JPH05506040A - 生体接着性リポソームと標的部位との相互作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生体接着性リポソームと標的部位との相互作用発明の背景 本発明は、新規の薬物送達システム、特に、外用及び局所的な薬物投与のための 、薬物カプセル化「生体接着性Ｊリポソームを利用した顕微鏡的薬物送達システ ム（ＭＤＤＳ）の製造に関する。

現在、薬物の外用又は局所的投与は、その遊離の形態で、適当な希釈剤中に又は クリーム、ゲル又は軟膏等の担体中に、溶解若しくは分散させて行うことができ る。外用又は局所的薬物投与のための治療上の又は指定された標的には、火傷： 傷：骨の損傷：眼、皮膚、鼻腔内及び口腔内の感染：緑内障のような眼の慢性的 状態；及び外用又は局所的にアクセス可能な腫瘍が含まれる。遊離の形態での薬 物の外用又は局所的投与にはいくつかの困難がある。例えば、指定された投与部 位における薬物の保持が短いことは、治療効果を減少させて高頻度の投与を必要 とする。局所又は口部領域における生物学的環境に遊離形態の薬物を曝すことは 、薬物の分解、不活性体への変換及び、無差別で制御不能の薬物分布をもたらし 得る。そのような薬物の分解及び制御不能の分布は、毒性問題、望ましくない副 作用及び効果の損失をもたらし得る。

顕微鏡的薬物送達システム（ＭＤＤＳ）は、遊離の形態での薬物の投与に関連し た困難のいくつかを克服するために開発された。ＭＤＤＳは、２つの基本的なり ラスに分かれる。すなわち、細胞、マイクロスフェア、ライスルエンベロープ及 びリポソームのような粒子システム、又は、蛋白質若しくは合成ポリマーのよう な巨大分子である非粒子システムである。このような個々のシステムを用いて、 薬物負荷ＭＤＤＳは、持続的な又は制御された放出をする薬物デポとして働くこ とができる。薬物及び生物学的環境の相互的保護を提供することによって、ＭＤ ＤＳは薬物の分解又は不活性化を減少させる。薬物の制御された放出のためのシ ステムとして、ＭＤＤＳ的に投与された薬物とは異なることから、ＭＤＤＳは、 毒性及び望ましくない副作用を減少させるための追加の方法を提供する。

リポソームは、他のＭＤＤＳシステムに比して一定範囲の利点を提供する。リポ ソームは、水性コンパートメントを包囲する、膜様の脂質層よりなる脂質小胞で ある。生体適合性且つ生分解性である天然材料よりなることから、リポソームは 、種々の目的のために生物学的活性材料をカプセル化するのに使用される。種々 の層、サイズ、表面電荷及び組成を有するため、リポソームの製造及びそれらの 中への薬物のカプセル化のための非常に多くの方法が開発されており、それらの あるものは、産業的レベルにまで大規模化されてきている。リポソームのタイプ とサイズの適当な選択により、カプセル化される薬物もまた様々なサイズであり 得る。リポソームは、脂溶性薬物、水溶性薬物及び、親水基及び疎水基の双方を 有する薬物物の投与という従前のプラクティスに対しＭＤＤＳを開発するにあた っての一般的な一選択肢としている。

のりボソームは、限定された向標的能力、循環中における限定されへのこれらの 認識物質の結合は起こったが、得られた修飾されたり。例えば、抗体は患者に特 異的であり得、従って、薬物療法のコスている。これらは一般に３つの主要なタ イプに分けられる。すなわ数及び親和性において異なっている。そのような非受 容体要素へのセスを効率化するものでなければならない。現在入手し得るリポソ ーム及びＭＤＤＳシステムは、外用及び局所的薬物投与のこれらの性能要求を満 たさない。

発明の概要 特定の認識物質をリポソーム表面に共有結合で係留することによって通常のリポ ソームを修飾することで、標的特異性と保持を有する「生体接着性」リポソーム がつくり出されることが判明した。認識物質は、薬物カプセル化リポソームを治 療的標的領域に取りつける接着剤又はニカワとして利用することができる分子で ある。これらの「生体接着性」認識物質は、受容体メカニズムにより、又は細胞 外マトリクス内の成分との関連によって、働き得る。接着の具体的メカニズムの いかんにかかわりなく、その共通の最終結果に基づき、これらの物質を「生体接 着性認識物質」という。

共有結合による係留によって、生体接着性認識物質はリポソームの一体化した一 部となるが、しかも標的部位における相互作用対照物とのアクセスは可能なまま である。それらはリポソーム及びカプセル化された薬物に、標的部位に対して接 着する能力を賦与する。

こうして、標的接着性の持続的放出性薬物デボである「生体接着性」リポソーム が開発された。リポソームを修飾する認識物質及び方法論の同定が本出願に開示 されている。これらの生体接着性リポソームは、外用又は局所的に投与される遊 離の薬物及び他のＭ　Ｄ　Ｄ　Ｓ（通常のリポソームであると他のＭＤＤＳであ るとを問わない）の従前のプラクティスに対していくつかの利点を提供する。こ れらの利点には、薬物及び生物学的環境の双方の相互的保護、薬物の生物学的利 用率及び標的部位における保持の向上、指定された標的部位への接着性の改善が 含まれる。これらの利点は、投与された薬物の望ましくない生物学的副作用の潜 在的減少をもたらす。

図面の簡単な説明 図１は、培養Ａ４３１細胞（単層）に対する、生体接着性リポソーム（ＥＧＦで 修飾されている：中抜きの二段の三角）及びＬＵＶＥＴタイプの通常のリポソー ム（アスタリスク）の結合を、リポソーム濃度に対して示す。結合したリポソー ム（Ｂで表す）は、細胞１０６個当たりｎｇＥＧＦ／の単位である。遊離のリガ ンド濃度（して表す）は、生体接着性リポソームに対しては細胞１０＠個当たり ｎｇＥＧＦの単位であり（Ｌ値の最初の行）、そして通常のリポソームに対して は細胞１０′個当たりμｍｏｌｅの単位である（Ｌ値の第２の行）。

図２は、培養Ａ４３１細胞（単層）に対するＭＬＶタイプの生体接着性リポソー ム（コラーゲンで修飾されている）の結合の時間的推移を示す。コラーゲンはト リチウム標識されている。ゼロ時間における最初の反応混合物中に存在した量に 対する、細胞に関連したリポソーム部分を時間を追って測定する。

図３は、培養Ａ４３１細胞（単層）に対する、生体接着性リポソーム（コラーゲ ン修飾）及び通常のＭＬＶタイプのリポソームの結合を示す。コラーゲンはトリ チウム（３Ｈ）標識し、リポソームは”Ｃ標識した。結合リポソーム（Ｂで表す ）は、細胞１０５個当たり’ＨＤＰＭの単位で表しく左の目盛）、細胞１０’個 当たり１４ＣＤＰＭの単位で示す（右の目盛）。遊離リガンド濃度（して示す） は、細胞１０’個当たりの３Ｈ又はｌ’ｃ　ＤＰＭの単位で示す。コラーゲンの 標識された生体接着性リポソームは、中抜きの二段の三角で示し、リポソームの 標識された生体接着性リポソームは十字で示し、そして通常のリポソームはアス タリスクで示す。

詳細な説明 本発明によれば、リポソームに結合した認識物質を有する生体接着性リポソーム は、受容体又は細胞外マトリクスを有する培養細胞に結合した。リポソーム、特 に、各々フオスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含有する多層性ベシクル （ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｉａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＭＬＶ）　、微小乳化リポ ソーム（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ。

ＭＥＬ）又は大要一枚膜ベシクル（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅ ｓｉｃｌｅｓ。

ＬＵＶＥＴ）が、確立された手順によって製造された。各々ヒトへの使用の承認 された認識物質としては、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、セ ラチン及びコラーゲンが含まれる。これらの認識物質の各々は、生物学的起源を 有し、生分解性且つ生体適合性である。更に、これらの認識物質は、通常のリポ ソーム表面への共存結合による係留のために用いることのできる官能基を育する 個々の生体接着性リポソームの製造の方法論は、本開示と共に現在出願されてい る別の出願において開示されており、ここでは繰り返さない。

結合要素の完全な評価は、独立及び従属変数の間の関係の定量的記述に適用され る、前に知られたラングミュア等温多項方程式によって決定された。

ここにｎは、特定の認識物質に対して細胞システムが有する異なる細胞関連結合 要素の数であり；　［Ｌ］は、認識物質であってよい遊離のリガンド、遊離のリ ポソーム又は生体接着性リポソームの濃度であり：Ｂは、所定のＣＬ］において 所定の細胞数滴たりに結合した認識物質の総量であり；１３ｍａｘ、及びＫｄ− よ、所定の要素の部位の総数及び対応する平衡解離定数である。Ｂ及びＢｍａｘ は、同数の細胞について標準化されている。

受容体及び非受容体細胞膜成分が認識物質の結合に関与する場合であって、非特 異的結合の解離定数が遊離のリガンド濃度に比して十分大きい場合には、方程式 ｌは次の形をとることができる。

ここに最後の項に１□［Ｌ］は、Ｂに対する非特異的結合の寄与であり、Ｋ　ａ 　ａは、非特異的結合に対応したＫｄに対するＢｍａｘの比率である。

非線型回帰手順を適用して方程式（１）及び／又は（２）に従ってコンピュータ ーによるデータ処理により、パラメーターｎ、ＢＩＩｌａｘ１、及びＫｄ、の「 最適」値が得られる。

生体接着性ＥＧＦ修飾リポソームの相互作用は、生物学的モデルとしてのＡ４３ １細胞の単層培養を用いて確立された。ヒト上皮癌に発したこの十分確立された 細胞株は、ＥＧＦ受容体に富んでいる。Ａ４３１細胞は、遊離のＥＧＦとその受 容体との相互作用の研究のために繰り返し使用した。

Ａ４３１細胞は、親和性及び数の異なる３つのクラスのＥＧＦ受容体を有してい ることが示された。これらのクラスの第１は、０゜０７ｎＭの平衡解離定数を有 し細胞膜たり１５０乃至４０００部位の数を有する、超高親和性部位である。第 ２のクラスは、０．　７ｎＭの平衡解離定数を育し細胞当たり１．５Ｘ１０’部 位の数を存する、高親和性部位である。最後のクラスは、５．９ｎＭの平衡解離 定数を有し細胞当たり２×１０″部位の数を有する、低親和性部位通常のリポソ ームと生体接着性リポソームとの結合能力を比較するために、Ａ４３１培養細胞 を、この細胞株のための通常の手順を適用してフラスコ中に単層に増殖させた。

実験の２．３日前に、細胞をマルチウェル培養プレートに播種し、系がフンフル エンドになったとき実験を行った。

修飾されたリポソームのアッセイのため、ＥＧＦ認識物質を一般に知られている 放射性マーカーで標識した。ＥＧＦ修飾ＬＵＶＥＴの調製は、同時に行った出願 にて開示した通りにして完成した。

ＥＧＦ修飾リポソーム、遊離のリポソーム又は遊離の認識物質の反応混合物を加 える前に、Ａ４３１細胞から培地を除去し、細胞を結合緩衝液で洗浄した。反応 混合物及び細胞を、室温にて１．２時間インキュベートした。インキュベーショ ンの終りに希釈して反応混合物を除去し、ウェルの結合緩衝液での２．３回の連 続洗浄を完了した。細胞の溶解又はウェルからの細胞の剥離に次いて、ウェル内 容物の除去及び収集を行い、細胞画分とした。該細胞画分のアッセイは、調製工 程によりつくり出される直接的生成物のカウントに比較して該分画の標識をカウ ントすることによって完了した。

Ａ４３１細胞に対する、遊離リポソームの結合とＥＧＦ修飾リポソームの結合と の間の比較を図１に示す。遊離のリポソームは細胞画分に見出されなかったこと から、Ａ４３１細胞に対し、ＥＧＦ修飾リポソームは遊離リポソームよりかなり よく接着する。仮に遊離リポソームが細胞と関連するとしても、洗浄によって生 じる希釈は定量的解離を起こすに十分であると考えられる。

実施例２ ４３１細胞に対するＥＧＦ修飾リポソームの結合研究を、実施例１に記載したよ うにして実施し、上記の方程式（１）に従ってデータを処理した。実験条件は、 非特異的結合の寄与が無視し得るようなものとした。実際、検討した各リポソー ム系について、データは単一タイプの結合部位に曖昧性なく適合することが見出 された。数個の系についての結果を表１に示す。

表１ ＥＧＦ−ＭＬＶ　０．６０　＋　０．０１７　０．１７　＋　０．０３ＥＧＦ− ＭＬＶ　５．０３　主１゜９　１．０７　＋　０．０３ＥＧＦ−ＬＵＶＥＴ　２ ．９１　＋０．００３　０．１８　±ｏ、ｏｏｉＥＧＦ−ＭＥＬ　０．０４　＋ 　０．００７　０．０４２　±０．００４２ＥＧＦ−ＭＥＬ　０．４０　＋　０ ．１３　３．７　±０．９０ＥＧＦ−ＭＥＬ　０．４８　主０゜０５　０．２８ 　主０゜０１（ａ）各生体接着性リポソーム系は、別の調製物である。各基にお ける認識物質はＥＧＦである。

ＥＧＦ修飾リポソームは、遊離のリポソームに比してかなり太きく且つ異なって おり、このことは結合パラメーターに影響を与えているものと予測される。所定 のクラスの受容体について、ＥＧＦ修飾リポソーム系の解離定数の大きさは、遊 離のＥＧＦのそれと近似か又は大きいものと予測される。所定のクラスの受容体 について、ＥＧＦ修飾リポソームが利用できる細胞当たりの受容体の数は、遊離 のＥＧＦが利用できる数に等しいか又は少ないと予測される。これらの考察に基 づき、本実施例の結合データは、超高親和性及び高親和性の受容体クラスに適合 する。

関与する特定の細胞関連結合要素にかかわりなく、表１に示した結合データは、 ＥＧＦ修飾リポソームが、高い親和性で且つこれらの修飾されたリポソームが所 望の生体接着性リポソームとして働くに十分な数の部位において、この細胞系に 結合するこを示しているＡ４３１細胞に対するコラーゲン修飾リポソームの結合 を、上に詳述した手順に本質的に従って行った。Ａ４３１細胞株は、コラーゲン に対する受容体を含むことは知られていない。Ａ４３１細胞株と遊離のコラーゲ ン又はリポソーム結合コラーゲンとの相互作用は、コラーゲンと細胞外マトリク ス中の成分との関連の結果であると予測される。図２を参照して、４時間までの インキュベーション時間は、結合とコラーゲン修飾リポソームの結集にとって最 適時間である３時間をもって完成された。

培養Ａ４３１細胞に対するコラーゲン修飾リポソームの結合の量的評価を通常の リポソームと比較し、図３に例示する。データは、上記の方程式（１）に従って 処理した。ｉＨ−コラーゲン及びｌ４Ｃ−コレステロールによる２重標識により 、コラーゲン及びリポソームを同時にモニターすることがてきた。細胞に対する コラーゲン修飾リポソームの結合は、対応する通常のリポソームの結合よりも大 きい。

遊離の及びコラーゲン修飾リポソームに関し、結合要素は、細胞関連要素のうち 細胞外マトリクスタイプのものである。実施例２に論じたＥＧＦ修飾リポソーム の場合のように、コラーゲン修飾リポソームの解離定数は、遊離のコラーゲンの それらと近似か又は高いものと予測される。同様に、コラーゲン修飾リポソーム が利用し得る、細胞外マトリクスの利用し得る部位の数は、遊離のコラーゲンに 比して同等か又は低いと予測される。表２に提示した例は、これらの考察に合致 する。遊離のコラーゲンに関するデータは、この細胞系に対するこの生体接着性 認識物質の結合は、実際に起こりそし、処理により定量的且つ意味あるパラメー ターを与えることのできる測定可能な現象であることを実証している。更に、表 ２のデータは、この細胞系に対するコラーゲン修飾リポソームの結合が、該コラ ーゲン修飾リポソームが所望の生体接着性リポソームとして働くに十分親和性が 高くかつ十分な数の部位を有するものであることを、極めて明瞭に示している。

表２ 培養Ａ４３１細胞株に対する、遊離の認識物質及び生体接着性リポソームの結合 パラメーター遊離のコラーゲン　８．５　主２゜３　１７９　±　１１コラ一ゲ ンＭ　Ｌ　Ｖ　６７、６　±３１．３５　５４８　±１６０好ましい具体例を記 述したが、本発明の範囲から離れることなく種々の修正及び置換をなし得る。例 えば、開示した実施例におけるマウスのＥＧＦ及びヒトのウロガステロンは、他 の天然の又は合成的起源になるＥＧＦに置換することができよう。同様に、コラ ーゲン、ゼラチン及びＨＡも、他の天然の又は合成起源になるものであってよい 。従って、本発明は、限定によってでなく例示によって記述されていることを理 解しなければならない。

時間（ｈｒ） （Ｄ　ＰＭ　／　１０ＣＩＤ’） 認識物質である、表皮増殖因子、ゼラチン、コラーゲン及びヒアルロン酸が、リ ポソームの表面に共有結合で結合され、リポソームを細胞標的部位に取りつける ために利用された。これらの「生体接着性」リポソームは、外用及び局所的に投 与される遊離の薬物の分野において、いくつかの利点を提供する。これらの利点 には、薬物及び生物学的環境双方の相互的保護、標的部位における薬物の生物学 的利用率と保持との向上、及び指定された標的部位に対する接着性の改善である 。

国際調査報告 −０１にゴＭ＠−一一―−−−ｍ　ｆｉｌｌ　−ＰＭｌｔａ　ｍ国際調査報告 ＵＳ　９１０８１１２ Ｓ＾　５６４８５

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．カプセル化リポソーム成分及び該リポソーム表面に結合した認識物質成分を 外用的に投与することよりなる、指定された細胞標的部位に外用的に物質を投与 するための方法であって、該認識物質成分が該リポソーム成分に標的部位への標 的特異性及び標的部位における保持を賦与するものである方法。
2. ２．該リポソーム成分が多層性ベシクル、微小乳化リポソーム及び大型一枚膜ベ シクルよりなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の投与方法。
3. ３．該リポソーム成分がフォスファチジルエタノールアミンを含むものである、 請求項１に記載の投与方法。
4. ４．該認識物質成分が、細胞標的部位において受容体メカニズムを介した接着の メカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものである、請求項１に記載 の投与方法。
5. ５．該認識物質成分が、細胞標的部位において細胞外マトリクス中の成分との関 連を介した接着のメカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものである 、請求項１に記載の投与方法。
6. ６．該認識物質成分が、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸及び表皮増殖因子 よりなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の投与方法。
7. ７．該リポソーム成分及び該認識物質成分が共有結合で連結されているものであ る、請求項１に記載の投与方法。
8. ８．該リポソーム成分と該認識物質成分が架橋剤によって共有結合で連結されて いるものである、請求項１に記載の投与方法。
9. ９．カプセル化リポソーム成分及び該リポソーム表面に結合した認識物質成分を 局所的に投与することよりなる、指定された細胞標的部位に局所的に物質を投与 するための方法であって、該認識物質成分が該リポソーム成分に標的部位への標 的特異性及び標的部位における保持を賦与するものである方法。
10. １０．該リポソーム成分が多層性ベシクル、微小乳化リポソーム及び大型一枚膜 ベシクルよりなる群より選ばれるものである、請求項９に記載の投与方法。
11. １１．該リボソーム成分がフォスファチジルエタノールアミンを含むものである 、請求項９に記載の投与方法。
12. １２．該認識物質成分が、細胞標的部位において受容体メカニズムを介した接着 のメカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものである、請求項９に記 載の投与方法。
13. １３．該認識物質成分が、細胞標的部位において細胞外マトリクス中の成分との 関連を介した接着のメカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものであ る、請求項９に記載の投与方法。
14. １４．該認識物質成分が、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸及び表皮増殖因 子よりなる群より選ばれるものである、請求項９に記載の投与方法。
15. １５．該リポソーム成分及び該認識物質成分が共有結合で連結されているもので ある、請求項９に記載の投与方法。
16. １６．該リポソーム成分と該認識物質成分が架橋剤によって共有結合で連結され ているものである、請求項９に記載の投与方法。
17. １７．リボソーム成分及び該リポソーム表面に結合した認識物質成分よりなり、 該認識物質成分が該リボソーム成分に、標的部位における標的特異性と保持とを 賦与するものである、指定された細胞標的部位に物質を投与するためのリポソー ム。
18. １８．該リポソーム成分が多層性ベシクル、微小乳化リポソーム及び大型一枚膜 ベシクルよりなる群より選ばれるものである、請求項１７に記載のリポソーム。
19. １９．該リポソーム成分がフォスファチジルエタノールアミンを含有するもので ある、請求項１７に記載のリポソーム。
20. ２０．該認識物質成分が、細胞標的部位において受容体メカニズムを介した接着 のメカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものである、請求項１７に 記載のリポソーム。
21. ２１．該認識物質成分が、細胞標的部位において細胞外マトリクス中の成分との 関連を介した接着のメカニズムによって標的特異性と保持とを賦与するものであ る、請求項１７に記載のリポソーム。
22. ２２．該認識物質成分が、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸及び表皮増殖因 子よりなる群より選ばれるものである、請求項１７に記載のリポソーム。
23. ２３．該リポソーム成分及び該認識物質成分が共有結合で連結されているもので ある、請求項１７に記載のリポソーム。
24. ２４．該リポソーム成分と該認識物質成分が架橋剤によって共有結合で連結され ているものである、請求項１７に記載のリポソーム。