KR20220108041A - 지속된 트랜스진 발현을 갖는 세포 - Google Patents

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츄-리 소
마크 제임스 토미시마
댄 찰스 주니어 윌킨슨
코너 브라이언 맥컬리프
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블루록 테라퓨틱스 엘피
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Abstract

하나 이상의 트랜스진을 지속된 발현 수준으로 발현하는 유전적으로 조작된 포유동물(예를 들어, 인간) 세포가 본원에 제공된다. 또한 세포를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.

Description

지속된 트랜스진 발현을 갖는 세포
관련 출원의 전후 참조
[0001] 본 출원은 2019년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/913,062의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
[0002] 본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함된다. 2020년 10월 9일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 025450_WO009_SL.txt이며 크기는 29,071 바이트이다.
발명의 배경
[0003] 세포 요법은 다양한 질병 및 질환의 치료에 대한 큰 가능성을 제공한다. 세포 요법에서, 자가 또는 동종이계 세포를 환자에게 이식하여 결함이 있거나 손상된 조직 또는 세포를 교체하거나 복구한다. 만능성 줄기 세포(PSC), 다능성 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포) 또는 분화된 세포(예를 들어, 도파민성 뉴런, 림프구, 심근세포 및 췌장섬 세포)와 같은 많은 상이한 유형의 세포가 사용될 수 있다. 세포 요법의 잠재적인 적용은, 예를 들어, 관절, 심장, 및 중추 및/또는 말초 신경계에서 암, 자가면역 질환의 치료 및 손상된 조직의 재생을 포함한다.
[0004] 세포 요법에서 치료 세포는 유전적으로 변형될 수 있으며, 트랜스진은 그 게놈에 안정하게 통합된다. 트랜스진은, 발현될 때, 일반적으로 존재하지 않는 단백질과 같은 새로운 특징을 변형된 세포에 도입할 수 있다. 그러나, 세포 또는 유기체 내에서 안정한 장기 트랜스진 발현은 이 분야에서 여전히 도전 과제로 남아 있다. 트랜스진은 표적 세포의 기존 또는 발달적으로 조절되는 유전자 발현 패턴의 대상이 될 수 있다. 이러한 패턴은, 예를 들어, 게놈의 DNA 메틸화 및 히스톤 변형을 통해 트랜스제닉 조절 요소로부터의 신호를 무시하여, 염색질 리모델링 및 트랜스진 침묵을 초래할 수 있다.
[0005] 살림 유전자와 같은 편재적으로 발현되는 특정 유전자의 유전자좌로의 트랜스진의 통합에 대해 유사한 문제가 존재한다. 많은 유전자가 모든 인간 조직에서 편재적으로 발현된다. 이러한 발현의 균일성으로 인해, 지속된 트랜스진 발현이 요구되는 경우 이러한 유전자로부터의 프로모터는 유전자 공학의 주요 후보로 보일 수 있다(Kao et al., Stem Cell Rep. (2016) 9(3):518-26). 그러나, 이들 유전자 중 일부는 이전에 생각했던 것처럼 모든 공지된 세포 표현형에서 균일하게 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다(de Jonge et al., PLoS One (2007) 2(9):e898). 따라서, 트랜스진 발현을 위해 이들 살림 유전자의 프로모터를 사용하는 것은 궁극적으로 트랜스진 발현의 낮거나 무시할 수 있는 수준으로 이어질 수 있다.
[0006] 따라서, PSC 및 PSC 유래된 세포에서 지속된 트랜스진 발현을 허용하는 트랜스진 통합 부위를 식별할 필요가 남아 있다.
발명의 개요
[0007] 본 개시는 게놈에서 지속된 트랜스진 발현 유전자좌(STEL)에 트랜스진을 포함하는 유전적으로 변형된 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 트랜스진은 검출 가능한 수준으로 발현된다. 일부 구체예에서, 트랜스진의 발현 수준은 (i) 5회 이상, 10회 이상 또는 15회 이상의 계대에 걸쳐, 또는 (ii) 세포 상태가 변함에 따라 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하로 변하며, 여기서 세포 상태는 선택적으로 만능성 및/또는 분화의 상태이다.
[0008] STEL 부위는, 예를 들어, 하기 표 1에 열거된 유전자좌 중 하나일 수 있다. 일부 구체예에서, STEL은 표에 개시된 대로 3.30 초과, 3.50 초과, 3.75 초과, 4.00 초과, 4.10 초과, 4.20 초과, 4.30 초과, 4.50 초과, 4.60 초과, 4.70 초과의 평균 표준화된 발현을 갖는 유전자좌이다.
[0009] 일부 구체예에서, STEL은 리보핵단백질 복합체 형성, 국소 접착, 세포-기질 부착 접합, 세포-기질 접합, 세포 고정, 세포외 엑소솜, 세포외 소포, 세포내 소기관, 고정 접합, RNA 결합, 핵산 결합(예를 들어, rRNA 또는 mRNA 결합) 및 단백질 결합 중 하나 이상에 관련된 단백질을 인코딩하는 유전자좌이다.
[0010] 일부 구체예에서, STEL은 리보솜 단백질을 인코딩하는 유전자, 예를 들어, RPL 유전자(예를 들어, RPL13A, RPLP0, RPL10, RPL13, RPS18, RPL3, RPLP1, RPL15, RPL41, RPL11, RPL32, RPL18A, RPL19, RPL28, RPL29, RPL9, RPL8, RPL6, RPL18, RPL7, RPL7A, RPL21, RPL37A, RPL12, RPL5, RPL34, RPL35A, RPL30, RPL24, RPL39, RPL37, RPL14, RPL27A, RPLP2, RPL23A, RPL26, RPL36, RPL35, RPL23, RPL4 및 RPL22) 또는 RPS 유전자(예를 들어, RPS2, RPS19, RPS14, RPS3A, RPS12, RPS3, RPS6, RPS23, RPS27A, RPS8, RPS4X, RPS7, RPS24, RPS27, RPS15A, RPS9, RPS28, RPS13, RPSA, RPS5, RPS16, RPS25, RPS15, RPS20 및 RPS11); 미토콘드리아 단백질을 인코딩하는 유전자(예를 들어, MT-CO1, MT-CO2, MT-ND4, MT-ND1 및 MT-ND2), 액틴 단백질을 인코딩하는 유전자(예를 들어, ACTG1 및 ACTB); 진핵생물 번역 인자를 인코딩하는 유전자(예를 들어, EEF1A1, EEF2 및 EIF1); 히스톤을 인코딩하는 유전자(예를 들어, H3F3A 및 H3F3B); 또는 FTL, FTH1, TPT1, TMSB10, GAPDH, PTMA, GNB2L1, NACA, YBX1, NPM1, FAU, UBA52, HSP90AB1, MYL6, SERF2 및 SRP14로부터 선택되는 유전자이다. 특정 구체예에서, STEL은 GAPDH, RPL13A, RPL7 또는 RPLP0 유전자좌이다.
[0011] 일부 구체예에서, 트랜스진은 유전자좌의 3' 비번역 영역에 삽입된다. 일부 구체예에서, 트랜스진 서열은 자가-절단 펩티드에 대한 코딩 서열을 통해 STEL 유전자 서열에 인 프레임으로(in frame) 연결된다. 일부 구체예에서, 트랜스진 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 통해 STEL 유전자 서열에 연결된다.
[0012] 일부 구체예에서, 트랜스진은 치료 단백질, 면역조절성 단백질, 리포터 단백질 또는 안전 스위치 신호(예를 들어, 자살 유전자)를 인코딩한다.
[0013] 일부 구체예에서, 유전적으로 변형된 포유동물 세포는 인간 세포이고, 예를 들어, PSC(예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도된 PSC), 또는 분화된 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 (i) T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 억제성 T 세포, 골수성 세포, 수지상 세포 및 면역억제성 대식세포로부터 선택적으로 선택되는 면역 세포; (ii) 도파민성 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기아교 세포, 별아교세포, 피질 뉴런, 척추 또는 안구운동 뉴런, 장 뉴런, 기원판-유래 세포, 슈반 세포, 및 삼차 또는 감각 뉴런으로부터 선택적으로 선택되는 신경계의 세포; (iii) 심근세포, 내피 세포 및 결절 세포로부터 선택적으로 선택되는 심혈관계의 세포; 또는 (iv) 간세포, 담관세포 및 췌장 베타 세포로부터 선택적으로 선택되는 대사 시스템의 세포이다.
[0014] 또 다른 양태에서, 본 개시는 본 발명의 유전적으로 변형된 인간 세포를 도입하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 이를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는데 사용하기 위한 유전적으로 변형된 인간 세포 및 이를 필요로 하는 인간을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 유전적으로 변형된 인간 세포의 용도가 제공된다.
[0015] 또 다른 양태에서, 본 개시는 배양된 포유동물 세포를 제공하고 배양된 세포의 게놈 내의 STEL 부위에 관심 트랜스진을 도입하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 포유동물 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 CRISPR 유전자 편집(예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집)을 통해 세포의 게놈에 도입된다.
일부 구체예에서, 본 개시의 조작된 세포는 배아 줄기 세포(예를 들어, 인간 배아 줄기 세포) 또는 유도된 PSC(예를 들어, 인간 유도된 PSC)와 같은 만능성 줄기 세포(PSC)이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 분화된 세포, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 골수성 세포 또는 수지상 세포), 면역억제성 세포(예를 들어, 억제성 T 세포 또는 면역억제성 대식세포), 신경계의 세포(예를 들어, 도파민성 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기아교 세포, 별아교세포, 피질 뉴런, 척추 또는 안구운동 뉴런, 장 뉴런, 기원판-유래 세포, 슈반 세포, 또는 삼차 또는 감각 뉴런), 심혈관계의 세포(예를 들어, 심근세포, 내피 세포 또는 결절 세포), 대사 시스템의 세포(예를 들어, 간세포, 담관세포 또는 췌장 베타 세포), 또는 망막 색소 상피 세포, 광수용기 원추 세포, 광수용기 간상 세포, 양극성 세포 및 신경절 세포로부터 선택적으로 선택되는 인간 안구 시스템의 세포이다.
[0016] 또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 유전적으로 변형된 인간 세포를 환자에게 도입하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 도입된 조작된 세포가 자살 유전자를 함유하는 일부 구체예에서, 상기 방법은 원하는 시간에 자살 유전자의 활성화제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0017] 일부 구체예에서, 인간 환자는 면역 억제를 필요로 하고, 유전적으로 변형된 면역 세포는 면역억제성 세포, 억제성 T 세포 또는 면역억제성 대식세포이다. 일부 구체예에서, 인간 환자는 이식편 이식을 필요로 하거나, 염증(예를 들어, 신경염증), 자가면역 질환 또는 암을 갖는다. 일부 구체예에서, 인간 환자는, 예를 들어, 손상되거나 퇴행된 조직(예를 들어, 뇌 조직, 심장 조직, 근육 조직, 관절, 또는 대사에 관여하는 조직)에 대한 세포 요법을 필요로 한다.
[0018] 또 다른 양태에서, 본 개시는 배양된 인간 세포를 제공하고 외인성 서열 및/또는 자살 유전자를 상기 배양된 인간 세포의 게놈에 도입하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 재조합 인간 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 도입 단계는 뉴클레아제-매개 유전자 편집(예를 들어, ZFN, TALEN 또는 CRISPR-Cas9 또는 CRISPR-cpf1)과 함께 또는 없이 상동성 재조합을 통해 수행된다. 비상동성 말단 결합이 또한 트랜스진을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
[0019] 본 치료 방법 중 하나에서 이를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 인간 세포가 또한 본원에 제공된다. 본 치료 방법 중 하나에서 이를 필요로 하는 인간을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 인간 세포의 용도가 또한 제공된다. 또한, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 인간 세포를 함유하는 제조 물품, 예를 들어, 키트가 제공된다.
[0020] 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 구체예 및 양태를 나타내지만, 제한이 아니라 단지 예시로서 주어진 것임이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 및 수정은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
[0021] 도 1은 분석에 포함된 세포 유형의 맥락에서 4개의 상이한 추정 STEL 유전자의 발현의 편재성을 보여주는 UMAP 플롯의 패널이다. 세포 유형: 도파민성 뉴런, 미세아교세포, 만능성 줄기 세포 및 심실 심근세포. 패널 a: 분석에 포함된 4개의 세포 유형의 동일성 및 클러스터링을 보여주는 UMAP 플롯. 패널 b: GAPDH, RPL7, RPLP0 및 RPL13A의 발현 프로파일을 보여주는 UMAP 플롯.
[0022] 도 2는 인간 GAPDH, RPL13A, RPLP0 또는 RPL7 유전자좌로의 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 트랜스진의 통합을 예시하는 다이어그램이다. 표적화된 내인성 유전자의 코딩 서열은 자가-절단 PQR 펩티드에 대한 코딩 서열을 통해 EGFP 코딩 서열에 연결되었다.
[0023] 도 3은 GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌에 표적화된 EGFP 트랜스진에 대한 동형접합 또는 이형접합 PSC에서 EGFP 발현 수준을 보여주는 세포측정 플롯이다. 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0024] 도 4는 RPLP0 유전자좌에 표적화된 EGFP 트랜스진에 대한 이형접합 PSC에서 EGFP 발현 수준을 보여주는 세포측정 플롯이다. 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0025] 도 5는 최대 8주 동안 매주 기준으로 GAPDH-표적화 EGFP 편집된 이형접합 및 동형접합 PSC에서 EGFP 발현이 검출되었지만 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)에서는 검출되지 않았음을 보여주는 qPCR 히스토그램이다.
[0026] 도 6은 최대 8주 동안 매주 기준으로 RPL13A-표적화 EGFP 편집된 이형접합 및 동형접합 PSC에서 EGFP 발현이 검출되었지만 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)에서는 검출되지 않았음을 보여주는 qPCR 히스토그램이다.
[0027] 도 7은 GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌에 표적화된 EGFP 트랜스진에 대한 동형접합 또는 이형접합 PSC 유래된 세포에서 EGFP 발현 수준을 보여주는 세포측정 플롯이다. 유전자 편집 후, 도파민성 뉴런으로의 분화 16일 후에 세포를 검정하였다.
[0028] 도 8은 GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌에 표적화된 EGFP 트랜스진에 대한 이형접합 PSC 또는 PSC 유래된 세포에서 EGFP 발현 수준을 보여주는 한 쌍의 세포측정 플롯이다. 유전자 편집 후, 심근세포로의 분화 12일 후에 세포를 검정하였다. 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0029] 도 9는 인간 GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌로의 HLA-G6 트랜스진의 통합을 예시하는 다이어그램이다. 표적화된 내인성 유전자의 코딩 서열은 자가-절단 PQR 펩티드에 대한 코딩 서열을 통해 HLA-G6 코딩 서열에 연결되었다.
[0030] 도 10은 GAPDH-표적화 HLA-G6 편집된 PSC 및 JEG-3 세포(양성 대조군)의 세포 배양 상청액에서 HLA-G6이 HLA-G5/G6-특이적 항체에 의해 검출되었음을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다. 편집되지 않은("야생형") PSC를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0031] 도 11은 GAPDH-표적화 HLA-G6 편집된 PSC 및 JEG-3 세포(양성 대조군)의 세포 배양 상청액에서 HLA-G6이 검출되었음을 보여주는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 검정 히스토그램이다. 편집되지 않은("야생형") PSC를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0032] 도 12는 HLA-G6이 RPL13A-표적화 HLA-G6 편집된 PSC의 세포 배양 상청액에서 검출되었지만 편집되지 않은("야생형") PSC에서는 검출되지 않았음을 보여주는 FRET 검정 히스토그램이다.
[0033] 도 13은 GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌 및 B2M 녹아웃(KO)에 표적화된 HLA-G6 트랜스진에 대해 편집된 PSC에서 HLA-G 발현을 보여주는 세포측정 플롯의 패널이다. HLA-G 발현은 편집된 PSC에서 분석 1주 및 8주 후에 검출될 수 있지만 편집되지 않은 PSC(트랜스진을 포함하지 않는 PSC)에서는 검출될 수 없다.
[0034] 도 14는 인간 GAPDH 유전자좌로의 항-tau scFv 트랜스진의 통합을 예시하는 다이어그램이다. 표적화된 내인성 유전자의 코딩 서열은 자가-절단 PQR 펩티드에 대한 코딩 서열을 통해 scFv 코딩 서열에 연결되었다. SP: 신호 펩티드 코딩 서열. PL: 펩티드 링커 코딩 서열. HA: 적혈구응집소 A 태그 코딩 서열.
[0035] 도 15는 GAPDH-표적화 scFv 편집된 PSC의 순수(neat) 및 농축된 세포 배양 상청액 및 세포 용해물에서 항-tau scFv가 검출되었음을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다. 편집되지 않은("야생형") PSC를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0036] 도 16은 RapaCasp9 트랜스진의 2개 성분의 인간 GAPDH 유전자좌로의 통합을 예시하는 다이어그램이다. 표적화된 내인성 유전자의 코딩 서열은 자가-절단 PQR 펩티드의 코딩 서열을 통해 각각의 RapaCasp9 코딩 서열에 연결된다. L1: FRB 펩티드 링커 코딩 서열. L2: FKBP12 펩티드 링커 코딩 서열. truncCasp9: CARD 도메인이 제거된 트렁케이션된 카스파제 9.
[0037] 도 17은 GAPDH 유전자좌에 표적화된 RapaCasp9 트랜스진에 대해 이중대립형질적으로 편집된 PSC에서 5 nM 또는 10 nM 라파마이신의 첨가 후 절단된 카스파제 3의 검출을 보여주는 세포측정 도트 플롯의 패널이다. 세포를 1, 2, 4 또는 24시간 동안 라파마이신 처리 후 분석하고, 음성 대조군으로 사용된 처리되지 않은 편집된 PSC와 비교하였다.
[0038] 도 18은 인간 GAPDH 유전자좌에 표적화된 PD-L1-기반 트랜스진 및 CD47-기반 트랜스진에 대해 이중대립형질적으로 편집된 PSC에서 PD-L1 및 CD47 공동-염색의 검출을 보여주는 2개의 세포측정 도트 플롯의 패널이다.
[0039] 도 19는 3개의 상이한 GAPDH-표적화 CSF1 편집된 인간 PSC 주의 세포 배양 상청액에서 CSF1이 검출되었지만 편집되지 않은 PSC에서는 검출되지 않았음을 보여주는 ELISA 면역검정 히스토그램이다.
[0040] 도 20A는 AAVS1 유전자좌에서 트랜스진 통합 부위를 보여주는 다이어그램이다. 트랜스진은 PD-L1 및 HSV-TK를 인코딩한다. 2개의 단백질에 대한 코딩 서열은 P2A 코딩 서열에 의해 인 프레임으로 분리된다. 트랜스진은 EF1α 프로모터의 제어하에 있다.
[0041] 도 20B는 분화되지 않은 편집된 인간 PSC 및 PSC로부터 분화된 심근세포에서 도 20A에 도시된 트랜스진으로부터의 PD-L1 발현 수준을 보여주는 2개의 세포측정 플롯의 패널이다.
발명의 상세한 설명
[0042] 본 발명은 본원에서 "지속된 트랜스진 발현 유전자좌"(STEL)로 지칭되는 게놈 내의 특정 유전자좌가 비-STEL 유전자좌보다 침묵에 더 내성이 있다는 발견에 기초한다. 침묵에 대한 내성은, 예를 들어, STEL-조작된 세포가 시간이 지남에 따라 배양될 때(예를 들어, 배양에서 수 일에 걸쳐, 임의로 1회 세포 계대를 포함함) 또는 세포 운명 변화(예를 들어, 만능성 줄기 세포로부터 계통-특이적 세포로의 분화)에 따라 관찰될 수 있다. 트랜스진이 이러한 유전자좌에 삽입될 때, 트랜스진의 발현이 지속될 수 있어, 트랜스진-의존성 세포 요법이 훨씬 더 효과적이 된다.
[0043] 따라서, 본 개시는 외인성으로 도입된 트랜스진이 일정 기간에 걸쳐 또는 세포가 분화함에 따라 안정적이고 지속된 수준으로 발현되는 유전적으로 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 인간)를 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 세포 요법에 사용하기 위해 조작된 PSC에 적용될 때 특히 유리하다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 유전적으로 변형된 PSC는 시간이 지남에 따라 배양에서 및/또는 세포가 하나 이상의 세포로 분화될 때 트랜스진 발현을 잃지 않는다.
[0044] 일부 구체예에서, 변형된 세포에서 트랜스진의 발현 수준은 1회 이상의 계대 이전의 트랜스진의 발현 수준과 비교하여, 1회 이상의 세포 배양 계대에 걸쳐 50% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하만큼 변한다. 1회 이상의 계대는, 예를 들어, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상 또는 15회 이상의 계대일 수 있다.
[0045] 일부 구체예에서, 변형된 세포에서 트랜스진의 발현 수준은 세포 상태 변화 이전의 트랜스진의 발현 수준과 비교하여, 세포 상태가 세포에서 변화함에 따라 50% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하만큼 변한다. 세포 상태는, 예를 들어, 세포의 만능성, 생물학적 활성, 표현형 또는 분화 상태일 수 있다.
[0046] 유전자(예를 들어, 트랜스진 또는 내인성 유전자)의 발현 수준은 특정 유전자에 적합한 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 유전자로부터 발현된 RNA(예를 들어, RT-PCR에 의해) 또는 단백질(예를 들어, FRET, ELISA, 세포측정 분석 및 웨스턴 블롯에 의해)이 측정될 수 있다.
[0047] 현재까지, 트랜스진은 AAVS1 유전자좌와 같은 게놈의 세이프 하버 부위(safe harbor sites)에 가장 일반적으로 표적화된다. 세이프 하버 유전자좌로부터의 높은 수준의 트랜스진 발현은 일반적으로 외부 프로모터 서열의 포함을 필요로 한다. 그러나 상이한 프로모터는 특정 세포 집단에서 트랜스진 발현을 유지하는 능력이 다양하다. AAVS1 및 다른 세이프 하버 부위에서의 트랜스진 발현이 일부 세포 계통(예를 들어, 도파민성 뉴런, 미세아교세포, 대식세포 또는 T 세포)에서 지지되지 않고 프로모터 침묵의 대상이 될 수 있음을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 유전적으로 변형된 인간 만능성 줄기 세포는 계통-지시적 분화시 트랜스진 발현을 상실하는 것으로 관찰되었다(예를 들어, 문헌[Klatt et al., Hum Gene Ther. (2020) 31(3-4):199-210; Ordovas et al., Stem Cell Rep. (2015) 5:918-31)] 참조). 본 개시는 이러한 문제를 우회하고 세포 요법의 개발을 크게 촉진할 트랜스진 발현 방법을 제공한다.
I. 지속된 트랜스진 발현 유전자좌
[0048] 본 개시의 지속된 트랜스진 발현 유전자좌(STEL)는 유전자 발현(예를 들어, 전사 인자 및 히스톤), 세포 대사(예를 들어, GAPDH 및 NADH 데하이드로게나제) 또는 세포 구조(예를 들어, 액틴), 또는 리보솜 단백질을 인코딩하는 것들(예를 들어, RPL13A, RPLP0 및 RPL7과 같은 크거나 작은 리보솜 서브유닛)에 관련된 것들과 같은 다중 세포 유형에서 활성인 특정 살림 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. STEL의 추가 예는 하기 표 1에 제시되어 있다. 이러한 단백질은 리보핵단백질 복합체, 국소 접착, 세포-기질 부착 접합, 세포-기질 접합, 세포 고정, 세포외 엑소솜, 세포외 소포, 세포내 소기관 또는 고정 접합을 형성하는 것들을 포함한다. 단백질 중 일부는 RNA 결합, 핵산 결합(예를 들어, rRNA 또는 mRNA 결합) 또는 단백질 결합에 관여한다.
[0049] 일부 구체예에서, STEL 부위는 분화 동안 뿐만 아니라 만능성 상태에서 견고하고 일관되게 발현되는 내인성 유전자의 유전자좌이다(예를 들어, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 분석에 의해 조사됨). 예를 들어, 내인성 유전자의 발현 수준은 5회 이상, 10회 이상 또는 15회 이상의 계대에 걸쳐 또는 세포 상태가 변함에 따라(예를 들어, 만능성 및/또는 분화 상태) 50% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하만큼 변한다(예를 들어, 감소).
[0050] 일부 구체예에서, STEL은 RPL 또는 RPS 유전자좌와 같은 리보솜 단백질 유전자좌이다. RPL 유전자의 예는 RPL10, RPL13, RPS18, RPL3, RPLP1, RPL13A, RPL15, RPL41, RPL11, RPL32, RPL18A, RPL19, RPL28, RPL29, RPL9, RPL8, RPL6, RPL18, RPL7, RPL7A, RPL21, RPL37A, RPL12, RPL5, RPL34, RPL35A, RPL30, RPL24, RPL39, RPL37, RPL14, RPL27A, RPLP2, RPLP0, RPL23A, RPL26, RPL36, RPL35, RPL23, RPL4 및 RPL22이다. RPS 유전자의 예는 RPS2, RPS19, RPS14, RPS3A, RPS12, RPS3, RPS6, RPS23, RPS27A, RPS8, RPS4X, RPS7, RPS24, RPS27, RPS15A, RPS9, RPS28, RPS13, RPSA, RPS5, RPS16, RPS25, RPS15, RPS20 및 RPS11이다.
[0051] 일부 구체예에서, STEL은 미토콘드리아 단백질을 인코딩하는 유전자좌이다. 이러한 유전자좌의 예는 MT-CO1, MT-CO2, MT-ND4, MT-ND1 및 MT-ND2이다.
[0052] 일부 구체예에서, STEL은 ACTG1 및 ACTB와 같은 액틴 단백질을 인코딩하는 유전자좌이다.
[0053] 일부 구체예에서, STEL은 EEF1A1 및 EEF2와 같은 진핵생물 번역 연장 인자 또는 EIF1과 같은 진핵생물 번역 개시 인자를 인코딩하는 유전자좌이다.
[0054] 일부 구체예에서, STEL은 H3F3A 및 H3F3B와 같은 히스톤을 인코딩하는 유전자좌이다.
[0055] 다른 구체예에서, STEL은 FTL, FTH1, TPT1, TMSB10, GAPDH, PTMA, GNB2L1, NACA, YBX1, NPM1, FAU, UBA52, HSP90AB1, MYL6, SERF2 및 SRP14로부터 선택되는 유전자좌이다.
[0056] 트랜스진 작제물을 숙주 세포에 도입하기 위해, 화학적 방법(예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 또는 리포펙션), 비화학적 방법(예를 들어, 전기천공 또는 뉴클레오펙션), 입자-기반 방법(예를 들어, 마게토펙션) 또는 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 하이브리드 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용함으로써)을 사용할 수 있다. 트랜스진은, 예를 들어, ZFN, TALEN, CRISPR-cas9, CRISPR/cpf1 또는 다른 뉴클레아제에 의해 유발된 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 절단을 통해 부위-특이적 방식으로 STEL 부위에 통합될 수 있다. 예를 들어, 편집된 대립유전자가 숙주 게놈과 이중-가닥 DNA 공여체 분자 사이의 상동성 재조합에 의해 생성되는 다양한 유형의 상동성 재조합 유전자 편집 시스템을 사용할 수 있다. 상동성 재조합은 숙주 게놈의 표적화된 상동성 유전자좌에서 이중-가닥 DNA 절단의 유도에 의해 촉진될 수 있고, 외인성 DNA 공여체 서열과 내인성 숙주 게놈 서열의 교환을 초래할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hoshijima et al., Methods Cell Biol. (2016) 135:121-47]을 참조한다. 그러나, 이중-가닥 DNA 절단은 상동성 재조합에 필요하지 않다.
[0057] DNA-결합 도메인(예를 들어, 아연 핑거 DNA-결합 단백질 또는 TALE DNA-결합 도메인), 가이드 RNA 요소(예를 들어, CRISPR 가이드 RNA) 및 가이드 DNA 요소(예를 들어, NgAgo 가이드 DNA)를 포함하는 게놈-표적화 요소를 이용하는 것과 같은 다른 잘 알려진 유전자 편집 시스템이 또한 사용될 수 있다. 프로그래밍 가능한 유전자-표적화 및 뉴클레아제 요소는 특정 게놈 유전자좌에서 이중-가닥 절단과 같은 DNA 절단을 도입함으로써 정확한 게놈 편집을 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 게놈 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN) 기반 시스템, CRISPR-기반 시스템 또는 NgAgo-기반 시스템이다. 일부 구체예에서, 외인성으로 도입된 DNA는 상동성 재조합을 통해 게놈 내로 트랜스진을 도입하기 위해 세포 복구 메커니즘을 이용하는데 사용될 수 있다.
[0058] 특정 구체예에서, 게놈 편집 시스템은 CRISPR-기반 시스템이다. CRISPR-기반 시스템은 하나 이상의 가이드 RNA 요소 및 하나 이상의 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함한다.
[0059] 추가 구체예에서, CRISPR-기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이다. "CRISPR-Cas 시스템"은 a) 적어도 하나의 가이드 RNA 요소 또는 가이드 RNA 요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산; 및 (b) Cas 단백질을 포함하는 Cas 단백질 요소 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 상기 가이드 RNA 요소는 하나 이상의 표적 게놈 영역에서의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 RNA 및 가이드 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 활성화 RNA를 포함한다. 가이드 RNA 및 활성화 RNA는 분리되거나 단일 RNA로 함께 융합될 수 있다.
[0060] 일부 구체예에서, CRISPR-기반 시스템은 클래스 1 CRISPR 및/또는 클래스 2 CRISPR 시스템을 포함한다. 클래스 1 시스템은 기능성 엔도뉴클레아제를 구축하기 위해 표적화 RNA로서 CRISPR RNA(crRNA)와 함께 여러 Cas 단백질을 사용한다. 클래스 2 CRISPR 시스템은 단일 Cas 단백질과 crRNA를 표적화 RNA로 사용한다. 타입 II Cas9-기반 시스템을 포함하는 클래스 2 CRISPR 시스템은 클래스 1 시스템에 의해 사용되는 다중-서브유닛 복합체보다는 절단을 매개하는 단일 Cas 단백질을 포함한다. CRISPR-기반 시스템은 또한 Cpf1 단백질 및 crRNA를 표적화 RNA로서 사용하는 클래스 2, 타입 V CRISPR 시스템을 포함한다.
[0061] Cas 단백질은 CRISPR-관련(Cas) 이중-가닥 DNA 뉴클레아제이다. 일부 구체예에서, CRISPR-Cas 시스템은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 단백질은 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 닉카제이다. Cas9 단백질과 같은 용어 "Cas 단백질"은 야생형 Cas 단백질 또는 이의 기능적 유도체(예를 들어, 뉴클레아제 활성을 갖는 야생형 Cas 단백질의 트렁케이션된 버전 또는 변이체)를 포함한다.
[0062] 일부 구체예에서, CRISPR-기반 시스템은 CRISPR-Cpf 시스템이다. "CRISPR-Cpf 시스템"은 (a) 적어도 하나의 가이드 RNA 요소 또는 가이드 RNA 요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산; 및 (b) Cpf 단백질(예를 들어, cpf1) 요소 또는 Cpf 단백질 요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 상기 가이드 RNA는 표적 핵산의 유전자좌에서의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적화 RNA를 포함한다.
II. 트랜스진
[0063] 트랜스진은, 예를 들어, 치료 단백질 또는 원하는 특징을 변형된 세포에 부여하는 유전자 생성물일 수 있는 페이로드를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, DsRED, mCherry, mKate2 및 tdTomato) 및 효소(예를 들어, 루시퍼라제 및 lacZ)와 같은 리포터 단백질을 인코딩한다. 리포터 유전자는 치료 세포가 환자에게 이식되면 이를 추적하는데 도움이 될 수 있다.
[0064] 일부 구체예에서, 트랜스진은 환자에게 결핍된 단백질과 같은 치료 단백질을 인코딩한다. 이러한 치료 단백질의 예는 리소좀 축적병에서 결핍된 것들, 예를 들어, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 A, 베타-글루코세레브로시다제, 산 스핑고미엘리나제 및 알파- 및 베타-갈락토시다제; 및 혈우병에서 결핍된 것들, 예를 들어, 인자 VIII 및 인자 IX를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료 단백질의 다른 예는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv), 예를 들어, 병원성 단백질을 표적화하는 것들(예를 들어, tau, 알파-시누클레인 및 베타-아밀로이드 단백질) 및 암 세포를 표적화하는 것들(예를 들어, CD19, CD20 및 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0065] 일부 구체예에서, 트랜스진은 면역조절에 관여하는 단백질 또는 면역조절성 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질의 예는 HLA-G, HLA-E, CD47, PD-L1, CTLA-4, M-CSF, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, IL-13, TGF-β1 및 이의 다양한 아이소형이다. 예를 들어, 트랜스진은 HLA-G의 아이소형(예를 들어, HLA-G1, -G2, -G3, -G4, -G5, -G6 또는 -G7) 또는 HLA-E를 인코딩할 수 있고; 이러한 비고전적인 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 동종이계 세포는 세포의 공급원이 아닌 인간 환자에게 이식될 때 덜 면역원성이고 더 잘 용인될 수 있어 "보편적인" 세포 요법을 가능하게 한다. 아래의 상세한 설명을 또한 참조한다.
[0066] 일부 구체예에서, 트랜스진은 안전 스위치 신호를 인코딩한다. 세포 요법에서, 예를 들어, 세포가 적절하게 기능하지 않거나 치료 목표가 달성된 경우, 환자에서 이들의 존재가 바람직하지 않을 때, 유전적으로 변형된 세포의 증식을 중지시키기 위해 안전 스위치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 안전 스위치는 소위 자살 유전자일 수 있으며, 이는 약학적 화합물을 환자에게 투여할 때 세포가 아폽토시스에 들어가도록 활성화되거나 비활성화될 것이다. 자살 유전자는 인간 세포에서 무해한 물질을 독성 대사산물로 전환하는 인간에서 발견되지 않는 효소(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 효소)를 인코딩할 수 있다. 자살 유전자의 예는 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 세포내 항체, 텔로머라제, 독소, 카스파제(예를 들어, iCaspase9) 및 HSV-TK 및 DNase의 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Zarogoulidis et al., J Genet Syndr Gene Ther. (2013) doi:10.4172/2157-7412.1000139]을 참조한다. 일부 구체예에서, 자살 유전자는 단순 헤르페스 바이러스(HSV)로부터의 티미딘 키나제(TK) 유전자일 수 있고, 자살 TK 유전자는 환자에게 간시클로버, 발간시클로버, 팜시클로버 등을 투여할 때 세포에 독성이 된다.
[0067] 일부 구체예에서, 안전 스위치는 CARD 도메인이 제거된 트렁케이션된 카스파제 9 유전자가 mTOR의 FRB(FKBP12-라파마이신) 또는 FKBP12(FK506-결합 단백질 12) 뒤에 연결된 라파마이신-유도성 인간 카스파제 9-기반(RapaCasp9) 세포 자살 스위치일 수 있다. 약물 라파마이신의 첨가는 FRB 및 FKBP12의 이종이량체화를 가능하게 하고, 이는 후속적으로 트렁케이션된 카스파제 9의 동종이량체화 및 아폽토시스의 유도를 야기한다.
[0068] 일부 구체예에서, 트랜스진은 폴리펩티드가 아닌 페이로드를 인코딩한다. 예를 들어, 트랜스진은 유전자 발현 패턴에 기초하여 세포를 선택적으로 제거할 수 있는 miRNA를 인코딩할 수 있다. 트랜스진은 또한 바람직한 방식으로 세포 거동을 제어할 수 있는 lncRNA 또는 다른 RNA 스위치를 인코딩할 수 있다.
III. STEL 부위에서 트랜스진의 발현
[0069] 트랜스진은 내인성 프로모터의 전사 제어하에 STEL 부위에서 내인성 유전자와 함께 하나의 mRNA로 전사될 수 있으며, 이후 각 유전자에 대한 RNA 서열은 mRNA에서 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 개별적으로 번역된다. 또 다른 접근법에서, 트랜스진은 내인성 유전자에, 예를 들어, 내인성 유전자의 3' 말단에서 인 프레임으로 삽입될 수 있지만, 번역 동안 리보솜 스킵(ribosomal skipping)을 유발하는 자가-절단 펩티드에 대한 코딩 서열에 의해 내인성 유전자 서열로부터 분리될 수 있다. 이러한 배열은 2개의 분리된 폴리펩티드, 즉, 트랜스진에 의해 인코딩된 페이로드와 내인성 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 생산을 초래한다. 자가-절단 펩티드의 예는 18-22개 아미노산의 전형적인 길이를 갖는 바이러스 유래된 펩티드인 2A 펩티드이다. 2A 펩티드는 T2A, P2A, E2A, F2A 및 PQR을 포함한다(Lo et al., Cell Reports (2015) 13:2634-2644). 예를 들어, P2A는 19개 아미노산의 펩티드이고; 절단 후, P2A로부터의 몇 개의 아미노산 잔기는 상류 유전자에 남고 프롤린은 두 번째 유전자의 시작부에 남는다. PQR 펩티드의 사용에 대해서는 아래의 실시예도 참조한다. 다른 구체예에서, STEL 유전자 및 트랜스진은 단일 mRNA로 전사되고 융합 단백질로 발현된다.
[0070] 일부 구체예에서, 트랜스진 작제물은 전사 종결 서열(예를 들어, SV40 polyA 부위와 같은 폴리아데닐화(polyA) 부위) 및 유전자 발현 또는 RNA 안정성을 향상시키는 서열(예를 들어, WPRE 요소)과 같은 추가적인 조절 서열을 표적화된 유전자좌에 도입할 수 있다. 트랜스진의 지속된 발현을 추가로 보장하기 위해, 적합한 전사 조절 요소가 또한 트랜스진 작제물을 통해 표적화된 STEL 부위로 도입될 수 있다. 이러한 요소는 프로모터의 상류에 배치된 유비쿼터스 염색질 개방 요소(UCOE), 및 기능적 경계를 생성하는 염색질 절연체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 염색질 절연체(예를 들어, 닭 베타 글로빈 유전자 클러스터(cHS4) 및 ArsI)는 침묵 이질염색질이 트랜스진으로 확산되는 것을 방지하는 인핸서 차단 또는 장벽 절연체일 수 있다.
IV. 유전적으로 변형된 세포
[0071] 본 개시는 게놈 내의 하나 이상의 STEL 부위에 하나 이상의 트랜스진을 함유하는 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 설치류 또는 뮤린) 세포를 제공한다. 인간 세포와 같은 세포는 본원에 기재된 것과 같은 유전자 편집 방법에 의해 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 조작될 수 있다. 관심 트랜스진을 발현하도록 다양한 인간 세포 유형이 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작될 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC)와 같은 만능성 줄기 세포이고, 이는 본원에서 PSC-유도체, PSC-유도체 세포 또는 PSC 유래된 세포로서 지칭되는 원하는 세포 유형으로 분화하도록 후속적으로 유도될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조작될 세포는 분화된 세포(예를 들어, 부분적으로 또는 최종 분화된 세포)이다. 부분적으로 분화된 세포는, 예를 들어, 조직-특이적 전구체 또는 줄기 세포, 예를 들어, 조혈 전구체 또는 줄기 세포, 골격근 전구체 또는 줄기 세포, 심장 전구체 또는 줄기 세포, 신경 전구체 또는 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포일 수 있다.
[0072] 본원에서 사용되는 용어 "만능성(pluripotent)" 또는 "만능성(pluripotency)"은 자가-재생하고 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 3개의 배엽층 중 하나의 세포로 분화하는 세포의 능력을 지칭한다. "만능성 줄기 세포" 또는 "PSC"는, 예를 들어, 주머니배의 내부 세포 덩어리로부터 유래되거나 체세포 핵 전달에 의해 유래된 ESC, 및 비만능성 세포로부터 유래된 iPSC를 포함한다.
[0073] 본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기", "ES" 세포 및 "ESC"는 초기 배아로부터 수득된 만능성 줄기 세포를 지칭한다. 일부 구체예에서, 이 용어는 인간 배아의 파괴를 수반하는 줄기 세포를 배제한다; 즉, ESC는 이전에 확립된 ESC 주로부터 획득된다.
[0074] 용어 "유도된 만능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 세포에 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하거나 이와 접촉시킴으로써, 비만능성 세포, 예를 들어, 성체 체세포, 부분적으로 분화된 세포 또는 최종 분화된 세포, 예를 들어, 섬유모세포, 조혈 계통의 세포, 근세포, 뉴런, 표피 세포 등으로부터 인공적으로 제조된 만능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다. iPSC를 생산하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함한다(예를 들어, 비제한적으로, SOX2(Gene ID: 6657), KLF4(Gene ID: 9314), c-MYC(Gene ID: 4609), NANOG(Gene ID: 79923) 및/또는 LIN28/LIN28A(Gene ID: 79727))와 조합된 POU5F1/OCT4(Gene ID: 5460)). 재프로그래밍 인자는 다양한 수단(예를 들어, 바이러스, 비바이러스, RNA, DNA 또는 단백질 전달)에 의해 전달될 수 있고; 대안적으로, 내인성 유전자는, 예를 들어, CRISPR 도구를 사용하여 활성화되어 비만능성 세포를 PSC로 재프로그래밍할 수 있다.
[0075] PSC의 다양한 계통의 세포로의 분화를 유도하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, PSC의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 방법은 문헌[Slukvin et al., J Imm. (2006) 176:2924-32; and Su et al., Clin Cancer Res. (2008) 14(19):6207-17; and Tseng et al., Regen Med. (2009) 4(4):513-26]에 개시되어 있다. PSC를 조혈 전구체 세포, 골수 계통의 세포 및 T 림프구로 유도하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Kennedy et al., Cell Rep. (2012) 2:1722-35]에 개시되어 있다.
[0076] 관심 트랜스진을 STEL 부위로 통합하는 것 외에도, 본원의 유전적으로 변형된 인간 세포(예를 들어, iPSC 또는 ESC)는 MHC 클래스 I 유전자(예를 들어, B2M 유전자) 중 하나 이상을 녹아웃시킴으로써 동종이계 세포 요법에서 이들을 덜 면역원성으로 만드는 것을 포함하여, 이들의 치료 잠재력을 개선하도록 추가로 조작될 수 있다. 인간 세포는 선택적으로 STEL 부위에 안전 스위치 신호(예를 들어, 자살 유전자)를 포함할 수 있다.
[0077] ESC 및 iPSC를 포함하는 PSC를 분리하고 유지하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Thomson et al., Science (1998) 282(5391):1145-7; Hovatta et al., Human Reprod. (2003) 18(7):1404-09; Ludwig et al., Nature Methods (2006) 3:637-46; Kennedy et al., Blood (2007) 109:2679-87; Chen et al., Nature Methods (2011) 8:424-9; and Wang et al., Stem Cell Res. (2013) 11(3):1103-16]을 참조한다.
[0078] 일부 구체예에서, PSC 또는 이들로부터 유래된 임의의 성숙 또는 중간 세포 유형은, 예를 들어, 페이로드 전달 및 안전성 제어와 같은 추가된 기능을 위해 추가로 조작될 수 있다(STEL 부위 조작 이전에, 동시에 또는 이후에).
[0079] 일부 구체예에서, PSC는 세포 요법을 위해 관심 세포 유형으로 분화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작되는 세포는 이미 분화된 관심 세포 유형이다. 분화된 세포 유형의 비제한적인 예는 하기에 기술된다.
A. 면역 세포
[0080] 유전적으로 변형된 인간 세포는 PSC 유래된 면역 세포, 예를 들어, 림프구 및 림프구 전구체 세포(예를 들어, T 세포 및 T 세포 전구체 세포(임의의 특정 T 세포 서브타입에 관계 없음, 예를 들어, 조절성 T 세포 및 T 이펙터 세포 포함), B 세포 및 NK 세포), 골수 및 골수 전구체 세포(예를 들어, 과립구, 단핵구/대식세포 및 미세아교세포) 및 수지상 및 수지상 전구체 세포(예를 들어, 골수 수지상 세포 및 형질세포 수지상 세포)를 포함하는 면역 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적으로 변형된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR T 세포를 발현하는 T 세포이다. 유전적으로 변형된 면역 세포는 또한 본원에 기재된 것과 같은 면역조절성 트랜스진을 발현할 수 있다.
[0081] 면역억제성 면역 세포(예를 들어, 조절성 T 세포 및 면역억제성 대식세포)와 같은 조작된 면역 세포는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 만성 림프구성 갑상선염, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 만성 궤양성 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환, 굿파스처 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 전신 혈관염, 경피증, 자가면역 용혈성 빈혈 및 자가면역 갑상선 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 자가면역 질환을 갖는 환자에게 이식될 수 있다. 면역 세포-기반 요법은 또한 이식과 관련된 증상, 예를 들어, 섬유증의 치료를 포함하는 이식에서 이식편 거부 반응을 치료하는데 사용될 수 있다.
B. 신경 세포
[0082] 유전적으로 변형된 인간 세포는 PSC 유래된 신경 세포, 비제한적으로, 뉴런 및 뉴런 전구체 세포(임의의 특정 뉴런 서브타입에 관계 없음, 예를 들어, 도파민성 뉴런, 피질 뉴런, 척추 또는 안구운동 뉴런, 장 뉴런, 인터뉴런, 및 삼차 또는 감각 뉴런 포함), 미세아교세포 및 미세아교세포 전구체 세포, 아교세포 및 아교세포 전구체 세포(임의의 특정 아교세포 서브타입에 관계 없음, 예를 들어, 희소돌기아교 세포, 별아교세포, 전용 희소돌기아교 세포 전구체 세포, 및 별아교세포 및 희소돌기아교 세포를 유발할 수 있는 이능성 아교세포 전구체), 기원판-유래 세포, 슈반 세포를 포함하는 신경 세포일 수 있다.
[0083] 조작된 신경 세포는 신경퇴행성 질환을 갖는 환자를 포함하나 이에 제한되지 않는 환자에게 이식될 수 있다. 신경퇴행성 질환의 예는 특히 파킨슨병, 알츠하이머병, 치매, 간질, 루이 소체 증후군, 헌팅턴병, 척수근 위축증, 프리드리히 실조증, 근위축성 측삭 경화증, 배튼병, 다계통 위축증이다.
[0084] 이러한 많은 질환에 대해, PSC는 먼저 이중 SMAD 억제를 통해 원시 신경 세포 운명을 채택하도록 지시될 수 있다(Chambers et al., Nat Biotechnol. (2009) 27(3):275-80). 원시 신경 세포는 전방 특성(anterior characteristics)을 채택하므로, 추가 신호가 없으면 전방/전뇌 피질 세포를 제공할 것이다. 코달라이징(caudalizing) 신호는 더 후방 특성(posterior character)을 갖는 배양물을 달리 생성할 수 있는 주변분비 신호를 방지하기 위해 차단될 수 있다(예를 들어, XAV939는 WNT를 차단할 수 있고 SU5402는 FGF 신호를 차단할 수 있음). 등쪽 피질 뉴런은 SHH 활성화를 차단함으로써 제조될 수 있는 반면, 배쪽 피질 뉴런은 SHH 활성화를 통해 제조될 수 있다. 세로토닌성 뉴런 또는 척추 운동 뉴런과 같은 더 많은 미측 세포 유형은 FGF 및/또는 WNT 신호의 추가를 통해 배양물을 코달라이징함으로써 제조될 수 있다. 일부 세포 유형의 경우, 레티노산(또 다른 코달라이징제)을 첨가하여 배양물을 후방화할 수 있다. 아교세포 유형의 생산은 일반적으로 FGF2 및/또는 EGF 함유 배지에서 연장된 배양 전에 원시 신경 세포의 동일한 패턴화를 따를 수 있다. PNS 세포 유형은 동일한 일반 원칙을 따를 수 있지만 분화 과정 초기에 시기 적절한 WNT 신호를 갖는다.
[0085] 유전적으로 변형된 신경 세포는 문제의 손상된 조직에 배치된 캐뉼라를 통해 환자에게 도입될 수 있다. 세포 제조물은 지지 배지에 배치되고 제조물을 정확하게 전달할 수 있는 주사기 또는 피펫과 같은 장치에 로딩될 수 있다. 이후 캐뉼라를 환자의 신경계에 배치 할 수 있으며, 일반적으로 정확한 전달을 목표로 하는 정위 방법을 사용한다. 이후 세포는 적절한 속도로 조직으로 배출될 수 있다.
C. 심혈관 세포
[0086] 유전적으로 변형된 인간 세포는 PSC 유래된 심혈관 세포, 예를 들어, 심근세포, 심장 섬유모세포, 심장 평활근 세포, 심외막 세포, 심장 내피 세포, 푸르키니에 섬유 및 심박조율기 세포를 포함하는 심혈관계의 세포일 수 있다.
[0087] 일부 구체예에서, 본 개시의 방법에 의해 제조, 농축 또는 분리된 심근세포는 iPSC와 같은 PSC로부터 유래된다. 예를 들어, 문헌[Kattman et al., Cell Stem Cell (2011) 8(2):228-40]에 제시되고, WO2016131137, WO2018098597 및 미국 특허 9,453,201에 제시된 바와 같이 PSC를 심근세포로 분화시키기 위한 수많은 방법이 존재한다. 당 분야의 임의의 적합한 방법은 STEL에서 트랜스진을 발현하도록 변형된 PSC 유래된 심근세포를 수득하기 위해 본원의 방법과 함께 사용될 수 있다.
[0088] 일부 구체예에서, PSC는 하나 이상의 심장 분화 배지에서 인큐베이션된다. 예를 들어, 배지는 다양한 농도의 골-형태형성 단백질(BMP; 예를 들어, BMP4) 및 액티빈(예를 들어, 액티빈 A)을 함유할 수 있다. 분화 인자 농도의 적정은 원하는 심근세포 분화를 달성하는데 필요한 최적의 농도를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
[0089] 일부 구체예에서, 분화된 심근세포는 심장 트로포닌 T(cTnT) 및/또는 미오신 경쇄 2v(MLC2v) 중 하나 이상을 발현한다. 일부 구체에서, 미성숙 심근세포는 트로포닌 T, 심장 트로포닌 I, 알파 액티닌 및/또는 베타-미오신 중쇄 중 하나 이상을 발현한다.
D. 대사 시스템의 세포
[0090] 유전적으로 변형된 인간 세포는 인간 대사 시스템과 관련될 수 있다. 예를 들어, 세포는 위장계의 세포(예를 들어, 간세포, 담관세포 및 췌장 베타 세포), 조혈계의 세포 및 중추 신경계의 세포(예를 들어, 뇌하수체 호르몬-방출 세포)일 수 있다. 예를 들어, 뇌하수체 호르몬-방출 세포를 생성하기 위해, SHH/FGF8 및 FGF10을 첨가하기 전에 PSC를 BMP4 및 SB431542(액티빈 신호전달을 차단함)와 함께 배양한다; 이후 세포가 특정 호르몬-방출 세포가 되도록 유도하기 위해 세포에 FGF8 또는 BMP(또는 둘 모두) 전에 연장된 기간 동안 SHH/FGF8 및 FGF10만을 적용한다. 예를 들어, 문헌[Zimmer et al., Stem Cell Reports (2016) 6:858-72]을 참조한다.
E. 안구 시스템의 세포
[0091] 유전적으로 변형된 인간 세포는 안구 시스템의 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 망막 전구체 세포, 망막 색소 상피(RPE) 전구체 세포, RPE 세포, 신경 망막 전구체 세포, 광수용기 전구체 세포, 광수용기 세포, 양극성 세포, 수평 세포, 신경절 세포, 무축삭 세포, 뮬러 아교세포, 원추 세포 또는 간상 세포일 수 있다. iPSC를 RPE 세포로 분화시키는 방법은, 예를 들어, WO 2017/044483에 기술되어 있다. RPE 세포를 분리하는 방법은, 예를 들어, WO 2017/044488에 기술되어 있다. iPSC를 신경 망막 전구체 세포로 분화시키는 방법은 WO 2019/204817에 기술되어 있다. 망막 전구체 세포 및 RPE 세포를 확인하고 분리하는 방법은, 예를 들어, WO 2011/028524에 기술되어 있다.
V. 약학적 조성물 및 용도
[0092] 본원에 기재된 유전적으로 조작된 세포는 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 동물 유래된 성분을 임의로 함유하지 않는 세포 배양 배지일 수 있다. 저장 및 운송을 위해, 세포는 < -70℃에서(예를 들어, 드라이 아이스 또는 액체 질소에서) 동결보존될 수 있다. 사용하기 전에, 세포를 해동하고 관심 세포 유형을 지지하는 멸균 세포 배지에서 희석할 수 있다.
[0093] 세포는 환자에게 전신적으로(예를 들어, 정맥내 주사 또는 주입을 통해) 또는 국소적으로(예를 들어, 국소 조직, 예를 들어, 심장, 뇌 및 손상된 조직의 부위에 직접 주사를 통해) 투여될 수 있다. 관상동맥내 투여, 심근내 투여, 경심내막 투여 또는 두개내 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방법이 환자의 조직 또는 기관에 세포를 투여하기 위해 당 분야에 공지되어 있다.
[0094] 치료적으로 유효한 수의 조작된 세포가 환자에게 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한"은 질병, 장애 및/또는 질환을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 인간 대상체에게 투여될 때, 질병, 장애 및/또는 질환의 증상(들)의 발병 또는 진행을 치료, 예방 및/또는 지연시키기에 충분한 세포의 수 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 전형적으로 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여된다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
[0095] 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학용어 및 기술용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되어 있으며, 본 개시의 실시 또는 시험에서 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질들이 또한 사용될 수 있다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술 및 이와 관련하여 사용된 명명법은 당 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용된다. 효소적 반응 및 정제 기술은 당 분야에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이, 제조자의 사양에 따라 수행된다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하고, 복수형 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구체예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 변형예, 예를 들어, "갖다", "갖는", "포함" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하는 것을 의미하지 않음이 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전체내용이 참조로 포함된다. 다수의 문헌들이 본원에 인용되어 있지만, 이러한 인용은 임의의 이러한 문서들이 당 분야의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.
[0096] 본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 기술된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
실시예
[0097] 다음 실시예에서, 유전자 편집은 하기 기재된 바와 같이 수행되었다.
가이드 RNA 및 검증
[0098] CRISPR-Cas9 유전자 편집은 하기 실험에서 의도된 STEL 부위에 트랜스진을 삽입하기 위해 수행되었다. 3개의 가이드 RNA(gRNA)는 정지 코돈에 근접한 GAPDH의 3' UTR을 표적화하도록 계산적으로 설계되었다. 정지 코돈에 근접한 RPL13A의 3' UTR을 표적화하도록 5개의 gRNA를 계산적으로 설계하였다. 이러한 gRNA는 적은 수의 오프-타겟 부위를 갖고 표적 서열에 대해 높은 예측 활성을 갖도록 설계되었다.
[0099] gRNA 절단 효율을 시험하기 위해, Cas9 뉴클레아제와 복합체화된 gRNA를 뉴클레오펙션을 통해 인간 PSC에 개별적으로 리보핵단백질(RNP)로서 전달하였다. 뉴클레오펙션 72시간 후에, gDNA를 뉴클레오펙션된 세포의 각 풀로부터 추출하였다. GAPDH 또는 RPL13A 유전자좌 의도된 절단 부위 주변의 영역을 다음 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다:
Figure pct00001
PCR 생성물을 정제하고 다음 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱하였다:
Figure pct00002
[00100] 각 gRNA의 전체 절단 효율은 편집되지 않은 세포로부터의 Sanger 시퀀싱 크로마토그램을 각 gRNA 조건으로부터의 Sanger 시퀀싱 크로마토그램과 비교함으로써 CRISPR 편집물(ICE) 분석의 추론에 의해 결정되었다. ICE 분석은 5'-CUUCCUCUUGUGCUCUUGCU-3'(SEQ ID NO:7)의 RNA 서열을 갖는 GAPDH gRNA 및 5'-GGAAGGGCAGGCAACGCAUG-3'(SEQ ID NO:8)의 RNA 서열을 갖는 RPL13A gRNA가 각각의 유전자좌에 대해 시험된 모든 gRNA 중 가장 높은 상대적 절단 효율을 가졌음을 결정하였다.
녹인 생성
[00101] 각각의 선택된 STEL 부위에 대한 화학적으로 변형된 gRNA를 제조자에 의해 제공되는 뉴클레아제-비함유 TE 완충액에 재현탁시키고 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 뉴클레아제 2NLS(Synthego) 및 GAPDH- 또는 RPL13A-표적화 공여체 플라스미드와의 복합체에서 RNP로서 인간 iPSC로 뉴클레오펙션시켰다. Lonza 4D Nucleofector™ X-Unit을 트랜스펙션에 사용하였다(P3 Nucleofector Solution and Nucleofector program CA-137). 이후 개별 콜로니를 멸균 조건하에 픽-투-킵(pick-to-keep) 방법을 통해 재조합 트렁케이션된 비트로넥틴으로 코팅된 96-웰 플레이트로 옮기고 유전자 스크리닝 및 동결을 위해 확장시켰다(Essential 8 완전 배지 + 10% DMSO에서). 가능한 가장 낮은 계대 수를 제공하기 위해 특성화 및 스크리닝 동안 계대 수를 제한하도록 주의를 기울였다.
[00102] 클론을 표적화 작제물 외부의 쌍당 하나의 프라이머 세트 및 표적화 작제물 내부의 쌍당 하나의 프라이머를 사용하여 5' 및 3' 접합 PCR에 의해 관련 녹인에 대해 스크리닝하였다. 5' 및 3' 접합 PCR 생성물 둘 모두에 대해 양성인 클론을 확장하고 동결보존하였다. 각각의 5' 및 3' 양성 클론으로부터의 gDNA를 주형으로 사용하여 통합된 작제물(상동성 아암 포함)에 완전히 걸쳐 있는 PCR 생성물을 생성하였다. 이후 이러한 PCR 생성물을 사용하여 게놈 맥락에서 통합된 작제물의 길이를 Sanger 시퀀싱하였다.
세포 배양 플랫폼
[00103] iPSC는 Essential 8 배지(Thermo Fisher Scientific; Catalog# A1517001) 및 재조합 인간 비트로넥틴(VTN-N)(N-말단 트렁케이션된 비트로넥틴 폴리펩티드)을 사용하여 유지되었다. 단일 세포 계대 및 클로닝 절차 동안, Y-27632 ROCK 억제제를 사용하였다. iPSC는 매일 공급되었고 일주일에 한번 이중 공급되었다. 세포 배양은 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다. 배양 동안 녹아웃 클론과 모 야생형 세포 사이에 관찰된 형태에는 유의한 변화가 없었다.
클론성
[00104] 원하는 유전자 변형을 위한 전기천공 직후, 단일 세포가 부착되고 독립적으로 성장하도록 하기 위해 iPSC를 저밀도로 플레이팅하였다. 각 세포를 콜로니로 성장시켰다. 콜로니가 최적의 크기에 도달하면, 각각의 개별 콜로니를 골라 별도의 웰에 넣었다. 각 클론은 유전자 편집 이벤트에 대해 서열-분석되었고 또한 G-banded 핵형 분석을 거쳤다.
클론 HLA-G 단백질 특성화
[00105] BD Biosciences(클론 4H84)의 pan-HLA-G 항체를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 HLA-G의 세포 표면 발현을 확인하였다. Thermo Fisher Scientific의 HLA-G5/G6 특이적 항체(클론 5A6G7)를 사용하여 HLA-G6 및 HLA-G5의 세포 배양 배지로의 분비를 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 구체적으로, 4 mL의 배지를 100 μl로 농축시킨 다음 HLA-G6 및 -G5의 존재에 대해 웨스턴에 의해 시험하였다.
실시예 1: STEL 부위의 식별
[00106] 이 연구에서, 본 발명자는 STEL 후보에 대한 부위 조사를 수행하기 위해 인간 PSC 및 이들의 분화 유도체로부터 수집된 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터를 평가하였다. 본 발명자는 여러 세포 유형의 scRNA-seq 데이터를 사용하여 추정 STEL 부위를 발견할 수 있다고 가정하였다. 이 접근법은 수십만 개의 사용 가능한 개별 전사체를 직접 검사할 수 있게 한다. 현재 연구에서, 단일 세포 RNA 서열 데이터는 PSC 및 3개의 PSC 유래된 세포 유형, 미세아교세포, 도파민성 뉴런 및 심실 심근세포로부터 수집되었다. 데이터는 28,387개의 고유한 유전자의 전사체 깊이를 갖는 267,058개의 세포로부터 수집되었다. STEL 부위의 첫 번째이자 가장 중요한 특징은 발현의 편재성이다. 유전자는 먼저 전사체 수 데이터를 이진화한 다음 세포에 걸쳐 합산함으로써 발현의 편재성에 따라 순위를 매겼다. 이후 각 유전자에 대한 합계를 총 세포 수로 나누어, 총 데이터에서 해당 유전자의 유병률을 반영하는 분수를 산출하였다.
[00107] 총 98개의 유전자가 99% 이상의 분수 표현을 가지며 이후 추가 분석을 위해 선택되었다. 이후 선택된 유전자는 이진화되지 않은 발현 데이터의 표준 편차에 의해 분류되었다. 표준 편차가 1보다 큰 유전자를 제거하였다. 이후 나머지 94개의 유전자는 평균 발현에 의해 분류되었고 이들은 주로 리보솜 유전자였지만 GAPDH 및 ACTB와 같은 일부 알려진 살림 유전자도 포함하였다(표 1).
표 1 단일 세포 RNA 시퀀싱에 의해 식별된 STEL 부위
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
[00108] 이러한 유전자 중 몇몇(GAPDH, RPLP0, RPL7 및 RPL13A)은 도 1에 도시된 UMAP 플롯에서 시각화된다. 이러한 4개의 유전자좌는 하기 기재된 실험을 위해 STEL로서 선택되었다. 상기 열거된 것들로부터 STEL 부위의 선택을 완료할 때 고려한 다른 기준은 종양유전자로부터의 게놈 거리(가능한 멀리), 개념 증명을 위한 공개된 연구, 및 유전자좌에서 위유전자의 수(오프-타겟 프라이머 결합을 최소화하기 위해 적을수록 좋다)를 포함하였다. 상기 기술된 RNA 서열 방법은 STEL 부위를 발견하는데 사용될 수 있지만, 잠재적 부위의 자격을 박탈하는 데에도 사용될 수 있다.
[00109] 또한, 유전자 발현의 scRNAseq 분석은 유전자 발현 분석을 위한 대조군으로 일반적으로 사용되는 모든 내인성 유전자가 STEL 부위는 아니라는 것을 보여준다. 예를 들어, 펩티딜프롤릴 이소머라제 A(PPIA; 또는 사이클로필린 A) 유전자, 튜불린 베타 폴리펩티드(TUBB) 및 베타-2-마이크로글루블린(B2M)을 인코딩하는 유전자는 일반적으로 그 발현 수준이 포유동물 세포의 RT-PCR 검정을 위한 표준화 기준으로 사용되는 신뢰할 수 있는 살림 유전자로 간주된다. 그러나 본 발명자의 데이터에 따르면, 이러한 유전자는 상기 표 1에 제시된 STEL 유전자보다 발현 수준이 세포 유형에 걸쳐 훨씬 더 가변적이기 때문에 STEL 부위가 아니다. RNA 분석을 위한 표준화 대조군으로 일반적으로 사용되는 다른 살림 유전자, 예를 들어, ALAS1, GUSB, HMBS, HPRT, SDHA, TBP 및 TFRC를 인코딩하는 유전자에 대해 유사한 관찰이 이루어졌다. 대조적으로, RPL13A 및 RPLP0 유전자와 같은 리보솜 단백질 유전자는 세포 유형에 걸쳐 강력한 발현을 가지므로 트랜스진 통합에 적합한 STEL 부위가 된다.
[00110] 비정상적인 통합의 위험을 감소시키기 위해, STEL은 바람직하게는 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 옆에 있지 않다. 예를 들어, TUBB 유전자는 MDC1 유전자, DNA 복구 매개체 및 공지된 종양 억제 유전자 근처에 있다. TUBB 유전자는 이러한 추가 이유로 STEL 부위로 선택되지 않았다. STEL 부위는 유전자 편집이 가능한 스플라이스 변이체(있다면) 및 인접 유전자로부터 적절한 거리를 가질 수 있다. 또한 STEL 부위는 많은 수의 위유전자를 갖지 않는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 표적화된 유전자에 상동성인 서열로 인해 트랜스진 표적화 효율을 감소시킬 수 있다.
실시예 2: PSC 내의 STEL 부위에서 EGFP의 발현
[00111] 상기 연구를 기반으로, 페이로드 후보 발현의 시험을 위해 4개의 STEL 부위(GAPDH, RPL13A, RPLP0 및 RPL7)를 선택하였다. 페이로드 후보의 발현 카세트는 내인성 STEL 프로모터의 제어하에 있었다. 그 결과, 페이로드 후보의 발현은 내인성 STEL 유전자의 발현에 연결되었다. STEL 프로모터가 세포에서 활성을 유지한다면, 연결된 페이로드 트랜스진의 발현은 지속되고 항시적일 것으로 예상된다. 본 발명자는 CRISPR-cas9 유전자 편집을 사용하여 GAPDH, RPL13A, RPLP0 또는 RPL7 유전자좌에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 작제물을 삽입하였다(도 2). EGFP 코딩 서열은 아래에 제시된다.
Figure pct00007
[00112] 삽입된 EGFP 트랜스진은 PQR 서열을 코딩하는 DNA 서열에 의해 내인성 STEL 유전자에 인 프레임으로 연결되었다(Lo et al., supra)(도 2). PQR 서열은 번역 동안 리보솜 스킵을 야기하는 변형된 2A 자가-절단 펩티드이며, PQR 서열이 절단되면 EGFP 및 내인성 STEL 유전자의 바이시스트론 발현이 발생한다. PQR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 아래에 제시된다.
Figure pct00008
[00113] 각각의 PQR/EGFP 삽입 작제물은 또한 내인성 STEL 유전자좌에 상동성인 서열을 보유하는 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다. 상동성 아암은 마지막 아미노산 코돈 바로 뒤에 STEL 유전자의 3' UTR에서 표적화 작제물의 통합을 가능하게 하였다.
[00114] GAPDH 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암의 서열은 각각 SEQ ID NO:12 및 13으로 아래에 제시된다.
Figure pct00009
[00115] RPL13A 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암의 서열은 각각 SEQ ID NO:14 및 15로 아래에 제시된다.
Figure pct00010
Figure pct00011
[00116] RPLP0 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암의 서열은 각각 SEQ ID NO:16 및 17로 아래에 제시된다.
Figure pct00012
[00117] 유세포 분석은 분화되지 않은 편집되지 않은 PSC, 분화되지 않은 GAPDH-표적화 EGFP 편집된 PSC, 또는 분화되지 않은 RPL13A-표적화 편집된 PSC에 대해 수행되었다(도 3). GAPDH-표적화 및 RPL13A-표적화 EGFP 편집된 PSC 주 둘 모두에 대해, 본 발명자는 하나의 동형접합-표적화 주(둘 모두의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함) 및 하나의 이형접합-표적화 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함)를 조사하였다. 데이터는 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 4개의 편집된 PSC 주 모두로부터의 높은 EGFP 형광 신호를 입증한다. 이러한 결과는 GAPDH 및 RPL13A 유전자좌에 EGFP 작제물의 삽입이 편집된 PSC에서 높은 수준의 트랜스진 발현을 허용하였음을 나타낸다.
[00118] 유세포 분석은 분화되지 않은 편집되지 않은 PSC, 또는 RPLP0-표적화 EGFP 편집된 PSC의 3개의 다른 분화되지 않은 클로날 PSC 주에 대해 수행되었다(도 4). 3개의 RPLP0-표적화 EGFP PSC 주는 모두 이형접합이었고, 하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유하였다. 데이터는 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 3개의 편집된 PSC 주 모두로부터의 높은 EGFP 형광 신호를 입증한다. 이러한 결과는 RPLP0 유전자좌에 EGFP 작제물의 삽입이 편집된 PSC에서 높은 수준의 트랜스진 발현을 허용하였음을 나타낸다.
[00119] qPCR 분석은 편집되지 않은 PSC 및 GAPDH-표적화 EGFP 편집된 PSC로부터 수집된 RNA에 대해 8주 동안 배양된 세포주에서 매주 수행되었다(도 5). 세포주는 매주 평균 2 내지 3회 일상적으로 계대되었다. 15 내지 20회 사이클 사이의 평균 Cq 범위는 매우 많은 양의 표적 RNA 및 트랜스진 발현을 나타낸다. Cq 값은 샘플에서 표적 RNA의 양과 반대이다; Cq 값이 낮을수록 트랜스진 발현의 양이 더 많다. 이형접합 GAPDH-표적화 EGFP PSC 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함) 및 동형접합 GAPDH-표적화 EGFP PSC 주(둘 모두의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함)는 모두 EGFP를 발현하지 않았던 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 높은 트랜스진 발현을 보여주었다. 동형접합 GAPDH-표적화 EGFP PSC 주는 이형접합 GAPDH-표적화 EGFP PSC 주보다 약간 더 낮은 Cq 값을 나타내었고, 이는 동형접합 GAPDH-표적화 EGFP PSC 주로부터의 더 높은 트랜스진 발현을 나타낸다. 편집된 두 PSC 라인은 모두 최대 8주 동안 매주 높은 수준의 EGFP 발현을 나타내었고, 이는 최대 8주 동안 일상적인 PSC 배양 후 높은 수준의 트랜스진 발현이 유지되었음을 나타낸다.
[00120] qPCR 분석은 편집되지 않은 PSC 및 RPL13A-표적화 EGFP 편집된 PSC로부터 수집된 RNA에 대해 8주 동안 배양된 세포주에서 매주 수행되었다(도 6). 세포주는 매주 평균 2 내지 3회 일상적으로 계대되었다. 15 내지 25회 사이클 사이의 평균 Cq 범위는 매우 많은 양의 표적 RNA 및 트랜스진 발현을 나타낸다. Cq 값은 샘플에서 표적 RNA의 양과 반대이다; Cq 값이 낮을수록 트랜스진 발현의 양이 더 많다. 이형접합 RPL13A-표적화 EGFP PSC 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함) 및 동형접합 RPL13A-표적화 EGFP PSC 주(둘 모두의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함)는 모두 EGFP를 발현하지 않았던 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 높은 트랜스진 발현을 보여주었다. 이형접합 RPL13A-표적화 EGFP PSC 주는 동형접합 RPL13A-표적화 EGFP PSC 주보다 약간 더 낮은 Cq 값을 나타내었고, 이는 이형접합 RPL13A-표적화 EGFP PSC 주로부터의 더 높은 트랜스진 발현을 나타낸다. 편집된 두 PSC 주는 모두 최대 8주 동안 매주 높은 수준의 EGFP를 나타내었고, 이는 최대 8주 동안 일상적인 PSC 배양 후 높은 수준의 트랜스진 발현이 유지되었음을 나타낸다.
[00121] 유세포 분석은 또한 16일 도파민성 뉴런으로 분화된 편집되지 않은 PSC, GAPDH-표적화 EGFP 편집된 PSC 및 RPL13A-표적화 EGFP 편집된 PSC에 대해 수행되었다(도 7)(예를 들어, Chambers et al., supra 참조). GAPDH-표적화 및 RPL13A-표적화 EGFP 편집된 PSC 주 둘 모두에 대해, 본 발명자는 하나의 동형접합-표적화 주(둘 모두의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함) 및 하나의 이형접합-표적화 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함)를 조사하였다.
[00122] 데이터는 도파민성 뉴런으로의 16일 분화 후 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 4개의 편집된 PSC 주 모두로부터의 높은 EGFP 형광 신호를 입증한다. 이러한 결과는 GAPDH 및 RPL13A 유전자좌에 EGFP 작제물의 삽입이 편집된 PSC에서 높은 수준의 트랜스진 발현을 허용하였고, 높은 수준의 트랜스진 발현이 편집된 PSC의 계통-지시적 분화 후에 유지되었음을 나타낸다.
[00123] 유세포 분석은 또한 12일 심근세포로 분화되거나 분화되지 않은 편집되지 않은 PSC, 이형접합 GAPDH-표적화 EGFP 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함), 및 12일 심근세포로 분화되거나 분화되지 않은 이형접합 RPL13A-표적화 EGFP 주(하나의 대립유전자에 유전자 편집물을 보유함)에 대해 수행되었다(도 8)(예를 들어, 문헌[Lian et al., Nat. Protoc. (2013) 8(1):162-75)] 참조). 데이터는 심근세포로의 12일 분화 후 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 GAPDH-표적화 EGFP 주 및 RPL13A-표적화 EGFP 주 둘 모두로부터의 높은 EGFP 형광을 입증한다. 분화된 편집된 주의 형광 수준은 분화되지 않은 편집된 주와 비교할 때 약간 더 낮았지만, 여전히 높다. 결과는 편집된 PSC의 심근세포 계통-지시적 분화 후에 높은 수준의 트랜스진 발현이 유지되었음을 나타낸다.
실시예 3: iPSC 내의 GAPDH 및 RPL13A 유전자좌에서 HLA-G6의 발현
[00124] 이 연구에서, HLA-G6을 발현하는 작제물은 iPSC 내의 GAPDH 유전자좌 또는 RPL13A 유전자좌로 편집되었다. HLA-G6 코딩 서열은 아래에 제시되어 있다.
Figure pct00013
[00125] 삽입된 HLA-G6 트랜스진은 상기 기재된 바와 같이 PQR 서열에 의해 내인성 살림 유전자에 인 프레임으로 연결되었다(도 9). 각각의 PQR/HLA-G6 삽입 작제물은 또한 상기 기재된 바와 같이 내인성 STEL 유전자좌(GAPDH 또는 RPL13A)에 상동성인 서열을 보유하는 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다.
[00126] Thermo Fisher Scientific의 HLA-G5/G6 특이적 항체(클론 5A6G7)를 사용하여 HLA-G6의 세포 배양 배지로의 분비를 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 편집되지 않은 야생형 PSC, 대조군 JEG-3 융모막암종 세포(HLA-G가 정상적으로 발현되는 인간 태반으로부터 유래됨) 및 GAPDH-표적화 HLA-G6 PSC 주의 세포 배양 상청액에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 10). 사용된 1차 항체는 HLA-G5 및 HLA-G6을 포함하는 가용성 HLA-G 아이소형에 특이적이었다. HLA-G6의 예상 단백질 크기는 약 30 kDa이다. 데이터는 HLA-G6이 GAPDH-표적화 HLA-G6 편집된 PSC 세포 및 대조군 JEG-3 세포의 세포 배양 상청액에서 유사한 수준으로 검출되었지만, 편집되지 않은 PSC의 세포 배양 상청액에는 부재했음을 입증한다. 이러한 결과는 GAPDH 유전자좌에 HLA-G6 작제물의 삽입이 편집된 PSC로 하여금 높은 수준의 HLA-G6을 분비하도록 하였음을 나타낸다.
[00127] 형광 공명 에너지 전달(FRET) 검출 검정이 또한 편집되지 않은 야생형 PSC, 대조군 JEG-3 세포 및 GAPDH-표적화 HLA-G6 PSC의 세포 배양 상청액에 대해 수행되었다(도 11). FRET는 가까이 있을 때의 2개의 형광단, 즉, 공여체와 수용체 사이의 에너지 전달을 포함한다. 공여체 분자는 pan-HLA-G 항체(BD Biosciences; 클론 4H84)에 연결되었고 수용체 분자는 HLA-G5 및 HLA-G6을 포함하는 가용성 HLA-G 아이소형을 검출하는 항체(Thermo Fisher Scientific; 클론 5A6G7)에 연결되었다. 두 항체 모두는 분비된 HLA-G6 단백질에 결합하여, 공여체와 수용체 분자 사이에 FRET가 발생하도록 한다. FRET 신호가 높을수록 검출된 단백질의 양이 더 많다. 데이터는 대조군 JEG-3 세포의 세포 배양 상청액에서 높은 FRET 신호 및 GAPDH-표적화 HLA-G6 편집된 PSC로부터 심지어 더 높은 FRET 신호를 나타내지만, 편집되지 않은 PSC로부터의 신호는 없다. 이러한 결과는 GAPDH 유전자좌에 HLA-G6 작제물의 삽입이 편집된 PSC로 하여금 높은 수준의 HLA-G6을 분비하도록 하였음을 확인시켜 준다.
[00128] 또 다른 연구에서, 편집되지 않은 PSC 및 RPL13A-표적화 HLA-G6 PSC 주의 세포 배양 상청액에 대해 FRET 검출 검정을 수행하였다(도 12). 데이터는 RPL13A-표적화 HLA-G6 편집된 PSC의 세포 배양 상청액에서 높은 FRET 신호를 나타내지만, 편집되지 않은 PSC로부터의 신호는 거의 없다. 이러한 결과는 RPL13A 유전자좌에 HLA-G6 작제물의 삽입이 또한 편집된 PSC로 하여금 높은 수준의 HLA-G6을 분비하도록 하였음을 나타낸다.
[00129] B2M 유전자는 GAPDH-표적화 HLA-G6 주 및 RPL13A-표적화 HLA-G6 주 둘 모두에서 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 녹아웃되었고, 각 HLA-G6-편집된 PSC 주에 대해 3개의 상이한 B2M 녹아웃(KO) 클론이 생성되었다. pan-HLA-G 항체(BD Biosciences; 클론 4H84)를 사용하여 6개의 편집된 클론 모두에 대해 유세포 분석을 수행하였다(도 13). 분석은 일상적인 PSC 배양의 1주 후, 및 일상적인 PSC 배양의 8주 후에 반복되었다. 데이터는 편집되지 않은 PSC 주와 비교하여 편집된 PSC 주에서 높은 HLA-G 발현을 입증하고, HLA-G 발현이 심지어 B2M 유전자 녹아웃 후에도 8주까지의 일상적인 PSC 배양 동안 모든 편집된 클로날 세포주에 걸쳐 유지되는 것을 보여준다. GAPDH-표적화 PSC 주로부터의 HLA-G 발현은 RPL13A-표적화 PSC 주보다 높았고, 이는 GAPDH 유전자좌로부터의 더 높은 트랜스진 발현을 나타낸다.
실시예 4: PSC 내의 GAPDH 유전자좌에서 항-Tau scFv의 발현
[00130] 이 연구에서, 인간 tau에 대한 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체를 발현하는 작제물(Ising et al., J. Exp. Med. (2017) 214(5):1227-1238)을 GAPDH 유전자좌에 삽입하였다. 항-tau scFv 삽입 작제물은 분비 신호 펩티드(SP), S(GGGGS)3(SEQ ID NO:19) 펩티드 링커(PL)에 의해 연결된 항-tau 항체 HJ8.5의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)(WO 2016/126993 및 WO 2014/008404) 및 인간 인플루엔자 적혈구응집소(HA) 펩티드 태그를 인코딩하는 서열로 구성되었다(도 14). 항-tau scFv에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있고, 여기서 분비 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있으며, VL에 대한 코딩 서열은 이탤릭체로 표시되고, 펩티드 링커에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고, VH에 대한 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있으며, HA 태그에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고 이탤릭체로 표시된다.
Figure pct00014
[00131] TGA 정지 코돈은 번역의 종결을 허용하기 위해 트랜스진 코딩 서열 뒤에 혼입되었다. scFv의 발현은 상기 기재된 바와 같이 PQR 서열에 의해 GAPDH의 발현에 연결되었다. 각각의 PQR/항-tau scFv 삽입 작제물은 또한 상기 기재된 바와 같이 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다.
[00132] 편집되지 않은 PSC, GAPDH-표적화 항-tau scFv PSC 주(순수 상청액 또는 항-HA 아가로스 면역침전에 의해 농축됨)의 세포 배양 상청액, 및 GAPDH-표적화 항-tau scFv PSC 주의 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 15). 사용된 1차 항체는 HA 펩티드 태그로부터 유래된 9-아미노산 서열 YPYDVPDYA(SEQ ID NO:21)을 인식하는 항-HA 모노클로날 항체였다. 항-tau scFv의 예상 단백질 크기는 약 30 kDa이다.
[00133] 데이터는 GAPDH-표적화 항-tau scFv 편집된 PSC 주의 순수 및 농축된 세포 배양 상청액, 및 GAPDH-표적화 항-tau scFv 편집된 PSC 주의 세포 용해물에서 항-tau scFv가 검출되었지만, 편집되지 않은 PSC 주의 세포 배양 상청액에는 부재하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 GAPDH 유전자좌에 항-tau scFv 작제물의 삽입이 편집된 PSC로 하여금 높은 수준의 scFv를 분비하도록 하였음을 나타낸다.
실시예 5: PSC 내의 GAPDH 유전자좌에서 RapaCasp9 세포 자살 스위치의 발현
[00134] 이 연구에서, 라파마이신-유도성 인간 카스파제 9-기반(RapaCasp9) 세포 자살 스위치를 함께 포함하는 2개의 상이한 작제물(Stavrou et al., Mol. Ther. (2018) 26(5):1266-76)을 GAPDH 유전자좌의 각 대립유전자에 삽입하였다. 하나의 RapaCasp9 작제물은 CARD 도메인이 제거된 트렁케이션된 카스파제 9 유전자(truncCasp9)에 SGGGS(SEQ ID NO:22) 펩티드 링커(L1)에 의해 연결된 mTOR의 FRB(FKBP12-라파마이신 결합) 도메인을 인코딩하는 서열로 구성되었다. 다른 RapaCasp9 작제물은 CARD 도메인이 제거된 트렁케이션된 카스파제 9 유전자(truncCasp9)에 SGGGS(SEQ ID NO:22) 펩티드 링커(L2)에 의해 연결된 FKBP12(FK506-결합 단백질 12) 유전자를 인코딩하는 서열로 구성되었다(도 16). 약물 라파마이신의 첨가는 FRB 및 FKBP12의 이종이량체화를 가능하게 하고, 이는 후속적으로 트렁케이션된 카스파제 9의 동종이량체화 및 아폽토시스의 유도를 야기한다.
[00135] RapaCasp9의 FRB-L1-truncCasp9 성분에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있고, 여기서 FRB에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고, 펩티드 링커(L1)에 대한 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있으며, 트렁케이션된 카스파제 9에 대한 코딩 서열은 이탤릭체로 표시된다.
Figure pct00015
[00136] RapaCasp9의 FKBP12-L2-truncCasp9 성분에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있고, 여기서 FKBP12에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고, 펩티드 링커(L2)에 대한 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있으며, 트렁케이션된 카스파제 9에 대한 코딩 서열은 이탤릭체로 표시된다.
Figure pct00016
[00137] TGA 정지 코돈은 번역의 종결을 허용하기 위해 각 트랜스진 코딩 서열 뒤에 혼입되었다. RapaCasp9의 FRB-L1-truncCasp9 및 FKBP12-L2-truncCasp9 성분 둘 모두의 발현은 상기 기재된 바와 같이 PQR 서열에 의해 GAPDH의 발현에 연결되었다. 각각의 PQR/RapaCasp9 작제물은 또한 상기 기재된 바와 같이 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다.
[00138] GAPDH-표적화 RapaCasp9 PSC 주를 1, 2, 4 또는 24시간 동안 5 nM 또는 10 nM의 라파마이신으로 처리하고, 각 시점 이후에 유세포 분석을 위해 세포를 수확하였다(도 17). 사용된 1차 항체는 Alexa Fluor® 488 2차 항체에 컨쥬게이션된 항-인간/마우스 절단된 카스파제-3이었다. 1차 항체는 Asp175에서 절단된 인간 및 마우스 카스파제 3을 검출한다. 카스파제 3은 아폽토틱 캐스케이드에서 개시자 카스파제, 카스파제 9의 하류 기능을 하는 실행자 카스파제이다. 인간 프로카스파제 3은 일반적으로 비활성 동종이량체이다. 세포 스트레스 또는 활성화를 통한 아폽토시스의 유도시, 이는 절단된 카스파제 3 서브유닛으로의 단백질분해를 겪는다. 데이터는 5 nM 또는 10 nM의 라파마이신으로 GAPDH-표적화 RapaCasp9 PSC 주를 처리한 후, 절단된 카스파제 3 염색이 처리 4시간 후에 쉽게 검출 가능하며, 처리 24시간 후에 절단 카스파제 3에 대해 거의 모든 세포(>99%)가 염색됨을 입증한다. 라파마이신으로 처리되지 않은 편집된 PSC에 대한 절단된 카스파제 3의 검출은 무시할 만하다. 이러한 결과는 GAPDH 유전자좌에 FRB-L1-truncCasp9 및 FKBP12-L2-truncCasp9 RapaCasp9 작제물의 이중대립형질적 삽입이 편집된 PSC로 하여금 라파마이신으로 유도시 아폽토시스를 겪도록 하였음을 나타낸다.
실시예 6: PSC 내의 GAPDH 유전자좌에서 PD-L1 및 CD47 면역조절성 분자의 발현
[00139] 이 연구에서, 면역조절성 분자 및 HSV-TK.007(단순 헤르페스 티미딘 키나제) 세포 자살 스위치 둘 모두를 각각 함유하는 2개의 상이한 작제물을 GAPDH 유전자좌의 각 대립유전자에 삽입하였다. PD-L1-기반 작제물은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 HSV-TK.007에 대한 코딩 서열에 연결된 PD-L1(프로그래밍된 사멸 리간드 1)의 코딩 서열로 구성되었고, 이는 P2A 서열을 통해 puroR(푸로마이신 내성 유전자)에 대한 코딩 서열에 연결되었다. CD47-기반 작제물은 IRES 서열을 통해 HSV-TK.007에 대한 코딩 서열에 연결된 CD47의 코딩 서열로 구성되었다. 간시클로버를 첨가하면, 이들 작제물을 함유하는 세포는 간시클로버를 독성 뉴클레오티드 유사체로 전환시켜 능동적으로 증식하는 세포에서 DNA 복제 실패 및 세포 사멸을 유발한다.
[00140] PD-L1-기반 작제물에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있고, 여기서 PD-L1에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고, IRES에 대한 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있고, HSV-TK.007에 대한 코딩 서열은 이탤릭체로 표시되고, P2A에 대한 코딩 서열(GSG 링커 포함)은 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있으며, puroR에 대한 코딩 서열은 정규 스크립트에 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
[00141] CD47-기반 작제물에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있고, 여기서 CD47에 대한 코딩 서열은 굵게 표시되고, IRES에 대한 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있으며, HSV-TK.007에 대한 코딩 서열은 이탤릭체로 표시된다.
Figure pct00019
[00142] 정지 코돈은 번역의 종결을 허용하기 위해 각 트랜스진 코딩 서열 뒤에 혼입되었다. PD-L1-기반 작제물의 발현은 상기 기재된 바와 같이 PQR 서열에 의해 GAPDH의 발현에 연결되었고, 상기 기재된 바와 같이 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다. CD47-기반 작제물의 발현은 P2A 서열에 의해 GAPDH의 발현에 연결되었고, 여기서 GSG 링커는 아래의 서열에서 굵게 표시되고, 상기 기재된 바와 같이 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다:
Figure pct00020
[00143] 유세포 분석은 편집되지 않은 PSC, 또는 PD-L1-기반 작제물로 편집된 하나의 대립유전자 및 CD47-기반 작제물로 편집된 다른 대립유전자를 포함하는 GAPDH-표적화 PSC에 대해 수행되었다(도 18). 데이터는 GAPDH-표적화 PSC에서 이중 PD-L1 및 CD47 공동-염색이 검출되지만 편집되지 않은 PSC에서는 염색이 없음을 입증하며, 이는 GAPDH 유전자좌에 PD-L1-기반 작제물 및 CD47-기반 작제물의 이중대립형질적 삽입이 편집된 PSC로 하여금 PD-L1 및 CD47을 발현하도록 하였음을 나타낸다.
실시예 7: PSC 내의 GAPDH 유전자좌에서 CSF1의 발현
[00144] 이 연구에서, CSF1(콜로니 자극 인자 1)에 대한 코딩 서열을 함유하는 작제물을 GAPDH 유전자좌의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에 삽입하였다. CSF1은 대식세포의 생존, 분화 및 기능을 조절하는 사이토카인이다. CSF1에 대한 코딩 서열은 아래에 제시되어 있다.
Figure pct00021
[00145] TAG 정지 코돈은 번역의 종결을 허용하기 위해 트랜스진 코딩 서열 뒤에 혼입되었다. CSF1의 발현은 상기 기재된 바와 같이 PQR 서열에 의해 GAPDH의 발현에 연결되었다. 각각의 PQR/CSF1 삽입 작제물은 또한 상기 기재된 바와 같이 800 bp의 좌측 상동성 아암 및 800 bp의 우측 상동성 아암과 측접하였다.
[00146] ELISA 면역검정은 편집되지 않은 PSC 및 3개의 상이한 GAPDH-표적화 CSF1 PSC 주의 세포 배양 상청액에 대해 수행되었다(도 19). 데이터는 분비된 CSF1이 3개의 GAPDH-표적화 CSF1 편집된 PSC 주 모두의 세포 배양 상청액에서 검출되었지만 편집되지 않은 PSC 주의 세포 배양 상청액에는 부재하였음을 입증한다. 이러한 결과는 GAPDH 유전자좌에 CSF1 작제물의 삽입이 편집된 PSC로 하여금 쉽게 검출 가능한 수준의 CSF1을 분비하도록 하였음을 나타낸다.
실시예 8: 분화된 PSC 내의 AAVS1 유전자좌에서 PD-L1의 트랜스진 침묵
[00147] 이 연구에서, 본 발명자는 AAVS1 세이프 하버 유전자좌에 PD-L1을 발현하는 작제물을 삽입하기 위해 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 사용하였다(도 20A). 삽입 작제물은 트랜스진 작제물의 발현을 유도하기 위해 외부 EF1a 프로모터를 포함하였다. 또한, 소분자 처리를 통해 증식하는 세포를 제거하도록 유도될 수 있는 자살 유전자인 HSV-TK는 P2A 서열에 의해 PD-L1에 연결되었고, 이는 P2A의 절단시 PD-L1 및 HSV-TK 둘 모두의 바이시스트론 발현을 허용한다. 삽입 작제물은 또한 내인성 AAVS1 유전자좌에 상동성인 서열을 보유하는 좌측 및 우측 상동성 아암과 측접하여 의도된 표적화 부위에서 작제물의 통합을 가능하게 하였다. 유세포 분석은 분화되지 않은 야생형 PSC 또는 분화되지 않은 AAVS1-표적화 PD-L1/HSV-TK 편집된 PSC에 대해 수행되었다(도 20B). 세포를 항-PD-L1 1차 항체로 염색하였다.
[00148] 데이터는 PD-L1/HSV-TK 편집물을 보유하는 대부분의 PSC(99.9%)가 유세포 분석에 의해 PD-L1을 발현하는 반면, 야생형 PSC는 PD-L1을 발현하지 않음을 입증한다. 두 PSC 라인 모두는 이후에 심근세포로 분화되고 항-PD-L1 1차 항체로 염색한 후 유세포 분석에 의해 분석되었다. 데이터는 PD-L1/HSV-TK 편집물을 보유하는 PSC의 49%만이 유세포 분석에 의해 PD-L1을 발현함을 입증한다. 이러한 결과는 AAVS1 유전자좌에 PD-L1/HSV-TK 작제물의 삽입이 PSC의 심근세포로의 계통-지시적 분화시 PD-L1 발현의 트랜스진 침묵을 초래함을 나타낸다. 유사한 트랜스진 침묵이 B2M 유전자좌에서 관찰되었다.
[00149] 결론적으로, 상기 데이터는 GAPDH, RPL13A 및 RPLP0 유전자좌가 그 안에 통합된 다양한 트랜스진의 지속된 높은 수준의 발현을 허용함을 보여준다. 본 발명자의 데이터는 또한 일반적으로 사용되는 AAVS1 및 B2M 유전자좌에 통합된 트랜스진(예를 들어, PD-L1을 인코딩하는 것)이 일단 세포가 PSC에서 심근세포로 분화되면 편집된 세포에서 그 발현을 상실하였음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> BLUEROCK THERAPEUTICS LP <120> CELLS WITH SUSTAINED TRANSGENE EXPRESSION <130> 025450.WO009 <140> <141> <150> 62/913,062 <151> 2019-10-09 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 tggacctgac ctgccgtcta 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 ccccagaccc tagaataaga cagg 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 aacagttgca ttatgatatg cccag 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 tgctttcaag caacttcggg a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of 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atggatatga gagtgcctgc ccaacttctc ggactgctgc tgctttggct tagaggtgca 60 agatgcgaca ttgtgctgac acagtctcct gcttccttag ctgtatctct gggacagagg 120 gccaccatct catgcagggc cagccaaagt gtcagtacat ctagatatag ttatatacac 180 tggtaccaac agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tcaagtatgc atccaaccta 240 gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 300 atccatcctc tggaggagga ggatgctgca acatattact gtcaccacag ttgggagatt 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaat ccggtggagg cggttcaggc 420 ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggaa gtgaaggttg aggagtctgg aggaggcttg 480 gtgcaacctg gaggatccat gaaactctcc tgtgttgtct ctggattcac tttcagtaac 540 tactgggtga actgggtccg ccagtctcca gagaaggggc ttgagtgggt tgctcaaatt 600 agattgaaat ctgataatta tgcaacacat tatgaggagt ctgtgaaagg gaggttcacc 660 atctcaagag atgattccaa aagtagtgtc tatctgcaaa tgaacaacct aagggctgaa 720 gacagtggaa tttattactg cactaactgg gaagactact ggggccaagg caccactctc 780 acagtctcct catacccata cgatgttcca gattacgct 819 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza 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agaggccaga cctgcgtggt gcactatacc ggcatgctgg aggacggcaa gaagttcgac 120 agcagccgcg accgcaataa gcccttcaag ttcatgctgg gcaagcagga ggtgatcaga 180 ggctgggagg agggcgtggc ccagatgagc gtgggccaga gagccaagct gaccatcagc 240 cccgactacg cctatggcgc caccggccac cccggcatca tcccacccca cgccaccctg 300 gtgtttgatg tggagctgct gaagctggag tccggaggcg gctccggcgt ggatggcttc 360 ggcgacgtgg gagccctgga gagcctgaga ggcaacgccg atctggccta catcctgagc 420 atggagccct gtggccactg cctgatcatc aacaacgtga acttctgccg ggagagcggc 480 ctgcggaccc ggaccggcag caacatcgac tgcgagaagc tgaggaggcg cttctcctcc 540 ctgcacttta tggtggaggt gaaaggcgat ctgactgcca agaaaatggt gctggccctg 600 ctggagctgg cccagcagga ccacggagcc ctggattgct gtgtggtggt gatcctgtcc 660 cacggctgcc aggccagcca cctgcagttc cccggagccg tgtacggcac cgacggctgt 720 cccgtgtccg tggagaagat cgtgaacatc ttcaacggca cctcctgccc ctccctgggc 780 ggcaagccca agctgttctt tatccaggcc tgtggcggcg agcagaagga ccacggcttt 840 gaggtggcca gcacctcccc cgaggacgag agcccaggca gcaaccccga gcccgacgcc 900 acccccttcc 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caaccaaaga 420 attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480 cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540 accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600 acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660 acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720 ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780 ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840 aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taacccctct ccctcccccc cccctaacgt 900 tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac 960 catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag 1020 cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa 1080 ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag 1140 gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga 1200 tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag 1260 agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc 1320 ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag 1380 gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 1440 tgataatatg gccacaacca tggccagcta cccctgtcac cagcacgcca gcgccttcga 1500 ccaggccgcc agaagcaggg gccacagcaa ccggcggacc gccttaagac ccaggcggca 1560 gcaggaagcc accgaagtcc ggctggaaca gaagatgccc accctgctgc gggtgtacat 1620 cgacggcccc cacggcatgg gcaagaccac caccacccag ctgctggtgg ccctgggcag 1680 ccgggacgac atcgtgtacg tgcccgagcc catgacctac tggcaggtgc tgggcgccag 1740 cgagaccatc gccaacatct acaccacaca gcacaggctg gaccagggcg agatctctgc 1800 cggcgacgcc gccgtggtga tgaccagcgc ccagatcaca atgggcatgc cctacgccgt 1860 gaccgacgcc gtgctggccc ctcacgtggg cggcgaggcc ggctctagcc acgcccctcc 1920 ccctgccctg accctgatct tcgaccggca ccccatcgcc cacctgctgt gctaccctgc 1980 cgccagatac ctgatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggccttcg tggccctgat 2040 cccccccacc ctgcccggca ccaacatcgt gctgggagcc ctgcccgagg accggcacat 2100 cgaccggctg gccaagcggc agagacccgg cgagcggctg gacctggcca tgctggccgc 2160 catccggcgg gtgtacggcc tgctggccaa caccgtgaga tacctgcagg gcggagggtc 2220 ttggtgggag gactggggcc agctgtccgg caccgccgtg ccacctcagg gcgccgagcc 2280 ccagagcaat gccggccctc ggccccacat cggcgacacc ctgtttaccc tgttcagagc 2340 ccccgagctg ctggccccca acggcgacct gtacaacgtg ttcgcctggg ccctggacgt 2400 gctggccaag aggctgcggc ccatgcacgt gttcatcctg gactacgacc agagccctgc 2460 cggctgcagg gacgccctgc tgcagctgac cagcggcatg gtgcagaccc acgtgaccac 2520 ccccggcagc atccccacca tctgcgacct ggcccggacc ttcgcccggg agatgggcga 2580 ggccaacgga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggcg acgtggagga 2640 gaaccctgga cctatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 2700 cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 2760 cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 2820 cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 2880 gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 2940 cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 3000 ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 3060 caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 3120 gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 3180 caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 3240 gcccggtgcc tga 3253 <210> 26 <211> 2599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 26 atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60 ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120 tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180 aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240 tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300 gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360 agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg 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<400> 28 atgaccgcgc cgggcgccgc cgggcgctgc cctcccacga catggctggg ctccctgctg 60 ttgttggtct gtctcctggc gagcaggagt atcaccgagg aggtgtcgga gtactgtagc 120 cacatgattg ggagtggaca cctgcagtct ctgcagcggc tgattgacag tcagatggag 180 acctcgtgcc aaattacatt tgagtttgta gaccaggaac agttgaaaga tccagtgtgc 240 taccttaaga aggcatttct cctggtacaa gacataatgg aggacaccat gcgcttcaga 300 gataacaccc ccaatgccat cgccattgtg cagctgcagg aactctcttt gaggctgaag 360 agctgcttca ccaaggatta tgaagagcat gacaaggcct gcgtccgaac tttctatgag 420 acacctctcc agttgctgga gaaggtcaag aatgtcttta atgaaacaaa gaatctcctt 480 gacaaggact ggaatatttt cagcaagaac tgcaacaaca gctttgctga atgctccagc 540 caagatgtgg tgaccaagcc tgattgcaac tgcctgtacc ccaaagccat ccctagcagt 600 gacccggcct ctgtctcccc tcatcagccc ctcgccccct ccatggcccc tgtggctggc 660 ttgacctggg aggactctga gggaactgag ggcagctccc tcttgcctgg tgagcagccc 720 ctgcacacag tggatccagg cagtgccaag cagcggccac ccaggagcac ctgccagagc 780 tttgagccgc cagagacccc agttgtcaag gacagcacca tcggtggctc accacagcct 840 cgcccctctg tcggggcctt caaccccggg atggaggata ttcttgactc tgcaatgggc 900 actaattggg tcccagaaga agcctctgga gaggccagtg agattcccgt accccaaggg 960 acagagcttt ccccctccag gccaggaggg ggcagcatgc agacagagcc cgccagaccc 1020 agcaacttcc tctcagcatc ttctccactc cctgcatcag caaagggcca acagccggca 1080 gatgtaactg gtaccgcctt gcccagggtg ggccccgtga ggcccactgg ccaggactgg 1140 aatcacaccc cccagaagac agaccatcca tctgccctgc tcagagaccc cccggagcca 1200 ggctctccca ggatctcatc actgcgcccc cagggcctca gcaacccctc caccctctct 1260 gctcagccac agctttccag aagccactcc tcgggcagcg tgctgcccct tggggagctg 1320 gagggcagga ggagcaccag ggatcggagg agccccgcag agccagaagg aggaccagca 1380 agtgaagggg cagccaggcc cctgccccgt tttaactccg ttcctttgac tgacacaggc 1440 catgagaggc agtccgaggg atccttcagc ccgcagctcc aggagtctgt cttccacctg 1500 ctggtgccca gtgtcatcct ggtcttgctg gccgtcggag gcctcttgtt ctacaggtgg 1560 aggcggcgga gccatcaaga gcctcagaga gcggattctc ccttggagca accagagggc 1620 agccccctga ctcaggatga cagacaggtg gaactgccag tgtag 1665

Claims (26)

  1. 게놈 내의 지속된 트랜스진 발현 유전자좌(STEL)에 트랜스진을 포함하는 유전적으로 변형된 포유동물 세포로서, 상기 트랜스진이 검출 가능한 수준으로 발현되고, 선택적으로 상기 포유동물 세포가 인간 세포인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 트랜스진의 발현 수준이 (i) 5회 이상, 10회 이상 또는 15회 이상의 계대에 걸쳐, 또는 (ii) 세포 상태가 변함에 따라 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하로 변하며, 상기 세포 상태가 선택적으로 만능성 및/또는 분화의 상태인 유전적으로 변형된 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, STEL이 표 1에 열거된 유전자좌로부터 선택되는 유전적으로 변형된 세포.
  4. 제3항에 있어서, STEL이 표 1에 개시된 대로 3.30 초과, 3.50 초과, 3.75 초과, 4.00 초과, 4.10 초과, 4.20 초과, 4.30 초과, 4.50 초과, 4.60 초과, 4.70 초과의 평균 표준화된 발현을 갖는 유전자좌인 유전적으로 변형된 세포.
  5. 제3항에 있어서, STEL이 리보핵단백질 복합체 형성, 국소 접착, 세포-기질 부착 접합, 세포-기질 접합, 세포 고정, 세포외 엑소솜, 세포외 소포, 세포내 소기관, 고정 접합, RNA 결합, 핵산 결합(예를 들어, rRNA 또는 mRNA 결합) 및 단백질 결합 중 하나 이상과 관련된 단백질을 인코딩하는 유전자에 있는 유전적으로 변형된 세포.
  6. 제3항에 있어서, STEL이
    리보솜 단백질을 인코딩하는 유전자, 선택적으로 (i) RPL13A, RPLP0, RPL10, RPL13, RPS18, RPL3, RPLP1, RPL15, RPL41, RPL11, RPL32, RPL18A, RPL19, RPL28, RPL29, RPL9, RPL8, RPL6, RPL18, RPL7, RPL7A, RPL21, RPL37A, RPL12, RPL5, RPL34, RPL35A, RPL30, RPL24, RPL39, RPL37, RPL14, RPL27A, RPLP2, RPL23A, RPL26, RPL36, RPL35, RPL23, RPL4 및 RPL22로부터 선택되는 RPL 유전자; 또는 (ii) RPS2, RPS19, RPS14, RPS3A, RPS12, RPS3, RPS6, RPS23, RPS27A, RPS8, RPS4X, RPS7, RPS24, RPS27, RPS15A, RPS9, RPS28, RPS13, RPSA, RPS5, RPS16, RPS25, RPS15, RPS20 및 RPS11로부터 선택되는 RPS 유전자;
    MT-CO1, MT-CO2, MT-ND4, MT-ND1 및 MT-ND2로부터 선택적으로 선택되는 미토콘드리아 단백질을 인코딩하는 유전자;
    ACTG1 및 ACTB로부터 선택적으로 선택되는 액틴 단백질을 인코딩하는 유전자;
    EEF1A1, EEF2 및 EIF1로부터 선택적으로 선택되는 진핵생물 번역 인자를 인코딩하는 유전자;
    H3F3A 및 H3F3B와 같은 히스톤을 인코딩하는 유전자; 또는
    FTL, FTH1, TPT1, TMSB10, GAPDH, PTMA, GNB2L1, NACA, YBX1, NPM1, FAU, UBA52, HSP90AB1, MYL6, SERF2 및 SRP14로부터 선택되는 유전자인 유전적으로 변형된 세포.
  7. 제3항에 있어서, STEL이 GAPDH 유전자인 유전적으로 변형된 세포.
  8. 제3항에 있어서, STEL이 리보솜 단백질 유전자인 유전적으로 변형된 세포.
  9. 제8항에 있어서, STEL이 RPL13A, RPL7 및 RPLP0 유전자로부터 선택적으로 선택되는 리보솜 단백질 L(RPL) 유전자인 유전적으로 변형된 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포(PSC)인 유전적으로 변형된 세포.
  11. 제10항에 있어서, PSC가 인간 배아 줄기 세포(ESC) 또는 인간 유도된 PSC(iPSC)인 유전적으로 변형된 포유동물 세포.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 분화된 세포인 유전적으로 변형된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 분화된 세포가 인간 ESC 및 인간 iPSC로부터 선택적으로 선택되는 인간 PSC로부터 유래되는 유전적으로 변형된 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 분화된 세포가
    T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 억제성 T 세포, 골수성 세포, 수지상 세포 및 면역억제성 대식세포로부터 선택적으로 선택되는 인간 면역 세포;
    도파민성 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기아교 세포, 별아교세포, 피질 뉴런, 척추 또는 안구운동 뉴런, 장 뉴런, 기원판-유래 세포, 슈반 세포, 및 삼차 또는 감각 뉴런으로부터 선택적으로 선택되는 인간 신경계의 세포;
    심근세포, 내피 세포 및 결절 세포로부터 선택적으로 선택되는 인간 심혈관계의 세포;
    간세포, 담관세포 및 췌장 베타 세포로부터 선택적으로 선택되는 인간 대사 시스템의 세포, 또는
    망막 색소 상피 세포, 광수용기 원추 세포, 광수용기 간상 세포, 양극성 세포 및 신경절 세포로부터 선택적으로 선택되는 인간 안구 시스템의 세포인 유전적으로 변형된 포유동물 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 유전자좌의 3' 비번역 영역에 삽입되는 유전적으로 변형된 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진 서열이 자가-절단 펩티드에 대한 코딩 서열을 통해 STEL 유전자 서열에 인 프레임으로 연결되거나, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 통해 STEL 유전자 서열에 연결되는 유전적으로 변형된 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 치료 단백질, 면역조절성 단백질, 리포터 단백질 또는 안전 스위치 신호를 인코딩하는 유전적으로 변형된 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈이, 선택적으로 게놈의 STEL 유전자좌에 외인성 자살 유전자를 추가로 포함하고, 상기 외인성 자살 유전자가 일단 활성화되면 세포의 아폽토시스를 유발하는 유전적으로 변형된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 자살 유전자가 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자인 유전적으로 변형된 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 세포를 환자에게 도입하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 세포가 인간 세포인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인간 환자가
    이식편 이식을 필요로 하거나,
    염증, 선택적으로 신경염증, 자가면역 질환 또는 암을 갖는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항의 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포.
  24. 제21항 또는 제22항의 방법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포의 용도.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서,
    배양된 포유동물 세포를 제공하고,
    트랜스진을 상기 배양된 세포의 게놈 내의 STEL 부위에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 도입 단계가 CRISPR 유전자 편집을 통해 수행되는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022251443A1 (en) * 2021-05-26 2022-12-01 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods to prevent rapid silencing of genes in pluripotent stem cells
WO2023212722A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Bluerock Therapeutics Lp Novel sites for safe genomic integration and methods of use thereof
WO2024163957A1 (en) * 2023-02-02 2024-08-08 Senti Biosciences, Inc. Sustained transgene expression of modified ert2 peptide-suicide protein fusion polypeptides
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Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6166900B2 (ja) 2009-08-24 2017-07-19 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨンＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 実質的に純粋なヒト網膜前駆細胞培養物、前脳前駆細胞培養物、網膜色素上皮細胞培養物、及び、それらの製造方法
WO2013056072A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
SG11201408626YA (en) 2012-07-03 2015-03-30 Univ Washington Antibodies to tau
WO2016074016A1 (en) * 2014-11-10 2016-05-19 Murdoch Childrens Research Institute Vectors and methods for targeted integration in loci comprising constitutively expressed genes
WO2016090470A1 (en) * 2014-12-08 2016-06-16 Brian Chen Cleavable nucleic acid linkers for protein quantification ratioing
MA41451A (fr) 2015-02-04 2017-12-12 Univ Washington Constructions anti-tau
US10561687B2 (en) 2015-02-17 2020-02-18 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes
KR20180042437A (ko) 2015-09-08 2018-04-25 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 임상 등급 망막 색소 상피 세포의 재현성 있는 분화 방법
LT3347457T (lt) 2015-09-08 2022-02-10 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Tinklainės pigmento epitelio ląstelių, kilusių iš kamieninių ląstelių, valymas macs metodu
CA3045182A1 (en) 2016-12-04 2018-06-07 University Health Network Generating atrial and ventricular cardiomyocyte lineages from human pluripotent stem cells
CA3097428A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Method for differentiation of ocular cells and use thereof

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