KR102328463B1 - 리포솜 조성물 및 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 과제는, 높은 AUC를 나타내는 리포솜 조성물 및 의약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인, 리포솜 조성물과 상기 리포솜 조성물을 포함하는 의약 조성물이 제공된다.

Description

리포솜 조성물 및 의약 조성물
본 발명은, 높은 혈중 체류성을 나타내는 리포솜 조성물 및 의약 조성물에 관한 것이다.
리포솜 조성물에 의하여, 약물을, 암 등의 질환 부위에 집적시켜, 장기간에 걸쳐 노출시키는 것이 많이 검토되고 있다. 의약 조성물로서의 리포솜 조성물에 있어서는, 지질막으로 이루어지는 리포솜 중에 약물이 내포되어 있다.
특허문헌 1 및 비특허문헌 1에는, 스핑고미엘린과 콜레스테롤을 포함하는 리포솜에, 토포테칸을 내포시킨 리포솜이 기재되어 있다.
특허문헌 2에는, 다이하이드로스핑고미엘린과 콜레스테롤을 포함하는 리포솜에, 토포테칸을 내포시킨 리포솜이 기재되어 있다.
특허문헌 3에는, 캄프토테신의 안정성을 높이도록 적합하게 된 리포솜캄프토테신 제제로서, (a) 리포솜에 봉입된 캄프토테신, (b) 리포솜의 외부에 있고, pH4.5 미만 또는 4.5인 제1 용액, 및 (c) 리포솜 내부에 있는 제2 용액을 포함하는 제제가 기재되어 있다. 또, 리포솜이 다이하이드로스핑고미엘린 및 콜레스테롤을 포함하는 것이 기재되어 있다.
특허문헌 4에는, 양(兩) 친매성 약제를 리포솜에 유효하게 충전하는 시스템으로서, 암모늄 화합물 또는 암모늄염의 존재하에서 리포솜 현탁액을 조정하여, 상기 현탁액을 완충제 또는 염으로 희석하고, 내부 수성상과 외부 수성상의 사이에, 내측으로부터 외측으로 향하는 암모늄 구배와, 리포솜의 내측의 pH가 외측의 pH보다 산성 측인 pH 구배를 부여하는 것을 포함하는, 시스템이 기재되어 있다.
특허문헌 5에는, 정제 수소 첨가 대두 인 지질 또는 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 친수성 폴리머 유도체 지질을 포함하는 리포솜에, 황산 암모늄의 존재하에서 토포테칸을 내포시킨 리포솜이 기재되어 있다.
특허문헌 1: 미국 특허공보 제7,060,828B2호 특허문헌 2: 미국 특허공보 제7,811,602B2호 특허문헌 3: 일본 공표특허공보 2008-519045호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 평2-196713호 특허문헌 5: 미국 특허공보 제6,355,268B2호
비특허문헌 1: AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22-26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.
상기한 특허문헌 1, 2 및 3과, 비특허문헌 1에는, 토포테칸을, 스핑고미엘린 또는 다이하이드로스핑고미엘린을 포함하는 리포솜에 내포시킴으로써, 혈중에서의 토포테칸의 유출을 억제하고, AUC(Area Under the blood concentration-time Curve: 혈중 농도-시간 곡선 하면적)를 향상시킴으로써 약효의 향상을 도모하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 리포솜을 구성하는 지질 조성, 및 토포테칸을 침전시키는 염의 조성의 최적화가 이루어져 있지 않기 때문에, AUC의 향상은 충분한 것이 아니고, 추가적인 개선이 요구되고 있다.
또, 토포테칸이, 리포솜의 내수상(內水相)으로부터 외수상(外水相)으로 누출되어, 중성 조건에 노출되면, 토포테칸은 유연체(類緣體)로 변화한다. 구체적으로는, 매우 용해도가 낮은 N-N bis 부가물(토포테칸아민 이량체) 등이 결정으로서 석출되어 침전하는 경우가 있다. 최종적으로는, 미국의 Food and Drug Administration(FDA), 일본의 Pharmaceutical and Medical Device Agency(PMDA), 및 European Medicines Agency(EMEA)가 규정하는 안전 기준 및 품질 기준을 벗어나는 많은 불용성 미립자가 생성되어 바람직하지 않다. 이와 같은 불용성 미립자의 생성을 억제하기 위하여, 특허문헌 3에 있어서는, 외수상의 pH를 산성 조건으로 하고 있다. 그러나, 외수상이 산성 조건에서는, 리포솜을 구성하는 지질의 분해가 촉진되어, 리포솜의 안정화를 위해서는 불리했다. 특허문헌 3의 리포솜에 있어서는, 외수상을 산성으로 하는 것이 필요한 점에서, 산성으로 가수분해하는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민을 혈중 체류성의 향상을 위하여 첨가하는 것은 곤란하다.
본 발명은, 높은 AUC를 나타내는 리포솜 조성물 및 의약 조성물을 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 사용하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비를 0.36 이상으로 함으로써, 상기의 과제를 해결한 리포솜 조성물을 제공할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 하기를 제공한다.
[1]
리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인, 리포솜 조성물.
[2]
약물이 토포테칸 또는 그 염, 독소루비신 또는 그 염, 이리노테칸 또는 그 염, 수니티닙 또는 그 염인, [1]에 기재된 리포솜 조성물.
[3]
전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.6 이상 1.8 이하인, [1] 또는 [2]에 기재된 리포솜 조성물.
[4]
친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민이, 폴리에틸렌글라이콜 또는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[5]
리포솜막의 구성 성분에 있어서의 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민의 비율이 2~10몰%인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[6]
리포솜막의 구성 성분에 있어서의 콜레스테롤류의 비율이 35~43몰%인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[7]
입자경이 150nm 이하인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[8]
외수상의 pH가 5.5~8.5인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[9]
다이하이드로스핑고미엘린이 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 포함하는 다이하이드로스핑고미엘린이고, 내포 약제가 토포테칸 또는 그 염인 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[10]
리포솜의 내수상에 포함되는 황산 이온의 리포솜 조성물 전체의 황산 이온에 대한 비율이, 적어도 80%이며, 리포솜의 내수상에 포함되는 약물의 리포솜 조성물 전체의 약물에 대한 비율이, 적어도 80%인, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[11]
암모늄 농도가 1mmoL/L 이하인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 20%/24시간 이하이며, 암모늄 농도가 4~6mmoL/L인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 60%/24시간 이상인, [9]에 기재된 리포솜 조성물.
[12]
5℃에서 1개월의 보관 후에 있어서의 리포솜 조성물의 지질 1μmol당 포함되는 10μm 초과의 입자가 150개 이하, 상기 리포솜 조성물의 지질 1μmol당 포함되는 25μm를 초과하는 입자의 개수가 15개 이하인, [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물.
[13]
[1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 리포솜 조성물을 포함하는, 의약 조성물.
[14]
항암제인, [13]에 기재된 의약 조성물.
[15]
리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 암모늄염을 포함하며, 다이하이드로스핑고미엘린이 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 다이하이드로스핑고미엘린인, 리포솜 조성물.
[A] 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인, 리포솜 조성물을, 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법.
[B] 질환(바람직하게는, 암)의 치료에 있어서 사용하기 위한, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인, 리포솜 조성물.
[C] 의약 조성물의 제조를 위한, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물로서, 상기 리포솜 조성물은 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인, 리포솜 조성물의 사용.
본 발명의 리포솜 조성물 및 의약 조성물은, 높은 AUC를 나타낼 수 있다.
도 1은, A549 피하 이식 마우스 모델을 이용한 약효 시험에 있어서의 체중의 측정 결과를 나타낸다.
도 2는, A549 피하 이식 마우스 모델을 이용한 약효 시험에 있어서의 체중의 측정 결과를 나타낸다.
도 3은, A549 피하 이식 마우스 모델을 이용한 약효 시험에 있어서의 종양 체적의 측정 결과를 나타낸다.
도 4는, A549 피하 이식 마우스 모델을 이용한 약효 시험에 있어서의 종양 체적의 측정 결과를 나타낸다.
도 5는, 각 콜레스테롤양에 대한 AUC의 값을 나타낸다.
도 6은, 릴리스율에 부여하는 암모늄 이온 의존성을 측정한 결과를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 "~"를 이용하여 나타난 수치 범위는, "~"의 전후에 기재되는 수치를 각각 최솟값 및 최댓값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우, 특별히 설명하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 상기 복수의 물질의 합계량을 의미한다.
"혈중 체류성"이란, 리포솜 조성물을 투여한 대상에 있어서, 리포솜에 봉입된 상태의 약물이 혈액 중에 존재하는 성질을 의미한다.
"리포솜의 평균 입자경"이란, 특별히 지정하지 않는 한 동적 광산란법을 이용하여 측정되는 큐물런트 평균 입자경을 의미한다. 동적 광산란을 이용한 시판 중인 측정 장치로서는, 농후계 입경 애널라이저 FPAR-1000(오쓰카 덴시사제), 나노트랙 UPA(닛키소사제) 및 나노사이저(말번사제) 등을 들 수 있다. 각 제조 회사의 측정 장치 고유의 변환식에 의하여, 리포솜의 체적 평균 입자경이나 수평균 입자경을 산출하는 것도 가능하다.
100nm 부근의 입자를 측정하기 위해서는, 정적 광산란법 등으로는, 정확하게 입자의 분포를 파악할 수 없고, 동적 광산란법에 의한 측정이 바람직하다.
"불용성 미립자"란, 정맥 주사 제제 등 전신 투여용 의약품 조성물에 있어서의, PMDA, FDA, EMEA 등의 규제 당국이 안전성 및 품질 기준으로서 설정하는 항목이며, 예를 들면 일본에 있어서의 일본 약국방 <6.07> 주사제의 불용성 미립자 시험법에 있어서, 제1법(광 차폐 입자 계수법)으로 평가하는 경우, 표시량이 100mL 미만인 제품의 약물 바이알 1개에 포함되는 입경이 10μm 이상인 불용성 미립자는 6000개 이하, 입경이 25μm 이상인 불용성 미립자는 600개 이하일 것을 요구하고 있다. 또, 제2법(현미경 입자 계수법)으로 평가하는 경우, 입경이 10μm 이상인 불용성 미립자는 6000개 이하, 입경이 25μm 이상인 불용성 미립자는 600개 이하일 것을 요구하고 있다.
불용성 미립자는, 그 입자의 성분에 관계없이, 입자의 사이즈에 의해서만 정의되는 것이고, 예를 들면 리포솜 조성물에 있어서, 리포솜 자체의 응집물이어도 되며, 리포솜 내부로부터 누출된 약물 성분의 응집 및 석출물이어도 되고, 리포솜 외수상의 성분의 응집 및 석출물이어도 된다. 특히 본 발명에 있어서의 토포테칸을 내포한 리포솜은, 내포된 토포테칸이 리포솜 외로 누출되고, 용해도가 낮은 분해물로의 분해를 거쳐 생성되는 석출물인 것이, 특허문헌 3 등의 기재에 의하여 알려져 있다.
불용성 미립자를 측정하는 방법으로서, 광학적으로 검출하는 광 차폐 입자 계수법(파티클 카운터, 예를 들면 벡크만·쿨터사의 HIAC 9703+, 파티클 사이징 시스템사의 아큐사이저 A2000USP가 사용됨) 외에, 현미경으로의 확대상을 육안으로 관찰하여 카운트하는 현미경 입자 계수법을 들 수 있다.
리포솜 의약 조성물, 특히 주사 제제의 경우는, 일본 약국방 <6.07> 주사제의 불용성 미립자 시험법에 정하는 바와 같이, 사용 시에 있어서 의약 조성물에 포함되는 입경이 10μm를 초과하는 입자가 6000개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 600개 이하인 것이 바람직하다고 여겨진다.
리포솜 의약 조성물의 주사 제제에 있어서는, 불용성 미립자가 발생하는 원인은, 대부분이 보관 중에 발생하는 리포솜 입자 성분의 응집·합일·분해에 기인하는 것으로 생각되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포솜을 구성하는 주된 소재인 지질의 양에 따라, 불용성 미립자가 발생하는 경향이 있다. 예를 들면, 지질 농도 20mmol/L의 리포솜 조성물 2mL를 포함하는 의약 조성물을 생각한 경우, 지질 1μmol당 입경이 10μm를 초과하는 입자가 150개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 15개 이하이면, 일본 약국방 <6.07> 주사제의 불용성 미립자 시험법에 정하는 기준인, 의약 조성물에 포함되는 입경이 10μm를 초과하는 입자가 6000개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 600개 이하를 충족시킬 수 있다.
본 발명의 리포솜 조성물에 있어서도, 5℃에서 1개월의 보관 후에 있어서 지질 1μmol당 입경이 10μm를 초과하는 입자가 150개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 15개 이하인 것이 바람직하다. 5℃에서 1개월의 보관 후에 있어서 지질 1μmol당 입경이 10μm를 초과하는 입자가 75개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 7.5개 이하인 것이 보다 바람직하다. 5℃에서 1개월의 보관 후에 있어서 지질 1μmol당 입경이 10μm를 초과하는 입자가 25개 이하, 입경이 25μm를 초과하는 입자가 2.5개 이하인 것이 더 바람직하다.
또, 입경이 10μm를 초과하는 조대 입자는, 보관 시의 경시 열화에 의하여 증대하는 경우가 많아, 3개월 저장 후의 상태여도 상기 개수를 충족시키는 것이 바람직하고, 1년 저장 후의 상태여도 상기 개수를 충족시키는 것이 보다 바람직하다.
"대상"이란, 질병 등의 예방 혹은 치료를 필요로 하는 인간, 마우스, 원숭이, 가축 등의 포유 동물이며, 바람직하게는, 질병 등의 예방 혹은 치료를 필요로 하는 인간이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 제1 형태인 리포솜 조성물은, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 약물을 내포하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하며, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상이다.
또, 본 발명의 제2 형태인 리포솜 조성물은, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함하는 리포솜 조성물이며, 약물을 내포하고, 내수상이 암모늄염을 포함하며, 다이하이드로스핑고미엘린이 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 다이하이드로스핑고미엘린이다.
본 발명에 있어서는, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 사용함으로써, 혈중에서의 리포솜의 체류성을 향상시키고 있다. 또한, 내수상이 황산 암모늄을 포함함으로써, 혈중에서의 리포솜으로부터의 약물의 누출을 억제하여, AUC를 향상시키고 있다. 또한, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비를 0.36 이상으로 함으로써, 혈중에서의 리포솜으로부터의 약물의 누출을 더 억제하여, 보다 높은 AUC를 달성하고 있다.
상기의 결과, 냉장 보관 중에 있어서도, 내수상으로부터 외수상으로의 약물의 누출을 억제할 수 있고, 중성 조건에 있어서도 불용성 미립자의 생성을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 리포솜 조성물에 있어서는, 외수상의 pH를 중성(pH7.4) 부근으로 설정할 수 있고, 산성 조건하에서 가수분해하는 "친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민"을, 혈중 체류성 향상을 위하여 사용하는 것이 가능하게 되었다.
(리포솜)
리포솜이란, 지질을 이용한 지질 이중막으로 형성되는 폐쇄 소포체이며, 그 폐쇄 소포의 공간 내에 수상(내수상)을 갖는다. 내수상에는, 물 등이 포함된다. 리포솜은 통상, 폐쇄 소포 외의 수용액(외수상)에 분산된 상태로 존재한다. 리포솜은 싱글 라멜라(단층 라멜라 또는 유니라멜라라고도 부르고, 이중 층막이 일중의 구조임)여도 되며, 다층 라멜라(멀티라멜라라고도 부르고, 양파상의 형상의 다수의 이중 층막의 구조이다. 개개의 층은 물과 유사한 층으로 구획되어 있음)여도 되지만, 본 발명에서는, 의약 용도에서의 안전성 및 안정성의 관점에서, 싱글 라멜라의 리포솜인 것이 바람직하다.
리포솜은, 약물을 내포할 수 있는 리포솜이면, 그 형태는 특별히 한정되지 않는다. "내포"란, 리포솜에 대하여 약물이 내수상 및 막 자체에 포함되는 형태를 취하는 것을 의미한다. 예를 들면, 막으로 형성된 폐쇄 공간 내에 약물을 봉입하는 형태, 막 자체에 내포시키는 형태 등을 들 수 있고, 이들의 조합이어도 된다.
리포솜의 평균 입자경은, 일반적으로는 10nm~1000nm이고, 20nm~500nm가 바람직하며, 30~300nm가 보다 바람직하고, 30nm~200nm가 더 바람직하며, 150nm 이하, 예를 들면 30nm~150nm가 한층 더 바람직하고, 70~150nm가 특히 바람직하다.
리포솜은 구상 또는 그것에 가까운 형태를 취하는 것이 바람직하다.
리포솜의 지질 이중층을 구성하는 성분은, 지질로부터 선택된다. 지질로서, 수용성 유기 용매 및 에스터계 유기 용매의 혼합 용매에 용해되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 리포솜은, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류를 포함한다.
리포솜이란, 상술과 같은 지질을 이용한 지질 이중막으로 형성되는 폐쇄 소포체이며, 일반적으로 지질 이중막을 형성하는 기재가 되는 지질로서는 2개의 아실쇄를 갖는 인 지질, 예를 들면 포스파티딜콜린(레시틴), 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 카디올리핀 등의 천연 혹은 합성의 인 지질, 또는 이들에 수소 첨가한 것(예를 들면, 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린(HSPC)) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 지질 이중막을 형성하는 기재가 되는 지질로서, 2개의 아실쇄를 갖는 인 지질, 다이하이드로스핑고미엘린을 이용한다.
다이하이드로스핑고미엘린을 사용함으로써, 혈중에서의 리포솜의 체류성을 향상시킬 수 있다.
다이하이드로스핑고미엘린을 리포솜막의 기재로서 이용함으로써, 그 리포솜막의 격벽성을 향상시켜, 내포한 약물의 누출을 방지할 수 있다. 이는, 다이하이드로스핑고미엘린이 갖는 아마이드 결합이, 강한 수소 결합능을 갖고, 서로 강하게 상호 작용함으로써 강고하며 격벽성이 높은 막을 형성할 수 있기 때문이라고 추측한다. 또, 본 발명에 있어서 동시에 이용하는 콜레스테롤의 수산기와도 강하게 상호 작용하여, 추가로 격벽성이 높은 막을 만들 수 있다. 이는, 에스터 결합을 갖는 HSPC나 레시틴 등의 범용되고 있는 지질로는 달성할 수 없는 기능이 된다.
또, 아마이드 결합을 갖지만, 아실쇄에 불포화 결합을 갖는 스핑고미엘린에 대하여, 모두 포화된 다이하이드로스핑고미엘린은 그 융점이 높고, 형성되는 막의 운동성이 낮아지는 점에서, 스핑고미엘린에 대해서도, 다이하이드로스핑고미엘린은, 격벽성이 높은 막을 만들 수 있다고 추측한다.
다이하이드로스핑고미엘린은, 일반적으로 분자 내에 2개의 장쇄 알킬기를 갖고 있으며, 탄소수 16의 장쇄 알킬기를 2개 갖는 것, 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 것, 탄소수 16과 탄소수 20~24의 장쇄 알킬기를 갖는 것을 들 수 있다.
다이하이드로스핑고미엘린으로서는, 약물의 리포솜으로부터의 누출 방지의 관점에서, 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 하기 화합물을 이용하는 것이 바람직하다. 이는, 탄소수가 많을수록, 융점이 높아져 격벽성이 높은 리포솜막을 만들 수 있기 때문이다.
[화학식 1]
Figure 112019098238813-pct00001
다이하이드로스핑고미엘린으로서는, 예를 들면 천연물 유래의 스핑고미엘린을 일반적인 수법으로 환원함으로써 얻어지는 다이하이드로스핑고미엘린을 이용해도 되고, 합성함으로써 얻어지는 다이하이드로스핑고미엘린을 이용해도 된다.
계란 등 천연물 유래의 다이하이드로스핑고미엘린은, 일반적으로 탄소수 16의 장쇄 알킬기를 2개 갖는 것이 대부분을 차지하기 때문에, 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 다이하이드로스핑고미엘린이 순도 높게 얻어지는 점에서, 화학 합성에 의하여 얻어지는 것을 사용하는 편이 바람직하다.
리포솜막의 구성 성분(리포솜을 구성하는 전체 지질)에 있어서의 다이하이드로스핑고미엘린의 비율은 바람직하게는 30~80몰%이고, 보다 바람직하게는 40~70몰%이며, 더 바람직하게는 50~60몰%이다.
친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민에 있어서의 친수성 고분자로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글라이콜류, 폴리글리세린류, 폴리프로필렌글라이콜류, 폴리바이닐알코올, 스타이렌-무수 말레산 교호 공중합체, 폴리바이닐피롤리돈, 합성 폴리아미노산 등을 들 수 있다. 상기의 친수성 고분자는, 각각 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
이들 중에서도, 조성물의 혈중 체류성의 관점에서, 폴리에틸렌글라이콜류, 폴리글리세린류 및 폴리프로필렌글라이콜류가 바람직하고, 폴리에틸렌글라이콜(PEG), 폴리글리세린(PG), 폴리프로필렌글라이콜(PPG) 및 그들의 유도체가 보다 바람직하다.
범용성 및 혈중 체류성의 관점에서, 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 및 그 유도체가 더 바람직하다. 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로서는, 메톡시폴리에틸렌글라이콜 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
폴리에틸렌글라이콜류의 분자량은, 특별히 한정되지 않지만, 500~10,000돌턴이고, 바람직하게는 1,000~7,000돌턴이며, 보다 바람직하게는 2,000~5,000돌턴이다.
다이아실포스파티딜에탄올아민에 있어서의 아실의 탄소수는 16 이상이 바람직하고, 예를 들면 탄소수 16 이상 30 이하가 바람직하며, 탄소수 16 이상 24 이하가 보다 바람직하고, 탄소수 20이 더 바람직하다.
폴리에틸렌글라이콜류로 수식된 다이아실포스파티딜에탄올아민으로서는, 예를 들면 1,2-다이스테아로일-3-포스파티딜에탄올아민-PEG2000(니혼 유시사제), 1,2-다이스테아로일-3-포스파티딜에탄올아민-PEG5000(니혼 유시사제) 및 다이스테아로일글리세롤-PEG2000(니혼 유시사제) 등의 1,2-다이스테아로일-3-포스파티딜에탄올아민폴리에틸렌글라이콜을 들 수 있다.
리포솜막의 구성 성분(리포솜을 구성하는 전체 지질)에 있어서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민의 비율은, 바람직하게는 1~15몰%이고, 보다 바람직하게는 2~10몰%이다.
콜레스테롤류로서, 사이클로펜타하이드로페난트렌을 기본 골격으로 하여, 그 일부 혹은 전부의 탄소가 수소화되어 있는 콜레스테롤 및 그 유도체를 들 수 있다. 예를 들면, 콜레스테롤이 바람직하다. 리포솜의 평균 입자경을 100nm 이하로 미세화해 가면, 지질막의 곡률이 높아지는 경우가 있다. 리포솜에 있어서 배열한 막의 변형도 커진다. 지질에 의한 막의 변형을 메우기(막안정화 효과) 위하여, 콜레스테롤 등을 첨가하는 것이 유효하다.
리포솜에 있어서, 콜레스테롤의 첨가는, 리포솜의 막의 간극을 메우는 것 등에 의하여, 리포솜의 막의 유동성을 낮추는 것이 기대된다.
리포솜막의 구성 성분(리포솜을 구성하는 지질)에 있어서의 콜레스테롤의 비율은, 바람직하게는 20몰%~50몰%이고, 보다 바람직하게는 30몰%~45몰%이며, 더 바람직하게는 35~43몰%이다.
리포솜에는, 상기의 성분 외에, 혈중 체류성의 개선을 위하여 친수성 고분자 등, 막 구조의 안정화제로서 지방산 또는 다이아세틸포스페이트 등, 항산화제로서 α-토코페롤 등을 첨가해도 된다. 본 발명에서는, 의약 용도에 있어서 정맥 주사 용도로의 사용이 인정되지 않은 분산 조제(助劑) 등의 첨가제, 예를 들면 계면활성제 등을 이용하지 않는 것이 바람직하다.
(약물)
본 발명의 리포솜 조성물은, 약물을 내포한다.
약물의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 이하에 예시하는 항암제를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 독소루비신, 다우노루비신 및 에피루비신 등의 안트라사이클린계 항암제;
시스플라틴 및 옥살리플라틴 등의 시스플라틴계 항암제;
파클리탁셀 및 도세탁셀 등의 탁세인계 항암제;
빈크리스틴 및 빈블래스틴 등의 빈카알칼로이드계 항암제;
블레오마이신 등의 블레오마이신계 항암제;
시롤리무스 등의 시롤리무스계 항암제;
토포테칸(노기테칸이라고도 함), 이리노테칸, 카레니테신(등록 상표)(BNP1350이라고도 함), 엑사테칸, 루르토테칸, 지마테칸(ST1481이라고도 함) 및 벨로테칸(CKD602라고도 함) 등의 캄프토테신계 항암제;
메토트렉세이트, 플루오로유라실, 젬시타빈, 사이타라빈 및 페메트렉시드 등의 대사 길항제; 그리고
이마티닙(글리벡(등록 상표)), 에베롤리무스(아피니토르(등록 상표)), 에를로티닙(타세바(등록 상표)), 제피티닙(이레사(등록 상표)), 수니티닙(수텐트(등록 상표)), 소라페닙(넥사바르(등록 상표)), 다사티닙(스프라이셀(등록 상표)), 타미바로텐(암노레이크(등록 상표)), 트레티노인(베사노이드(등록 상표)), 보르테조밉(벨케이드(등록 상표)) 및 라파티닙(타이커브(등록 상표)) 등의 분자 표적약을 들 수 있다.
상기 중에서도 토포테칸(노기테칸이라고도 함), 독소루비신, 이리노테칸 또는 수니티닙이 바람직하고, 토포테칸이 보다 바람직하다.
약물은, 염의 형태로 하여 사용해도 된다.
약물의 염으로서는, 통상 알려져 있는 아미노기 등의 염기성기, 하이드록실기 및 카복실기 등의 산성기에 있어서의 염을 들 수 있다.
염기성기에 있어서의 염으로서는, 예를 들면 염산, 브로민화 수소산, 인산, 붕산, 질산 및 황산 등의 광산(鑛酸)과의 염; 폼산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 옥살산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 말산, 타타르산, 아스파라진산, 트라이클로로아세트산 및 트라이플루오로아세트산 등의 유기 카복실산과의 염; 그리고 메테인설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 메시틸렌설폰산 및 나프탈렌설폰산 등의 설폰산과의 염을 들 수 있다.
산성기에 있어서의 염으로서는, 예를 들면 나트륨 및 칼륨 등의 알칼리 금속 과의 염; 칼슘 및 마그네슘 등의 알칼리 토류 금속과의 염; 암모늄염; 그리고 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 트라이뷰틸아민, 피리딘, N,N-다이메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모폴린, 다이에틸아민, 다이사이클로헥실아민, 프로카인, 다이벤질아민, N-벤질-β-펜에틸아민, 1-에펜아민 및 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민 등의 함질소 유기 염기와의 염 등을 들 수 있다.
리포솜 조성물에 있어서의 약물의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 리포솜 조성물에 대하여 0.025~20mg/ml인 것이 바람직하고, 0.25~10mg/ml인 것이 보다 바람직하다.
리포솜막을 형성하는 지질에 대한 리포솜에 내포된 약물량은, 리포솜으로부터의 방출 속도, 리포솜 내부의 침투압이나 침전된 약물에 의한 리포솜 형상의 관점에서, 몰비로 0.1~1.5가 바람직하고, 0.2~0.3이 보다 바람직하다.
지질에 대한 약물량의 몰비가 너무 낮은 경우, 단위 약물량에 대한 리포솜막의 면적이 커짐으로써 약물의 리포솜으로부터의 방출 속도가 커져, 혈중 체류성을 향상시키는 기능이 손상된다. 한편, 지질에 대한 약물량의 몰비가 너무 높은 경우는, 리포솜 내부의 침투압이 약물의 용해량이 증가함으로써 상승하여 리포솜이 파괴되거나, 또는 약물이 리포솜 내부에서 침전하는 경우는 침전한 고형물이 크게 성장하여 리포솜 형상이 변형되게 된다.
(내수상에 있어서의 황산 암모늄)
본 발명에 있어서의 리포솜의 내수상은, 황산 암모늄을 포함한다. 또, 본 발명의 제1 형태인 리포솜 조성물에 있어서는, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비는 0.36 이상이며, 바람직하게는 0.4 이상이다. 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비는, 보다 바람직하게는 0.4 이상 1.8 이하이며, 더 바람직하게는 0.6 이상 1.8 이하이다. 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비를 상기와 같이 설정함으로써, 혈중에서의 리포솜으로부터의 약물의 누출을 억제할 수 있다. 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 너무 낮으면, 약물의 황산염에 의한 고형물의 형성이 불완전해지고, 리포솜 내에서 리포솜막의 투과성이 높아지는 용해 상태의 약물의 농도가 높아지며, 약물이 리포솜으로부터 누출되기 쉬워져, 혈중 체류성 향상의 효과를 손상시킨다. 또, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 너무 높으면, 리포솜 내부의 침투압이 높아져, 리포솜 구조의 파괴를 초래하기 때문에, 약물이 리포솜으로부터 누출되기 쉬워져, 혈중 체류성 향상의 효과를 손상시킨다.
또, 본 발명에 있어서 리포솜의 내수상에 포함되는 황산 이온의 리포솜 조성물 전체의 황산 이온에 대한 비율(황산 이온의 내수상률)이, 적어도 80%인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 보다 바람직하며, 동시에, 리포솜의 내수상에 포함되는 약물의 리포솜 조성물 전체의 약물에 대한 비율(약물의 내수상률)이, 적어도 80%인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 보다 바람직하다.
리포솜 중의 약물 농도는, 예를 들면 액체 크로마토그래피/자외 가시 흡광도 검출법에 의하여 측정할 수 있다. 또, 리포솜의 내수상의 황산 이온 농도는, 예를 들면 이온 크로마토그래피에 의하여 측정할 수 있다.
(외수상의 pH)
본 발명의 리포솜 조성물은, 약물을 내포하는 리포솜과, 상기 리포솜을 분산시키는 수성 용매(외수상)를 포함할 수 있다. 외수상의 pH는, 중성인 것이 바람직하고, 구체적으로 pH5.5~8.5 정도인 것이 바람직하다.
약물의 누출을 극도로 지나치게 억제하면, 환부, 특히 종양부에서의 약물의 누출도 억제되어, 기대한 정도의 약효가 얻어지지 않는 경우가 있다.
본 발명의 리포솜 조성물은, 혈중에서의 약제 누출을 억제하고, 충분한 양의 약물을 종양부에 송달시키며, 또한 종양부에서는 신속하게 약물을 방출하는 놀랄 만한 기구를 겸비하고 있다.
종양부에 있어서는, 혈중 등 그 외 장기에 비하여 암모늄 농도가 높다는 성질이 있고(인용 논문: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850), 본 발명의 리포솜 조성물은, 종양과 같이 글루타민 분해가 항진되어 암모늄 농도가 높은(5mmol/L) 환경에서, 약물의 릴리스가 매우 증대된다.
본 발명의 리포솜 조성물은, 암모늄 농도가 1mmol/L 이하인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 20%/24시간 이하이며, 암모늄 농도가 4~6mmol/L인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가 60%/24시간 이상이고, 보다 바람직하게는, 암모늄 농도가 1mmol/L 이하인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 15%/24시간 이하이며, 암모늄 농도가 4~6mmol/L인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 약물의 릴리스 속도가 70%/24시간 이상이다.
(리포솜 조성물의 제조 방법)
본 발명의 리포솜 조성물의 제조 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 일례로서,
(a) 유상(油相)의 조제;
(b) 수상(水相)의 조제;
(c) 유화(乳化)에 의한 리포솜 입자 형성;
(d) 익스트루더에 의한 정립(整粒);
(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환;
(f) 리모트 로딩에 의한 약물의 리포솜 입자로의 내포; 및
(g) 투석에 의한 외수상 약물의 제거:
의 공정에 의하여 제조할 수 있다. (d) 익스트루더에 의한 정립은, 행해도 되고, 행하지 않아도 된다.
<(a) 유상의 조제>
(a) 유상의 조제에 있어서는, 리포솜을 구성하는 각 성분(친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤류)과 유기 용매를 혼합하고, 혼합물을 가온하여 상기 성분을 용해시킴으로써 유상을 제조할 수 있다.
유상에 있어서 사용하는 유기 용매는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 물과 임의로 혼합되는 수용성 유기 용매를 이용할 수 있다.
수용성 유기 용매로서는, 예를 들면 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올 및 t-뷰탄올 등의 알코올류, 글리세린, 에틸렌글라이콜 및 프로필렌글라이콜 등의 글라이콜류, 폴리에틸렌글라이콜 등의 폴리알킬렌글라이콜류 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 알코올류가 바람직하다. 알코올류로서는, 에탄올, 메탄올, 2-프로판올 및 t-뷰탄올로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하고, 에탄올, 2-프로판올 및 t-뷰탄올로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 보다 바람직하며, 에탄올인 것이 더 바람직하다.
리포솜을 구성하는 각 성분의 농도는, 특별히 한정되지 않고, 적절히 조정하는 것이 가능하다.
<(b) 수상의 조제>
수상으로서는, 물(증류수, 주사용수 등), 생리 식염수, 각종 완충액 또는 당류(수크로스 등)의 수용액 및 이들의 혼합물(수성 용매)을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 후술하는 리모트 로딩에 의하여 약물을 리포솜 입자에 내포시키는 경우에는, 수상으로서 황산 암모늄 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
완충액으로서는, 유기계, 무기계에 한정되는 것은 아니지만, 체액에 가까운 수소 이온 농도 부근에 완충 작용을 갖는 완충액이 적합하게 이용되고, 인산 완충액, 트리스 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액 및 굿 버퍼 등을 들 수 있다. 리포솜의 내수상은, 리포솜을 제조할 때에, 리포솜을 분산시키는 수용액이어도 되고, 새롭게 첨가되는, 물, 생리 식염수, 각종 완충액 또는 당류의 수용액 및 이들의 혼합물이어도 된다. 외수상 또는 내수상으로서 이용하는 물은, 불순물(먼지, 화학 물질 등)을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
생리 식염수란, 인체와 등장(等張)이 되도록 조정된 무기염 용액을 의미하고, 추가로 완충 기능을 갖고 있어도 된다. 생리 식염수로서는, 염화 나트륨을 0.9w/v%(질량/체적 퍼센트) 함유하는 식염수, PBS 및 트리스 완충 생리 식염수 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 수상이란, 외수상 및 내수상의 양쪽 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서의 외수상이란, 리포솜을 분산시키는 수용액을 의미한다. 예를 들면 주사제의 경우에 있어서는, 바이알병 또는 프리필드 시린지 포장되어 보관된 리포솜의 분산액의 리포솜의 외측을 차지하는 용액이 외수상이 된다. 또, 첨부된 분산 용액 또는 그 외 용해액에 의하여 투여 시에 용시(用時) 분산한 액에 대해서도 마찬가지로, 리포솜의 분산액의 리포솜의 외측을 차지하는 용액이 외수상이 된다.
본 발명에 있어서의 내수상이란, 리포솜의 지질 이중막을 사이에 둔 폐쇄 소포 내의 수상을 의미한다.
<(c) 유화에 의한 리포솜 입자 형성>
유화 공정에서는, 유상과 수상을 혼합하여 지질을 포함하는 수용액을 교반하여 유화시킬 수 있다. 지질이 유기 용매에 용해되어 있는 유상 및 수상을 혼합하여 교반하고, 유화시킴으로써, 유상 및 수상이 O/W형(수중유형(水中油型))으로 유화된 유화액이 조제된다. 혼합 후, 유상 유래의 유기 용매의 일부 또는 전부를 증발에 의하여 제거함으로써, 리포솜이 형성된다. 또는, 유상 중의 유기 용매의 일부 또는 전부가 교반·유화의 과정에서 증발하여, 리포솜이 형성된다.
교반하는 방법으로서는, 입자 미세화를 위하여, 초음파 또는 기계적 전단이 이용된다. 또, 입자경의 균일화를 위해서는, 일정한 구멍 직경의 필터를 통과시키는 익스트루더 처리 또는 마이크로플루이다이저 처리를 행할 수 있다. 익스트루더 등을 이용하면, 부차적으로 형성된 다포 리포솜을 분해하여 단포 리포솜으로 할 수 있다.
유화 공정은, 유화하는 공정이면 한정되지는 않지만, 바람직하게는 고전단을 가하여, 유기 용매를 포함하는 유화 공정으로 미립자화하는 공정이다. 고전단은, 유화기의 교반 날개의 주속으로 정의되고, 5m/s~32m/s가 바람직하며, 특히 20m/s~30m/s가 바람직하다. 필요에 따라서, 유화 공정에서 이용한 유기 용매를 증발시킴으로써(탈용매함으로써) 리포솜을 형성할 수 있다.
리포솜을 제조할 때의 유화 공정의 액온은, 적절히 조정하는 것이 가능하지만, 유상과 수상과의 혼합 시의 액온을 사용하는 지질의 상전이 온도 이상으로 하는 것이 바람직하고, 예를 들면 상전이 온도가 35~40℃인 지질을 사용하는 경우, 35℃~70℃로 하는 것이 바람직하다.
유화 공정에 있어서는, 리포솜을 포함하는 수용액으로부터 유기 용매와 물을 증발시켜도 된다. 여기에서 말하는 증발이란, 유상 유래의 유기 용매와 수상 유래의 물의 일부 또는 전부를 증발 공정으로서 강제적으로 제거해도 되고, 유상 유래의 유기 용매와 수상 유래의 물의 일부 또는 전부가 교반·유화의 과정에서 자연스럽게 증발하는 것이어도 된다.
증발의 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 유기 용매와 물을 가열함으로써 증발시키는 공정, 유화 후에 정치 또는 완만한 교반을 계속하는 공정, 및 진공 탈기를 행하는 공정 중 적어도 하나를 행하면 된다.
<(d) 익스트루더에 의한 정립>
얻어진 리포솜은, 투석법, 여과법 또는 익스트루젼 처리 등을 이용하여 입경을 균일하게 할 수 있다.
익스트루젼 처리란, 미세 구멍을 갖는 필터에 리포솜을 통과시킴으로써, 물리적인 전단을 실시하여, 미립화하는 공정을 의미한다. 리포솜을 통과시킬 때, 리포솜 분산액 및 필터를, 리포솜을 구성하는 막의 상전이 온도 이상의 온도로 보온함으로써, 신속하게 미립화할 수 있다.
또한, 익스트루더에 의한 정립은 행해도 되고, 행하지 않아도 된다.
<(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환>
본 발명에 있어서, 리모트 로딩에 의하여 약물을 리포솜 입자에 내포시키는 경우에는, 투석에 의하여 리포솜 외수상액을 치환해도 된다. 투석액으로서, 0.05~5질량%의 NaCl 수용액을 사용할 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 상기한 투석액을 이용하여, 리포솜액을 투석함으로써, 외수상에 존재하는 황산 암모늄을 제거하고, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜을 얻을 수 있다.
<(f) 리모트 로딩법에 의한 약물의 리포솜 입자로의 내포>
본 발명에 있어서는, 리모트 로딩법에 의하여 약물을 리포솜 입자에 내포시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 리모트 로딩법이란, 약물이 내포되어 있지 않은 빈 리포솜을 제조하고, 리포솜 외액에 약물을 첨가함으로써 리포솜에 약물을 도입하는 방법을 의미한다. 리모트 로딩의 방법에 대해서는, 특별히 한정되지 않지만, 암모늄염을 이용한 방법이 바람직하고, 황산 암모늄을 이용한 방법이 보다 바람직하다.
리모트 로딩법에서는, 외액에 첨가된 약물이, 능동적으로 리포솜으로 이행하여, 리포솜으로 들어간다. 이 드라이빙 포스로서는, 용해도 구배, 이온 구배, pH 구배 등이 이용되고 있다. 예를 들면, 리포솜막을 사이에 두고 형성되는 이온 구배를 이용하여 약물을 리포솜 내부에 도입하는 방법이 있다. 예를 들면, Na+/K+ 농도 구배를 이용하여 리모트 로딩법에 의하여 미리 형성되어 있는 리포솜 중에 약물을 첨가하는 기술이 있다.
이온 구배 중에서도 프로톤 농도 구배가 일반적으로 이용되고, 예를 들면 리포솜막의 내측(내수상) pH가, 외측(외수상) pH보다 낮은 pH 구배를 갖는 양태를 들 수 있다. pH 구배는, 구체적으로, 암모늄 이온 구배의 농도 구배 등에 의하여 형성할 수 있다.
<(g) 투석에 의한 외수상 약물의 제거>
약물을 내포한 리포솜액은, 리포솜에 포함되지 않았던 약물을 제거하기 위하여, 투석을 행해도 된다. 예를 들면, 소정 농도의 수크로스/히스티딘 버퍼를 투석액으로서 이용하고, 약물을 내포한 리포솜액에 대하여, 투석을 행함으로써, 외수상에 존재하는 약물을 제거하여, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜 조성물을 얻을 수 있다.
<무균 여과>
상기에서 얻어진 리포솜 조성물은, 무균 여과를 행하는 것이 바람직하다. 여과 방법으로서는, 중공사막, 역침투막 또는 멤브레인 필터 등을 이용하여, 리포솜을 포함하는 수용액으로부터 불필요한 것을 제거할 수 있다. 본 발명에서는, 멸균할 수 있는 구멍 직경을 갖는 필터(바람직하게는 0.2μm의 여과 멸균 필터)에 의하여 여과하는 것이 바람직하다.
리포솜의 변형에 의한 평균 입자경에 대한 영향을 방지하기 위하여, 무균 여과 공정 및 후술하는 무균 충전 공정은, 리포솜을 구성하는 지질의 상전이 온도 이하에서 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 지질의 상전이 온도가 50℃ 부근인 경우, 0~40℃ 정도가 바람직하고, 보다 구체적으로는 5~30℃ 정도에서 제조되는 것이 바람직하다.
<무균 충전>
무균 여과의 후에 얻어진 리포솜 조성물은, 의료 용도로서 무균 충전하는 것이 바람직하다. 무균 충전의 방법은 공지의 것을 적용할 수 있다. 용기에 무균적으로 충전함으로써 의료용으로서 적합한 리포솜 조성물을 조제할 수 있다.
(의약 조성물)
본 발명의 리포솜 조성물은, 투여 경로에 관련하여, 의약적으로 허용되는 등장화제, 안정화제, 산화 방지제, 및 pH 조정제 중 적어도 1종을 포함해도 된다. 즉, 본 발명의 리포솜 조성물은, 의약 조성물로서 제공할 수 있다.
등장화제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 염화 나트륨, 염화 칼륨, 인산 수소 나트륨, 인산 이수소 나트륨, 인산 이수소 칼륨과 같은 무기염류, 글리세롤, 만니톨, 소비톨과 같은 폴리올류, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 또는 수크로스와 같은 당류를 들 수 있다.
안정화제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 글리세롤, 만니톨, 소비톨, 락토스, 또는 수크로스와 같은 당류를 들 수 있다.
산화 방지제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 아스코브산, 요산(尿酸), 토코페롤 동족체(예를 들면, 비타민 E, 토코페롤 α, β, γ, δ의 4개의 이성체) 시스테인, EDTA(에틸렌다이아민 사아세트산) 등을 들 수 있다. 안정화제 및 산화 방지제는, 각각 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
pH 조정제로서는, 수산화 나트륨, 시트르산, 아세트산, 트라이에탄올아민, 인산 수소 나트륨, 인산 이수소 나트륨, 인산 이수소 칼륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 리포솜 조성물은, 의약적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리바이닐알코올, 폴리바이닐피롤리돈, 카복시바이닐 폴리머, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알진산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 스타치 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 잔탄검, 아라비아검, 카세인, 젤라틴, 한천, 다이글리세린, 프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소비톨, 락토스, 인산 완충 생리 식염수(PBS), 염화 나트륨, 당류, 생체 내분해성 폴리머, 무혈청 배지, 의약 첨가물로서 허용되는 첨가물을 함유해도 된다.
본 발명의 리포솜 조성물을 충전하는 용기는, 특별히 한정되지 않지만, 산소 투과성이 낮은 재질인 것이 바람직하다. 예를 들면, 플라스틱 용기, 유리 용기, 알루미늄박, 알루미늄 증착 필름, 산화 알루미늄 증착 필름, 산화 규소 증착 필름, 폴리바이닐알코올, 에틸렌바이닐알코올 공중합체, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리 염화 바이닐리덴 등을 가스 배리어층으로서 갖는 래미네이팅 필름에 의한 백 등을 들 수 있고, 필요에 따라서, 착색 유리, 알루미늄박이나 알루미늄 증착 필름 등을 사용한 백 등을 채용함으로써 차광할 수도 있다.
리포솜 조성물을 충전하는 용기에 있어서, 용기 내의 공간부에 존재하는 산소에 의한 산화를 방지하기 위하여, 용기 공간부 및 약액 중의 가스를 질소 등의 불활성 가스로 치환하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 주사액을 질소 버블링하여, 용기로의 충전을 질소 분위기하에서 행하는 것을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로서는, 비경구적 투여가 바람직하다. 예를 들면, 점적(点滴) 등의 정맥 내 주사(정주), 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 안내(眼內) 주사 및 수강(髓腔) 내 주사를 들 수 있다. 투여 방법으로서는, 시린지 또는 점적에 의한 투여를 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량 및 투여 횟수는, 약물의 종류, 환자의 상태 등에 따라 적절히 설정하면 되고, 유효 성분인 약물량으로서, 1일당, 일반적으로는 0.01mg/kg~100mg/kg의 범위로 설정할 수 있다. 유효 성분인 약물량으로서, 1회당, 2mg~10mg의 범위로 설정할 수 있다. 단, 이들 투여량에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은, 바람직하게는 항암제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 적용 대상인 암의 종류는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 폐암(특히, 소세포 폐암), 난소암, 소아 고형 종양, 자궁 경부암, 유방암, 전립선암, 자궁체암, 위(위선)암, 비소세포 폐암, 췌장암, 경부 편평 상피암, 식도암, 방광암, 멜라노마, 대장암, 신세포암, 비호지킨 림프종, 요로 상피암, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 성인 T세포 백혈병, 골수 전이암, 육종, 연부 조직 종양, 만성 골수 단구성 백혈병, 호지킨 림프종, 피부 T세포 림프종 등을 들 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에서 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 실시예에 한정되는 것은 아니다.
SM은, 스핑고미엘린(Sphingomyelin)(COATSOME NM-10, 니치유제)을 나타낸다.
계란 유래 DHSM은, 계란 유래의 SM을 수소 첨가함으로써 얻은 다이하이드로스핑고미엘린(Dihydrosphingomyelin)(COATSOME NM-10(니치유제)에 대하여 수소 첨가한 합성품)을 나타낸다. 이 계란 유래 DHSM은, 탄소수 16의 알킬쇄를 2개 가진 것이, 전체의 70~80%이며, 나머지는 알킬쇄 길이가 다른 DHSM을 포함하는 혼합물이다.
전체 합성 DHSM은, 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 하기 화합물을 98% 이상 포함하도록 화학 합성에 의하여 제작된 다이하이드로스핑고미엘린(Dihydrosphingomyelin)을 나타낸다.
[화학식 2]
Figure 112019098238813-pct00002
PEG 인 지질(표 중에서는 PEG로 표기)로서는, SUNBRIGHT DSPE-020CN, 니치유제(이하, DSPE-PEG로 함)를 사용했다.
콜레스테롤(표 중에서는 Chol로 표기)로서는, Cholesterol HP(닛폰 세이카사제)를 사용했다.
<비교예 1~10>
(a) 유상의 조제
비교예 1에 대해서는, SM, PEG 인 지질, 콜레스테롤을 각각 11.52g, 4.32g, 4.32g 칭량했다. 비교예 2~10에 대해서는, 표 1에 기재된 비율이 되도록, SM 또는 계란 유래 DHSM, PEG 인 지질, 콜레스테롤의 양을 변경했다. 이 지질을 381mL의 에탄올과 혼합하고, 65℃에서 용해하여 유상으로 했다.
(b1) 수상 1의 조제
황산 암모늄 25.2g을 물 1118.5g에 용해하여, 수상 1을 조제했다.
(b2) 수상 2의 조제
황산 암모늄 5.04g을 물 223.7g에 용해하여, 수상 2를 조제했다.
(c) 유화에 의한 리포솜 입자 형성
(b1)에서 조제한 수상 1을 65℃로 가온하고, (a)에서 조제한 유상 전체량을 첨가한 후, 정밀 유화 분산기로, 주속 26m/s로 60분간 혼합했다. 계속해서, 실온의 수상 2를 첨가한 후, 65℃에서 가온하면서 주속 0.1m/s로 교반을 계속함으로써 유기 용매와 물을 증발시켜, 액이 600mL까지 농축된 시점에서 가온과 교반을 멈추어, 증발을 정지시켰다.
(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환
투석액으로서 3.15질량%의 NaCl 수용액을 이용했다. 이 투석액을 이용하고, (c)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 크로스 플로 필트레이션을 이용하여, 외수상에 존재하는 황산 암모늄을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜을 얻었다.
(f) 리모트 로딩에 의한 토포테칸의 리포솜 입자로의 내포
토포테칸 염산염(Biocompounds사제)에 주사용수를 첨가하여, 5mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 토포테칸을 용해시켰다. 이 토포테칸 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 60℃에서 60분간 가온했다.
(g) 투석에 의한 외수상 토포테칸의 제거
투석액으로서 9.4질량% 수크로스, 10mmol/L 히스티딘으로 이루어지는 수크로스/히스티딘 버퍼를 조제했다. 이 투석액을 이용하고, (f)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 크로스 플로 필트레이션을 이용하여, 외수상에 존재하는 토포테칸을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 토포테칸 함유 리포솜을 얻었다.
<비교예 11 및 12>
(a) 유상의 조제
비교예 11에 대해서는, 계란 유래 DHSM, 및 콜레스테롤을 각각, 0.517g 및 0.233g 칭량했다. 비교예 12에 대해서는, 표 1에 기재된 비율이 되도록, SM, 및 콜레스테롤의 양을 변경했다. 리포솜을 DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)로 표지하기 위하여, 전체 지질에 대하여 0.2mol%가 되는 분량의 DiI를 칭량하고, 에탄올에 용해시켰다. 이 DiI 에탄올 용액에 에탄올을 첨가하여, 전체량으로 1.5mL로 하고, 칭량한 지질과 이 유기 용매를 혼합하며, 65℃로 가온하여 지질을 용해하여 유상으로 했다.
(b) 수상의 조제
황산 암모늄 0.9g 및 수크로스 2.16g을 물 13.5g에 용해하여, 수상을 조제했다.
(c) 유상과 수상 혼합에 의한 리포솜 입자 형성
(b)에서 조제한 수상을 65℃로 가온하고, 마그네틱 스터러로 교반한다(3000rpm). (a)에서 조제한 유상 전체량을 핫플레이트로 65℃로 가온하고, 유상 전체량을 시린지로 빨아들여 5분간 핫플레이트로 가온한다. 가온되어 있는 수상에, 유상을 30초 동안 적하한다.
(d) 익스트루더에 의한 정립
70℃의 가온하에서 익스트루더(Mini Extruder, Avanti Polar Lipids사제)를 이용하고, (c)에서 얻은 액을 필터에 차례로 통과시킴으로써 정립했다.
(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환
투석액으로서 0.09질량%의 NaCl 수용액을 이용했다. 이 투석액을 이용하여, (c) 또는 (d)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 투석을 행하고, 외수상에 존재하는 황산 암모늄을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜을 얻었다.
(f) 리모트 로딩에 의한 토포테칸의 리포솜 입자로의 내포
토포테칸 염산염(Biocompounds사제)에 주사용수를 첨가하여, 5mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 토포테칸을 용해시켰다. 이 토포테칸 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 60℃에서 120분간 가온했다.
(g) 투석에 의한 외수상 토포테칸의 제거
투석액으로서 9.4질량% 수크로스 및 10mmol/L 히스티딘으로 이루어지는 수크로스/히스티딘 버퍼를 조제했다. 이 투석액을 이용하며, (f)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 투석을 행하고, 외수상에 존재하는 토포테칸을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 토포테칸 함유 리포솜을 얻었다.
<실시예 1~8>
(a) 유상의 조제
실시예 1에 대해서는, 계란 유래 DHSM, PEG 인 지질(SUNBRIGHT DSPE-020CN, 니치유제, 이하, DSPE-PEG라고 함), 및 콜레스테롤을 각각 11.52g, 4.32g, 및 4.32g 칭량했다. 실시예 2~8에 대해서는, 표 2에 기재된 비율이 되도록, DHSM, DSPE-PEG, 및 콜레스테롤의 양을 변경했다. 이 지질을 381mL의 에탄올과 혼합하고, 65℃에서 용해하여 유상으로 했다.
(b1) 수상 1의 조제
황산 암모늄 25.2g을 물 1118.5g에 용해하여, 수상 1을 조제했다.
(b2) 수상 2의 조제
황산 암모늄 5.04g을 물 223.7g에 용해하여, 수상 2를 조제했다.
(c) 유화에 의한 리포솜 입자 형성
(b1)에서 조제한 수상 1을 65℃로 가온하고, (a)에서 조제한 유상 전체량을 첨가한 후, 정밀 유화 분산기로, 주속 26m/s로 60분간 혼합했다. 계속해서, 실온의 수상 2를 첨가한 후, 65℃에서 가온하면서 주속 0.1m/s로 교반을 계속함으로써 유기 용매와 물을 증발시켜, 액이 600mL까지 농축된 시점에서 가온과 교반을 멈추어, 증발을 정지시켰다.
(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환
투석액으로서 3.15질량%의 NaCl 수용액을 이용했다. 이 투석액을 이용하고, (c)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 크로스 플로 필트레이션을 이용하여, 외수상에 존재하는 황산 암모늄을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜을 얻었다.
(f) 리모트 로딩에 의한 토포테칸의 리포솜 입자로의 내포
토포테칸 염산염(Biocompounds사제)에 주사용수를 첨가하여, 5mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 토포테칸을 용해시켰다. 이 토포테칸 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 60℃에서 60분간 가온했다.
(g) 투석에 의한 외수상 토포테칸의 제거
투석액으로서 9.4질량% 수크로스, 10mmol/L 히스티딘으로 이루어지는 수크로스/히스티딘 버퍼를 조제했다. 이 투석액을 이용하고, (f)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 크로스 플로 필트레이션을 이용하여 외수상에 존재하는 토포테칸을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 토포테칸 함유 리포솜을 얻었다.
<실시예 9 및 10>
(a) 유상의 조제
실시예 9에 대해서는, 계란 유래 DHSM, DSPE-PEG, 콜레스테롤을 각각 0.412g, 0.153g, 및 0.153g 칭량했다. 실시예 10에 대해서는, 표 2에 기재된 비율이 되도록, 계란 유래 DHSM, DSPE-PEG, 및 콜레스테롤의 양을 변경했다. 리포솜을 DiI로 표지하기 위하여, 전체 지질에 대하여 0.2mol%가 되는 분량의 DiI를 칭량하고, 에탄올에 용해시켰다. 이 DiI 에탄올 용액에 에탄올을 첨가하여, 전체량으로 11.25mL로 하고, 추가로 아세트산 에틸 3.75mL를 첨가했다. 칭량한 지질과 이 유기 용매를 혼합하고, 60℃로 가온하여 지질을 용해하여 유상으로 했다.
(b) 수상의 조제
황산 암모늄 0.9g을 물 40g에 용해하여, 수상을 조제했다.
(c) 유화에 의한 리포솜 입자 형성
(b)에서 조제한 수상을 70℃로 가온하고, (a)에서 조제한 유상 전체량을 첨가한 후(용적비: 수상/유상=8/3), 유화기(엑셀 오토 호모지나이저 ED-3, 니혼 세이키 세이사쿠쇼제)로, 3000rpm(rotation per minute: 1/60s- 1)으로 30분간 혼합했다. 계속해서, 65℃에서 가온하면서 300rpm으로 교반을 계속함으로써 유기 용매와 물을 증발시켜, 액이 15g까지 농축된 시점에서 가온과 교반을 멈추어, 증발을 정지시켰다.
(d) 익스트루더에 의한 정립
70℃의 가온하에서 익스트루더(Mini Extruder, Avanti Polar Lipids사제)를 이용하고, (c)에서 얻은 액을 필터에 차례로 통과시킴으로써 정립했다.
(e) 투석에 의한 리포솜 외수상액의 치환
투석액으로서 0.09질량%의 NaCl 수용액을 이용했다. 이 투석액을 이용하여, (c) 또는 (d)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 투석을 행하고, 외수상에 존재하는 황산 암모늄을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 리포솜을 얻었다.
(f) 리모트 로딩에 의한 토포테칸의 리포솜 입자로의 내포
토포테칸 염산염(Biocompounds사제)에 주사용수를 첨가하여, 5mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 토포테칸을 용해시켰다. 이 토포테칸 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 60℃에서 120분간 가온했다.
(g) 투석에 의한 외수상 토포테칸의 제거
투석액으로서 9.4질량% 수크로스, 10mmol/L 히스티딘으로 이루어지는 수크로스/히스티딘 버퍼를 조제했다. 이 투석액을 이용하며, (f)에서 얻은 액에 대하여, 실온에서 투석을 행하고, 외수상에 존재하는 토포테칸을 제거하며, 투석액으로 외수상을 치환한 토포테칸 함유 리포솜을 얻었다.
[물성 측정 및 평가]
<평균 입자경>
본 발명에 있어서, 평균 입자경이란, 동적 광산란법에 의하여 측정되는 큐물런트 평균 입자경을 의미한다. 표에 기재된 각 실시예 및 비교예의 평균 입자경은, 오토샘플러 장착 농후계 입경 애널라이저 FPAR-1000AS(오쓰카 덴시사제)에 의하여 동적 광산란법으로 측정한 큐물런트 평균 입자경이다. 측정 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다.
<토포테칸 농도 측정>
HPLC(고속 액체 크로마토그래피) 장치 Nexera-iLC-2040C(시마즈사제)로, 샘플을 측정하고, 토포테칸 농도를 정량한 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 구체적인 측정 방법은 다음과 같다.
표 1 및 2의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 약물의 리포솜 조성물 전체의 약물에 대한 비율은, 비교예 10을 제외하면 적어도 95%였다. 비교예 10은 59%였다.
리포솜 제제 중의 토포테칸량의 측정
조제한 리포솜액을 메탄올에 녹여 필터 여과한 시료 용액, 및 토포테칸 염산염을 희석 조제한 검량선 표준액을 이용하여, 액체 크로마토그래피/자외 가시 흡광도 검출법에 의하여 측정했다.
내수상 토포테칸 농도는, 전체 수상 토포테칸 농도로부터 외수상 토포테칸 농도를 빼서 산출했다. 각 수상의 토포테칸 농도는 이하와 같이 측정했다.
(전체 수상 토포테칸 농도)
리포솜 분산액을 50μL 측정하여 취하고, 메탄올 950μL를 첨가하며, 보텍스로 1분간 교반했다. 그 액을 100μL를 측정하여 취하고, 밀리Q수를 900μL를 첨가하며, 보텍스를 1분간 교반하여, HPLC 분석용 샘플로 했다.
(외수상 토포테칸 농도)
리포솜 분산액을 50μL 측정하여 취하고, 9.4wt% 수크로스/10mM 히스티딘 수용액 450μL를 첨가하여 희석한다. 그 희석액 100μL에 PBS 200μL를 첨가하고, 전도(轉倒) 혼화했다. 이 분산액을 초원심 분리(200,000g, 20℃, 60분간)하여, 상청을 HPLC 분석 샘플로 했다. 초원심 분리기는, 히타치제 himacCP80WX를 사용했다.
a) 검량선 표준액의 조제
토포테칸 염산염 약 20mg을 계량하여, 20mL의 10질량% 메탄올 수용액에 녹였다. 이 액에 밀리Q수를 첨가하여, 토포테칸 염산 농도 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 또는 100.0ppm의 용액을 조제하고, 검량선 표준액으로 했다.
b) 시료 용액의 조제
(1) 시료(리포솜 제제 용액) 약 50μL를 마이크로맨(MICROMAN(등록 상표))으로 계량하여 취하고, 이에 마이크로맨으로 계량하여 취한 약 950μL의 메탄올을 첨가했다. 이때, 약 1분간 진탕하여, 용액이 투명해지는 것을 육안으로 확인했다.
(2) 상기 (1)의 용액 100μL를 마이크로맨으로 계량하여 취하고, 마이크로 피펫으로 계량하여 취한 약 900μL의 밀리Q수를 첨가했다. 이 액을 약 1분간 진탕한 후, 약 1분간 초음파 처리를 하고, 추가로 약 10초간 진탕했다.
(3) 상기 (2)의 용액을 DISMIC(등록 상표) 필터(구멍 직경 0.45μm)로 여과한 용액을 시료 용액으로 했다.
c) 측정
액체 크로마토그래피/자외 가시 흡광도 검출법에 의하여 이하의 조건으로 측정했다.
측정 파장: 382nm, 칼럼: 시세이도 CAPCELLPAK C18 ACR 3μm_3.0mm*75mm
칼럼 온도: 40℃ 부근의 일정 온도
이동상(移動相) A, B는 모두 물/메탄올/트라이플루오로아세트산 혼액이고, 이동상의 송액은 이동상 A 및 B의 혼합비를 변경하여 농도 구배를 제어했다.
유량: 분당 1.0mL, 주입량: 10μL, 오토샘플러 온도: 25℃ 부근의 일정 온도에서 측정을 행했다.
<황산 이온 농도 측정>
이온 크로마토 장치 883 Basic IC plus(Metrohm사제)로, 샘플을 측정하고, 황산 이온 농도를 정량했다. 토포테칸에 대한 황산 이온의 몰비를 측정한 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 표 1 및 2의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 황산 이온의 리포솜 조성물 전체의 황산 이온에 대한 비율이, 적어도 90%였다.
내수상 황산 이온 농도는, 전체 수상 황산 이온 농도로부터 외수상 황산 이온 농도를 뺄셈하여, 산출했다.
각 수상의 황산 이온 농도는 이하와 같이 측정했다.
(전체 수상 황산 이온 농도)
리포솜 분산액을 50μL 측정하여 취하고, 메탄올 950μL를 첨가하며, 초음파 처리를 15초 실시하여, 혼화했다. 그 액을 90μL를 측정하여 취하고, 주사용수(광제약제)를 810μL를 첨가하며, 초음파 처리를 30초 실시하여, 혼화했다. 이 용액에 아세트산 에틸 900μL를 첨가하고, 잘 흔들어 아세트산 에틸상으로 지질류를 추출했다. 수상의 액을 적당량은 측정하여 취하고, 이온 크로마토 분석에 사용했다.
(외수상 황산 이온 농도)
리포솜 분산액을 100μL 측정하여 취하고, 5% 포도당액(오쓰카 세이야쿠제) 900μL를 첨가하여 희석했다. 그 액 450μL를 한외 여과로 처리하고, 여과액을 이온 크로마토 분석 샘플로 했다.
원심 조건은, 7400g, 5℃, 30분. 원심 분리기는, 히타치제 himac CF15RXII를 사용했다.
<AUC의 측정>
조제한 토포테칸 함유 리포솜을 투여한 마우스(투여량은 약물량으로서 1mg/kg)에 대해서는, 투여 후 0.25, 2, 6, 24시간에 채혈했다. 혈액은 800×g, 10분간 원심하여, 혈장을 회수했다. 채취한 혈장에 대하여, 액체 크로마토그래피/질량 분석/질량 분석(LC/MS/MS)을 이용하여, 토포테칸 농도의 정량을 행했다. 얻어진 토포테칸 농도 추이로부터 약물 동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(등록 상표)(Certara)을 이용하여 단회 투여 후의 무한 시간까지의 혈중 농도-시간 곡선 하면적(AUC)을 산출했다. AUC의 단위는, 시간×ng/mL(표 중에서는, hr*ng/mL라고 표기)이다. 또한, 비특허문헌 1에 기재된 리포솜의 AUC는, 68152시간×ng/mL라고 계산된다.
[표 1]
Figure 112019098238813-pct00003
[표 2]
Figure 112019098238813-pct00004
표 1 및 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 리포솜막의 구성 성분으로서, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜 조성물에 있어서, 내수상이 황산 암모늄을 포함하고, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 이상인 실시예 1~10에 있어서, AUC의 측정값이 200000 이상이 되어, 높은 혈중 체류성을 달성할 수 있는 것이 나타났다. 한편, 다이하이드로스핑고미엘린을 사용하지 않는 비교예 1 내지 8, 전체 수상 약물에 대한 내수상 황산 이온의 몰비가 0.36 미만인 비교예 9 및 10, 친수성 고분자로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민을 사용하지 않는 비교예 11 및 12에 있어서는, AUC의 측정값이 200000 미만이며, 실시예 1 내지 10보다 뒤떨어지는 것이 나타났다.
<A549 피하 이식 마우스 모델을 이용한 약효 시험>
Balb/c/nu/nu 마우스(암컷, 6주령)에 인간 폐암 세포주인 A549 세포 1×107개를 우복측부 피하에 이식했다. 이식 후 15일째부터 실시예 10에서 조제한 토포테칸 함유 리포솜(약물량으로서 4mg/kg 및 2mg/kg, 주 1회 투여를 2회), 비교예 12에서 조제한 토포테칸 함유 리포솜(약물량으로서 4mg/kg 및 2mg/kg, 주 1회 투여를 2회)을 투여했다. 또, 음성 대조로서는 생리 식염액을 투여했다. 또, 비교 대조로서는, 토포테칸 수용액(약물량으로서 2mg/kg)을 투여했다. 투여 개시로부터 주 2회, 체중 및 종양 체적을 측정했다. 체중의 측정 결과를 도 1 및 도 2에 나타내고, 종양 체적의 측정 결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.
도 3 및 도 4의 결과로부터, 비교예 12에서 조제한 토포테칸 용액과 비교하여, 실시예 10에서 조제한 토포테칸 함유 리포솜은, 높은 약효를 나타내고, 효과는 용량에 의존하고 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 11~16, 비교예 13~16>
실시예 11~16에 대하여, 유상의 조정에 있어서의 콜레스테롤의 첨가량과 계란 유래 DHSM의 첨가량을, 표 3에 기재된 비율이 되도록, DHSM, DSPE-PEG, 및 콜레스테롤의 양을 변경한 것 이외에 대해서는, 실시예 1과 동일하게 제작했다. 예를 들면, 실시예 11에 대하여, 유상의 조정에 있어서의 콜레스테롤의 첨가량과 계란 유래 DHSM의 첨가량을, 콜레스테롤 3.6g, 계란 유래 DHSM 12.9g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 제작했다.
비교예 13~16에 대하여, 표 3에 기재된 비율이 되도록, SM, DSPE-PEG, 및 콜레스테롤의 양을 변경했다.
마찬가지로 입자경, 전체 수상 토포테칸 농도, 내수상 황산 이온 농도, AUC를 측정한 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 각 콜레스테롤양에 대한, AUC의 값을 도 5에 나타낸다.
표 3의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 약물의 리포솜 조성물 전체의 약물에 대한 비율은, 비교예 13을 제외하고 적어도 98%였다. 비교예 13은, 68%였다.
표 3의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 황산 이온의 리포솜 조성물 전체의 황산 이온에 대한 비율이, 비교예 13을 제외하고 적어도 90%였다. 비교예 13은, 71%였다.
[표 3]
Figure 112019098238813-pct00005
실시예 11~16, 비교예 1, 2, 4, 7, 13~16의 결과로부터, 계란 유래 DHSM을 이용한 리포솜이, SM 리포솜보다 폭넓은 콜레스테롤의 첨가 비율에 있어서, 본 발명은 양호한 AUC를 달성하는 것을 알 수 있다. 또 본 발명의 계란 유래 DHSM 리포솜에 있어서, 특히 콜레스테롤 비율이, 35~43몰%의 범위에서 AUC가 보다 양호한 것을 알 수 있다.
<실시예 17~24, 비교예 17~24>
<리포솜 분산액의 제작>
실시예 17~24, 비교예 17~24에 대하여, 유상의 조정에 있어서의 각 지질의 첨가량을 표 4와 같이 설정하고, 또, 리모트 로딩에 의하여 리포솜 입자에 내포하는 약물을 표 4와 같이 설정하며, 토포테칸 이외의 약제는, 하기의 <리모트 로딩에 의한 각 항암제의 리포솜 입자로의 내포>에 기재한 방법으로 약제를 내포한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 제작했다. 또, 실시예 17~24, 비교예 17~24에 대하여, 각각의 지질 구성비를 표 5에 나타낸다.
[표 4]
Figure 112019098238813-pct00006
[표 5]
Figure 112019098238813-pct00007
<리모트 로딩에 의한 각 항암제의 리포솜 입자로의 내포>
독소루비신의 내포(실시예 19, 20, 비교예 19, 20): 독소루비신 염산염(도쿄 가세이사제)에 주사용수를 첨가하여, 4mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 독소루비신 염산염을 용해시켰다. 이 독소루비신 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, pH7.0으로 조정한 분산액을 62℃에서 60분간 가온했다.
수니티닙의 내포(실시예 21, 22, 비교예 21, 22): 말산 수니티닙(토론토 리서치 케미컬즈사제)에 주사용수를 첨가하여, 5mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 말산 수니티닙을 용해시켰다. 이 수니티닙 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 62℃에서 60분간 가온했다.
이리노테칸의 내포(실시예 23, 24, 비교예 23, 24): 이리노테칸 염산염(도쿄 가세이사제)에 주사용수를 첨가하여, 4mg/mL로 했다. 또한, 액을 잘 교반하면서 8mol/L의 HCl 용액을 첨가하고, pH를 약 3으로 조정하여 이리노테칸 염산염을 용해시켰다. 이 이리노테칸 용액에 리포솜을 1/1의 용적비로 첨가한 후, 62℃에서 60분간 가온했다.
실시예 17~22, 비교예 17~22에 대하여, 본 실시예 중에 있어서 상기한 방법과 마찬가지로 AUC를 측정한 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure 112019098238813-pct00008
실시예 17~22, 비교예 17~22의 결과로부터, 토포테칸 및 수니티닙 중 어느 쪽의 약제를 이용한 경우에 있어서도, DHSM을 이용한 리포솜 쪽이, SM 리포솜 및 HSPC 리포솜보다 혈중 체류성이 향상되는 결과가 되었다. 또, DHSM으로서 탄소수 16과 18의 알킬쇄를 갖는 DHSM이 98% 이상의 순도를 갖는 전체 합성 DHSM을 이용한 리포솜이, 계란 유래 DHSM에 비하여 혈중 체류성을 향상시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 17~24, 비교예 17~18, 21~24에 대하여, 입자경, 토포테칸 농도, 황산 이온 농도, 릴리스율을 측정한 결과를 표 7에 나타낸다. 입자경, 토포테칸 농도, 황산 이온 농도는, 본 실시예 중에 있어서 상기한 방법과 동일하게 측정했다.
표 7의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 약물의 리포솜 조성물 전체의 약물에 대한 비율은, 적어도 95%였다.
표 7의 리포솜에 있어서는, 리포솜의 내수상에 포함되는 황산 이온의 리포솜 조성물 전체의 황산 이온에 대한 비율이, 적어도 95%였다.
각 농도의 염화 암모늄 함유 PBS 완충액 중에 리포솜 제제를 20배 희석하고, 4시간 인큐베이트한 시점의 릴리스율을 측정했다. 릴리스율은, 외수상으로 누출된 API 농도를 초기의 전체 수상 API 농도로 나눗셈한 값의 백분율로서 정의된다.
각 농도의 염화 암모늄 함유 PBS 완충액으로서는,
실시예 17, 18, 비교예 17, 18(토포테칸 내포 리포솜의 평가)에서는, 염화 암모늄 4.8mmol/L,
실시예 19, 20, 비교예 19, 20(독소루비신 내포 리포솜의 평가)에서는, 염화 암모늄 200mmol/L,
실시예 21, 22, 비교예 21, 22(수니티닙 내포 리포솜의 평가)에서는, 염화 암모늄 100mmol/L,
실시예 23, 24, 비교예 23, 24(이리노테칸 내포 리포솜의 평가)에서는, 염화 암모늄 4.8mmol/L를 용해한 PBS 완충액을 이용했다.
[표 7]
Figure 112019098238813-pct00009
실시예 17~24, 비교예 17~18, 21~24의 결과로부터, 어느 약제를 이용한 경우에 있어서도, DHSM을 이용한 리포솜 쪽이, SM 리포솜 및 HSPC 리포솜보다 릴리스율이 저감되어, 혈중 체류성의 향상을 기대할 수 있는 결과가 되었다. 또, DHSM으로서 탄소수 16과 18의 알킬쇄를 갖는 DHSM이 98% 이상의 순도를 갖는 전체 합성 DHSM을 이용한 경우, 토포테칸 내포 리포솜, 독소루비신 내포 리포솜, 이리노테칸 내포 리포솜에서 크게 릴리스율이 저감되어 있어, 혈중에서의 누출을 억제하는 데에, 보다 바람직한 것을 알 수 있었다.
<불용성 미립자 측정>
액중 파티클 카운터(HACH ULTRA)로, 실시예 2, 3, 4에 대하여, 각각 5℃ 보관 후 1개월의 샘플을 측정하고, 1바이알 제제(2mL)당 포함되는 10μm 초과의 입자 및 25μm 초과의 입자의 개수를 측정했다(이하, 특별히 설명이 없는 한, 10μm 초과의 입자란, 입경이 10μm를 초과하는 입자를 의미한다. 25μm 초과의 입자란, 입경이 25μm를 초과하는 입자를 의미한다.). 실시예 2, 3, 4는 지질 농도 23mmol/L이며, 지질 1μmol당 입자의 개수로 하여 정리하면, 10μm 초과의 입자에 대하여, 실시예 2는 0.7개, 실시예 3은 1.1개, 실시예 4는 0.3개였다. 또, 25μm 초과의 입자에 대하여, 실시예 2는 0.09개, 실시예 3은 0.5개, 실시예 4는 0개였다. 토포테칸을 내포한 리포솜은, 누출되어 중성 환경에 노출되면 난용성의 이량체로 분해되어, 불용성 미립자가 되는 것이 알려져 있다. 이 결과는, 본 발명에 의하여 누출을 매우 잘 억제할 수 있었기 때문에, 불용성 미립자의 발생도 저감시킬 수 있었던 놀랄 만한 결과이다.
비교예 8에 대하여, 5℃ 보관 후 1개월의 샘플에 있어서도 1바이알 제제(2mL) 중의 불용성 미립자를 측정했다. 지질 1μmol당 입자의 개수로 환산하면, 10μm 초과의 입자가 251개이며 150개를 크게 초과하고 있고, 또 25μm 초과의 입자의 개수가 17개이며, 15개를 크게 초과하고 있었다.
<릴리스율에 부여하는 암모늄 이온 의존성>
릴리스율은, 전체 수상 약제 농도에 대한 누출한 약제 농도(외수상 농도)의 백분율로 산출했다. 실시예 17에서 제작한 토포테칸을 내포하는 DHSM 리포솜, 독소루비신을 내포하는 HSPC 리포솜(독실(등록 상표) 20MG, 얀센 파마)을, 염화 암모늄을 첨가하지 않는 혈장(LAMPIRE제, 마우스 혈장, 품명: Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep, 카탈로그 번호 7315511)과 5mmol/L의 염화 암모늄을 용해한 혈장 중에서의 릴리스율을 측정했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 종양 환경에 있어서는, 글루타민 분해가 항진되어 있고, 그 결과 암모늄이 많이 발생하고 있으며, 대략 5mmol/L의 발생이 보고되어 있다(인용 논문: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850).
독실(등록 상표) 20MG은 HSPC로 이루어지는 독소루비신을 내포한 리포솜이다. 독실(등록 상표)은, 혈중을 모방한 환경에서는 누출이 매우 적지만, 종양 환경을 모방한 고암모늄 환경에서도 거의 방출되지 않는 것을 알 수 있다. 이에 대하여, 본 발명의 실시예 17에 기재된 토포테칸을 함유하는 리포솜은, 혈중을 모방한 환경에서는 누출이 매우 적어 높은 혈중 체류성이 얻어지는 한편, 종양 환경을 모방한 고암모늄 환경에서, 86%라는 매우 높고, 혈중에서는 누출되지 않아 많은 약물이 종양에 리포솜에 의하여 송달되며, 리포솜에 의하여 운반된 약물이 종양에서 많이 방출되는 것을 기대할 수 있는 결과가 되었다. 이 결과를 도 6에 나타냈다.
또, 실제로 인간 난소암 세포주 ES-2를 BALB/c 누드 마우스의 피하에 이식하여 얻은 종양을 채취하고, 구멍 직경 5μm의 원심 여과 필터에 올려 놓으며, 400g에서 10분간 원심함으로써, 종양 간질액을 얻었다. 종양 간질액 30μL에, 실시예 17에서 제작한 본 발명의 토포테칸 리포솜(약물량으로서 30ng), 독소루비신을 내포하는 HSPC 리포솜(독실(등록 상표) 20MG, 얀센 파마)(약물량으로서 30ng)을 각각 첨가하고, 37℃ 24시간 인큐베이트했을 때의 릴리스율은, 실시예 17에서 85%, 독소루비신을 내포하는 HSPC 리포솜에서 6%가 되어, 실제의 종양 환경으로부터 채취된 종양 간질액에서, 릴리스성의 차이가 기대와 같이 관찰되었다.

Claims (23)

  1. 내수상을 갖는 리포솜과, 리포솜을 분산시키는 외수상인 수용액을 갖는 리포솜 조성물로서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질로서, 폴리에틸렌글라이콜 또는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤을 포함하고,
    리포솜 조성물이 항암제를 포함하고, 내수상이 황산 암모늄을 포함하고, 내수상 및 외수상에 포함되는 항암제의 몰의 총합에 대한 내수상에 포함되는 황산 이온의 몰비가 0.36 이상이고, 항암제가 토포테칸의 염, 독소루비신의 염, 이리노테칸의 염, 또는 수니티닙의 염인, 리포솜 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    내수상 및 외수상에 포함되는 항암제의 몰의 총합에 대한 내수상에 포함되는 황산 이온의 몰비가 0.6 이상 1.8 이하인, 리포솜 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의, 폴리에틸렌글라이콜 또는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민의 비율이 2~10몰%인, 리포솜 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의 콜레스테롤의 비율이 35~43몰%인, 리포솜 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    리포솜의 입자경이 30nm 이상 150nm 이하인, 리포솜 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    외수상의 pH가 5.5~8.5인, 리포솜 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    다이하이드로스핑고미엘린이 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 포함하는 다이하이드로스핑고미엘린이고, 항암제가 토포테칸의 염인, 리포솜 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    리포솜 조성물 전체에 포함되는 황산 이온에 대한 내수상에 포함되는 황산 이온의 비율이, 적어도 80%이며, 리포솜 조성물 전체에 포함되는 항암제에 대한 내수상에 포함되는 항암제의 비율이, 적어도 80%인, 리포솜 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    암모늄 농도가 1mmol/L 이하인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 항암제의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 20% 릴리스율/24시간 이하이며, 암모늄 농도가 4~6mmol/L인 혈장에 있어서의 리포솜으로부터의 항암제의 릴리스 속도가, 37℃에 있어서 60% 릴리스율/24시간 이상인, 리포솜 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    5℃에서 1개월의 보관 후에 있어서의 리포솜 조성물의 지질 1μmol 당 포함되는 10μm를 초과하는 불용성 미립자가 150개 이하이며, 리포솜 조성물의 지질 1μmol당 포함되는 25μm를 초과하는 불용성 미립자가 15개 이하인, 리포솜 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의 다이하이드로스핑고미엘린의 비율이 40~70몰%인, 리포솜 조성물.
  13. 청구항 1에 기재된 리포솜 조성물을 포함하는, 의약 조성물.
  14. 청구항 13에 기재된 의약 조성물을 포함하는, 항암제.
  15. 내수상을 갖는 리포솜과, 리포솜을 분산시키는 외수상인 수용액을 갖는 리포솜 조성물로서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질로서, 폴리에틸렌글라이콜 또는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민, 다이하이드로스핑고미엘린, 및 콜레스테롤을 포함하고,
    리포솜 조성물이 항암제를 포함하고, 내수상이 암모늄염을 포함하고, 다이하이드로스핑고미엘린이 탄소수 16과 탄소수 18의 장쇄 알킬기를 갖는 다이하이드로스핑고미엘린이고, 항암제가 토포테칸의 염, 독소루비신의 염, 이리노테칸의 염, 또는 수니티닙의 염인, 리포솜 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서,
    내수상 및 외수상에 포함되는 항암제의 몰의 총합에 대한 내수상에 포함되는 황산 이온의 몰비가 0.6 이상 1.8 이하인, 리포솜 조성물.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의, 폴리에틸렌글라이콜 또는 메톡시폴리에틸렌글라이콜로 수식한 다이아실포스파티딜에탄올아민의 비율이 2~10몰%인, 리포솜 조성물.
  18. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의 콜레스테롤의 비율이 35~43몰%인, 리포솜 조성물.
  19. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    리포솜의 입자경이 30nm 이상 150nm 이하인, 리포솜 조성물.
  20. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    외수상의 pH가 5.5~8.5인, 리포솜 조성물.
  21. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    다이하이드로스핑고미엘린이, 화학 합성에 의해 얻어지는 것인, 리포솜 조성물.
  22. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    리포솜을 구성하는 전체 지질에 있어서의 다이하이드로스핑고미엘린의 비율이 40~70몰%인, 리포솜 조성물.
  23. 청구항 15 또는 청구항 16에 기재된 리포솜 조성물을 포함하는, 의약 조성물.
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