JPH10506396A - Ａｉｄｓ及びいくつかの他のウィルス性疾患を治療するための方法及び製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リポソームに封入された抗ウィルス剤の投与を含んで成る、ウィルス性疾病を処理するための方法が開示される。ウィルス性疾病の処理、及びより特定には、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)及びサイトメガロウィルス(CMV)により引き起こされる感染の処理のためのリポソーム製剤がまた、提供される。それらのリポソーム製剤は、特定種類の脂質成分から構成され、そしてウィルス性疾病に対して効果的な閉じ込められた薬物を含む。それらの抗ウィルス薬物のリポソーム製剤は、異なった細胞系における高い細胞透過性、HIV 及びCMV 複製に対しての良好なインビトロ抗ウィルス効能、HIV 貯蔵体の効果的なインビボ標的化及び薬物の薬物運動学の著しい改良を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 AIDS及びいくつかの他のウィルス性疾患を治療するための方法及び製剤発明の分野 本発明は、ウィルス性疾病の治療、及び特に、ウィルス様ヒト免疫不全ウィル ス及びサイトメガロウィルスにより引き起こされる感染の治療への使用のための リポソーム製材及び方法に関する。発明の背景 多くの抗ウィルス剤が、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)感染を有する患者の治療 のために開発されて来た。しかしながら、実際の抗レトロウィルス剤又はそれら の組合せのいづれかにより治療された HIV−感染の患者には、単に一時的且つ限 定された利点のみが観察されている。ウィルス負荷を低めるそれらの剤の限定さ れた能力、耐性の急速な進行、及びほとんどの薬物の毒性副作用が、それらの長 期効能を制限して来た。患者への抗ウィルス剤の投与に関連する１つの主な問題 は、感染された細胞に入り、そしてそれを標的にする抗ウィルス剤の低い能力で ある。急速な薬物クリアランス及び原因化合物又は代謝物の毒性はまた、多くの 抗ウィルス剤の開発及び使用を遅らせる主な欠点のいくつかを構成する。AIDS及 び他のウィルス性疾病を治療するために実際に利用できる抗ウィルス剤の重度の 毒性及び感染された細胞を標的にするそれらの制限された能力のために、感染さ れた細胞中に治療レベルの薬物を到達せしめ、そして毒性を減じるための手段が 開発されるべきである。リポソーム中への薬物の封入は、感染された細胞への活 性剤の供給を改良し、そし てそれらの投与に関連する毒性効果を減じるための好ましいアプローチを構成す る。リポソームは、種々の薬物が組込まれ得る微小小胞である。天然の膜とリポ ソームの主成分との類似性のために、リポソームは一般的に非毒性であり且つ生 物分解性である。抗ウィルス剤のキャリヤーとしてのリポソームの役割の良好な 理解が、AIDS及び他のウィルス性疾病の治療のために使用される薬物の効能及び 安定性を改良することができる新規の手段を導びくと思われる。 マクロファージが免疫系を通してウィルスの拡散のための貯蔵体として作用す る、HIV 病因に中心的な役割を演じることを示す多くの証拠が存在する(Gendelm anなど.，1989，AIDS 3 : 475-495 ; Meltzer など.，1990 ; Ann．Rev．Immuno l．8 : 169-194)。感染の初期段階において及び臨床的潜伏期を通して、HIV は 末梢血液における最小のウィルス活性にもかかわらず、リンパ系器官において蓄 積し、そして活発に複製することが最近報告されている(Pantaleoなど.，1993， Nature 362 : 355-358 ; Embretson など.，1993，Nature 362 : 359-362 ; Fox など.，1994，Nature 370 : 256)。リンパ系組織に観察される高いウィルス負 荷は、胚中心の小胞性樹枝状細胞(follicular dendritic cell)における捕捉さ れたHIV ウィルスに関連していることが報告されている。HIV 感染の間にわたっ て、小胞性樹枝状細胞の網状構造が徐々に崩壊し、そして究極的には破壊された 。リンパ系組織の微小環境は効果的な免疫応答のために決定的であるので、その 微小環境網状構造の統合性を保持するために、リンパ系組織中へのHIV の蓄積を 減じ又は撤廃することが基本的である。薬物供給システムとしてのリポソームの 使用は、HIV 疾病の進行を制御するために特に適切である。リポソームは天然に おいて、単核性ファゴサイトシステム(MPS)の細胞により摂取されるので、リポ ソームに基づく治療は、HIV 感染に対して感受性の細 胞内に抗ウィルス剤を集中せしめ、そして同時に、それが潜在的に毒性である部 位で薬物の量を減じるべきである。従って、リポソーム封入された薬物は、リン パ系組織へのHIV の拡散を減じ、そして特徴的な免疫不全状態を進行せしめるこ とから感染された宿主を保護するだろう小胞性樹枝状細胞の微小環境を保持する 便利な手段を代表することができる。 薬物供給システムとしてのリポソームの使用は、もとの薬物に比較する場合、 重要な利点を提供する。たとえば、リポソームは、酵素的な分解に対して薬物を 保護し、それらの薬物動態及び組織分布を改良し、そして適切な細胞への治療剤 の調節された開放を可能にすることができる。さらに、リポソームの分布及び治 療的な利用性は、それらの大きさ、層状性(lamellarity)、脂質組成、電荷及び 表面特性の変動を通して調整され得る。従って、所望の治療目的を有するリポソ ームの物理化学性質を適合せしめることが決定的である。AIDS及び他のウィルス 性疾病の治療のための、薬物のリポソーム製剤を生成することが本発明の目的で ある。そのような標的化された供給システムは、たぶん、AIDS又は他のウィルス 疾病を有するヒトにおいて抗ウィルス剤の高められた効能及び減じられた毒性を もたらす。さらに、リポソーム中への薬物の封入に基づく改良された薬物生物利 用性が、投与間隔を減じ、そして結果的に、HIV 及び他のウィルスにより感染さ れた患者の生命の本質を改良することができる。発明の要約 本発明は、リポソームに封入された抗ウィルス剤の投与を含んで成る、ウィル ス性疾病の治療のための方法に関する。本発明はまた、ウィルス性疾病の治療及 びより具体的には、ウィルス様HIV 及び CMV により引き起こされる感染の治療のためのリポソーム製剤にも関する。リポ ソーム製剤は、特定の種類の脂質成分から成り、そしてウィルス性疾病に対して 効果的な封入された薬物を含む。本発明の独創性は、薬物のそれらのリポソーム 製剤が種々の細胞系における高い細胞侵入性、HIV 及びCMV に対する良好なイン ビトロ抗ウィルス活性、HIV 貯蔵体の効果的なインビボ標的化、及び薬物の薬物 動態における著しい改良を可能にすることである（例を参照のこと）。 好ましい態様において、リポソーム製剤は、10：３のモル比でのジステアロイ ルホスファチジルコリン（DSPC）：ジステアロイルホスファチジルグリセロール （DSPG）から構成され、約0.05〜0.5 μｍの平均粒子直径を有し、そして抗ウィ ルス薬物として２’−３’−ジデオキシイノシン（ddＩ）を含む。もう１つの好 ましい態様においては、リポソーム製剤は、10：３：1.45のモル比でのDSPC：DS PG：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール (DSPE−PEG)から構成され、約0.05〜0.5 μｍの平均粒子直径を有し、そして抗 ウィルス剤として２’−３’−ジデオキシイノシン（ddＩ）を含む。もう１つの 好ましい態様においては、ポリエチレングリコールは約 500〜5000ドルトンの分 子量を有する。もう１つの好ましい態様においては、リポソーム製剤は、４：１ ：５のモル比でのジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）：ジセチルホス フェート（DP）：コレステロール（CHOL）から構成され、約0.05〜0.5 μｍの平 均粒子直径を有し、そして抗ウィルス薬物として２’−３’−ジデオキシシチジ ン（ddＣ）を含む。さらにもう１つの好ましい態様においては、リポソーム製剤 は、10：３のモル比でのDPPC：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DP PG）から構成され、約0.05〜0.5 μｍの平均粒子直径を有し、そし て抗ウィルス薬物としてホスカネット(foscarnet)を含む。図面の簡単な説明 図１ａ及び１ｂは、U937細胞（図１ａ）及びRAW264.7細胞（図１ｂ）における 、時間の関数としての遊離の及びリポソーム中のddＩ（20μＭのddＩ）の蓄積を 示す。図１ｃ及び１ｄは、U937細胞（図１ｃ）及びRAW264.7細胞（図１ｄ）にお ける、時間の関数としての遊離の及びリポソーム中のddＣ（25μＭのddＣ）の蓄 積を示す。図１ｅ及び１ｆは、RAW264.7細胞における、薬物濃度の関数としての それぞれの遊離の及びリポソーム中のddＣ並びにホスカネットの蓄積を示す。 図２ａ，２ｂ及び２ｄは、HIV−１_IIIBにより感染されたU937細胞における、 それぞれ、遊離の及びリポソーム中のddＩ（10μＭのddＩ）、ddＣ（0.01μＭの ddＣ）及びホスカネット（１μＭのホスカネット）の抗ウィルス活性を示す。図 ２ｃ及び２ｅは、HIV−１_IIIBにより感染されたMolt−４クローン−８細胞にお けるそれぞれ、遊離の及びリポソーム中のddＣ（0.01μＭのddＣ）及びホスカネ ット（１μＭのホスカネット）の抗ウィルス活性を示す。図２ｆは、HIV−１_{III B} により感染されたSupt−１細胞における遊離の及びリポソーム中のホスカネッ ト（１μＭ）の抗ウィルス活性を示す。図２ｇは、遊離の及びリポソーム中のホ スカネット(それぞれPFA及びＬ−PFA)によるヒト肺線維芽細胞(MRC−５細胞系) におけるCMV p72 タンパク質発現の阻害を示す。 図３ａ，３ｂ，３ｃは、遊離のddＩ又は10：３のモル比でのDSPC：DSPGから構 成され、そして 0.175μｍの平均粒子直径を有するリポソームに封入されたddＩ の投与後、ラットにおける遊離のddＩ（図３ａ）、リポソーム中のddＩ（図３ｂ ）及びリポソーム脂質（図３ｃ）の血漿及び組織分布を示す。図３ｄ及び３ｅは 、10：３：1. 45のモル比でのDSPC：DSPG：DSPE−PEG から構成され、そして 0.150μｍの平均 サイズ粒子直径を有するリポソームに封入されたddＩの投与の後、ラットにおけ るリポソームddＩ（図３ｄ）及びリポソーム脂質（図３ｅ）の血漿及び組織分布 を示す。図３ｆ，３ｇ，３ｈ及び３ｉは、遊離のddＣ、又は４：１：５のモル比 でのDPPC：DP：CHOLから構成されそして 0.300μｍの平均サイズ粒子直径を有す るリポソームに封入されたddＣの静脈内（図３ｆ及び３ｇ）又は腹腔内（図３ｈ 及び３ｉ）投与後１時間でのラットにおける遊離の及びリポソーム中のddＣ（dd Ｃ及びＬ−ddＣ）の血漿及び組織分布を示す。図３ｊ，３ｋ及び３ｌは、遊離の ホスカネット、又は10：３のモル比でのDPPC：DPPGから構成されそして 0.165μ ｍの平均サイズ粒子直径を有するリポソームに封入されたホスカネットの投与後 、ラットにおけるリポソームホスカネット（図３ｊ）、遊離のホスカネット（図 ３ｋ）及びリポソーム脂質（図３ｌ）の血漿及び組織分布を示す。図３ａ〜３ｌ において、値は時点でのグループ当たり４〜６匹の動物から得られた平均(±SEM )を示す。発明の特定の記載 脂質成分 リポソーム基材の生成物においては、感染された細胞中に多量の抗ウィルス剤 を供給するリポソームの能力の利点を得るために、薬物封入の高い効率及び封入 された薬物の減じられた漏れを可能にするリポソーム二層特徴を使用することが 必要である。本発明の範囲下での薬物の場合、それらの必要条件は、ｉ）ジアシ ルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルグリセロールの混合物（10 ：１〜１：１の範囲のモル比、ここでアシル鎖は飽和又は不飽和のいづれかであ り、そして14〜18個の長さの炭素原子を有する）、又 はii）ジアシルホスファチジルコリン：ジセチルホスフェート：コレステロール の混合物（４：１：５のモル比、ここでホスファチジルコリンのアシル鎖は、飽 和又は不飽和のいづれかであり、そして14〜18個の長さの炭素原子を有する）か ら構成されるリポソームを用いることによって得られる。 本発明のリポソームは、上記脂質成分から構成され、そしてポリマー、たとえ ばポロキサマー及びポロキサミン、又はポリマーにより誘導体化された両親媒性 脂質、たとえばDSPE−PEG 又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン− PEG(DOPE−PEG)の組込みにより変性されるリポソームとして本明細書において定 義される立体的に安定化されたリポソームを包含する。DSPE−PEG の合成のため の詳細は、例１に提供される。本発明のリポソームはまた、イムノリポソーム、 たとえば上記脂質成分から構成され、そして特定細胞の標的化を増強する抗体分 子の結合により変性されるリポソーム又は立体的に安定化されたリポソームを包 含する。 試験されるリポソーム製剤のすべてが、効果的な薬物封入及び薬物保持を示し たわけではない。たとえば、55：45のモル比での卵ホスファチジルコリン：コレ ステロールから構成されるリポソームにおけるddＩの封入は、10：３のモル比で のDSPC：DSPGから構成されるリポソームについて観察される封入効率よりも約30 倍低い薬物封入の効率を示した。他方、ddＩの90％以上が、ヒト血清におけるわ ずか１時間のインキュベーションの後、35：45：10のモル比での卵PC：コレステ ロール：カルジオリピンから成る多層小胞から開放された。対照的に、わずか10 ％のddＩが、ヒト血清における５時間のインキュベーションの後、類似する条件 下で10：３のモル比でのDSPC：DSPGから成る多層小胞から開放された。 次の例が特定のリポソーム製剤を記載したとしても、多くの種類 のリポソーム製剤が、価値あるそれらの性質に影響を及ぼさないで、それらから 容易に誘導され得ると思われる。従って、この種の化合物は、試験された一定の リン脂質配合物の他のアシル鎖を含んで成る。リポソームの調製 リポソームの調製のための多くの数の技法が、薬物供給システムとしてのリポ ソームのますます多くの特定の適用に応答して過去数年、開発されて来た。本発 明のリポソームの調製は、種々の技法、たとえば文献に記載される技法により行 なわれ得る(Szoka and Papahadjopoulos，1980，Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9 : 467-508 as drug delivery systems．p261-338)。それらの中で、薄脂質フィルム水和化 技法は、リポソームを生成するための迅速且つ単純な方法を構成する。この技法 により生成されるリポソームはほとんど多層小胞(multilamellar vesicle)であ り、そして一般的に、0.2〜10μｍの大きさの範囲を有する。この薄脂質層水和 化技法は例２に記載されている。リポソームの調製のもう１つの通常の技法は、 アメリカ特許第 4,235,871号(Szokaなど)により記載される逆相蒸発技法である 。この技法により生成されるリポソームは単層性(unilamellar)又は多層性(plur ilamellar)であり、そして一般的に 0.2〜５μｍの大きさの範囲である。この逆 相蒸発技法は例３に記載される。抗ウィルス剤 ウィルスDNA 及び／又はRNA 合成並びに／又はHIV プロテアーゼのいづれかの インヒビターが本発明の範囲下に存在する。抗ウィルス剤、たとえば３’−アジ ド−３’−デオキシチミジン(AZT)、ddＩ，ddＣ、ホスカネット（foscanet）、 リバビリン(rivavirin)、 ガンシクロビル(genciclovir)及びサクイナビル（saquinavir）がこの種類に包 含される。リポソーム中へのそれらの薬物の組込みは、能動的及び／又は受動的 負荷の１又は複数の方法、たとえば文献(Mayerなど.，1986，Chem．Phys．Lipid s 40 : 333-345)に記載される方法により達成され得る。 本発明のリポソーム製剤は、いづれの大きさの平均粒子直径を有するものを包 含するが、しかし最も好ましくは、約0.05〜0.5 μｍのものを包含する。本発明 のリポソーム製剤はまた、いづれの薬物／脂質モル比により調製されたものでも 包含する。前で記載されたように、MPS の細胞により摂取されるべきリポソーム の性質はHIV 又は他のウィルス性感染に敏感な細胞内にその閉じ込められた抗ウ ィルス剤を集中せしめ、従って抗ウィルス効能を改良し、そしてそれらの毒性を 減じることである。従って、次の例は、HIV 及びCMV 感染の治療のために非常に 効果的である抗ウィルス薬物の特定のリポソーム製剤の調製を示すことを意図す るが、しかしその範囲を限定するものではない。さらに、薬物のリポソーム製剤 の効果が２つのウィルス種、すなわちHIV 及びCMV に対して特別に確かめられて いるが、ウィルスDNA 及び／又はRNA 合成のインヒビターの効果に対して敏感な いづれのウィルスでも本発明の範囲下にある。例１ DSPE −PEG の合成 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール(D SPE−PEG)を文献に記載されるようにして調製した(Gabizon and Papahadjopoulo s，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 : 6949-6953 ; Klibanuv など.，199 0，FEBS Letters 268 : 235-237)。手短に言及すれば、１μモル脂質当たり0.01 μCiの〔¹⁴ Ｃ〕−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE（〔¹⁴Ｃ〕−DOPE）を 含む、３：１：3.5 のモル比でのメトキシポリエチレングリコールスクシンイミ ジルスクシネート(PEG−OSu ; MW5000)、DSPE及びトリエチルアミンの混合物を 、CHCl₃，下で一晩、室温でインキュベートした。次に、溶媒を窒素の流れ下で 蒸発せしめ、そして得られる無水混合物を二回蒸留された水により水和化した。 そのミセル溶液を、Bio−Gel Ａ−1.5 Ｍ（50−100 メッシュ）を含むカラム（3 2×２cm）に通し、結合されなかった PEG−OSu を除去した。DSPE−PEG を含む ピーク画分を、シンチレーション計数（〔¹⁴Ｃ〕−DOPE−PEG のための）及び 2 25nmでの吸光度読み取り（遊離 PEG−OSu のための）の両者により決定した。DS PE−PEG を含む画分をプールし、そして 300,000の公称分子量カットオフ（MWCO ）を有する透析膜(Spectra-Por，Sepectrum Medical，Los Angeles, CA)を用い て水に対して24時間、透析し、そして次に、凍結乾燥せしめた。DSPE−PEG はま た、種々の分子量で市販されている。例２ 10：３のモル比でのDSPC：DSPG及び10：３：1.45のモル比でのDSPC：DSPG：DS PE−PEG から成るリポソーム中に、２’−３’−ジデオキシイノシン（ddＩ）を 、薄脂質フィルム水和化法を用いて封入した。DSPE−PEG は例１に従って合成さ れ得るか又は市販されている。手短に言及すれば、脂質混合物を、少量の〔¹⁴Ｃ 〕−DPPC（＜0.002％ モル／モル）の存在下でクロロホルム：メタノール（２ ：１ ｖ／ｖ）に溶解し、そして次に溶媒を丸底フラスコにおいて蒸発し、フラ スコの壁上に薄い脂質フィルムを形成した。その脂質フィルムを、少量の放射性 ラベルされた〔³Ｈ〕−ddＩが添加されている、２つの薬物／脂質モル比でのdd Ｉのリン酸緩衝溶液(PBS, 145mM，pH7.4)により水和化した。室温で約30分間放 置した後、多 層小胞(MLV)が、脂質混合物のゲル〜流体相転移上の温度でのリポソーム調製物 の機械的撹拌に基づいて形成された。0.2μｍのポリカーボネート膜（Nuclepore ，Cambridge，MA）を通してステンレス鋼押出し装置（Lipex Biomembrane，Vanc ouver，BC）によりMLV を押出した。小胞のサイズ分布及び均質性を、サブミク ロン粒子分析機（モデル M4SD Coulter Electronics，Hialean，FL）による準弾 性光散乱（QELS）により評価した。押出されたリポソームの平均直径は、それぞ れDSPC：DSPG及びDSPC：DSPG：DSPE−PEG 配合物について 0.175±0.035 μｍ及 び0.15±0.01μｍであった。封入されなかった薬物を、粗 Sephadex Ｇ−50(Pha rmacia LKB，Montreal，QC)の10mlカラムを通してのリポソーム調製物（１ml） の遠心分離（４℃で15分間、300ｇ）、超遠心分離（４℃で90分間、160000ｇ） 、又は一定体積のPBS に対する透析により除去した。薬物閉じ込めの効率を、液 体シンチレーションカウンター（モデル LS 6000TA，Beckman Instruments Cana da Inc.，Mississauga，ON）の使用により決定した。例３ ２’−３’−ジデオキシシチジン（ddＣ）を、４：１：５のモル比でのDPPC： DP：CHOLから成るリポソーム中に、逆相蒸発法（Szoka and Papahadjopoulos，1 978，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75 : 4194-4198）を用いて封入した。手短に 言及すれば、脂質混合物を、少量のコレステリル〔１−¹⁴Ｃ〕オレエートの存在 下でクロロホルム：メタノール（２：１ ｖ／ｖ）に溶解し、そして次に、溶媒 を丸底フラスコにおいて蒸発し、フラスコの底上に薄脂質フィルムを形成した。 次に、脂質フィルムを、イソプロピルエーテル：メタノール（３：0.8 ｖ／ｖ） に再溶解した。この有機相に、少量の放射性ラベルされた〔³Ｈ〕−ddＣを含む 、3.6 の薬物／脂質モル比 でのddＣのリン酸緩衝溶液(PBS，145mM，pH7.4)を添加した。次に、この２種の 相の混合物を室温で超音波槽において５分間、音波処理し、均質溶液を得た。有 機溶媒を50℃で再蒸発により調節された条件下で真空下で排除した。次に、リポ ソーム懸濁液を 0.4μｍのポリカーボネート膜を通して押出した。小胞のサイズ 分布及び均質性を、QELSにより評価した。押出されたリポソームの平均直径は 0 .300±0.08μｍであった。封入されなかった薬物を上記のようにして除去し、そ してddＣの封入効率を放射能計数により評価した。例４ ホスカネットを、ddＣのリポソーム調製について記載されるような逆相蒸発法 （例３）を用いてリポソーム中に封入した。但し、脂質成分は、10：３のモル比 でのDPPC：DPPGであった。この場合、薬物／脂質モル比は５であり、そして〔³ Ｈ〕−DPPC及び〔¹⁴Ｃ〕−ホスカネットを、それぞれ、脂質及び薬物マーカーと して使用した。リポソーム懸濁液を 0.2μｍのポリカーボネート膜を通して押出 し、0.165±0.030 μｍの平均直径を有するリポソームを生成した。封入されな かった薬物を上記のようにして除去し、そしてホスカネットの封入効率を放射能 計数により評価した。リポソーム薬物の細胞摂取と遊離薬物の細胞摂取とを比較する例 ネズミ単球−マクロファージRAW264.7細胞及びヒト前単球U937細胞における遊 離の及びリポソーム−封入された抗−HIV 剤の蓄積を評価するためにインビトロ 実験を実施した。手短に言及すれば、少量の放射性ラベルされた薬物及び脂質が 添加されている、種々の濃度の遊離の及びリポソーム−封入された抗−HIV 剤の 存在下で培養培地において集密的細胞(confluent)をインキュベートすることに よって実験を実施した。異なるインキュベーション時間において培地を除去し、 そして細胞を洗浄し、そして Triton Ｘ−100 溶液に より処理した。薬物及び脂質取込みを、液体シンチレーションカウンターにより 放射能レベルを測定することによって決定した。個々のサンプルについてのタン パク質濃度を、マイクロタイタープレートにおけるPierceビシンコニン酸タンパ ク質アッセイ（Rockford，IL）により決定した。結果は、リポソームでのddＣの 組込みがRAW264.7及びU937細胞において薬物取込みを非常に増強したことを示し た（図１ｃ，１ｄ及び１ｅ）。同様に、リポソーム中のホスカネットは、RAW264 .7細胞において遊離の薬物よりも一層良好に蓄積した（図１ｆ）。対照的に、そ れらの細胞におけるリポソームddＩの取込みレベルはddＣ又はホスカネットのリ ポソーム製剤の取込みレベルに類似するけれども、独立ddＩのより高い蓄積が両 細胞系に観察され（図１ａ及び１ｂ）、これは他の抗−HIV 剤に比較してddＩへ のそれらの細胞系のより高い膜透過性を示唆している。インビトロ抗ウィルス効能 抗ウィルス薬物のリポソーム製剤の抗ウィルス効能をまた、異なった細胞系に おいて評価した。手短に言及すれば、細胞を、１の感染の増殖性（ウィルス／標 的細胞）を有するHIV の異なった株により感染せしめ、そして種々の濃度の遊離 の及びリポソーム−封入された薬物により処理した。ウィルス複製を、酵素試験 を用いて細胞フリー上清液における逆転写酵素活性又はウィルスp24 タンパク質 のいづれかを測定することによって異なった時間の間隔でモニターした。ウィル ス転写をまた、HIV プライマー対（M661／M667）を用いての処理の24時間後、ポ リメラーゼ鎖反応(PCR)分析によりモニターした。PCR 評価を、細胞におけるヒ トＢ−グロブン遺伝子の量に対して標準化した。細胞生存性をテトラゾリウム基 材の比色(MTT)アッセイを用いて評価した。結果は、リポソームにおけるddＣの 組込みがU937及びMolt−４クローン−８細胞における HIV−１_IIIB 複製に対して独立した剤よりも比較的又は一層良好な抗−HIV 効能をもたらした ことを示した（図２ｂ及び２ｃ）。同様に、リポソーム中ホスカネットは、U937 、Molt−４クローン−８及びSupt−１細胞における HIV−１_IIIB複製に対する封 入されていない薬物の効能よりも比較的又は一層良好な抗ウィルス効能を示した （図２ｄ，２ｅ及び２ｆ）。ddＩのリポソーム製剤の抗ウィルス効能は、U937細 胞（図２ａ）における HIV−１_IIIB複製に対する独立剤の効能よりも低かったが 、より高い抗−HIV 効能が単球由来のマクロファージにおける HIV−１λ_da−Ｍ 複製に対してリポソームddＩについて観察された（表１）。リポソームはMPS の 細胞により選択的に取込まれるので、独立薬物よりもリポソーム薬物のより高い 抗−HIV 効能がインビボ状況下で最とも良く観察されるであろう。 遊離の及びリポソーム−封入されたホスカネットの抗−CMV 活性をまた、胚性 肺線維芽細胞(MRC−５細胞系)において評価した。手短に言及すれば、細胞をヒ トCMV のAD169 株により感染せしめ、そして独立した及びリポソームホスカネッ トの一連の希釈溶液により処理した。96時間のインキュベーションの後、細胞を 固定し、そしてイムノペルオキシダーゼ染色を、72−KDa の直前CMV タンパク質 に対して向けられたモノクローナル抗体を用いて実施した。ラベルされたプラー クを計数し、そして結果をホスカネットの濃度対未処理の感染された対照細胞に 対する％として表わした。結果は、遊離の及びリポソーム中のホスカネットは M RC−５細胞系（図２ｇ）においてCMV p72 タンパク質発現に対して相当の阻害活 性を有することを示した。インビボ研究 遊離の及びリポソーム−封入された抗−HIV 剤の薬物動態及び組織分布をラッ トにおいて研究した。手短に言及すれば、遊離の及びリポソーム−封入された薬 物を、動物の頸静脈を通して挿入されるカテーテルを通して一回の静脈内ボーラ ス用量として雌の Sprague−Dawleyラットに注射した。特定の時点で、動物を殺 し、そして血液をヘパリン処理された管に集め、そして遠心分離により分離した 。同時に、選択された組織を除去し、洗浄し、計量測定し、そして 均質化した。次に組織及び血漿を市販の組織溶解機の方法に従って処理した。す べてのサンプルにおける薬物及び脂質のレベルの決定を放射能トレーサーにより モニターした。 結果は、リポソーム中への抗ウィルス剤の封入が封入されていない薬物に関し て観察される薬物蓄積に対してマクロファージに富む組織においてより高い薬物 蓄積をもたらしたことを明確に示した（図３ａ〜３ｌ）。HIV 感染に対して敏感 なそれらの組織へのより多くの量の抗ウィルス剤の供給及び潜在的に毒性である 部位での薬物の減じられた供給は、抗−HIV 剤の高められた効能及び低められた 毒性をもたらすべきである。特に興味あることには、リンパ節におけるリポソー ムホスカネットの蓄積は独立剤の蓄積よりも８倍高かったことが示された（表２ ：図３ｊ，３ｋ及び３ｌにおけるのと同じ配合物：10mgのホスカネット／kg）。 高められた薬物蓄積はまた、遊離のホスカネットよりもむしろリポソーム中の ホスカネットが動物に注射される場合、動物の脳に観察された。そのような特徴 は、重度の中枢神経系疾患がHIV 病理学に関するので特に重要である。さらに、 本発明のデータは遊離の薬物よりもむしろリポソーム中のホスカネットの注射の 後、眼において高めれた薬物蓄積を示すので、リポソーム−封入されたホスカネ ットの投与がHIV により感染され、そしてCMV 網膜炎のために治療される患者に おいてCMV に対する薬物効能を改良するはずである。改良された薬物動態がまた 、リポソーム中への抗ウィルス剤の閉じ込めに基づいて観察された（表３及び４ ；図３ａ〜３ｅ及び３ｊ〜３ｌにおけるのと同じ配合物）。閉じ込められた薬物 の全射性クリアランスは独立剤のものよりもより低いことが見出され、これはリ ポソーム薬物の排除半減期の大きな上昇をもたらした。リポソームへの封入に基 づく抗ウィルス剤の改良された薬理学は、従来の治療に使用される抗ウィルス剤 の用量及び抗−HIV 剤の投与の頻度をたぶん減じ、従ってAIDS及び他のウィルス 性疾病を有する患者の生命の本質を改良する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デソルモー，アンドレ カナダ国，ケベック ジー２シー １ワイ １，ヌフシャテ，ドゥ ボーシャステ 7640

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウィルス性疾病の治療のためのリポソーム製剤であって、ｉ）10：１〜１ ：１の範囲のモル比でのジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチ ジルグリセロールの混合物を含んで成る脂質成分、ここで前記アシル鎖が飽和の 又は不飽和の、そして1418個の長さの炭素原子を有し；そしてii）前記ウィルス 性疾病に対して効果的な治療量の閉じ込められた薬物を含んで成るリポソーム製 剤。 ２．前記脂質成分がさらに、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのポリ エチレングリコール誘導体を含んで成る請求の範囲第１項記載のリポソーム製剤 。 ３．ウィルス性疾病の治療のためのリポソーム製剤であって、ｉ）４：１：５ のモル比でのジアシルホスファチジルコリン：ジセチルホスフェート：コレステ ロールの混合物を含んで成る脂質成分、ここで前記アシル鎖が飽和の又は不飽和 の、そして14〜18個の長さの炭素原子を有し；そしてii）前記ウィルス性疾病に 対して効果的な治療量の閉じ込められた薬物を含んで成るリポソーム製剤。 ４．前記脂質成分がさらに、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのポリ エチレングリコール誘導体を含んで成る請求の範囲第３項記載のリポソーム製剤 。 ５．前記閉じ込められた薬物が、３’−アジド−３’−デオキシチミジン(AZT )、ddＩ，ddＣ、ホスカネット、リバビリン、ガンシクロビル及びサクイナビル から成る群から選定される請求の範囲第１項記載のリポソーム製剤。 ６．前記脂質成分が10：３のモル比でのジアシルホスファチジルコリン：ジア シルホスファチジルグリセロールである請求の範囲第 ５項記載のリポソーム製剤。 ７．前記閉じ込められた薬物が３’−アジド−３’−デオキシチミジン(AZT) 、ddＩ，ddＣ、ホスカネット、リバビリン、ガンシクロビル及びサクイナビルか ら成る群から選定される請求の範囲第２項記載のリポソーム製剤。 ８．前記脂質成分が10：３：1.45のモル比でのジアシルホスファチジルコリン ：ジアシルホスファチジルグリセロール：ジアシルホスファチジルエタノールア ミン−ポリエチレングリコールである請求の範囲第７項記載のリポソーム製剤。 ９．前記閉じ込められた薬物が３’−アジド−３’−デオキシチミジン(AZT) 、ddＩ，ddＣ、ホスカネット、リバビリン、ガンシクロビル及びサクイナビルか ら成る群から選定される請求の範囲第３項記載のリポソーム製剤。 10．前記閉じ込められた薬物が３’−アジド−３’−デオキシチミジン(AZT) 、ddＩ，ddＣ、ホスカネット、リバビリン、ガンシクロビル及びサクイナビルか ら成る群から選定される請求の範囲第４項記載のリポソーム製剤。 11．前記ポリエチレングリコールが約 500〜5000ドルトンの分子量を有する請 求の範囲第２，４，８及び10のいづれか１項記載のリポソーム製剤。 12．前記脂質成分が10：３のモル比でのジステアロイルホスファチジルコリン ：ジステアロイルホスファチジルグリセロールであり、そして前記閉じ込められ た薬物が２’−３’−ジデオキシイノシンである請求の範囲第６項記載のリポソ ーム製剤。 13．前記脂質成分が10：３：1.45のモル比でのジステアロイルホスファチジル コリン：ジステアロイルホスファチジルグリセロール：ジステアロイルホスファ チジルエタノールアミン−ポリエチレン グリコールであり、そして前記閉じ込められた薬物が２’−３’−ジデオキシイ ノシンである請求の範囲第８項記載のリポソーム製剤。 14．前記脂質成分が10：３のモル比でのジパルミトイルホスファチジルコリン ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり、そして前記閉じ込められ た薬物がホスカネットである請求の範囲第６項記載のリポソーム製剤。 15．前記脂質成分が４：１：５のモル比でのジパルミトイルホスファチジルコ リン：ジセチルホスフェート：コレステロールであり、そして前記閉じ込められ た薬物が２’−３’−ジデオキシシチジンである請求の範囲第９項記載のリポソ ーム製剤。 16．約0.05〜0.5 μｍの平均粒子直径を有する請求の範囲第１〜10及び12〜15 のいづれか１項記載のリポソーム製剤。 17．約0.05〜0.5 μｍの平均粒子直径を有する請求の範囲第11項記載のリポソ ーム製剤。 18．請求の範囲第１〜10，12〜15及び17のいづれか１項記載のリポソーム製剤 をウィルス性疾病を有する患者に投与する段階を含んで成る、前記ウィルス性疾 病を治療するための方法。 19．請求の範囲第11項記載のリポソーム製剤をウィルス性疾病を有する患者に 投与する段階を含んで成る、前記ウィルス性疾病を治療するための方法。 20．請求の範囲第16項記載のリポソーム製剤をウィルス性疾病を有する患者に 投与する段階を含んで成る、前記ウィルス性疾病を治療するための方法。