CN116270495A - 一种可降解负载双药的纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种可降解负载双药的纳米粒子，所述纳米粒子是以磷酸钙（CaP）和脂质体（Lip）复合形成载体，负载盐酸阿霉素（DOX）和紫杉醇（PTX），形成的DOX/PTX‑CaP@Lip纳米粒子，具体是将含有PTX的脂质膜与负载了DOX的CaP混合水化得到。本发明的可降解负载双药的纳米粒子中，纳米粒子的结构稳定性优异，亲水性的DOX和疏水性的PTX拥有各自独立的载药空间和释放通道，避免了药物负载和释放时的相互干扰，使得纳米粒子具有较高的载药量和包封率，同时该体系形成了对药物的有效缓释，使得DOX和PTX能更好的发挥协同作用，实现了小计量达到高效治疗效果。

Description

一种可降解负载双药的纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米生物医药技术领域，具体涉及一种可降解负载双药的纳米粒子及其制备方法。
背景技术
当今社会，肿瘤是威胁人类生命健康的疾病之一，目前针对肿瘤的治疗主要有化学治疗、放射治疗、免疫治疗和手术治疗等，其中化学药物治疗在肿瘤治疗中占据了非常重要的地位。盐酸阿霉素(DOX)通过阿霉素分子嵌入DNA，抑制核酸的合成，对乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、恶性淋巴癌和急性白血病等肿瘤具有很好的疗效；紫杉醇(PTX)通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制肿瘤细胞有丝分裂，在临床上，用于进展期卵巢癌的一线和后继治疗、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种癌症的治疗。
但是化学药物存在溶解性、生物相容性和选择性较差等问题，很难靶向集中于肿瘤部位，由此会引发很多毒副作用，且长期使用单一药物甚至会诱导肿瘤细胞产生多药耐药性，最终可能导致化疗失败。近年来，基于纳米技术的纳米药物递送体系出现，给肿瘤治疗带来新的希望。纳米药物递送系统不仅可以通过增强渗透和滞留(EPR)效应，被动靶向肿瘤部位，还可以通过对材料的修饰主动靶向肿瘤血管和细胞，从而在一定程度上促进药物在肿瘤部位的富集，提高化疗药物安全性，降低其毒副作用；同时，纳米递药系统还可以改善化疗药物的溶解性，提高化疗药物的稳定性，减少药物与血液中蛋白的结合。
如脂质体是常见的纳米递送载体，如专利CN107753434A公开一种包载亲疏水性不同药物的载药脂质体及其制备方法与应用。该发明将亲疏水性不同的药物载入脂质体内使之具有包载疏水性组分的脂质体壳层和包载亲水性组分的脂质体核，以实现亲疏水性不同的两种及以上组分在不同时间的程序性释放的药物效果。但是，脂质体在体内容易被网状内皮系统清除，药物动力学性质差，且同时负载多种药物时，普通脂质体存在载药量较低、包封率低、不稳定、长期贮存时药物易产生泄漏等问题，正是这些问题限制了脂质体载药递送系统的进一步发展。
发明内容
为了提高肿瘤药物治疗效果，减少副作用和耐药性，本发明目的在于提供一种可降解负载双药的纳米粒子。
本发明另一目的在于提供上述可降解负载双药的纳米粒子的制备方法。增强了递送纳米粒子的整体稳定性，提高了对药物的载药量和包封率，同时实现了对多种药物的可控的释放。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种可降解负载双药的纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子是以磷酸钙(CaP)和脂质体(Lip)复合形成载体，负载盐酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，形成的DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子，具体是将含有PTX的脂质膜与负载了DOX的CaP混合水化得到。
进一步，所述脂质体是由大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)制备得到的DLD脂质体。
该DLD脂质体在中性环境条件下其表面电荷为负电性，然而在弱酸性环境下其表面电荷会发生电性翻转，更容易被细胞摄取。
进一步，所述可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：先制备盐酸阿霉素/磷酸钙(DOX/CaP)纳米粒子，然后制备含有紫杉醇(PTX)的脂质膜，将DOX负载的CaP纳米粒子水溶液加入脂质膜中进行水化、超声处理。
本发明中通过将DOX和PTX同步负载至脂质体材料中，实现DOX和PTX的同步释放，在肿瘤部位协同作用，从而发挥较好的疗效，但是在采用薄膜分散法制备脂质体过程中，对DOX和PTX进行同时负载时发现，直接通过水化脂质膜很难实现高效率的DOX负载，即使使用其他方法，将DOX和PTX同时装载在脂质体纳米粒子中，药物释放时二者存在一定的干扰，对于PTX和DOX缓释可控性不好，且DOX有较高的水溶性，很快就被完全释放，无法维持较长时间的药效，不能与PTX配合形成较好的协同作用。
本发明中采用CaP与脂质体形成复合载体，CaP与脂质体的结合，提高了脂质体的稳定性，同时CaP被脂质体包覆，也降低了CaP的生物毒性。此外，通过先将DOX负载于CaP，再与含有PTX的脂质膜复合的方式，使得亲水性的DOX负载在CaP纳米粒子中，再进一步进入脂质体的内水相中，而疏水性的PTX负载在含有CaP@Lip的双分子层中，DOX和PTX有着各自独立的载药空间和释放通道，彼此载药和缓释不受影响，避免了药物间的相互作用干扰，此外，DOX通过CaP的负载和脂质体包封的双重作用，实现了DOX的有效缓释，提高了药物的治疗效果。同时，该具有独立的载药空间和释放通道的双药递送体系能够有效克服药物耐药性，用最小的剂量达到较好的治疗效果，降低了药物毒性，减少副作用。
进一步，上述制备DOX/CaP纳米粒子是将DOX水溶液与CaP纳米粒子水溶液混合，置于混合仪上旋转20～24h，然后离心洗涤。
进一步，所述DOX水溶液与CaP纳米粒子水溶液的体积比为0.4～0.5:1，DOX水溶液浓度为5mg·mL-1，CaP纳米粒子水溶液的浓度为2mg·mL-1。
进一步，上述制备含有PTX的脂质膜是将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜。
进一步，所述大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.5～8:1～1.2:3.2～3.5:1～1.2。
进一步，优选的，所述大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.7:1.1:3.3:1.1。
进一步，所述混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为2：1。
进一步，所述水化的温度为50～55℃，水化时间为4～6min。
进一步，所述超声处理时间为4～5min，具体是每间隔5s，超声5s，超声功率为30～40W。
进一步，所述CaP是在去离子水中加入聚丙烯酸(PAA)水溶液，搅拌后加入Ca(OH)2，超声15～20min得混合液，在混合液中滴加异丙醇，再加入Na2HPO4进行反应8～12h，反应结束后洗涤得到。
进一步，所述混合液中去离子水/聚丙烯酸水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.8～1mL:48～50mg，其中聚丙烯酸水溶液的浓度为0.2g·mL-1。
进一步，所述混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:155～160mg，其中异丙醇的滴加速率为1～2s/滴。
所述洗涤是采用去离子水在8000rpm下洗涤8～10min，重复2～3次。
最具体的，一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
步骤1、制备CaP纳米粒子
(1)在去离子水中，加入浓度为0.2g·mL-1的PAA水溶液，搅拌均匀后加入Ca(OH)2，超声15～20min得混合液，其中去离子水、PAA水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.8～1mL:48～50mg；
(2)在混合液中以1～2S/滴的速率滴加异丙醇，滴加完毕后，称取Na2HPO4加入上述溶液中，反应8～12h，最后使用去离子水在8000rpm水洗8～10min，重复2～3次，获得CaP纳米粒子，混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:155～160mg；
步骤2、制备负载DOX的CaP纳米粒子
将DOX配制成浓度为5mg·mL-1的水溶液与配制成2mg·mL-1的CaP纳米粒子水溶液按照体积比为0.4～0.5:1混合，置于混合仪上旋转20～24h，然后使用去离子水在8000rpm下水洗8～10min，重复2～3次，得DOX/CaP纳米粒子；
步骤3、制备负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇体积比为2：1的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜，大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.5～8:1～1.2:3.2～3.5:1～1.2；
(2)在脂质膜中加入DOX/CaP纳米粒子水溶液，在50～55℃下水化4～6min，然后在30～40W下超声处理，具体是每间隔5s超声5s，总时长为4～5min，得负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，DOX/CaP纳米粒子水溶液的浓度是1.26～1.28mg·mL-1，且制备脂质膜使用的PTX和DOX/CaP纳米粒子水溶液的质量比为1～1.1:3.8～4。
本发明具有如下技术效果：
本发明制备的可降解负载双药的纳米粒子中，纳米粒子的结构稳定性优异，亲水性的DOX和疏水性的PTX拥有各自独立的载药空间和释放通道，避免了药物负载和释放时的相互干扰，使得纳米粒子具有较高的载药量和包封率，同时该体系形成了对药物的有效缓释，使得DOX和PTX能更好的发挥协同作用，实现了小计量达到高效治疗效果。
附图说明
图1：CaP纳米粒子，CaP@Lip纳米粒子，负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子的动态光散射(DLS)图。
图2：CaP纳米粒子、CaP@Lip纳米粒子、磷钨酸负染的CaP@Lip纳米粒子和DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子的透射电镜(TEM)图。
图3：CaP@Lip纳米粒子在pH为7.4和5.5条件下随时间变化纳米粒子降解透射电镜图。
图4：游离DOX在不同pH下体外积累释放图。
图5：对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子在不同pH下体外积累释放图。
图6：负载DOX的CaP纳米粒子和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子在pH为5.5和7.4的PBS中体外累积释放图。
图7：游离PTX在不同pH下的体外累计释放图。
图8：负载PTX的CaP@Lip纳米粒子在不同pH下的体外累计释放图。
图9：不同纳米粒子的结晶紫染色结果图。
图10：钙黄绿素-碘化丙啶共染色实验评价不同纳米粒子与细胞孵育12h后的荧光图片。
图11：负载DOX的CaP@Lip纳米粒子和负载DOX的CaP纳米粒子激光共聚焦显微镜(CLSM)结果图。
图12：负载DOX的CaP纳米粒子和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的流式细胞仪分析图。
图13：负载DOX的CaP@Lip纳米粒子在pH 6.8和pH 7.4条件下CLSM结果图。
图14：负载DOX的CaP@Lip纳米粒子在pH6.8和pH7.4条件下流式细胞仪结果图。
图15：CaP@Lip纳米粒子的体外细胞毒性。
图16：不同浓度的CaP@Lip纳米粒子作用2h后的红细胞溶血率。
图17：不同纳米粒子对4T1细胞的细胞毒作用。
图18：不同纳米粒子的抗肿瘤效果。
图19：不同纳米粒子对小鼠心、肝、脾、肺和肾的H&E染色图像。
图20：不同纳米粒体内抗转移作用、肺转移结节、4T1肿瘤小鼠肺组织的H&E染色图片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1、制备CaP纳米粒子
(1)在去离子水中，加入浓度为0.2g·mL-1的PAA水溶液，搅拌均匀后加入Ca(OH)2，超声15min得混合液，其中去离子水/PAA水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.8mL:48mg；
(2)在混合液中以1～2s/滴的速率滴加异丙醇，滴加完毕后，称取Na2HPO4加入上述溶液中，反应10h，最后使用去离子水在8000rpm水洗8min，重复3次，获得CaP纳米粒子，混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:155.2mg；
步骤2、制备负载DOX的CaP纳米粒子
将DOX配制成浓度为5mg·mL-1的水溶液与配制成2mg·mL-1的CaP纳米粒子水溶液按照体积比为0.4:1混合，置于混合仪上旋转24h，然后使用去离子水在8000rpm下水洗8min，重复3次，得DOX/CaP纳米粒子；
步骤3、制备负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇体积比为2：1的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜，大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.7:1.1:3.3:1.1；
(2)在脂质膜中加入DOX/CaP纳米粒子水溶液，在50℃下水化5min，然后在35W功率下超声处理，具体是每间隔5s超声5s，总时长为4min，得负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，DOX/CaP纳米粒子水溶液的浓度是1.28mg·mL-1，且制备脂质膜使用的PTX和DOX/CaP纳米粒子水溶液的质量比是1.1:3.8。
通过对CaP纳米粒子、空白的CaP@Lip纳米粒子和DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子通过动态光散射(DLS)分别测定其粒径大小。结果如图1所示。DLS结果显示：其粒径分布均匀。
通过透射电镜(TEM)观察其CaP纳米粒子、CaP@Lip纳米粒子和DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子形貌。结果如图2所示。TEM图像结果显示CaP@Lip纳米粒子的平均尺寸在110±20nm，经药物装载后的CaP@Lip纳米粒子的尺寸略有增加。
生物可降解性：
取适量CaP@Lip纳米粒子置于中性磷酸盐缓冲液(pH＝7.4PBS)和酸性磷酸盐缓冲液(pH＝5.3PBS)中，然后在不同时间点0，3，8h通过TEM观察CaP@Lip纳米粒子的形貌。结果如图3所示。A-C表示CaP@Lip纳米粒子在pH5.5时0、3、8h透射电镜，D-F表示CaP@Lip纳米粒子在pH 7.4时0、3、8h透射电镜。实验结果表明CaP@Lip纳米粒子在弱酸性条件下具有生物降解性，有利于药物释放和在体内的快速代谢。
对比例1：
与实施例1相比，不同点在于，本方案中没有实施例1中将DOX负载于CaP纳米粒子的步骤2，步骤3中先采用大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)制备出脂质膜，然后将与实施例1中等量的DOX和CaP纳米粒子水溶液直接加入脂质膜中，其余步骤、参数均与实施例1一致，制备得到DOX+CaP-Lip。
载药量和包封率的测定：
(1)载药量
通过离心收集负载DOX的CaP@Lip纳米粒子以及对比例1的上清液，用紫外分光光度法在480nm波长处测定上清液中原始DOX和残留DOX的含量。
通过离心收集负载PTX的CaP@Lip纳米粒子的上清液。用紫外分光光度法在232nm波长处测定上清液中原始PTX和残留PTX的含量。
载药量(DL％)由式(1)计算：
Figure BDA0004174795410000081
由于CaP@Lip纳米粒子特定的空间结构，亲水性或疏水性的药物装载入独立的空间中，避免了药物之间的相互影响，亲水性的DOX负载到CaP纳米粒子中，由于CaP中负电性的PAA和正电性的DOX之间存在静电吸引，其负载效率达到了90.0％，对比例1的负载效率为65.0％。
包封率
包封率按照公式(2)计算：
Figure BDA0004174795410000091
由于CaP@Lip纳米粒子实现了亲水性DOX和疏水性PTX的成功装载，二者有各自独立的存储空间，通过离心收集负载DOX的CaP纳米粒子的上清液，CaP纳米粒子对DOX负载效率可以达到90.0％，载药量约为47.3％。对比例1的载药量为39.3％，通过离心收集负载PTX的CaP@Lip纳米粒子的上清液，CaP@Lip纳米粒子对PTX负载效率可以达到70.0％，载药量约为7.0％。
体外释放：
(1)DOX的释放
比较游离的DOX、DOX-CaP、对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子和本发明制备的DOX-CaP@Lip纳米粒子的释放。
通过透析法考察游离DOX、对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子、负载DOX的CaP纳米粒子和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的体外释放行为。
DOX的体外释放行为：采用透析法研究DOX从载药制剂中的体外释放行为。取两份等量的DOX溶液、对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子(5mg)、负载DOX的CaP纳米粒子(5mg)和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子(5mg)，分别分散在pH 7.4和pH 5.5的PBS(1mL)。然后，将透析袋分别浸入30mL的PBS缓冲液(pH7.4和pH5.3)中，在37℃下轻轻摇动，分别在10min、20min、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h取样，通过紫外分光光度法测量DOX的药物释放量。
对于游离DOX、对比例1制备的DOX+CaP@Lip纳米粒子，由于DOX的良好的水溶性，可以很快从透析袋中释放出来，当释放时间为24h时，游离DOX在pH 5.5的PBS中累计释放量可以达到83.6％，如图4所示。对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子的累计释放量83.3％，并且在酸性和中性生理环境下，药物释放行为并没有发生显著变化，如图5所示。这说明对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子对DOX的释放行为并没有起到缓慢释放作用。
如图6所示，对于负载DOX的CaP纳米粒子，当释放时间延长到150h时，在pH 5.5的PBS中累积释药可达95％，而在pH 7.4的PBS中，药物释放仅为25％左右。而负载DOX的CaP@Lip纳米粒子与负载DOX的CaP纳米粒子相比，在pH 5.5和pH 7.4的PBS中，药物释放速度相对缓慢，说明脂质体的成功包裹能够有效地减缓药物释放。
通过上述游离DOX、对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子的释放行为相比较，说明DOX装载在CaP纳米粒子中，再通过脂质体的包封更能优化这种缓释药物的行为。
鉴于对比例1制备的DOX+CaP-Lip纳米粒子的释放行为与游离DOX相近，不再对DOX+CaP-Lip纳米粒子进行后续实验。
(2)PTX的释放
比较游离的PTX和本发明制备的DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子中PTX的释放。
PTX的体外释放行为：采用透析法研究PTX从载药制剂中的体外释放行为。取两份等量的游离PTX溶液、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子(5mg)，分别重新分散在pH 7.4和pH 5.3的PBS(1mL)中，并分别向其中加入5％的吐温80。然后，将透析袋分别浸入30mL含有5％吐温80的PBS缓冲液(pH7.4和pH5.3)中，在37℃下轻轻摇动。分别在特定的时间点取样，通过紫外分光光度法测量PTX的释放量。
如图7-8所示，游离PTX的药物释放速度很快，在24h时累计释放73.7％，并且释放行为没有pH响应。负载PTX的纳米粒子在pH 5.5的PBS中的药物释放速度明显快于在中性条件下的释放速度。这是由于在弱酸条件下，磷脂双分子层中的马来酸酐酰胺键断裂，促进了药物的释放。游离PTX的药物释放在明显快于PTX负载的纳米粒子的药物释放速度，结果充分说明，脂质体对PTX的包封有效实现了药物的缓慢释放。
细胞实验：
以下试验中用到的纳米粒子中，负载DOX的CaP@Lip纳米粒子和实施例1中步骤一致，不同点在于制备的脂质膜中不含PTX；负载PTX的CaP@Lip纳米粒子的制备与实施例1中步骤一致，不同点在于在含有PTX的脂质膜中直接加入CaP，没有DOX。
1.体外抗肿瘤试验
(1)结晶紫染色
A.铺板：将4T1细胞(1×105)孔接种于6孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
B.加药：设置5个分组，分别是对照组、CaP@Lip纳米粒子组(10μg mL-1)、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组(10μg mL-1)、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组(10μg mL-1)、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组(10μg mL-1)，其中对照组加入1mL 1640培养基，随后放入培养箱孵育24h。
C.处理：吸出板中细胞上清液，将6孔板置于冰上用预冷的PBS洗两次，每个孔中加入1mL的4％的组织固定液避光固定10min，PBS洗两次，用1％的结晶紫染色液覆盖细胞染色。
结晶紫染色测定结果：
通过对对照组、CaP@Lip纳米粒子组、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组的结晶紫染色后的颜色对比，如图9所示，对照组和CaP@Lip纳米粒子组颜色最深，而负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组，负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组和负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组结晶紫颜色呈现出依次由深到浅的趋势。结果表明，负载药物的纳米粒子组都对细胞的增殖有抑制作用，其中负载DOX/PTX的纳米粒子组对细胞增殖抑制作用最强。
(2)活-死细胞染色实验
A.铺板：将4T1细胞(1×105)孔接种于6孔板爬片上，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
B.加药：设置5个分组，分别是对照组、CaP@Lip纳米粒子组(5μg mL-1)、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组(5μg mL-1)、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组(5μg mL-1)、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组(5μg mL-1)，其中对照组加入1mL 1640培养基，随后放入培养箱孵育12h。
C.处理：将低温保存的活死双染试剂盒提前拿出放在室温下解冻，溶解后配制染色液。用去离子水将10×Assay Buffer(反应缓冲液)稀释10倍得到1×Assay Buffer。取4μL钙黄绿素溶液(2mM)和12μL碘化丙啶溶液(1.5mM)加入到4mL 1×Assay Buffer中，并用涡旋仪混匀。然后将6孔板从培养箱中取出放入超净台，弃去孔中液体，PBS洗2次，每个孔中加入500μL配制好的染色液，放入培养箱孵育15min后吸出液体，PBS洗涤两次，用1mL注射器针头挑起细胞爬片，倒扣至已滴加50％甘油的载玻片上，避光储存，于荧光显微镜下拍照观察。
活/死细胞染色实验结果：
采用钙黄绿素(绿色)和碘化丙啶(红色)双重染色法研究CaP@Lip纳米粒子、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子和负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子对细胞增殖的抑制作用。绿色代表活细胞，红色代表死细胞，如图10所示，对照组和CaP@Lip纳米粒子组几乎没有细胞凋亡，负载PTX的纳米粒子组和负载DOX的纳米粒子组细胞凋亡逐渐增多，而负载DOX/PTX的纳米粒子组较其它组显示更多的凋亡细胞。结果表明，负载DOX/PTX的纳米粒子对细胞增殖的抑制作用最强。
体外抗肿瘤活性结果表明：载药纳米粒子都对细胞的增殖起到一定的抑制作用，但本发明制备的负载DOX/PTX-CaP@Lip的纳米粒子与其他负载单一药物的纳米粒子相比，抑制细胞增殖作用更强。
2.对载药纳米粒子摄取
(1)激光共聚焦(CLSM)：将4T1细胞(1×105)接种于6孔板爬片上，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。然后，将制备好的负载DOX的CaP纳米粒子(2μg·mL-1)和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子(2μg·mL-1)加入在细胞中，孵育一定的时间后，弃去孔中液体，PBS洗2次以清除剩余的DOX负载的纳米粒子和死亡细胞。用4％的组织固定液避光固定20min，PBS洗2次，再加入配制好的5μg·mL-1的DAPI染色液，孵育10min后PBS洗2次，用1mL注射器针头挑起细胞爬片，倒扣至已滴加50％甘油的载玻片上，避光储存，于CLSM下进行拍照观察。
采用CLSM考察负载DOX的CaP纳米粒子和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子与细胞共同孵化后的摄取情况。DOX作为荧光探针来检测细胞对纳米粒子的摄取过程。CLSM结果：
如图11所示(比例尺＝25μm)，在相同时间下，可以清楚地看到负载DOX的纳米粒子在4T1细胞中广泛内化，DOX内化于细胞核中并发出强烈的红色荧光。对于负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组，细胞核中的DOX荧光强度相对较弱，通过对照说明在相同的时间，CaP@Lip纳米粒子组在细胞中药物释放相对缓慢。
(2)流式：将4T1细胞(1×105)接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。然后，将制备好的负载DOX的CaP纳米粒子(2μg·mL-1)和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子(2μg·mL-1)按照不同的时间点0.5、1、3、6h依次加入在细胞中，孵育一定的时间后，弃去孔中液体，用PBS洗2次以清除剩余的负载DOX的纳米粒子和死亡细胞，随后加入500μL无EDTA的E酶放入培养箱消化4min左右，用含10％胎牛血清的DMEM 500μL终止消化，将细胞轻轻吹打下来放入离心管中离心(800rpm，5min)，吸走液体，加入1mL PBS离心洗涤一次，最后用400μLPBS进行重悬在流式细胞仪上进行测试。
采用流式细胞仪进一步考察负载DOX的CaP纳米粒子组和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组的细胞摄取，通过比较负载DOX的CaP纳米粒子和负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的摄取结果。结果如图12所示：图中蓝线代表负载DOX的CaP纳米粒子，红线代表负载DOX的CaP@Lip纳米粒子，随着时间的增加，细胞对药物的摄取逐渐增多。但是，细胞对负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组的药物摄取相对较慢，因此也说明，CaP@Lip纳米粒子有效的减缓药物释放速度。
3.载药纳米粒子对细胞内电荷转换作用
采用CLSM和流式细胞仪考察4T1细胞在pH 7.4和pH 6.8条件下，对负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的摄取情况。CLSM结果如图13(比例尺＝25μm)所示，当pH为6.8时，负载DOX的CaP@Lip纳米粒子中的红色荧光比pH 7.4时更强。流式细胞仪测试结果如图14所示，蓝线表示细胞在pH6.8时对负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的摄取，红线表示在pH7.4时细胞摄取对负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的摄取。随着时间的延长，细胞对药物的摄取逐渐增多。但当pH为6.8时，细胞对负载DOX的CaP@Lip纳米粒子的摄取更多。因此这两个实验都表明，在弱酸性条件下，纳米粒子带正电，更有有利于细胞的摄取。
4.体外生物安全性研究
(1)细胞毒性实验
本实验以Vero细胞为模型细胞，采用MTT法分析CaP@Lip纳米粒子对正常细胞的毒性。
将Vero细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL,置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后，弃去旧的培养基，分别加入等体积含有不同浓度的CaP@Lip纳米粒子(CaP@Lip纳米粒子浓度为6.25～200μgmL-1)，以加入不含纳米粒子的培养基为对照组；共同孵育24h后弃去培养基，PBS洗两次，每孔加入10μL MTT溶液(5.0mg mL-1)，于37℃下继续孵育4h；随后弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，恒温震荡10min后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度值。细胞存活率计算公式为：
Figure BDA0004174795410000151
实验结果：
采用MTT法考察了纳米粒子对正常细胞的毒性，以评价该载体材料的生物相容性。结果如图15所示，CaP@Lip纳米粒子的体外细胞毒性(均值±SD，n＝6)表现为随着纳米粒子浓度升高，细胞存活率没有明显的降低，即使当纳米粒子浓度达到200μg mL-1时，细胞存活率仍大于90％，因此说明CaP@Lip纳米粒子表现出良好的生物安全性。
(2)溶血性试验
取适量新鲜家兔动脉血于用肝素钠浸润的离心管中。量取全血5mL，加入等渗Saline10 mL充分摇匀，离心(1000rpm，10min)，弃去上清液，用Saline清洗三遍，弃去上清液，余下为压积红细胞。将得到的红细胞用Saline稀释为2％(v/v)的红细胞悬液。分别取200μL 2％(v/v)的红细胞悬液与200μL受试溶液CaP@Lip纳米粒子(CaP@Lip纳米粒子浓度为15～500μg mL-1)混合，作用2h后进行观察并计算其溶血率。
溶血性实验结果：
通过对CaP@Lip纳米粒子血液相容性的考察，如图16所示，图中插图为离心后的CaP@Lip纳米粒子与红细胞混合的照片。可见，即使在最高测试浓度(500μg mL-1)下，其溶血率都低于10％，这表明我们研究中使用的CaP@Lip纳米粒子具有良好的血液相容性。
5.载药纳米粒子对细胞体外杀伤作用
采用MTT法来考察载药纳米粒子对细胞体外杀伤作用。如图17所示，随着载药纳米粒子浓度的不断增高，细胞存活率在逐渐降低。同时，负载双药的CaP@Lip纳米粒子与负载单药的CaP@Lip纳米粒子相比，对细胞增殖抑制作用更强，当载药浓度达到100μg mL-1时，细胞的存活率仅为11.1％。而纳米粒子组对细胞存活率无明显影响，也更加充分说明纳米粒子组对细胞无毒性。
动物实验(体内试验)
小鼠体内肿瘤实验当肿瘤体积达到80mm3左右时，将小鼠随机分为6组进行给药，按相同剂量的DOX(1.8mg/kg)、PTX(2.5mg/kg)给小鼠尾静脉注射PBS、CaP@Lip纳米粒子、游离的DOX/PTX、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，每只注射200μL，每隔一天给一次药，每一次给药前都要对小鼠进行称重和肿瘤体积的测量，并做好记录。给药结束后，将小鼠断颈安乐处死，取出肿瘤和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，每一组摆放在一起，观察其肿瘤体积变化并拍照记录。为探讨其抑制肿瘤生长的机制，对肿瘤组织进行HE、Ki67和TUNEL染色。
实验结果：
在对照组中，由于肿瘤的快速生长导致小鼠体重轻微增加，然而因为游离药物的毒性，在DOX/PTX组中小鼠体重出现轻微的减轻，而在CaP@Lip纳米粒子组、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组，小鼠体重没有明显下降，表明我们制备的纳米粒子可以作为安全的给药系统。在肿瘤的生长曲线、肿瘤的代表性照片(图和肿瘤重量中看出，负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组的肿瘤体积是最小的，对照组和CaP@Lip纳米粒子组对肿瘤生长无抑制作用，游离的DOX/PTX组对肿瘤生长有轻微的抑制作用，载药纳米粒子组对肿瘤生长有较好的抑制作用，其中负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组对肿瘤生长抑制作用最大，可以达到75％，该组的小鼠肿瘤体积和重量最小。为探讨其抑制肿瘤生长的机制，对肿瘤组织进行了HE、Ki67和TUNEL染色。H&E染色显示对照组的肿瘤细胞状态良好，负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组细胞出现最大程度的凋亡和坏死。Ki67染色的肿瘤切片图像显示，负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组对细胞的增殖抑制作用最明显。通过TUNEL检测肿瘤细胞的凋亡率，并用Hoechst 33258(蓝色)对肿瘤组织中的细胞核进行染色以进一步评价治疗效果，如图18所示，TUNEL结果显示，对照组和CaP@Lip组无明显的细胞凋亡，游离的DOX/PTX组、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子组、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子组和负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组都出现了一定程度的细胞凋亡，其中负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组肿瘤组织中的凋亡细胞数最多，因此表明了两种药物联合使用良好的抗肿瘤效果。具体结果如图18所示，其中(A)为不同治疗后不同组别的肿瘤生长曲线，(B)为16天后，安乐处死小鼠，分离肿瘤，并展示了一张具有代表性的肿瘤照片(C)，(D)为不同组别的肿瘤重量，(E)为实验后取肿瘤组织切片，进行H&E、Ki-67和TUNEL染色以及肿瘤组织切片用TUNEL染色(绿色，比例尺＝200μm)，(F)为细胞核用Hoechst33258蓝色染色(蓝色，比例尺＝200μm)。
2.体内毒性实验
将CaP@Lip纳米粒子组和负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组小鼠的主要脏器置于4％多聚甲醛中，4℃条件下固定24h，石蜡包埋后切成厚度为4μm的切片，经脱蜡、梯度脱水处理后，进行苏木精-伊红(H&E)染色，利用倒置显微镜观察获得的组织。
实验结果：通过对小鼠主要脏器进行染色，H&E染色图像结果如图19所示，与对照组相比，CaP@Lip纳米粒子组和负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子组小鼠的心、肝、脾、肺、肾没有明显的损伤，表明纳米粒子可以作为安全的药物递送系统用于肿瘤部位的药物输送。
3.4T1的抗转移实验
为了进一步研究负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子在乳腺癌转移小鼠体内的靶向能力，建立了经尾静脉注射4T1细胞的肺转移模型，模拟肿瘤细胞从实体瘤向血液的扩散过程。将4T1细胞进行消化，收集细胞，用无FBS的DMEM培养液将其重悬，用细胞计数板对其进行计数，每只小鼠接种2×105个，4T1肺转移模型采用尾静脉注射细胞的方法建立。将4T1荷瘤小鼠随机分为6组。6天后，按相同剂量的DOX(1.8mg/kg)、PTX(2.5mg/kg)给小鼠尾静脉注射PBS、CaP@Lip纳米粒子、游离的DOX/PTX、负载DOX的CaP@Lip纳米粒子、负载PTX的CaP@Lip纳米粒子、负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，同时记录荷瘤小鼠的体重。第15天取各组小鼠肺组织，计数肺转移灶。肺组织固定于4％多聚甲醛溶液中，进行H&E染色。
实验结果：如图20所示，(A)4T1肿瘤肺转移模型的建立及负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒体内抗转移作用的研究；(B)肺转移结节的定量分析；(C)不同治疗组治疗后第15天荷4T1肿瘤小鼠肺组织的H&E染色。与对照组相比，CaP@Lip纳米粒子组转移灶数量大约为25个，转移程度与对照组接近；DOX/PTX组、负载DOX的CaP@Lip组、负载PTX的CaP@Lip组转移灶数量大约为18、16、11个；负载DOX/PTX的CaP@Lip组转移灶数量明显减少，大约为4个。结果表明，单一载药纳米粒子对肿瘤细胞的肺转移有轻微的抑制作用，而负载双药纳米粒子对肺转移有明显的抑制作用。为了探究4T1细胞肺转移的机制，对各组小鼠肺组织进行HE染色分析，对照组有广泛的肺转移，然而，负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子治疗组的转移灶面积显著减少，由此表明双药联合治疗也能有效抑制肺转移的发生。
实施例2
一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1、制备CaP纳米粒子
(1)在去离子水中，加入浓度为0.2g·mL-1的聚丙烯酸(PAA)水溶液，搅拌均匀后加入Ca(OH)2，超声20min得混合液，其中去离子水/PAA水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:1mL:50mg；
(2)在混合液中以1～2S/滴的速率滴加异丙醇，滴加完毕后，称取Na2HPO4加入上述溶液中，反应8h，最后使用去离子水在8000rpm水洗10min，重复2～3次，获得CaP纳米粒子，混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:160mg；
步骤2、制备负载DOX的CaP纳米粒子
将DOX配制成浓度为5mg·mL-1的水溶液与配制成2mg·mL-1的CaP纳米粒子水溶液按照体积比为0.5:1混合，置于混合仪上旋转20h，然后使用去离子水在8000rpm下水洗10min，重复3次，得DOX/CaP纳米粒子；
步骤3、制备负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇体积比为2：1的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜，大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为8:1.2:3.5:1；
(2)在脂质膜中加入DOX/CaP纳米粒子水溶液，在55℃下水化4min，然后在功率为40W下超声处理，具体是每间隔5s超声5s，总时长为5min，得负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，DOX/CaP纳米粒子水溶液的浓度是1.26mg·mL-1，且制备脂质膜使用的PTX和DOX/CaP纳米粒子水溶液的质量比是1:3.9。
实施例3
一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤1、制备CaP纳米粒子
(1)在去离子水中，加入浓度为0.2g·mL-1的聚丙烯酸(PAA)水溶液，搅拌均匀后加入Ca(OH)2，超声18min得混合液，其中去离子水/聚丙烯酸水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.9mL:49mg；
(2)在混合液中以1～2S/滴的速率滴加异丙醇，滴加完毕后，称取Na2HPO4加入上述溶液中，反应11h，最后使用去离子水在8000rpm水洗9min，重复3次，获得CaP纳米粒子，混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:158mg；
步骤2、制备负载DOX的CaP纳米粒子
将DOX配制成浓度为5mg·mL-1的水溶液与配制成2mg·mL-1的CaP纳米粒子水溶液按照体积比为0.4:1混合，置于混合仪上旋转22h，然后使用去离子水在8000rpm下水洗10min，重复3次，得DOX/CaP纳米粒子；
步骤3、制备负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇体积比为2：1的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜，大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.5:1:3.2:1.2；
(2)在脂质膜中加入DOX/CaP纳米粒子水溶液，在55℃下水化6min，然后在(功率)下超声处理，具体是每间隔5s超声5s，总时长为4min，得负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，DOX/CaP纳米粒子水溶液的浓度是1.27mg·mL-1，且制备脂质膜使用的PTX和DOX/CaP纳米粒子水溶液的质量比是1.1:4。

Claims (10)

1.一种可降解负载双药的纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子是以磷酸钙(CaP)和脂质体(Lip)复合形成载体，负载盐酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，形成的DOX/PTX-CaP@Lip纳米粒子，具体是将含有PTX的脂质膜与负载了DOX的CaP混合水化得到。
2.一种如权利要求1所述的可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：先制备盐酸阿霉素/磷酸钙(DOX/CaP)纳米粒子，然后制备含有紫杉醇(PTX)的脂质膜，将DOX/CaP纳米粒子水溶液加入脂质膜中进行水化、超声处理。
3.如权利要求2所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述制备DOX/CaP纳米粒子是将DOX水溶液与CaP纳米粒子水溶液混合，置于混合仪上旋转20～24h，然后离心洗涤，所述DOX水溶液与CaP纳米粒子水溶液的体积比为0.4～0.5:1，DOX水溶液浓度为5mg·mL-1，CaP纳米粒子水溶液的浓度为2mg·mL-1。
4.如权利要求2或3所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述制备含有PTX的脂质膜是将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜。
5.如权利要求4所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.5～8:1～1.2:3.2～3.5:1～1.2。
6.如权利要求2-5任一项所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述超声处理时间为4～5min，具体是每间隔5s，超声5s，超声功率为30-40W。
7.如权利要求3所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述CaP纳米粒子是在去离子水中加入聚丙烯酸水溶液，搅拌后加入Ca(OH)2，超声15～20min得混合液，在混合液中滴加异丙醇，再加入Na2HPO4进行反应8～12h，反应结束后洗涤得到。
8.如权利要求7所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述混合液中去离子水/聚丙烯酸水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.8～1mL:48～50mg，其中聚丙烯酸水溶液的浓度为0.2g·mL-1。
9.如权利要求8所述的一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:155～160mg，其中异丙醇的滴加速率为1～2s/滴。
10.一种可降解负载双药的纳米粒子的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
步骤1、制备CaP纳米粒子
(1)在去离子水中，加入浓度为0.2g·mL-1的聚丙烯酸水溶液，搅拌均匀后加入Ca(OH)2，超声15～20min得混合液，其中去离子水/聚丙烯酸水溶液和Ca(OH)2的用量比为100mL:0.8～1mL:48～50mg；
(2)在混合液中以1～2S/滴的速率滴加异丙醇，滴加完毕后，称取Na2HPO4加入上述溶液中，反应8～12h，最后使用去离子水在8000rpm水洗8～10min，重复2～3次，获得CaP纳米粒子，混合液中使用的去离子水、异丙醇和Na2HPO4的用量比为100mL:200mL:155～160mg；
步骤2、制备负载DOX的CaP纳米粒子
将DOX配制成浓度为5mg·mL-1的水溶液与配制成2mg·mL-1的CaP纳米粒子水溶液按照体积比为0.4～0.5:1混合，置于混合仪上旋转20～24h，然后使用去离子水在8000rpm下水洗8～10min，重复2～3次，得DOX/CaP纳米粒子；
步骤3、制备负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-Lys-DMA(DLD)和紫杉醇(PTX)溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，经旋转蒸发得含有PTX的脂质膜，大豆卵磷脂、胆固醇、DLD和PTX的质量比为7.5～8:1～1.2:3.2～3.5:1～1.2；
(2)在脂质膜中加入DOX/CaP纳米粒子水溶液，水化，然后在功率为30-40W下超声处理，具体是每间隔5s超声5s，总时长为4～5min，得负载DOX/PTX的CaP@Lip纳米粒子，DOX/CaP纳米粒子水溶液的浓度是1.26～1.28mg·mL-1，且制备脂质膜使用的PTX和DOX/CaP纳米粒子水溶液的质量比为1～1.1:3.8～4。
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