JPH0818973B2 - 脱水リポソ−ム - Google Patents

脱水リポソ−ム

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JPH0818973B2
JPH0818973B2 JP60503630A JP50363085A JPH0818973B2 JP H0818973 B2 JPH0818973 B2 JP H0818973B2 JP 60503630 A JP60503630 A JP 60503630A JP 50363085 A JP50363085 A JP 50363085A JP H0818973 B2 JPH0818973 B2 JP H0818973B2
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liposome
liposomes
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vesicles
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キユリス，ピーター，アール
バリー，マルセル，ビー
フアウンテイン，ミカエル，ダブリユ
ギンスバーグ，リチヤード，エス
ホープ，ミカエル，ジエイ
マツデン，トーマス，デイー
シーレン，ヒユー，ピー
ヤブロンスキー，レジナ，エル
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ザ リポソ−ム，カムパニ−，インコ−ポレ−テツド
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景技術 1.発明の技術分野 本発明は、リポソームに関し、特により長い期間貯蔵
され、その後使用される時および場所で再水和可能な脱
水リポソームに関する。
2.従来技術 技術上周知であるが、リポソームは、水性相の芯を囲
む少なくとも一つの脂質二重層膜を有する閉じたベシク
ル類（小胞体）である。リポソームの初期の使用方法の
一つは、薬剤類、化粧品類、診断試薬類、生物活性化合
物類等の種々な物質担体としてである。
これら使用方法の各々に関して、リポソームの運搬す
る選ばれた物質をリポソームから本質的に漏出させるこ
となく、長期間リポソームを貯蔵することが重要であ
る。特に、商業上の環境で有効であるために、リポソー
ム製剤は、中間および最終使用者により種々の温度条件
下で簡単に製造され、船で運ばれかつ貯蔵されるように
十分に長い保存寿命を有するべきである。
特に薬剤工業においては、製薬業者が最終的に彼ら自
身の施設で彼ら自身の薬剤を負荷することが可能な、薬
剤を負荷していないリポソームを製薬業者に提供するこ
とも重要である。そのような二段階または二つの工場を
用いる方法（すなわち、最初の施設で無負荷リポソーム
を製造し、そして第２の施設で負荷を行なう）は、製薬
業者に供給者から規格化された商品（defined commodit
y）、すなわち無負荷リポソームを購入し、そしてその
商品を最終製品のための既製成分として使用することを
可能にするであろう。
製薬業者は、最近では、製薬業者自身で業務を行なう
ため、彼らは供給者から規格化された商品を購入し、そ
して彼ら自身の施設で最終製品を組み立てることを強く
好んでいる。この方法によれば、製薬業者は個々に最終
製品の品質を制御できる。若し、リポソームが規格化さ
れた商品として製薬業者に供給されるのであれば、薬剤
産業によるリポソーム技術の使用は著しく高められるで
あろう。
今日まで、リポソーム製剤は、一般に相対的に保存寿
命が短かった。その上、ある時点でリポソームを調製
し、その後、時間的に非常に遅れた時点で選択された物
質をリポソームに充填する方法は知られていなかった。
本発明は、今日の技術状態におけるこれらの欠点を補う
ものである。
発明の要約 上記技術状態に鑑み、本発明の目的は、リポソームか
ら内部の被包性物質を実質的に漏出させることなく、よ
り長期間貯蔵可能なリポソーム製剤を提供することにあ
る。
さらに、本発明の目的は、脱水、貯蔵および再水和工
程において実質的にその内部成分を損失することなく、
脱水され、脱水された間は長期間貯蔵され、その後使用
する時および場所において再水和可能なリポソーム製剤
を提供することになる。
さらに加えて、本発明の目的は、脱水され、脱水され
た間は長期間貯蔵され、再水和され、その後選択された
物質で充填することが可能なリポソーム製剤を提供する
ことにある。
これらおよびその他の目的を達成するために、本発明
は、その態様の一つに従って、一若しくはそれ以上の保
護糖類の存在下で脱水されたリポソーム製剤を提供す
る。本発明のある好適な実施態様において、リポソーム
類はリポソーム膜の内部および外部表面の両方に存在す
る一若しくはそれ以上の糖類と共に脱水される。他の好
適な実施態様において、糖類はトレハロース、マルトー
ス、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキス
トランから成る群から選ばれ、性能の点からも最も好ま
しい糖類はトレハロースおよびスクロースである。
脱水は、減圧下で行なわれ、かつリポソーム製剤の前
凍結ありまたはなしで実施される。
好ましくは、脱水前の製剤における初期水の少なくと
も約２％、最も好ましくは約２％〜約５％が脱水工程の
終点において製剤中に残存すべきである。これを脱水製
剤における脂質１モル当りのモル数で表せば、脱水製剤
において、好ましくは脂質１モル当り少なくとも約12モ
ルの水、および最も好ましくは脂質１モル当り約12〜約
35モルの水の水レベルに相当する。
本発明の他の態様によれば、予め製造されたリポソー
ムの後からの負荷（装填）は、適切な条件下で、これら
の膜を横切ることが可能な一若しくはそれ以上の荷電種
のリポソーム膜を横切る濃度勾配を作ることにより達成
される。この濃度勾配は、選ばれた荷電物質、すなわち
薬剤を膜間電位（transmembrane potential）をつくる
ことによってリポソーム内に負荷するために使用され
る。
リポソーム膜を横切る濃度勾配を有するリポソーム
は、上記のようにおよびさらに、詳しく下記に示すよう
に、一若しくはそれ以上の糖類の存在下で脱水状態で貯
蔵され次に再水和されそして荷電物質をリポソーム内に
負荷する膜間電位を作るために使用できることが明らか
と成った。一方、濃度勾配は、リポソーム類が脱水、貯
蔵、再水和された後に作ることができる。
本発明の前記および他の目的および有効性の達成は、
本発明の好適な実施態様の記載に関連して以下に十分に
記載されている。
図面の簡単な説明 第１図は、トレハロース濃度を関数として、脱水され
／水和されたベシクルによる22Na+の保存を示す。大き
なユニラメラ（unilamellar）ベシクルは、前凍結なし
で（白ぬき円）または液体窒素中で凍結後（白ぬき四
角）乾燥された。
第２図は、前凍結を行った後、脱水／再水和の前（第
２図ａ…比較例）と後（第２図ｂ…凍結乾燥）のベシク
ルの凍結破壊電子顕微鏡写真を示す。卵ホスファチジル
コリンベシクルは大きなマルチラメラベシクルを100nm
ポリカーボネートフィルターから押し出すことにより調
製された。ベシクル類は、250mMトレハロースの存在下
で脱水された。
第３図は、脱水前後の卵ホスファチジルコリンベシク
ルの凍結破壊電子顕微鏡写真を示す。ベシクルは、大き
なマルチラメラ（multilamellar）ベシクルを100nmポリ
カボネートフィルターから押し出すことにより調製され
た。第３図ａは脱水前のベシクルを示す。第３図ｂはト
レハロースを使用することなしに得られた大きな構造を
示す。第３図ｃおよび第３図ｄは各々50mMおよび125mM
トレハロースの存在下で脱水および再水和後のベシクル
を示す。第３図ｂの大きなリポソームの直径は、ほぼ90
0nmであり、図の右上部の矢印は影付の方法を示す。
第４図は、トレハロース濃度を関数として、3H−イヌ
リンの保持を示す。補足された3H−イヌリンを含有する
大きなユニラメラベシクルは、前凍結なしで高減圧下で
乾燥された。
第５図は、脱水され／再水和されたベシクルにより保
持された22Na+量についての塩化ナトリウム濃度の影響
を示す。ベシクルは、250mMトレハロースの存在下、高
真空下で24時間乾燥された。
第６図は、比較例ベシクル（四角形）および脱水され
／再水和されたベシクル（円形）に対してのpH勾配によ
って作られた膜間電位を示す。あらかじめ存在するプロ
トン勾配を有するベシクルは、４℃で24時間保持され
（対照）、または250mMのトレハロースの存在下、高真
空状態で同時間脱水された。ベシクルの再水和で観測さ
れた電位は、CCCP（プロトンイオノファ、イオン透過担
体）なしで（白ぬき円および四角形）、またはプローブ
3H−テトラフェニル−ホスホニウムブロマイドを使用し
て20μＭのCCCP（プロトンイオノファ、イオン透過担
体）の存在下（黒円および四角形）で測定された。CCCP
（プロトンイオノファ、イオン透過担体）の存在下およ
び存在しない状態でpH勾配してベシクルで観察された膜
間電位は、各々、黒の三角形、そして白ぬき三角形によ
り示される。
第７図は、対照ベシクル（四角形）および脱水され／
再水和されたベシクル（円形）により生み出された膜間
電位を示す。あらかじめ存在するNa+/K+勾配を有するベ
シクルは、４℃で24時間保持され（対照）、または250m
Mのトレハロースの存在下高真空状態で同時間脱水され
た。ベシクルの再水和で観察された電位は、バリノマイ
シン不存在下（黒円および黒四角形）、またはプローブ
3H−テトラフェニルホスホニウムブロマイドを使用して
0.5μg/μモルのリン脂質バリノマイシンの存在下（白
ぬき円および白ぬき四角形）で測定された。バリノマイ
シンの存在下および不存在で膜の両側にグルタミン酸カ
リウムを有するベシクルで観察された膜間電位は、各
々、白ぬきおよび黒三角形により示されている。
第８図は、アドリアマイシンを前もって乾燥されたベ
シクル内に負荷するための膜間電位の使用を示す。予め
存在するNa+/K+勾配を有するベシクルは、250mMトレハ
ロースの存在下24時間脱水された。再水和後、バリノマ
イシン（0.5μg/μモル リン脂質）の存在下（白ぬき
円形）、または不存在下（黒円形）でアドリアマイシン
を蓄積するベシクルの能力が測定された。上記と同期間
４℃に保持した対照小胞体を、バリノマイシンの存在下
（白ぬき四角形）または不存在下（黒四角形）で同様の
テストを行った。
第９図は、凍結融解マルチラメラベシクル（FATMLV
s）および安定プルリラメラベシクル（SPLVs）中のイヌ
リンの保持を、脱水工程の最後に製剤中に保有される最
初の水のパーセンテージの関数として示す。リポソーム
は、保護糖類の不存在下、減圧状態で乾燥された。本図
は本発明の参考例に関するものである。
好適な実施態様の記述 上記のごとく、本発明は、リポソームの内部含有量の
実質的な漏出なしで長期間貯蔵されるリポソームに関す
る。リポソームは、脱水状態で貯蔵され、その脱水は一
若しくはそれ以上の保護糖類の存在下で行なわれる。あ
るいは、脱水されたリポソームが脂質多重層を有するタ
イプからなり、そして実質的な膜部分が再水和でその完
全性を保有するために脱水を前凍結なしで、そして製剤
中に十分な水が残される終点まで行なうのであれば、保
護糖類の使用は省略してもよい。
脱水されるリポソームは、種々の成分および内部含有
成分を有することができ、ユニラメラのリポソームの形
態で、または、さらに一般的に、既知あるいは今後開発
される脂質−含有粒子であることができる。例えば脂質
含有粒子は、逆相蒸発、浸出液方法および界面活性剤希
釈のごとき多くのユニラメラリポソーム（LUV）生産用
に使用される技術をリポソームを生産するために使用し
得る。リポソーム生産用のこれらおよび他の方法に関す
る概説は、リポソーム、マークジェイ．オストロ，イー
デー.,マーセル デッカー，インク.,ニューヨーク,198
3,チャプター１（Liposomes,Marc J.Ostro,ed.,Marcel
Dekker,Inc.New York,1983,Chapter 1）のテキスト中に
見出すことができ、その部分を参照されたい。同様に、
スゾーカ ジュニア等（1980）アン，レブ．バイオフィ
ズ．バイオエンジ.,９:467（Szoka.Ir.,etal.,（1980）
Ann.Rev.Biophys.Bioengr.,９:467）を参照されたい。L
UVs調製用の特に好ましい方法は、「ユニラメラベシク
ル製造用駆逐技術（Extrusion Technique for Producin
g Unilamellar Vesicles）」と称する1984年６月20日に
出願され、普通に譲渡されかつ同時係属している米国特
許出願第622690号（関連米国特許第5,008,050号参照）
に記載されており、その部分を参照されたい。
あるいは、リポソームは、上に引用した米国特許第4,
522,803号、4,588,578号および4,721,612号に記載され
た方法、または、同様に上に引用した米国特許第4,975,
282号に記載の凍結融解方法に従って生産される。同様
に、リポソーム自体を使用するよりむしろ、上に引用し
た米国特許第4,610,868号に記載の方法の如き、他の脂
質含有粒子が本発明の実施において使用され得る。さら
に、必要により、脱水されるリポソームまたは脂質含有
粒子は、「限定された粒径分布を有するリポソーム（Li
posomes Having Defined Size Distributions）」と称
する1984年６月20日に出願され、普通に譲渡されかつ同
時係属の米国特許出願第622502号の方法に付すことによ
り、より均一な粒径分布が得られる。その部分を参照さ
れたい。
リポソームは、好ましくは標準凍結乾燥装置またはそ
れと同等の装置を使用して脱水される。すなわち、好ま
しくは減圧下で脱水される。必要により、リポソームお
よびその外部媒体は、脱水前に液体窒素中で凍結され得
る。あるいは、全く驚くべきことであるが、リポソーム
は、単に減圧下に置かれることにより、前凍結なしでも
脱水され得る。前凍結なしの脱水は、前凍結した脱水よ
りも長くかかるが、凍結ステップが無いと全プロセスよ
り穏やかであり、かつ一般にリポソームの損害がより少
なく、それに対応してリポソームの内部含量の損失が少
ない。例えば、室温および水銀の1mmオーダーの圧力を
生み出すことが可能な真空ポンプにより与えられた減圧
下で前凍結することなく行なう脱水は、ほぼ24〜36時間
かかる、一方向条件下の前凍結した脱水は、ほぼ12〜24
時間かかる。
リポソームが、その内部含有物の実質的な部分を漏出
することなく脱水工程を完了するために、この系の水が
除去されるときにリポソーム膜と相互作用し、かつ該リ
ポソーム膜を完全な状態としておくように、一もしくは
それ以上の糖類を使用できることが重要である。トレハ
ロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクト
ースおよびデキストランの如く糖類を含む種々の糖類が
使用できる。一般に、二糖類に関してはトレハロースお
よびスクロースが最も有効であった。他のさらに複雑な
糖類も使用され得る。例えば、ストレプトマイシンおよ
びジヒドロストレプトマイシンを含むアミノグリコシド
糖が脱水中リポソームを保護することが見出された。
一若しくはそれ以上の糖類は、糖類がリポソーム膜の
内表面および外表面との両面と相互作用することが可能
であるので内部媒体および外部媒体の両媒体中に含まれ
る。内部媒体中に包含することは、リポソームが被包す
る溶質中に糖または糖類を加えることにより達成され
る。大部分の場合にこの溶質が、最終的なリポソーム用
の浴媒体をも形成するので、溶質中への糖類の包含は、
同様に外部媒体部分とする。もちろん、もし初期溶質と
異なる外部媒体が、例えば膜間電位を作るために使用さ
れると（下記参照）、新しい外部媒体も一若しくはそれ
以上の保護糖類を含有すべきである。
使用される糖の量は、使用された糖のタイプおよび保
護すべきリポソームの特性に依る。下記例１−５に示さ
れるように、当業者は、特定のリポソーム製剤に最も良
く作用する組み合わせを決定するために各種糖類および
濃度をテストできる。一般に、10mMおよび以上のオーダ
ーの糖濃度が最も高い保護レベルを達成するために必要
であることが見い出された。膜リン脂質の観点からすれ
ば、100mMオーダーのミリモルレベルはリン脂質１モル
当りほぼ５モルの糖に対応する。
リポソームがいったん脱水されれば、使用されるまで
の拡大された期間の間貯蔵され得る。貯蔵用の適切な温
度は、リポソームの組成およびカプセル化された物質の
温度感度による。例えば、技術上周知であるが、種々の
薬剤が熱に不安定であり、そのような薬剤含有脱水リポ
ソームは、薬剤がその効力を失なわないように冷蔵条件
下で貯蔵すべきである。同様に、かかる薬剤にとって脱
水工程は室温よりも、いくぶん低温で実施されることが
好ましい。
脱水リポソームが使用されるとき、再水和は、単に水
溶液、例えば蒸留水をリポソームに加え、そしてそれら
を再水和させることにより達成される。リポソームは、
溶液を徐々に渦巻かせることにより水溶液中に再懸濁さ
せられる。再水和は、室温、またはリポソームの組成お
よびその内部含有物に適した温度で行なわれる。
上記のごとく、ある種の適用、例えば薬剤投与では、
リポソーム調製方法とリポソーム負荷方法を分けること
ができることが好ましい。このことは、予備成形された
イポソームの膜を横切る膜間電位を作り、かつその膜間
電位を使用して荷電された物質、例えば薬剤をリポソー
ム中に負荷することにより達成され得る。膜間電位は、
リポソーム膜を横切る一若しくはそれ以上の荷電種（例
えば、K+および／またはH+）用の濃度勾配を作ることに
より生成される。濃度勾配は、異種の内部媒体および外
部媒体、すなわち一若しくはそれ以上の荷電種の異なる
濃度を有する内部媒体および外部媒体を有するリポソー
ムを生産することにより作られる。
具体的には、一若しくはそれ以上の荷電種の第一の濃
度を有する第一媒体をカプセル化するリポソームが調製
される。典型的なリポソーム調製技術（上記を参照され
たい）において、この第一媒体はリポソームが形成され
るときにリポソームを囲むので、このようなリポソーム
の最初の外部媒体は第一媒体と同一組成を有することに
なる濃度勾配を作るために最初の外部媒体は、一若しく
はそれ以上の荷電種の異なる濃度を有する新しい外部媒
体により置き換えられる。外部媒体の置き換えは、リポ
ソーム製剤を新しい媒体で平衡にされたゲル濾過カラ
ム、例えばセファデックス（Sephadex）カラムを通過さ
せ、または遠心分離、透析または関連した技術の如き各
種技術により達成し得る。
リポソーム膜の透過性により、濃度勾配に対する十分
な膜間電位が自然に形成し、または透過増強剤、例えば
バリノマイシンの如きイオン透過担体が浴媒体に加えら
れなければならない（必要により、クロマトグラフィー
または他の技術を使用して負荷を完成させた後、透過増
強剤は製剤から除去され得ることに注意されたい。）。
いずれの場合も、ネルンスト（Nernst）式により規定さ
れた強度を有する膜間電位は、リポソーム膜を横切って
生ずるであろう。この膜間電位が、荷電物質、例えば荷
電製剤をリポソーム内に負荷せしめる。特に、膜間電位
は、リポソーム内部電位に反対の荷電を有するこれらの
物質をリポソーム内に蓄積させるであろう。このよう
に、外部媒体に負荷したい物質を加えることにより、そ
して濃度勾配およびこのような適切な配向性を有する膜
間電位を選ぶことにより、リポソーム負荷はリポソーム
生成とは別操作として達成され得る。
膜間電位負荷およびリポソーム脱水の組合せは、最終
的な、負荷されたリポソーム生産のための全工程に非常
に大きな柔軟性（種々の選択性）を与えるものである。
例えば、同一内部媒体および外部媒体、すなわち膜間電
位を有しないリポソームが、調製、脱水、貯蔵、再水和
され、ついで該外部媒体が膜間電位すなわちリポソーム
を負荷するために使用される膜間電位を発生させる組成
を有する新しい媒体で置き換えられる。あるいは膜間電
位を生ずる内部媒体および外部媒体を有するリポソーム
が、調製、脱水、貯蔵、再水和され、ついで該膜間電位
を使用して負荷され得る。
いずれの場合も、脱水状態で無負荷リポソームは、貯
蔵、船で運搬その他簡単に取扱うことができる。特に、
脱水された無負荷リポソームは、製薬業者が好んで購入
し、このようなタイプのリポソーム製品用に長い間求め
られてきた需要を満足する（上記参照のこと）正にこの
タイプの規格化された商品である。
これらの膜間電位負荷および／またはリポソーム脱水
方法の特に重要な応用は、アドリアマイシン（下記例１
および６を参照されたい）の如き抗腫瘍性剤の投与分野
である。これの応用のさらなる議論は、「リポソームに
おける抗腫瘍性剤被包（Encapsulation of Antineoplas
tic Agents in Liposomes）」と1985年６月26日に出願
され、同時係属かつ普通に譲渡された米国特許出願第74
9161号［関連米国特許第4,880,635号参照］に見い出さ
れる。その部分を参照されたい。
本発明は次の例によりさらに詳しく説明されるが、本
発明はいかなる方法によってもそれに限定されることは
ない。
物質と方法 物質 卵ホスファチジルコリン（EPC）は標準的な方法（例
えば、シングルトン等、（1965）ジャーナル オブ ジ
アメリカンオイル ケミカル ソサイアティー 42:5
3（Singleton,et al.,（1965）Journal of the America
n Oil Chemical Society,42:53）を参照されたい）を使
用して単離され、TLCにより決定された純度99％以上で
あった。トレハロース、マルトース、スクロースおよび
フルコースを、シグマ ケミカル カンパニー（Sigma
Chemial Company）［セント ルイス、モンタナ（St.Lo
uis,MO.）から入手し、一方ラクトースをフィッシャー
サイエンティフィック カンパニー（Fisher Scienti
fic Company）［フェアーローン，ニュージャジー（Fai
rlawn,N.J）」から購入した。22Na+、3H−イヌリン、3H
−テトラフェニルホスホニウムブロマイドおよび3H−H2
Oを、ニュー イングランド ニュクリアー（New Engla
nd Nuclear）［ラチン，ケベック（Lachine,Quebec）］
から入手した。アドリアマイシンをアドエイア ラボラ
トリー（Adria Laboratory）［ミシザウガ，オンタリオ
（Mississauga,Ontario）］から入手した。
ベシクル製剤 ベシクルを、上記引用した米国特許出願第622690号
（関連米国特許第5,008,050号参照）および622502号記
載の押出し技術を使用して調製した。使用された技術の
完全な記載は、これらの出願に記載され、参考のためこ
こに導入記載されている。これらの技術により調製され
たベシクルを、ここれはETV、すなわちＥxtrusion Ｔe
chnique Ｖesicles（押出し技術ベシクル）と称する。
簡単に言えば、80μmoleの卵ホスファチジルコリンを
2mlの150mM NaCl、トレハロースまたは他の糖類の指示
された濃度を含有する20mMヘペス（HEPES））（pH7.4）
で水和した。脱水後、存在する残りの水を測定する場合
において3H−水（30μCi）をヘペス（HEPES）緩衝液／
糖液に加えた。22Na+（５μCi）または、3H−イヌリン
（５μCi;比活性409mCi/g）を水和前に乾燥脂質に加え
た。
混合物を渦巻かせることにより分散させ、その後17.5
8kg/cm2（250psi）の圧力を使用して細孔径100nmの二枚
の積層ポリカーボネートフィルター［ニュクレポアー，
インク.,プレザントン，シーエイ（Nuclepore,Inc.,Ple
asanton,CA］を10回通過させた。凍結−融解方法が使用
されるこれらの場合において、ベシクルを上記の如く調
製し、液体窒素を使用して一度凍結−融解し、その後、
再び繰り返して積層フィルターを通過させた。
ベシクルを22Na+除去用セファデックス（Sephadex）
Ｇ−50（微細）または3H−イヌリン除去用ウルトラゲル
（Ultragel）AcA34のいずれかのカラム（1.4×10cm）を
通過させることにより、未被包の22Na+または3H−イヌ
リンを除いた。この方法では、ミリリッター当り約20μ
moleリン脂質濃度を与えるためのサンプルのリン脂質濃
度を約50パーセントに希釈した。
脱水 バーティス フリーズ ドライヤー（Virtis Freeze
Drier）［ガーディナー ニューヨーク（Gardiner,n.
y.）］を使用して高真空下、室温で10mlカイメックス
（Kimex）管内でサンプル（1ml）を乾燥した。ある場合
には、サンプルは脱水前に液体窒素中で凍結させられ
た。いずれの場合にも、減圧脱水方法をほぼ24時間行な
った。
再水和 脱水および１〜７日間にわたる貯蔵後、サンプルを蒸
留水（900μｌ）で水和し、該ベシクルを緩やかな渦巻
き流により分散した。被包された22Na+、3H−イヌリン
またはベシクル内に残っているアドリアマイシンの量
を、被包されなかったいずれの物質をも除去するため、
ベシクルが懸濁させれているものと同一溶液で平衡にさ
れた、セファデックス（Sephadex）Ｇ−50（微細）また
はウルトラゲル（Ultragel）AcA34のカラム（1ml）に10
0μｌ一定量づつのベシクル懸濁液を通過させたのち、
下記記載の技術（「測定」の項を参照されたい）を使用
して測定した（さらに詳細には米国特許出願番号第6226
90号（関連米国特許第5,008,050号参照）。カラムは、
使用された少量のリポソームを捕捉し易いので、脱水／
再水和工程後保持された被包された物質の量として下記
に報告される値は、本発明の方法により実際に得られた
レベルより若干小さい。
凍結破壊電子鏡検法 凍結破壊用サンプルは、25％グリセロールを含み、そ
してバルツアー凍結破壊装置（Balzer freeze−fractur
e apparatus）を使用して、マデン，ティ．デー.,ホー
プ，エム，ジェイおよびガリス．ピー．アール（1983）
バイオケミストリー 22,1970−1974（madden,T.D.,Hop
e,M.J.and Gullis,P.R.（1983）Biochemistry 22.1970
−1974）の記載方法に従って破壊され、レプリカがとら
れた。
レプリカをフィリップス400電子顕微鏡（Phillips 40
0 electron microscope）で観察した。
準弾性光線分散測定法 ニーコムプ 200 レーザー粒子サイザー（Nicomp 20
0 Laser particle Sizer）［ニーコムプ インストルメ
ント，ゴレタ，シーエイ（Nicomp Instrument,Goleta,C
A）］をしようとして632.8nmおよび5mWの操作条件でベ
シクルの粒子を測定した。
測定 チェン等（1956）アナル．ケミー．28:1756（Chen,et
al.,（1956）Anal.Chem.28:1756）記載の無機リン測定
法によりリン脂質の量を測定した。0.5％トリトン（Tri
ton）Ｘ−100へのベシクルの溶解後、アドリアマイシン
消費量を480nmにおける吸収で測定した。3H−イヌリ
ン、3H−H2Oおよび3H−テトラフェニルホスホニウムを
フィリップス PW 4700液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、一方ベックマン ガンマ（Beckman Gamm
a）800のガンマ計量により22Na+の量を測定した。
例１ リポソームの脱水 保護糖トレハロースの使用 この例は、脱水および次の再水和工程において、リポ
ソームの内部含有物の実質的な損失なしにリポソームを
保護する糖、トレハロースの能力を示す。22Na+、3H−
イヌリンおよびアドリアマイシンの高い保有レベルを示
す実験を行なった。その結果を第１〜４図および第１表
に示す。
特に、卵ホスファチジルコリンETVsを上に記載したよ
うに22Na+および各種濃度のトレハロースを含有する溶
質溶液を使用して調製した。ETVを液体窒素中で前凍結
して、またはなしで脱水し、再水和しそして上記の如く
測定した。その結果を第１図に示す。
その図に示されるように、再水和後ベシクル中に保有
される22Na+量は、試験されたトレハロースの最も中い
濃度（500mM）で保有されているNaの90％まで、トレハ
ロース濃度に依存する。同様にその図に示されるよう
に、前凍結なしで脱水されたベシクルは、液体窒素中で
凍結されたものよりは多くの含有物を保有する。すなわ
ち、凍結なしのものの脱水は、凍結されたものの脱水よ
り全体に緩やかな方法である。
脱水／再水和におけるリポソーム保護のトレハロース
の能力は、前凍結して脱水／再水和前（第２図ａ…対
照）及び後（第２図ｂ…凍結緩衝）のリポソームを示す
凍結破壊電子顕微鏡写真図２により、さらに示される。
この場合のトレハロース濃度は250mMであった。この図
から明らかなように、リポソーム集合物の外観は、脱水
／再水和工程で本質的に無変化である、すなわち、トレ
ハロースがこの工程においてリポソームを十分に保護す
る。
溶質溶液中のどんなトレハロースも含まずに行なった
実験では、初期サンプルの乳白色（opalescent）の外観
に対して、再水和でミルク状の懸濁液を生じた。さら
に、未被包22Na+を取り除くため使用された1mlのセファ
デックス（Sephadex）カラムからのベシクルの回収が少
なかった（10％未満）ということは、リポソームが溶融
して大きな構造体を形成したことを示している。
第３図は、トレハロース濃度変化の効果を示す。第３
図ａは乾燥前のリポソーム、一方、第３図ｂはトレハロ
ースの不存在下における乾燥および再水和後のリポソー
ムを示す。これらの図から明らかであるが、最初のベシ
クルは、大きさが小さくかつ均一であり、一方脱水され
／再水和されたベシクルは、一般にさらに大きい。
第３図ｃおよび第３図ｄは、それぞれ50mMおよび125m
Mのトレハロースの存在下で乾燥および再水和されたリ
ポソームを示す。これらの図で示されるように、50mMの
トレハロースの存在下で乾燥され、その後再水和された
ベシクルは、一般に脱水前と同サイズであるが、大きな
構造体も少し観察される。125mM若しくはそれ以上のト
レハロース濃度では、脱水および再水和前後のベシクル
と識別できる構造上の違いはない。
トレハロース存在下で脱水されたベシクルがその含有
物を保有し、そして再水和で簡単に標識を再被包しない
ことを確認するために、ベシクルを250mMトレハロース
中で調製し、その後22Na+を外部媒体中に加えた。脱水
および再水和後、懸濁液の一定量を上記物質と方法で記
載した1mlのセファデックス（Sephadex）カラムを流下
させた。利用可能な22Na+の0.02％未満が再水和ベシク
ルにより捕捉されたということは、再水和では外部媒体
中の溶質が被包されないことが確認されたことを示す。
脱水ETVsのイヌリン（分子量5000）保有能力は、第４
図にトレハロース濃度関数として示される。この図と第
１図の比較では、同一トレハロース濃度において多くの
高分子量イヌリンが低分子量Naよりも保有されることが
示される。しかしながら、高トレハロース濃度において
その差が全く少なく、少量の各々の標識損失は、透過性
の変化というよりむしろベシクル破壊の結果であること
を示唆する。
トレハロース存在下で脱水された時に抗腫瘍薬剤アド
リアマイシンを保有するETVの能力は、第１表に示され
ている。この表中のデータは、次のようにして得られ
た：卵ホスファチジルコリンETVsを250mMのトレハロー
ス含有溶質溶液［169mM KGlu,20mMヘペス（HEPES）（p
H7.4）.40μmol脂質/ml］を使用して上記の如く調製し
た。次に外部Ｋ緩衝液をNa緩衝液［150mM NaCl,20mMヘ
ペス（HEPES）（pH7.4）,250mMトレハロース］で交換し
た。アドリアマイシン（200nmol/μmol脂質）を膜間電
位を引き起こすためにバリノマイシン（0.5μg/μmol）
とともに加えた。２時間の保温後、上記のNa緩衝液含有
トレハロースで平衡にしたセファデックス（Sephadex）
Ｇ−50カラムにベシクルを通過させることにより、未被
包のアドリアマイシンを除いた。ETVを前凍結すること
なく24時間脱水し、その後上記の如く再水和した。
脱水／再水和前後の両方でベシクル中に捕捉されたア
ドリアマイシン量を、ベシクルからの薬剤漏出割合と同
様に、未被包物質を全て除去するためにセファデックス
（Sephadex）Ｇ−50カラム（1ml）にベシクル懸濁液の1
00μｌ一定量を最初に通過させることにより測定した
（さらに詳細には米国特許出願第622690号（関連米国特
許第5,008,050号参照）。捕捉されたアドリアマイシン
の量を、（ベリクルを破壊し、捕捉された薬剤を開放す
る）0.5％トリトン（Triton）Ｘ−100とベシクル懸濁液
の一定量を混合し、パイユニカムSP8−200スペクトロホ
トメータ（Pye Unicam SP8−200 spectrophotometer）
を使用して480nmで吸収を監視しながら、測定した。こ
のカラムはそこに適用された少量のリポソームを捕捉し
易いので、脱水／再水和工程後に保持された被包物質量
の測定値は、実際に達成されたレベルより若干低い。
これらの実験結果を表１に示す。そこに示されるよう
に、90％の薬剤は、脱水および再水和の後に、すなわち
22Na+、3H−イヌリンで達成されたと同レベルに保有さ
れる。しかしながら、再水和されたベシクルからのアド
リアマイシンの漏出比率は脱水されなかったベシクルで
観察された割合に匹敵する（バレー等，（1985）バイオ
チム．バイオフィズ．アクタ.,812:66（Bally.et al.,
（1985）,Biochim.Biophys.Acta.,812:66）を参照され
たい）。
この例で明らかに示されているが、リポソーム内に被
包された90％以上の物質を再水和後にもさらに保持する
ため、糖、トレハロースは脱水および次の再水和におい
てリポソームを保護出来るものである。
例２ 保護糖に対しリポソーム膜の内部および外部両表面がさ
らされていること この例は、リポソーム膜の内部および外部両表面と接
触する保護糖（トレハロース）を有することによって高
められた保護効果を示す。
（ベシクルを形成するために使用された溶質溶液中に
トレハロースを含有することにより）膜の両側に、また
は（溶質溶液からトレハロースを除き、ベシクル形成後
外部媒体にトレハロースを加えることにより）膜の外側
にのみトレハロースを有するETVを調製した。ベシクル
を脱水し、72時間までの各時点において再水和し、保持
された22Na+レベルを測定した。その結果を、脱水後の
サンプル中に存在する残りの水量値と共に第２表に示
す。
この表に示されるように、保護糖が膜の両表面に存在
する時に最も強い保護が達成される。同様に、外表面の
みが保護糖にさらされる時には、ベシクルが受ける構造
損害はサンプル中に存在する残留水量に関係する。
例３ ベシクルサイズおよび塩濃度の効果 この例では、脱水および再水和においてベシクルを保
護するトレハロース能力に対する各種ベシクルサイズお
よび塩濃度の効果を記載する。
種々の大きさのETVを50nm〜800nmの細孔径を有するポ
リカーボネートフィルターを使用して生産した。ETVを
上記「物質と方法」に記載した凍結−融解サイクルに従
属させた。準弾性光線分散により測定された、得られた
ベシクルの平均直径を第３表に示す。
第３表のデータが、最も安定なベシクルは約170nmの
平均直径のものであろうということを示すが、より大き
なベシクルのマルチラメラ構造は、厳密な比較を困難に
している。
固定されたトレハロース濃度に対する内部および外部
媒体の塩濃度変化の効果を第５図に示す。そこに示され
るように、高塩濃度のベシクル中に保有された22Na+量
において小さいが重要な増加がある。
例４ 脱水中にベシクルを保護するトレハロースと他糖類の相
対能力 この例は、脱水中にベシクルを保護するトレハロース
および他糖類との相対能力を示す。
ベシクルを500mMのトレハロース、マルトース、ラク
トース、スクロースおよびグルコース中で調製し、脱水
および再水和後にベシクルによって保有される22Na+量
を測定した。表４に示されるように、トレハロースおよ
びスクロースが最も有効であり、マルトース、グルコー
スおよびラクトースがそれに続くものである。
例５（参考例） 保護糖ストレプトマイシンを使用するリポソームの脱水 この例は、脱水および次の再水和において内部含有物
を実質的に損失することなくリポソームを保護する糖、
ストレプトマイシンの能力を示す。3H−イヌリンの高保
有を示す実験を行なった。
特に、「単相で調製された脂質ベシクル（Lipid Vesi
cles Prepared in Monophase）」と称する1983年８月８
日に出願され同時係属かつ普通譲渡された米国特許出願
第521176号（米国特許第4,588,578号）に記載の如く卵
ホスファチジルコリン単相ベシクル（MPV）を調製し
た。この例に使用された技術の完全な記載は、その出願
に載っておりかつ本明細書に参考のために記載されてい
る。
簡単に云えば、127μmoleの卵ホスファチジルコリン
をベシクル製剤に使用した。3H−イヌリンおよび各種濃
度ストレプトマイシンを二価カチオンの欠如するリン酸
塩緩衝生理的食塩水水溶液（PBS）（pH7.3）に加え、MP
Vを形成した。MMPVを前凍結して脱水し、PBS中で再水和
し、そして上記の如き保有された3H−イヌリンを測定し
た。その結果を表５に示す。
この表に示されるように、再水和後ベシクル中に保有
される3H−イヌリン量は試験したストレプトマイシンの
最高濃度（568mM）において保有された86％のイヌリン
まで、ストレプトマイシン濃度に依存する。
ジヒドロストレプトマイシンを最終リポソームの内部
含有物の一部としてのみ含有させるためにジヒドロスト
レプトマイシン欠如のPBSでMPVの洗浄を行なう以外はス
トレプトマイシンを使用したと本質的に同一プロトコル
に従って、脱水／再水和の間にリポソームを保護するジ
ヒドロストレプトマイシンの能力を同様に試験した。こ
の場合、ジヒドロストレプトマイシン濃度が565mMで63
％の保有レベルが観察された。
例６ 膜間電位を使用する再水和リポソーム負荷 この例は次のことを示す： １）リポソーム膜を横切る濃度勾配を有するリポソーム
を保護糖の存在下で脱水し、濃度勾配ロスなしで再水和
出来る；そして ２）再水和後、荷電物質（薬剤アドリアマイシン）をリ
ポソーム中に負荷するため濃度勾配を使用できる。
グルタミン酸カリウム緩衝液（169mMグルタミン酸カ
リウム,250mMトレハロース,20mMヘペス（HEPES）,PH7.
4）中でETVを形成し、その後NaCl溶液であらかじめ平衡
にされたセファデックス（sephadex）Ｇ−50（微細）カ
ラム（1.4×10cm）中をベシクルを通過させることによ
りNaCl緩衝液（150mM NaCl,250mMトレハロース,20mMヘ
ペス（HEPES）,PH7.4）で外部緩衝液と置き換えること
により、ベシクル膜を横切るNa+−K+化学勾配を有する
ベシクルを調製した。使用されたバリノマイシン［シグ
マ，エスティ．ルイス，ミズーリ（Sigma,St.Lauis,Mis
souri）］をエタノール中に加えてリン脂質μmol当り濃
度を0.5μｇとした。
同様に、低pH緩衝液（135mMグルタミン酸,250mMトレ
ハロース，水酸化カリウム添加によりpH5.5にされた）
中でリポソームを調製し、その後セファデックス（seph
adex）Ｇ−50（微細）カラム上で、高pH緩衝液（125mM
グルタミン酸,30mM NaCl,250mMトレハロース，水酸化
カリウム添加によりpH7.5にされた）で交換し、膜間pH
勾配（内部酸）を形成した。使用に当ってはプロトンイ
オノフアCCCPを20μＭの最終濃度となるように加えた。
親油性カチオン3H−テトラフェニルホスホニウムブロ
マイド（3H−TPPB,NEN,カナダ）分布を測定することに
より、膜間電位を測定した。具体的には、１μｌエタノ
ール中の１μCiの3H−TPPBをETV分散液の１〜2mlサンプ
ルに加え、混合物を20℃で20分間保温した。一定量（10
0μｌ）を抜き出し、1mlの処理シリンジに充填されたセ
ファデックス（sephadex）Ｇ−50に該一定量試料を負荷
し、その後ベシクルを溶解させるために500gで３分間カ
ラムを遠心分離することにより、未捕捉3H−TPP+を除去
した。捕捉した3H−TPP+を液体シリンチレーションカウ
ンターで測定し、リン脂質をリン酸塩測定法で測定し
た。
ETV方法でETV中に捕獲された22Naまたは3H−イヌリン
量を測定することにより決定されたETV用の捕捉体積値
（リン脂質μmol当りμｌ）を使用して、ベシクル内部
［3H−TPP+］ｉおよび外部［3H−TPP+］ｏの3H−TPP+濃
度を計算し、そこからネルンスト（Nernst）式 Vm＝−591og［3H−TPP+］i/［3H−TPP+］ｏを使用して
膜間電位（Vm）を計算した。
Na+/K+およびpH勾配ベシクルの両者を、高真空下で24
時間脱水しその後再水和した。対照のベシクルを４℃で
24時間保持した。乾燥、再水和後イオン透過担体の存在
下または不存在下でこれらベシクルにより示された膜間
電位を、同様にイオン透過担体の存在下または不存在下
で対照で生じた膜間電位と比較した。その結果を第６図
（pH）および第７図に（Na+/K+）に示す。
これらの図から判るように、脱水されその後再水和さ
れたベシクルにより示された膜間電位は、対照により示
された膜間電位と本質的に同一である。唯一の明白な相
違は、pH勾配ベシクルの場合において脱水され／再水和
されたベシクルの膜間電位が対照ベシクルの膜間電位よ
り若干ゆるやかに展開していることである。
脱水および再水和後のカドリアマイシンを蓄積するNa
+/K+ベシクル能力をイオノフォアバリノマイシンの存在
下および不存在下で試験し、対照ベシクル、すなわち24
時間脱水したものではなく４℃で24時間貯蔵したベシク
ルにより示された蓄積と比較した。アドリアマイシンを
外部媒体中へ十分加えて、リン脂質１モル当り最終的に
0.2モル濃度のアドリアマイシンを負荷した。
これらの試験結果を第８図に示す。図面から判るよう
に、脱水され／再水和されたベシクルは、対照ベシクル
と本質的に同じ速度および同じ程度でアドリアマイシン
を蓄積する。
いかなる特別な作用理論によっても拘束されることを
望むものではないが、Na+/K+勾配に応答するアドリアマ
イシンの観測された捕捉に関係する機構の一つはリポソ
ーム膜のH+イオン透過性によるそのような勾配に応答し
て自動的に生み出されるpH勾配を含むであろう。この機
構に従って、アドリアマイシンは、無荷電状態で膜を通
過し、その内部および外部濃度は内部および外部H+イオ
ン濃度関数であり、内部H+濃度が高い時にアドリアマイ
シンの内部濃度が高く、その逆もまた同じことが言え
る。
要するに、この例は、ベシクルの後からの負荷が濃度
勾配および脱水／再水和方法の結合で達成され得ること
を示す。
例７（参考例） 前凍結なしで保護糖を使用することなく脂質多重層を有
するリポソームの脱水 この例は、保護糖を使用しなくても、脱水をリポソー
ムの前凍結なしで行ない、かつ実質的な膜部分が再水和
で完全性を保持するために製剤中に十分の水が残る終点
まで脱水を行なうならば、脂質多重層を有するリポソー
ムが脱水および次の再水和中に実質的な内容含有物を保
有することを示す。
リポソームの全てが脂質多重層を有する次タイプのリ
ポソーム：マルチラメラリポソーム（MLV）、安定プル
リラメラリポソーム（SMLV）および単相ベシクル（MP
V）を使用して実験した。SPLVおよびMPV生産用の好適な
技術の詳細な記載は、同時係属かつ普通譲渡された米国
特許出願第476496号（米国特許第4,522,803号）および
第521176号（米国特許第4,588,578号）にそれぞれ明ら
かであり、その関連部分を、参考のためにここに記載し
ている。MLV調製法の記載は、例えば、上に引用したザ
リポソームテキスト（マーク ジェイ．オストロ，イー
デー.,1983）［the Liposome text（Marc J.Ostro,ed.,
1983）］およびスゾーカ，ジュニア等参照（アン．レ
ブ．バイオフ．バイオエン.,1980）［Szoka,Jr.,et al.
reference（Ann.Rev.Biophys.Bioenngr.1980）］を含む
文献中に見出され、その関連部分を参考のためにここに
記載している。
使用された物質および実験プロトコールは次のようで
あった。シグマ ケミカル カンパニー（Sigma Chemic
al Company）から得た卵ホスファチジルコリン（EPC）
とトレハロース有りまたは無しのヘペスバッファー（He
pes buffer）（すなわち、20mMヘペス、150mM NaCl、p
H7.4…バッファー0;または20mMヘペス、150mM NaCl、2
50mMトレハロース、pH7.4…バッファー250）から３種類
のリポソームを得た。標準塩化ナトリウム溶液中の51Cr
O4 ＝［ニューイングランドニュクリアー（New England
Nuclear）］をトレーサーとして使用した。0.01mlのト
レーサーはほぼ500,000のcpmレベルを生じた。
３種類のリポソームの各々に対して、EPCをCHCl3（10
0mg/ml）に溶解し、3.14mlの得られた溶液をロートバッ
プ エバポレータ（Rotovap evaporator）を使用してガ
ラス製丸底フラスコ面に沈着させた。SPLVを得るため
に、0.01mlのトレーサー溶液を含む0.5mlのバッファー
０またはバッファー250のいずれかを加えたエーテル（1
0ml）中に、脂質を再溶解した。ソニケーター浴中でソ
ニケートしながら窒素流中でエーテルを除いた。4.5ml
のバッファー０またはバッファー250をその後加え、最
終脂質濃度62.8mg/mlとした。
MPVsを得るために、0.01mlのトレーサー溶液を含む0.
5mlのバッファー０またはバッファー250のいずれかを加
えた100％エタノール中で脂質を再溶解した。ロートバ
ップ エバポレータ（Rotovap evaporator）を使用して
55〜60℃でエタノールを蒸発させた。4.5mlのバッファ
ー０またはバッファー250をその後加えて最終脂質濃度6
2.8mg/mlとした。
5.0mlのバッファー０またはバッファー250を丸底フラ
スコに加えそしてサンプルをガラスビーズで約５分間渦
巻き攪拌することにより、MLVを得た。バッファーは0.0
1mlのトレーサー溶液を含んでいた。SPLVおよびMPVにつ
いては、その最終脂質濃度は62.8mg/mlであった。
（３種類のリポソームの各々は、１つがトレハロース
を有し残りがトレハロースを有しない）６種のリポソー
ムサンプルを調製し、約５分間渦巻き攪拌することによ
り丸底フラスコからそれらを除き、各サンプルをトーマ
ス（Thomas）12,000M.W.透析チューブ材料から成る透析
バッグに入れた。各バッグの放射能を計数し、トレーサ
ーがリポソームを取り囲む外部媒体から除かれたことを
示す安定なカウントが得られるまで、適切に、500mlの
バッファー０またはバッファー250に対してそのバッグ
を透析した。約24時間透析で安定なカウントに達するに
十分であることが判った。
前凍結することなく、バーティス フリーズ ドライ
ヤー（ガーディナー ニューヨーク［Virtis Freeze Dr
ier（Gardiner,N.Y.）］を使用して10mlカイメックス
（Kimex）管中で室温下、高真空下で24時間の間、1.0ミ
リリッターの各サンプルを乾燥した。トレハロースを含
有しないリポソーム製剤について以下に示す結果から明
らかなように、この期間およびこれらの条件下の脱水
が、保護糖を使用しなくてもその実質的なリポソーム膜
部分に再水和に対してその完全性を保有させるために十
分な残留水を含有する脱水化製剤を生じた。
脱水後、リポソームを0.9mlの蒸留水中に加え、必要
により、おだやかな渦巻き（swirling）または旋回（vo
rtexing）で徐々に再水和した。
再水和リポソームを上記タイプの透析バッグに移し、
その放射能を測定した。約18時間後、適切にバッファー
０またはバッファー250に対してバッグは透析され、そ
の放射能を再測定した。透析後のリポソームに保有され
た放射能量は、脱水／再水和工程を通じてリポソームが
保有可能な内部含有物量の測定として使用した。対照と
して、1.0ミリリットルの各サンプルを10mlのカイメッ
クス（Kimex）管に入れ、乾燥することなく24時間室温
に保ち、透析バッグに入れ、放射能を測定し、適切なバ
ッファーに対して透析し、その後放射能を測定した。
それらの実験結果は次のようであった。示された％
は、透析前の１分間あたりの計数に対する透析後の１分
間あたりの計数であり、カッコ内の数字は対照の値であ
る： ０バッファー 250バッファー MLV 91.9％（87.7％） 84.4％（100.1％） SPLV 85.1％（82.1％） 84.3％（94.2％） MPV 85.5％（90.1％） 75.9％（93.2％） これらの結果に示されるように、３種類のリポソーム
の各々の内部成分の80％以上がいかなる保護糖も使用す
ることなく脱水／再水和工程後に十分に保有された。し
かしながら、これらのタイプのリポソームにトレハロー
スを加えると、脱水／再水和工程後リポソーム中にとど
まる内部成分量は増加するというよりは減少した。
例８（参考例） 保護糖を使用しないリポソームの脱水： 好適な残留水レベルの定量 この例は、リポソーム製剤が保護糖を使用することな
く脱水されるときに、その製剤中の初期水の少なくとも
約２％、好ましくは約２％〜約５％が、リポソームの再
水和に対し実質的に内部含有物を保有させるために脱水
工程の終点において、その製剤中に留まるべきであるこ
とを示す。
安定なプルリラメラリポソーム（SPLV）および凍結お
よび融解マルチラメラベシクル（FATMLV）、その両者は
脂質多重層を有する、を使用して実験した。SPLV生産の
好適な技術の詳細な記載は、上に引用した米国特許出願
第476496号（米国特許第4,522,803号）に明らかであ
る。同様に、グルンナー等.,（1985）バイオケミストリ
ー，24:2833［Grunner et al.,（1985）Biochemistry,2
4:2833］を参照されたい。FATMLV生産用技術の記載は、
「改良された捕捉効率を有するマルチラメラリポソーム
（Multillamellar Liposomes Having Improved Trappin
g Efficiences）」と称する1985年７月５日に出願さ
れ、同時係属かつ普通譲渡された米国特許出願第752423
号（関連米国特許第4,975,282号）に見出すことがで
き、その関連部分が参考のためにここに記載されてい
る。
使用された物質および実験法は次のようであった。卵
ホスファチジルコリン（99％）をアバンチ ポーラー
リピッド社（バーミンガム，アラバマ）［Avanti Polar
Lipids,Inc.（Birmingham,Alabama）］から購入した［
14C］イヌリンおよび三重水素化された水をニューイン
グランド ニュクリアー［New England Nuclear（Bosto
n,Massachusetts）］から入手した。２チャンネル操作
用のベックマンLS6800液体シンチレーションカンウター
セットで、三重水素化された水および［14C］イヌリン
を計数した。全データはアイソトープ計数効率およびチ
ャンネルスピルオーバー用に集められた。
クロロホルム中の400μmoleの卵PCを100mlの丸底フラ
スコに加えることによりSPLVを調製した。ロートバップ
エバポレーター（Rotovap evaporator）を利用して約
２分間蒸発して大量の溶媒を除いた；脂質は乾燥しなか
った。10ミリリットルの無水ジエチルエーテル（ジェ
イ．ティ．ベーカー ケミカル社.,フィリップスバー
グ，ニュージャージー）（J.T.Baker Chemical CO.Phil
lipsburg,New Jersey）をフラスコに加え脂質を再溶解
させた。［14C］イヌリン（16.67μCi/ml,比活性2.4mCi
/g）および無標識イヌリンを含有する20mMヘペス（HEPE
S）（PH7.4）を有する0.3mlの等モル145mM NaCl/KClを
この溶液に加え、最終イヌリン濃度を0.3mlバッファー
当り1.42μmolイヌリンにした。サンプルを分散させる
ために１分間ソニケートし、その後、エーテル臭がもは
や検出できなくなるまでソニケートしながらN2でサンプ
ルを乾燥した。脂質を10mlのバッファー中で再懸濁し、
30mlコレックス（Colex）管に移した。
捕捉されなかった［14C］イヌリンを４回の洗浄／遠
心分離サイクルで除き、その遠心分離をJA−20ローター
を有するベックマンJ2−21遠心分離機で12,100×ｇで30
分間行なった。最初の洗浄を10mlのバッファーで、その
後の洗浄を20mlのバッファーで行なった。
最終洗浄上澄液をデカンテーションした後、ベシクル
ペレットを三重水素化された水（2.5μCi/ml,比活性1mC
i/g）を含有する5mlのバッファーで再懸濁させた。この
製剤中の脂質濃度を、製剤の測定された容積を使用され
た脂質量（400μmol）で割ることにより決定した。SPLV
リポソームの平均容積は6.01±0.04mlであり、6.65×10
-5mol脂質/mlの平均脂質濃度を生じた。
ベシクルを再懸濁するために使用された三重水素化さ
れたバッファーの放射能を測定したところ、5.55×106d
pm/ml（dpm＝１分間当りの壊変（disintegrations per
minute））であることが判った。脂質１モル当りの水の
モル数によって脱水された製剤中の残留水値を計算し得
るようにするために（下記参照）、バッファー中の水濃
度をdpm/ml値で割ることにより、このdpm/ml値をモルH2
O/dpm値に変換した。この目的のため、バッファーを純
水とみなし、その結果、水濃度は5.55×10-2mol H2O/ml
であた。モルH2O/dpm値は、1.00×10-8mol H2O/dpmであ
ると計算された。
三重水素化されたバッファー中で再懸濁後、三重水素
化された水を製剤全体に平衡にさせるために脱水前に室
温で少なくとも30〜60分間、製剤を保持した。
クロロホルム中の400μモルの卵PCを100mlの丸底フラ
スコに加えてFATMLVを調製した。デシケーター中高真空
下で２時間後、５分間回転することで溶媒を除いた（下
記、使用した特殊装置の記載の脱水に関する議論を参照
されたい）。
5mlの等モルの145mM NaCl/KClおよび［14C］イヌリ
ン（１μCi/ml,比活性2.4mCi/g）と最終イヌリン濃度を
1.08mMにするための無標識イヌリンを含有する20mMヘペ
ス（HEPES）（pH7.4）を脂質を水和した。
該混合物を渦巻き攪拌により分散し、一定量資料を1.
8mlヌンク クリオ チューブ（ヌンク，デンマーク）
［Nunc cryo tubes（Nunc,Denmark）］に移した。サン
プルを、５回、液体窒素中で十分に凍結し、温水中で融
解した。内容物をプールし、混合しそして30mlコーレッ
クス（Corex）管に移した。
攪拌されなかった［14C］イヌリンを各洗浄に20mlの
バッファーを使用して４回の洗浄／遠心分離により除去
した。遠心分離はSPLV用に上に記載した方法により行な
われた。
最終洗浄上澄液をデカンテーションした後、SPLVを再
懸濁するために使用したと同じ5mlの三重水素化された
水でベシクルペレットを再懸濁させた。三重水素化され
た水を製剤全体に平衡にさせるため脱水前に少なくとも
30〜60分間、最終製剤を保持した。SPLV実験と同様にし
て、製剤の測定容積を使用された脂質量（400μmol）で
割ることにより製剤中の脂質濃度を決定した。この場
合、平均容積が7.13±0.06mlであり、5.60×10-5mol脂
質/mlの平均脂質濃度であった。
再懸濁SPLVおよびFATMLVの一定試料の三重水素化され
た水による放射能を測定し、SPLV懸濁液については4.18
×106±1.49×105dpm/mlの平均値、FATMLV懸濁液につい
ては3.60×106±1.41×105dpm/mlの平均値を得た。ベシ
クルのないバッファーについて測定した1.00×10-8mol
H2O/dpm値を使用して、これらの放射能値をSPLV懸濁液
およびFATMLV懸濁液の水濃度に変換した。具体的には、
SPLV懸濁液については4.18×10-2mol H2O/mlの水濃度、
FATMLV懸濁液については3.60×10-2mol H2O/mlの水濃度
が計算された。下記の如く、上で与えられた脂質濃度と
共にこれらの値は、脂質１モル当りの水モル数によっ
て、脱水された製剤中の残留水値を計算するために使用
された。
三重水素化された水による再懸濁化製剤の放射能の測
定に加えて、［14C］イヌリンによる放射能も測定し
た。
その後、製剤を脱水した。具体的には、多数のサンプ
ルをピペットで30mlコーレックス（Corex）管にはかり
とり（管あたり約1mlの懸濁液）、懸濁液と管の両者を
加えた重量を記録した。３×10-4Torrの最大部分圧力お
よび1271/分の排気能力を有するモデルD4Aマシキマ真空
ポンプ（フィシャー サイエンティフィック，フェアロ
ーン，ニュージャージー）［model D4A Maxima Vacuum
Pump（Fisher Scientific,Fairlawn,N.J.）］を用いる
高真空下、室温でサンプルを乾燥した。
サンプルを種々の時点で取り出し、蒸留水でその前−
脱水重量まで再水和しながら48時間の間脱水した。この
ベシクルを徐々に渦巻き攪拌して分散し、脱水工程後、
サンプル中に保有される三重水素化された水を製剤全体
に平衡にさせるため、サンプルをほぼ15〜30分間保持し
た。
次に該サンプルから一定量試料を取り出し、三重水素
化された水による1ml当りの放射能を測定した。脱水サ
ンプルの残留水の％レベル、すなわち、脱水工程後のサ
ンプル中に残っている初期水の％は上記で与えられた平
均前−脱水値、すなわちSPLVについては4.18×106dpm/m
lそしてFATMLVについては3.60×106dpm/mlが、単に再水
割後の測定された放射能レベルで割ることで計算され
た。
上で示された水濃度、すなわちSPLVについては4.18×
10-2mol H2O/ml、FATMLVについては3.60×10-2mol H2O/
ml、に％を掛け、そして脂質濃度、すなわちSPLVに6.65
×10-5mol 脂質/ml、FATMLVに5.60×10-5mol 脂質/ml、
で割ることによって、％残留水値を脱水製剤中の脂質１
モル当りの水のモル数に変換した。例えば、１〜６の間
の整数％に対し得られた計算値は次のようである： 三重水素化された水による再水和製剤の放射能を測定
後、再水和サンプルを１回の洗浄当り10ミリリットルの
バッファーを使用する３回の洗浄／遠心分離サイクルに
まず付すことにより、イヌリン保有量を決定した。上記
装置を利用して12,100×ｇで25分間遠心分離を行なっ
た。最終ペレット中のベシクルをバッファーで最初の重
量に再懸濁させ、［14C］イヌリンを検出した。前−脱
水値で再水和後の放射能を割ることにより、％イヌリン
保有値を計算した。
これらの実験結果を第９図にグラフで示す。そこから
判るように、％イヌリン保有値は約５％の残留水レベ
ル、すなわち35のオーバーの脱水製剤の脂質値１モル当
りの水のモル数、に下がるまで相対的に一定に保たれて
いる。その後、著しく大きなイヌリン損失が残留水レベ
ルが減少すると共に見られ、即ち、残留水が約2.0％、
すなわち脱水製剤の脂質１モル当りの水モル数が12のレ
ベルを下がると、30〜40％オーダーもしくはそれ以上の
損失が見られる。
長期間保存のため、一般に製剤中に最小限の水を保有
することが好ましいが、これらの結果は、この目標を達
成しかつベシクル破壊の合理的に近いレベルを保持する
ために脱水製剤中の残留水レベルを好ましくは約２％〜
約５％、または脂質１モル当りの水のモル数として、約
12モルH2O/モル脂質〜約35モルH2O/モル脂質に保つべき
であることを示す。
例９（参考例） 保護糖を使用しないリポソームの脱水： ベシクルのタイプ、脂質のタイプおよび脂質の濃度の効
果 この例は、保護糖なしでリポソーム脱水を行なう場合
のベシクルのタイプ、脂質タイプおよび脂質の濃度効果
を示す。
例８に次のような変更を加えて、SPLVおよびFATMLVを
例８の記載のようにして調製した： １）卵PCおよび大豆PC（アバンティ ポーラーリピッ
ド，バーミンガム，アラバマ）（Avanti Polar Lipids,
Birmingham,Alabama）両者を使用した。;2）脂質の最初
の量は、例８の如く400μmolまたは15μmolのいずれか
であった;3）2.5μCi/mlの三重水素化された水に加えて
1.0μCi/mlの三重水素化された水を加えた；そして４）
SPLVの場合には、例８の方法に従って、［14C］イヌリ
ン（3.34μCi/ml、比活性2.4mCi/g）および未標識イヌ
リンを加えることにより、最終イヌリン濃度を1.08μmo
lイヌリン/0.3mlバッファーとすることによって、イヌ
リンおよび放射性イヌリンを加えた。この最後の変更に
関しては、保持されているイヌリンの測定値は二つの放
射性イヌリン製剤を区別できないことが判った。上記例
７で引用した米国特許出願第521176号（米国特許第4,58
8,578号）の方法に従って、MPVを調製した。具体的に
は、15または400μmolのクロロホルム中の卵PCおよび大
豆PCのいずれかを100ml丸底フラスコ中に加えた。例８
に記載された装置を使用して30分間高真空下に置いたの
ち、５〜10分間回転蒸発させることにより溶媒を除去し
た。脂質を再溶解するためにフラスコ中に５ミリリット
ルの100％エタノールを加えた。［14C］イヌリン（16.6
7μCi/ml、比活性2.4mCi/g）および未標識イヌリンを含
有する20mMのヘペス（pH7.4）を有する0.30mlの等モル1
45mM NaCl/KClをこの溶液に加え、最終イヌリンを1.42
μmolイヌリン/0.3mlバッファーとした。フラスコの内
容物を渦巻き攪拌により混合し、再び例８の装置を使用
して30分間高真空下においた後、５〜10分間回転蒸発さ
せることにより、その混合物を乾燥し薄いフィルムとし
た。脂質を5mlのバッファーに再懸濁させ、30mlコーレ
ックス（Corex）管に移した。
各洗浄用に20ミリリットルのバッファーを使用して、
４回の洗浄／遠心分離により捕捉されていない［14C］
イヌリンを除去した。遠心分離を例８に記載された如く
30分間行なった。最終洗浄上澄液をデカンテーションし
た後、ベシクルペレットを三重水素化された水（1.0μC
i/ml、比活性1mCi/g）で再懸濁した。三重水素化された
水を製剤全体に平衡にさせるため脱水前に少なくとも30
〜60分間、その製剤を保持した。
15または400μmolのクロロホルム中の卵PCおよび大豆
PCのいずれかを100ml丸底フラスコ中に加えることによ
り、MLVを調製した。例８の装置を使用して５分間回転
蒸発後高真空下に２時間置いた後、溶媒を除去した。［
14C］イヌリン（1.0μCi/ml、比活性2.4mCi/g）および
未標識イヌリンを含有する20mMのヘペス（HEPES）（pH
7.4）を有する5mlの等モル145mM NaCl/KClで脂質を水
和し最終イヌリン濃度を1.08mMにした。脂質を渦巻攪拌
により分散し、その懸濁液を２時間膨潤させた。捕捉さ
れていない［14C］イヌリンを除去し、三重水素化され
た上記MPVs用に記載された方法に従って加えた。
16の製剤（SPLV、FATMLV、MPVおよびMLVの高濃度EP
C、低濃度EPC、高内度SPCおよび低濃度SPC）の１ミリリ
ットルサンプルを30mlコーレックス（Corex）管に入
れ、例８に記載の真空ポンプを使用して高真空下、室温
で２日間デシケーター中でそれを乾燥した。他の組のサ
ンプルを凍結乾燥した。特に、1mlのサンプルをシェル
凍結技術を使用して30mlコーレックス（Corex）管中で
凍結させ、その後、モデル エフデーエックス−１−84
−デー フレッキシ−ドライ凍結乾燥装置（エフティエ
ス システム社，ストーンリッヂ，ニューヨーク）［Mo
del FDX−１−84−D Flexi−dry lyophilizationunit
（FTS System,Inc.,Stone Ridge,New York）］で一夜乾
燥した。対照サンプル（30mlコーレックス（Corex）管
中の1ml）をカバーし二日間室温で放置した。
例８に記載の方法および装置を使用してイヌリン保有
％および残留水％を決定した。その結果を表６に示す。
各種製剤のイヌリン保有値の比較により次のことが判
る： １）脱水前に高リン脂質濃度を有する製剤は、低リン脂
質濃度を有する製剤よりも損害が少ない（すなわち、リ
ポソームの内部含有物の漏出がより少ない）;2）卵PCベ
シクルは、一般に大豆PCベシクルよりも損害がより少な
い；そして３）MPVは一般にSPLVおよびFATMLVよりも損
害がより少ない。さらに、そのデータは、ベシクルのタ
イプ、脂質のタイプまたは脂質濃度に関係なく、脱水前
の製剤の凍結（「凍結乾燥」実験）が前凍結（「真空デ
シケーション（dessication）」実験）なしで脱水する
よりもベシクルにより重大な損害を与える結果となるこ
とを示す。
本発明の特定の実施態様が記載および示されてきた
が、これらは本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく変更可能であると理解すべきである。例えば、例で
使用された以外のリポソーム調製技術が、脱水され、そ
の後再水和されるリポソームを調製するために使用され
得る。同様に、アドリアマイシン以外の荷電物質を膜電
位を使用してリポソーム中に負荷し得る。
アドリアマイシンおよび250mMのトレハロースを含有
する溶質溶液を使用してETVを調製した。前凍結するこ
となく該サンプルを24時間脱水した。最初のサンプルお
よび再水和されたベシクルのアドリアマイシン含量を実
施例１に記載の如く測定した。
マルチラメラベシクルを適切な直径のポリカーボネー
トフィルター中を押し出すことにより、種々の平均直径
を有するベシクルを調製した（「物質と方法」を参照さ
れたい）。サンプル全てに250mMのトレハロースを含有
させ、前凍結なしで24時間脱水した。
各糖500mMの存在下、大きなユニラメラベシクルが製
造され、前凍結することなく24時間脱水、そして再水和
されたときに残っている22Na+の量を「物質と方法」の
項に記載されたようにして測定した。
実施例５に記載の如く、ストレプトマイシンの存在下
および不存在下で単相ベシクルを調製、洗浄し、前凍結
して真空下で脱水し、そして再水和した。比較例ベシク
ルを凍結乾燥方法で使用したのと同じ期間室温で貯蔵し
た（24時間）。
データを取った点における実験数＝2;データは、ブラ
ンク、２チャンネルスピルオーバーで補正した;EPC＝卵
PC:SPC＝大豆PC
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キユリス，ピーター，アール カナダ国 バンクーバー ブイ６ジエイ ３アール２ ウオルナツト ストリート 1329 (72)発明者 バリー，マルセル，ビー カナダ国 バンクーバー ブイ６テイ １ エム８ コルベツト クレツセント 5516 (72)発明者 フアウンテイン，ミカエル，ダブリユ アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 08540 プリンストン ボツクス 500 ア ール．デイー．ナンバー１ リンカーン アベニユー 11 (72)発明者 ギンスバーグ，リチヤード，エス アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 08831 ジエームスバーグ ボツクス 330 アール．デイー．ナンバー１ (72)発明者 ホープ，ミカエル，ジエイ カナダ国 バンクーバー ブイ６アール ２ケイ２ ウエスト イレブンス アベニ ユー 3550 (72)発明者 マツデン，トーマス，デイー カナダ国 バンクーバー ブイ６ケイ ２ エイ５ エイピーテイー 302 ウエスト エイス アベニユー 2185 (72)発明者 シーレン，ヒユー，ピー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067 ヤードレイ デラウエアー リム ドライブ 19 (72)発明者 ヤブロンスキー，レジナ，エル アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 08610 トレントン スミス アベニユー 966 (56)参考文献 特開 昭54−49317（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−7714（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−4913（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−76021（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−43110（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】二重膜（bilayer membrane）および一若し
    くはそれ以上の保護糖を有するリポソームからなり、該
    保護糖はリポソーム膜の内部表面および外部表面の両者
    に存在し、それによってリポソームが脱水中にそれらの
    内容物の実質的部分を保有しており、そして続いて行わ
    れる再水和において、それらの内容物の実質的部分を保
    有するような、平均粒子径が50nm以上のユニラメラリポ
    ソームであることを特徴とする脱水リポソーム製剤。
  2. 【請求項２】一若しくはそれ以上の保護糖が、二糖類で
    ある請求の範囲第１項記載の製剤。
  3. 【請求項３】一若しくはそれ以上の保護糖が、トレハロ
    ース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトー
    ス、およびデキストロースからなる群から選ばれる請求
    の範囲第１項又は第２項記載の製剤。
  4. 【請求項４】一若しくはそれ以上の保護糖が、アミノグ
    リコシド類である請求の範囲第１項記載の製剤。
  5. 【請求項５】糖がストレプトマイシン又はジヒドロスト
    レプトマイシンである請求の範囲第４項記載の製剤。
  6. 【請求項６】内容物が薬剤を含有する請求の範囲第１項
    記載の製剤。
  7. 【請求項７】一若しくはそれ以上の保護糖がリポソーム
    膜の内部表面及び外部表面の両者に存在する一若しくは
    それ以上の保護糖を含むリポソーム製剤を調製する工
    程、及び該製剤から水を除去する工程を含有、保護糖が
    一糖類若しくは二糖類であることを特徴とするリポソー
    ム脱水方法に従って調製された、請求の範囲第１項記載
    の脱水リポソーム製剤。
  8. 【請求項８】保護糖の濃度が、リン脂質のモル当り少な
    くとも５モルとなるものである請求の範囲第７項記載の
    脱水リポソーム製剤。
  9. 【請求項９】一若しくはそれ以上の保護糖が、トレハロ
    ース、マルトース、スクロース、グルコースおよびラク
    トースから成る群から選ばれる請求の範囲第７項記載の
    脱水リポソーム製剤。
  10. 【請求項１０】一若しくはそれ以上の保護糖が、アミノ
    グリコシド類である請求の範囲第７項に記載の脱水リポ
    ソーム製剤。
  11. 【請求項１１】糖がストレプトマイシン又はジヒドロス
    トレプトマイシンである請求の範囲第10項に記載の脱水
    リポソーム製剤。
  12. 【請求項１２】一若しくはそれ以上の保護糖がリポソー
    ム膜の内部表面及び外部表面の両者に存在する一若しく
    はそれ以上の保護糖を含む平均粒子径が50nm以上のユニ
    ラメラリポソーム製剤を調製する工程、及び該製剤から
    水を除去する工程を含有、保護糖が一糖類若しくは二糖
    類であることを特徴とするリポソーム脱水方法。
  13. 【請求項１３】保護糖の濃度がリン脂質のモル当り少な
    くとも５モルである、請求の範囲第12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】一若しくはそれ以上の保護糖が、トレハ
    ロース、マルトース、スクロール、グルコースおよびラ
    クトースから成る群から選ばれる請求の範囲第12項に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】一若しくはそれ以上の保護糖が、アミノ
    グリコシド類である請求の範囲第12項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】糖がストレプトマイシン又はジヒドロス
    トレプトマイシンである請求の範囲第15項に記載の方
    法。
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