ES2303114T3 - Metodo para cargar medicamentos en liposomas. - Google Patents

Abstract

Una composición de liposoma, que comprende: liposomas compuestos por lípidos formadores de vesículas y que tienen un agente ionizable atrapado en asociación con un anión de glucuronato.

Description

Método para cargar medicamentos en liposomas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método y al producto obtenido de este para cargar agentes terapéuticos en liposomas preformados, en particular, a la carga de compuestos protonables mediante un gradiente de ión amonio que tiene al glucuronato como el anión de compensación.

Antecedentes de la invención

La administración de agentes terapéuticos vía composiciones liposómicas ha cambiado drásticamente la farmacocinética de los medicamentos y la biodistribución de algunos agentes (Martin, F.M., en MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES, Lasic, D. D. y D. Papahadjopaulos, eds., p. 635-88, Elsevier, Amsterdam (1998)). Por ejemplo, la doxorubicina, conocida como limitante en su dosificación ante toxicidad cardiaca, no muestra toxicidad cardiaca aparente (clínica y funcional) en pacientes con tumores sólidos cuando se administra atrapada en liposomas (Doxil®, ALZA Corporation, Mountain View, CA; Uziely, B. et al., J. Clin. Onco., 13:1777-1785 (1995); Working, P.K. et al., J. Pharmaco. Exp. Ther., 289:1128-1133 (1999)). Un estudio de biopsia cardiaca en pacientes con el sarcoma de Kaposi (KS) asociado al síndrome de inmunodeficacia adquirida (SIDA), que recibían grandes dosis acumulativas de Doxil® no mostró daño al tejido, lo que sugiere que la formulación liposómica puede haber tenido un efecto de protector cardíaco respecto a la doxorubicina (Berry, G. et al., Ann. Oncol., 9:71-76 (1998)). La ausencia de toxicidad cardiaca se atribuye en parte, a la vida media de circulación extendida de los liposomas (liposomas con recubrimiento de polietilenglicol conocidos como Stealth®, ALZA Corporation, Mountain View, CA) y a la retención estable de medicamentos, de tal manera que la mayoría de la dosis administrada llega a los tejidos en forma de liposomas encapsulados con filtración proveniente de los liposomas, de solo cantidades mínima del medicamento (< 5%) durante la circulación y distribución al tejido como medicamento libre (Martin, F.M., supra, (1998); Gabizon, A. et al., Cancer Res., 54:987-92 (1994)).

Es conocido que los liposomas de circulación extendida se acumulan preferiblemente (10 veces) en los tejidos con permeabilidad microvascular incrementada, lo que incluye a la mayoría de los tumores con neoangionésis activa (Wu, N.Z., et al., Cancer Res., 53:3765-3770 (1993); Yuan, F., et al., Cancer Res., 54:3352-3356 (1994)). Los liposomas de larga circulación también se acumulan en diversos tejidos sanos y susceptibles tales como la piel (Gabizon, A. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 24:337-344 (1997)) y probablemente en las mucosas. Bajo exposición prolongada, la acumulación de doxorubicina atrapada en liposomas en la piel puede causar eritrodisesteris palmar plantar (PPE, también conocida como síndrome mano-pie; Lyass et al., Cancer 89:1037-1047 (2000)). El desenlace de la PPE puede evitarse mediante la prolongación de los intervalos de dosificación, sin embargo, las modificaciones a las dosis y/o esquemas de administración puede reducir la eficacia contra ciertos tumores, e.g., carcinoma de mamas (Lyass et al., supra, (2000); Ranson, M.R. et al., J. Clin. Oncol., 15:3185-3191 (1997)).

Los datos actuales preclínicos y clínicos sobre la doxorubicina de circulación extendida atrapada en liposomas (Doxil®) indican que hay una liberación no apreciable del medicamento proveniente de los liposomas circulantes (<5% de la dosis inyectada). Una vez que los liposomas se han extravasado hacia dentro de los fluidos de tejido extracelular, se conoce poco de los procesos que determinan la liberación del medicamento. Se cree que la pérdida gradual del gradiente de protón que retiene el medicamento, la ruptura enzimática de los fosfolípidos liposomales mediante las fosfolipasas, y/o la endocitosis derivada de macrófagos fagocitos posiblemente contribuyen a la liberación del medicamento. La doxorubicina cuando se atrapa en el (Doxil®) liposomal disponible comercialmente forma una sal con el anión divalente de sulfato. La sal se precipita o gelatiniza en el compartimiento liposomal acuoso interno debido a su baja solubilidad. Esta formación de gel estabiliza la doxorubicina atrapada en la vesícula lípida y disminuye su velocidad de emanación.

La alteración de la capacidad de retención del anión sobre la doxorubicina puede tener un gran impacto sobre la velocidad de liberación del medicamento. Por ejemplo, la aceleración de la velocidad de liberación del medicamento a partir de liposomas de Doxil®, sin interferir con sus propiedades de circulación extendida y albergue tumoral, puede ser significativa debido a las razones siguientes: (1) la actividad inhibitoria tumoral puede incrementarse debido a la exposición más intensa en función del tiempo de los tumores al medicamento, y (2) la toxicidad en la piel puede disminuir debido a que esta clase de toxicidad es fundamentalmente una función de la exposición prolongada del tejido de la piel al medicamento.

En correspondencia, se desea una composición de liposoma que varíe la liberación de un compuesto atrapado y en particular, de la doxorubicina a partir de liposomas. Sería deseable un método para atrapar compuestos terapéuticos en liposomas preformados que retenga las ventajas del gradiente de sulfato de amonio, e.g., la eficacia y estabilidad, a la vez que permita la liberación del compuesto atrapado a una mayor velocidad.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención brinda liposomas de composición liposomal compuestos por lípidos formadores de vesículas y que tienen atrapados agentes terapéuticos capaces de ser ionizados en asociación con un anión de glucuronato. El agente terapéutico cargado de tal forma tiene una velocidad de liberación superior a la del agente cargado mediante un gradiente de amonio que tiene al sulfato como el anión de compensación, o contra anión.

En una realización, los lípidos formadores de vesículas que forman los liposomas son fosfolípidos. En otra realización, los liposomas comprenden además entre alrededor de 1-20 porciento molar de un lípido formador de vesículas derivado con un polímero hidrofílico, tal como el polietilenglicol.

En otra realización, el lípido formador de vesículas es fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y dicho lípido formador de vesículas derivado con un polímero hidrofílico es diestaroíl fosfatidiletanolamina derivada con polietilenglicol (DSPE). En aún otra realización, los liposomas comprenden además colesterol. Una composición a modo de ejemplo es el HSPC, colesterol y DSPE-PEG en una relación molar de 92,5:70:7,5.

En otra realización, el agente terapéutico es un antibiótico del tipo antraciclina. El antibiótico del tipo antraciclina a manera de ejemplo incluye doxorubicina, daunorubicina y epirubicina.

La composición descrita con anterioridad se utiliza, en otro aspecto, para tratar a un paciente. La composición se utiliza, en otro aspecto, para tratar un neoplasma en un paciente.

En otro aspecto, la presente invención incluye un método mejorado para la preparación de liposomas que tienen un agente terapéutico ionizable atrapado, donde el agente terapéutico se carga dentro de liposomas preformados en presencia de un gradiente de ión amonio con sulfato como contra ión. La mejora comprende la carga del agente terapéutico ionizable en los liposomas mediante un gradiente de ión amonio que tiene al glucuronato como contra ión.

En este método mejorado, en una realización, la carga incluye la preparación de una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma al menos un compartimiento acuoso interno que contiene glucuronato de amonio en una primera concentración.

En otra realización, el método mejorado incluye la preparación de liposomas suspendidos en un medio masivo externo que tiene una segunda concentración de glucuronato de amonio, en el que la primera concentración es superior a la segunda concentración, estableciendo por tanto un gradiente de concentración del ión amonio a través de las bicapas lípidas de los liposomas.

En otra realización, el método mejorado incluye la adición de una cantidad del agente terapéutico a la suspensión de liposomas.

En otro aspecto, la presente invención incluye un método de preparación de liposomas, que comprende la formación de liposomas que tienen un compartimiento interno y una membrana lípida bicapa. Los liposomas tienen un gradiente de concentración de glucuronato de amonio a través de sus membranas lípidas bicapas. Los liposomas son puestos en contacto con un agente terapéutico ionizable para lograr el transporte del agente hacia el compartimiento interno.

En una realización, el método incluye (i) preparación de una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma en la suspensión al menos un compartimiento interno acuoso que contiene glucuronato de amonio en una primera concentración, comprendiendo los liposomas suspendidos en un medio masivo externo glucuronato de amonio en la primera concentración; (ii) reducción de la primera concentración de glucuronato de amonio en el medio masivo externo a una segunda concentración menor de glucuronato de amonio, estableciendo por tanto un gradiente de concentración del ión amonio a través de las bicapas lípidas de los liposomas.

En diversas realizaciones, el paso de la reducción se logra mediante la dilución, diálisis, filtración con diálisis o intercambio iónico.

Aún en otro aspecto, la presente invención incluye un método para la carga de un compuesto protonable en liposomas preformados, que comprende la preparación de una suspensión de liposomas que tienen una concentración mayor de glucuronato de amonio dentro de los liposomas que afuera de los liposomas, estableciendo por tanto un gradiente de concentración del ión amonio desde el interior al exterior de los liposomas. El gradiente es capaz del transporte activo de dicho compuesto protonable hacia el interior de los liposomas. El método incluye también la adición a la suspensión de una cantidad del compuesto protonable, y permitiendo que el compuesto protonable se transporte hacia dentro de los liposomas para lograr un contenido de dicho compuesto protonable dentro de los liposomas mayor que el correspondiente al exterior de los liposomas.

En una realización, el método incluye la formación de liposomas en la presencia de una solución de glucuronato de amonio que tiene una primera concentración; y atrapando dicha solución de glucuronato de amonio de dicha primera concentración dentro de dichos liposomas; y reduciendo dicha primera concentración de dicha solución de glucuronato de amonio fuera de los liposomas a una segunda concentración que es menor que la de dicha primera concentración.

El método de la presente invención tiene una alta eficacia de carga. En una realización más del 50% del compuesto protonable añadido a la suspensión se transporta al interior de los liposomas. En otra realización, aproximadamente 90% de la cantidad del compuesto protonable añadido a la suspensión se transporta al interior de los liposomas. En realizaciones específicas, la eficacia de carga de la doxorubicina es mayor del 90% y la relación de doxorubicina a fosfolípido está en el entorno de alrededor de 100-150 \mug/\mumol.

Éstos, y otros objetivos, y características de la presente invención se apreciarán con mayor plenitud cuando se examine la siguiente descripción detallada de la presente invención de conjunto con los diagramas acompañantes.

Breve descripción de los diagramas

Las Figuras 1A-1E son curvas de inhibición del crecimiento que trazan la velocidad de crecimiento, como un porcentaje de células de control no tratadas de líneas de células de ratón M109ST (Figura 1A), M109R (Figura 1B) y de líneas de células humanas C-26 (Figura 1C), KB (Figura 1D) y KB-V (Figura 1E), respecto a la concentración de doxorubicina (en nM), después de tratamiento con doxorubicina libre (círculos), doxorubicina atrapada en liposomas, en las que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (triángulos, "lipo-dox-AS") o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (cuadrados, "lipo-dox-AG");

La Figura 2 muestra la velocidad de filtración in vitro de doxorubicina de los liposomas, en la que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (triángulos, "lipo-dox-AS") o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (cuadrados, "lipo-dox-AG");

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra la concentración de doxorubicina (\mug/ml) en plasma de ratón en diferentes momentos después de la inyección de liposomas conteniendo doxorubicina, en la que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (barras punteadas) o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (barras estriadas);

La Figura 4 es un trazado del espesor medio de la almohadilla plantar, en mm, en ratones inoculados con células M109S como una función de los días después del tratamiento con solución salina (cuadrados cerrados), doxorubicina libre (círculos), o doxorubicina atrapada en liposomas, en la que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (triángulos, "lipo-dox-AS") o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (cuadrados abiertos, "lipo-dox-AG");

La Figura 5 es un trazado del espesor medio de la almohadilla plantar, en mm, en ratones inoculados con células M109R (células tumorales resistentes a la doxorubicina) como una función de los días después del tratamiento con solución salina (cuadrados cerrados), doxorubicina libre (círculos), o doxorubicina atrapada en liposomas, en la que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (triángulos, "lipo-dox-AS") o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (cuadrados abiertos, "lipo-dox-AG"); y

La Figura 6 es un trazado del número de ratones supervivientes como una función de los días después de las inoculación con células tumorales C26 y el tratamiento con doxorubicina libre (círculos) o con doxorubicina atrapada en liposomas, en la que la doxorubicina se cargó de manera remota en los liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (triángulos, "lipo-dox-AS") o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (cuadrados, "lipo-dox-AG").

Descripción detallada de la invención

La presente invención brinda una composición liposomal en la que un agente terapéutico ionizable está atrapado en el(os) compartimiento(s) liposomal(ales) interno(s) en forma de una sal iónica con aniones monovalentes de glucuronato. Como se mostrará más adelante, el agente terapéutico atrapado tiene una mayor velocidad de liberación desde los liposomas en comparación con la velocidad de liberación del agente atrapado en los liposomas en forma de una sal iónica con aniones divalentes de sulfato. La presente invención también brinda un procedimiento de carga remota para cargar los agentes terapéuticos dentro de liposomas preformados en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio. La mayor velocidad de liberación del agente terapéutico a partir de los liposomas aporta flexibilidad para ajustar la dosificación sin comprometer la eficacia biológica de los agentes terapéuticos. El método de la presente invención por tanto brinda una alternativa beneficiosa para la carga mediante sulfato de amonio.

De manera similar al método convencional del gradiente de sulfato de amonio, el método de carga remota del glucuronato de amonio no requiere que los liposomas estén preparados en pH acídico, ni de alcalinizar el medio acuoso externo a los liposomas. El enfoque también permite la carga de agentes terapéuticos en un amplio espectro de liposomas de diversos tipos, tamaños y composiciones, incluyendo liposomas estabilizados estéricamente, inmunoliposomas e inmunoliposomas estabilizados estéricamente. El término "atrapado" tal como se utiliza aquí se refiere a un agente atrapado dentro de los espacios acuosos de los liposomas o dentro de las bicapas lípidas.

La mayor velocidad de liberación es resultado del uso del glucuronato como el anión de compensación. Aún sin querer ceñirse a la teoría, hipotéticamente el ión de glucuronato, siendo monovalente y conteniendo varios grupos funcionales hidroxilo en su anillo de seis miembros, es menos eficaz comparado con un ión de sulfato respecto a inducir agregación y precipitación del agente terapéutico después de ser transportado dentro de los liposomas. Los inventores han observado que la solubilidad de la doxorubicina es aproximadamente 100 veces mayor en una solución de 250 mM de glucuronato de amonio (AG) que en una solución de 250 mM de sulfato de amonio (AS). Adicionalmente, la doxorubicina precipita a una concentración menor de 2 mM en presencia de iones sulfato, mientras que se requiere una concentración mucho mayor de doxorubicina para que ocurra la precipitación en presencia de iones glucuronato. En correspondencia, cuando el glucuronato es el ión de compensación, más del agente terapéutico está en una forma soluble y por tanto está más disponible para su liberación a partir de los liposomas. Es más, la permeabilidad del glucuronato a través de las membranas liposomales es muy baja, debido posiblemente a su bajo pKa, su masividad y/o polaridad, haciéndolo muy eficaz para el mantenimiento del gradiente de ión amonio para la carga de agentes terapéuticos.

El método de la presente invención puede utilizarse para cargar de manera remota esencialmente cualquier agente terapéutico que sea protonable (que pueda existir en un estado cargado positivamente) cuando se disuelva en un medio acuoso apropiado. Preferiblemente, el agente debe ser relativamente lipofílico de manera que se desintegre dentro de las membranas vesiculares lípidas. También, preferiblemente, el compuesto para la carga es un compuesto anfifático débil, esto es, un compuesto que tiene porciones básicas o ácidas débiles. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser cargados en los liposomas mediante el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina, mitomicina, bleomicina, daunorubicina, estreptozocina, vinblastina, vincristina, hidrocloruro de mecloretamina, melfalano, ciclofosfamida, trietilenetiofosforamida, carmustina, lomustina, semustina, fluoruracil, hidroxiurea, tioguanina, citarabina, floxuridina, decarbazina, cisplatina, procarbacina, ciprofloxacina, epirubicina, carcinomina, N-acetiladriamicina, rubidazona, 5-imidodaunomicina, N-acetildaunomicina, todos los medicamentos del tipo antraciclina, daunorilina, propranolol, pentamindina, dibucaína, tetracaína, procaína, clorpromacina, pilocarpina, fisostigmina, neostigmina, cloroquina, amodiaquina, cloroguanida, primaquina, mefloquina, quinina, pridinol, prodipina, mesilato de benzotropina, hidrocloruro de triexifenidilo, propranolol, timolol, pindolol, quinacrina, benadril, prometacina, dopamina, serotonina, epinefrina codeína, meperidina, metadona, morfina, atropina, deciclomina, metixena, propantelina, imipramina, amitriptilina, doxepina, desipramina, quinidina, propranolol, lidocaína, cloropromacina, prometacina, perfenacina, naranja de acridina, prostaglandinas, fluoresceína, carboxofluoresceína, y otras moléculas similares a éstas anteriores.

En adición a la carga de un agente terapéutico único, el método puede utilizarse para cargar múltiples agentes terapéuticos, simultánea o secuencialmente. También, los liposomas dentro de los cuales se cargan los agentes terapéuticos protonables pueden por sí mismos ser precargados con otros agentes farmacéuticos o medicamentos utilizando técnicas convencionales de atrapado (e.g. incorporando el medicamento en el búfer a partir del cual se preparan los liposomas). El método de la presente invención por tanto brinda gran flexibilidad en la preparación de "cócteles de medicamentos" de liposomas encapsulados para uso en terapias. Por supuesto, si se desea, puede precargarse uno o más de los medicamentos protonables relacionados anteriormente y entonces puede añadirse a los liposomas el mismo medicamento u otro diferente utilizando el gradiente de glucuronato de amonio de la presente inven-
ción.

El método es particularmente apropiado para cargar medicamentos débilmente anfipáticos tales como la doxorubicina. La doxorubicina cargada en los liposomas que tienen un área de recubrimiento externo de cadenas de polímero hidrofílico mediante un gradiente de glucuronato de amonio (aquí referido como "lipo-dox-AG") exhibe una velocidad de liberación mayor que la doxorubicina cargada en liposomas que tienen un área de recubrimiento externo de cadenas de polímero hidrofílico mediante un gradiente de sulfato de amonio (aquí referido como "Lipodox-AS"; conocido comercialmente como Doxil®), teniendo similar eficacia biológica. Se contempla que la liberación más rápida del medicamento cuando se carga en liposomas en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio disminuye la duración del medicamento en la sangre y reduce la oportunidad de que la doxorubicina se acumule en la piel causando eritrodisestesia palmar plantar (PPE, también conocida como síndrome mano-pie), un efecto colateral observado cuando se administra la doxorubicina liposomal atrapada.

En estudios realizados en apoyo a la presente invención, se prepararon liposomas contentivos de doxorubicina atrapada, en los que la doxorubicina se cargó de manera remota en liposomas preformados en presencia de un gradiente de sulfato de amonio o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio. En la Sección I a continuación, se describirá la composición del liposoma y el procedimiento de carga remota. Estos liposomas se caracterizaron in vitro para determinar su citotoxicidad, asimilación celular medicamentosa y velocidad de filtración de plasma, también descritos en la Sección I. En las Secciones II y III se presentan la velocidad de eliminación in vivo de plasma y la actividad terapéutica de la doxorubicina atrapada en liposomas.

I. Componentes y preparación de liposomas A. Componente de liposomas

Los liposomas apropiados para uso en las composiciones de la presente invención incluyen aquellos compuestos fundamentalmente por lípidos formadores de vesículas. Los lípidos formadores de vesículas, ejemplificados por los fosfolípidos, se forman espontáneamente en vesículas bicapas en agua a pH y temperaturas fisiológicas. Los liposomas pueden también incluir otros lípidos, incorporados en las bicapas de lípido, con el resto hidrófobo en contacto con el interior de la región hidrófoba de la membrana bicapa, y el resto del grupo líder orientada hacia la superficie exterior, polar de la membrana bicapa.

Los lípidos formadores de vesículas son preferiblemente los que tienen dos cadenas de hidrocarburo, típicamente cadenas acilo, y un grupo líder, polar o no polar. Hay una variedad de lípidos sintéticos diacilos formadores de vesículas y lípidos de ocurrencia natural formadores de vesículas, tales como fosfolípidos, diglicéridos, glicolípidos dialifáticos, lípidos sencillos tales como esfingomielina y glicosfingolípido, colesterol y sus derivados, solos o en combinaciones y/o con o sin agentes rigidizantes de la membrana de los liposomas. Como aquí se define, los "fosfolípidos" incluyen fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), esfingomielina, plasmalógenos y derivados de lípidos de fosfatidilcolina en los que las dos cadenas de hidrocarburos están típicamente entre 14-22 átomos de carbono en longitud, y tienen diversos grados de insaturación. Los lípidos antes descritos y fosfolípidos cuyas cadenas acilo tienen diversos grados de saturación pueden obtenerse comercialmente o prepararse según métodos publicados.

Los lípidos catiónicos son también apropiados para uso en los liposomas de la presente invención, en los que el lípido catiónico puede incluirse como un componente menor de la composición del lípido o como un componente principal o único. Tales lípidos catiónicos tienen típicamente un resto lipofílico, tal como un esterol, una cadena acilo o diacilo, y en el que el lípido en su conjunto tiene una carga neta positiva. Preferiblemente el grupo líder del lípido porta la carga positiva. Los lípidos catiónicos que sirven de ejemplo incluyen 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilarnino)-propano (DOTAP); bromuro de N-[I-(2,3,ditetradeciloxi)propil]-NN-dimetil-N-hidroxietilanimonio (DMRIE); bromuro de N-[I-(2,3-dioleiloxi)propil]-NN-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 30[N-(N',N'-dirnetilaminoetano) carbarnoli] colesterol (DC-Col); y dimetildioctadecilamonio (DDAB).

El lípido catiónico formador de vesículas puede ser también un lípido neutral, tal como dioleoilfosfafidil etanolamina (DOPE) o un lípido anfifático, tal como un fosfolípido, derivado con un lípido catiónico, tal como una polilisina u otros lípidos de poliamina. Por ejemplo, el lípido neutral (DOPE) puede derivarse con polilisina para formar un lípido catiónico.

El lípido formador de vesículas puede seleccionarse para lograr un grado especificado de fluidez o rigidez, para controlar la estabilidad del liposoma en suero y para controlar la velocidad de liberación del agente atrapado en el liposoma. Los liposomas que tienen una bicapa lípida más rígida, o una bicapa cristalina líquida, se logran mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido, e.g., un lípido que tenga una temperatura de transición de fase relativamente alta, e.g., por encima de la temperatura ambiente, más preferiblemente por encima de la temperatura corporal y hasta 80ºC. Los lípidos rígidos, i. e., saturados, contribuyen a mayor rigidez de la membrana en la bicapa lípida. Otros componentes lípidos, tales como el colesterol, son también conocidos como contribuyentes para lograr la rigidez de la membrana en las estructuras lípidas bicapas.

La fluidez de lípidos se logra mediante la incorporación de un lípido relativamente fluido, típicamente uno que tenga una fase lípida con temperatura de transición de fase cristalina líquido a líquido relativamente baja, e.g., a o por debajo de la temperatura ambiente, más preferiblemente, a o por debajo de la temperatura corporal.

Los liposomas pueden opcionalmente incluir un lípido formador de vesículas derivado con un polímero hidrofílico, como se ha descrito, por ejemplo en la Patente de los EE.UU. No 5 013 556 y en la WO 98/07 409, que se incorporan aquí como referencia. La incorporación de un conjugado de polímero hidrofílico lípido en el polímero de bicapa liposomal brinda un recubrimiento superficial de cadenas de polímero hidrofílico tanto en las superficies externas como internas de las membranas del liposoma de bicapa lípida. El recubrimiento de la superficie más externa de cadenas de polímero hidrofílico es eficaz para extender el tiempo de vida de circulación de sangre in vivo relativa a los liposomas que carecen del recubrimiento de la cadena de polímero. El recubrimiento interno de las cadenas de polímeros hidrofílicos se extiende hacia dentro de los compartimientos acuosos en los liposomas, i. e., entre las bicapas lípidas y dentro del compartimiento del núcleo central, y está en contacto con cualesquiera agentes atrapados. Los lípidos formadores de vesículas apropiados para derivación con un polímero hidrofílico incluyen cualquiera de aquellos lípidos relacionados anteriormente, y, en particular fosfolípidos, tales como el diestaroíl fosfatidiletanolamina (DSPE).

Los polímeros hidrofílicos apropiados para derivación con un lípido formador de vesículas incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilainida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroetilcelulosa, polietilenglicol y poliaspartamida. Los polímeros pueden emplearse como homopolímeros o como bloque de copolímeros aleatorios.

El polietilenglicol (PEG) es una cadena de polímeros hidrofílicos preferida, preferiblemente como una cadena PEG que tiene un peso molecular entre alrededor de 500 y alrededor de 10 000 Daltons, más preferiblemente entre alrededor de 500 y alrededor de 5 000 Daltons, más preferiblemente entre alrededor de 1 000 y alrededor de 2 000 Daltons. Los análogos de PEG con cubierta metoxi o etoxi también se prefieren como polímeros hidrofílicos, disponibles comercialmente en una variedad de tamaños de polímeros, e.g., 120 a 20 000 Daltons.

La preparación de lípidos formadores de vesículas derivados con polímeros hidrofílicos ha sido descrita, por ejemplo en la Patente de los EE. UU. No. 5 395 619. La preparación de liposomas que incluyen tales lípidos derivados también se ha descrito, en la que típicamente, entre 1 a 20 porciento molar de tal lípido derivado se incluye en la formulación del liposoma. Se apreciará que el polímero hidrofílico puede acoplarse establemente al lípido, o acoplarse a través de un vínculo inestable que le permita a los liposomas protegidos desprenderse del recubrimiento de cadenas de polímeros a medida que circulan en el torrente sanguíneo o en respuesta a un estímulo, como ha sido descrito, por ejemplo, en la Patente de los EE. UU. No. 6 043 094, que se incorpora aquí como referencia.

B. Preparación del liposoma

Las suspensiones de liposomas comprendidas por liposomas que tienen un gradiente de ión a través de la bicapa del liposoma (también referidas como "gradiente transmembrana") para uso en carga remota pueden prepararse mediante una diversidad de técnicas, tales como las detalladas en Szoka, F., Jr., et al., Ann Rev Biophys Bioeng 9:467, (1980). Las vesículas multilarnelares (MLV) pueden formarse mediante técnicas simples de hidratación de película de lípidos. En este procedimiento, se disuelve una mezcla de lípidos formadores de liposomas del tipo antes descrito en un solvente orgánico apropiado y después el solvente se evapora dejando una película fina. La película se cubre entonces mediante un medio acuoso, que contiene las especies disueltas, e.g. glucuronato de amonio que forma la fase acuosa en los espacios interiores del liposoma y también la solución de suspensión externa al liposoma. La película lípida se hidrata para formar MLV, típicamente con tamaños entre alrededor de 0,1 a 10 micrones.

Los lípidos utilizados en la formación de liposomas de la presente invención están presentes preferiblemente en una relación molar de alrededor de 70 a 100 porciento molar de lípidos formadores de vesículas, opcionalmente de 1 a 20 porciento molar de un lípido derivado con una cadena de polímero hidrofílico. Una formulación a manera de ejemplo incluye 80 a 90 porciento molar de fosfatidiletanolamina, 1 a 20 porciento molar de PEGDSPE. El colesterol puede incluirse en la formulación en porcentajes de alrededor de 1 a 50 porciento molar. En una realización preferida, los componentes lípidos son fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol (Chol) y diestaroil fosfatidiletanolamina derivada con polietilenglicol protegido con restos metoxi (mPEG (2 000) DSPE) en una relación molar de 92,5: 70:7,5.

Para la preparación de liposomas que tengan un gradiente de glucuronato de amonio, el medio de hidratación contiene glucuronato de amonio. La concentración del glucuronato de amonio dependerá de la cantidad del agente terapéutico a cargar. Típicamente, la concentración está entre 100 y 300 mM de glucuronato de amonio. En una realización preferida, el medio de hidratación contiene 250 mM de glucuronato de amonio.

Las vesículas formadas por el método de película fina pueden ser conformadas para alcanzar una distribución de tamaño dentro de un intervalo seleccionado, según métodos conocidos. Preferiblemente, los liposomas son de tamaño uniforme en un intervalo entre 0,04 a 0,25 \mum. Las pequeñas vesículas unilamelares (SUVs, por sus siglas en inglés, Small Unilamellar Vesicles), típicamente en el intervalo entre 0,04 a 0, 08 \mum, pueden prepararse mediante sonicación de post formación u homogenización. Pueden producirse liposomas de tamaño homogéneo con tamaños dentro de un intervalo seleccionado entre alrededor de 0,08 a 0,4 \mum, e. g., por extrusión a través de membranas de policarbonato u otras membranas de tamaño de poros definido que tengan tamaños uniformes de poros seleccionados entre 0,03 a 0,5 \mum, típicamente 0,05, 0,08, 0,1 o 0,2 \mum. El tamaño de poros de la membrana corresponde aproximadamente al tamaño mayor de los liposomas producidos por extrusión a través de esa membrana, particularmente en los que el preparado se somete a extrusión dos o más veces a través de la misma membrana. El dimensionamiento se lleva a cabo preferiblemente en el búfer original hidratante del lípido, de manera que los espacios interiores del liposoma retengan este medio a lo largo de los pasos de procesamiento del liposoma. La preparación de una formulación liposomal a manera de ejemplo se describe en el Ejemplo 1.

Generalmente, se carga un agente terapéutico en los liposomas después del dimensionamiento. Del intercambio del agente terapéutico en el medio externo o masivo en el cual se suspenden los liposomas con un ión amonio en el compartimiento liposomal interior resulta un proceso de carga "remoto" o "activo". La eficacia de la carga depende, al menos en parte, de un gradiente de ión amonio, en el que la concentración del ión amonio dentro de los liposomas es mayor que la concentración del ión amonio en el medio externo, masivo de la suspensión. La magnitud de este gra-
diente determina en gran medida el nivel de encapsulamiento, a mayor gradiente, generalmente mayor el encapsulado.

Puede formarse un gradiente de glucuronato de amonio a través de la bicapa liposomal lípida, en el que la concentración del ión amonio es mayor en el interior de los liposomas que en el medio externo de la suspensión (i. e., un gradiente de ión amonio mayor interno/menor externo) en una diversidad de formas, e.g., mediante (i) dilución controlada del medio externo, (ii) diálisis respecto al medio final deseado, (iii) cromatografía mediante tamiz molecular, e.g., utilizando Sephadex G 50, respecto al medio deseado, o (iv) centrifugación de alta velocidad y resuspensión de liposomas en forma de pelets en el medio final deseado. El gradiente se mide como la relación de glucuronato de amonio en el interior a la correspondiente al exterior de los liposomas. Generalmente, el gradiente está en el intervalo de 1000-10 interior/exterior. Preferiblemente, el gradiente está en el intervalo de 500-50.

La concentración de glucuronato de amonio en un medio externo que también contiene electrolitos puede ser medida como concentración de amoníaco a pH 13-14 (Bolotin, E.M., et al., Journal of Liposome Research 4(I):455-479 (1994) mediante un analizador iónico, e.g. un analizador Coming 250 pH/ion (Coming Science Products, Corning, NY) equipado con un electrodo de amoníaco Corning 476130 y una sonda de acero inoxidable de compensación automática de temperatura (ATC). Si el medio externo final carece de electrolitos el gradiente de glucuronato de amonio puede confirmarse mediante mediciones de conductividad utilizando un metro de conductividad, e.g., un tipo de metro de conductividad CDM3 equipado con un electrodo de inmersión CDC 304 con compensador manual de temperatura tipo CDA 100 (Radiometer, Copenhague, Dinamarca).

En un enfoque, el gradiente de ión amonio se crea mediante dilución controlada. Este método aporta un preparado diluido del liposoma. Después del dimensionamiento, la suspensión liposomal tiene una primera concentración seleccionada de glucuronato de amonio dentro del liposoma y en el medio masivo externo. El medio masivo externo se diluye con un segundo medio que no contiene glucuronato de amonio. El segundo medio a manera de ejemplo incluye soluciones acuosas que contienen electrolitos (cloruro de sodio o cloruro de potasio) o soluciones acuosas que contienen no electrolitos (glucosa o sucrosa). Los medio interno y externo se seleccionan preferiblemente para contener alrededor de la misma osmolaridad, e.g., mediante un ajuste apropiado de la concentración del búfer, sal, o soluto de bajo peso molecular, tal como la sucrosa. Un segundo medio preferido es 1,5 mM de búfer HEPES que contiene 5% de dextrosa a un pH aproximadamente de 7.

En otro enfoque, un gradiente de protones a través de la bicapa lípida se produce por diálisis en el cual el medio masivo externo se intercambia por un ión amonio faltante, e.g., el mismo búfer pero uno en el que el glucuronato de amonio se reemplace con una sal tal como NaCl o KCl, o mediante un azúcar que aporte la misma osmolaridad dentro y fuera de los liposomas. Para la preparación a pequeña escala, el gradiente puede crearse mediante cuatro diálisis consecutivas de intercambio respecto a 25 volúmenes del búfer de diálisis. Para la preparación a gran escala, el gradiente puede prepararse mediante un flujo de diálisis tangencial de tres pasos, e.g., utilizando el sistema de ultrafiltración Minitan (Millipore Corp., Bedford, MA), equipado con membranas de polisulfona "300 K". El búfer de diálisis contiene electrolitos (e.g., cloruro de sodio o cloruro de potasio) o no electrolitos (glucosa o sucrosa). En una realización preferida, el búfer de diálisis es 1,5 mM HEPES que contiene 5% de dextrosa a aproximadamente pH 7. Utilizando cualquiera de los enfoques de diálisis (a pequeña o a gran escala) y en condiciones en las cuales el medio de hidratación fuera de 60 a 250 mM de glucuronato de amonio, puede obtenerse un gradiente de 1 000 o más sin dilución de la dispersión liposomal.

Los eventos de ionización que ocurren cuando se carga un medicamento ionizable en liposomas en presencia de un gradiente de ión amonio están descritos en la técnica (ver la Patente de los EE. UU. No. 5 192 549). Brevemente, después de la formación de los liposomas y del establecimiento de un gradiente a través de las bicapas liposomales, los iones amonio dentro de los liposomas se disocian y están en equilibrio con el amoníaco y los protones. El gas de amoníaco es permeable en la bicapa lípida, con un coeficiente de permeabilidad de alrededor de 1,3 x 10-1 cm/segundo, y es capaz de permear la bicapa liposomal. La efusión de amoníaco cambia el equilibrio dentro del liposoma hacia la producción de protones, lo que resulta en un gradiente [H^{+}], con la concentración interna del liposoma mayor que la correspondiente al medio externo al liposoma. El medicamento no protonado cruza la bicapa liposomal, se convierte en protonado dentro del liposoma y se estabiliza mediante los aniones presentes en el compartimiento interno acuoso del liposoma. La formación de una sal medicamentosa de glucuronato eleva el pH interno del liposoma e induce la formación de NH3 dentro de los liposomas. Este ciclo se repite, repitiéndose hasta que esencialmente todos los iones amonio emanan desde el compartimiento liposomal interior como NH3. Un agente terapéutico, e.g., doxorubicina, puede ser cargado en los liposomas añadiendo una solución del agente a una suspensión de liposomas que tenga un gradiente de ión amonio a través de las membranas liposomales. La suspensión se trata en condiciones efectivas para permitir el paso del compuesto desde el medio externo a los liposomas. Las condiciones de incubación apropiadas para la carga del medicamento son las que (i) permitan la difusión del compuesto, que está en una forma no cargada, en los liposomas, y (ii) lleven preferiblemente a una alta concentración de carga del medicamento, e.g., 5-500 mM de medicamento encapsulado, más preferiblemente entre 20-300 mM, más preferiblemente entre 50-200 mM.

La carga se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura superior a la temperatura de la fase de transición de los lípidos del liposoma. Por tanto, para los liposomas formados predominantemente a partir de fosfolípidos saturados, la temperatura de carga pues ser tan alta como hasta de 60ºC o más. El período de carga es típicamente entre 15 a 120 minutos, dependiendo de la permeabilidad del medicamento a la membrana bicapa del liposoma, a la temperatura y a las concentraciones relativas de lípido del liposoma y del medicamento. En una realización preferida, la carga se lleva a cabo a 60ºC durante 60 minutos.

Por tanto, con una selección apropiada de la concentración del liposoma, la concentración externa del compuesto añadido, y el gradiente iónico, esencialmente todo el compuesto añadido puede cargarse en los liposomas. Por ejemplo, con un gradiente de ión amonio de aproximadamente 1 000, el atrapado de la doxorubicina puede ser mayor del 90%. Conociendo el volumen interno calculado del liposoma, y la máxima concentración del medicamento cargado, uno puede entonces seleccionar una cantidad de medicamento en el medio externo que lleve a una carga sustancialmente completa de los liposomas.

Si la carga del medicamento no es lo suficientemente efectiva como para agotar sustancialmente el medicamento libre en el medio externo, la suspensión del liposoma puede ser tratada, después de la carga del medicamento, para retirar el medicamento no encapsulado. El medicamento libre puede ser eliminado, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, diálisis, o centrifugación. En una realización, el medicamento no atrapado se elimina utilizando Dowex 50WX 4 (Dow Chemical, Ml). Por ejemplo, la doxorubicina libre (pero no la doxorubicina liposomal) enlaza a una resina de intercambio de catión (Storm, G. et al., Biochim Biophys Acta, 818:343 (1985)).

II. Caracterización in vitro A. Citotoxicidad in vitro

La citotoxicidad in vitro de la doxorubicina libre (DOX libre), de la doxorubicina atrapada en el liposoma cargada en presencia de un gradiente de sulfato de amonio (lipo-dox-AS) o en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio (lipo-dox-AG) se sometieron a prueba respecto a dos líneas de células de ratón (M109S y M109R) y tres líneas de células de tumor humanas (C26, KB y KBV). Las líneas de células M109 R y KB v son sublíneas resistentes a la doxorubicina de M109S y KB, respectivamente. Las células fueron expuestas continuamente a la formulación del medicamento durante 72 horas siguiendo los detalles experimentales descritos por Horowitz, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1109: 203-209 (1992) y también en el Ejemplo 2.

La Tabla 1 muestra la concentración de doxorubicina necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular (valores IC50) para la doxorubicina libre (F-DOX), lipo-dox-AG y lipo-dox-AS. La doxorubicina en forma libre es más citotóxica que cualquiera de las dos formulaciones liposomales de doxorubicina. La doxorubicina cargada en los liposomas en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio es más citotóxica que cuando se carga en liposomas en presencia de un gradiente de sulfato de amonio, sugiriendo que el medicamento es más biodisponible a partir de la sal de glucuronato que de una sal de sulfato.

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TABLA 1 Valores de concentración inhibitoria IC50

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1

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Que la lipo-dox-AG es más citotóxica que la lipo-dox-AS se demuestra más aún mediante las curvas de inhibición mostradas en las Figuras 1A-1E, que muestran la velocidad de crecimiento de las células, como un porcentaje de células no tratadas con el medicamento (control), respecto a la cantidad de doxorubicina añadida al medio de crecimiento. Las Figuras 1A-1E son curvas de inhibición para líneas de células de ratón, M109S (Figura 1A), M109R (Figura 1B) y las líneas de células humanas C26 (Figura 1C), KB (Figura 1D) y KBV (Figura 1E). La concentración de doxorubicina, en nM, de las diferentes formulaciones se representa como doxorubicina libre (círculos), lipo-dox-AG (cuadrados), y lipo-dox-AS (triángulos). Todas las formulaciones de medicamentos a concentraciones de doxorubicina entre 10^{2} a 10^{6} resultaron citotóxicas para cada una de las líneas de células de tumores evaluadas. En todos los casos, con variaciones en la inhibición de la velocidad de crecimiento, la lipo-dox-AG fue más citotóxica que la lipo-dox-AS, mostrando que el medicamento de la plataforma liposomal de glucuronato de amonio estaba biodisponible más fácilmente que el medicamento de la plataforma liposomal de sulfato de amonio.

B. Asimilación de medicamento in Vitro por parte de células tumorales

La acumulación in vitro de la doxorubicina en células tumorales de ratón se estudió exponiendo células KB, KBV y M109R a la doxorubicina libre, a la lipo-dox-AS o a la lipo-dox-AG durante 1, 5 y 24 horas, como se describe en el Ejemplo 2. La Tabla 2 muestra los resultados del estudio. Hay una mayor acumulación de medicamento en las células tratadas con lipo-dox-AG que en las tratadas con lipo-dox-AS. Esto es consistente con los resultados in Vitro de la citotoxicidad descritos anteriormente (Figuras 1A-1E), lo que muestra que la lipo-dox-AG fue más citotóxica que la lipo-dox-AS.

TABLA 2 Asimilación in vitro de doxorubicina en células tumorales

2

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C. Filtración in vitro en plasma

Para determinar la filtración in vitro del medicamento encapsulado en el liposoma en el plasma, las lipo-dox-AS y lipo-dox-AG se incubaron en un 90% de plasma humano a 37ºC con agitación continua en recipiente de incubación contentivo de perlas de resina de intercambio catiónico Dowex. Las perlas de resina enlazan el medicamento liberado, sea libre o enlazado a proteínas. A intervalos preestablecidos, se tomaron muestras para extracción acidificada de alcohol y determinación fluorométrica de la fracción de medicamento remanente asociada a los liposomas (i. e., no atrapada por las perlas de resina). Los resultados se muestran en la Figura 2 e indican que la doxorubicina de la lipo-dox-AG del liposoma fue más rápida que la del medicamento de la lipo-dox-AS. La diferencia entre los dos preparados comienza a manifestarse después de 24 horas de incubación. Al final de la incubación (96 horas), la lipo-dox-AG ha liberado aproximadamente dos veces más doxorubicina que la lipo-dox-AS (aproximadamente 80% vs. 40%).

III. Caracterización in vivo A. Liberación de plasma

La farmacocinética de la doxorubicina atrapada en liposomas mediante carga en presencia de un gradiente de glucuronato de amonio se evaluó en ratones hembra de 3 meses de edad BALB/c. Como se describe en el ejemplo 3A, los liposomas con doxorubicina atrapada cargada respecto a sulfato de amonio o glucuronato de amonio se inyectaron en forma intravenosa a los ratones. Las muestras de sangre se tomaron a intervalos seleccionados y analizaron respecto a la concentración de doxorubicina. La Figura 3 muestra la concentración de doxorubicina en plasma de los ratones tratados con lipo-dox-AG (barras de líneas transversales estriadas) o con lipo-dox-AS (barras punteadas). La vida media de la doxorubicina cuando se administra a partir de una plataforma lipo-dox-AG es de 16 horas aproximadamente, mientras que la doxorubicina cuando se administra a partir de una plataforma lipo-dox-AS es de aproximadamente 24 horas. Es aparente también que la lipo-dox-AG se libera más rápidamente que la lipo-dox-AS. Las concentraciones en sangre de lipo-dox-AG fueron 25% menores después de 4 horas de administración intravenosa, 33% menores en 24 horas y casi 50% menores a las 48 horas de administración intravenosa. Como la composición y tamaño de los liposomas eran idénticos, la velocidad de asimilación mediante el sistema reticuloendotelial (RES) debe ser similar. En correspondencia, la más rápida liberación es probablemente el resultado de una velocidad de liberación mayor in vivo de la doxorubicina de la formulación de la lipo-dox-AG, consistente con los experimentos in Vitro.

B. Actividad terapéutica in vivo

Para determinar si la liberación más rápida de la doxorubicina al ser administrada a partir de liposomas contentivos de una sal de glucuronato doxorubicina tiene un impacto en la eficacia terapéutica, las formulaciones liposomales se administraron a ratones portadores de tumores.

Como se describe en el Ejemplo 3B, se inocularon los ratones con células tumorales M109S (10^{6} células) y se trataron con una dosis única de doxorubicina a 10 mg/kg de doxorubicina libre, lipo-dox-AS, o lipo-dox-AG post inoculación del tumor. La Figura 4 muestra el espesor medio de la almohadilla plantar (n=10), en mm., respecto a los días post tratamiento con doxorubicina. Ambos preparados liposomales fueron más eficaces en la supresión del crecimiento tumoral que el medicamento libre (círculos). Hubo una mejora ligera, pero insignificante, en la eficacia cuando las ratas se trataban con lipo-dox-AG (cuadrados) en comparación con lipo-dox-AS (triángulos).

En otro estudio, también descrito en el Ejemplo 3B, los ratones se inocularon con células M109R (10^{6} células). Diez días después de la inoculación, los ratones se trataron con doxorubicina libre, lipo-dox-AS, o lipo-dox-AG a dosis de 8 mg/kg. La misma dosis se administró de nuevo una semana y tres semanas más tarde. La Figura 5 muestra el espesor medio de la almohadilla plantar (n=10), en mm. como función de los días post inoculación del tumor. Ambos preparados liposomales (triángulos, cuadrados abiertos) fueron más eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral que el medicamento libre (círculos), a pesar del crecimiento progresivo del tumor en todos los grupos de prueba, debido probablemente a la naturaleza resistente de este tumor.

En otro estudio, también descrito en el Ejemplo 3B, los ratones se inocularon con células C26 (10^{6} células) para inducir un tumor, tratándolo cinco días después de la inoculación, con doxorubicina libre, lipo-dox-AS, o lipo-dox-AG a una dosis de doxorubicina de 10 mg/kg. La Figura 6 muestra el número de ratones sobrevivientes como una función del tiempo post inoculación del tumor. Los ratones no tratados (de control) murieron rápidamente con una media de supervivencia de 13 días (no se muestra). Los ratones tratados con doxorubicina libre (círculos) mostraron un incremento despreciable en el tiempo medio de supervivencia (4 días más que los de control, i.e., 17 días). Ambos preparados liposomales (cuadrados, triángulos), fueron más eficaces en la extensión del tiempo de supervivencia en los ratones portadores de tumor que los correspondientes a la doxorubicina libre.

Todos los modelos anteriores son tumores de tipo carcinoma. Un modelo adicional sometido a prueba (los resultados no se muestran) fue el linfoma J6456 de ratones BALB/c con un diseño experimental similar al modelo C26 (10^{6} células tumorales intraperitoneales, terapia intravenosa con una dosis de 10 mg/kg en el día 5 post inoculación del tumor). Las formulaciones liposomales fueron más efectivas que el medicamento libre, sin diferencias significativas entre el tiempo de supervivencia del ratón después del tratamiento con lipo-dox-AS o lipo-dox-AG.

De lo anterior puede apreciarse como se cumplen diversos objetivos y características de la presente invención. Los liposomas que tienen un medicamento atrapado en la forma de una sal de glucuronato brindan una velocidad de liberación mayor del medicamento en comparación con un liposoma similar en el que el medicamento está atrapado en forma de una sal de sulfato, sin efecto significativo sobre la eficacia del medicamento. Los datos clínicos con doxorubicina atrapada en liposomas ((Doxil®) indican que la incidencia y severidad de la disminución de PPE con un acortamiento de la vida media de circulación del (Doxil®), la liberación más rápida y la circulación más breve de la doxorubicina en la forma de lipo-dox-AG, brindan una buena alternativa para la administración de doxorubicina. Se apreciará que los resultados específicos a la doxorubicina se extienden a otros medicamentos capaces de carga remota en presencia de un gradiente de ión amonio, tales como los aquí citados.

IV. Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran aún más la invención aquí descrita y no intentan de forma alguna limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación y carga de liposomas A. Preparación de liposomas

Los liposomas conteniendo glucuronato de amonio en los compartimientos acuosos se prepararon como sigue. El componente lípido, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con polietilenglicol protegido con restos metoxi (mPEG (2 000) DSPE) en una relación molar de 92,5:70 : 7,5, se disolvieron en cloroformo. El solvente se evaporó utilizando un evaporador rotatorio bajo presión reducida dejando una fina película seca de lípido. La fina película seca de lípido se hidrató con 250 mM de una solución búfer acuosa de glucuronato de amonio (pH 5,5), formando liposomas que contenían glucuronato de amonio en los compartimientos acuosos internos y se suspendió en un medio masivo externo de glucuronato de amonio. Los liposomas se conformaron mediante extrusión a través de membranas de poros con 0,5 \muM.

Después de la extrusión, el búfer externo de glucuronato de amonio se intercambió mediante diálisis en presencia de un búfer de diálisis que contenía 5% de dextrosa y 15 mM Hepes en pH 7.

Se preparó de manera similar una formulación comparativa de liposoma contentiva de 250 mM de sulfato de amonio en los compartimientos interiores acuosos, utilizando 250 \muM de sulfato de amonio como búfer de hidratación. Las tandas obtenidas fueron similares a los preparados de glucuronato de amonio en tamaño de vesículas, eficacia de carga del medicamento, y relación medicamento a fosfolípido.

B. Carga remota

La doxorubicina se cargó en los liposomas conteniendo glucuronato de amonio (lipo-dox.-AG) y en los liposomas conteniendo sulfato de amonio (lipo-dox-AG) mediante incubación de los liposomas preparados como se describió en A anteriormente, con una solución de doxorubicina durante 1 hora a 60ºC. La encapsulación de la doxorubicina se llevó a cabo con una eficacia >90%. La relación de medicamento final a proporción de fosfolípido fue de 100-150 \mug/\mumol.

La doxorubicina libre (i. e., la doxorubicina no atrapada en un liposoma) en el medio masivo externo se eliminó mediante cromatografía en una columna Sephadex G50 diluida con búfer de dextrosa Hepes desgasificado.

Ejemplo 2 Caracterización in vitro A. Citotoxicidad in vitro

La doxorubicina libre y las formulaciones liposomales de doxorubicina, preparadas como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, se sometieron a prueba respecto a cinco líneas de células tumorales de ratón y humanas (M109S, M109R, C26, KB y KBV).

Las células para cada línea fueron expuestas continuamente a medicamentos durante 72 horas. Otros detalles experimentales fueron tal como se describe por parte de Horowitz et al., Biochem Biophys Acta, 1109(2):203 (1992). Brevemente, 5 x 103 células de cultivos de crecimiento exponencial en 200 \muL alícuotas se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano. Después de 20 horas de cultivo, durante las cuales las células se fijaron y reanudaron el crecimiento, 20 \muL de la formulación del medicamento sometido a prueba (doxorubicina libre, lipo-dox-AS, lipo-dox-AG) se añadieron a cada pocillo. Para cada incremento de 10 veces en la concentración del medicamento, se sometieron a prueba seis puntos de concentración del medicamento. Cada prueba se realizó en pocillos triplicados y en dos placas paralelas. Las células se trataron continuamente durante 72 horas. Los cultivos se fijaron mediante la adición de 50 \muL 2,5% de glutaraldehído a cada pocillo durante 10 minutos. Las placas se lavaron tres veces con agua deionizada, una vez con 0,1 M de búfer de borato (pH 8,5) y entonces se marcaron durante 60 minutos con 100 \mul de azul de metileno (1% en 0,1 M de búfer de borato, pH 8,5) a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces en cinco baños de agua deionizada para eliminar el tinte no enlazado a las células y se secaron. El tinte se extrajo con 200 \mul 0,1 M de HCl durante 60 minutos a 37ºC y se determinó la densidad óptica utilizando un espectrómetro de microplacas.

La velocidad de crecimiento se calculó dividiendo los tiempos de repliegue de las células tratadas con el medicamento entre los de las células de control. La concentración del medicamento causante de una inhibición del 50% de la velocidad de control del crecimiento (IC50) se calculó y/o interpoló de los dos valores más cercanos de la curva de inhibición del crecimiento.

La Tabla 1 muestra los valores IC50 para la doxorubicina, lipo-dox-AS, y lipo-dox-AG para cada una de las líneas celulares, y las curvas correspondientes de inhibición del crecimiento se muestran en las Fig. 1A-1E.

B. Asimilación in Vitro del medicamento

La acumulación celular de doxorubicina se sometió a ensayo mediante un método similar al descrito en Chambers, S. K et al., Cancer Res., 49:6275-6279 (1989). Las monocapas de células KB, KBV y M109R (cultivos de crecimiento exponencial de alrededor de 10^{6} células en placas de 35 mm) se incubaron con doxorubicina libre, lipo-dox-AS y lipo-dox-AG durante 1, 5 y 24 horas. Al final de la incubación, las células se enjuagaron tres veces con PBS y el medicamento se extrajo de las células con 1 ml de isopropanol acidificado (0,075 M HCl en 90% de isopropanol), durante 20 horas a 4ºC. La concentración de doxorubicina se determinó de manera espectrofluorométrica utilizando una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. La intensidad de la fluorescencia emitida fue traducida a equivalentes de doxorubicina basados en una curva estándar de doxorubicina, después de sustraer las lecturas de las células de fondo no tratadas.

El resultado de la asimilación de medicamento por parte de las células KB, KBV y M109R después de la exposición a la doxorubicina libre, lipo-dox-As y lipo-dox-AG durante 1, 5 y 24 horas se muestra en la Tabla 2.

C. Filtración de Plasma in vitro Materiales

Se prepararon lipo-dox-AS y lipo-dox-AG tal como se describe en el Ejemplo 1 a una concentración de >500 \mug de doxorubicina/ml.

Se añadieron 2 ml de 50% de perlas de resina de intercambio catiónico Dowex® (Sigma, 50W hidrógeno, 50% prelavado en solución salina) a 15 ml de cultivo de tejido en tubos plásticos de fondo redondo. Los tubos se centrifugaron durante 10 min a 2 000 r.p.m (850g) y se decantó el líquido. Los preparados liposomales se diluyeron con plasma humano a aproximadamente 5 \mug de doxorubicina/ml en 90% de plasma humano. Se prepararon tubos duplicados para cada preparado liposomal, y se prepararon tubos contentivos de los preparados liposomales sin las perlas de resina Dowex®.

Se preparó una solución ácida de isopropanol a partir de 10% de 0,75N HCL en 90% isopropanol, vol/vol. Los reactivos fueron reactivos de grado químico obtenibles de Sigma.

Todos los materiales utilizados en el estudio eran estériles, y todos los experimentos se realizaron en condiciones estériles.

Ensayo

Las perlas de resina de intercambio catiónico Dowex® enlazan con la doxorubicina en el plasma humano ya esté el medicamento en estado libre o enlazado a proteínas. En este ensayo se incubaron lipo-dox-AG y lipo-dox-AS en los tubos contentivos de las perlas de resina y del plasma humano (tal como se describió anteriormente) a 37ºC con agitación continua utilizando un removedor rotatorio para evitar la sedimentación de las perlas de resina. A intervalos preestablecidos, se tomaron muestras de extracción de alcohol acidificado y determinación fluorométrica de la fracción de medicamento remanente asociada con los liposomas (i. e., no atrapada por las perlas de resina). Se siguió el siguiente protocolo paso a paso para el análisis.

1. Añadir 30 ml de plasma humano a un tubo de 50 ml.

2. Añadir 2 ml al 50% de perlas de resina Dowex® estériles en solución salina a los tubos de centrifugación (15 ml, plásticos de fondo redondo) y centrifugar durante 10 minutos, a 2 000 r.p.m (850g). Decantar el fluido flotante de los tubos de centrifugación.

3. Utilizar preparados liposomales preparados tal como se describe en el Ejemplo 1, añadir una cantidad de la suspensión del liposoma a los tubos de 50 ml que contienen 30 ml de plasma humano para obtener una cepa con una concentración final de 5 \mug/ml de doxorubicina.

4. Añadir 9 ml de los 5 \mumg/ml de la cepa de la suspensión liposomal de doxorubicina a cada uno de los tubos de centrifugación que contienen las perlas de resina (Tubos No. A, B), y añadir 10 ml de la cepa liposomal a un tubo que no contiene perlas de resina (Tubo No. C). Mezclar.

5. Retirar alícuotas de 1 ml de cada tubo (A, B, C) y centrifugar durante 3 minutos a 14 000 r.p.m. Retirar 200 \muL del material flotante para un lectura de tiempo cero, y congelar las muestras a -20ºC hasta el análisis.

6. Incubar los tubos a 37ºC con agitación continua removiendo con un removedor rotatorio que agarra y rota los tubos a 360ºC en cámara lenta, con velocidad suficiente para evitar la sedimentación de las perlas de resina.

7. Retirar una alícuota de 1 \mul de cada uno de los tubos a 1, 4, 24, 48, 72 y 96 horas. Centrifugar cada alícuota a 14 000 r.p.m durante 3 minutos, retirar una alícuota de 200 \mul del material flotante aclarado. Congelar la alícuota a alrededor de -20ºC hasta el análisis.

8. Para el análisis de las muestras, se añadieron 1,8 ml de isopropanol acidificado a las muestras de 200 \mul para extraer la doxorubicina de los liposomas. Las muestras se incubaron durante la noche a 4ºC y entonces se centrifugaron para eliminar el precipitado (2 000 r.p.m durante 10 minutos). Los materiales flotantes aclarados se examinaron en un espectrofluorímetro con un fotomultiplicador de longitud de onda elevada, excitación a 470 nm y emisión a 590 nm. La concentración de doxorubicina se determinó basándose en una curva de calibración estándar, en la que la concentración obtenida representaba la cantidad de doxorubicina retenida en los liposomas.

Los resultados se muestran en la Figura 2.

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Ejemplo 3 Caracterización in vivo A. Velocidad de liberación de plasma in vivo

Se inyectaron por vía intravenosa ratones hembra BALB/c de tres meses de edad con 10 mg/kg de lipo-dox-AS o lipo-dox-AG, preparados como se describe en el Ejemplo 1. Se tomaron muestras de sangre a las 4, 24 y 48 horas después de la inyección para el análisis de los niveles de doxorubicina en plasma. Los resultados se muestran en la Figura 3.

B. Actividad terapéutica in vivo

Se inocularon 30 ratones en la almohadilla plantar con células M109S (10^{6} células). Siete días después, cuando el espesor de la almohadilla plantar aumentó de un valor normal de aproximadamente 1,5 mm a un promedio de 2,0 a 2,5 mm., se dividieron los ratones en tres grupos de 10 cada uno y los grupos de ratones se inyectaron de manera intravenosa con doxorubicina libre, lipo-dox-AS o lipo-dos-AG a una dosis de doxorubcina de 10 mg/kg. Después, el espesor de la almohadilla plantar se midió dos veces por semana con calibradores para seguir el crecimiento del tumor y el efecto de la terapia. Los resultados se muestran en la Figura 4.

En un estudio por separado, se inocularon 30 ratones en la almohadilla plantar con la línea de células tumorales M109R resistentes a la doxorubicina (10^{6} células). Diez días después, cuando aumentó el espesor de la almohadilla plantar de un valor normal de aproximadamente 1,5 mm a un promedio de 2,0 a 2,5 mm., los ratones se dividieron en tres grupos para tratamiento intravenoso con doxorubicina libre, lipo-dox-AS o lipo-dox-AG a una dosis de doxorubicina de 8 mg/kg. Se administraron dos inyecciones adicionales a la misma dosis 1 y 3 semanas después. El espesor de la almohadilla plantar se midió dos veces por semana con calibradores y los resultados se muestran en la Figura 5.

En otro estudio, los ratones se inocularon i. p. con células C26 (10^{6} células). Cinco días después, los ratones se separaron en tres grupos de 10 ratones cada uno, y cada grupo de ratones se inyectó por vía intravenosa con doxorubicina libre, lipo-dox-AS o lipo-dox-AG a una dosis de 10 mg/kg. Se siguió la supervivencia de estos ratones y las curvas de supervivencia se muestran en la Figura 6.

Aunque la invención ha sido descrita con respecto a realizaciones particulares, será aparente a los expertos en la técnica que pueden llevarse a cabo diversos cambios y modificaciones sin apartarse de la invención.

Claims (25)

1. Una composición de liposoma, que comprende:

liposomas compuestos por lípidos formadores de vesículas y que tienen un agente ionizable atrapado en asociación con un anión de glucuronato.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos lípidos formadores de vesículas son fosfolípidos.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos liposomas comprenden además entre 1-20 por ciento mol. de un lípido formador de vesículas derivado con un polímero hidrofílico.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho polímero hidrofílico es polietilenglicol.

5. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho lípido formador de vesículas es fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y dicho lípido formador de vesículas derivado con un polímero hidrofílico es diestaroíl fosfatidiletanolamina derivado con polietilenglicol (DSPE).

6. La composición de la reivindicación 5, en la que dichos liposomas comprenden además colesterol.

7. La composición de la reivindicación 5, en la que dichos liposomas están compuestos por HSPC, colesterol, y DSPE-PEG en una relación molar de 92,5:70:7,5.

8. La composición de la reivindicación 1, reivindicación 3, o reivindicación 5, en la que dicho agente terapéutico es un antibiótico del tipo antraciclina.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que dicho antibiótico se selecciona entre doxorubicina, daunorubicina, y epirubicina.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 para uso en el tratamiento de un paciente.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 para uso en el tratamiento de un neoplasma en un paciente.

12. Un método de preparación de liposomas que tiene un agente terapéutico ionizable atrapado, en el que dicho agente terapéutico está cargado en liposomas preformados en presencia de un gradiente de ión amonio con sulfato como un ión de compensación, comprendiendo la mejora:

carga del agente terapéutico ionizable en liposomas mediante un gradiente de ión amonio que tiene al glucuronato como un ión de compensación.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicha carga incluye la preparación de una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma al menos un compartimiento interno acuoso que contiene glucuronato de amonio a una primera concentración.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha preparación de una suspensión de liposomas incluye la preparación de liposomas suspendidos en un medio masivo externo que tiene una segunda concentración de glucuronato de amonio, en el que la primera concentración es mayor que la segunda concentración estableciendo por tanto un gradiente de concentración de ión amonio a través de las bicapas lípidas de los liposomas.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además la adición de una cantidad del agente terapéutico a la suspensión de liposomas.

16. El método de la reivindicación 15, en el que dicha adición comprende la adición de un antibiótico del tipo antraciclina.

17. Un método de preparación de liposomas, que comprende:

formación de liposomas que tienen un compartimiento interior y una membrana lípida bicapa, teniendo dichos liposomas un gradiente de concentración de glucuronato de amonio a través de sus membranas lípidas bicapas;

contacto de los liposomas con un agente terapéutico ionizable para lograr el transporte del agente al compartimiento interno.

18. El método de la reivindicación 17, en el que dicho contacto comprende contactar los liposomas con un agente terapéutico ionizable del tipo antraciclina.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho contacto comprende el contacto de los liposomas con un agente terapéutico ionizable del tipo antraciclina seleccionado entre doxorubicina, daunorubicina y epirubicina.

20. El método de la reivindicación 17, en el que dicha formación de liposomas incluye (i) preparación de una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma en la suspensión al menos un compartimiento interior acuoso que contiene glucuronato de amonio a una primera concentración, suspendidos dichos liposomas en un medio externo masivo que comprende glucuronato de amonio a una primera concentración; (ii) reducción de la primera concentración de glucuronato de amonio en el medio masivo externo a una segunda concentración, inferior de glucuronato de amonio, estableciendo por tanto un gradiente de concentración de ión amonio a través de las bicapas lípidas de los liposomas.

21. El método de la reivindicación 20, en el que dicha reducción se logra mediante dilución, diálisis, filtración con diálisis, o intercambio iónico.

22. Un método para la carga de un compuesto protonable en liposomas preformados, que comprende:

preparación de una suspensión de liposomas que tengan una concentración mayor de glucuronato de amonio dentro de los liposomas que fuera de los liposomas, estableciendo por tanto un gradiente de la concentración de ión amonio desde el interior al exterior de los liposomas; en el que dicho gradiente es capaz de transportar activamente dicho compuesto protonable hacia el interior de los liposomas,

adición de una cantidad de compuesto protonable a la suspensión, y

permitir que dicho compuesto protonable se transporte dentro de dichos liposomas y alcance un contenido de dicho compuesto protonable dentro de los liposomas que sea mayor que el correspondiente al exterior de los liposomas.

23. El método de la reivindicación 22, en el que dicha preparación comprende

formación de liposomas en presencia de una solución de glucuronato de amonio que tiene una primera concentración;

oclusión de dicha solución de glucuronato de amonio de dicha primera concentración dentro de dichos liposomas; y

reducción de dicha primera concentración de dicha solución de glucuronato de amonio en el exterior de los liposomas a una segunda concentración que sea menor que la correspondiente a dicha primera concentración.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho compuesto protonable es un antibiótico del tipo antraciclina.

25. El método de la reivindicación 24, en el que dicho antibiótico del tipo antraciclina es doxorubicina o daunorubicina.