JPH02502348A - リポリーム製剤の脱水方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 長期保存のための脱水小胞製剤 発明の分野 本発明は、一般的に言って、保存用添加物の存在下での脱水操作の間の小胞の保 存に関するものであり、これにより、小胞の２分子層の完全性が保たれ、凝集や 融合が避けられ、従つて、この小胞の利用性に何の障害ももたらさない。

本発明の１つの態様は、噴霧乾燥により保存された小胞に向けられている。本発 明で使用される小胞には、１個の単−薄層状の小胞を包含するリン脂質小胞が含 まれる。上記の保存された小胞は、再水和により、脱水にかけていない小胞と同 じ目的に使用することがリポソームは、広（文献に記載されており、その構造は よく知られている。リポソームは、液体空間（群）を囲っている単−薄層状また は多重薄層状の脂質小胞である。小胞の壁は、極性頭部および非極性尾部を持っ た、ｌまたはそれ以上の脂質成分の２分子層で形成されている。水性（または極 性）溶液中では、１つの層の極性頭部は外側に向かって配置し、周囲の媒質中に 入り込み、脂質の非極性尾部は互いに寄り集まっており、このようにして小胞の 壁の中には極性の表面と非極性のコアができる。単−薄層状のリポソームは、こ のような１個の２分子層を持つているが、多重薄層状のリポソームは、一般に、 実質的に同心状の複数の２分子層を持っている。

リポソームの製造法は種々知られており、その多（は５ｚｏｋａおよびＰａｐａ ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓにより記述されている［Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏ　ｈｙ ｓｉｃｓ　Ｂｉ。

ｅｎｇ、　９　：　４Ｂ？−５０８（１９８０）、およびＬｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　　ｏｒ　　Ｌｉｐｏ＠ｏｍｅ ｓ、　　Ｖｏｌ、Ｉ、　　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｅｄ、）、　　ＣＲＣＰｒ ｅｓｓ、Ｉｎｃ、（１９W ４）］。また、数種のリポソーム封入法が特許文献、特にＰａｐａｈａｄｊｏｐ 。

ｕｌｏｓらの米国特許第４．２ｉ１５．８７１号（１９８０年１１月２５日）、 および５ｕｚｕｋｉらの米国特許第４．０１６．１００号（１９７７年４月５日 ）に記載されている。

リポソームを商業上有用なものとするには、リポソーム製剤の保　　　。

存寿命を延ばすことが望ましい。このような製剤は、製造および出荷が容易であ って、かつ種々の温度条件下で中間または末端ユーザーが貯蔵できるよう、十分 長い保存寿命を持っていなければならない。特に医薬業界においては、封入され た薬物が実質的に漏出することなく長期間に渡ってリポソーム製剤を貯蔵し得る ことが重要である。

貯蔵時のリポソームの安定性は、通常、与えられた製剤がその元の構造および寸 法分布を保持する程度、および該当する場合には、治療薬であれ、診断薬であれ 、封入された薬物の封入量によって決められる。例えば、放置する間に、衝突し た小胞が融合し、その結果小胞サイズが自然に増大したときに非安定性が生じる 。小胞の寸法（サイズ）により、浄化速度や組織分布が決まるので、この大きい 小胞は、インビボにおいて非常に異なつた薬動力学を示すことになる。例えば、 大きいリポソームは、小さいものより早く循環系から除去される。さらに、水性 リポソーム分散液中のリポソームは凝集し、沈澱物として沈降することがある。

通常、このような沈澱物は再分散することができるが、元の分散液の構造や寸法 分布は変わるであろう。最後に、非安定性に関する重要な因子は、低分子量の封 入物質が貯蔵リポソームから漏出しやすいということである［一般的には、　Ｇ 、ＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓのＬｉｐｏｓｏｍｅ＠ｆｏｒ　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　 Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　３Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　 ２１５−２４１　（１９８５）を参照］。導入した薬物の含量が少ないとき、お よび／または外部の水性媒体の量が多いときには、そのような漏出がリポソーム 中の薬物の全含量のかなりの割合を占めることもある。

貯蔵時のリポソーム安定性の長期化に関する研究は、凍結乾燥の形態でのリポソ ーム保存にその焦点が当てられていた。凍結乾燥とは、高真空下で急速に凍結さ せ、そして脱水することによって物質を乾燥形に調製する方法を意味している。

従来の知見によれば、リン脂質はうまく凍結乾燥されないということであった。

ディビス（Ｄａｖｉｓ）のカリフォルニア大学でＪｏｈｎおよびＬｏｉｓ　Ｃｒ ｏｗｅによって行われた最近の研究は、三糖類であるトレハロースが凍結乾燥中 に凍結防止物質として機能することを示しており、この研究は、凍結防止物質が リポソームの内外に存在しているときに最善の結果が達成されると結論している 。Ｌ、　Ｍ、　Ｃｒｏｗｅら［Ｉ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　２４２　（１９８５）］。Ｊ、　Ｉｌ、　Ｃ ｒｏｗｅ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｃｒｏｗｅ　［Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ。

１９、　３１７　　（１９ｇ２）　　Ｉｎ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｍ ｂｒａｎｅｓ、　　Ｄ、Ｃｈａｐｍａｎ、　　Ｅｄ、（Ａｃ≠р■ ｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　５．５７）］も参照；これには、４　ンｆ　ｓ 　’）などのある種の生物がトレハロースの存在下で脱水に耐えることができる と報告されている。また、Ｂｉｔｔｅｌｌｅ　１ｌｅｓｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ、　Ｂａ５ｅｌは、凍結乾燥中のリポソーム保護物質としてタンパク質 類、および多糖類を使用することを開示しているが、その報告によれば損傷を受 けていないリポソーム量は約７０％にすぎない。５ｃｈｎｅｉｄｅｒら、リポソ ームのコロイド分散液の脱水方法、米国特許第４．２２９．８６０号（１９８０ 年１０月２１日）。他にもい（つかの特許が発行されているが、これらには凍結 乾燥法を用いてリポソームを保存するための種々の方法が開示されている。Ｉ： ｖａｎｓら、凍結乾燥リポソーム組成物の製造法、米国特許第４．３７０．３４ ９号（１０３年１月２５日）　Ｈ１ｅｉｎｅｒら、貯蔵安定な脂質小胞および製 造法、米国特許第４．３９７．８４６号（１９８３年８月９日）：Ｖａｎｌｅｒ ｂｅｒｇｈｅら、小球体水性分散液の貯蔵安定性（１９８１年１月２７日）。

さらに、凍結乾燥と再水和にかけた筋小胞体に及ぼす、および凍結−解凍にかけ たミクロソームおよび卵ホスファチジルコリンＳＵＶに及ぼす糖類の安定化作用 も既に知られていた。

工業スケールで製造するためには相当な設備投資を必要とするであろう。噴霧乾 燥法およびスクレイプー表面乾燥（ドラム−乾燥）法は、Ｈａｎｓｅｎが一般的 に記載しており［米国特許第３．５４９．３８２号（１９７０年１２らの方法は 凍結乾燥法が必要とするエネルギーに比べ必要なエネルギーが少ない。薄膜蒸発 法は噴霧乾燥およびスクレイプ表面乾燥法と等価な方法を構成している。これら ３種の方法のそれぞれは、分散媒体の瞬間的な蒸発、または急速な蒸発を引き起 こすことができ、この媒体に懸濁させた物質（本発明の場合にはリポソーム）の 完全性を損なうことがない。このような蒸発が約り０℃〜約１５０℃の範囲の温 度で起こる。

最近になって、単−薄層状の脂質小胞が、膜関与型の過程、例えば膜融合、界面 での触媒、エネルギーの伝導および変換、薬物の放出および標的化などを取り扱 ういくつかの研究領域で重要になった。

この種の研究が結局は単−薄層状の脂質小胞の工業的応用につながるであろうこ とが期待される。あらゆる実際の応用において、長期保存の問題およびこれに関 連する小胞と２分子層の安定性の問題が重要になる。小さい単−薄層状の脂質小 胞（ＳＵＶ）の水性懸濁液が熱力学的に不安定であることがよ（知られている。

例えば、両性イオンであるホスファチジルコリン類から調製されたＳＵＶは、室 温で凝集するか、または大きい多重薄層状の脂質粒子に融合する傾向にある。さ らに、これらは時間とともに化学的な分解を受ける。ＳＵＶの融合過程は、ＳＵ Ｖが凍結−解凍または脱水にかけられたときに太き（促進される。凍結と解凍に よって卵ホスファチジルコリンのＳＵｖが大きい多重薄層構造に逆戻りすること が示されていた［Ｇ、５ｔｒａｕｓｓおよびＨ，Ｈａｕｓｅｒ、　ＰｒｏｃＪａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．２４２２　（１９８６）　：この文献 の開示は参考のために挙げた］。従って、ＳＵＶは、種々の添加物の安定化作用 を試験するのに、および噴霧乾燥またはこれと等価な方法による脱水を試験する のに理想的な系である。

３里９１旬 本明細書中で説明する発明は、保存用添加物の存在下、噴霧乾燥およびこれと等 価な方法によってリン脂質小胞を保存することに関する。

本発明は、分散媒体の瞬間的な蒸発、または急速な蒸発が可能な乾燥法を意図す るものである。噴霧乾燥およびその他の等価な方法、例えばスフレイブ表面乾燥 または薄膜蒸発などを本発明において用いることができる。

態様の１つでは、小さい単一薄層状のリン脂質小胞を、５〜１０％（０，１５〜 ０．３Ｍ）スクロースの存在下、噴霧乾燥によって保存する。

図面の簡単な説明 第１Ｄ図は、１０％（０，３Ｍ）スクロース含有の緩衝液中、ｌ−バルミトイル −２−オレオイル−５ｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）／ジオレオイルー ５ｎ−ホスファチジルセリン−ナトリウム塩（ＤＯＰＳ）がモル比７：３である 、超音波処理したリン脂質分散液の代表的な溶離プロフィールを図式的に示すも のである。

第１Ｅ図は、同じ超音波処理分散液を噴霧乾燥にかけた後の溶離プロフィールを 図式的に示すものである。

第１Ｆ図は、上記２つの溶離プロフィール（ＩＤおよびＩＥ）を重ね合わせたと きの差異プロフィールを図式的に示すものである。

第２図は、超音波処１！ｌたＰＯＰｃ／ＤＯＰＳ（−１Ｑｔ、７：３）の混合リ ン脂質分散液の電子顕微鏡写真を示すものである。

５ＵＶ＝小さい単一薄層状の小胞 ＥＰＣ＝卵ホスファチジルコリン ｐｏｐｃ＝１−バルミトイル−２−オレオイル−５ｎ−ホスファチジルコリン ＤＯＰＳ＝ジオレオイル−５ｎ−ホスファチジルセリンの一ナトリウム塩 ＥＳＲ−電子スピン共鳴 ＣＡＴ１６＝４−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシル）アンモニウム−２， ２，６，６−テトラメチルビベリリジル１−オ牛ジルアイオダイド 本明細書中で用いる「小胞」は、水性の内室を有する通常は球状のミセルを意味 り、２分子層の膜を形成する脂質から得られることが多り、「リポソーム」と呼 ばれる。「ミセル」は両親媒性分子の凝集によって得られる粒子を意味する。本 発明においては、好ましい両親媒性物質は生物学的脂質である。ミセルは、自然 に結合する疎水性部分と親水性部分を備えた分子（いわゆる両親媒性分子）の水 溶性の凝集体である。

小胞を形成させる方法はこれまで当分野で極めてよく知られていた。代表的には 、リン脂質、例えば１−バルミトイル−２−オレオイル−５ｎ−ホスファチジル コリンから調製されるが、その他の物質、例えば中性の脂質など、さらに、表面 改質剤、例えば陽性または陰性に荷電した化合物などを含んでいてもよい。本明 細書中で用いる「小さい単一薄層状の小胞」とは、その寸法範囲が約２０００Ａ 以下である単一の２分子層の球状の殻を有する小胞を意味する。

本発明において保存用添加物として用いるのに適しているのは、種々の炭水化物 を含む多数のあらゆる物質であり、特にデキストランおよびある種の三糖類、例 えばスクロースおよびラクトースなど、アルコールｔ　例えばグリセロール、マ ンニトールオヨヒエチレングリコールなど、タンパク質類、例えば卵アルブミン など、およびアラビアゴムが含まれる。後記の実施例で用いられているように、 発明の範囲内で用いることができることは当業者の理解するところであろう。

本発明の小胞はｓ　Ｍ、Ｒ，ＭａｕｋおよびＲ，Ｃ，Ｇａｍｂｌｅが記載してい る超音波処理［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ、、　９４．　ｐ、３０２−３０７　（１９ ７９）］によって、または１１９８５１１月３１に出願され、本出願と同じ譲受 人に譲渡されたＲ、　Ｇａｍｂｌｅの同時継続出願（現在は米国特許第４．７５ ３．７８８号）に記載されている方法を用いる微細乳化によって調製された小さ い（２００ＯＡ以下）単一薄層状のリン脂質小胞の形態であるのが好ましい（両 文献は参考のために挙げた）。

種々のあらゆる化合物を小胞の水性内室に封入することができる。

代表的な治療用薬物には抗生物質、代謝調整剤、免疫調節剤、化学療法剤、解毒 剤などが含まれる。同様にして、診断用の放射性核種および蛍光物質またはその 他のインビトロおよびインビボ適用で検出可能な物質をこの小胞に供給すること もできる。

本発明の好ましい態様では、小胞は、保存用の添加物の存在下で噴霧乾燥にかけ られる小さい単一薄層状のリン脂質小胞である。

本発明は、脱水とその後の再水和の間に小胞を保存するので極めて有用である。

「保存」とは、平均の寸法および寸法の分布が影響を受けず、再水和のときに融 合または凝集が全く観察されないかまたはわずかしか観察されず、小胞の２分子 層の完全性が保持され、小胞の利用性に何の障害ももたらさないことを意味する 。

原料および方法 Δ社 ジオレオイル−ホスファチジルセリン［１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ −３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）］は、Ｉｌｅｒｍｅｔｔｅｒら［Ｃｈｅ ｓｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄｓ、　Ｖｏｌ、　３ ０．　ｐ、　３５　（１９８２）］に従って合成したか、またはＣｉｂａｇｅｉ ｇｙ（Ｂａｓｅｌ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）から供給を受けた。ｌ−バルミ トイル−２−オレオイル−５ｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１．２− バルミトイル−５ｎ−ホスファチジルコリン、１．２−ジオレオイル−５ｎ−ホ スファチジルコリンは、すべてＰａ１ｔａｕｆら［Ｂｉｏｃｈｉｓｉｃａ　　Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　　Ａｃｔａ　　Ｖｏｌ、２４９＋　　ｐ、５３９　　（１ ９７１）R に従うて合成した。卵ホスファチジルコリンおよび雄牛脳ホスファチジルセリン はＬｉｐｉｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓｕｒｒｅｙ、　Ｕ、Ｉ［、）から購入した 。使用したリン脂質はＴＬＣで測定して９９％純度であった。スクロース、トレ ハロースおよびグルコースは５１ｇｇ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ 　（ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）から入手した。アスコルビン酸はＦｌｕｋａ 　（Ｂｕｃｈｓ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。４−（Ｎ、Ｎ−ジ メチル−Ｎ−ヘキサデシル）アンモニウム−２，２，６，６−テトラメチルピペ リジン−１，３−オキシルアイオダイド（ＣＡＴ　　１６）はＭｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃ１ｔｙ、　Ｏｒｅｇｏｎ）から購入 した。ＫｓＦｅ（ＣＮ）、はＭｅｒｃｋ　［Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｆ。

Ｒ，Ｇ、　］から入手した。”Ｈ（Ｇ）−ラフィノースはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｐｉｕｃｌｅａｒ［Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓコの製品 であり、イヌリン［Ｃ”１カルボン酸（Ｍｒ＝　５２００）はＡｍｅｒｓｈａｍ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｕ、に、）力１ら入手した 。セファデツクスＧ−５０およびセファロース４ＢはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ（Ｚｕｒｉｃｈ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ） から購入した。

小胞の調製 超音波処理したリン脂質分散液は以前に記載されているよう番こして調製した［ Ｂｒｕｎｎｅｒら：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２５３、　ｐ、７５３ｇ　（１９７８）コ。簡単に説明 すると、リン脂質（例えばＰＯＰＣおよびＤＯＰＳ、モル比７　：３）（２５０ ｍ９）を所望によりＣＡＴ　１６　（１、７ｍｇ）とともにＣＨＣＱ＠／ＣＨ， ０Ｈ（２：１　容量／容量）（１０ＭＱ＞に溶解し、このリン脂質の有機溶媒溶 液を回転蒸発により乾燥した。このフィルムを高真空下（＜　１０−”ｔｏｒｒ ）で乾燥し、この乾燥リン脂質フィルムを５〜１０％（０，１５〜０．３Ｍ：通 常は１０％スクロースを使用）スクロース含有の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ７；　５蛙）に懸濁させることによってリン脂質分散液を調製した。他 に記載がなければリン脂質濃度は５０１９７Ｍ（ｌであり、リン脂質とスピン標 識（ＣＡＴ１６）のモル比は１００：１であった。

この分散液（５１１２）を、標準マイクロチップを備えたＢｒａｎｓｏｎ　Ｂ１ ２ソニケーターを用いて超音波処理にかけた。Ｎ、雰囲気中、平面底のガラス製 容器において５０分間、超音波処理を行った。この試料管を氷水中に浸漬し、ソ ニケーターをパルスのモードで用いた（５０％効率のサイクル；即ち、３０秒間 の超音波処理と冷却を交互に行った）。超音波処理の後、試料を５００　Ｏｒｐ ｍで１０分間遠心し、ソニケーターのチップから放出されたＴｉを除いた。この 超音波処理したリン脂質分散液を緩衝液で希釈し、全容量を５０ＭＱにした（希 釈係数＝１０）。この希釈の超音波処理分散液（４５ｍ＜２）を、後記のように Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機を用いて噴霧乾燥した。超音波処理によって生成した小さ い単一薄層状の小胞（ＳＵＶ）の水性内室に封入させようとするあらゆる化合物 （物質）を、乾燥リン脂質フィルムを分散させるのに用いた１０５Ｍリン酸緩衝 液（ｐＨ７）に加えた。こうして、Ｋ　＠　Ｆ　ｅ（ＣＨ）ｓ　”Ｈ−ラフィノ ースおよびｌ４Ｃ−イヌリンカルボン酸を封入Ｌ？＝。外部のに！Ｆｅ（ＣＨ） ＠、”Ｈ−５７４／−１＊た４ｔ”Ｃ−イヌリンカルボン酸は、セファデックス Ｇ−５０（媒体）のゲル濾過によりＳＵＶから除去した（カラムの寸法　１９　 ＣＩＸ　２　ｃｍ）。ゲル濾過の条件としては、８０ｘｙ／ｘ１２のリン脂質分 散液（３ｉｆｆ）を適用し、分画収集器で溶出液を集め、分画あたりに１５滴＝ ０．９１．１５を集め、溶出速度は７５ｘｆｆ／時であった。この溶出液をリン 酸塩に対して分析した。リン脂質含有の分画を集め、５０ｍ１２に希釈した。こ の希釈したリン脂質分散液（４５ｍｆｆ）をＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機で噴霧乾燥し た（下記を参照）。

Ｂｕｃｈｉの噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ、　Ｆｌａｗｉｌ、　５ｖｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。希釈した超音 波処理リン脂質分散液（４５ｘｆｆ）を噴霧乾燥した（リン脂質濃度：〜５　ｍ ｙ／　ａ（１）。以下の機器パラメーターヲ用いた：圧力４　ｂａｒ　：噴霧流 量５２０：アスピレータ−位置０：ポンブ位置１；加熱率８．７〜８．９；入口 温度１４０±５℃：出口温度６４℃。

噴霧乾燥の後、集塵器とすべての接続部を水（２０〜３０ｍ□ですすぎ、乾燥リ ン脂質粉末を再水和した。この乾燥リン脂質の再分散に用いる水の量を調節して 、元の分散液（噴霧乾燥前）の濃度と同様の濃度のリン脂質分散液を得た。この リン脂質を手で穏やかに振盪することによって再分散した。噴霧乾燥後に回収し たリン脂質の量は５０〜７５％の間に変化した。噴霧乾燥の後に脂質の純度をＴ ＬＣでチェックした。噴霧乾燥の工程は検出可能なリン脂質の分解を全く引き起 こさなかった。

リン脂質分散液の目盛付きセファロース４Ｂカラムによるゲル濾過超音波処理し たリン脂質分散液（主としてＳＵｖからなる）のゲル濾過は、Ｓｃｈｕｒｔｅｎ ｂｅｒｇｅｒおよびｔｌａｕｓｅｒ［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ ｃａ　Ａｃｔａ、　Ｖｏｌ、７７ｇ、　ｐ、４７０　（１９８４）コらの詳細な 記述のようにして行った。

セファロース４Ｂ樹脂の目盛付けもこの参考文献に記載されている。

■豊作９元監Ｌ アルゴンイオンレーザ−（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　；モデル１７１　 ：λ＝５１４．５ｎ■）、温度コントロールした散乱セルホルダー、デジタル自 動修正器［Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｋ　７０２３　；　９６チヤンネルコ、およびオン ラインのＮｏｖａ　３コンビ１−ター［１１ａｌｌｅｒ、Ｈ，Ｒ，、Ｄｉｓｓｅ ｒｔａｔｉｏｎ　６６０４．　ＥＴＨＺｕｒｉｃｈ］からなる自家製の装置でリ ン脂質小胞の寸法を測定した。

礁糀虱星員五！監限 Ｂａｕｓｅｒら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　：　４７７５　（１９８３ ）］および本明細書中に引用した参考文献（これらの開示は参考のために本明細 書中に示した）の記載のようにして、凍結破壊電子顕微鏡用のリン脂質分散液試 料を凍結固定し、破壊し、そして複製した。

ＥＳＲ−測定 ２分子層の完全性および障壁の性質をモニターするために、先の刊行物［５ｔｒ ａｕｓｓ　ａｎｄ　Ｈａｕｓｅｒ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　ｖｏｌ　８３．　ｐ。

２４２２　（１９８６）　：参考のために示したコに記載されている電子スピン 共鳴試験を用いた。スピン標識ＣＡＴ１６を、脂質と標識のモル比〜１００：１ としてリン脂質２分子層に加えた。このスピン標識の遊離ラジカルは２分子層の 極性基の領域に配置される。ＳＵＶからなる超音波処理の分散液においては、こ の標識は２分子層の外側および内側層の間にランダムに分配される。即ち、約６ ５〜７０％の標識は外側の２分子層表面に配置され、その残りは内部の２分子層 表面に存在する。リン脂質分散液を０℃まで冷却し、３ＱｍＭのアスコルビン酸 ナトリウムを加えた。アスコルビン酸ナトリウムは、０℃ではリン脂質２分子層 を透過できない還元剤であり、外側の２分子層表面に位置しているスピン標識と 相互作用するであろう。結果として６５〜７０％のスピン標識が失活する。残り の「内側の」ＥＳＲシグナルの損失は、無傷の膜では全シグナルの〜ｌ／３であ るが、この損失が２分子層がアスコルビン酸塩に対して漏出性になったことの指 標となる。

わずかに修飾を加えたＣｈｅｎらの方法［Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、＋　Ｖｏｌ、２ Ｌ　ｐ、１７５ａ　（１９５６）］を用いる無機リンの測定によってリン脂質を 定量した。

ＫＪｅ（ＣＮ）ｓの濃度は４２０ｎａでの吸収を測定することによって調べた。

′Ｈ−ラフィノースおよびイヌリン［”Ｃｌカルボン酸はＢｅａｋｓｉｎ　ＬＳ 　７５００液体シンチレーシ璽ン計数管での放射の計数によって定量した。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらに限定 されるものではない。

実施例１ 本実施例は、噴霧乾燥中にＳＵｖを安定化するスクロースの能力を説明するもの である。超音波処理したＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比７：３）の分散液を、上記 のように１０％スクロース含有の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて調製 した。噴霧乾燥工程がＳＵＶ分散の形態（即ち、平均小胞寸法および寸法分布） を変えなかったことを第１図に示す。噴霧乾燥前のＳＵＶのゲル濾過パターン、 およびリン脂質を噴霧乾燥して再分散した後のパターンを、それぞれ第１Ｄ図お よび第１Ｅ図に示す。これらの溶出パターンは極めて類似しているが、第１Ｆ図 の差異のパターンから明らかなように完全には重ね合わせることができない。Ｓ ＵＶの主ピーク（第１Ｄ図および第１Ｅ図）は溶出容量Ｖｅ−１９，３ｓ＋ｆｆ で溶出し、これは１２５人のストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）半径に対応している（ １２．５ｎ■）。第１Ｆ図に示した差異のプロフィールは、噴霧乾燥−再水和の サイクルがＳＵＶの若干の凝集および／または融合につながることを示した。凝 集／融合の程度のおおざっばな評価は差異のプロフィールから得ることができる ：凝集／融合を受けたリン脂質は１０％を越えなかった。セファロース４Ｂのゲ ル濾過から得られた結論は凍結破壊電子顕微鏡によつて支持された。第２図は、 リン酸緩衝液中の超音波処理したＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比＝７：３）の分散 液が１０％スクロースの非存在下および存在下の両方で直径１８〜７０ａｍのＳ ＵＶからなることを示している（それぞれ、第２Ａ図および第２Ｂ図）。

これら分散液を噴霧乾燥にかけ、この乾燥残渣を水に再溶解しても、スクロース が緩衝液中に存在しているときには、平均の小胞の寸法および寸法の分布にはわ ずかしか作用しなかった（第２Ｄ図）。上記の結論は沈降試験によってさらに裏 付けられる。１０％スクロース含有のリン酸緩衝液中の超音波処理したＰＯＰＣ ／ＤＯＰＳ分散液を、１２０００ｘｙで５分間遠心した。この遠心操作によって 、超音波処理していない分散液中に存在するリン脂質リポソームは定量的にペレ ット化されることがわかった。超音波処理したＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ分散液を、噴 霧乾燥前、および噴霧乾燥と乾燥残渣の再分散の後に、１２０００ｘｔｔで５分 間遠心した。この両者において、生成したベレットは分散した全リン脂質の２． ５％量であった。この実験により、１０％スクロースの存在下での噴霧乾燥工程 の間にＳＵＶが実質的に保たれることが確かめられた。

実施例２ 本実施例は、スクロースが存在しないときには、実施例１で用いたものと同じ超 音波処理ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ分散液が噴霧乾燥の間に凝集と融合を経ることを示 すものである。リン酸緩衝液（ｐＨ７）中ノ超音波処理ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モ ル比＝７：３）の分散液（５０ｕ／ｘＱ）を上記のように調製した。緩衝液中に 糖を全く含んでいないこの分散液を噴霧乾燥にかけ、乾燥残渣を水中に再分散さ せると、粒子径の劇的な変化が導かれた（第２Ｃ図）。凍結破壊試料の電子顕微 鏡観察により、直径が〜０．２から２μｌの大きい主として単−薄層状の小胞の 存在が明らかになった（この大きい小胞はその水性内室中に封入された比較的小 さい小胞を含んでいる）。第２Ｃ図に示した電子顕微鏡写真は、超音波処理して いないＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比＝７：３）分散液で撮った電子顕微鏡写真に 極めて類似している。この結果は、スクロースの存在しないところではＳＵＶが 噴霧乾燥の間に大きな凝集と融合を経ることを示している。また、糖の存在しな いところでの噴霧乾燥によって誘導されるこの融合過程は遠心によっても示され る。噴霧乾燥し、乾燥リン脂質を水に再分散した後に、このリン脂質分散液を１ ２０００ｘｙで５分間遠心した。この条件下では９７％のリン脂質がペレットに なった。この実験は、噴霧乾燥してその乾燥リン脂質を再分散した後の超音波処 理ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比＝７：３）分散液が超音波処理していないものと 同様にふるまうことを示すものである。

去農ヨ】 本実施例は実施例１の繰り返しである。１０％スクロースを加えたｌＯ鵬Ｍリン 酸緩衝液（ｐＨ７）中の超音波処理したリン脂質分散液ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モ ル比＝７：３）を前記のように調製した。噴霧乾燥前の濃度は５０ｏ／ｍ（ｌで あった。超音波処理したリン脂質分散液の平均小胞寸法および寸法分布を、噴霧 乾燥の前後に、セファロース４Ｂのゲル濾過によって測定した。噴霧乾燥前には 、ＳＵＶはＶｅ＝１９．２１ｉ２で溶出し、これはストークス半径１２．５ｎｓ に対応していた。噴霧乾燥してその乾燥リン脂質を水に再分散した後には、溶出 パターン中の主ピークはＶｅ＝１８．６ｘ（ｌにあった。この若干低い溶出容量 Ｖｅの値は、比較的大きい平均小胞寸法を反映したものであり、このようにして 得たストークス半径は１３゜５ｘｍであった。

実施例４ 本実施例においては、実施例１〜３で用いた合成のリン脂質のかわりに天然のリ ン脂質を用いた。超音波処理リン脂質分散液を、卵黄ホスファチジルコリンおよ び雄牛脳ホスファチジルセリン（モル比＝７：３）から調製した。この天然のリ ン脂質混合物のモル比は、実施例１〜３で用いた合成のリン脂質混合物のものと 同一であった。

０．０１Ｍリン酸緩衝液、１０％スクロース中の卵ホスファチジルコリンと雄牛 脳ホスファチジルセリンの超音波処理リン脂質分散液は、実施例１〜３と同じ方 法で調製した。こうして得た超音波処理リン脂質分散液の平均小胞寸法と寸法分 布を、セファロース４Ｂのゲル濾過によって調べた。噴霧乾燥の前後に分散液を セファロース４Ｂのクロマトグラフィーにかけた。得られた結果は実施例１およ び３に記した結果と極めて類似していた。この結論は、天然のリン脂質の混合物 は合成のリン脂質と同様にふるまうということである。

去遡舅１ 本実施例は、ＳＵＶの小胞寸法は噴霧乾燥の間に実質的に維持されるが、２分子 層はアスコルビン酸塩に対して透過性になることを示すものである。１０％スク ロース含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の超音波処理ＰＯＰＣ／ＤＯ ＰＳ（モル比＝７：３）の分散液を前記のように調製した。本実施例ではリン脂 質２分子層をＣＡＴ１６で標識した。ＥＳＲスペクトルのセンターラインのシグ ナルの高さを記録しｔ、Ｃ−１００％）。１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム を加えた後には、このシグナルの高さは、アスコルビン酸塩と２分子層表面の外 側に位置するＣＡＴとの相互作用のために３３％まで低下した。この分散液を噴 霧乾燥し、乾燥リン脂質を水に再分散した。噴霧乾燥した後にはＥＳＲシグナル は全（検出されず、このことは、噴霧乾燥の間にアスコルビン酸塩が２分子層を 越え、２分子層表面の内部に存在していた残存のＣＡＴ分子を減少させたことを 示すものである。

亥１舅１ リン脂質ＳＵＶを実施例５と全く同じ方法で調製した。超音波処理したリン脂質 分散液を用いた。その半分を１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウムに調製した。ア スコルビン酸ナトリウムの添加の前後にＥＳＲスペクトルを測定した。実施例５ に記した結果を再現することができた。リン脂質分散液の残りの半分は噴霧乾燥 し、その乾燥リン脂質を適切な量の水に再分散した。ＥＳＲスペクトルを記録Ｌ 、ＥＳＲスペクトルのセンターラインのシグナルの高さを測定シた（＝　１００ ％）。この分散液にｌＱｍＭアスコルビン酸ナトリウムを加え、ＥＳＲスペクト ルを記録した。アスコルビン酸塩の添加によりシグナルの高さが減少した（＝３ １％）。この３１％の値は、噴霧乾燥前に同一の分散液で測定された値と実質的 に同一である。噴霧乾燥前に脂質分散液に１０５Ｍアスコルビン酸塩を添加する と、センターシグナルの高さを３３％に減少させた。本実施例の結論は以下の通 りである： （１）噴霧乾燥の前後で同様の値のシグナル高さが得られたという事実は、１０ ％スクロースの存在下では噴霧乾燥の間に小胞の寸法および寸法の分布が有意に 変化することができないことを意味している。この結論は他の方法、例えばセフ ァロース４Ｂでのゲル濾過、凍結−破壊電子顕微鏡および遠心などによって得ら れた結論と一致する。

（２）噴霧乾燥の間に２分子層がアスコルビン酸塩に対して透過性になる。この ことは、卵ホスファチジルコリン２分子層が室温でアスコルビン酸ナトリウムに 対して透過性になることがわかっていることを考慮するとそれほど驚くべきこと ではない。さらに、実施例６に記した実験は、噴霧乾燥の間に生じたすべての２ 分子層の混乱が可逆性であることを示唆している。

実施例７ １Ｏ％スクロースを加えたリン酸緩衝液中の超音波処理ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ分散 液（モル比７：３）を前記のように調製する。前記のようにして＄Ｈ−標識した ラフィノースを小胞の内腔に封入し、外側の［”Ｈ］ラフィノースをセファデツ クスＧ−５０のゲル濾過によって除去する。ラフィノースが封入されたＳＵＶか らなるこの脂質分散液を、噴霧乾燥の前後に、セファロース４Ｂのクロマトグラ フィーにかけた。噴霧乾燥の前には、９５％のラフィノースが小胞のピークとと もに溶出することがわかった。噴霧乾燥の後には、８５％のラフィノースがＳＵ Ｖとともに溶出した。即ち、本実験は、噴霧乾燥の間にラフィノースが少な（と も９０％まで実質的に封入されたままであることを示すものである。

実施例８ ラフィノースの代わりに［Ｉ４Ｃ］イヌリンカルボン酸を封入すること以外は同 じ方法を用いて実施例７に記載の実験を行った。上記の結果から予想されるよう に、小胞内腔に封入されたイヌリンは噴霧乾燥中に封入されたままであることが 本実施例８かられかった。

実施例９ １Ｏ％（０，３Ｍ）スクロースを加えた０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中１ ７）ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モア１．比＝７：３）の超ｉＪ処Ｍ！Ｊ　ン脂質分散 液を実施例７の記載のように調製した。ＫｓＦｅ（ＣＮ）ｓを封入するた・め、 この緩衝液に０．１Ｍのに、Ｆｅ（ＣＮ）を加えた。外側に存在するに＊Ｆｅ（ ＣＮ）＊をセファデックスＧ−５０のゲル濾過により除去した。次いで、実施例 ７の記載のように実験を行った。Ｋ−Ｆｅ（ＣＮ）、を含有するＳＵｖのリン脂 質分散液を噴霧乾燥した後には、約９０％のＫｓＦｅ（ＣＮ）、がＳＵＶととも に溶出した。本実験は、噴霧乾燥中に２分子層の障壁が無傷のままであり、イオ ンがリン脂質２分子層を貫通しないということを結論させる。

上記の実施例から、本発明が脱水中の小胞の保存を提供するものであることが明 らかである。具体的には、５〜１０％（０，１５〜０゜３Ｍ）１７）ＸりＨ−ス ｔｖ存在下、リン脂質（ＰＯＰＣ／ＤＯＰＳ　；％ル比７：３）から調製された ＳＵＶは噴霧乾燥中に保存された。糖が存在しないと、噴霧乾燥はＳＵＶの凝集 と融合を導いた。荷電したリン脂質のＳＵＶの場合には、大きな単一薄層状の小 胞が生成した。

小胞を脱水状態で保存することによって、小胞の利用性を損なうことなく、ある いは封入されたあらゆる物質が漏出することなく、小胞の凝集または融合が避け られ、小胞を長期間貯蔵することができる。

特定の適用を参考にして本発明を説明したが、本発明の本質には当業者に自明で あるその他の適用も含まれる。即ち、本発明は、本明細書に添付した請求の範囲 に示した範囲でのみ限定されるものである。

Ｉ２こ！ｌ Ｍｅ＠／６ＭｌＮ７％ 国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．分散媒中に保存用添加物を存在せしめたリン脂質小胞製剤の脱水方法であっ て、分散媒中に懸濁された小胞の寸法、寸法分布および完全性を実質的に保持し たまま、該分散媒を瞬間蒸発させ得る乾燥操作からなる方法。
2. ２．乾燥操作が噴霧乾燥、スクレイプー表面乾燥、または薄膜蒸発によるもので ある請求項１に記載の方法。
3. ３．リン脂質小胞が約２０００Ａ以下である請求項１に記載の方法。
4. ４．リン脂質小胞が単一薄層状である請求項１に記載の方法。
5. ５．リン脂質がホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群か ら選ばれる請求項１に記載の方法。
6. ６．ホスファチジルコリンが卵ホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２− オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン、１，２−パルミトイル−ｓｎ−ホス ファチジルコリンおよび１，２ジオレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンであ る請求項５に記載の方法。
7. ７．ホスファチジルセリンがジオレオイル−ｓｎ−ホスファチジルセリン、１， ２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、および雄牛腦ホス ファチジルセリンである請求項５に記載の方法。
8. ８．保存用添加物が炭水化物、二糖類、アルコール類、タンパク質、アラビアゴ ム、および単糖類からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
9. ９．炭水化物がデキストラン、単糖または二糖である請求項８に記載の方法。
10. １０．二糖類がスクロース、ラクトースおよびトレハロースからなる群から選ば れる請求項９に記載の方法。
11. １１．単糖がグルコースである請求項９に記載の方法。
12. １２．保存用添加物がスクロースである請求項８に記載の方法。
13. １３．スクロースが約５％〜約１０％スクロースの量で存在する請求項１２に記 載の方法。
14. １４．アルコール類がグリセロール、マンニトール、およびエチレングリコール からなる群から選ばれる請求項８に記載の方法。
15. １５．タンパク質がアルブミンまたはアラビアゴムである請求項８に記載の方法 。
16. １６．リン脂質小胞に治療薬または診断薬が含まれている請求項１に記載の方法 。
17. １７．小胞の再構成の際に治療薬および／または診断薬が組み込まれる請求項１ に記載の方法。
18. １８．治療薬が抗生物質、代謝調整剤、免疫調節剤、化学療法剤および解毒剤か らなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。