ES2214269T3 - Composiciones liposomicas para una retencion del farmaco mejorada. - Google Patents

Composiciones liposomicas para una retencion del farmaco mejorada.

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ES2214269T3 ES00926483T ES00926483T ES2214269T3 ES 2214269 T3 ES2214269 T3 ES 2214269T3 ES 00926483 T ES00926483 T ES 00926483T ES 00926483 T ES00926483 T ES 00926483T ES 2214269 T3 ES2214269 T3 ES 2214269T3
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Abstract

Composición liposómica, que comprende una suspensión liposómica compuesta de un lípido formador de vesícula; contenida dentro de los liposomas, un compuesto de fluorquinolona y un polímero polianiónico eficaz para formar un complejo con la fluorquinolona y para aumentar la retención de la fluorquinolona en los liposomas.

Description

Composiciones liposómicas para una retención del fármaco mejorada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición liposómica que proporciona una retención de un fármaco dentro de los liposomas mejorada. En particular, la invención se refiere a liposomas que incluyen un compuesto antibiótico de fluorquinolona.
Antecedentes de la invención
Los liposomas o vesículas de lípido, constituyen un sistema reconocido de administración de fármacos que puede mejorar la actividad terapéutica y aumentar la seguridad de varios agentes terapéuticos. Para su utilización como excipientes in vivo de compuestos de diagnóstico o terapéuticos, los liposomas se preparan de forma típica para contener el compuesto ocluido en el liposoma. Para ser útiles en los tratamientos médicos, las formulaciones liposómicas deberían tener una gran eficacia de carga, es decir, una proporción fármaco a lípido grande para reducir la cantidad de lípido no terapéutico en el paciente y deberían tener un periodo de conservación práctico cuando el compuesto está ocluido, con poca fuga o pérdida de actividad durante el almacenamiento.
Existen dos procedimientos generales para preparar formulaciones liposómicas, el de carga pasiva, en el que el fármaco y el lípido se combinan en el momento de la formación de la vesículas de lípido y el de carga aislada, en el que el fármaco se carga dentro de los liposomas después de la formación de la vesícula de lípido. En el procedimiento de carga pasiva, una película de lípido seca se hidrata de forma típica con un medio en fase acuosa que contiene el fármaco en cuestión, para formar vesículas multilaminares que retienen de forma pasiva el compuesto durante la formación del liposoma. El compuesto puede ser bien un compuesto lipófilo incluido en la película seca de lípido o un compuesto soluble en agua contenido en el medio hidratante. Para los compuestos solubles en agua, este procedimiento proporciona eficacias de encapsulación bastante escasas, en el que de forma típica solamente ente el 5 y el 20% del compuesto total en la suspensión final liposómicas están en forma encapsulada. Otro compuesto se puede perder si las vesículas se procesan más, es decir, por extrusión, para producir liposomas más pequeños, de tamaño más uniforme.
Se conocen otros procedimientos de oclusión pasiva para formar liposomas cargados con el compuesto y se han propuesto procedimientos de inyección de disolvente y un planteamiento de evaporación en fase inversa (Szoka, F.C., Jr. y Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198 (1978)). Estos procedimientos tienden a adolecer de eficacias de carga relativamente escasas y/o problemas de difícil manipulación de los disolventes.
La carga aislada de los compuestos ha proporcionado un medio para superar algunas de las deficiencias de la carga pasiva y en particular proporciona una metodología que puede conseguir una relación de fármaco a lípido grande. En la carga aislada, se establece un gradiente iónico, como por ejemplo un gradiente de ión hidrógeno o amonio, a través de la bicapa liposoma-lípido y se carga un compuesto ionizable dentro de los liposomas.
Sin embargo, existen problemas reconocidos con la carga aislada frente a un gradiente iónico, siendo uno de ellos que está limitado a los fármacos con un grupo ionizable. Además, no todos los fármacos ionizables se acumulan en los liposomas en respuesta a un gradiente iónico ((Chakrabarti, A., et al., Patente U.S. nº 5.380.532; Madden, T.D., et al., Chemistry and Physics of Lipids 53:37-46 (1990)). Otro problema es que algunos agentes que se acumulan en los liposomas se liberan inmediatamente después de la acumulación. Otro problema todavía es que algunos agentes que se cargan con éxito y se retienen en el liposoma in vitro tienen un índice de fuga elevado en los liposomas in vivo, obviando las ventajas de la administración del agente en forma ocluida por los liposomas.
Sumario de la invención
Por consiguiente, un objetivo de la invención consiste en proporcionar una composición liposómica que incluya un compuesto ionizable, en particular una fluorquinolona, ocluida en los liposomas con retención superior.
Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para preparar dicha composición liposómica.
En un aspecto, la invención incluye una composición liposómica, compuesta de una suspensión liposómica formados por un lípido formador de vesículas. Dentro de los liposomas está contenido el compuesto de fluorquinolona y un polímero eficaz para formar un complejo con la fluorquinolona y para aumentar la retención de la fluorquinolona en los liposomas.
En una forma de realización, la fluorquinolona es la 6-fluorquinolona. En una forma de realización preferida, la 6-fluorquinolona se selecciona de entre el grupo constituido por norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, lomefloxacina, flerofloxacina, perfloxacina y amifloxacina.
En otra forma de realización, el polímero polianiónico es un polímero que tiene grupos aniónicos seleccionados de entre grupos sulfato, sulfonato, fosfato y carboxilatos. En particular, el polímero polianiónico se selecciona de entre sulfato de dextrano, sulfato A de condroitina, ácido polivinilsulfónico y ácido polifosfórico.
Los liposomas, en otra forma de realización, incluyen además un lípido derivado con un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol.
En una forma de realización preferida, los liposomas incluyen el polímero polianiónico sulfato de dextrano y la 6-fluorquinolona, ciprofloxacina.
En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento para aumentar la retención de la 6-fluorquinolona en un liposoma. El procedimiento incluye la preparación de los liposomas compuestos de un lípido formador de vesículas y con un polímero polianiónico ocluido; y la incubación de los liposomas en presencia de un compuesto de 6-fluorquinolona en condiciones eficaces para conseguir la absorción del compuesto en los liposomas y el acomplejamiento del compuesto con el polímero polianiónico.
Todavía en otro aspecto, la invención incluye un procedimiento de preparación de una suspensión liposómica que tiene una 6-fluorquinolona ocluida en los liposomas en forma de un complejo con un polímero polianiónico. El procedimiento incluye las etapas de formación de una suspensión liposómica para tener una fase acuosa interna que incluye el polímero polianiónico y una fase externa que incluye el polímero polianiónico, de eliminación de cualquier polímero polianiónico no ocluido de la fase externa añadiendo una sal eficaz para aumentar la fuerza iónica de la fase de carga externa y que sea eficaz para condensar el polímero; la carga de una 6-fluorquinolona en los liposomas incubando los liposomas en presencia de 6-fluorquinolona en condiciones eficaces para conseguir la absorción de la 6-fluorquinolona en la fase acuosa interna de los liposomas; y la eliminación de cualquier 6-fluorquinolona no ocluida en la fase externa.
En una forma de realización, la eliminación se lleva a cabo por diafiltración del polímero polianiónico condensado.
La sal para la etapa de eliminación se selecciona de entre el grupo constituido por NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4} y K_{2}SO_{4}.
Estos y otros objetivos y características de la invención se apreciarán de forma más completa a partir de la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1A presenta la estructura general de los compuestos antibióticos de quinolona;
la Fig. 1B presenta la estructura general de los compuestos de las 6-fluorquinolonas;
la Fig. 1C presenta la estructura general de los compuestos de las 6-fluorquinolona, ciprofloxacina;
la Fig. 2 es una representación que muestra la cantidad de sulfato de dextrano en las fracciones recogidas en el permeado durante la diafiltración frente al agua (círculos blancos) y frente al NaCl 0,15 M (cuadrados negros), al NaCl 0,35 M (triángulos negros), al NaCl 0,45 M (círculos negos) y al NaCl 1,0 M (símbolos X);
la Fig. 3 es una representación que muestra el porcentaje de ciprofloxacina que queda en los liposomas después de la incubación en plasma en función del tiempo para que los liposomas tengan un agente de oclusión del polímero polianiónico (círculos negros) y liposomas sin agente de oclusión del polímero (cuadrados blancos, diamantes blancos);
la Fig. 4A es una representación que muestra el porcentaje de la dosis inyectada de ciprofloxacina que queda en el torrente sanguíneo en función del tiempo después de la administración in vivo de los liposomas que contienen ciprofloxacina unida al sulfato de dextrano (círculos negros) y de los liposomas que contienen ciprofloxacina unida al ácido poliacrílico (triángulos negros) y de los liposomas que contienen ciprofloxacina sin agente de oclusión del polímero (cuadrados blancos); y
la Fig. 4B presenta la concentración, en \mug/ml, de ciprofloxacina en el torrente sanguíneo después de la administración intravenosa de preparaciones en liposomas de sulfato de dextrano/ ciprofloxacina (círculos negros), de ciprofloxacina acomplejada con poliacrilato (triángulos negros) y liposómica de referencia con ciprofloxacina ocluida sin agente de oclusión del polímero (cuadrados blancos).
Descripción detallada de la invención I. Composición liposómica
La presente invención se refiere a proporcionar una composición que incluye un antibiótico de quinolona preferentemente una 6-fluorquinolona, que se retiene de forma estable en los liposomas. Este apartado describe los componentes del liposoma, incluyendo el fármaco ocluido y el polímero polianiónico y los componentes lípidos del liposoma. La preparación y la caracterización de los liposomas se describirá en los apartados a continuación.
A. Compuesto de quinolona ocluido en los liposomas
Las quinolonas son una clase de agentes antimicrobianos de estructura general de ácido 4-piridona-3-carboxílico, como se muestra en la Fig. 1A. En la estructura general mostrada en la figura, X es N o C y R_{1}, R_{2}, R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} pueden ser cualquier grupo. Algunos miembros de los fármacos de la clase quinolona, tal como el ácido nalidíxico, han estado disponibles durante muchos años. Hace poco, se han introducido las quinolonas fluoradas y estos derivados ofrecen una ventaja terapéutica sobre los primeros miembros de la clase, ya que los agentes fluorados presentan extensa actividad microbiana y son eficaces después de la administración oral para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades infecciosas. Los compuestos además tienen relativamente pocos efectos secundarios y la resistencia microbiana a su acción no se desarrolla rápidamente. La estructura general de las 6-fluorquinolonas se presenta en la Fig. 1B.
Las 6-fluorquinolonas se han estudiado ampliamente y se conocen muchas variaciones estructurales, muchas de las cuales son adecuadas para su utilización en la presente invención. Una de las 6-fluorquinolonas más potentes es la ciprofloxacina (ácido 1-ciclopropil-6-flúor-1,4-dihidro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-quinolina carboxílico), cuya estructura se muestra en la Fig. 1C. Como las demás quinolonas, la ciprofloxacina actúa inhibiendo la replicación bacteriana del ADN. El fármaco se une a la subunidad \beta de la ADN-girasa, una enzima especial para la replicación del ADN que permite que se deshagan y se vuelvan a formar los superenrollamientos e inhibe de forma eficaz su actividad.
La ciprofloxacina incluye un anillo de ciclopropilo en R_{1} y un anillo de piperazina en R_{7}, que incluye una amina ionizable con un pK_{a} de aproximadamente 8,7. Este fármaco es eficaz contra la mayoría de las bacterias patógenas gram negativas y algunas gram positivas. Sin embargo, la eficacia terapéutica del antibacteriano está limitada a su semivida por corta eliminación de 3 a 4 horas, que dificulta el mantener una concentración terapéutica en la sangre.
Como se describió anteriormente, la oclusión de fármacos dentro de los liposomas es un planteamiento para mejorar la eficacia terapéutica del fármaco, y la oclusión de la ciprofloxacina ha sido descrita (Ryan, J. et al., documento WO 91/09616; Wong, J.P. et al., solicitud EP A1 0652008, Hope, M. et al. documento WO 96/26715). Sin embargo, la ciprofloxacina ocluida de forma liposómica no se retiene en los liposomas durante un tiempo suficiente para conseguir la extensión de la biodistribución in vivo de los liposomas de circulación prolongada con un recubrimiento en superficie de cadenas de polímero hidrófilo. Esto se demuestra en el Ejemplo comparativo 1, que describe la preparación de los liposomas con un recubrimiento en superficie de cadenas de polietilenglicol y la oclusión de la ciprofloxacina en los liposomas por carga aislada. Se analizaron in vitro los liposomas que contienen ciprofloxacina para medir la cantidad de ciprofloxacina que se había liberado de los liposomas en el plasma (utilizando la tecnología descrita en el Ejemplo 5). Se observó que casi todo el fármaco fugaba de los liposomas después de la incubación en el plasma durante 4 horas a 37ºC, con aproximadamente el 75% del fármaco liberado en una hora.
Los liposomas de circulación prolongada permanecen en el torrente circulatorio hasta 24 horas. Los liposomas de "circulación prolongada" utilizados en la presente memoria se refieren a liposomas que tiene un recubrimiento en superficie de cadenas de polímero hidrófilo, tal como los liposomas recubiertos con polietilenglicol descritos en la patente U.S. nº 5.013.556. Hasta el 30% de la dosis inyectada de los liposomas de circulación prolongada permanece en el torrente circulatorio 24 horas después de la inyección, en comparación con los liposomas convencionales, p. ej.: liposomas que carecen de recubrimiento de las cadenas de polímero, que se eliminan del torrente sanguíneo en varias horas. Por lo tanto, los liposomas de circulación prolongada consiguen una biodistribución en el cuerpo que incluye órganos y tejidos aparte de los del sistema de fagocitos mononucleados o del sistema reticuloendotelial cuando los liposomas convencionales se acumulan rápidamente después de la administración (Papahadjopoulos, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11460-11464 (1991)). Obviamente, una composición liposómica con ciprofloxacina que libera más de la mitad de la carga de ciprofloxacina en un periodo de varias horas debido a la fuga del fármaco a través de la bicapa del liposoma no presenta las ventajas del tiempo de residencia de la circulación prolongada y de la buena biodistribución de los liposomas de circulación prolongada.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una composición liposómica con ciprofloxacina ocluida dentro de los liposomas y retenida en los liposomas durante un tiempo suficiente para conseguir la biodistribución de los liposomas. En una forma de realización, la ciprofloxacina está ocluida en los liposomas que tienen un recubrimiento en la superficie de cadenas de polímero hidrófilo y la ciprofloxacina está retenida en los liposomas durante un tiempo suficiente para presentar las ventajas del periodo de vida prolongado de los liposomas en la circulación sanguínea, para conseguir buena biodistribución y liberación lenta del compuesto ocluido.
Más generalmente, la invención contempla la oclusión de cualquier número de compuestos dentro de los liposomas y en particular cualquier 6-fluorquinolona. Con referencia otra vez a la Fig. 1B, las 6-flúor-quinolonas son de forma típica cuando R_{1} es un grupo alquilo de C_{1} a C_{3}, como por ejemplo metilo, etilo, propilo o ciclopropilo, que puede estar sustituido en una o más posiciones con F, Cl o Br; R_{7} es un alcano que contiene nitrógeno cíclico lineal o ramificado que contiene preferentemente un grupo amino ionizable; ejemplos de sustituyentes R_{7}incluyen estructuras en anillo tales como 1-azetidilo, 1-piperazinilo, 4-metil-1-piperazinilo, 4-etil-1-piperazinilo, 2-piperazinilo, 1-pirrolidilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido con un grupo NH_{2}, NHCH_{3}, N(CH_{3})_{2}, 2-aminoetilo, etilaminometilo, 1-pirrolidilo o aminoetilaminometilo, otros ejemplos de heterociclos con nitrógeno saturados o insaturados incluyen heterociclos monocíclicos, p. ej.: imidazol, imidazolina, dihidropirrol, 1,2,3,6-tetrahidropiridina, 1,4,5,6-tetrahidropirimidina, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 1,3,5-triazina y heterociclos bicíclicos, p. ej.: perhidroindol, prehidroquinolina, perhidroisoquinolina, perhidro-7-azaindol, perhidro-4-azabenzimidazol, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]noneno (DBN), 1,8-diaza-biciclo[5.5.0]undec-7-eno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]nonano, 1,8-diaza-biciclo-[5.5.0]undecano, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (trietilendiamina), 3-azabiciclo-[3.2.2]-nonano, 3-azabiciclo[4.3.0]nonano, 3-azabiciclo[3.3.0]octano, 2,8-diazabiciclo-[4.3.0]-nonano, 5-diazabiciclo[4.3.0]nonano, 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]-dec-5-eno, 2,7-diazaespiro-[4.4]nonano, X es N o C, de modo que cuando X sea N, R_{8} no es nada y cuando X sea C, R_{8} es H, F, Cl o CF_{3}, OCH_{3} u OCH_{2}CH_{3}, o R_{1} y R_{8} conjuntamente se componen de un puente alquilo o alcoxi de dos o tres átomos que se unen a los átomos 1 y 8 del anillo en el anillo de quinolona para formar un anillo de cinco o seis elementos, respectivamente. Cuando son posibles los estereoisómeros cis- y trans-, se contemplan ambos isómeros. Cuando están presentes centros asimétricos quirales, el compuesto puede incluir uno solo o una mezcla de estereoisómeros, de forma típica una mezcla racémica de estereoisómeros.
Algunas 6-fluorquinolonas preferidas incluyen ciprofloxacina, norfloxacina,ofloxacina, esparfloxacina, lomefloxacina, flerofloxacina, perfloxacina y amifloxacina.
B. Componentes lípidos del liposoma
Como se describió anteriormente, un compuesto de quinolona está ocluido en los liposomas, cuando "ocluido" se refiere al compuesto que está secuestrado en el compartimento acuoso central de los liposomas, en el espacio acuoso entre las bicapas de lípido del liposoma o dentro de la propia bicapa. Más específicamente, en la presente invención, el compuesto de quinolona está ocluido en los liposomas en forma de complejo con el polímero polianiónico descrito anteriormente. "Complejo" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a la especie formada cuando el polímero y la quinolona se ponen en contacto. El complejo puede ser una especie estable en solución o un precipitado. En este apartado, se describen los liposomas para su utilización en la invención.
Los liposomas de la invención se componen de lípidos formadores de vesículas, que incluyen en general lípidos anfipáticos que tienen tanto grupos de cola hidrófobos como grupos polares en cabeza. Una característica del lípido formador de vesículas es su capacidad para formarse en las vesículas bicapa en agua, tal como se ejemplifica mediante los fosfolípidos. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo son preferentemente los que tienen dos colas o cadenas hidrocarbonadas, típicamente grupos acilo y un grupo polar en cabeza. Incluidos en esta clase están los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilinositol (PI), en los que las dos cadenas hidrocarbonadas están comprendidas típicamente entre aproximadamente 14 y 22 átomos de carbono de longitud y presentan varios grados de insatauración. Los fosfolípidos preferidos incluyen PE y PC. Un ejemplo de PC es la fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC). También se pueden utilizar los lípidos de una sola cadena, tal como la esfingomielina (SM).
Los lípidos y fosfolípidos descritos anteriormente cuyas cadenas de acilo presentan varios grados de saturación se pueden adquirir en el comercio o preparar según procedimientos publicados. Otros lípidos que se pueden incluir en la invención son los glucolípidos. El término "glucolípido" utilizado en la presente memoria abarca los lípidos que tienen dos cadenas hidrocarbonadas, una de las cuales es la cadena hidrocarbonada de esfingosina y uno o más restos de azúcar.
Los lípidos para su utilización en la presente invención pueden ser lípidos relativamente "fluidos", lo que significa que la fase fluida tiene una temperatura de fusión del lípido relativamente baja, p. ej.: a o inferior a la temperatura ambiente, o como alternativa, lípidos relativamente "rígidos", lo que significa que el lípido tiene una temperatura de fusión relativamente alta, p. ej.: a temperaturas de hasta 50ºC. Como regla general, los más rígidos, es decir, los lípidos saturados, contribuyen a mayor rigidez de la membrana en la estructura de la bicapa del lípido, y por lo tanto a una retención del fármaco más estable después de la carga activa del fármaco. Los lípidos preferidos de este tipo son aquellos que tienen temperaturas de transición de fase superiores aproximadamente a 37ºC.
Los liposomas pueden incluir además lípidos que pueden estabilizar una vesícula o liposoma compuestos predominantemente de fosfolípidos. El lípido de este grupo empleado más frecuentemente es el colesterol en concentraciones comprendidas entre 25 y 45 moles por ciento.
En una forma de realización, los liposomas de la invención incluyen un recubrimiento en superficie de una cadena de polímero hidrófilo. "Recubrimiento en superficie" se refiere al recubrimiento de cualquier polímero hidrófilo en la superficie de los liposomas. El polímero hidrófilo está incluido en el liposoma incluyendo en la composición del liposoma uno o más lípidos formadores de vesículas derivados con una cadena de polímero hidrófilo. Los lípidos formadores de vesículas que se pueden utilizar son cualquiera de los descritos anteriormente para el primer componente del lípido formador de vesículas, sin embargo, se prefieren los lípidos formadores de vesículas con cadenas de diacilo, como por ejemplo los fosfolípidos. Un fosfolípido preferido es la fosfatidiletanolamina (PE), que contiene un grupo amino reactivo conveniente para el acoplamiento a los polímeros activados. Un ejemplo de PE es diestearil PE (DSPE).
Un polímero hidrófilo preferido para su utilización en el acoplamiento a un lípido formador de vesículas es el polietilenglicol (PEG), preferentemente como una cadena de PEG con un peso molecular comprendido entre 1.000 y 10.000 daltons, más preferentemente entre 1.000 y 5.000 daltons.
Otros polímeros hidrófobos que pueden ser adecuados incluyen ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida y celulosas derivadas, como por ejemplo hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
La preparación de conjugados lípido-polímero que contienen estos polímeros unidos a un lípido adecuado, tal como PE, se ha descrito por ejemplo en la patente U.S. nº 5.395.619 y por Zalipsky en STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic y F. Martin, Eds., CRC Press, capítulo 9 (1995)). Normalmente, en los componentes formadores liposómicos incluyen aproximadamente entre 1 y 20 por ciento de moles del lípido derivado del polímero durante la formación liposómica.
Las cadenas de polímero hidrófilo proporcionan un recubrimiento en superficie de cadenas hidrófilas suficiente para prolongar el tiempo de circulación en la sangre de los liposomas en ausencia de dicho recubrimiento. La prolongación del aumento del tiempo de circulación en la sangre es varias veces el conseguido en ausencia del recubrimiento de polímero, como se describe en la patente US nº 5.013.556 reconocida con la presente.
Además, se pueden preparar liposomas que contengan grupos en la superficie, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, pequeñas moléculas de efector para interactuar con los receptores de la superficie de la célula, antígenos y otros como los compuestos para conseguir las propiedades deseadas de unión a la diana a poblaciones de células específicas. En éstos el componente del lípido incluido en los liposomas incluiría bien un lípido derivado con la molécula de direccionamiento o un lípido con un grupo químico polar en cabeza que se puede derivar con la molécula de direccionamiento en los liposomas formados previamente, según procedimientos conocidos.
C. Polímero polianiónico
Los liposomas según la invención incluyen además un polímero polianiónico ocluido dentro de los liposomas. El polímero es cualquier molécula que consiste en unidades repetitivas de estructura química preferentemente similar y con grupos ionizables, esto es, grupos químicos funcionales capaces de disociación electrolítica que producen la formación de cargas iónicas y preferentemente una carga aniónica. Se contemplan los polímeros que tienen un peso molecular por encima de un intervalo amplio, desde 400 a 2.000.000 Daltons.
Los polímeros polianiónicos adecuados para su utilización en la invención incluyen polímeros sulfatados, sulfonados, carboxilados o hidrófilos fosfatados. Por ejemplo, proteoglucanos sulfatados, como por ejemplo heparina sulfatada, polisacáridos sulfatados, como por ejemplo celulosa sulfatada o derivados de celulosa, carragenina, sulfato de dextrano, mucina, polipéptidos sulfatados, como por ejemplo polilisina con grupos amino sulfatados, glucopétidos derivados de sulfonato o subunidades de péptido y ácido hialurónico. Se contemplan también sulfatos de condroitina A, B y C, sulfatos de queratina y sulfatos de dermatán.
El polímero puede ser también un polímero neutro modificado que incluya un grupo funcional aniónico. Por ejemplo, se puede modificar amilosa, pectina, amilopectina, celulosas y dextrano para que incluyan una subunidad aniónica.
Son asimismo adecuados los polímeros que llevan un grupo sulfo tales como sulfato de polivinilo, sulfonato de polivinilo, sulfonato de poliestireno y goma de colofonia sulfatada.
Tal como se describirá a continuación, el polímero polianiónico está ocluido en los liposomas durante la formación de la vesícula de lípido. En la carga de un fármaco en los liposomas, el polímero sirve entonces para ocluir o retener el fármaco dentro de los liposomas. En estudios realizados en apoyo de la invención, se utilizó sulfato de dextrano como ejemplo de polímero polianiónico. El sulfato de dextrano es un polímero de glucosa anhidra con aproximadamente 2,3 grupos sulfato por resto de glucosoilo. Se compone de aproximadamente 95% enlaces alfa-D-(1,6) y los restantes enlaces (1-3) justifican la ramificación del dextrano. El polímero está disponible fácilmente en pesos moleculares que oscilan entre 5.000 y 500.000 Daltons.
II. Preparación liposómica
Los liposomas para su utilización en la presente invención se preparan para tener un gradiente iónico de dentro a fuera a través de la bicapa de lípido. El gradiente iónico se utiliza a continuación para cargar el compuesto deseado en los liposomas. Los liposomas que tienen dicho gradiente iónico, incluyendo el gradiente del ión hidrógeno y del ión amonio, son conocidos por los expertos en la técnica y se preparan fácilmente utilizado metodologías conocidas.
En los estudios realizados en apoyo de la presente invención, se prepararon liposomas con un gradiente de ión amonio a través de la membrana de lípido. La preparación de dichos liposomas se ha descrito previamente, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.192.549. En ésta los liposomas se prepararon en un tampón acuoso que contiene una sal de amonio, normalmente sal de amonio 0,1 a 0,4 M, tal como sulfato de amonio o sulfato de amonio y dextrano, a un pH adecuado, p. ej.: 5,5 a 7,5. Después de la formación y clasificación por tamaños de los liposomas, se intercambia el medio externo por uno que carece de iones amonio, p. ej.: el mismo tampón, pero aquel en que el sulfato de amonio esté sustituido por NaCl o por un azúcar que proporciona la misma osmolaridad dentro y fuera de los liposomas.
Después de la formación del liposoma, los iones amonio dentro de los liposomas están en equilibrio con el amoniaco y los protones. El amoniaco es capaz de penetrar la bicapa del liposoma y escapar del interior del liposoma. El escape de amoniaco desplaza continuamente el equilibrio dentro del liposoma hacia la derecha, hacia la producción de protones.
Según otro aspecto de la invención, se describe un procedimiento de preparación de una suspensión liposómica que tiene un antibiótico de quinolona ocluido en su interior en forma de complejo con un polímero polianiónico. Tal como se describe en el Ejemplo 2, se prepararon liposomas compuestos de fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC), colesterol y mPEG-DSPE (N-(carbonil-metoxipolietilenglicol 2000)-1,2-diesteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Se disolvieron los lípidos en etanol en una relación molar 50:45,2:4,8. Los lípidos solubilizados se añadieron a una solución de la sal amónica del sulfato de dextrano, preparada como se describe en el Ejemplo 2 y mezclada durante una hora para formar liposomas multilaminares de tamaño heterogéneo y con la sal amónica del sulfato de dextrano ocluida dentro de los liposomas.
Se extruyeron bajo presión los liposomas hidratados para clasificar por tamaños los liposomas de aproximadamente 100 a 150 nm de diámetro, según se indica en el ejemplo.
Después de la formación del liposoma, el fármaco seleccionado se carga en las vesículas. El fármaco, sin embargo, se acomplejará o precipitará en presencia del polímero polianiónico. Por lo tanto cualquier polímero no ocluido se debe eliminar del medio de suspensión externo antes de la carga del fármaco para evitar la formación indeseable del complejo en el medio externo del liposoma. En el caso de la ciprofloxacina, la precipitación tiene lugar en presencia incluso de cantidades muy pequeñas de sulfato de dextrano, p. ej.: 0,1 \mug/ml. Es importante eliminar del medio externo prácticamente todo el polímero no ocluido.
Según una característica importante de este aspecto de la invención, el polímero polianiónico no ocluido se elimina por diafiltración en presencia de un electrolito salino. Según se describe en el Ejemplo 3, se diafiltraron los liposomas formados utilizando la sal amónica del sulfato de dextrano en el medio de hidratación frente a NaCl 350 nM utilizando un cartucho de ultrafiltración de fibra hueca. La presencia de la sal reduce la viscosidad de la suspensión liposómica y condensa el polímero para facilitar la eliminación del sulfato de dextrano. Preferentemente, la diafiltración se realiza en condiciones que producen suficiente eliminación de cualquier polímero no ocluido cuyo complejo o precipitado de polímero/fármaco no es visible durante la etapa de carga del fármaco.
En los estudios realizados en apoyo de la invención, la eliminación de la sal sódica del sulfato de dextrano con un peso molecular medio de 8.000 Daltons, se examinó por diafiltración del sulfato de dextrano frente a agua y frente a varias soluciones salinas que difieren en la fuerza iónica. Según se describe en el Ejemplo 3, una solución de sulfato de dextrano con una concentración de 100 mg/ml se diafiltró frente a NaCl 0,15 M, NaCl 0,35 M, NaCl 0,45 M y NaCl 1,0 M. Se analizó el sulfato de dextrano en el permeado de cada serie de diafiltración y los resultados se presentan en la Fig. 2. Como se observa, el sulfato de dextrano se eliminó con más eficacia cuando se diafiltró frente a soluciones que tienen un aumento de fuerza iónica (NaCl 0,15 M (cuadrados negros), NaCl 0,35 M (triángulos negros), NaCl 0,45 M (círculos negros) y NaCl 1,0 M (símbolos X)). La Tabla 1 resume la cantidad de sulfato de dextrano restante en el retenido después de 10 intercambios de volumen con varias soluciones salinas.
TABLA 1 Concentración de sulfato de dextrano que queda en la solución diafiltrada después de 10 intercambios de volumen
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En general, se observó que se podría eliminar más del 99% de sulfato de dextrano aumentando la fuerza iónica de la solución por diafiltración (es decir, NaCl desde 0 mM hasta 350 mM) y ajustando el pH de la solución a un intervalo neutro (pH =7,4).
Debe apreciarse que se pueden utilizar varios electrolitos para aumentar la fuerza iónica del medio durante la diafiltración. Se prefieren las sales tales como NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4} y K_{2}SO_{4}. La cantidad de electrolito para la eliminación óptima del polímero variará, desde luego, con el polímero y la sal y las cantidades relativas de cada uno. En general, se necesita aproximadamente 150 mM de electrolito, siendo más preferible 450 mM y posible hasta 1000 mM. El límite superior de la cantidad de polielectrolito se determinará en parte por la estabilidad de los liposomas en la solución, ya que se establece un gradiente iónico a través de la bicapa de liposoma y aumenta al aumentar la concentración de electrolito.
El pH del medio de diafiltración se puede ajustar también para optimizar la separación del polímero del medio externo. En los estudios realizados en apoyo de la invención, un pH neutro (p. ej.: pH 7-7,5) proporcionó buena separación del sulfato de dextrano utilizando NaCl como electrolito.
Después de la eliminación del polímero no ocluido, se carga el fármaco seleccionado en los liposomas incubando una solución del fármaco con los liposomas formados previamente en condiciones eficaces para conseguir la carga del fármaco en los liposomas. Según se describió en el Ejemplo 2, se cargó ciprofloxacina en los liposomas que contienen sulfato de dextrano incubando una solución acuosa del fármaco con los liposomas entre 60 y 65ºC durante 30 minutos. Se eliminó a continuación por diafiltración cualquier fármaco no ocluido.
La Tabla 2 resume las propiedades de cuatro preparaciones liposómicas utilizando la preparación liposómica y el procedimiento de diafiltración descritos anteriormente. Las preparaciones incluían como ejemplo la quinolona ciprofloxacina y se determinó la concentración de ciprofloxacina utilizando espectrofotometría. Se determinó el contenido de lípidos totales midiendo el contenido de fosfolípidos totales. Las mediciones del tamaño de partícula se determinaron utilizando dispersión dinámica de la luz.
TABLA 2 Liposomas con sulfato de dextrano/ciprofloxacina ocluido
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En otros estudios realizados en apoyo de la invención, se utilizó ácido poliacrílico con polímero polianiónico, como agente de oclusión para la ciprofloxacina. Tal como se describe en el Ejemplo 4, se hidrataron los lípidos HSPC, colesterol y mPEG y DSPE en una relación molar 40:45,2:4,8 con una solución acuosa de poliacrilato amónico. Después de la eliminación del polímero no ocluido de medio externo por diafiltración en presencia de un polielectrolito, se cargaron los liposomas con ciprofloxacina. Estos liposomas y los liposomas formados utilizando sulfato de dextrano como agente de oclusión se utilizaron para los ensayos de fuga in vitro y para los estudios farmacocinéticos in vivo descritos a continuación.
III. Caracterización de los liposomas
Se caracterizaron in vitro e in vivo los liposomas preparados tal como se describió anteriormente con ciprofloxacina ocluida en forma de complejo con sulfato de dextrano o con poliacrilato.
De forma más específica, se realizaron pruebas in vitro para determinar el índice de fuga de ciprofloxacina de los liposomas en presencia de plasma. Tal como se describe en el Ejemplo 5, se prepararon liposomas y se incubaron en plasma a una concentración de 50 \mug/ de ciprofloxacina/ml de plasma. Se incubaron los liposomas en el plasma a 37ºC durante cuatro horas, con las muestras tomadas a las 0, 1, 2 y 4 horas para análisis.
En el Ejemplo 5 en las Tablas 3A a 3C se resumen los resultados y en la Fig. 3 se muestra el porcentaje de ciprofloxacina restante en los liposomas en función del tiempo. Los liposomas preparados con el agente de oclusión de sulfato de dextrano (círculos negros) presentaban una fuga de ciprofloxacina sustancialmente inferior, permaneciendo el 50% del fármaco en los liposomas después de 2 horas de incubación. En cambio, las preparaciones liposómicas con ciprofloxacina ocluida sin agente de oclusión polianiónico (cuadrados blancos, diamantes blancos) tenían menos de aproximadamente 10% de fármaco todavía en los liposomas después de 2 horas de incubación en plasma de rata.
Las preparaciones liposómicas que contienen ciprofloxacina ocluida en sulfato de dextrano y la ciprofloxacina ocluida en poliacrilato se ensayaron in vivo para determinar las cinéticas de ciprofloxacina administrada en la formulación liposómica preparada según la invención. Como referencia, los liposomas que contienen sulfato de amonio/ciprofloxacina, que están sin agente de oclusión del polímero, se administraron también a animales. Tal como se describe en el Ejemplo 6, se administró a las ratas por vía intravenosa una sola dosis por embolada (40 mg de ciprofloxacina/kg). Se extrajeron muestras de sangre de los animales en varios puntos de tiempo hasta 24 horas y se analizó el contenido de ciprofloxacina. Los resultados se resumen más adelante en la Tabla 5 y se presentan gráficamente en las Figs. 4A y 4B.
La Fig. 4A presenta los resultados de los liposomas que contienen ciprofloxacina unida a sulfato de dextrano (círculos negros), ciprofloxacina acomplejada con poliacrilato (triángulos negros) y de los liposomas de referencia, p. ej.: liposomas que contienen sulfato de amonio/ciprofloxacina sin agente de oclusión del polímero (cuadrados blancos). Como se aprecia, la ciprofloxacina ocluida en los liposomas sin polímero polianiónico (cuadrados blancos) se liberó rápidamente de los liposomas y se eliminó del torrente sanguíneo, con aproximadamente el 50% de la dosis inyectada eliminada aproximadamente 1,5 horas después de la administración. En cambio, los liposomas con agente de oclusión del polímero presentaban de forma significativa mejor retención de ciprofloxacina, con 50% de la dosis de ciprofloxacina todavía presente en el torrente sanguíneo después de 2 horas para los liposomas con sulfato de dextrano como agente de oclusión del polímero (círculos negros) y ácido poliacrílico como agente de oclusión (triángulos negros).
La Fig. 4B es una representación similar que presenta la concentración de ciprofloxacina en el plasma para las formulaciones del ensayo, en la que los liposomas con ciprofloxacina acomplejada con sulfato de dextrano (círculos negros; véase la Tabla 5 para datos no elaborados); para los liposomas con ciprofloxacina acomplejada con polacrilato (triángulos negros, véase la Tabla 5 para datos no elaborados) y para los liposomas que contienen en el compartimento interno ciprofloxacina ocluida con sulfato de amonio sin agente de oclusión del polímero (cuadrados blancos, véase la Tabla 5 para datos no elaborados). El tiempo de residencia mejorado en la circulación sanguínea resultante del aumento de la retención de la ciprofloxacina en los liposomas debido al agente de oclusión es evidente. Cuando se administran en forma liposómica sin agente de oclusión del polímero, queda poca ciprofloxacina en el torrente sanguíneo 24 horas después de la administración. En cambio, cuando se administra el fármaco en los liposomas que incluyen un agente de oclusión del polímero, el fármaco está todavía presente en el punto de tiempo de las 24 horas.
En la Tabla 6 se resumen los parámetros farmacocinéticos AUC (áreas bajo la curva) y la C_{máx} para la ciprofloxacina unida al sulfato de dextrano, la ciprofloxacina unida al poliacrilato y la formulación de referencia sin agente de oclusión del polímero.
TABLA 6 Parámetros farmacocinéticos para las formulaciones de ciprofloxacina liposómica
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Ejemplo comparativo 1
Preparación liposómica que contienen ciprofloxacina
Se prepararon liposomas con un recubrimiento en superficie de polietilenglicol disolviendo fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC), colesterol y polietilenglicol derivados en diasteroil fosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) en una relación molar de 50:45:5 respectivamente, en 50 ml de etanol entre 60 y 65ºC. Se preparó una solución de sulfato de amonio 350mM (pH 5,5) y se calentó entre 60 y 65ºC. Se añadieron los lípidos disueltos a la solución de sulfato de amonio y se dejó mezclar durante 1 hora entre 60 y 65ºC. Se extrusionaron los liposomas multilaminares obtenidos a través de membranas de policarbonato de tamaño de poro 0,4 \mum, 0,2 \mum, 0,1 \mum y 0,08 \mum, 8 veces cada uno. El proceso de extrusión se realizó entre 60 y 65ºC. Los liposomas extruidos tenían un diámetro medio de aproximadamente 100 nm.
Los liposomas se diafiltraron a continuación frente a sulfato de amonio 350 mM (10 intercambios de volumen), a continuación NaCl 5 mM que contenía sacarosa al 10% (10 intercambios de volumen).
Se preparó una solución madre de ciprofloxacina a razón de 58 mg/ml en solución de sacarosa al 10%. La carga de fármaco activo se realizó mezclando los liposomas preparados tal como se describió anteriormente con la solución de ciprofloxacina a una proporción de fármaco/lípido de 0,71 mg/mg y se incubó entre 60 y 65ºC durante 30 minutos, en cuyo periodo se tomó una muestra alícuota y se determinó el porcentaje de carga del fármaco utilizando una columna Sephadex G-50. El porcentaje de carga del fármaco fue 56% (se pudo conseguir una eficacia de carga hasta el 94% utilizando una proporción fármaco/lípido más baja).
El fármaco no encapsulado se separó por diafiltración frente a tampón de histidina 10 mM pH 6,5, que contenía sacarosa al 10%. Los liposomas cargados con ciprofloxacina se filtraron estériles a través de una membrana de 0,2 \mum y se almacenaron entre 2 y 8ºC. Los liposomas finales tenían un diámetro medio de 101 nm y una proporción fármaco/lípido de 0,41 mg/mg.
Se preparó otra preparación liposómica que contenía ciprofloxacina con un diámetro medio de 142 nm utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente con una técnica de extrusión ligeramente modificada.
Ejemplo 2 Preparación liposómica que contiene sulfato de dextrano-ciprofloxacina A. Preparación de la sal amónica del sulfato de dextrano
La sal sódica del sulfato de dextrano, peso molecular 8.000 daltons (Dextran Product Limited (Ontario, Canadá)) se transformó en la sal amónica del sulfato de dextrano de la forma siguiente. Una columna de intercambio iónico con un volumen de lecho de 400 ml se rellenó con resina de intercambio iónico DOWEX 50X8-100 (Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI). La columna rellena se enjuagó con 2 l de HCl 1N a un caudal de 3 a 4 ml/min hasta que el pH del eluido fue aproximadamente de 1 a 2. Se lavó el exceso de HCl de la columna con 2 a 3 L de agua desionizada hasta que el pH del agua de elución fue aproximadamente 5,5.
Se aplicaron 300 ml de sal sódica de sulfato de dextrano (50 mg/ml en agua) a la resina y se recogieron en fracciones de 12,50 ml. Se agruparon las fracciones que contenían sulfato de dextrano (fracciones 3 a 12) y se ajustó el pH desde 1,29 hasta 5,5 con hidróxido de amonio 5 M (aproximadamente 25 ml).
Se liofilizó la sal amónica del sulfato de dextrano en un matraz de fondo redondo de 1 L en cuatro fracciones de 150 ml. El polvo liofilizado se disolvió en NaCl 5 mM a una concentración de 100 mg/ml. El pH de la solución fue 5,4.
B. Preparación liposómica
Se preparó una solución de sulfato de dextrano 8,75 mM tal como se describió anteriormente y se calentó entre 60 y 65ºC.
Fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC, Lipoid K.G. Ludwigshafen, Alemania), colesterol (Croda, Inc. Nueva York, NY) y mPEG-DSPE (Sygena, Ltd., Liestal, Suiza) se disolvieron a una relación molar de 50:45,2:4,8 en etanol deshidratado (Quantum Chemical, Cincinnati, Ohio) entre 60 y 65ºC. Se añadieron los lípidos solubilizados a la solución calentada de sulfato de dextrano y se combinó la mezcla entre 60 y 65ºC durante una hora. La concentración de lípido total fue de 106,38 mg/ml o 150 \mumol/ml.
Los liposomas hidratados se extruyeron a presión a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,2 \mum de tamaño de poro durante 8 a 10 pasos a 60-65ºC.
El polímero no retenido se separó por tamaño de la suspensión de liposoma, por diafiltración frente a la solución de NaCl. Utilizando un cartucho de ultrafiltración de fibra hueca (NMCO 300.000; A/G Tech. Corp. Needham, MA) se filtraron por diámetro los liposomas frente a NaCl 350 mM, pH 7,4 durante 10 intercambios de volumen y a continuación frente a NaCl 150 mM, pH 7,4, durante 10 intercambios de volumen.
Se disolvió suficiente ciprofloxacina (Bayer AG, Leverkusen, Alemania) en NaCl 150 mM para formar una solución de 30 mg/ml. Se calentó la solución a 60ºC para la disolución completa. Se mezcló la solución del fármaco con la suspensión liposómica y se incubó entre 60 y 65ºC durante 30 minutos, seguido de enfriamiento rápido a temperatura ambiente utilizando un baño con hielo. Se midió el porcentaje de encapsulación del fármaco por separación del fármaco libre de la vesícula de liposoma en una columna de exclusión por tamaño y analizando cuantitativamente la cantidad de fármaco en cada fracción por espectrofotometría UV.
Se eliminó el fármaco no retenido por diafiltración frente a una solución de NaCl 150 mM durante 5 intercambios de volumen y a continuación frente a 10 intercambios de volumen de sacarosa al 10%, histidina 10 mM, pH 6,5.
Ejemplo 3 Diafiltración de sulfato de dextrano frente a soluciones salinas
Se disolvió en agua destilada la sal disódica del sulfato de dextrano (peso molecular 8.000 Daltons, Dextran Products Limited, Scarborough, Ontario, Canadá) a una concentración de 100 mg/ml. Se lavó el cartucho de diafiltración con un corte de peso molecular de 300.000 y un área superficial de 0,79 pie^{2} (A/G/Technology Corporation, Needham, MA) con 2 litros de agua destilada. Se diafiltraron 90 ml de sulfato de dextrano frente a 1000 ml (aproximadamente 10 intercambios de volumen) de agua destilada. Los intercambios de volumen (cada uno de 100 ml) se recogieron por separado y se utilizó 1 ml de cada uno para el análisis cuantitativo del sulfato de dextrano. El material retenido final se llevó al mismo volumen original (90 ml) con agua y a continuación se analizó el contenido en sulfato de dextrano.
Se repitió el mismo procedimiento de diafiltración utilizando NaCl 0,15 M, NaCl 0,35 M, NaCl 0,45 M y NaCl 1,0 M. Se recogieron los permeados y se analizó el sulfato de dextrano utilizando azul de 1,9-dimetileno y una absorbancia a 590 nm. Los resultados se presentan en la Fig. 2 y en la Tabla 1.
Ejemplo 4 Preparación liposómica con ácido poliacrílico
Se preparó una solución acuosa de ácido poliacrílico 250 mM con un peso molecular de 2.000 Daltons (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI) y de sulfato de amonio 50 mM, se ajustó el pH de la solución a 5,5 con NaOH 5 M.
Se prepararon liposomas tal como se describe en el Ejemplo 2 hidratando el HSPC solubilizado, colesterol y mPEG-DSPE en una relación molar de 50:45,2:4,8 con la solución acuosa de poliacrilato de amonio/sulfato de amonio. Se eliminó el polímero no retenido y se cargó la ciprofloxacina en los liposomas según el Ejemplo 2.
Ejemplo 5 Caracterización in vitro
Se determinó el índice de fuga de ciprofloxacina de los liposomas preparados según los Ejemplos 2 y 3 incubando los liposomas a una concentración de 50 \mug de ciprofloxacina/ml de plasma. Se incubaron los liposomas en el plasma a 37ºC durante cuatro horas, con muestras tomadas a las 0, 1, 2 y 4 horas para análisis. Se separaron los liposomas en cada muestra del fármaco libre por un procedimiento de extracción en fase sólida (indicado a continuación en el Ejemplo 5B) y se analizó el contenido de ciprofloxacina por HPLC en fase inversa (indicado a continuación en el Ejemplo 5C). En las Tablas 3A a 3C a continuación se resumen los resultados y se presentan en la Fig. 3.
TABLA 3A Liposomas con sulfato de dextrano y amonio/ciprofloxacina
4
TABLA 3B Liposomas con sulfato de amonio/ciprofloxacina
5
TABLA 3C Liposomas con sulfato de amonio/ciprofloxacina
6
A. Procedimiento de extracción en fase sólida 1. Preparación de la muestra
Se diluyó la formulación de ciprofloxacina liposómica hasta una concentración de aproximadamente 2 mg/ml en sacarosa al 10%/histidina 10 mM, pH 6,5. Para cada formulación de ciprofloxacina liposómica, se dejó enfriar en hielo 1,95 ml de blanco de plasma de rata. En el tiempo cero, se mezclaron 50 \muL de la formulación liposómica enfriada con el plasma enfriado (concentración final de ciprofloxacina de 50 \mug/ml) y se separaron dos alícuotas de 100 \muL para la extracción inmediata de la fase sólida para el punto en el tiempo cero. Las mezclas de plasma/liposoma se colocaron a continuación en un baño de agua a 37ºC. A las 1, 2 y 4 horas, se combinaron las mezclas y se separaron las alícuotas duplicadas de 100 \muL para la extracción. Se preparó un blanco de plasma de forma similar, sustituyendo la formulación de ciprofloxacina liposómica por sacarosa al 10%/histidina 10 mM, tampón de pH 6,5. A las 4 horas, se separó una serie adicional duplicada de alícuotas de 100 \muL de cada mezcla plasma/liposoma para la determinación de ciprofloxacina total.
2. Procedimiento de extracción en fase sólida
Se utilizaron para el procedimiento de extracción un procesador SPE-24G (JT Baker, parte # JT 7208-8) en columna de vidrio de extracción en fase sólida y cartuchos C_{18}, de Bond Elute LRC para extracción en fase sólida, 100 mg, 10 ml (Variant particular nº 1211-3001). Se sujetaron agujas disponibles del calibre 20 por debajo de los cartuchos para ayudar en la recogida de muestras. Se lavaron previamente los cartuchos utilizando 2 ml de metanol, seguido de 2 ml de solución salina. Se consiguió un flujo de gotas a través de los cartuchos utilizando vacío a aproximadamente 4 a 6 pulg. de Hg y no se dejó secar nunca el lecho de relleno C_{18} hasta el final del procedimiento de extracción. Los cartuchos y las agujas se descartaron tras una utilización.
Se colocó un matraz volumétrico de 2 ml bajo el cartucho C_{18} prelavado para la recogida de muestras. Se pretrató a continuación el cartucho con 200 \muL de blanco de plasma de rata para eliminar las zonas activas en el absorbente C_{18}. Se cargó a continuación la alícuota de 100 \muL de la mezcla plasma/liposoma al lecho C_{18}. Se lavó el cartucho con 1 ml de solución salina, recogiendo el eluyente en el mismo frasco por debajo. Esta fracción salina contiene la ciprofloxacina liposómica y se etiquetó "Fracción S".
Se lavó a continuación la ciprofloxacina libre del cartucho C_{18} con 1,6 ml de metanol/NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 2,2 (9:1, v/v) (metanol acidificado). Se recogió el lavado en un segundo matraz volumétrico de 2 ml y se absorbió en seco el relleno C_{18}, separándolo todo de la muestra. Esta fracción se etiquetó "Fracción F".
La Fracción F y la Fracción S se llevaron hasta 2,0 ml de volumen utilizando solución salina. Las alícuotas de 100 \muL de la mezcla plasma/ciprofloxacina liposómica recogidas a las 4 horas para la determinación de la ciprofloxacina total se diluyeron también hasta 2,0 ml utilizando solución salina y se etiquetaron "Total".
B. Análisis de ciprofloxacina por HPLC 1. Condiciones de la HPLC
Temperatura de la columna: 30ºC
Caudal: 1 ml/min
Tiempo de la serie: 12 min.
Detección: UV a 278 nm
Fase móvil: NaH_{2}PO_{4} 25 mM, pH 2,3/acetonitrilo (87:13)
Volumen de inyección: 20 \muL
Columna: Water Symmetry C_{18} 4,6 \times 150 mm, 5 micras, con precolumna.
Se trataron la "Total" y la "Fracción S" de la forma siguiente. Se mezclaron en agitación 250 \muL de la fracción con 1000 \muL de metanol acidificado, a continuación se centrifugó a 3000 rpm (Sorvall RT6000) durante 30 minutos, 10ºC. Se transfirieron los sobrenadantes a viales de HPLC para su análisis.
Se preparó la muestra de precisión del sistema de ciprofloxacina y patrones de calibración en blanco de plasma de rata al 15% en solución salina y se trataron las alícuotas con metanol acidificado de la misma forma que para la "Total" y la "Fracción S". Se prepararon muestras para el control de calidad de ciprofloxacina y de ciprofloxacina retenida por liposomas en blanco de plasma de rata, y se diluyeron alícuotas de 100 \muL de las muestras hasta 2,0 ml de solución salina. Se trataron a continuación alícuotas de las muestras diluidas con metanol acidificado de la misma forma que para la "Total" y la "Fracción S". El intervalo de la curva de calibración para HPLC fue de 0,02 a 10 \mumg/ml y se establecieron los resultados utilizando la regresión lineal de los mínimos cuadrados ponderada por 1/(concentración)^{2}.
Ejemplo 6 Caracterización in vivo A. Formulaciones liposómicas
Se prepararon liposomas con las siguientes composiciones según el procedimiento indicado en los Ejemplos 1, 2 y 4, en las que se consiguió la carga activa liposómica utilizando un gradiente de concentración de sulfato amónico después de preparar los liposomas por el procedimiento de hidratación en etanol.
TABLA 4 Formulaciones liposómicas para ensayos in vivo
7
B. Animales
Se adquirieron dieciocho ratas macho Sprague-Dawley (220 a 250 g) al proveedor (Simonsen Labs, Gilroy, Ca) y se alojaron en alojamientos convencionales bajo un ciclo de luz:oscuridad 12 h:12 h con alimentación (Lab Diet^{TM} Laboratory Rodent Diet nº 5001) y agua a voluntad. Se mantuvieron los animales por lo menos tres días antes del comienzo del estudio para asegurar su buena salud.
C. Diseño del estudio
Se administró a las ratas una sola inyección intravenosa por una vena lateral de la cola de una de las tres formulaciones de ciprofloxacina liposómica a razón de 40 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre de los animales anestesiados (isoflurano inhalado) vía seno retro-orbital extrayendo la sangre completa en anticoagulante EDTA al 7,5% a los tiempos siguientes: 30 segundos, 20 minutos, 40 minutos, 1,5 h, 3 h, 5 h, 7 h y 24 horas después de la dosis. Las muestras de sangre se almacenaron en hielo hasta su centrifugación a 750 \times g durante 20 min a temperatura ambiente para obtener la fracción de plasma. Se congeló el plasma a 4ºC hasta que se analizó la ciprofloxacina total (libre más encapsulada) por HPLC en fase inversa.
D. Evaluación de los datos
Se obtuvo la farmacocinética en cada rata utilizando la regresión lineal ponderada con estimación de la probabilidad máxima utilizando el programa informático de análisis de sistemas farmacocinético/farmacodinámico ADAPT II, versión 4.0 (D'Argenio y Schmutizky, ADAP II Users Guide. Biomedical Simulations Resource, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA). El modelo de varianza empírico para las concentraciones suponía que las desviaciones estándar ("errores") residuales de las observaciones (o) estaban relacionadas linealmente con los valores verdaderos. La discriminación del modelo fue por el criterio de información de Akaike (AIC) (Akaike, H., Bayesian Extension of the Minimum AIC Procedure of Autorregresive Model Fitting, Biometika, 66:237-242 (1979)). Las concentraciones máximas de ciprofloxacina (C_{máx}) se obtuvieron por observación directa de las concentraciones en el plasma y se determinó el área bajo la curva en estado estacionario (AUCss) desde el tiempo cero hasta el infinito por integración numérica.
Las concentraciones de ciprofloxacina en el plasma se resumen en la Tabla 5 y se presentan gráficamente en las Figs. 4A y 4B. Los parámetros farmacocinéticos de los estudios in vivo se presentan en la Tabla 6 anterior.
TABLA 5
Concentraciones de ciprofloxacina en el plasma
Tiempo Ciprofloxacina en sangre
(horas) (\mug/ml)
Referencia Sulfato de dextrano Poliacrilato
0,083 918 \pm 109 754 \pm 83,9 935 \pm 82,7
0,333 831 \pm 13,8 648 \pm11,1 773 \pm 57,0
0,66 742 \pm 31,2 587 \pm 18,9 1150 \pm 71,6
1,5 558 \pm 27,1 491 \pm 25,9 575 \pm 32,1
3 304 \pm 37,4 396 \pm 29,0 363 \pm 51,6
5 38,6 \pm 15,8 345 \pm 16,2 154 \pm 41,9
7 6,5 \pm 1,4 306 \pm 22,6 49 \pm 27,1
24 BQL 42,6 \pm 22,6 BQL
*BQL = inferior al límite de cuantificación

Claims (12)

1. Composición liposómica, que comprende una suspensión liposómica compuesta de un lípido formador de vesícula; contenida dentro de los liposomas, un compuesto de fluorquinolona y un polímero polianiónico eficaz para formar un complejo con la fluorquinolona y para aumentar la retención de la fluorquinolona en los liposomas.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha fluorquinolona es una 6-fluorquinolona.
3. Composición según la reivindicación 2, en la que dicha 6-fluorquinolona es una seleccionada de entre el grupo constituido por norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, lomefloxacina, flerofloxacina, perfloxacina y amifloxacina.
4. Composición según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el polímero polianiónico es un polímero que incluye grupos aniónicos seleccionados de entre los grupos sulfato, sulfonato, fosfato y carboxilato.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que el polímero polianiónico se selecciona de entre sulfato de dextrano, sulfato A de condroitina, ácido polivinilsulfónico y ácido polifosfórico.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los liposomas incluyen además un lípido derivado con un polímero hidrófilo.
7. Composición según la reivindicación 6, en la que el polímero hidrófilo es polietilenglicol.
8. Composición según la reivindicación 7, en la que el polímero polianiónico es el sulfato de dextrano y la 6-fluorquinolona es ciprofloxacina.
9. Procedimiento para aumentar la retención de una fluorquinolona en una composición liposómica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento:
la preparación de los liposomas compuestos de un lípido formador de vesículas, presentando los liposomas el polímero polianiónico ocluido en su interior; y
la incubación de los liposomas en presencia de un compuesto de 6-fluorquinolona en condiciones eficaces para conseguir la absorción del compuesto en los liposomas y el acomplejamiento del compuesto con el polímero polianiónico.
10. Procedimiento de preparación de una suspensión liposómica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que tiene una 6-fluorquinolona ocluida en los liposomas en forma de un complejo con un polímero polianiónico, que comprende la formación de una suspensión liposómica para tener una fase acuosa interna que incluye el polímero polianiónico y una fase externa que incluye el polímero polianiónico;
la eliminación de cualquier polímero polianiónico no ocluido de la fase externa añadiendo una sal eficaz para aumentar la fuerza iónica de la fase de carga externa y que sea eficaz para condensar el polímero;
la carga de la fluorquinolona en los liposomas incubando los liposomas en presencia de 6-fluorquinolona en condiciones eficaces para conseguir la absorción de la fluorquinolona en la fase acuosa interna de los liposomas; y
la eliminación de cualquier fluorquinolona no ocluida en la fase externa.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha separación incluye separar por diafiltración el polímero polianiónico condensado.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que la sal se selecciona de entre el grupo constituido por NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4} y K_{2}SO_{4}.
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