KR100766753B1 - 개선된 약물 체류를 위한 리포솜 조성물 - Google Patents

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Abstract

퀴놀론 화합물, 특히 플루오로퀴놀론 화합물의 증강된 체류를 위한 리포솜 조성물이 기재되어 있다. 리포솜에 엔트랩핑되는 것은 플루오로퀴놀론과의 착체 형성에 효과적인 다중음이온성 중합체이다. 엔트랩핑되지 않은 다중음이온성 중합체의 제조 방법 또한 기재되어 있다.

Description

개선된 약물 체류를 위한 리포솜 조성물{LIPOSOME COMPOSITIONS FOR IMPROVED DRUG RETENTION}
본 발명은 리포솜 내에서 약물의 향상된 체류를 제공하는 리포솜 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 플루오로퀴놀린 항생제 화합물을 포함하는 리포솜에 관한 것이다.
리포솜, 또는 지질 소포는 치료 활성을 개선시킬 수 있고 다양한 약제학적 제제의 안전성을 증가시킬 수 있는 인지된 약물 전달 시스템이다. 진단 또는 치료 화합물의 생체내 담체로서의 용도를 위하여, 리포솜은 전형적으로는 리포솜-엔트랩핑된 형태로 화합물을 함유하도록 제조된다. 의약적 치료에 유용하기 위해서는, 리포솜 제형물은 높은 로딩 효능, 즉 환자에게 비-치료 지질 로드를 감소시키는 높은 약물 대 지질비를 가져야 하고, 화합물이 저장 동안 활성이 거의 누출되지 않거나 또는 거의 손실되지 않게 엔트랩핑되는 실제 저장 수명을 가져야 한다.
리포솜 제형물을 제조하는 두 가지 일반적인 방법이 있는데, 약물 및 지질이 지질 소포의 형성시 합해지는 수동 로딩과, 약물이 지질 소포의 형성 후 리포솜에 로딩되는 원격 로딩이 있다. 수동 로딩 방법에서는, 건조 지질막이 전형적으로는 목적 약물을 함유하는 수성상 매질로 수화되어 리포솜 형성 동안 화합물을 수동으 로 엔트랩하는 다중-라멜라 소포를 형성한다. 화합물은 건조 지질막에 포함된 친유성 화합물, 또는 수화 매질에 함유된 수용성 화합물 중 어느 하나일 수 있다. 수용성 화합물에 대해서는, 상기 방법은 전형적으로는 최종 리포솜 현탁액 중 총 화합물의 5 내지 20 % 만이 캡슐화된 형태인, 다소 불량한 캡슐화 효능을 제공한다. 소포가 더욱 가공, 즉, 압출에 의해 가공될 경우, 부가적인 화합물이 손실되어, 더욱 작은, 더욱 균일한 크기의 리포솜이 형성될 수 있다.
화합물-로딩된 리포솜을 형성하기 위한 다른 수동 엔트랩핑 방법이 공지되어 있고, 용매 주입법 및 역-증발상 접근법 (Szoka, F.C., Jr., 및 Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198 (1978)) 이 제안되었다. 상기 방법은 비교적 불량한 로딩 효능 및/또는 난해한 용매 취급 문제점이 있는 경향이 있다.
화합물의 원격 로딩은 수동 로딩의 몇 가지 단점을 극복하는 수단을 제공하였고, 특히 높은 약물 대 지질 비를 성취할 수 있는 방법론을 제공한다. 원격 로딩에서는, 수소 또는 암모늄 이온 구배와 같은 이온 구배가 리포솜 지질 이중층을 통하여 구축되고, 이온성 화합물이 리포솜에 로딩된다.
그러나, 이온 구배에 대해 원격 로딩이 갖는 문제점들이 인식되는데, 그 중 하나는 이온화가능한기를 갖는 약물에 한정된다는 점이다. 또한, 모든 이온화가능한 약물이 이온 구배에 반응하여 리포솜에 축적되는 것은 아니다 [Chakrabarti, A. 등, 미국 특허 제 5,380,532 호; Madden, T,D. 등, Chemistry and Physics of Lipids 53:37-46 (1990)]. 또 다른 문제는 리포솜에 축적하는 몇 가지 제제가 축 적 후 즉시 방출된다는 점이다. 또 다른 문제는, 생체외 리포솜에 성공적으로 로딩되고 체류된 몇 가지 제제가, 리포솜-엔트랩핑된 형태 제제의 투여 이점을 없애는 생체 내 리포솜으로부터의 고누출율을 갖는다는 것이다.
[본 발명의 개요]
따라서, 본 발명의 목적은 이온화가능한 화합물, 특히 월등히 체류하면서 리포솜에 엔트랩핑되는, 플루오로퀴놀론을 포함하는 리포솜 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 그러한 리포솜 조성물의 제조법을 제공하는 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 소포-형성 지질로 형성된 리포솜 현탁액으로 구성된 리포솜 조성물을 포함한다. 리포솜에 함유된 것은 플루오로퀴놀론 화합물 및 플루오로퀴놀론과의 착체를 형성하고 리포솜 중 플루오로퀴놀론의 체류를 증강시키는데 효과적인 다중음이온성 중합체이다.
한 구현예에서, 플루오로퀴놀론은 6-플루오로퀴놀론이다. 바람직한 구현예에서, 6-플루오로퀴놀론은 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파르플록스신, 로메플록사신, 플레로플록사신, 페플록사신 및 아미플록사신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 다중음이온성 중합체는 술페이트, 술포네이트, 포스페이트, 및 카르복실레이트기로부터 선택되는 음이온성 기를 갖는 중합체이다. 특히, 다중음이온성 중합체는 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 A, 폴리비닐 황산 및 폴리인산으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리포솜은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 중합체를 사용하여 유도체화된 지질을 더 포함한다.
바람직한 구현예에서, 리포솜은 다중음이온성 중합체 덱스트란 술페이트 및 6-플루오로퀴놀론 시프로플록사신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 리포솜 안에 6-플루오로퀴놀론의 체류를 증강시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 소포-형성 지질로 구성되고 엔트랩핑된 다중음이온성 중합체를 갖는 리포솜을 제조하고; 화합물을 리포솜에 취해서 상기 화합물을 다중음이온성 중합체와 착화시키는데 효과적인 조건 하에 6-플루오로퀴놀론 화합물의 존재 하에 리포솜을 인큐베이션시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다중음이온성 중합체와의 착체 형태의 리포솜에 엔트랩핑된 6-플루오로퀴놀론을 갖는 리포솜 현탁액의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법은 다중음이온성 중합체를 포함하는 내부 수성상 및 다중음이온성 중합체를 포함하는 외부상을 갖게 되는 리포솜 현탁액을 형성시키는 단계; 외부 벌크 상의 이온 강도를 증가시키는데 효과적이고 중합체를 응축시키는데 효과적인 염을 첨가하여 외부 상으로부터 임의의 엔트랩핑되지 않은 다중음이온성 중합체를 제거하는 단계; 6-플루오로퀴놀론을 리포솜의 내부 수성상에 취하는데 효과적인 조건 하에 6-플루오로퀴놀론의 존재 하에 리포솜을 인큐베이션시킴으로써 6-플루오로퀴놀론을 리포솜에 로딩하는 단계; 및 외부 상으로부터 임의의 엔트랩핑되지 않은 6-플루오로퀴놀론을 제거하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 제거 단계는 응축된, 다중음이온성 중합체의 투석여과에 의한 것이다.
제거 단계에서의 염은 NaCl, KCl, Na2SO4 및 K2SO4 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 상기 및 다른 목적 및 특성은 본 발명의 하기 상세한 설명을 수반된 도면과 함께 읽을 때 더욱 자세하게 이해될 것이다.
도 1A 는 퀴놀론 항생제 화합물에 대한 일반 구조를 나타내고;
도 1B 는 6-플루오로-퀴놀론 화합물에 대한 일반 구조를 나타내고;
도 1C 는 6-플루오로-퀴놀론 시프로플록사신의 구조를 나타내고;
도 2 는 물 (
Figure 112001027859938-pct00001
) 및 0.15 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00002
), 0.35 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00003
), 0.45 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00004
) 및 1.0 M NaCl (X) 에 대하여 투석여과 동안 투과물로부터 수합되는 분획 중 덱스트란 술페이트의 양을 나타내는 플롯이고;
도 3 은 다중음이온성 중합체 트랩핑제를 갖는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00005
) 및 중합체 트랩핑제를 갖지 않는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00006
, ◇) 에 대한 시간의 함수로서 인큐베이션 후 혈장 내 리포솜에 잔류하는 시프로플록사신의 백분율을 나타내는 플롯이고;
도 4A 는 덱스트란-술페이트-결합 시프로플록사신을 함유하는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00007
) 및 폴리아크릴산-결합 시프로플록사신을 함유하는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00008
) 및 중합체 트랩핑제 없이 시프로플록사신을 함유하는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00009
) 의 생체내 투여 후 시간의 함수로서 혈류에 잔류하는 시프로플록사신의 주입 투여량의 백분율을 나타내는 플롯이고;
도 4B 는 덱스트란 술페이트/시프로플록사신 (
Figure 112001027859938-pct00010
), 폴리아크릴레이트-착화된 시프로플록사신 (
Figure 112001027859938-pct00011
) 의 리포솜 제제 및 중합체 트랩핑제 없이 엔트랩핑된 시프로플록사신을 갖는 대조구 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00012
) 의 정맥내 투여 후 혈류 중 시프로플록사신의 농도 (㎍/mL) 를 나타낸다.
Ⅰ. 리포솜 조성물
본 발명은 리포솜에 안정하게 엔트랩핑된 퀴놀론 항생제, 바람직하게는 6-플루오로퀴놀론을 포함하는 리포솜 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다. 상기 부분은 엔트랩핑된 약물 및 다중음이온성 중합체 및 리포솜 지질 성분을 포함하는, 리포솜 성분을 기재한다. 리포솜의 제조 및 특성화는 하기 부분에서 기재될 것이다.
A. 리포솜-엔트랩핑된 퀴놀론 화합물
퀴놀론은 도 1A 에서 나타낸 바와 같이, 통상적인 4-피리돈-3-카르복실산 구조의 합성 항미생물제 계열이다. 도면에서 나타낸 일반 구조에서, X 는 N 또는 C 이고, R1, R2, R5, R6, R7 및 R8 은 임의의 기일 수 있다. 날리딕스산과 같은, 약물의 퀴놀론 계열의 몇 가지 원이 수년간 사용가능했다. 더욱 최근에는, 플루오르화 퀴놀론들이 도입되었고, 플루오르화 제제가 광범위한 항미생물 활성을 갖고 광범위한 감염 질병의 치료를 위해 경구 투여 후 효과적이므로, 상기 유도체들은 그 계열의 더욱 초기의 원들에 비해 치료 이점을 제공한다. 상기 화합물들은 또한 비교적 부작용이 없고 그의 작용에 대한 미생물 내성이 빠르게 진전하지 않는다. 6-플루오로퀴놀론의 일반 구조가 도 1B 에 나타나 있다.
6-플루오로-퀴놀론은 널리 연구되었고, 많은 구조적 변형이 공지되어 있고, 이중 다수가 본 발명에서의 용도에 적절하다. 더욱 강력한 6-플루오로-퀴놀론 중 하나는 시프로플록사신, (1-시클로프로필-6-플루오로-1,4-디히드로-4-옥소-7-(1-피페라지닐)-3-퀴놀린 카르복실산) 이고, 그의 구조는 도 1C 에 나타나 있다. 다른 퀴놀론과 같이, 시프로플록사신은 균의 DNA 복제를 억제함으로써 작용한다. 약물은 슈퍼코일이 이완 및 재형성하도록 하는 DNA 복제의 필수 효소인 DNA 기라제 (gyrase) 의 β-서브유닛에 결합하여, 그의 활성을 효과적으로 억제한다.
시프로플록사신은 R1 에서의 시클로프로필 고리 및 R7 에서의 피페라진 고리를 포함하고, 이는 약 8.7 의 pKa 를 갖는 이온화가능한 아민을 포함한다. 약물은 대부분의 그람 음성 및 몇 가지 그람 양성 병원균에 대하여 효과적이다. 그러나, 항균제의 치료 효과는 혈액 중 치료제의 농도를 유지하기 어렵게 만드는 3-4 시간의 그의 짧은 소실반감기에 의해 제한된다.
상기 기재한 바와 같이, 약물을 리포솜에 엔트랩시키는 것은 약물의 치료 효과를 향상시키는 한 접근법이고, 시프로플록사신을 엔트랩시키는 것은 [Ryan, J. 등, WO 91/09616; Wong, J.P. 등, EP A1 0652008, Hope, M. 등, WO 96/26715] 에 기재되어 있다. 그러나, 리포솜에 엔트랩핑된 시프로플록사신은 리포솜에서 친수성 중합체 사슬의 표면-코팅을 갖는 장-순환 리포솜의 생체내 생분포 (biodistribution) 범위를 성취하기에 충분한 시간 동안 리포솜에 체류하지 않는다. 이는 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 표면 코팅을 갖고 원격 로딩에 의하여 시프로플록사신을 리포솜에 엔트랩시킨 리포솜의 제조를 기재하고 있는 비교예 1 에서 증명된다. 시프로플록사신-함유 리포솜을 생체외에서 시험하여, 리포솜으로부터 혈장으로 방출된 시프로플록사신의 양을 측정하게 된다 (실시예 5 에 기재된 방법론을 사용함). 약물의 약 75 % 가 한 시간 이내에 방출되는 것과 함께, 약물의 거의 대부분이 37 ℃ 에서 4 시간 동안 혈장에서 인큐베이션 후 리포솜으로부터 누출된 것이 발견되었다.
장-순환 리포솜은 혈류에 최대 24 시간 잔류한다. 본원에서 사용된 "장순환" 리포솜은 미국 특허 제 5,013,556 호에 기재된 폴리에틸렌 글리콜-코팅된 리포솜과 같은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜을 가리킨다. 수시간 후 혈류로부터 없어지는 통상적인 리포솜, 예를 들어 중합체 사슬의 코팅이 결여된 리포솜과 대조적으로, 30 % 이하의 장-순환 리포솜의 주입 투여량은 주입 후 24 시간 경과 시 혈류에 24 시간 잔류한다. 이에 따라, 장순환 리포솜은 통상적인 리포솜이 투여 후 빠르게 축적되는 단핵 식세포계 또는 세망내피계가 아닌 기관 및 조직을 포함하는 신체에서 생분포를 성취한다 [Paphadjopoulos, D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:11460-11464 (1991)]. 명백히, 리포솜 이중층을 통한 약물의 누출로 인하여, 수시간 후 시프로플록사신의 로드의 절반 초과를 방출하는 시프로플록사신-리포솜 조성물은 장-순환 수명 및 장-순환 리포솜의 우수한 생분포를 이용하지 않는다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 리포솜 내에 엔트랩핑되고 리포솜의 생분포를 성취하기에 충분한 시간 동안 리포솜 내에서 체류하는 시프로플록사신을 갖는 리포솜 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 시프로플록사신은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜에 엔트랩핑되고, 시프로플록사신은 리포솜의 긴 혈액 순환 수명을 이용하기에 충분한 시간 동안 리포솜에 체류하여, 우수한 생분포 및 엔트랩핑된 화합물의 서방을 성취한다.
더욱 통상적으로는, 본 발명은 리포솜 내에 임의의 개수의 화합물, 특히 임의의 6-플루오로퀴놀론을 엔트랩하는 것을 포함한다. 도 1B 를 다시 참조하여, 6-플루오로-퀴놀론에서 전형적으로 R1 은 하나 이상의 위치에서 F, Cl, 또는 Br 로 치환될 수 있는, C1 내지 C3 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 또는 시클로프로필이고; R7 은 바람직하게는 이온화가능한 아미노기를 함유하는 선형, 분지형 또는 고리형 질소-함유 알칸이고; R7 치환기의 예에는 고리 구조, 예를 들어 1-아제티딜, 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-에틸-1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 1-피롤리딜이 포함되고, 이들은 각각 NH2, NHCH3, N(CH3)2, 2-아미노에틸, 에틸아미노메틸, 1-피롤리딜, 또는 아미노에틸아미노메틸기로 치환될 수 있고, 다른 포화 및 불포화 질소 헤테로고리의 예에는 모노시클릭 헤테로고리, 예를 들어 이미다졸, 이미다졸린, 디히드로피롤, 1,2,3,6-테트라히드로피리딘, 1,4,5,6-테트라히드로피리미딘, 피롤리딘, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 1,3,5-트리아진 및 비시클릭 헤테 로고리, 예를 들어 퍼히드로인돌, 퍼히드로퀴놀린, 퍼히드로이소퀴놀린, 퍼히드로-7-아자인돌, 퍼히드로-4-아자벤즈이미다졸, 1,5-디아자비시클로[4.3.0]노넨 (DBN), 1,8-디아자비시클로[5.5.0]운데크-7-엔 (DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]노난, 1,8-디아자비시클로[5.5.0]운데칸, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(트리에틸렌디아민), 3-아자비시클로[3.2.2]노난, 3-아자비시클로[4.3.0]노난, 3-아자비시클로[3.3.0]옥탄, 2,8-디아자비시클로[4.3.0]노난, 5-디아자비시클로[4.3.0]노난, 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔, 2,7-디아자스피로[4.4]노난이 포함되고; X 는 N 또는 C 이고, 단, X 가 N 인 경우, R8 은 존재하지 않고, X 가 C 인 경우, R8 은 H, F, Cl, 또는 CF3, OCH3, 또는 OCH 2CH3 이거나, 또는 R1 및 R8 가 함께 퀴놀론 고리내 1 내지 8 개의 고리 원자를 연결하는 2- 또는 3-원자 알킬 또는 알콕시 브릿지 연결기를 함유하여, 각각 5- 또는 6- 원 고리를 형성한다. 시스- 및 트랜스- 입체이성질체가 가능한 경우에는, 두 이성질체 모두가 포함된다. 비대칭 키랄 중심이 존재할 경우, 화합물은 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물, 전형적으로는 라세믹 혼합물이 포함될 수 있다.
몇 가지 바람직한 6-플루오로퀴놀론에는 시프로플록사신, 노르플록사신 오플록사신, 스파르플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 페플록사신 및 아미플록사신이 포함된다.
B. 리포솜 지질 성분
상기 논의된 바와 같이, 퀴놀론 화합물은 리포솜에 엔트랩핑되고, 여기서 " 엔트랩핑된" 은 화합물이 리포솜 지질 이중막 사이의 또는 이중막 그 자체 내에서의 수성 공간에서, 리포솜의 중심 수성 구획에 봉착되는 것을 가리킨다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에서, 퀴놀론 화합물은 상기 기재된 다중음이온성 중합체와의 착체 형태로 리포솜에 엔트랩핑된다. 본원에서 사용된 "착체" 는 중합체 및 퀴놀론이 접촉되었을 때 형성되는 종을 의미한다. 착체는 용액 또는 침전물에서 안정한 종일 수 있다. 상기 부분에 본 발명에서 사용되는 리포솜이 기재되어 있다.
본 발명의 리포솜은 통상적으로는 소수성 테일기 (tail group) 및 극성 헤드기 모두를 갖는 양쪽성 지질을 포함하는 소포-형성 지질로 구성되어 있다. 소포-형성 지질의 특성은 인지질로 대표되는, 수 중에서 이중층 소포를 자발적으로 형성하는 그의 능력이다. 상기 형태의 소포-형성 지질은 바람직하게는 두 개의 탄화수소 테일 또는 사슬, 전형적으로는 아실기, 및 극성 헤드기를 갖는 것이다. 이 계열에 포함되는 것은 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜글리세롤 (PG), 및 포스파티딜이노시톨 (PI) 이고, 여기서 두 개의 탄화수소 사슬은 전형적으로는 약 14 내지 22 개의 탄소 원자 길이이고, 다양한 불포화도를 갖는다. 바람직한 인지질에는 PE 및 PC 가 포함된다. PC 의 예는 수소화 콩 포스파티딜콜린 (HSPC) 이다. 스핑고미엘린 (SM) 과 같은 단일 사슬 지질도 사용될 수 있다.
아실 사슬이 다양한 포화도를 갖는 상기 기재된 지질 및 인지질이 상업적으로 수득될 수 있거나, 공개된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 다른 지질은 당지질이다. 본원에서 사용된 용어 "당지질" 은 두 개의 탄화 수소 사슬을 갖는 지질을 포함하고, 이 중 하나는 스핑고신의 탄화수소 사슬, 및 하나 이상의 당 잔기이다.
본 발명에서 사용되는 지질은, 지질상이 예를 들어 실온 이하의 온도에서 비교적 낮은 지질 용융 온도를 갖는 것을 의미하는, 비교적 "유체" 지질, 대안적으로는 지질이 예를 들어 50 ℃ 이하의 온도에서 비교적 높은 용융점을 갖는 것을 의미하는, 비교적 "강성 (rigid)" 지질일 수 있다. 통상적으로, 더욱 강성인, 즉 포화된 지질은 지질 이중층 구조에서 더욱 큰 막 강성에 기여하고, 따라서 활성 약물 로딩 후 더욱 안정한 약물 체류에 기여한다. 상기 형태의 바람직한 지질은 약 37 ℃ 를 초과하는 상 전이 온도를 갖는 것들이다.
리포솜은 주로 인지질로 구성된 리포솜 또는 소포를 안정화시킬 수 있는 지질을 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 군으로부터 가장 빈번하게 사용되는 지질은 25 내지 45 mole% 의 수준의 콜레스테롤이다.
한 구현예에서, 본 발명의 리포솜은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 포함한다. "표면-코팅" 은 리포솜의 표면 상의 임의의 친수성 중합체의 코팅을 의미한다. 친수성 중합체는 리포솜 조성물에 친수성 중합체 사슬로 유도체화된 하나 이상의 소포-형성 지질을 포함함으로써 리포솜에 포함된다. 사용될 수 있는 소포-형성 지질은 제 1 소포-형성 지질 성분에 대하여 상기 기재된 임의의 것일 수 있지만, 디아실 사슬을 갖는 소포-형성 지질, 예를 들어 인지질이 바람직하다. 한 바람직한 인지질은 포스파티딜에탄올아민 (PE) 이고, 이는 활성화된 중합체에 커플링되기 편리한 반응성 아미노기를 함유한다. PE 의 한 예는 디스테아릴 PE (DSPE) 이다.
소포 형성 지질에 커플링하는데 사용되기 바람직한 친수성 중합체는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 바람직하게는 1,000 내지 10,000 달턴, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000 달턴의 분자량을 갖는 PEG 사슬이다.
적절할 수 있는 다른 친수성 중합체에는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 및 유도체화된 셀룰로스, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 히드록시에틸셀룰로스가 포함될 수 있다.
적절한 지질, 예를 들어 PE 에 부착된 상기 중합체를 함유하는 지질-중합체 접합물의 제조가, 특별히 본원에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허 제 5,395,619 호 및 [Zalipsky, STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic 및 F. Martin 저, CRC Press, 9 장 (1995))] 에 기재되어 있다. 전형적으로는, 약 1 내지 20 mole% 의 중합체-유도체와 지질이 리포솜 형성 동안 리포솜-형성 성분에 포함된다.
코팅의 부재 시에는 친수성 중합체 사슬이 리포솜의 혈액 순환 시간을 연장하기에 충분한 친수성 사슬의 표면 코팅을 제공한다. 혈액 순환 시간의 증강 정도는 본원에 참고문헌으로서 명백히 포함되어 있는 공유의 미국 특허 제 5,013,556 호에 기재되어 있는 바와 같이, 중합체 코팅의 부재 하에 성취되는 것의 수 배이다.
또한, 리포솜은 표면기, 예를 들어 항체 또는 항체 단편, 세포-표면 수용체, 항원, 및 특정 세포 집단에 대한 목적하는 표적-결합성을 성취하기 위한 기타 화합 물들과의 상호작용을 위한 작은 효과기 분자를 함유도록 제조될 수 있다. 여기서 리포솜에 포함된 지질 성분은 표적 분자로 유도체화된 지질, 또는 공지된 방법에 따라 예비 형성된 리포솜에서 표적 분자를 사용하여 유도체화될 수 있는 극성-헤드 화학기를 갖는 지질을 포함할 것이다.
C. 다중음이온성 중합체
본 발명에 따른 리포솜은 또한 리포솜 안에 엔트랩핑된 다중음이온성 중합체를 포함한다. 중합체는 바람직하게는 유사한 화학 구조의 반복 단위로 이루어지고 이온화가능한 기, 즉, 전해질 분해하여 이온성 전하, 바람직하게는 음이온성 전하를 일으킬 수 있는 화학적 관능기를 갖는 임의의 분자이다. 400 내지 2,000,000 달턴의 넓은 범위에 걸친 분자량을 갖는 중합체가 포함된다.
본 발명에서 사용되기 적절한 다중음이온성 중합체에는 술페이트화, 술폰화, 카르복실화 또는 포스페이트화 친수성 중합체가 포함된다. 예를 들어, 술페이트화 프로테오글리칸, 예컨대 술페이트화 헤파린, 술페이트화 다당류, 예컨대 술페이트화 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 카라기닌, 덱스트란 술페이트, 뮤신, 술페이트화 폴리펩티드, 예컨대 술페이트화 아민기를 갖는 폴리리신, 술포네이트-유도체화된 당류 또는 펩티드 서브유닛을 갖는 당단백질, 및 히알루론산이 있다. 콘드로이틴 술페이트 A, B 및 C, 케라틴 술페이트, 데르마탄 술페이트 또한 포함된다.
또한, 중합체는 음이온성 관능기를 포함하도록 변형된 중성 중합체일 수 있다. 예를 들어, 아밀로스, 펙틴, 아밀로펙틴, 셀룰로스 및 덱스트란이 음이온성 서브유닛을 포함하도록 변형될 수 있다.
술포기, 예를 들어 폴리비닐술페이트, 폴리비닐술포네이트, 폴리스티렌술포네이트 및 술페이트화 로진 검을 포함하는 중합체 또한 적절하다.
하기되는 바와 같이, 다중음이온성 중합체는 지질 소포 형성 동안 리포솜에 엔트랩핑된다. 약물을 리포솜에 로딩할 때, 이어서 중합체가 리포솜 내에 약물을 트랩 또는 체류하도록 작용한다. 본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 덱스트란 술페이트는 대표적인 다중음이온성 중합체로서 사용되었다. 덱스트란 술페이트는 글루코실 잔기 당 대략 2.3 개의 술페이트기를 갖는 안히드로글루코스의 중합체이다. 그것은 대략 95 % 알파-D-(1-6) 연결기를 포함하고, 나머지 (1-3) 연결기는 덱스트란의 분지화를 이룬다. 중합체는 5,000 내지 500,000 달턴 범위의 분자량으로 용이하게 입수가능하다.
Ⅱ. 리포솜 제조
본 발명에서 사용되는 리포솜은 지질 이중층을 통한 내부에서 외부로의 이온 구배를 갖도록 제조된다. 이어서, 이온 구배는 목적 화합물을 리포솜으로 로딩하는데 사용된다. 수소 이온 및 암모늄 이온 구배를 포함하는, 상기 이온 구배를 갖는 리포솜이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고, 공지된 방법론을 사용하여 용이하게 제조된다.
본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 지질막을 통한 암모늄 이온 구배를 갖는 리포솜이 제조되었다. 상기 리포솜의 제조는 이미 예를 들어 미국 특허 제 5,192,549 호에서 기재되었다. 여기서 리포솜은 예를 들어 5.5 내지 7.5 의 적절한 pH 에서 암모늄 염, 전형적으로는 0.1 내지 0.4 M 의 암모늄 술페이트 또는 암 모늄 덱스트란 술페이트와 같은 암모늄염을 함유하는 수성 완충액에서 제조된다. 리포솜 형성 및 사이징 후, 외부 매질을 암모늄 염이 결여된 것, 예를 들어 암모늄 술페이트가, 리포솜의 내부 및 외부에 동일한 삼투압을 제공하는 NaCl 또는 당으로 대체된 것을 제외하면 동일한 완충액으로 교환된다.
리포솜 형성 후에는, 리포솜 내의 암모늄 이온이 암모니아 및 프로톤과 평형 상태에 있다. 암모니아는 리포솜 이중층을 침투할 수 있고, 리포솜 내부로부터 빠져나올 수 있다. 암모니아의 누출은 연속적으로 리포솜 내부의 평형을 오른쪽으로, 즉 프로톤의 생성 쪽으로 옮긴다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 다중음이온성 중합체와의 착체 형태인, 그 안에 엔트랩핑된 퀴놀론 항생제를 갖는 리포솜의 현탁액의 제조 방법을 기재한다. 실시예 2 에서 기재한 바와 같이, 수소화 콩 포스파티딜콜린 (HSPC), 콜레스테롤 및 mPEG-DSPE (N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민) 으로 구성된 리포솜을 제조하였다. 50 : 45.2 : 4.8 몰비의 지질을 에탄올에 용해시켰다. 용해화된 지질을 실시예 2 에 기재된 바와 같이 제조된 덱스트란 술페이트 암모늄 염 용액에 첨가하고, 한 시간 동안 혼합하여 리포솜 안에 엔트랩핑된 덱스트란 술페이트 암모늄 염을 갖는 이질성 크기의 다중-라멜라형 리포솜을 형성하였다.
실시예에서 설명하듯이, 압력 하에 수화 리포솜을 압출하여 리포솜의 직경을 약 100 내지 150 nm 의 크기로 하였다.
리포솜 형성 후, 선택된 약물을 소포에 로딩하였다. 그러나, 약물은 다중 음이온성 중합체의 존재 하에 착화 또는 침전화될 것이다. 이에, 임의의 엔트랩핑되지 않은 중합체를 약물 로딩에 앞서 외부 현탁액 매질로부터 제거하여, 리포솜 외부 매질에서의 목적하지 않는 착체 형성을 예방해야 한다. 시프로플록사신의 경우에는, 심지어 매우 적은 양, 예를 들어 0.1 ㎍/mL 의 덱스트란 술페이트의 존재 하에서도 침전이 일어난다. 외부 매질로부터 모든 엔트랩핑되지 않은 중합체를 실질적으로 제거하는 것이 중요하다.
본 발명의 상기 양태의 중요한 특징에 따라, 엔트랩핑되지 않은 다중음이온성 중합체가 염 전해질의 존재 하에 투석여과에 의해 제거된다. 실시예 3 에 기재된 바와 같이, 수화 매질 중 덱스트란 술페이트 암모늄 염을 사용하여 형성된 리포솜을 중공 (hollow) 섬유 초여과 카트리지를 사용하여, 350 mM NaCl 에 대하여 투석여과하였다. 염의 존재는 리포솜 현탁액의 점도를 감소시키고 중합체를 응축하여 덱스트란 술페이트의 제거를 촉진한다. 바람직하게는, 투석여과는 약물 로딩 단계 동안 어떠한 중합체/약물 착체 또는 침전물도 보이지 않는, 임의의 엔트랩핑되지 않은 중합체의 충분한 제거를 일으키는 조건 하에 수행된다.
본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 8,000 달턴의 평균 분자량을 갖는 덱스트란 술페이트 나트륨 염의 제거가 이온 강도에 있어서 상이한 다양한 염 용액에 대하여 그리고 물에 대하여 덱스트란 술페이트의 투석 여과에 의해 시험된다. 실시예 3 에 기재한 바와 같이, 100 mg/ml 의 농도를 갖는 덱스트란 술페이트 용액을 0.15 M NaCl, 0.35 M NaCl, 0.45 M NaCl 및 1.0 M NaCl 에 대하여 투석여과하였다. 각 투석여과를 실행한 투과물을 덱스트란 술페이트에 대하여 분석하여 결과를 도 2 에 나타내었다. 보는 바와 같이, 증가된 이온 강도 0.15 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00013
), 0.35 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00014
), 0.45 M NaCl (
Figure 112001027859938-pct00015
) 및 1.0 M NaCl (X) 를 갖는 용액에 대하여 투석여과하였을 때, 덱스트란 술페이트가 더욱 효과적으로 제거되었다. 표 1 은 각종 염 용액과의 10 부피 투석 여과 후 체류물에 잔류하는 덱스트란 술페이트의 양을 요약한다.
10 부피 투석 여과 후 투석여과된 용액에 잔류하는 덱스트란 술페이트의 농도
NaCl 농도 (M) 체류액에 잔류하는 덱스트란 술페이트 (㎍/ml)
0 1088
0.15 1276
0.35 23
0.45 28
1.0 7
통상적으로, 투석여과 (즉, 0 mM 내지 350 mM NaCl) 용 용액의 이온 강도를 증가시키고 용액의 pH 를 중성 범위 (pH = 7.4) 로 조절함으로써 99 % 를 초과하는 덱스트란 술페이트가 제거될 수 있다.
다양한 전해질이 투석여과 동안 매질의 이온 강도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 것은 염, 예를 들어 NaCl, KCl, Na2SO4 및 K2SO4 이다. 중합체의 최적 제거를 위한 전해질의 양은 물론 중합체 및 염 및 각각의 상대적인 양에 따라 다를 것이다. 통상적으로, 약 150 mM 의 전해질이 필요하고, 450 mM 가 더욱 바람직하고, 1000 mM 까지 가능하다. 전해질의 양의 상부 한계는 부분적으로는 용액 중 리포솜의 안정성에 따라 결정되는데, 이는 리포솜 이중막을 통한 이온 구배 가 전해질의 농도가 증가함에 따라 구축되고 증가하기 때문이다.
투석여과 매질의 pH 는 또한 외부 매질로부터의 중합체의 제거를 최적화하기 위해 조절될 수 있다. 본 발명을 지지하여 수행된 연구에서, 중성 pH (예를 들어, pH 7-7.5) 는 전해질로서 NaCl 을 사용하여 덱스트란 술페이트의 양호한 제거를 제공한다.
엔트랩핑되지 않은 중합체의 제거 후, 리포솜에 약물을 로딩하기에 효과적인 조건 하에 예비-형성된 리포솜과의 약물 용액을 인큐베이션함으로써, 선택된 약물을 리포솜에 로딩한다. 실시예 2 에서 기재하고 있는 바와 같이, 시프로플록사신은 60 내지 65 ℃ 에서 30 분간 리포솜과의 약물 수용액을 인큐베이션함으로써 덱스트란 술페이트를 함유하는 리포소에 시프로플록사신을 로딩하였다. 이어서, 임의의 엔트되지 않은 약물을 투석여과하여 제거하였다.
표 2 는 상기 기재된 리포솜 제조 및 투석여과 방법을 사용한 4 가지 리포솜 제제의 성질을 요약한다. 제제는 대표적인 퀴놀론으로서 시프로플록사신을 포함하였고, 시프로플록사신의 농도는 분광측광법을 사용하여 측정하였다. 총 지질 함량은 총 인지질 함량을 측정하여 결정하였다. 입자의 크기 측정은 동적인 광 산란을 사용하여 측정하였다.
엔트랩핑된 덱스트란-술페이트/시프로플록사신을 갖는 리포솜
배치 번호 시프로플록사신 농도 (mg/mL) 총 지질 농도 (mg/mL) 약물/지질 비 입자 크기 (nm)
1 11.8 24.6 0.48 164
2 22.4 51.0 0.44 145
3 21.0 43.5 0.48 125
4 20.7 43.8 0.47 127
본 발명을 지지하여 수행되는 다른 연구에서는, 다중음이온성 중합체 폴리아크릴산이 시프로플록사신에 대한 트랩핑제로서 사용된다. 실시예 4 에 기재된 바와 같이, 40 : 45.2 : 4.8 의 몰비의 지질 HSPC, 콜레스테롤 및 mPEG-DSPE 를 암모늄 폴리아크릴레이트 수용액을 사용하여 수화하였다. 전해질의 존재 하에 투석여과를 통하여 외부 매질로부터 엔트랩핑되지 않은 중합체를 제거한 후, 리포솜에 시프로플록사신을 로딩하였다. 상기 리포솜, 및 트랩핑제로서 덱스트란-술페이트를 사용하여 형성된 리포솜을 생체외 누출 시험 및 하기 기재된 생체내 약동학적 연구에 사용하였다.
Ⅲ. 리포솜의 특성화
덱스트란 술페이트 또는 폴리아크릴레이트와의 착체 형태로 엔트랩핑된 시프로플록사신을 갖는 상기 기재된 바와 같이 제조된 리포솜을 생체외 및 생체내에서 특성화하였다.
보다 구체적으로는, 생체외 테스트를 수행하여 혈장의 존재 하에 리포솜으로부터 시프로플록사신이 누출되는 속도를 측정하였다. 실시예 5 에서 기재하는 바와 같이, 리포솜을 제조하고 50 ㎍ 시프로플록사신/mL 혈장의 농도로 혈장에서 인큐베이션하였다. 리포솜을 37 ℃ 에서 4 시간 동안 혈장에서 인큐베이션시키고, 샘플을 0, 1, 2 및 4 시간에서 취하여 분석하였다.
결과를 실시예 5 에서의 표 3A 내지 3C 에서 요약하고 시간의 함수로서 리포솜에 잔류하는 시프로플록사신의 백분율을 도 3 에 나타내었다. 덱스트란 술페이트 트랩핑제를 사용하여 제조된 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00016
) 은 시프로플록사신의 실질적으로 더 느린 누출을 나타내었고, 인큐베이션 2 시간 후에는 50 % 의 약물이 리포솜에 잔류하였다. 대조적으로, 다중음이온성 트랩핑제를 갖지 않는 엔트랩핑된 시프로플록사신을 갖는 리포솜 제제 (
Figure 112001027859938-pct00017
, ◇) 는 랫트 혈장에서 2 시간 인큐베이션한 후 리포솜에 여전히 약 10 % 미만의 약물이 남았다.
덱스트란 술페이트-엔트랩핑된 시프로플록사신 및 폴리아크릴레이트-엔트랩핑된 시프로플록사신을 함유하는 리포솜 제제를 생체내에서 시험하여 본 발명에 따라 제조된 리포솜 제형물에 투여된 시프로플록사신의 혈액 순환 역학을 결정하였다. 대조구로서, 즉, 중합체 트랩핑제가 없는, 암모늄 술페이트/시프로플록사신을 함유하는 리포솜을 동물에게 투여하였다. 실시예 6 에 기재된 바와 같이, 단일 거환 (bolus) 투여량 (40 mg 시프로플록사신/kg) 을 랫트에게 정맥 투여하였다. 24 시간까지 다양한 시점에서 동물로부터 혈액 샘플을 수합하고 시프로플록사신 함량을 분석하였다. 결과를 하기 표 5 에 요약하고 도 4A - 4B 에 그래프로 나타내었다.
도 4A 는 덱스트란 술페이트-결합된 시프로플록사신 (
Figure 112001027859938-pct00018
), 폴리아크릴레이트-착화된 시프로플록사신 (
Figure 112001027859938-pct00019
) 및 대조구 리포솜, 예를 들어 중합체 트랩핑제 없이 암모늄 술페이트/시프로플록사신을 함유하는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00020
) 에 대 한 결과를 나타낸다. 보는바와 같이, 다중음이온성 중합체가 없는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00021
) 에 엔트랩핑된 시프로플록사신은 리포솜으로부터 빠르게 방출되고 혈류로부터 제거되어 투여 약 1.5 시간 후에는 주입된 투여량의 약 50 % 가 제거된다. 반대로, 중합체 트랩핑제를 갖는 리포솜은 시프로플록사신의 상당히 더 나은 체류를 나타내었고, 중합체 트랩핑제로서 덱스트란 술페이트 (
Figure 112001027859938-pct00022
) 및 트랩핑제로서 폴리아크릴산 (
Figure 112001027859938-pct00023
) 을 갖는 리포솜은 2 시간 후 혈류에 50 % 의 시프로플록사신 투여량이 여전히 존재하였다.
도 4B 는 시험 제형물, 즉 덱스트란 술페이트-착화된 시프로플록사신 을 갖는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00024
; 표 5 의 원데이터를 참조); 폴리아크릴레이트-착화된 시프로플록사신을 갖는 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00025
, 표 5 의 원데이터를 참조) 및 중합체 트랩핑제 없이 내부 구획에 암모늄 술페이트-엔트랩핑된 시프로플록사신을 함유하는 대조구 리포솜 (
Figure 112001027859938-pct00026
, 표 5 의 원데이터를 참조) 의 시프로플록사신의 혈장 농도 (㎍/ml) 를 나타내는 유사한 플롯이다. 트랩핑제로 인하여 리포솜 중 시프로플록사신의 증강된 체류로부터 기인한 향상된 혈액 순환 수명이 명백하다. 중합체 트랩핑제가 없는 리포솜의 형태로 투여되었을 경우에는, 투여 24 시간 후 혈류에 시프로플록사신이 거의 잔류하지 않았다. 반대로, 약물을 중합체 트랩핑제를 포함하는 리포솜에 투여하였을 때는, 약물은 24 시간 시점에서도 여전히 존재한다.
덱스트란-술페이트 결합 시프로플록사신, 폴리아크릴레이트-결합 시프로플록사신 및 중합체 트랩핑제가 없는 대조구 제형물에 대한 약동학적 파라미터 AUC (곡 선 아래 면적) 및 Cmax 를 표 6 에 요약하였다.
리포솜의 시프로플록사신 제형물에 대한 약동학적 파라미터
제형물 AUC (㎍/ml ×시간) Cmax (㎍/ml)
덱스트란 술페이트 5772 754
폴리아크릴레이트 2452 925
대조구 2115 918
Ⅳ. 실시예
하기 비교예 및 실시예는 트랩핑된 시프로플록사신을 포함하는 리포솜의 제조를 설명한다. 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.
비교예 1
시프로플록사신을 함유하는 리포솜의 제조
60 내지 65 ℃ 에서 50 ml 에탄올 중에 각각 50:45:5 의 몰비로 수소화 콩 포스파티틸콜린 (HSPC), 콜레스테롤 및 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE) 으로 유도체화된 폴리에틸렌 글리콜을 용해시킴으로써 폴리에틸렌 글리콜의 표면 코팅을 갖는 리포솜을 제조하였다. 350 mM 암모늄 술페이트 용액 (pH 5.5) 을 제조하여, 60 내지 65 ℃ 까지 가열하였다. 용해된 지질을 암모늄 술페이트 용액에 첨가하고, 1 시간 동안 60 내지 65 ℃ 에서 혼합시켰다. 수득된 다중라멜라형 리포솜을 0.4 ㎛, 0.2 ㎛, 0.1 ㎛ 및 0.08 ㎛ 세공 크기 폴리카르보네이트 막을 통해 각 8 회 압출하였다. 압출 공정을 60 내지 65 ℃ 에서 수행하였다. 압출된 리포솜은 약 100 nm 의 평균 직경을 가졌다.
이어서, 리포솜을 350 nm 암모늄 술페이트에 대해 (10 부피 투석 여과), 또한 그 다음으로 10 % 수크로스를 함유하는 5 mM NaCl (10 부피 투석 여과) 에 대해 투석여과하였다.
시프로플록사신의 스톡 용액을 10 % 수크로스 용액 중에서 58 mg/ml 로 제조하였다. 활성 약물 로딩을 상기 기재된 바와 같이 제조된 리포솜을 시프로플록사신 용액과 0.71 mg/mg의 약물/지질 비로 혼합하고, 60 내지 65 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션함으로써 수행하였고, 이 때, 한 분취량의 샘플을 취해서 세파덱스 G-50 칼럼을 사용하여 약물 로딩의 퍼센트를 결정하였다. 약물 로딩의 퍼센트는 56 % 였다 (94 % 까지의 로딩 효율이, 더 낮은 약물/지질 비를 사용하여 달성될 수 있었다).
캡슐화되지 않은 약물은 10 % 수크로스를 함유하는 10 mM 히스티딘 완충액 (pH 6.5) 에 대해 투석여과함으로써 제거하였다. 시프로플록사신-로딩된 리포솜을 0.2 ㎛ 막을 통해 멸균여과하고, 2 내지 8 ℃ 에서 저장하였다. 최종 리포솜은 101 nm 의 평균 직경 및 0.41 mg/mg 의 약물/지질 비를 가졌다.
142 nm 의 평균 직경을 갖는 시프로플록사신 함유 리포솜의 또 다른 제제를 약간 수정된 압출 기술로 상기 기재된 동일한 과정을 사용하여 제조하였다.
실시예 2
덱스트란 술페이트-시프로플록사신 함유 리포솜의 제조
A. 덱스트란 술페이트 암모늄 염의 제조
분자량 8,000 달턴의 덱스트란 술페이트 나트륨 염 (Dextran Product Limited (Ontario, Canada)) 을 덱스트란 술페이트 암모늄염으로 하기와 같이 전환시켰다. 400 mL 의 베드 부피를 갖는 이온 교환 칼럼을 DOWEX 50X8-100 이온 교환 수지 (Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI) 로 패킹하였다. 패킹된 칼럼을 2 L 의 1 N HCl 을 사용하여 3 내지 4 mL/분의 유속으로, 용출물의 pH 가 약 1 내지 2 일 때까지 린스하였다. 과량의 HCl 을 칼럼으로부터 2 내지 3 L 의 탈이온수로 용출수의 pH 가 약 5.5 일 때까지 세척하였다.
300 mL 의 덱스트란 술페이트 나트륨 염 (수중 50 mg/mL) 을 수지에 적용시키고, 12 개의 50 mL 분획으로 수합하였다. 덱스트란 술페이트를 함유하는 분획 (분획 3 내지 12) 을 풀링시키고, 5 M 암모늄 히드록시드 (약 25 mL) 을 사용하여 pH 를 1.29 에서 5.5 로 조절하였다.
덱스트란 술페이트 암모늄 염을 1 L 둥근 바닥 플라스크에서 4 개의 150 mL 분획으로 동결건조시켰다. 동결건조된 분말을 5 mM NaCl 중에 100 mg/mL 의 농도로 용해시켰다. 용액 pH 는 5.4 였다.
B. 리포솜 제조
8.75 mM 덱스트란 술페이트 용액을 상기 기재된 바와 같이 제조하고, 60 내지 65 ℃ 까지 가열하였다.
수소화 콩 포스파티딜 콜린 (HSPC, Lipoid K.G. Ludwigshafen, Germany), 콜레스테롤 (Croda, Inc. New York, NY) 및 mPEG-DSPE (Sygena, Ltd, Liestal Switzerland) 를 50 : 45.2 : 4.8 의 몰비로 60 내지 65 ℃ 에서 탈수 에탄올 (Quantum Chemical, Cincinnati, Ohio) 중에 용해시켰다. 용해된 지질을 덱스트 란-술페이트 용액에 첨가하고, 혼합물을 60 내지 65 ℃ 에서 1 시간 동안 혼합하였다. 총 지질 농도는 106.38 mg/mL, 또는 150 μmol/mL 이었다.
수화 리포솜을 0.2 ㎛ 세공 크기 폴리카르보네이트 막 필터를 통해 60 내지 65 ℃ 에서 8 내지 10 회 통과시켜 압출하였다.
트랩핑되지 않은 중합체를 NaCl 용액에 대해 투석여과함으로써 사이징된 리포솜 현탁액으로부터 제거하였다. 중공 섬유 초여과 카트리지 (NMCO 300,000; A/G Tech Corp. Needham, MA) 를 사용하여, 리포솜을 pH 7.4, 350 mM NaCl 에 대해 10 부피 투석 여과로, 이어서 pH 7.4, 150 mM NaCl 에 대해 10 부피 투석 여과로 투석여과하였다.
충분한 시프로플록사신 (Bayer AG, Leverkusen, Germany) 을 150 mM NaCl 중에서 용해시켜, 30 mg/mL 용액을 형성하였다. 용액dml 완전한 용해를 위해 60 ℃ 까지 가열하였다. 약물 용액을 리포솜 현탁액과 혼합하고, 60 내지 65 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 얼음조를 사용하여 실온까지 빠르게 냉각하였다. 크기 배제 칼럼 상에서 리포솜 베히클로부터 유리 약물을 분리하고, 약물의 양을 UV 분광측광법에 의해 각 분획에서 정량함으로써 약물 캡슐화 퍼센트를 측정하였다.
150 mM NaCl 용액에 대해 5 부피 투석 여과로, 이어서 pH 6.5 의 10 % 수크로스, 10 mM 히스티딘의 10 부피 투석 여과에 대해 투석여과함으로써 엔트랩핑되지 않은 약물을 제거하였다.
실시예 3
염 용액에 대한 덱스트란-술페이트의 투석여과
덱스트란 술페이트 나트륨염 (분자량 8,000 달턴, Dextran Products Limited, Scarborough, Ontario, Canada) 을 증류수 중에 100 mg/ml 의 농도로 용해시켰다. 300,000 분자량 컷-오프 및 0.79 ft2 표면적을 갖는 투석여과 카트리지 (A/G/Technology Corporation, Needham, MA) 를 2 리터의 증류수로 세척하였다. 90 mL 의 덱스트란 술페이트를 1000 mL 의 증류수에 대해 (약 10 부피 투석 여과) 투석여과하였다. 부피 투석 여과 (각각 100 mL) 를 별도로 수합하고, 각 1 mL 을 덱스트란 술페이트 정량을 위해 사용하였다. 최종 체류물을 동일한 원래의 부피 (90 mL) 까지 물을 사용하여 되돌린 후, 덱스트란 술페이트 함량을 분석하였다.
동일한 투석여과 과정을 0.15 M NaCl, 0.35 M NaCl, 0.45 M NaCl 및 1.0 M NaCl 을 사용하여 반복하였다. 투과물을 수합하고, 1,9-디메틸렌 블루를 사용하여 덱스트란 술페이트에 대해 분석하고, 590 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 2 및 표 1 에 나타내었다.
실시예 4
폴리아크릴산을 사용한 리포솜의 제조
분자량 2,000 달턴을 갖는 250 mM 폴리아크릴산 (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) 및 50 mM 암모늄 술페이트의 수용액을 제조하고, 용액의 pH 를 5 M NaOH 를 사용하여 5.5 로 조절하였다.
리포솜을 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 용해된 HSPC, 콜레스테롤 및 mPEG-DSPE 를 50 : 45.2 : 4.8 의 몰비로 암모늄 폴리아크릴레이트/암모늄 술페이트 수용액을 사용하여 수화시킴으로써 제조하였다. 엔트랩핑되지 않은 중합체를 제거하고, 시프로플록사신을 실시예 2 에 따른 리포솜에 로딩하였다.
실시예 5
생체외 특성화
실시예 2 및 3 에 따라 제조된 리포솜으로부터의 시프로플록사신 누출 속도를 50 ㎍ 시프로플록사신/mL 혈장 의 농도에서 리포솜을 인큐베이션함으로써 결정하였다. 분석을 위해 0, 1, 2 및 4 시간에서 취한 샘플을 사용하여, 37 ℃ 에서 4 시간 동안 리포솜을 혈장중에서 인큐베이션시켰다. 각 샘플 중 리포솜을 고체상 추출법 (하기 실시예 5B 에서 기술함) 에 의해 유리 약물로부터 분리하고, 역상 HPLC (하기 실시예 5 C 에서 기술함) 에 의해 시프로플록사신 함량에 대해 분석하였다. 결과를 하기 표 3A 내지 3C 에 요약하고, 도 3 에 나타내었다.
암모늄 덱스트란 술페이트/시프로플록사신을 갖는 리포솜
시간 (시) 리포솜의 시프로플록사신 (㎍/ml) 유리 시프로플록사신 (㎍/ml) 총 시프로플록사신 (㎍/ml) 리포솜 중의 시프로플록사신 %
0 53.03 0.6 53.63 98.9
1 31.16 22.02 53.18 58.6
2 27.07 25.66 52.73 51.3
4 21.96 30.7 52.66 41.7
암모늄 술페이트/시프로플록사신을 갖는 리포솜
시간 (시) 리포솜의 시프로플록사신 (㎍/ml) 유리 시프로플록사신 (㎍/ml) 총 시프로플록사신 (㎍/ml) 리포솜 중의 시프로플록사신 %
0 48.52 0.99 49.51 98.0
1 13.44 35.01 48.45 27.7
2 3.18 44.96 48.14 6.6
4 BQL* 47.76 BQL* 0
*BQL = 정량 한계 이하
암모늄 술페이트/시프로플록사신을 갖는 리포솜
시간 (시) 리포솜의 시프로플록사신 (㎍/ml) 유리 시프로플록사신 (㎍/ml) 총 시프로플록사신 (㎍/ml) 리포솜 중의 시프로플록사신 %
0 50.95 1.11 52.06 97.9
1 10.68 36.21 46.89 22.8
2 5.32 42.42 47.74 11.1
4 BQL* 45.89 BQL* 0
*BQL = 정량 한계 이하
A. 고체상 추출법
1. 샘플 제조
리포솜-시프로플록사신 제형물을 pH 6.5 의 10 % 수크로스/10 mM 히스티딘 중 약 2 mg/mL 의 시프로플록사신 농도로 희석시켰다. 각 리포솜-시프로플록사신 제형물에 대하여, 1.95 mL 의 블랭크 랫트 혈장을 얼음 상에서 냉각시켰다. 0 시에서, 50 μL 의 냉각된 리포솜 제형물을 냉각된 혈장 (50 ㎍/mL 의 최종 시프로플록사신 농도) 와 함께 혼합하고, 두 개의 100 μL 의 분취량을 0 시점에 대한 즉각적인 고체상 추출을 위하여 제거하였다. 이어서, 플라스마/리포솜 혼합물을 37 ℃ 의 수조에 위치시켰다. 1, 2 및 4 시간에서, 혼합물을 혼합하고 복사물 100 μL 분취량을 추출을 위해 제거하였다. 리포솜의 시프로플록사신 제형물을 pH 6.5 의 10 % 수크로스/10mM 히스티딘 완충액으로 대체하여 혈장 블랭크를 유사한 방법으로 제조하였다. 4 시간에서, 각 혈장/리포솜 혼합물로부터의 100 μL 분취량의 추가적인 복사물 셋트를 총 시프로플록사신 결정을 위해 제거하였다.
2. 고체상 추출법:
SPE-24G 고체상 추출 유리 컬럼 프로세서 (JT Baker, part #JT 7208-8) 및 Bond Elute LRC, 고체상 추출용 C18 카트리지, 100 mg, 10 mL (Varian part # 1211-3001) 를 추출 과정에 사용하였다. 20 개의 표준 일회용 바늘을 카트리지 밑에 부착하여 샘플 수합을 보조하였다. 2 mL 메탄올, 이어서 2 mL 염수를 사용하여 카트리지를 예비세척하였다. Hg 에서 약 4-6 으로 진공을 사용하여 카트리지를 통한 적절한 적하 흐름을 성취하고, C18 패킹 베드가 추출 과정 끝까지 절대 건조되지 않도록 하였다. 한번 사용한 후에는 카트리지 및 바늘을 버렸다.
2 mL 용적의 플라스크를 샘플 수합을 위한 예비-세척된 C18 카트리지 하에 위치시켰다. 이어서, 카트리지를 200 μL 블랭크 랫트 혈장으로 예비-처리하여, C18 흡수제 상의 활성제 부위를 제거하였다. 이어서, 혈장/리포솜 혼합물의 100 μL 분취량을 C18 베드에 로딩하였다. 카트리지를 1 mL 염수로 세척하고, 용출액을 동일한 플라스크에 수합하였다. 상기 염수 분획은 리포솜-시프로플록사신을 함유하고, "S-Fraction" 으로 표지하였다.
이어서, 유리 시프로플록사신을 pH 2.2 의 1.6 mL 메탄올/0.1 M NaH2PO4 (9:1, v/v) (산성화 메탄올) 과의 C18 카트리지로부터 세척하였다. 세척물을 두 번째 2 mL 용량의 플라스크에 수합하고, C18 패킹을 흡수 건조시키고, 모든 샘플을 제거하였다. 상기 분획을 "F-Fraction" 으로 표지하였다.
F-Fraction 및 S-Fraction 을 염수를 사용하여 2.0 mL 부피로 하였다. 총 시프로플록사신의 측정을 위하여 4 시간에 수합한 플라스마/리포솜-시프로플록사신 혼합물의 100 μL 분취량을 또한 염수 및 "Total" 로 표지된 것을 사용하여 2.0 mL 로 희석시켰다.
B. 시프로플록사신의 HPLC 분석:
1. HPLC 조건:
컬럼 온도: 30 ℃
유속: 1 mL/분
가동 시간 (run time): 12 분
검출: 278 nm 의 UV
이동상: 25 mM NaH2PO4, pH 2.3/아세토니트릴 (87:13)
주입 부피: 20 μL
컬럼: 프리 컬럼 (precolomn) 이 있는, Water Symmetry C18 4.6 ×150 mm, 5 미크론.
"Total" 및 "S-Fraction" 을 하기와 같이 처리하였다. 250 μL 의 분획을 1000 μL 산성화 메탄올과 보텍스 (vortex) 혼합한 후, 10 ℃ 및 3000 rpm (Sorvall RT6000) 에서 30 분간 원심분리하였다. 상층액을 분석용 HPLC 바이알로 옮겼다.
시프로플록사신 시스템의 정밀한 샘플 및 눈금측정 표준을 염수 중 15 % 블랭크 랫트 혈장에서 제조하고, 분취량을 "Total" 및 "S-Fraction" 과 동일한 방법으로 산화 메탄올로 처리하였다. 시프로플록사신 및 리포솜 엔트랩핑된-시프로플록사신의 품질 대조구 샘플을 블랭크 랫트 혈장에서 제조하고, 샘플의 100 μL 분취량을 2.0 mL 염수로 희석시켰다. 이어서, 희석된 샘플의 분취량을 "Total" 및 "S-Fraction" 과 동일한 방법으로 산화 메탄올로 처리하였다. HPLC 눈금측정 곡선의 범위가 0.02-10 μmg/mL 였고, 결과는 1/(농도)2 에 의해 칭량된 최소 제곱 선형 회귀를 사용하여 조절하였다.
실시예 6
생체내 특성화
A. 리포솜 제형물
하기 조성을 갖는 리포솜을, 리포솜을 에탄올 수화법에 의해 제조한 후, 암모늄 술페이트 농도 구배를 사용하여 리포솜의 활성 로딩이 성취되는 실시예 1, 2 및 4 에 설명된 과정에 따라 제조하였다.
생체내 시험용 리포솜 조성
성분 대조구 리포솜1 덱스트란 술페이트 내부 폴리아크릴레이트 내부
HSPC2 (mole %) 50.0 50.0 50.0
콜레스테롤 (mole %) 45.0 45.0 45.0
mPEG-DSPE3 (mole %) 5.0 5.0 5.0
총 지질 (mg/mL) 36.7 41.4 35.7
시프로플록사신 함량 (mg/mL) 10.3 5.84 5.39
내부 완충액 암모늄 술페이트 암모늄 덱스트란 술페이트 암모늄 폴리아크릴레이트
외부 완충액 10 % 수크로스, 10 mM 히드티딘, 5 mM NaCl, pH 6.5 10 % 수크로스, 10 mM 히스티딘, 5 mM NaCl, pH 6.5 10 % 수크로스, 10 mM 히스티딘, 5 mM NaCl, pH 6.5
압출 온도 (℃) 60 60 60
입자 크기 (nm) 102 114 94
1암모늄 술페이트 내부
2수소화 콩 포스파티딜콜린
3메톡시폴리에틸렌 글리콜 디스테아로일 포스파티딜 콜린
B. 동물
18 마리의 수컷 Sprague-Dawley 랫트 (220 내지 250 그람) 을 공급원 (Simonsen Labs, Gilroy, Ca) 으로부터 수득하고, 임의로 사료 (Lab DietTM Laboratory Rodent Diet # 5001) 및 물을 제공하여, 12 시간:12 시간의 빛:어둠 하에 통상적 사육소에서 사육하였다. 양호한 건강을 확실히 하기 위해, 동물들을 연구 시작 적어도 3 일 전에 유지시켰다
C. 연구 계획안
3 개의 리포솜-시프로플록사신 제형물 중 하나를 랫트의 측면 꼬리 정맥을 통하여 40 mg/kg 으로 단일 정맥내 주사 투여하였다. 투여 후 하기 횟수: 30 초, 20 분, 40 분, 1.5 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간 및 24 시간에 전체 혈액을 7.5 % EDTA 항응고제로 수합함으로써, 레트로-오비탈 시누스를 통하여 마취된 동물 (흡입 이소플루란) 로부터 혈액 샘플을 수득하였다. 혈액 샘플을 실온에서 750 ×g 에서 20 분간 원심분리하여 혈장 분획을 수득할 때까지 얼음 상에서 저장하였다. 역상 HPLC 에 의하여 총 시프로플록사신 (유리된 것과 캡슐화되지 않은 것) 에 대해 분석할 때까지 혈장을 4 ℃ 에서 동결시켰다.
D. 데이터 평가
[ADAPT Ⅱ, Release 4.0 Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software (D'Argenio and Schmutizky, ADAP Ⅱ Users Guide. Biomedical Simulations Resource, University of Southern California, Los Angeles, CA)] 를 사용하여 최대 근접 평가와 함께 칭량된 비선형 회귀를 사용하여 각 랫트에서 약동학을 수득하였다. 시프로플록사신 농도에 대한 경험상의 다양성 모델은 관찰의 잔류 ('에러') 표준편차 (σ)가 실제 값에 선형으로 관계된다는 것을 추정하였다. 모델 구별은 Akaikes' Information Criterion (AIC) [Akaike, H., A Bayesian Extension of the Minimum AIC Procedure of Autoregressive Model Fitting, Biometika, 66:237-242 (1979)] 를 이용하였다 . 혈장 농도를 직접 관찰함으로써 최대 시프로플록사신 농도 (Cmax) 를 수득하고, 시간 0 부터 무한대의 시간의 항정 상태 (steady-state) 에서의 곡선 아래 면적 (AUCss) 을 수적으로 적분하여 결정하였다.
혈청 시프로플록사신 농도를 표 5 에 요약하고, 도 4A 내지 4B 에 그래프로 나타내었다. 생체내 연구로부터의 약동학적 파라미터를 표 6 에 나타내었다.
혈장 시프로플록사신의 농도
시간 (시) 혈액 중 시프로플록사신 (㎍/ml)
대조구 덱스트란 술페이트 폴리아크릴레이트
0.083 918 ±109 754 ±83.9 925 ±82.7
0.333 831 ±13.8 648 ±11.1 773 ±57.0
0.66 742 ±31.2 587 ±18.9 1150 ±71.6
1.5 558 ±27.1 491 ±25.9 575 ±32.1
3 304 ±37.4 396 ±29.0 363 ±51.6
5 38.6 ±15.8 345 ±16.2 154 ±41.9
7 6.5 ±1.4 306 ±22.6 49 ±27.1
24 BQL 42.6 ±22.6 BQL
*BQL = 정량 한계 이하
본 발명을 특정 구현예에 관하여 기재하였지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명에서 벗어나지 않고 가능할 수 있다는 것이 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다.

Claims (21)

  1. 리포솜 안에 함유된, 인지질 또는 스핑고미엘린으로부터 선택되는 소포-형성 지질, 플루오로퀴놀론 화합물 및 다중음이온성 중합체의 착체로 구성된 리포솜 현탁액을 함유하는 리포솜 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 플루오로퀴놀론이 6-플루오로퀴놀론인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 6-플루오로퀴놀론이 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파르플록스신, 로메플록사신, 플레로플록사신, 페플록사신 및 아미플록사신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중음이온성 중합체가 술페이트, 술포네이트, 포스페이트, 및 카르복실레이트기로부터 선택되는 음이온성 기를 포함하는 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 다중음이온성 중합체가 덱스트란술페이트, 콘드로이틴 술페이트 A, 폴리비닐황산 및 폴리인산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 다중음이온성 중합체가 덱스트란 술페이트이고, 6-플루오로퀴놀론이 시프로플록사신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 인지질 또는 스핑고미엘린으로부터 선택되는 소포-형성 지질로 구성된 리포솜으로서, 엔트랩핑된 다중음이온성 중합체를 갖는 리포솜을 제조하고; 6-플루오로퀴놀론 화합물의 존재 하에 리포솜을 인큐베이션시킴으로써, 6-플루오로퀴놀론 화합물 및 다중음이온성 중합체의 리포솜-엔트랩핑된 착체를 형성하는 것을 포함하는, 리포솜 내 6-플루오로퀴놀론의 체류를 증강시키는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 제조 방법이 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 갖는 리포솜을 제조하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 다중음이온성 중합체를 포함하는 내부 수성상을 갖고, 다중음이온성 중합체를 포함하는 외부상에서 현탁된 각각의 리포솜의 현탁액을 형성하고; 염을 첨가함으로써 외부 상으로부터 다중음이온성 중합체를 제거하고; 플루오로퀴놀론의 존재 하에 리포솜을 인큐베이션시킴으로써 리포솜에 플루오로퀴놀론을 로딩하고; 외부 상으로부터 엔트랩핑되지 않은 플루오로퀴놀론을 제거하는 것을 포함하는, 다중음이온성 중합체와의 공침전물의 형태의 리포솜에 엔트랩핑된 플루오로퀴놀론을 갖는, 제 1 항 내지 제 3 항, 제 5 항 및 제 8 항 중 어느 한 항의 리포솜 현탁액의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 현탁액 내의 리포솜이 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 제거 단계가, 응축된 다중음이온성 중합체를 투석여과시킴으로써 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, Na2SO4 및 K2SO4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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