以是细胞培养基，其任选地不包含任何动物来源的成分。对于储存和运输，细胞可以在<-70℃下(例如，在干冰或液氮中)冷冻保存。在使用之前，可以将细胞解冻，并在支持感兴趣的细胞类型的无菌细胞培养基中稀释。

细胞可以向患者全身施用(例如，通过静脉内注射或输注)或局部施用(例如，通过直接注射到例如心脏、脑和受损组织部位的局部组织)。本领域已知用于将细胞施用到患者的组织或器官中的各种方法，包括但不限于冠状动脉内施用、心肌内施用、经心内膜施用或颅内施用。

向患者施用治疗有效量的工程化改造细胞。如本文所用，术语“治疗有效的”是指当施用于患有或易患疾病、失调和/或病症的人类受试者时，细胞数量或药物组合物的量足以治疗、预防和/或延迟疾病、失调和/或病症的症状的发作或进展。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用。

除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。在冲突的情况下，本说明书包括限定将作为控制。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药物和药物化学、以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是众所周知并且在本领域中普遍使用的那些。酶促反应和纯化技术如本领域中常见的或如本发明所述，根据制造商的说明书进行。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。在整个说明书和实施方案中，词语“具有”和“包含”或诸如“有”、“拥有”、“包括”或“含有”的变体将被理解为意味着包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。本发明提到的所有出版物和其他参考文献通过整体引用并入。尽管本发明引用了许多文献，但该引用并不应该被视为承认这些文献中的任何一个构成本领域普通常识的一部分。

为使本发明得到更好的理解，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在以下实施例中，基因编辑如下所述进行。

引导RNA和验证

在以下实验中，进行了CRISPR-Cas9基因编辑以将转基因插入预期的STEL位点。计算设计三种引导RNA(gRNA)以靶向接近终止密码子的GAPDH的3’UTR。计算设计五种gRNA以靶向接近终止密码子的RPL13A的3’UTR。这些gRNA经设计具有少量的脱靶位点并且对靶序列具有高预测活性。

为测试gRNA切割效率，与Cas9核酸酶复合的gRNA通过核转染分别作为核糖核蛋白(RNP)递送到人PSC中。在核转染后72小时，从每个核转染细胞的池中提取gDNA。使用以下引物对GAPDH或RPL13A基因座预期切割位点周围的区域进行PCR扩增：

GAPDH F:5’-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3’(SEQ ID NO:1)，和

GAPDH R:5’-CCCCAGACCCTAGAATAAGACAGG-3’(SEQ ID NO:2)(扩增子大小＝619bp)以及

RPL13A F:5’-AACAGTTGCATTATGATATGCCCAG-3’(SEQ ID NO:3)，

RPL13A R:5’-TGCTTTCAAGCAACTTCGGGA-3’(SEQ ID NO:4)(扩增子大小＝696bp)。

纯化PCR产物并使用以下引物Sanger测序：

GAPDH:5’-AAAACCTGCCAAATATGATGACA-3’(SEQ ID NO:5)和

RPL13A:5’-AAGTACCAGGCAGTGACAGC-3’(SEQ ID NO:6)。

每种gRNA的总体切割效率通过Inference of CRISPR Edits(ICE)分析，通过比较来自未编辑细胞的Sanger测序色谱图与来自每种gRNA条件的Sanger测序色谱图确定。ICE分析确定具有5’-CUUCCUCUUGUGCUCUUGCU-3’(SEQ ID NO:7)的RNA序列的GAPDH gRNA和具有5’-GGAAGGGCAGGCAACGCAUG-3’(SEQ ID NO:8)的RNA序列的RPL13A gRNA具有各自基因座测试的所有gRNA中的最高相对切割效率。

敲入生成

将每个选定STEL位点的经化学修饰的gRNA重新悬浮在制造商提供的无核酸酶TE缓冲液中，并作为与酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶2NLS(Synthego)和靶向GAPDH或RPL13A的供体质粒复合的RNP核转染到人iPSC中。Lonza 4D Nucleofector^TM X-单元用于转染(P3 Nucleofector溶液和Nucleofector程序CA-137)。然后将单个集落在无菌条件下通过挑选以保留(pick-to-keep)方法转移到用重组的截短玻连蛋白包被的96孔板中，并扩增以用于基因筛选和冷冻(在Essential 8完全培养基+10％DMSO中)。注意在表征和筛选期间限制传代数以提供尽可能低的传代数。

使用靶向构建体外部的每对一套引物和靶向构建体内部的每对一套引物，通过5’和3’连接PCR针对相关敲入筛选克隆。对5’和3’连接PCR产物两者均呈阳性的克隆进行扩增和冷冻保存。来自每个5’和3’阳性克隆的gDNA用作模板以生成完全跨越整合构建体(包括同源臂)的PCR产物。然后使用这些PCR产物在其基因组环境中对整合构建体的长度进行Sanger测序。

细胞培养平台

使用Essential 8培养基(Thermo Fisher Scientific；目录号A1517001)和重组人玻连蛋白(VTN-N)(N端截短的玻连蛋白多肽)维持iPSC。在单细胞传代和克隆过程期间使用Y-27632 ROCK抑制剂。每天饲养iPSC且每周双重饲养一次。将细胞培养物保持在37℃和5％CO₂下。在培养期间，在敲除克隆和亲本野生型细胞之间观察到的形态没有显著变化。

克隆性

在进行用于期望的遗传修饰的电穿孔后，立即以低密度铺板iPSC，以确保单个细胞独立附着和生长。允许每个细胞生长为一个集落。一旦集落达到最佳大小，就挑选出每个单独的集落并将其放入单独的孔中。对每个克隆进行针对基因编辑事件的序列分析，并进行G带核型分析。

克隆HLA-G蛋白表征

使用来自BD Biosciences的泛-HLA-G抗体(克隆4H84)进行流式细胞术以确认HLA-G的细胞表面表达。使用来自Thermo Fisher Scientific的HLA-G5/G6特异性抗体(克隆5A6G7)通过蛋白质印迹评估HLA-G6和HLA-G5到细胞培养基中的分泌。具体而言，将4mL培养基浓缩至100μl，然后通过蛋白质印迹检测HLA-G6和HLA-G5的存在。

实施例1：STEL位点的鉴定

在这项研究中，我们评估了从人PSC及其分化衍生物中收集的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，以对STEL候选者进行位点调查。我们假设可能使用多种细胞类型的scRNA-seq数据发现推定的STEL位点。这种方法将允许直接检查数十万个可用的个体转录组。在目前的研究中，从PSC和三种PSC衍生细胞类型：小胶质细胞、多巴胺能神经元和心室心肌细胞中收集单细胞RNA序列数据。数据收集自具有28,387个独特基因的转录组深度的267,058个细胞。STEL位点的首要特征是表达的普遍性。通过首先对转录本计数数据进行二值化然后跨细胞求和，根据表达的普遍性对基因进行排序。然后将每个基因的总和除以细胞总数，得到反映该基因在总数据中的流行率的分数。

共98个基因具有超过99％的分数表示，且随后经选择用于进一步分析。然后根据未二值化的表达数据的标准偏差对选择的基因进行分选。除去标准偏差大于1的基因。然后通过平均表达对剩余的94个基因进行分选，且其主要为核糖体基因，但也包括一些已知的管家基因如GAPDH和ACTB(表1)。

表1由单细胞RNA测序鉴定的STEL位点

这些基因中的几个(GAPDH、RPLP0、RPL7和RPL13A)在图1中所示的UMAP图中可视化。将这四个基因座选为STEL用于下面描述的实验。在从上面列出的那些中最终选择STEL位点时，我们考虑的其他标准包括与癌基因的基因组距离(尽可能远)、已发表的概念验证研究以及基因座中假基因的数量(越少越好，以最小化脱靶引物结合)。虽然上述RNA序列方法可用于发现STEL位点，但也可用于取消潜在位点的资格。

此外，对基因表达的scRNAseq分析表明，并非所有通常用作基因表达分析对照的内源性基因都是STEL位点。例如，编码肽基脯氨酰异构酶A(PPIA；或亲环蛋白A)基因、微管蛋白β多肽(TUBB)和β-2-微球蛋白(B2M)的基因通常被认为是可靠的管家基因，其表达水平用作哺乳动物细胞RT-PCR测定的归一化参考。但基于我们的数据，这些基因不是STEL位点，因为其表达水平在不同细胞类型间的变化比上表1中显示的STEL基因要大得多。对通常用作RNA分析的归一化对照的其他管家基因，例如编码ALAS1、GUSB、HMBS、HPRT、SDHA、TBP和TFRC的基因进行了类似的观察。相比之下，核糖体蛋白基因如RPL13A和RPLP0基因在细胞类型间具有强大的表达，使其成为适合转基因整合的STEL位点。

为降低异常整合的风险，优选STEL的侧翼没有癌基因或肿瘤抑制基因。例如，TUBB基因位于MDC1基因附近，MDC1基因是DNA修复的介导物和已知的肿瘤抑制基因。TUBB基因由于该附加原因未被选择为STEL位点。如果有的话，STEL位点可以具有剪接变体，并且与相邻基因有适当的距离以进行基因编辑。还可以优选不具有大量假基因的STEL位点，假基因可能由于与靶向基因同源的序列而降低转基因靶向效率。

实施例2：EGFP在PSC中STEL位点的表达

基于上述研究，我们选择了四个STEL位点(GAPDH、RPL13A、RPLP0和RPL7)来测试有效载荷候选表达。有效载荷候选的表达盒由内源性STEL启动子控制。因此，有效载荷候选的表达与内源性STEL基因的表达相关联。如果STEL启动子在细胞中保持活性，则相关联的有效载荷转基因的表达将预期为持续的和组成性的。我们使用CRISPR-cas9基因编辑在GAPDH、RPL13A、RPLP0或RPL7基因座处插入表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的构建体(图2)。EGFP编码序列如下所示。

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO:9)

插入的EGFP转基因通过编码PQR序列的DNA序列与内源性STEL基因框内连接(Lo等人，同上)(图2)。PQR序列是修饰的2A自切割肽，其在翻译过程中会导致核糖体跳跃，从而一旦PQR序列经切割，就会导致EGFP和内源性STEL基因的双顺反子表达。PQR核苷酸和氨基酸序列如下所示。

GGAAGCGGAGCGACGAATTTTAGTCTACTGAAACAAGCGGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:10)

GSGATNFSLL KQAGDVEENP GP(SEQ ID NO:11)

每个PQR/EGFP插入构建体的侧翼也有800bp的左同源臂和800bp的右同源臂，同源臂携带与内源性STEL基因座同源的序列。同源臂能够在最后一个氨基酸密码子之后立即在STEL基因的3’UTR处整合靶向构建体。

用于靶向GAPDH基因座的左右同源臂的序列分别如下所示为SEQ ID NO:12和13。

TTGGTATCGTGGAAGGACTCATGGTATGAGAGCTGGGGAATGGGACTGAGGCTCCCACCTTTCTCATCCAAGACTGGCTCCTCCCTGCCGGGGCTGCGTGCAACCCTGGGGTTGGGGGTTCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGGAGGGAGGTAGAGGGGTGATGTGGGGAGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTTTTGCAGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGTGGCTGGGGCCAGAGACTGGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTCTGGCGCCCTCTGGTGGCTGGCTCAGAAAAAGGGCCCTGACAACTCTTTTCATCTTCTAGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAAGAG(SEQ ID NO:12)

CCCTGGACCACCAGCCAAAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCTCACTGCTGGGGAGTCCCTGCCACACTCAGTCCCCCACCACACTGAATCTCCCCTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCCTTGAAGAGGGGAGGGGCCTAGGGAGCCGCACCTTGTCATGTACCATCAATAAAGTACCCTGTGCTCAACCAGTTACTTGTCCTGTCTTATTCTAGGGTCTGGGGCAGAGGGGAGGGAAGCTGGGCTTGTGTCAAGGTGAGACATTCTTGCTGGGGAGGGACCTGGTATGTTCTCCTCAGACTGAGGGTAGGGCCTCCAAACAGCCTTGCTTGCTTCGAGAACCATTTGCTTCCCGCTCAGACGTCTTGAGTGCTACAGGAAGCTGGCACCACTACTTCAGAGAACAAGGCCTTTTCCTCTCCTCGCTCCAGTCCTAGGCTATCTGCTGTTGGCCAAACATGGAAGAAGCTATTCTGTGGGCAGCCCCAGGGAGGCTGACAGGTGGAGGAAGTCAGGGCTCGCACTGGGCTCTGACGCTGACTGGTTAGTGGAGCTCAGCCTGGAGCTGAGCTGCAGCGGGCAATTCCAGCTTGGCCTCCGCAGCTGTGAGGTCTTGAGCACGTGCTCTATTGCTTTCTGTGCCCTCGTGTCTTATCTGAGGACATCGTGGCCAGCCCCTAAGGTCTTCAAGCAGGATTCATCTAGGTAAACCAAGTACCTAAAACCATGCCCAAGGCGGTAAGGACTATATAATGTTTAAAAATCGGTAAAAATGCCCACCTCGCATAGTTTT(SEQ ID NO:13)

用于靶向RPL13A基因座的左右同源臂的序列分别如下所示为SEQ ID NO:14和15。

TCTTAAGCCCCTCTCTTTCTCTAACAGAAAAAGCGGATGGTGGTTCCTGCTGCCCTCAAGGTCGTGCGTCTGAAGCCTACAAGAAAGGTGAGTCCCAGCTTACGCTGCACCATCTACTTGGGAGATTTCAGGCCTGCTGAGGGACCTGGGGACCTGGAGCCTGGCAGATGATGTCCTTATCTCACGATGGTCTGCGGATGTCCCTGTGGGAATGGCGACAATGCCAATGGCTTAGCTGATGCCAGGAGGCTTGGGTGGGTGCTTTTCTAACAGGCCTGCAGAGAACAGTTGCATTATGATATGCCCAGCTGTCAGTCACCTCCCAGCTCTCAACAGCTCCGGCTCTTCAGGGTGTGGGGGCTTAGATATCCTTACAACTTCATTTGTTCACCCCCCCCCCCCCCCCCCGCAGTTTGCCTATCTGGGGCGCCTGGCTCACGAGGTTGGCTGGAAGTACCAGGCAGTGACAGCCACCCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGAAAGCCAAGATCCACTACCGGAAGAAGAAACAGCTCATGGTGAGGCCAGGGGCTGGTGCTGAGGGGGGCATCTCACTCCTGGACAGGCCTGGCAGGTGCCTTGCTCACAGAGTACTCTTAACTGGCAAAGGACCAGCCGGGGTTGGGGTGGGATGCAGTCCATGTAATGAGGGCAATGCAACCCCTCCTGACCACCACCACCTGCACTTATTCTTGGCAGAGGCTACGGAAACAGGCCGAGAAGAACGTGGAGAAGAAAATTGACAAATACACAGAGGTCCTCAAGACCCACGGACTCTTAGTC(SEQ ID NO:14)

GCCCAATAAAGACTGTTAATTCCTCATGCGTTGCCTGCCCTTCCTCCATTGTTGCCCTGGAATGTACGGGACCCAGGGGCAGCAGCAGTCCAGGTGCCACAGGCAGCCCTGGGACATAGGAAGCTGGGAGCAAGGAAAGGGTCTTAGTCACTGCCTCCCGAAGTTGCTTGAAAGCACTCGGAGAATTGTGCAGGTGTCATTTATCTATGACCAATAGGAAGAGCAACCAGTTACTATGAGTGAAAGGGAGCCAGAAGACTGATTGGAGGGCCCTATCTTGTGAGTGGGGCATCTGTTGGACTTTCCACCTGGTCATATACTCTGCAGCTGTTAGAATGTGCAAGCACTTGGGGACAGCATGAGCTTGCTGTTGTACACAGGGTATTTCTAGAAGCAGAAATAGACTGGGAAGATGCACAACCAAGGGGTTACAGGCATCGCCCATGCTCCTCACCTGTATTTTGTAATCAGAAATAAATTGCTTTTAAAGAAATCTGGCGTCTTTGCACTGTGTCTGCTGTGGAGGCAGGCCCCTGGCAAATGGGGGGTGAGGAGCTTGAAGAGGGTAGAATGGGCTGTGCTAATATACAGAATATATGTAACTTGCTATAAATTGAATGATCCTTTATAGACACCGTTTACAAACCAAAGACATAAAATGTGGCCAGCAGTGCCTGGTGCTTCCTAGTTAATGTAAAGCTGTCTCATTCTAATTCAGCTGCAAAGTATGGACCCATGCCCTGCTGCCAGGCTGCTGTAGTCCCGGCGGTCTGTAGAGACTAGCATTTTGCAAATGATAA(SEQ ID NO:15)

用于靶向RPLP0基因座的左右同源臂的序列分别如下所示为SEQ ID NO:16和17。

CTGAGCTGCCAACCTGGCAATTATTGTCTGCTAAGGGTTCTCTTTATTCACCCTTACTTGGACTTCCTTTCCTGTAGGGAATCTCACGTAAAATGAAATCTTCCCTCCCCCAGGGTGTCCGCAATGTTGCCAGTGTCTGTCTGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCATCAGTACCCCATTCTATCATCAACGGGTACAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTACACCTTCCCACTTGCTGAAAAGGTAAAAGGATCCCACCAGGACCACAGTGGGCCTGACTGTGACAAATTAGCAGGGTGATGTGGCCTTCTACCTTACTGCTTTTATAGTTGTATTTTATATAGCAGATAATTTTGTGAGGGGATATTTGAGAGGTTGGGAGGCAGGGAAGGCGTTTCTCACTTGAGAAATGACAAGAGACCCAAAGAGGGGGTTAATGGGCAAGAGCTGGGCCTTAGGAACCCTGCCTCACTAGGCCATACCCAAGCTGTCCTGCTTGGGCTGCTTCTGACAGGAAAGGCTTCACACGGACTTTGATATTGTTGGTCCTTAAACTCTACCAAGGCAGGAGGGTGGTGGGTAATAGAGGAGTGTGGATGACCATTTTGACCACTTCCCCCCTCCTTTCAGGTCAAGGCCTTCTTGGCTGATCCATCTGCCTTTGTGGCTGCTGCCCCTGTGGCTGCTGCCACCACAGCTGCTCCTGCTGCTGCTGCAGCCCCAGCTAAGGTTGAAGCCAAGGAAGAGTCGGAGGAGTCGGACGAGGATATGGGATTTGGTCTCTTTGAC(SEQ ID NO:16)

TCACCAAAAAGCAACGAACTTAGCCAGTTTTATTTGCAAAACAAGGAAATAAATGCTTACTTCTTTAAAAAGTCTCTTGACTCTTAATTTTGTAATTTTTTTTCCTTTTTGACACAGGGTCTGGCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGTGGTGGTGTAATCATAACTCACTGCACCCTTGAACTCCTGGGATCAAGGGATCCTCGTATCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCACACACCATGACACTCAGCTACTAATTTTTAAATTTTTTTTTTGTAGAGATGTTGCACAAGCTGGTCTCAAATTCCTGGCCTCAAGGAATCCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGGCTTGAGCCACCATGTGCCTGGCCCTTAATTTTGAGGTTTATAGTGCCATATGCTAGAAACGAAAGCCATGGTAAAACCAGAGCTTTGTATTTAGGTGTTGATGTTTGGGTATCTAAATGAAGCTACCAATCAAACATCCTATACAGTTTTCTAGACACAGTTGTAACTATTACACTAGAATTACTGTTTCTATGGCTGCTGCATACTTGGAGTAGGTTTAGTGTCAGCTGAGATAGGCACCTGGTGGATGCTGGGGCCAGTCCCCTAGAGTAAAGTTTTTCAAACTGGGTGGTGCTCCAACTCGGTGGTAACCAATTTATATTTTCGAGATAGTCTCAAATATATTTGAGACTGGGGTGCAGTGGCTTGGACTTGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGC(SEQ ID NO:17)

对未分化的未编辑的PSC、未分化的靶向GAPDH的EGFP编辑的PSC或未分化的靶向RPL13A的编辑的PSC进行流式细胞术分析(图3)。对于靶向GAPDH和靶向RPL13A的EGFP编辑的PSC细胞系，我们检查了一个纯合靶向细胞系(携带两个等位基因中的基因编辑)和一个杂合靶向细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)。数据显示了相较于未编辑的PSC细胞系，来自所有四个编辑的PSC细胞系的高EGFP荧光信号。这些结果表明，在GAPDH和RPL13A基因座插入EGFP构建体允许在编辑的PSC中的高水平的转基因表达。

对未分化的未编辑的PSC或靶向RPLP0的EGFP编辑的PSC的三个不同未分化克隆PSC细胞系进行流式细胞术分析(图4)。所有三个靶向RPLP0的EGFP PSC细胞系都是杂合的，携带一个等位基因中的基因编辑。数据显示了相较于未编辑的PSC细胞系，来自所有三个编辑的PSC细胞系的高EGFP荧光信号。这些结果表明，在RPLP0基因座插入EGFP构建体允许在编辑的PSC中的高水平的转基因表达。

在培养八周的细胞系培养物上以周为单位，对从未编辑的PSC和靶向GAPDH的EGFP编辑的PSC收集的RNA进行qPCR分析(图5)。细胞系常规每周平均传代两到三次。15至20个循环之间的平均Cq范围表明非常高的靶RNA和转基因表达量。Cq值与样品中靶RNA的量成反比；Cq值越低，转基因表达的量越高。与不表达EGFP的未编辑的PSC细胞系相比，杂合的靶向GAPDH的EGFP PSC细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)和纯合的靶向GAPDH的EGFPPSC细胞系(携带两个等位基因中的基因编辑)均表现出高转基因表达。纯合的靶向GAPDH的EGFP PSC细胞系显示出比杂合的靶向GAPDH的EGFP PSC细胞系略低的Cq值，表明来自纯合的靶向GAPDH的EGFP PSC细胞系的转基因表达更高。两个编辑的PSC细胞系每周都表达高水平的EGFP表达，长达八周，表明在常规PSC培养长达八周后，高水平的转基因表达得以维持。

在培养八周的细胞系培养物上以周为单位，对从未编辑的PSC和靶向RPL13A的EGFP编辑的PSC收集的RNA进行qPCR分析(图6)。细胞系常规每周平均传代两到三次。15至25个循环之间的平均Cq范围表明非常高的靶RNA和转基因表达量。Cq值与样品中靶RNA的量成反比；Cq值越低，转基因表达的量越高。与不表达EGFP的未编辑PSC细胞系相比，杂合的靶向RPL13A的EGFP PSC细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)和纯合的靶向RPL13A的EGFPPSC细胞系(携带两个等位基因中的基因编辑)均表现出高转基因表达。杂合的靶向RPL13A的EGFP PSC细胞系显示出比纯合的靶向RPL13A的EGFP PSC细胞系略低的Cq值，表明来自杂合的靶向RPL13A的EGFP PSC细胞系的转基因表达更高。两个编辑的PSC细胞系每周都表达高水平的EGFP，长达八周，表明在常规PSC培养长达八周后，高水平的转基因表达得以维持。

还对未编辑的PSC、分化为第16天多巴胺能神经元的靶向GAPDH的EGFP编辑的PSC和靶向RPL13A的EGFP编辑的PSC进行流式细胞术分析(图7)(参见，例如Chambers等人，同上)。对于靶向GAPDH和靶向RPL13A的EGFP编辑的PSC细胞系，我们检查了一个纯合靶向细胞系(携带两个等位基因中的基因编辑)和一个杂合靶向细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)。

数据显示了在分化为多巴胺能神经元16天后，与未编辑的PSC细胞系相比，来自所有四个编辑的PSC细胞系的高EGFP荧光信号。这些结果表明，在GAPDH和RPL13A基因座插入EGFP构建体允许在编辑的PSC中高水平的转基因表达，并且在编辑的PSC的谱系定向分化后维持高水平的转基因表达。

也对未编辑的PSC、分化为第12天心肌细胞或未分化的杂合靶向GAPDH的EGFP细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)、以及分化为第12天心肌细胞或未分化的杂合靶向RPL13A的EGFP细胞系(携带一个等位基因中的基因编辑)进行了流式细胞术(图8)(参见,例如Lian等人,Nat.Protoc.(2013)8(1):162-75)。数据显示了在分化为心肌细胞12天后，与未编辑的PSC细胞系相比，来自靶向GAPDH的EGFP细胞系和靶向RPL13A的EGFP细胞系两者的高EGFP荧光。与未分化的编辑的细胞系相比，分化的编辑的细胞系的荧光水平略低，但仍然很高。结果表明，高水平的转基因表达在编辑的PSC的心肌细胞谱系定向分化后得以维持。

实施例3：HLA-G6在iPSC中GAPDH和RPL13A基因座的表达

在这项研究中，将表达HLA-G6的构建体编辑到iPSC中的GAPDH基因座或RPL13A基因座中。HLA-G6编码序列如下所示。

ATGGTGGTCATGGCGCCCCGAACCCTCTTCCTGCTGCTCTCGGGGGCCCTGACCCTGACCGAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCAACCCCCCCAAGACACACGTGACCCACCACCCTGTCTTTGACTATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCATACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACGTGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTGCCGGAGCCCCTCATGCTGAGATGGAGTAAGGAGGGAGATGGAGGCATCATGTCTGTTAGGGAAAGCAGGAGCCTCTCTGAAGACCTTTAA(SEQ ID NO:18)

插入的HLA-G6转基因通过如上所述的PQR序列与内源性管家基因框内连接(图9)。每个PQR/HLA-G6插入构建体的侧翼也有800bp的左同源臂和800bp的右同源臂，同源臂携带与如上所述的内源性STEL基因座(GAPDH或RPL13A)同源的序列。

使用来自Thermo Fisher Scientific的HLA-G5/G6特异性抗体(克隆5A6G7)通过蛋白质印迹评估HLA-G6到细胞培养基中的分泌。对未编辑的野生型PSC、对照JEG-3绒毛膜癌细胞(来源于人胎盘，其中HLA-G正常表达)和靶向GAPDH的HLA-G6 PSC细胞系的细胞培养上清液进行蛋白质印迹分析(图10)。使用的一抗特异于包括HLA-G5和HLA-G6的可溶性HLA-G同种型。HLA-G6的预测蛋白大小约为30kDa。数据显示，HLA-G6在靶向GAPDH的HLA-G6编辑的PSC细胞和对照JEG-3细胞的细胞培养上清液中检测到的水平相当，但不存在于未编辑的PSC的细胞培养上清液中。这些结果表明在GAPDH基因座插入HLA-G6构建体允许编辑的PSC分泌高水平的HLA-G6。

还对未编辑的野生型PSC、对照JEG-3细胞和靶向GAPDH的HLA-G6PSC的细胞培养上清液进行了荧光共振能量转移(FRET)检测测定(图11)。FRET涉及非常接近时供体和受体两个荧光团之间能量的转移。供体分子与泛-HLA-G抗体(BD Biosciences；克隆4H84)相连，且受体分子与检测包括HLA-G5和HLA-G6的可溶性HLA-G同种型的抗体(Thermo FisherScientific；克隆5A6G7)相连。两种抗体都结合分泌的HLA-G6蛋白，从而使FRET在供体和受体分子之间发生。FRET信号越高，检测到的蛋白质的量越多。数据显示了对照JEG-3细胞的细胞培养上清液中的高FRET信号，以及来自靶向GAPDH的HLA-G6编辑的PSC中的甚至更高的FRET信号，但没有来自未编辑的PSC的信号。这些结果证实，在GAPDH基因座插入HLA-G6构建体允许编辑后的PSC分泌高水平的HLA-G6。

在另一项研究中，对未编辑的PSC和靶向RPL13A的HLA-G6 PSC细胞系的细胞培养上清液进行FRET检测测定(图12)。数据显示了靶向RPL13A的HLA-G6编辑的PSC的细胞培养上清液中的高FRET信号，但来自未编辑的PSC的信号很少。这些结果表明，在RPL13A基因座插入HLA-G6构建体也允许编辑的PSC分泌高水平的HLA-G6。

使用CRISPR/Cas9基因编辑在靶向GAPDH的HLA-G6细胞系和靶向RPL13A的HLA-G6细胞系两者中敲除B2M基因，并对每个HLA-G6编辑的PSC细胞系生成三个不同的B2M敲除(KO)克隆。使用泛-HLA-G抗体(BD Biosciences；克隆4H84)对所有六个编辑克隆进行流式细胞术分析(图13)。在常规PSC培养一周和常规PSC培养八周后重复分析。数据显示了与未编辑的PSC细胞系相比，编辑的PSC细胞系中的HLA-G高表达，并且即使在B2M基因敲除后，HLA-G在所有编辑的克隆细胞系长达八周的常规PSC培养中维持表达。靶向GAPDH的PSC细胞系的HLA-G表达高于靶向RPL13A的PSC细胞系，表明GAPDH基因座的转基因表达更高。

实施例4：抗Tau scFv在PSC中的GAPDH基因座的表达

在这项研究中，将表达针对人tau的单链可变片段(scFv)抗体的构建体(Ising等人,J.Exp.Med.(2017)214(5):1227-1238)插入GAPDH基因座。抗tau scFv插入构建体由编码分泌信号肽(SP)、通过S(GGGGS)₃(SEQ ID NO:19)肽接头(PL)连接的抗tau抗体HJ8.5的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)(WO 2016/126993和WO 2014/008404)和人流感血凝素(HA)肽标签的序列组成(图14)。抗tau scFv的编码序列如下所示，其中分泌信号肽的编码序列用粗体和下划线表示，VL的编码序列用斜体表示，肽接头的编码序列用粗体表示，VH的编码序列用下划线表示，且HA标签的编码序列用粗体和斜体表示。

在转基因编码序列之后掺入TGA终止密码子以允许终止翻译。scFv的表达通过如上所述的PQR序列与GAPDH的表达相关联。每个PQR/抗tau scFv插入构建体的侧翼也有如上所述的800bp左同源臂和800bp右同源臂。

对未编辑的PSC、靶向GAPDH的抗tau scFv PSC细胞系(纯上清液或通过抗HA琼脂糖免疫沉淀浓缩)的细胞培养上清液和靶向GAPDH的抗tau scFv PSC细胞系的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析(图15)。使用的一抗是抗HA单克隆抗体，其识别源自HA肽标签的9-氨基酸序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:21)。抗tau scFv的预测蛋白大小约为30kDa。

数据显示，抗tau scFv在靶向GAPDH的抗tau scFv编辑的PSC细胞系的纯和浓缩细胞培养上清液和靶向GAPDH的抗tau scFv编辑的PSC细胞系的细胞裂解物中检测到，但在未编辑的PSC细胞系的细胞培养上清液中不存在。这些结果表明，在GAPDH基因座插入抗tauscFv构建体允许编辑的PSC分泌高水平的scFv。

实施例5：RapaCasp9细胞自杀开关在PSC中GAPDH基因座的表达

在这项研究中，将共同包含基于雷帕霉素诱导的人胱天蛋白酶9(RapaCasp9)的细胞自杀开关的两种不同的构建体(Stavrou等人,Mol.Ther.(2018)26(5):1266-76)插入到GAPDH基因座的每个等位基因中。一个RapaCasp9构建体由通过SGGGS(SEQ ID NO:22)肽接头(L1)连接到去除其CARD结构域的截短的胱天蛋白酶9基因(truncCasp9)的编码mTOR的FRB(FKBP12-雷帕霉素结合)结构域的序列组成。另一个RapaCasp9构建体由通过SGGGS(SEQID NO:22)肽接头(L2)连接到去除其CARD结构域的截短的胱天蛋白酶9基因(truncCasp9)的编码FKBP12(FK506结合蛋白12)基因的序列组成(图16)。药物雷帕霉素的添加使FRB和FKBP12能够异二聚化，随后导致截短的胱天蛋白酶9的同源二聚化和凋亡的诱导。

RapaCasp9的FRB-L1-truncCasp9组分的编码序列如下所示，其中FRB的编码序列用粗体表示，肽接头(L1)的编码序列用下划线表示，且截短的胱天蛋白酶9的编码序列用斜体表示。

RapaCasp9的FKBP12-L2-truncCasp9组分的编码序列如下所示，其中FKBP12的编码序列用粗体表示，肽接头(L2)的编码序列用下划线表示，且截短的胱天蛋白酶9的编码序列用斜体表示。

在每个转基因编码序列之后掺入TGA终止密码子以允许终止翻译。RapaCasp9的FRB-L1-truncCasp9和FKBP12-L2-truncCasp9组分两者的表达通过如上所述的PQR序列与GAPDH的表达相关联。每个PQR/RapaCasp9构建体的侧翼也有如上所述的800bp左同源臂和800bp右同源臂。

用5nM或10nM雷帕霉素处理靶向GAPDH的RapaCasp9 PSC细胞系1、2、4或24小时，并在每个时间点后收获细胞用于流式细胞术分析(图17)。使用的一抗是抗人/小鼠切割的胱天蛋白酶-3，与Alexa

488二抗缀合。一抗检测在Asp175处切割的人和小鼠胱天蛋白酶3。胱天蛋白酶3是刽子手胱天蛋白酶，在凋亡级联中在起始胱天蛋白酶胱天蛋白酶9的下游起作用。人胱天蛋白酶原3通常是无活性的同型二聚体。在通过细胞应激或激活诱导凋亡后，其经由蛋白水解为切割的胱天蛋白酶3亚基。数据显示，在用5nM或10nM雷帕霉素处理靶向GAPDH的RapaCasp9 PSC细胞系后，处理4小时后很容易检测到切割的胱天蛋白酶3染色，并且几乎所有细胞(>99％)在24小时处理后针对切割胱天蛋白酶3染色。对于未用雷帕霉素处理的编辑的PSC，切割的胱天蛋白酶3的检测可忽略不计。这些结果表明FRB-L1-truncCasp9和FKBP12-L2-truncCasp9 RapaCasp9构建体在GAPDH基因座的双等位基因插入允许编辑的PSC在雷帕霉素诱导后发生凋亡。实施例6：PD-L1和CD47免疫调节分子在PSC中GAPDH基因座的表达

在这项研究中，将各自包含免疫调节分子和HSV-TK.007(单纯疱疹胸苷激酶)细胞自杀开关两者的两种不同的构建体插入到GAPDH基因座的每个等位基因中。基于PD-L1的构建体由通过内部核糖体进入位点(IRES)序列与HSV-TK.007的编码序列连接的PD-L1(程序性死亡配体1)的编码序列组成，HSV-TK.007的编码序列通过P2A序列与puroR(嘌呤霉素抗性基因)的编码序列连接。基于CD47的构建体由通过IRES序列与HSV-TK.007的编码序列连接的CD47的编码序列组成。添加更昔洛韦后，含有这些构建体的细胞将更昔洛韦转化为有毒的核苷酸类似物，从而导致活跃增殖细胞中的DNA复制失败和细胞死亡。

基于PD-L1的构建体的编码序列如下所示，其中PD-L1的编码序列用粗体表示，IRES的编码序列用下划线表示，HSV-TK.007的编码序列用斜体表示，P2A(包括GSG接头)的编码序列用粗体和下划线表示，且puroR的编码序列用常规字体表示。

基于CD47的构建体的编码序列如下所示，其中CD47的编码序列用粗体表示，IRES的编码序列用下划线表示，且HSV-TK.007的编码序列用斜体表示。

在每个转基因编码序列之后掺入终止密码子以允许终止翻译。基于PD-L1的构建体的表达通过如上所述的PQR序列与GAPDH的表达相关联，并且侧翼是如上所述的800bp左同源臂和800bp右同源臂。基于CD47的构建体的表达通过P2A序列与GAPDH的表达相关联，其中GSG接头在以下序列中以粗体表示，且侧翼为如上所述的800bp左同源臂和800bp右同源臂：

对未编辑的PSC或靶向GAPDH的PSC进行流式细胞术分析，靶向GAPDH的PSC包含一个用基于PD-L1的构建体编辑的等位基因和另一个用基于CD47的构建体编辑的等位基因(图18)。数据显示在靶向GAPDH的PSC中检测到双重PD-L1和CD47共染色，但在未编辑的PSC中没有染色，表明基于PD-L1的构建体和基于CD47的构建体的双等位基因插入GAPDH基因座允许编辑的PSC表达PD-L1和CD47。

实施例7：CSF1在PSC中GAPDH基因座的表达

在这项研究中，将包含CSF1(集落刺激因子1)的编码序列的构建体插入到GAPDH基因座的一个或两个等位基因中。CSF1是控制巨噬细胞存活、分化和功能的细胞因子。CSF1的编码序列如下所示。

ATGACCGCGCCGGGCGCCGCCGGGCGCTGCCCTCCCACGACATGGCTGGGCTCCCTGCTGTTGTTGGTCTGTCTCCTGGCGAGCAGGAGTATCACCGAGGAGGTGTCGGAGTACTGTAGCCACATGATTGGGAGTGGACACCTGCAGTCTCTGCAGCGGCTGATTGACAGTCAGATGGAGACCTCGTGCCAAATTACATTTGAGTTTGTAGACCAGGAACAGTTGAAAGATCCAGTGTGCTACCTTAAGAAGGCATTTCTCCTGGTACAAGACATAATGGAGGACACCATGCGCTTCAGAGATAACACCCCCAATGCCATCGCCATTGTGCAGCTGCAGGAACTCTCTTTGAGGCTGAAGAGCTGCTTCACCAAGGATTATGAAGAGCATGACAAGGCCTGCGTCCGAACTTTCTATGAGACACCTCTCCAGTTGCTGGAGAAGGTCAAGAATGTCTTTAATGAAACAAAGAATCTCCTTGACAAGGACTGGAATATTTTCAGCAAGAACTGCAACAACAGCTTTGCTGAATGCTCCAGCCAAGATGTGGTGACCAAGCCTGATTGCAACTGCCTGTACCCCAAAGCCATCCCTAGCAGTGACCCGGCCTCTGTCTCCCCTCATCAGCCCCTCGCCCCCTCCATGGCCCCTGTGGCTGGCTTGACCTGGGAGGACTCTGAGGGAACTGAGGGCAGCTCCCTCTTGCCTGGTGAGCAGCCCCTGCACACAGTGGATCCAGGCAGTGCCAAGCAGCGGCCACCCAGGAGCACCTGCCAGAGCTTTGAGCCGCCAGAGACCCCAGTTGTCAAGGACAGCACCATCGGTGGCTCACCACAGCCTCGCCCCTCTGTCGGGGCCTTCAACCCCGGGATGGAGGATATTCTTGACTCTGCAATGGGCACTAATTGGGTCCCAGAAGAAGCCTCTGGAGAGGCCAGTGAGATTCCCGTACCCCAAGGGACAGAGCTTTCCCCCTCCAGGCCAGGAGGGGGCAGCATGCAGACAGAGCCCGCCAGACCCAGCAACTTCCTCTCAGCATCTTCTCCACTCCCTGCATCAGCAAAGGGCCAACAGCCGGCAGATGTAACTGGTACCGCCTTGCCCAGGGTGGGCCCCGTGAGGCCCACTGGCCAGGACTGGAATCACACCCCCCAGAAGACAGACCATCCATCTGCCCTGCTCAGAGACCCCCCGGAGCCAGGCTCTCCCAGGATCTCATCACTGCGCCCCCAGGGCCTCAGCAACCCCTCCACCCTCTCTGCTCAGCCACAGCTTTCCAGAAGCCACTCCTCGGGCAGCGTGCTGCCCCTTGGGGAGCTGGAGGGCAGGAGGAGCACCAGGGATCGGAGGAGCCCCGCAGAGCCAGAAGGAGGACCAGCAAGTGAAGGGGCAGCCAGGCCCCTGCCCCGTTTTAACTCCGTTCCTTTGACTGACACAGGCCATGAGAGGCAGTCCGAGGGATCCTTCAGCCCGCAGCTCCAGGAGTCTGTCTTCCACCTGCTGGTGCCCAGTGTCATCCTGGTCTTGCTGGCCGTCGGAGGCCTCTTGTTCTACAGGTGGAGGCGGCGGAGCCATCAAGAGCCTCAGAGAGCGGATTCTCCCTTGGAGCAACCAGAGGGCAGCCCCCTGACTCAGGATGACAGACAGGTGGAACTGCCAGTGTAG(SEQ ID NO:28)

在转基因编码序列之后掺入TAG终止密码子以允许终止翻译。CSF1的表达通过如上所述的PQR序列与GAPDH的表达相关联。每个PQR/CSF1插入构建体的侧翼也有如上所述的800bp左同源臂和800bp右同源臂。

对未编辑的PSC和三个不同的靶向GAPDH的CSF1 PSC细胞系的细胞培养上清液进行ELISA免疫测定(图19)。数据显示，分泌的CSF1在所有三个靶向GAPDH的CSF1编辑的PSC细胞系的细胞培养上清液中都检测到，但在未编辑的PSC细胞系的细胞培养上清液中不存在。这些结果表明，在GAPDH基因座插入CSF1构建体允许编辑的PSC分泌容易检测到的水平的CSF1。

实施例8：PD-L1在分化的PSC中AAVS1基因座的转基因沉默

在这项研究中，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑在AAVS1安全港基因座插入表达PD-L1的构建体(图20A)。插入构建体包括外部EF1a启动子以驱动转基因构建体的表达。此外，将可通过小分子处理诱导消除增殖细胞的自杀基因HSV-TK通过允许在P2A切割时PD-L1和HSV-TK两者的双顺反子表达的P2A序列与PD-L1连接。插入构建体的侧翼也有携带与内源性AAVS1基因座同源的序列的左右同源臂，以使构建体能够整合到其预期的靶向位点。对未分化的野生型PSC或未分化的靶向AAVS1的PD-L1/HSV-TK编辑的PSC进行流式细胞术分析(图20B)。细胞用抗PD-L1一抗染色。

通过流式细胞术，数据显示大多数携带PD-L1/HSV-TK编辑的PSC(99.9％)表达PD-L1，而没有野生型PSC表达PD-L1。随后将两个PSC细胞系分化为心肌细胞，并在用抗PD-L1一抗染色后通过流式细胞术进行分析。通过流式细胞术，数据显示只有49％的携带PD-L1/HSV-TK编辑的PSC表达PD-L1。这些结果表明在AAVS1基因座处插入PD-L1/HSV-TK构建体导致在PSC向心肌细胞的谱系定向分化后PD-L1表达的转基因沉默。在B2M基因座中观察到类似的转基因沉默。

总之，上述数据表明，GAPDH、RPL13A和RPLP0基因座允许整合到其中的多种转基因持续、高水平表达。我们的数据还表明，一旦细胞从PSC分化为心肌细胞，整合到常用的AAVS1和B2M基因座的转基因(例如，编码PD-L1的转基因)在编辑的细胞中失去其表达。

序列表

<110> 蓝岩治疗有限公司

<120> 具有持续转基因表达的细胞

<130> 025450.WO009

<140>

<141>

<150> 62/913,062

<151> 2019-10-09

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 1

tggacctgac ctgccgtcta 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 2

ccccagaccc tagaataaga cagg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 3

aacagttgca ttatgatatg cccag 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 4

tgctttcaag caacttcggg a 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 5

aaaacctgcc aaatatgatg aca 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

引物"

<400> 6

aagtaccagg cagtgacagc 20

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

寡核苷酸"

<400> 7

cuuccucuug ugcucuugcu 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

寡核苷酸"

<400> 8

ggaagggcag gcaacgcaug 20

<210> 9

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 9

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

寡核苷酸"

<400> 10

ggaagcggag cgacgaattt tagtctactg aaacaagcgg gagacgtgga ggaaaaccct 60

ggacct 66

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

肽"

<400> 11

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 12

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 12

ttggtatcgt ggaaggactc atggtatgag agctggggaa tgggactgag gctcccacct 60

ttctcatcca agactggctc ctccctgccg gggctgcgtg caaccctggg gttgggggtt 120

ctggggactg gctttcccat aatttccttt caaggtgggg agggaggtag aggggtgatg 180

tggggagtac gctgcagggc ctcactcctt ttgcagacca cagtccatgc catcactgcc 240

acccagaaga ctgtggatgg cccctccggg aaactgtggc gtgatggccg cggggctctc 300

cagaacatca tccctgcctc tactggcgct gccaaggctg tgggcaaggt catccctgag 360

ctgaacggga agctcactgg catggccttc cgtgtcccca ctgccaacgt gtcagtggtg 420

gacctgacct gccgtctaga aaaacctgcc aaatatgatg acatcaagaa ggtggtgaag 480

caggcgtcgg agggccccct caagggcatc ctgggctaca ctgagcacca ggtggtctcc 540

tctgacttca acagcgacac ccactcctcc acctttgacg ctggggctgg cattgccctc 600

aacgaccact ttgtcaagct catttcctgg tatgtggctg gggccagaga ctggctctta 660

aaaagtgcag ggtctggcgc cctctggtgg ctggctcaga aaaagggccc tgacaactct 720

tttcatcttc taggtatgac aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg 780

cccacatggc ctccaaagag 800

<210> 13

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 13

ccctggacca ccagccaaag caagagcaca agaggaagag agagaccctc actgctgggg 60

agtccctgcc acactcagtc ccccaccaca ctgaatctcc cctcctcaca gttgccatgt 120

agaccccttg aagaggggag gggcctaggg agccgcacct tgtcatgtac catcaataaa 180

gtaccctgtg ctcaaccagt tacttgtcct gtcttattct agggtctggg gcagagggga 240

gggaagctgg gcttgtgtca aggtgagaca ttcttgctgg ggagggacct ggtatgttct 300

cctcagactg agggtagggc ctccaaacag ccttgcttgc ttcgagaacc atttgcttcc 360

cgctcagacg tcttgagtgc tacaggaagc tggcaccact acttcagaga acaaggcctt 420

ttcctctcct cgctccagtc ctaggctatc tgctgttggc caaacatgga agaagctatt 480

ctgtgggcag ccccagggag gctgacaggt ggaggaagtc agggctcgca ctgggctctg 540

acgctgactg gttagtggag ctcagcctgg agctgagctg cagcgggcaa ttccagcttg 600

gcctccgcag ctgtgaggtc ttgagcacgt gctctattgc tttctgtgcc ctcgtgtctt 660

atctgaggac atcgtggcca gcccctaagg tcttcaagca ggattcatct aggtaaacca 720

agtacctaaa accatgccca aggcggtaag gactatataa tgtttaaaaa tcggtaaaaa 780

tgcccacctc gcatagtttt 800

<210> 14

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 14

tcttaagccc ctctctttct ctaacagaaa aagcggatgg tggttcctgc tgccctcaag 60

gtcgtgcgtc tgaagcctac aagaaaggtg agtcccagct tacgctgcac catctacttg 120

ggagatttca ggcctgctga gggacctggg gacctggagc ctggcagatg atgtccttat 180

ctcacgatgg tctgcggatg tccctgtggg aatggcgaca atgccaatgg cttagctgat 240

gccaggaggc ttgggtgggt gcttttctaa caggcctgca gagaacagtt gcattatgat 300

atgcccagct gtcagtcacc tcccagctct caacagctcc ggctcttcag ggtgtggggg 360

cttagatatc cttacaactt catttgttca cccccccccc ccccccccgc agtttgccta 420

tctggggcgc ctggctcacg aggttggctg gaagtaccag gcagtgacag ccaccctgga 480

ggagaagagg aaagagaaag ccaagatcca ctaccggaag aagaaacagc tcatggtgag 540

gccaggggct ggtgctgagg ggggcatctc actcctggac aggcctggca ggtgccttgc 600

tcacagagta ctcttaactg gcaaaggacc agccggggtt ggggtgggat gcagtccatg 660

taatgagggc aatgcaaccc ctcctgacca ccaccacctg cacttattct tggcagaggc 720

tacggaaaca ggccgagaag aacgtggaga agaaaattga caaatacaca gaggtcctca 780

agacccacgg actcttagtc 800

<210> 15

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 15

gcccaataaa gactgttaat tcctcatgcg ttgcctgccc ttcctccatt gttgccctgg 60

aatgtacggg acccaggggc agcagcagtc caggtgccac aggcagccct gggacatagg 120

aagctgggag caaggaaagg gtcttagtca ctgcctcccg aagttgcttg aaagcactcg 180

gagaattgtg caggtgtcat ttatctatga ccaataggaa gagcaaccag ttactatgag 240

tgaaagggag ccagaagact gattggaggg ccctatcttg tgagtggggc atctgttgga 300

ctttccacct ggtcatatac tctgcagctg ttagaatgtg caagcacttg gggacagcat 360

gagcttgctg ttgtacacag ggtatttcta gaagcagaaa tagactggga agatgcacaa 420

ccaaggggtt acaggcatcg cccatgctcc tcacctgtat tttgtaatca gaaataaatt 480

gcttttaaag aaatctggcg tctttgcact gtgtctgctg tggaggcagg cccctggcaa 540

atggggggtg aggagcttga agagggtaga atgggctgtg ctaatataca gaatatatgt 600

aacttgctat aaattgaatg atcctttata gacaccgttt acaaaccaaa gacataaaat 660

gtggccagca gtgcctggtg cttcctagtt aatgtaaagc tgtctcattc taattcagct 720

gcaaagtatg gacccatgcc ctgctgccag gctgctgtag tcccggcggt ctgtagagac 780

tagcattttg caaatgataa 800

<210> 16

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 16

ctgagctgcc aacctggcaa ttattgtctg ctaagggttc tctttattca cccttacttg 60

gacttccttt cctgtaggga atctcacgta aaatgaaatc ttccctcccc cagggtgtcc 120

gcaatgttgc cagtgtctgt ctgcagattg gctacccaac tgttgcatca gtaccccatt 180

ctatcatcaa cgggtacaaa cgagtcctgg ccttgtctgt ggagacggat tacaccttcc 240

cacttgctga aaaggtaaaa ggatcccacc aggaccacag tgggcctgac tgtgacaaat 300

tagcagggtg atgtggcctt ctaccttact gcttttatag ttgtatttta tatagcagat 360

aattttgtga ggggatattt gagaggttgg gaggcaggga aggcgtttct cacttgagaa 420

atgacaagag acccaaagag ggggttaatg ggcaagagct gggccttagg aaccctgcct 480

cactaggcca tacccaagct gtcctgcttg ggctgcttct gacaggaaag gcttcacacg 540

gactttgata ttgttggtcc ttaaactcta ccaaggcagg agggtggtgg gtaatagagg 600

agtgtggatg accattttga ccacttcccc cctcctttca ggtcaaggcc ttcttggctg 660

atccatctgc ctttgtggct gctgcccctg tggctgctgc caccacagct gctcctgctg 720

ctgctgcagc cccagctaag gttgaagcca aggaagagtc ggaggagtcg gacgaggata 780

tgggatttgg tctctttgac 800

<210> 17

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 17

tcaccaaaaa gcaacgaact tagccagttt tatttgcaaa acaaggaaat aaatgcttac 60

ttctttaaaa agtctcttga ctcttaattt tgtaattttt tttccttttt gacacagggt 120

ctggctgttg cccaggctgg agtgtggtgg tgtaatcata actcactgca cccttgaact 180

cctgggatca agggatcctc gtatctcagc ctcccaagta gctgggacta caggcacaca 240

ccatgacact cagctactaa tttttaaatt ttttttttgt agagatgttg cacaagctgg 300

tctcaaattc ctggcctcaa ggaatcctgc ctcagcctcc caaagtgcta ggattacagg 360

cttgagccac catgtgcctg gcccttaatt ttgaggttta tagtgccata tgctagaaac 420

gaaagccatg gtaaaaccag agctttgtat ttaggtgttg atgtttgggt atctaaatga 480

agctaccaat caaacatcct atacagtttt ctagacacag ttgtaactat tacactagaa 540

ttactgtttc tatggctgct gcatacttgg agtaggttta gtgtcagctg agataggcac 600

ctggtggatg ctggggccag tcccctagag taaagttttt caaactgggt ggtgctccaa 660

ctcggtggta accaatttat attttcgaga tagtctcaaa tatatttgag actggggtgc 720

agtggcttgg acttggctca ctgcaacctc cgcctcctgg gttcaagtga ttctcctgcc 780

tcagcctccc aagtagctgc 800

<210> 18

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 18

atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60

gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240

ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300

aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccaacccccc caagacacac 360

gtgacccacc accctgtctt tgactatgag gccaccctga ggtgctgggc cctgggcttc 420

taccctgcgg agatcatact gacctggcag cgggatgggg aggaccagac ccaggacgtg 480

gagctcgtgg agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc agctgtggtg 540

gtgccttctg gagaggagca gagatacacg tgccatgtgc agcatgaggg gctgccggag 600

cccctcatgc tgagatggag taaggaggga gatggaggca tcatgtctgt tagggaaagc 660

aggagcctct ctgaagacct ttaa 684

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

肽"

<400> 19

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 20

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 20

atggatatga gagtgcctgc ccaacttctc ggactgctgc tgctttggct tagaggtgca 60

agatgcgaca ttgtgctgac acagtctcct gcttccttag ctgtatctct gggacagagg 120

gccaccatct catgcagggc cagccaaagt gtcagtacat ctagatatag ttatatacac 180

tggtaccaac agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tcaagtatgc atccaaccta 240

gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 300

atccatcctc tggaggagga ggatgctgca acatattact gtcaccacag ttgggagatt 360

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaat ccggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa gtgaaggttg aggagtctgg aggaggcttg 480

gtgcaacctg gaggatccat gaaactctcc tgtgttgtct ctggattcac tttcagtaac 540

tactgggtga actgggtccg ccagtctcca gagaaggggc ttgagtgggt tgctcaaatt 600

agattgaaat ctgataatta tgcaacacat tatgaggagt ctgtgaaagg gaggttcacc 660

atctcaagag atgattccaa aagtagtgtc tatctgcaaa tgaacaacct aagggctgaa 720

gacagtggaa tttattactg cactaactgg gaagactact ggggccaagg caccactctc 780

acagtctcct catacccata cgatgttcca gattacgct 819

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 21

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

肽"

<400> 22

Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 23

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 23

atggcttcta gaatcctctg gcatgagatg tggcatgaag gcctggaaga ggcatctcgt 60

ttgtactttg gggaaaggaa cgtgaaaggc atgtttgagg tgctggagcc cttgcatgct 120

atgatggaac ggggccccca gactctgaag gaaacatcct ttaatcaggc ctatggtcga 180

gatttaatgg aggcccaaga gtggtgcagg aagtacatga aatcagggaa tgtcaaggac 240

ctcctccaag cctgggacct ctattatcat gtgttccgac gaatctcaaa gctcgagtat 300

agcggcggcg gcagcggcgt ggatggcttc ggcgacgtgg gagccctgga gagcctgaga 360

ggcaacgccg atctggccta catcctgagc atggagccct gtggccactg cctgatcatc 420

aacaacgtga acttctgccg ggagagcggc ctgcggaccc ggaccggcag caacatcgac 480

tgcgagaagc tgaggaggcg cttctcctcc ctgcacttta tggtggaggt gaaaggcgat 540

ctgactgcca agaaaatggt gctggccctg ctggagctgg cccagcagga ccacggagcc 600

ctggattgct gtgtggtggt gatcctgtcc cacggctgcc aggccagcca cctgcagttc 660

cccggagccg tgtacggcac cgacggctgt cccgtgtccg tggagaagat cgtgaacatc 720

ttcaacggca cctcctgccc ctccctgggc ggcaagccca agctgttctt tatccaggcc 780

tgtggcggcg agcagaagga ccacggcttt gaggtggcca gcacctcccc cgaggacgag 840

agcccaggca gcaaccccga gcccgacgcc acccccttcc aggagggcct gcgcaccttc 900

gaccagctgg acgccatcag cagcctgccc acccccagcg acatcttcgt gagctacagc 960

acctttcccg gcttcgtgag ctggcgcgat cccaagtccg gctcttggta tgtggagacc 1020

ctggacgaca tctttgagca gtgggctcat agcgaggacc tgcagagcct gctgctgcgc 1080

gtggccaatg ccgtgagcgt gaagggcatc tacaagcaga tgccaggctg cttcaacttc 1140

ctgcggaaga agctgttctt caagaccagc gcctcctga 1179

<210> 24

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 24

atgctggagg gcgtgcaggt ggagaccatc agcccaggcg acggcagaac cttccccaag 60

agaggccaga cctgcgtggt gcactatacc ggcatgctgg aggacggcaa gaagttcgac 120

agcagccgcg accgcaataa gcccttcaag ttcatgctgg gcaagcagga ggtgatcaga 180

ggctgggagg agggcgtggc ccagatgagc gtgggccaga gagccaagct gaccatcagc 240

cccgactacg cctatggcgc caccggccac cccggcatca tcccacccca cgccaccctg 300

gtgtttgatg tggagctgct gaagctggag tccggaggcg gctccggcgt ggatggcttc 360

ggcgacgtgg gagccctgga gagcctgaga ggcaacgccg atctggccta catcctgagc 420

atggagccct gtggccactg cctgatcatc aacaacgtga acttctgccg ggagagcggc 480

ctgcggaccc ggaccggcag caacatcgac tgcgagaagc tgaggaggcg cttctcctcc 540

ctgcacttta tggtggaggt gaaaggcgat ctgactgcca agaaaatggt gctggccctg 600

ctggagctgg cccagcagga ccacggagcc ctggattgct gtgtggtggt gatcctgtcc 660

cacggctgcc aggccagcca cctgcagttc cccggagccg tgtacggcac cgacggctgt 720

cccgtgtccg tggagaagat cgtgaacatc ttcaacggca cctcctgccc ctccctgggc 780

ggcaagccca agctgttctt tatccaggcc tgtggcggcg agcagaagga ccacggcttt 840

gaggtggcca gcacctcccc cgaggacgag agcccaggca gcaaccccga gcccgacgcc 900

acccccttcc aggagggcct gcgcaccttc gaccagctgg acgccatcag cagcctgccc 960

acccccagcg acatcttcgt gagctacagc acctttcccg gcttcgtgag ctggcgcgat 1020

cccaagtccg gctcttggta tgtggagacc ctggacgaca tctttgagca gtgggctcat 1080

agcgaggacc tgcagagcct gctgctgcgc gtggccaatg ccgtgagcgt gaagggcatc 1140

tacaagcaga tgccaggctg cttcaacttc ctgcggaaga agctgttctt caagaccagc 1200

gcctcctga 1209

<210> 25

<211> 3253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 25

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780

ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840

aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taacccctct ccctcccccc cccctaacgt 900

tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac 960

catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag 1020

cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa 1080

ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag 1140

gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga 1200

tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag 1260

agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc 1320

ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag 1380

gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 1440

tgataatatg gccacaacca tggccagcta cccctgtcac cagcacgcca gcgccttcga 1500

ccaggccgcc agaagcaggg gccacagcaa ccggcggacc gccttaagac ccaggcggca 1560

gcaggaagcc accgaagtcc ggctggaaca gaagatgccc accctgctgc gggtgtacat 1620

cgacggcccc cacggcatgg gcaagaccac caccacccag ctgctggtgg ccctgggcag 1680

ccgggacgac atcgtgtacg tgcccgagcc catgacctac tggcaggtgc tgggcgccag 1740

cgagaccatc gccaacatct acaccacaca gcacaggctg gaccagggcg agatctctgc 1800

cggcgacgcc gccgtggtga tgaccagcgc ccagatcaca atgggcatgc cctacgccgt 1860

gaccgacgcc gtgctggccc ctcacgtggg cggcgaggcc ggctctagcc acgcccctcc 1920

ccctgccctg accctgatct tcgaccggca ccccatcgcc cacctgctgt gctaccctgc 1980

cgccagatac ctgatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggccttcg tggccctgat 2040

cccccccacc ctgcccggca ccaacatcgt gctgggagcc ctgcccgagg accggcacat 2100

cgaccggctg gccaagcggc agagacccgg cgagcggctg gacctggcca tgctggccgc 2160

catccggcgg gtgtacggcc tgctggccaa caccgtgaga tacctgcagg gcggagggtc 2220

ttggtgggag gactggggcc agctgtccgg caccgccgtg ccacctcagg gcgccgagcc 2280

ccagagcaat gccggccctc ggccccacat cggcgacacc ctgtttaccc tgttcagagc 2340

ccccgagctg ctggccccca acggcgacct gtacaacgtg ttcgcctggg ccctggacgt 2400

gctggccaag aggctgcggc ccatgcacgt gttcatcctg gactacgacc agagccctgc 2460

cggctgcagg gacgccctgc tgcagctgac cagcggcatg gtgcagaccc acgtgaccac 2520

ccccggcagc atccccacca tctgcgacct ggcccggacc ttcgcccggg agatgggcga 2580

ggccaacgga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggcg acgtggagga 2640

gaaccctgga cctatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 2700

cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 2760

cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 2820

cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 2880

gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 2940

cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 3000

ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 3060

caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 3120

gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 3180

caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 3240

gcccggtgcc tga 3253

<210> 26

<211> 2599

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 26

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggaat aacccctctc cctccccccc 900

ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 960

attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1020

cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1080

tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1140

cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1200

tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1260

tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 1320

gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt 1380

ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga 1440

aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat ggccagctac ccctgtcacc agcacgccag 1500

cgccttcgac caggccgcca gaagcagggg ccacagcaac cggcggaccg ccttaagacc 1560

caggcggcag caggaagcca ccgaagtccg gctggaacag aagatgccca ccctgctgcg 1620

ggtgtacatc gacggccccc acggcatggg caagaccacc accacccagc tgctggtggc 1680

cctgggcagc cgggacgaca tcgtgtacgt gcccgagccc atgacctact ggcaggtgct 1740

gggcgccagc gagaccatcg ccaacatcta caccacacag cacaggctgg accagggcga 1800

gatctctgcc ggcgacgccg ccgtggtgat gaccagcgcc cagatcacaa tgggcatgcc 1860

ctacgccgtg accgacgccg tgctggcccc tcacgtgggc ggcgaggccg gctctagcca 1920

cgcccctccc cctgccctga ccctgatctt cgaccggcac cccatcgccc acctgctgtg 1980

ctaccctgcc gccagatacc tgatgggcag catgaccccc caggccgtgc tggccttcgt 2040

ggccctgatc ccccccaccc tgcccggcac caacatcgtg ctgggagccc tgcccgagga 2100

ccggcacatc gaccggctgg ccaagcggca gagacccggc gagcggctgg acctggccat 2160

gctggccgcc atccggcggg tgtacggcct gctggccaac accgtgagat acctgcaggg 2220

cggagggtct tggtgggagg actggggcca gctgtccggc accgccgtgc cacctcaggg 2280

cgccgagccc cagagcaatg ccggccctcg gccccacatc ggcgacaccc tgtttaccct 2340

gttcagagcc cccgagctgc tggcccccaa cggcgacctg tacaacgtgt tcgcctgggc 2400

cctggacgtg ctggccaaga ggctgcggcc catgcacgtg ttcatcctgg actacgacca 2460

gagccctgcc ggctgcaggg acgccctgct gcagctgacc agcggcatgg tgcagaccca 2520

cgtgaccacc cccggcagca tccccaccat ctgcgacctg gcccggacct tcgcccggga 2580

gatgggcgag gccaactaa 2599

<210> 27

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

寡核苷酸"

<400> 27

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gcgacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 28

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成

多核苷酸"

<400> 28

atgaccgcgc cgggcgccgc cgggcgctgc cctcccacga catggctggg ctccctgctg 60

ttgttggtct gtctcctggc gagcaggagt atcaccgagg aggtgtcgga gtactgtagc 120

cacatgattg ggagtggaca cctgcagtct ctgcagcggc tgattgacag tcagatggag 180

acctcgtgcc aaattacatt tgagtttgta gaccaggaac agttgaaaga tccagtgtgc 240

taccttaaga aggcatttct cctggtacaa gacataatgg aggacaccat gcgcttcaga 300

gataacaccc ccaatgccat cgccattgtg cagctgcagg aactctcttt gaggctgaag 360

agctgcttca ccaaggatta tgaagagcat gacaaggcct gcgtccgaac tttctatgag 420

acacctctcc agttgctgga gaaggtcaag aatgtcttta atgaaacaaa gaatctcctt 480

gacaaggact ggaatatttt cagcaagaac tgcaacaaca gctttgctga atgctccagc 540

caagatgtgg tgaccaagcc tgattgcaac tgcctgtacc ccaaagccat ccctagcagt 600

gacccggcct ctgtctcccc tcatcagccc ctcgccccct ccatggcccc tgtggctggc 660

ttgacctggg aggactctga gggaactgag ggcagctccc tcttgcctgg tgagcagccc 720

ctgcacacag tggatccagg cagtgccaag cagcggccac ccaggagcac ctgccagagc 780

tttgagccgc cagagacccc agttgtcaag gacagcacca tcggtggctc accacagcct 840

cgcccctctg tcggggcctt caaccccggg atggaggata ttcttgactc tgcaatgggc 900

actaattggg tcccagaaga agcctctgga gaggccagtg agattcccgt accccaaggg 960

acagagcttt ccccctccag gccaggaggg ggcagcatgc agacagagcc cgccagaccc 1020

agcaacttcc tctcagcatc ttctccactc cctgcatcag caaagggcca acagccggca 1080

gatgtaactg gtaccgcctt gcccagggtg ggccccgtga ggcccactgg ccaggactgg 1140

aatcacaccc cccagaagac agaccatcca tctgccctgc tcagagaccc cccggagcca 1200

ggctctccca ggatctcatc actgcgcccc cagggcctca gcaacccctc caccctctct 1260

gctcagccac agctttccag aagccactcc tcgggcagcg tgctgcccct tggggagctg 1320

gagggcagga ggagcaccag ggatcggagg agccccgcag agccagaagg aggaccagca 1380

agtgaagggg cagccaggcc cctgccccgt tttaactccg ttcctttgac tgacacaggc 1440

catgagaggc agtccgaggg atccttcagc ccgcagctcc aggagtctgt cttccacctg 1500

ctggtgccca gtgtcatcct ggtcttgctg gccgtcggag gcctcttgtt ctacaggtgg 1560

aggcggcgga gccatcaaga gcctcagaga gcggattctc ccttggagca accagagggc 1620

agccccctga ctcaggatga cagacaggtg gaactgccag tgtag 1665

Claims

1.经遗传修饰的哺乳动物细胞，其包含在基因组中持续转基因表达基因座(STEL)处的转基因，其中所述转基因以可检测的水平表达，任选地其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

2.权利要求1的经遗传修饰的细胞，其中所述转基因的表达水平(i)在五次或更多次、十次或更多次或者15次或更多次传代中，或(ii)随着细胞状态改变，未改变超过40％、超过30％、超过20％或超过10％，其中所述细胞状态任选地是多能性和/或分化的状态。

3.权利要求1或2的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL选自表1中列出的基因座。

4.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是如表1中列出的具有超过3.30、超过3.50、超过3.75、超过4.00、超过4.10、超过4.20、超过4.30、超过4.50、超过4.60、超过4.70的平均归一化表达的基因座。

5.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL位于编码参与以下的一项或多项的蛋白质的基因处：核糖核蛋白复合物形成、粘着斑、细胞-基底粘附连接、细胞-基底连接、细胞锚定、细胞外外泌体、细胞外囊泡、细胞内细胞器、锚定连接、RNA结合、核酸结合(例如，rRNA或mRNA结合)和蛋白质结合。

6.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL为

编码核糖体蛋白的基因，任选地(i)RPL基因，选自RPL13A、RPLP0、RPL10、RPL13、RPS18、RPL3、RPLP1、RPL15、RPL41、RPL11、RPL32、RPL18A、RPL19、RPL28、RPL29、RPL9、RPL8、RPL6、RPL18、RPL7、RPL7A、RPL21、RPL37A、RPL12、RPL5、RPL34、RPL35A、RPL30、RPL24、RPL39、RPL37、RPL14、RPL27A、RPLP2、RPL23A、RPL26、RPL36、RPL35、RPL23、RPL4和RPL22；或(ii)RPS基因，选自RPS2、RPS19、RPS14、RPS3A、RPS12、RPS3、RPS6、RPS23、RPS27A、RPS8、RPS4X、RPS7、RPS24、RPS27、RPS15A、RPS9、RPS28、RPS13、RPS5、RPS16、RPS25、RPS15、RPS20和RPS11；

编码线粒体蛋白的基因，任选地选自MT-CO1、MT-CO2、MT-ND4、MT-ND1和MT-ND2；

编码肌动蛋白的基因，任选地选自ACTG1和ACTB；

编码真核翻译因子的基因，任选地选自EEF1A1、EEF2和EIF1；

编码组蛋白的基因，例如H3F3A和H3F3B；或

基因，选自FTL、FTH1、TPT1、TMSB10、GAPDH、PTMA、GNB2L1、NACA、YBX1、NPM1、FAU、UBA52、HSP90AB1、MYL6、SERF2和SRP14。

7.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是GAPDH基因。

8.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是核糖体蛋白基因。

9.权利要求8的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是核糖体蛋白L(RPL)基因，任选地选自RPL13A、RPL7和RPLP0基因。

10.权利要求1-9中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是多能干细胞(PSC)。

11.权利要求10的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中所述PSC是人胚胎干细胞(ESC)或人诱导PSC(iPSC)。

12.权利要求1-9中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是分化细胞。

13.权利要求12的经遗传修饰的细胞，其中所述分化细胞源自人PSC，任选地选自人ESC和人iPSC。

14.权利要求12或13的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中所述分化细胞为

人免疫细胞，任选地选自T细胞、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、抑制性T细胞、髓样细胞、树突状细胞和免疫抑制性巨噬细胞；

人神经系统中的细胞，任选地选自多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元、脊髓或动眼神经元、肠神经元、基板衍生细胞、施万细胞和三叉神经或感觉神经元；

人心血管系统中的细胞，任选地选自心肌细胞、内皮细胞和结细胞；

人代谢系统中的细胞，任选地选自肝细胞、胆管细胞和胰腺β细胞；或

人眼系统中的细胞，任选地选自视网膜色素上皮细胞、感光锥细胞、感光杆细胞、双极细胞和神经节细胞。

15.前述权利要求中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述转基因插入到所述基因座的3’非翻译区。

16.前述权利要求中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述转基因序列通过自切割肽的编码序列与所述STEL基因序列框内连接，或通过内部核糖体进入位点(IRES)与所述STEL基因序列连接。

17.前述权利要求中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述转基因编码治疗性蛋白、免疫调节蛋白、报告蛋白或安全开关信号。

18.前述权利要求中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞的基因组进一步包含外源自杀基因，任选地位于所述基因组中的STEL基因座中，其中所述外源自杀基因一旦激活就会引起所述细胞的凋亡。

19.权利要求18的经遗传修饰的细胞，其中所述自杀基因是单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因。

20.药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的细胞和药学上可接受的载体。

21.治疗有此需要的人患者的方法，其包括将权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的细胞引入所述患者，其中所述细胞是人细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述人患者

需要移植物移植，或

患有炎症，任选地神经炎症、自身免疫性疾病或癌症。

23.权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其用于权利要求21或22的方法。

24.权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的哺乳动物细胞在制备用于在权利要求21或22的方法中使用的药物中的用途。

25.产生权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的哺乳动物细胞的方法，其包括

提供培养的哺乳动物细胞，以及

将所述转基因引入所述培养细胞的基因组中的STEL位点。

26.权利要求25的方法，其中所述引入步骤通过CRISPR基因编辑进行。