CN103370055A - 缓释性脂质体组合物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供脂质体组合物和具有临床上维持充分的有效浓度的缓释性的、适于皮下给药等的脂质体制剂，该脂质体组合物为相对于在水混溶性有机溶剂中含有总浓度为100～200w/v%的磷脂和胆固醇而成的水混溶性有机溶液1体积，以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液，得到混合相中的磷脂和胆固醇的总浓度为15～50w/v%的乳液，用第二水相溶液对前述乳液进行外液置换而得到的脂质体组合物，在由前述第一水相溶液构成的脂质体膜的内部区域水相与由前述第二水相溶液构成的脂质体膜的外部区域水相之间形成离子梯度，该脂质体组合物能够以高包封量导入药物。

Description

缓释性脂质体组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及含有药物等有效成分的缓释性脂质体组合物。
背景技术
近年，随着老龄化社会发展，认知功能障碍、脑疾病、帕金森氏病等需要看护者的患者增加。这类患者自己忘记吃药、或由于咽下困难而吃药困难，自己难以管理吃药，寻求经口给药以外的给药方法。另外，对于抗精神病的患者等，由于若断药则立即表现出症状而对生活带来障碍，因此必须在药物的效果中断之前，一天给药几次，频繁给药对于患者而言成为大的负担。由此，缓释制剂在所有疾病领域中为非常值得期待的制剂。
作为皮下给药制剂或肌肉内给药制剂，迄今研究的缓释制剂大多为使用聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的微球。例如有在PLGA的交联基质中包封抗癌药亮丙瑞林而成的微囊制剂Leuprin(注册商标)。已知这些使用PLGA的微球在给药后立即释放药物(突释)，血药浓度立即升高到有效浓度以上，因此副作用令人担心。另外，使用PLGA的情况下，难以高效、高浓度地包封药物，另一方面，临床上能够给药的给药量存在极限，因此药物包封量的改善也仍然存在问题。进而，使用PLGA的情况下，由于制造工序中使用有机溶剂，因此必须从制剂去除有机溶剂，大多难以以工业规模制造。并且，使用PLGA时，水解的同时局部酸增强，因此在给药部位产生炎症也成为大的问题。
另外，对于多室脂质体，提出了利用主动载药法包封丁哌卡因的方法，但是该文献中，不追求粒径与缓释性的关系，未发现缓释制剂中最佳的粒径。另外，所公开的缓释时间在临床上也不是充分的持续时间(Anesthesiology101(2004)133-137、International Society for Anaesthetic Pharmacology110(2004)1018-1023)。进而，日本特表2001-522870中记载的多囊脂质体(MVL)，作为用于局部或全身性的药物递送的脂质基质的缓释性药物载体得到开发，但是对于其而言，在药物包封量和缓释时间方面也仍然不充分，存在问题。
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供可以得到脂质体制剂的脂质体组合物，所述脂质体制剂在临床上可以以低体积给予必要的药物量、进而具有可以长期稳定地持续有效的血药浓度的缓释性。
用于解决问题的方案
本发明人等发现，只要在12重以上的多层膜中具有均匀的内水相、并且在脂质体(以下有时称为空的脂质体)的内/外水相之间形成了离子梯度的脂质体组合物中包封药物，则能得到具有缓释性的脂质体制剂，从而完成了本发明。
上述问题通过以下的本发明解决。
(1)一种脂质体组合物，其为相对于在水混溶性有机溶剂中含有总浓度为100～200w/v%的磷脂和胆固醇而成的水混溶性有机溶液1体积，以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液，得到混合相中的磷脂和胆固醇的总浓度为15～50w/v%的乳液，用第二水相溶液对前述乳液进行外液置换而得到的脂质体组合物，在由前述第一水相溶液构成的脂质体膜的内部区域水相与由前述第二水相溶液构成的脂质体膜的外部区域水相之间形成离子梯度。
(2)根据(1)所述的脂质体组合物，其中，前述离子梯度为pH质子梯度，具有脂质体的内部区域水相(以下有时称为内水相)的pH低于脂质体的外部区域水相(以下有时称为外水相)的pH的pH梯度。
(3)根据(1)或(2)所述的脂质体组合物，其中，前述脂质体具有最外径为2.5μm以上的平均粒径且在12重以上的多层膜中具有前述内部区域水相。
(4)一种脂质体制剂，其为利用离子梯度将药物导入上述(1)～(3)中任一项所述的脂质体组合物的内部区域水相而成的脂质体制剂，以0.08(摩尔)/总脂质(摩尔)以上将该药物保持在脂质体内。
(5)根据(4)所述的脂质体制剂，其中，前述脂质体制剂具有包封在其内部区域的药物的血药有效浓度维持至少四天以上的全身性缓释性，或具有包封在其内部区域的药物的局部有效浓度维持至少四天以上的局部性缓释性。
(6)根据(4)或(5)所述的脂质体制剂，其中，前述药物为两亲性弱碱性化合物。
(7)一种缓释制剂用试剂盒，其包括上述(4)～(6)中任意一项所述的前述脂质体制剂和27～33号中的至少一号尺寸的注射针。
本发明的脂质体组合物可以在脂质体组合物中含有本发明的脂质体以外的脂质体，本发明的脂质体以外的脂质体有小单室脂质体、多小囊脂质体等。优选本发明的脂质体为前述脂质体中的50质量%以上，更优选为60质量%以上，进一步优选为80质量%以上。
发明的效果
本发明的脂质体组合物在特定的总脂质浓度时可以高效地包封药物，能得到药物浓度高的脂质体制剂。另外，在多层膜中具有前述内部区域水相的本发明的脂质体组合物若包封药物而形成脂质体制剂，则在临床上能够没有突释地长期稳定地持续释放有效的血药浓度，也避免了副作用的担心，并且能够减少给药次数，因此是非常有用的脂质体制剂。进而，根据本发明的脂质体制剂，能够以低体积给予必要的药物量，与皮下或肌肉内给药制剂通常必须用19～21号的粗针给药相比，本发明的脂质体制剂即使是号数高的小直径的针也能够给药，是能够大幅提高患者的生活质量(QOL)的有用的脂质体制剂。
附图说明
图1为表示制造例2中得到的多奈哌齐脂质体制剂的冷冻断裂复型电子显微镜观察照片的图。图1的a为脂质体制剂的接近最外表面处的分割图。图1的b为大致中央处的分割图。
图2为表示平均粒径与膜层数(lamellarity)的关系的图。
图3为表示来自具有不同粒径的脂质体制剂的释放特性(使用了硫酸铵的体外(in vitro)释放试验法中的测定结果)的图。
图4为表示粒径与药物释放速度的关系的图。
图5为表示单纯的多奈哌齐和脂质体制剂的皮下给药中的血中盐酸多奈哌齐浓度的图。
图6为表示肌肉内给药中的单纯的盐酸丁哌卡因和脂质体制剂的给药部位的盐酸丁哌卡因残留率(质量%)的图。
具体实施方式
本发明的脂质体由具有特定粒径(脂质体颗粒的最外径)的多组脂质双重层形成，内部具有一个内水相。本发明的脂质体的平均粒径优选为2.5μm～12μm，更优选为3.7μm～10μm，进一步优选为5μm～10μm，特别优选为6μm～10μm。本发明的脂质体优选平均粒径为2.5μm以上。关于本发明的脂质体的粒径，可以通过使用粒度分布计(例如光散射衍射式粒度分布计、例如Beckman Coulter LS230)，以平均粒径(平均最外径)测定。
本发明的脂质体的壁由脂质双重层构成。若由一组脂质双重膜构成一层的层结构(lamellarity)，则本发明的脂质体通过特定层数的层结构构成作为壁的外壳。尤其是本发明的脂质体具有12层～35层(12重～35重)的层结构(具有该层结构时的(平均粒径)为2.5μm～12μm)。优选具有14层～27层(14重～27重)的层结构(具有该层结构时的外径(平均粒径)为3.7μm～10μm)。这些层结构，在内侧和外侧大致接触地存在邻接的层结构，在它们之间存在少量的水。层结构的层数可以如下求得：在破坏一部分的本发明的脂质体的壁的条件下拍摄扫描电子显微镜(SEM)照片，计测层结构的层数，由此求得层结构的层数。
本发明的脂质体在内部具有内水相。内水相在存在于最内侧的层结构的内表面的内部区域构成。一层的层结构(脂质双重膜)的厚度为约10nm，正由于所存在的脂质双重膜的组数而产生脂质体的壁厚。脂质双重膜的层结构为20层的情况下，10nm的20层厚度配置在内水相的两侧，因此形成0.4μm的两壁厚。通过从由20层形成的脂质体的外径减去0.4μm，可以计算内水相的内径。本发明的脂质体组合物和制剂的内水相的内径可以优选列举出2.2μm(平均粒径2.5μm、12层)～11.3μm(平均粒子径12μm、35层)，更优选为3.4μm(平均粒径3.7μm、14层)～9.4μm(平均粒子径10μm、27层)。本发明的脂质体例如在平均粒径为2.5μm时层结构为12层。同样地，例如在平均粒径为3.7μm时层结构为14层。例如在平均粒径为10μm时层结构为27层，在平均粒径为12μm时层结构为35层。
如此制造的脂质体得到优选的缓释性的同时，能够以均匀的脂质体组合物形式制造。
本发明的脂质体为通过以下的工序得到的脂质体，分散在外部区域水相中而形成本发明的脂质体组合物。
本发明的脂质体为如下得到的脂质体：“相对于在水混溶性有机溶剂中含有总浓度(以下有时记载为总脂质浓度)为100～200w/v%(100ml中100～200g)的磷脂和胆固醇而成的水混溶性有机溶液1体积，以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液，得到混合相中的磷脂和胆固醇的总浓度为15～50w/v%(100ml中15～50g)的乳液，用第二水相溶液对前述乳液进行外液置换，得到上述脂质体”。
在此，“水混溶性有机溶剂”指的是甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等醇类，优选为乙醇。
“水混溶性有机溶液(以下有时称为醇溶液)”指的是醇中含有总浓度为100～200w/v%(100ml中100～200g)的磷脂和胆固醇的溶液。
“混合相”指的是相对于水混溶性有机溶液1体积、以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液而得到的混合相，总脂质浓度为15～50w/v%(100ml中15～50g)。
“第一水相”也称为内部区域水相或内水相，为均匀存在于本发明的脂质体的多层膜中的内部区域水相。
“第二水相”也称为外部区域水相或外水相，为存在于发明的脂质体的多层膜的外部的水相，为与内部区域水相形成离子梯度的水相。
以下对各成分进行说明。
<磷脂>
本发明的脂质体组合物的脂质膜的主要构成成分之一即磷脂为生物膜的主要构成成分，通常为分子内具有由长链烷基构成的疏水基和由磷酸基构成的亲水基的两亲性物质。作为磷脂，优选磷脂酰胆碱(=卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等甘油磷酸；神经鞘磷脂(SM)等鞘磷脂；心磷脂等天然或者合成的双磷脂酰磷脂以及它们的衍生物；它们的氢化物例如氢化大豆卵磷脂(HSPC)、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂。磷脂可以为单独一种或者多种的组合。
<磷脂以外的添加物>
本发明的脂质体组合物的膜脂质可以在包含上述主要构成成分的同时包含其它膜成分，例如，可以根据需要包含磷脂以外的脂质或者其衍生物、膜稳定剂、抗氧化剂等。磷脂以外的脂质指的是分子内具有长链烷基等疏水基且分子内不含有磷酸基的脂质，没有特别的限定，可以列举出甘油糖脂、神经鞘糖脂、胆固醇等甾醇衍生物以及它们的氢化物等衍生物。作为胆固醇衍生物，可列举出具有环戊烷多氢菲(cyclopentano hydrophenanthrene)环的甾醇类。这些之中，本发明的脂质体组合物优选含有胆固醇。作为抗氧化剂，可列举出例如抗坏血酸、尿酸或者生育酚同系物即维生素E等。生育酚中存在有α、β、γ、δ四种异构体，本发明中可以使用任意一种。
本发明中，有时将磷脂与胆固醇的总计记载为总脂质。
需要说明的是，本发明的脂质体组合物通过如以下所述选择作为磷脂和胆固醇的总脂质的组成，可以形成适宜的脂质体组合物。
1)脂质体的脂质膜仅由具有链长16～18的饱和脂肪酸的酰基链的磷脂构成。
2)脂质体的脂质膜含有具有链长14～18的饱和脂肪酸的酰基链的磷脂和胆固醇作为主要构成成分时，两成分的摩尔比为80:20～50:50。
3)脂质体的脂质膜含有具有链长16～18的不饱和脂肪酸的酰基链的磷脂和胆固醇作为主要构成成分时，两成分的摩尔比为60:40～50:50。
在此，酰基链的链长指的是酰基链的碳原子数。
酰基链碳原子数为14的饱和脂肪酸，可列举出肉豆蔻酸，酰基链碳原子数为15的饱和脂肪酸，可列举出十五烷基酸，酰基链碳原子数为16的饱和脂肪酸，可列举出棕榈酸(惯用名：鲸蜡酸、十六烷基酸、系统名：十六烷酸)，酰基链碳原子数为17的饱和脂肪酸，可列举出十七烷酸，酰基链碳原子数为18的饱和、不饱和脂肪酸，可列举出硬脂酸(系统名：十八烷酸)、油酸、亚油酸、亚麻酸等。
<脂质体内水相(第一水相)溶液>
本发明中，对于为了高效且稳定地将两亲性弱碱性药物包封在脂质体内而使用的脂质体的内水相溶液而言，与前述两亲性弱碱性药物一起包封在脂质体内的抗衡离子的选择是重要的。本发明的脂质体组合物为了高效的包封药物、并且实现长期缓释性，优选含有硫酸根离子。作为产生硫酸根离子的化合物，通常为硫酸铵，但是另外也可以从硫酸葡聚糖、硫酸软骨素等中选择。另外，作为其它的抗衡离子，可列举出氢氧化物、磷酸盐、葡糖醛酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、氰酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、氯化物、以及其它的无机或有机阴离子类、或阴离子性聚合物等。
对于内水相的pH，根据主动载药法的手法不同而异。例如，使用柠檬酸时，需要预先形成内水相与外水相的pH梯度，此时优选内水相与外水相的pH之差为3以上。另外，使用硫酸铵时，由于能通过化学平衡形成pH梯度，因此无需特别考虑。
另外，在本发明的脂质体组合物的制造中，相对于包含含有脂质的水混溶性溶剂的水混溶性有机溶液1体积，以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液。第一水相(内水相)溶液相对于水混溶性有机溶液1体积按体积比计优选为3～9，进一步优选为3～5.6。
<脂质体外水相(第二水相)溶液>
外水相使用用于与内水相溶液形成前述离子梯度的离子浓度低的水溶液，具体而言，使用HEPES溶液，NaCl溶液，葡萄糖、蔗糖等糖类水溶液。对于外水相的pH，期望利用缓冲剂进行调整，考虑到脂质的分解以及生物体内给药时的pH差别而调整到pH5.5～8.5的范围内是合适的，更优选处于pH6.0～7.5的范围内。对于脂质体的内水相和外水相的渗透压而言，调整到不会由于两者的渗透压差而破坏脂质体的范围的渗透压即可，没有特别限定，若考虑到脂质体的物理稳定性，则该渗透压差越小越好。
<脂质体制剂>
使用主动载药法将药物包封在本发明的脂质体组合物中，得到本发明的脂质体制剂。
<主动载药法>
主动载药法指的是制造未包封药物的空脂质体，向脂质体外液加入药物，由此将药物导入脂质体的方法。主动载药法中，加入到外液的药物主动地向脂质体移动而被引进到脂质体。作为这种驱动力，使用溶解度梯度、离子梯度、pH梯度等，例如通常为使用隔着脂质体膜形成的离子梯度而将药物导入到脂质体内部的方法，例如有通过对于Na+/K+浓度梯度的主动载药法，向预先形成的脂质体中添加药物的技术(参照日本专利第2847065号公报)。
利用离子梯度的主动载药法中，最通常使用质子浓度梯度，例如可以采用使用柠檬酸形成脂质体膜的内部区域水相(内水相)的pH低于外部区域水相(外水相)的pH的pH梯度的方式。另外，pH梯度可以通过铵离子浓度梯度和/或具有可质子化的氨基的有机化合物的浓度梯度等形成(参照日本专利第2659136号公报)。另外，近年也公开了通过将离子载体导入到脂质体膜来进行主动载药的方法。(参照美国专利4885172、美国专利5059421、美国专利5171578、美国专利5837282的各公报)。
<所包封的药物>
本发明的脂质体制剂中的保持药物只要能够利用离子梯度法而保持在脂质体内即可，没有特别限定，优选为两亲性弱碱。另外，从效果方面考虑，优选为局部给药中可以期待缓释性的药物，特别优选为脑血管疾病、帕金森病、抗精神病、认知功能障碍等的治疗药物、镇痛药物。作为这些药物，可列举出多奈哌齐、利培酮、卡巴拉汀、加兰他敏、毒扁豆碱、庚基毒扁豆碱、苯胺基甲酸酯毒扁豆酚碱(phenserine)、tolserine、cymserine、thiatolserine、thiacymserine、新斯的明、石杉碱、塔克林、美曲膦脂、米诺环素、盐酸法舒地尔、nimodine、吗啡、布比卡因、罗哌卡因、左旋布比卡因、曲马多、利多卡因等。另外可列举出多巴胺、L-DOPA、血清素、肾上腺素、可待因、哌替啶、美沙酮、吗啡、阿托品、decyclomine、美噻吨、丙胺太林、丙咪嗪、阿米替林、多虑平、地昔帕明、奎尼定、萘异丙仲胺、氯丙嗪、异丙嗪、羟哌氯丙嗪等。
<给药方法>
对本发明的脂质体制剂的给药方法没有特别的限制，优选为非经口且局部给药。例如可以选择皮下、肌肉内、腹腔内、髓腔内、硬膜外、脑室内，可以根据症状选择适当的给药方法。作为更优选的给药方法，为皮下或肌肉内给药，作为具体的给药方法，可以利用注射器给予脂质体制剂、通过喷雾式装置喷雾脂质体制剂。另外，也能够将导管插入到体内、例如管腔内、例如血管内而到达病灶部位，通过该导管局部给药。
本发明的脂质体制剂，具有包封在其内部区域的药物的血药有效浓度维持至少四天以上的全身性缓释性。本发明的脂质体制剂具有包封在其内部区域的药物的局部有效浓度维持至少四天以上的局部性缓释性。本发明的脂质体制剂，在给药后具有3天以上、优选4天以上、更优选5天以上、进一步优选7天以上的缓释性。
在此，血药浓度指的是，由血管采集血液，对血浆中的药物浓度例如利用以下的实施例中说明的高效液相色谱进行定量而得到的浓度。
局部浓度指的是，采集组织、内脏器官等特定部位，测定由该部位的匀浆得到的上清中的药物浓度而得到的值。有效浓度指的是由病态、药物的种类确定的、认为对于治疗有效的最小的浓度。
本发明的缓释制剂用试剂盒包括上述本发明的脂质体制剂和27～33号中的至少一号尺寸的注射针。注射针的根数可以为一根或多根，注射针的尺寸可以为一种或两种以上的组合。本发明的脂质体制剂即使是27号、30号、33号等细针也能够给药，所给药的患者的负担小。另外，所给予的脂质体制剂的缓释性也高，因此本发明的缓释剂用试剂盒的有用性高。
实施例
接着，列举出实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明不被它们所限定。
各例子中制造的包封有药物的脂质体的各浓度和粒径如下所述求得。
磷脂浓度(mg/mL)：使用高效液相色谱或磷脂定量而定量的脂质体悬浮液中的磷脂浓度。
胆固醇浓度(mg/mL)：使用高效液相色谱定量的脂质体悬浮液中的胆固醇浓度。
总脂质浓度(mol/L)：作为上述磷脂浓度和胆固醇浓度的总计的作为膜构成成分的总脂质的总计摩尔浓度(mM)。
<药物浓度(mg/mL)>
(1)盐酸多奈哌齐浓度(mg/mL)：将脂质体组合物用RO水(反渗透膜纯净水)稀释以使制剂的总脂质浓度约为20～30mg/mL后，将其进一步用甲醇稀释20倍而使脂质体破坏。对于该溶液，利用使用紫外分光光度计的高效液相色谱对315nm的吸光度进行定量，得到制剂中盐酸多奈哌齐浓度。
(2)盐酸丁哌卡因浓度(mg/mL)：将脂质体组合物用RO水(反渗透膜纯净水)稀释以使制剂的总脂质浓度约为20～30mg/mL后，将其进一步用甲醇稀释20倍而使脂质体破坏。对于该溶液，利用使用紫外分光光度计的高效液相色谱对263nm的吸光度进行定量，得到制剂中盐酸丁哌卡因浓度。
(3)盐酸罗哌卡因浓度(mg/mL)：将脂质体组合物用RO水(反渗透膜纯净水)稀释以使制剂的总脂质浓度约为20～30mg/mL后，将其进一步用甲醇稀释20倍而使脂质体破坏。对于该溶液，利用使用紫外分光光度计的高效液相色谱对263nm的吸光度进行定量，得到制剂中盐酸罗哌卡因浓度。
(4)载药量(药物/总脂质的摩尔比)：包封在脂质体的盐酸多奈哌齐浓度、盐酸丁哌卡因浓度或盐酸罗哌卡因浓度由上述药物浓度与上述总脂质浓度之比、以药物/总脂质的摩尔比表示。
(5)血浆中盐酸多奈哌齐浓度(mg/mL)：处理采集的血浆，对于最终离心分离得到的上清，利用使用荧光光度计的高效液相色谱对激发波长(Ex)322nm、检测波长(Em)385nm的荧光进行定量，测定血浆中盐酸多奈哌齐浓度。
(6)组织中盐酸丁哌卡因浓度(mg/mL)：处理采集的组织，对于最终离心分离得到的上清，利用使用紫外分光光度计的高效液相色谱对210nm的吸光度进行定量，测定组织中盐酸丁哌卡因浓度。
(7)平均粒径(μm)：利用光散射衍射式粒度分布计Beckman CoulterLS230测得的平均粒径。
以下表示所使用的各成分的简称以及分子量。
HSPC：氢化大豆卵磷脂(分子量790、Lipoid GmbH制造SPC3)
Chol：胆固醇(分子量388.66，Solvay Chemicals,Inc.制造)
DNP：盐酸多奈哌齐(以下有时称为DNP)(分子量415.95、UINANCHENGHUI-SHUANFDA Chemical Co.Itd)
盐酸丁哌卡因(分子量324.89、JINAN CHENGHUI-SHUANGDAChemical Co.Itd)
盐酸罗哌卡因(分子量310.88、JINAN CHENGHUI-SHUANGDAChemical Co.Itd)
<不同制造条件下得到的脂质体组合物的药物包封量的比较>
(制造例1～3)
以乙醇中的脂质浓度为150w/v%、200w/v%制造脂质体，利用pH梯度导入药物，制造脂质体制剂。
(1)空脂质体的制造
如表1所示，称量HSPC和Chol，使无水乙醇中的脂质浓度为150w/v%或200w/v%来添加无水乙醇后，约70℃下加温溶解。接着，相对于溶解了的脂质乙醇溶液1体积，以体积比4/1或3/1(v/v)加入作为第一水相的内水相溶液(150mM硫酸铵水溶液)，以恒定的转速加温搅拌约10分钟，由此制造空脂质体。将加温结束后的脂质体快速地用冰冷却。
(2)pH梯度的形成
对于冰冷却后的空脂质体，使用离心机进行外液置换，在脂质体内水相侧/外水相侧形成pH梯度。用约10倍量的外水相溶液(20mM HEPES/0.9%氯化钠(pH7.5))分散脂质体，以3500rpm离心分离15分钟，由此使脂质体沉淀。然后，去除上清，接着添加pH7.5的20mM HEPES/0.9%氯化钠进行分散，同样地进行离心分离。重复此操作3次后，使用pH7.5的20mM HEPES/0.9%氯化钠再次进行分散，形成pH梯度。
(3)利用pH梯度导入药物
对形成pH梯度后的脂质体的HSPC和胆固醇进行定量，求出总脂质浓度。基于所算出的总脂质浓度，使盐酸多奈哌齐(DNP、分子量415.95)/总脂质(摩尔/摩尔)比为0.16来计算盐酸多奈哌齐量，称量必要量的DNP后，通过RO水制造20mg/mL的DNP溶液(药物溶液)。
向65℃下加温了的脂质体溶液中添加规定量的预先在65℃加温了的DNP溶液后，接着在65℃下加温搅拌60分钟，由此进行药物导入。将药物导入后的脂质体快速地用冰冷却。
(4)去除未包封药物
导入药物后，向脂质体中添加外水相溶液(20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5))进行分散，以3500rpm离心分离15分钟，由此使脂质体沉淀。然后，去除上清，接着添加20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5)进行分散，同样地进行离心分离。重复此操作3次，由此去除未包封药物。
对于如上所述利用本发明的制造方法得到的制造例1～3的脂质体制剂而言，制造空脂质体时的乙醇中的脂质浓度、内水相/含有脂质的乙醇溶液的体积比、载药量(药物/总脂质摩尔比)和粒径如表2所示。可知以表2所示的乙醇溶液中脂质浓度、内水相/乙醇溶液的体积比制造时，得到药物/总脂质摩尔比为0.08摩尔/摩尔以上的高的载药量。
图1为用透射式电子显微镜(TEM)观察本申请实施例的制造例2中制造的、导入药物后的脂质体制剂的截面得到的照片。图1的a中所示的脂质体制剂在脂质体制剂的接近最外表面处被分割。图1的b中所示的脂质体制剂在大致中央处被分割。电子显微镜观察的结果如图1所示可知，本发明的脂质体制剂为包括具有由多层的脂质双重膜形成的外膜的一个均匀的内水相的结构。另外，肉眼观察电子显微镜的照片并计测多重性高的部分(具有层结构的部分)的脂质双重膜的膜层数(层结构、lamellarity)，结果当以一组脂质双重层为一层的层结构时，本发明中得到的平均粒径6μm的脂质体制剂中的层数(lamellarity)约为20。另外，平均粒径2.5μm时约为12。另一方面，本发明中得到的制剂表现出长期缓释性能的优选平均粒径为3μm左右以上。因此，推测脂质体制剂的层数为12以上(更优选为12～27)时，能得到优选的缓释性。
需要说明的是，本实施例中测定的平均粒径6μm的脂质体制剂为存在分别约不足10%(体积或个数)的3μm以下和10μm以上的脂质体制剂、并且存在约50%以上的4μm～7μm的脂质体制剂的脂质体制剂。
[表1]
Figure BDA00003607546200141
(制造例4～5)
通过调节制造空脂质体时的脂质体悬浮液的转速，对粒径进行控制，其他与制造例2同样地制造包封有DNP的脂质体制剂。其结果如表2所示，得到具有3.7μm和12.2μm的不同的平均粒径的脂质体制剂。另外，与制造例1～3同样地，能得到包封效率良好、载药量高的脂质体制剂。
[表2]
Figure BDA00003607546200151
(比较例1)
<乙醇中脂质浓度为100w/v%时制造的脂质体>
如表3所示，称量HSPC和Chol，使乙醇中的脂质浓度为100w/v%来添加1mL无水乙醇后，约70℃下加温溶解。接着，按照相对于溶解了的脂质乙醇溶液1体积内水相溶液(150mM硫酸铵溶液)为9/1的方式添加作为第一水相的内水相9mL，以恒定的转速加温搅拌约10分钟，制造脂质体。混合相中的总脂质浓度为10w/v%。将加温结束后的空脂质体快速地用冰冷却。此后的pH梯度的形成、药物导入、去除未包封药物通过与制造例1～3相同的方法进行，得到包封有药物的脂质体制剂。
上述比较例1的脂质体组合物的空脂质体制造时的乙醇中总脂质浓度、内水相/乙醇溶液的体积比如表4所示。另外，所得到的脂质体组合物的载药量(药物/总脂质摩尔比)和粒径如表4所示。其结果可知，尽管能得到与制造例1～3同等的平均粒径，但是混合相(内水相溶液+醇溶液)中的总脂质浓度低，药物包封量降低(表4)。由此认为，空脂质体制造时的乙醇中脂质浓度、内水相/乙醇溶液的体积比对脂质体的结构有影响，其结果对药物包封量有影响。
[表3]
Figure BDA00003607546200161
[表4]
<利用挤出法制造盐酸多奈哌齐脂质体制剂>
(比较例2～3)
分别称量0.71g的HSPC和0.29g的Chol，添加无水乙醇1mL进行加温溶解。向所得到的脂质乙醇溶液1mL中添加加温到约70℃的硫酸铵溶液(内水相)9mL，加温的同时利用超声波装置进行搅拌，制造粗脂质体悬浮液。利用加温到约70℃的挤出机(The Extruder T.10、Lipexbiomembranes Inc.)上安装的过滤器(Whatman公司)，使该粗脂质体悬浮液依次通过0.4μm孔径5次、或2μm孔径5次，制造粒径300nm左右的空脂质体。接着，将加温结束后的空脂质体快速地用冰冷却。冰冷却后，使用用外水相溶液(20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5))充分置换了的凝胶过滤，进行外液置换，形成pH梯度。然后，使药物/总脂质(摩尔/摩尔)=0.16来添加规定量的DNP溶液，65℃下加温搅拌60分钟，由此进行药物导入。将药物导入后的脂质体快速地用冰冷却，然后使用用20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5))充分置换了的凝胶过滤，去除未包封药物。
表4表示比较例2和比较例3中制造的脂质体组合物的载药量和粒径。其结果，能得到比较高的载药量的脂质体组合物。
<不同粒径下的体外(in vitro)释放特性的研究>
本实施例中，对于由制造例2、4、5和比较例2、3中制造的脂质体组合物的药物释放特性，利用使用硫酸铵的体外(in vitro)评价系统进行验证。
以7.5mM称量硫酸铵，加入磷酸盐缓冲液，制造释放试验液(pH7.4、300毫渗透压摩尔(mOsmol)的7.5mM硫酸铵/磷酸盐缓冲液)。用上述释放试验液将制造例2、4、5和比较例2、3中制造的脂质体组合物稀释10倍，37℃下加温规定时间。加温开始后，在0、1、2、5、8、10、15、30分钟取出试样，立即加入停止液，进行冰冷却，停止释放。所释放的DNP的定量按照上述药物浓度的定量方法利用高效液相色谱实施。
其结果如图3所示可知，对于由脂质体的DNP(盐酸多奈哌齐)的释放而言，粒径越小越快。另外，基于图3的数据，对于初期的释放的曲线分别算出斜率，算出各平均粒径下的释放速度。其结果如图4所示。12.2μm时的释放速度为23(μg/(mL·分钟))、6μm时为37(μg/(mL·分钟))、3.7μm时为51(μg/(mL·分钟))、1.2μm时为110(μg/(mL·分钟))。
由该结果可知，随着粒径减小，释放速度增大。尤其是平均粒径为1.2μm时，释放速度显著增快。由此推测1.2μm以下时，药物在短时间内释放，得不到持续性。认为这可能是由于，随着粒径减小，脂质膜的膜层数(层状结构的厚度)减少，药物易扩散到脂质体的外侧，因此释放加速。另外，认为粒径越小则脂质膜的曲率越大，随之，脂质膜的填充性减弱，药物易透过脂质膜也是主要原因之一。
由以上结果可知，释放速度显著加速、不能期待持续性的平均粒径为1.2μm以下，对于长期持续性而言，具有大于1.2μm的平均粒径是重要的。
由此推测，比较例2和3中得到的脂质体组合物，虽然药物的包封量高，但是与制造例2、4、5相比释放显著快，因此体外(in vitro)下三天以上的长期持续释放是困难的。另一方面可知，制造例2、4、5在体外(in vitro)释放试验中表现出经时性的释放曲线，尤其是粒径越大则释放速度越慢。
<DNP脂质体的药物动力学>
进行制造例2和比较例2、3中制造的多奈哌齐脂质体制剂和单纯的多奈哌齐的药物动力学试验。利用本发明的制造方法制造的脂质体组合物，由于可以得到高的药物包封量，能够以低体积给予高浓度的药物。因此，对于制造例2中制造的多奈哌齐脂质体制剂而言，按盐酸多奈哌齐量计，对大鼠背部皮下给予50mg/kg。另一方面，对于比较例2和3中制造的脂质体制剂，相对于制剂的药物浓度的能够给药的容量存在极限，因此按盐酸多奈哌齐量计，分别对大鼠背部皮下给予5mg/kg和25mg/kg。进而，作为比较，对大鼠背部皮下给予5mg/kg单纯的多奈哌齐。单纯的多奈哌齐、比较例2、比较例3、制造例2的给药量如表5所示。
[表5]
Figure BDA00003607546200191
对于单纯的多奈哌齐而言，给药后，经过0.5、1、5、10、30、120、480、1440、2880分钟后通过尾静脉采血。另一方面，对于脂质体制剂而言，给药后，经过0.5、1、3、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、264、288、312、336分钟后通过尾静脉采血，离心分离(6000rpm、10分钟、4℃)分取血浆。对所得到的血浆进行处理，利用高效液相色谱对激发波长(Ex)322nm、检测波长(Em)385nm的荧光强度进行定量，求出各血浆中的盐酸多奈哌齐浓度。其结果如图5所示。
如图5所示，皮下给予单纯的盐酸多奈哌齐时的血中盐酸多奈哌齐浓度在给药后0.5小时表现出最大血药浓度，然后急剧减少。48小时后已经为检测限以下。比较例2中制造的脂质体制剂与单纯的多奈哌齐相比，没有突释，直至48小时为止发现缓释，但是给药后8小时表现出最大血药浓度，然后急剧减少，给药后48小时已经低于10ng/ml。另外，对于比较例3中制造的脂质体制剂，虽然直至给药后4天为止维持比较高的血药浓度，但是此后急剧降低。这些制剂由于粒径比较小、为0.3μm和1.2μm，因此与大的粒径相比，由脂质体制剂的药物释放特性快。并且，认为在给药部位，脂质体易扩散，移动到淋巴、血液中，作为脂质体的消失也有可能快。推测由于这些主要原因，得不到期待的缓释性。
另一方面，关于本发明的制造例2中得到的脂质体制剂，没有突释，可确认缓释时间显著延长，可以得到14天的缓释性。认为这是由于，通过pH梯度将药物牢固地保持在内水相，并且粒径越大则脂质双重膜的膜层数越多，层状结构越厚，因此药物的脂质膜透过性受到抑制，其结果可以达成长期的缓释性。
本实施例中得到的血药浓度在临床上表现出充分的有效浓度。没有突释，可以稳定地持续有效浓度14天，消除了副作用的担心，可以提高患者的QOL，可以找到具有非常有效的缓释能力的制剂。
由此可知，通过本发明制造的脂质体组合物包括具有由多层的脂质双重膜形成的外膜的一个内水相，并且通过pH梯度法将充分的药物量牢固地保持在内水相，从而可以以高浓度包封药物。另外，在本发明的脂质体组合物中包封药物而成的本发明的脂质体制剂为发挥长期的缓释能力的优异的缓释制剂。
<本发明的盐酸丁哌卡因脂质体制剂的制造>
(制造例6～13)
如表6所示，称量HSPC和Chol，使无水乙醇中的脂质浓度分别为200、150、100w/v%来添加无水乙醇后，约70℃下加温溶解。接着，相对于溶解了的脂质乙醇溶液，以3/1、4/1、5.6/1、9/1(v/v)加入内水相溶液(pH2.5柠檬酸溶液)，以恒定的转速加温搅拌约10分钟，由此制造脂质体。将加温结束后的脂质体快速地用冰冷却。制造条件中的乙醇、内水相和脂质浓度的关系如表7所示。
然后，使用pH6.5的柠檬酸溶液，利用离心机进行外液置换，在脂质体内/外形成pH梯度。
然后，与制造例1～3同样地进行药物导入。作为药物，使用盐酸丁哌卡因(BPV、分子量324.89)。称量必要量的盐酸丁哌卡因(BPV)后，通过RO水制造10mg/mL的BPV溶液(药物溶液)，65℃下加温搅拌60分钟，由此进行药物导入。将药物导入后的脂质体快速地用冰冷却。接着，使用pH6.5柠檬酸溶液，通过与制造例1～3相同的操作去除未包封药物。对于所得到的盐酸丁哌卡因脂质体，作为药物包封量，表8示出盐酸丁哌卡因/总脂质(摩尔/摩尔)。
其结果如表2、7所示，乙醇中脂质浓度为100～200w/v%、并且以内水相(pH2.5柠檬酸溶液)与该乙醇溶液的比率为3/1、4/1、5.6/1、9/1(v/v)来加入内水相，进而，乙醇溶液和内水相(混合相)的总体积中的脂质浓度为15～50w/v%时，如表8所示，能得到非常高的药物包封量。
[表6]
[表7]
在此，脂质浓度%表示混合相中的总脂质的w/v%。
[表8]
Figure BDA00003607546200223
在此，制造例、比较例中的数字表示盐酸丁哌卡因/总脂质(摩尔/摩尔)。
(制造例14～17)
作为内水相使用150mM硫酸铵，除此之外与制造例6～9同样地制造盐酸丁哌卡因脂质体。如表9所示，称量HSPC和Chol，使无水乙醇中的脂质浓度分别为200w/v%来添加无水乙醇后，约70℃下加温溶解。接着，使用150mM硫酸铵作为内水相，相对于溶解了的脂质乙醇溶液，以3/1、4/1、5.6/1、9/1(v/v)加入内水相溶液(150mM硫酸铵)，以恒定的转速加温搅拌约10分钟，由此制造空脂质体。将加温结束后的脂质体快速地用冰冷却。
然后，与制造例6～9同样地，进行pH梯度的形成、盐酸丁哌卡因导入、去除未包封药物，得到盐酸丁哌卡因脂质体制剂。其结果如表2所示。内水相使用硫酸铵时，也与pH2.5柠檬酸溶液同样地得到高的药物包封量。
[表9]
Figure BDA00003607546200231
(比较例4～7)
如表10所示，称量HSPC和Chol，使无水乙醇中的脂质浓度分别为200、150、100w/v%来添加无水乙醇后，约70℃下加温溶解。接着，以内水相(pH2.5柠檬酸溶液)与溶解了的脂质乙醇溶液的比率为1.5/1、2/1、9/1(v/v)来加入内水相，以恒定的转速加温搅拌约10分钟，由此制造脂质体。将加温结束后的脂质体快速地用冰冷却。
然后，使用pH6.5的柠檬酸溶液进行外液置换，在脂质体内/外水相形成pH梯度。接着，使用盐酸丁哌卡因进行药物导入。
然后，使用pH6.5柠檬酸溶液去除未包封药物，得到脂质体制剂。对于所得到的脂质体制剂，盐酸丁哌卡因包封量如表4和表8所示。
其结果，乙醇中脂质浓度为100～200w/v%、并且内水相(pH2.5柠檬酸溶液)与脂质乙醇溶液的体积比为2/1以下时，药物包封量稍微降低，并且未包封的药物量(相对于制剂中盐酸丁哌卡因量的外液中盐酸丁哌卡因量)比较高、为6～9%。由此暗示了，在上述脂质体的制造条件下，不能稳定地将充分量的药物保持在内水相。
[表10]
<盐酸丁哌卡因脂质体制剂的药物动力学>
进行制造例16中制造的盐酸丁哌卡因脂质体制剂和单纯的盐酸丁哌卡因的药物动力学试验。给药量按盐酸丁哌卡因量计以表11所示的体积对大鼠背部皮下给药。盐酸丁哌卡因脂质体组合物在给药后经过1、24、72、120、168小时后，另一方面单纯的盐酸丁哌卡因在给药后经过0.5、4、24小时后，采集给药部位的背部皮下组织，进行匀浆处理。接着对匀浆溶液进行处理，利用高效液相色谱对所得到的试样溶液进行定量，求出残留在给药部位的背部皮下组织的盐酸丁哌卡因量。其结果如图6所示。单纯的盐酸丁哌卡因的给药部位残留率在给药后4小时不足1%。由此可知，单纯的盐酸丁哌卡因在数小时内从给药部位消失。另一方面，盐酸丁哌卡因脂质体制剂能得到依赖于经过时间的从给药部位持续消失的曲线，给药后第三天残留约10%、第五天残留约5%、第七天残留约3%的盐酸丁哌卡因。由此可知，所给予的脂质体在给药部位持续性地释放盐酸丁哌卡因。
由以上可知，本发明中得到的盐酸丁哌卡因制剂具有长期缓释能力。
[表11]
制剂 给药量
单纯的盐酸丁哌卡因皮下给药 SC  3.5mg/kg
制造例16 SC  3.5mg/kg
<通过本发明制造盐酸罗哌卡因脂质体>
(制造例18)
使用盐酸罗哌卡因作为药物，除此之外与制造例15同样地制作脂质体组合物，得到盐酸罗哌卡因脂质体。
其结果如表1所示，药物使用盐酸罗哌卡因时，也同样地可以用pH梯度法导入，得到高的药物包封量。另外，体外(in vitro)的释放性也表现出与盐酸多奈哌齐脂质体制剂和盐酸丁哌卡因脂质体制剂同等的释放曲线。
<用于给予本发明的脂质体制剂的注射针的尺寸的确认>
对直至哪种程度的细针为止也能够给予本发明的脂质体制剂进行研究。
使用制造例16中制造的本发明的含有盐酸丁哌卡因的脂质体制剂，通过具有不同的号的注射针进行吸入制剂的工序、和挤出制剂的工序。其结果，即使使用27号、30号、33号非常细的注射针，也都能够容易地吸入并且挤出本发明的脂质体制剂。
<比较实验>
作为上述的比较实验，对是否能够使用细的注射针来给予利培酮(Risperdal Consta)(Janssen Pharmaceutical K.K.)进行研究。利培酮为由聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)形成的微球。利培酮是抗精神病药的持续注射剂，是带有20G的注射针的试剂盒制品。微球的平均粒径为25～150μm。进行使用27～33号的注射针吸入微球的操作，结果对于吸入工序而言，任意一种针都不能吸入。另外，对于挤出工序而言，仅19～21号的粗的注射针能够在给药时使用，利用27号、30号、33号的细的注射针时，不能挤出。认为这是由于，微球的颗粒尺寸大，因此不能用细针给药。
由以上可知，通常，对于脂质体等微球而言，利用19～21号针给药是极限，但是对于本发明脂质体制剂而言，即使是27号、30号、33号等细针也能够给药。

Claims (7)

1.一种脂质体组合物，其为相对于在水混溶性有机溶剂中含有总浓度为100～200w/v%的磷脂和胆固醇而成的水混溶性有机溶液1体积，以体积比3/1～12/1混合第一水相溶液，得到混合相中的磷脂和胆固醇的总浓度为15～50w/v%的乳液，用第二水相溶液对所述乳液进行外液置换而得到的脂质体组合物，在由所述第一水相溶液构成的脂质体膜的内部区域水相与由所述第二水相溶液构成的脂质体膜的外部区域水相之间形成离子梯度。
2.根据权利要求1所述的脂质体组合物，其中，所述离子梯度为pH质子梯度，具有脂质体的内部区域水相的pH低于脂质体的外部区域水相的pH的pH梯度。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，所述脂质体具有最外径为2.5μm以上的平均粒径且在12重以上的多层膜中具有所述内部区域水相。
4.一种脂质体制剂，其为利用离子梯度将药物导入权利要求1～3中任一项所述的脂质体组合物的内部区域水相而成的脂质体制剂，以0.08(摩尔)/总脂质(摩尔)以上将该药物保持在脂质体内。
5.根据权利要求4所述的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂具有包封在其内部区域的药物的血药有效浓度维持至少四天以上的全身性缓释性，或具有包封在其内部区域的药物的局部有效浓度维持至少四天以上的局部性缓释性。
6.根据权利要求4或5所述的脂质体制剂，其中，所述药物为两亲性弱碱性化合物。
7.一种缓释制剂用试剂盒，其包括权利要求4～6中任意一项所述的所述脂质体制剂和27～33号中的至少一号尺寸的注射针。
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