CN116763733A - 脂质体组合物及医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种显示高AUC的脂质体组合物及医药组合物。根据本发明，提供一种脂质体组合物以及包含上述脂质体组合物之医药组合物，本发明的脂质体组合物包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，上述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。

Description

脂质体组合物及医药组合物
本申请是申请日为2018年3月30日、优先权日为2017年3月31日、中国专利申请号为201880023073.9、发明名称为“脂质体组合物及医药组合”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种显示高的血中滞留性的脂质体组合物及医药组合物。
背景技术
进行了很多如下研究：通过脂质体组合物使药物在癌症等疾病部位中累积并且使其长时间暴露。在作为医药组合物的脂质体组合物中，由脂质膜组成的脂质体中内含药物。
专利文献1及非专利文献1中记载有使包含鞘磷脂和胆固醇的脂质体中内含拓扑替康的脂质体。
专利文献2中记载有使包含二氢鞘磷脂和胆固醇的脂质体中内含拓扑替康的脂质体。
专利文献3中记载有一种制剂，其为适于提高喜树碱的稳定性的脂质体喜树碱制剂，所述制剂包含：(a)封装在脂质体中的喜树碱；(b)存在于脂质体的外部且pH小于4.5或为4.5的第一溶液；及(c)存在于脂质体内部的第2溶液。并且，记载有脂质体包含二氢鞘磷脂及胆固醇。
专利文献4中记载有一种系统，其将两亲药剂有效地填充到脂质体中，所述系统中，包含如下步骤：在铵化合物或铵盐的存在下调整脂质体悬浮液，并使用缓冲剂或盐稀释上述悬浮液，在内部水性相与外部水性相之间，赋予从内侧朝向外侧的铵梯度及脂质体的内侧的pH比外侧的pH更靠酸性侧的pH梯度。
专利文献5中记载有使包含纯化氢化大豆磷脂质或鞘磷脂、胆固醇及亲水性聚合物衍生物脂质的脂质体在硫酸铵的存在下内含拓扑替康的脂质体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第7,060,828B2号公报
专利文献2：美国专利第7,811,602B2号公报
专利文献3：日本特表2008-519045号公报
专利文献4：日本特开平2-196713号公报
专利文献5：美国专利第6,355,268B2号公报
非专利文献
非专利文献1：AACR-EORTC International Conference,San Francisco,California,October 22-26,2007,#C113 A Pharmacokinetics Study of a NovelSphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan inRats,William C.Zamboni et al。
发明内容
发明要解决的技术课题
上述的专利文献1、2及3以及非专利文献1中记载有如下内容：通过将拓扑替康包封在含有鞘磷脂或二氢鞘磷脂的脂质体中，抑制血液中的拓扑替康的流出，并且通过提高AUC(Area Under the blood concentration-time Curve：血液浓度-时间曲线下面积)来提高药效。但是，由于构成脂质体的脂质组成及沉淀拓扑替康的盐的组成尚未优化，因此AUC的提高不充分，要求进一步改善。
并且，拓扑替康从脂质体的内水相泄漏到外水相，并且暴露于中性条件时，拓扑替康变为类似物。具体而言，溶解度极低的N-N双加成物(拓扑替康胺二聚体)等可能会以结晶的形式析出并沉淀。最终会生成脱离美国的食品药品监督管理局(FDA)、日本的医药品医疗机械综合机构(PMDA)及欧洲药品管理局(EMEA)所规定的安全基准及质量基准的很多不溶性微粒，因此不优选。为了抑制这种不溶性微粒的生成，在专利文献3中，将外水相的pH设定为酸性条件。但是，外水相在酸性条件下，促进构成脂质体的脂质的分解，而不利于脂质体的稳定化。在专利文献3的脂质体中，由于需要将外水相设为酸性，因此难以添加用酸性水解的由甲氧基聚乙二醇修饰而成二酰基磷脂酰乙醇胺以提高血中滞留性。
本发明的课题在于，提供一种显示高AUC的脂质体组合物及医药组合物。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究的结果，发现了能够提供一种通过如下方法解决了上述课题的脂质体组合物，以致完成了本发明，即，使用经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，将内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比设为0.36以上。
即，本发明提供以下。
[1]
一种脂质体组合物，其包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，其中，
上述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。
[2]
根据[1]所述的脂质体组合物，其中，
药物为拓扑替康或其盐、阿霉素或其盐、伊立替康或其盐、舒尼替尼或其盐。
[3]
根据[1]或[2]所述的脂质体组合物，其中，
内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.6以上且1.8以下。
[4]
根据[1]至[3]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
经亲水性高分子修饰的的二酰基磷脂酰乙醇胺为经聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺。
[5]
根据[1]至[4]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的的二酰基磷脂酰乙醇胺的比率为2～10摩尔％。
[6]
根据[1]至[5]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
脂质体膜的构成成分中的胆固醇类的比率为35～43摩尔％。
[7]
根据[1]至[6]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
粒径为150nm以下。
[8]
根据[1]至[7]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
外水相的pH为5.5～8.5。
[9]
根据[1]至[8]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
二氢鞘磷脂为包含碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，内含药剂为拓扑替康或其盐。
[10]
根据[1]至[9]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子相对于脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率至少为80％，脂质体的内水相中所含有的药物相对于脂质体组合物整体的药物的比率至少为80％。
[11]
根据[9]所述的脂质体组合物，其中，
铵浓度为1mmoL/L以下的血浆中的来自脂质体的药物的释放速率在37℃下为20％/24小时以下，铵浓度为4～6mmoL/L的血浆中的来自脂质体的药物的释放速率在37℃下为60％/24小时以上。
[12]
根据[1]至[11]中任一项所述的脂质体组合物，其中，
在5℃下保管1个月后的脂质体组合物的每1μmol脂质中所含有的大于10μm的粒子为150个以下，所述脂质体组合物的每1μmol脂质中所含有的大于25μm的粒子的个数为15个以下。
[13]
一种医药组合物，其包含[1]至[12]中任一项所述的脂质体组合物。
[14]
根据[13]所述的医药组合物，其为抗癌剂。
[15]
一种脂质体组合物，其包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，其中，
所述脂质体组合物内含药物，内水相包含铵盐，二氢鞘磷脂为具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂。
[A]一种疾病的治疗方法，其包括将脂质体组合物给与对象的步骤，所述脂质体组合物包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，上述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。
[B]一种脂质体组合物，其用于治疗疾病(优选为癌症)，并且包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，其中，上述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。
[C]一种脂质体组合物的使用，所述脂质体组合物用于医药组合物的制造，并且包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，其中，上述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。
发明效果
本发明的脂质体组合物及医药组合物能够显示高的AUC。
附图说明
图1表示使用了A549皮下移植小鼠模型的药效试验中的体重的测定结果。
图2表示使用了A549皮下移植小鼠模型的药效试验中的体重的测定结果。
图3表示使用了A549皮下移植小鼠模型的药效试验中的肿瘤体积的测定结果。
图4表示使用A549皮下移植小鼠模型的药效试验中的肿瘤体积的测定结果。
图5表示相对于各胆固醇量的AUC的值。
图6表示铵离子对释放率的依赖性的测定结果。
具体实施方式
本说明书中，用“～”表示的数值范围表示将“～”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本说明书中，组合物中的各成分的量在组合物中存在多种属于各成分的物质时，只要无特别限定，则是指组合物中存在的上述多种物质的总量。
“血中滞留性”是指在给与脂质体组合物的对象中，封入到脂质体的状态的药物存在于血液中的性质。
“脂质体的平均粒径”只要没有特别指定，则表示使用动态光散射法测定的累积量平均粒径。作为利用了动态光散射的市售的测定装置，可列举浓厚系粒径分析仪FPAR-1000(OTSUKA ELECTRONICS Co.,LTD制)、NAN0TRAC UPA(Nikkiso Co.,Ltd.制)及Nano-sizer(Malvern Instruments Ltd.制)等。还能够通过各制造商的测定装置固有的转换方程式计算脂质体的体积平均粒径和数均粒径。
为了测定100nm附近的粒子，通过静态光散射法等无法准确地捕获粒子的分布，优选通过动态光散射法进行测定。
“不溶性微粒”是静脉注射制剂等全身给药用医药品组合物中的、PMDA、FDA、EMEA等监管机构以安全性及质量基准进行设定的项目，例如，日本的日本药典＜6.07＞注射剂的不溶性微粒试验法中，当通过第一方法(光屏蔽粒子计数法)进行评价时，要求显示量小于100mL的产品的1个药物小瓶中所含有的粒径为10μm以上的不溶性微粒为6000个以下、粒径为25μm以上的不溶性微粒为600个以下。并且，当通过第二方法(显微镜粒子计数法)进行评价时，要求粒径为10μm以上的不溶性微粒为6000个以下、粒径为25μm以上的不溶性微粒为600个以下。
不溶性微粒无关于其粒子的成分，仅由粒子的尺寸来定义，例如，在脂质体组合物中，可以是脂质体本身的凝聚物，也可以是从脂质体内部漏出的药物成分的凝聚及析出物，也可以是脂质体外水相的成分的凝聚及析出物。尤其，通过专利文献3等的记载可知，本发明中的内含拓扑替康的脂质体为如下析出物：所内含的拓扑替康向脂质体外漏出并经过分解成溶解度低的分解物而生成的析出物。
作为测定不溶性微粒的方法，除了光学检测的光屏蔽粒子计数法(使用粒子计数器、例如Beckman Coulter,Inc.的HIAC 9703+、Particle Sizing Systems,LLC的AccuSizer A2000USP)以外，还可列举使用显微镜目视观察放大图像并进行计数的显微镜粒子计数法。
关于脂质体医药组合物，尤其关于注射制剂，如日本药典＜6.07＞注射剂的不溶性微粒试验法中所定义，使用时优选为医药组合物中所含有的粒径大于10μm的粒子为6000个以下、粒径大于25μm的粒子为600个以下。
在脂质体医药组合物的注射制剂中，认为产生不溶性微粒的原因大部分在于在保管期间产生的脂质体粒子成分的凝聚、合一及分解，但并不限定于此。存在根据作为构成脂质体的主要材料的脂质的量而产生不溶性微粒的倾向。例如，当考虑到包含脂质浓度20mmol/L的脂质体组合物2mL的医药组合物时，若每1μmol脂质的粒径大于10μm的粒子为150个以下、粒径大于25μm的粒子为15个以下，则作为日本药典＜6.07＞注射剂的不溶性微粒试验法中所定义的基准的、医药组合物中所含有的粒径大于10μm的粒子能够满足6000个以下、粒径大于25μm的粒子能够满足600个以下。
在本发明的脂质体组合物中，也优选为在5℃下保管1个月后，每1μmol脂质的粒径大于10μm的粒子为150个以下、粒径大于25μm的粒子为15个以下。更优选为在5℃下保管1个月后，每1μmol脂质的粒径大于10μm的粒子为75个以下、粒径大于25μm的粒子为7.5个以下。进一步优选为在5℃下保管1个月后，每1μmol脂质的粒径大于10μm的粒子为25个以下、粒径大于25μm的粒子为2.5个以下。
并且，粒径大于10μm的粗大粒子多为随着保管时的经时劣化而增加，优选即使在储存3个月后的状态下也满足上述个数，更优选即使在储存1年后的状态下也满足上述个数。
“对象”是指需要预防或治疗疾病等的人、小鼠、猴、家畜等哺乳动物，优选为需要预防或治疗疾病等的人。
以下，详细说明本发明。
作为本发明的第一方式的脂质体组合物包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，所述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上。
并且，作为本发明的第二方式的脂质体组合物包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，所述脂质体组合物内含药物，内水相包含铵盐，二氢鞘磷脂为具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂。
本发明中，使用经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，从而提高血液中的脂质体的滞留性。此外，内水相包含硫酸铵，由此抑制药物从血液中的脂质体泄漏，从而提高AUC。此外，通过将内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比设为0.36以上，进一步抑制药物从血液中的脂质体泄漏，从而实现更高的AUC。
由上述结果，即使在冷藏保管期间也能够抑制药物从内水相向外水相泄漏，并且即使在中性条件下也能够抑制不溶性微粒的生成。即，在本发明的脂质体组合物中，能够将外水相的pH设定为接近中性(pH7.4)，并能够使用在酸性条件下进行水解的“经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺”以提高血中滞留性。
(脂质体)
脂质体是由使用了脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，并且在该封闭囊泡的空间内具有水相(内水相)。内水相包含水等。脂质体通常以分散在封闭囊泡外的水溶液(外水相)的状态而存在。脂质体可以是单层(也称为单层层状或unilamellar，且为双层膜为单层的结构。)，也可以是多层层状(也称为多层，且为洋葱状的形状的多个双层膜的结构。各层由水样层分开。)，在本发明中，从医药用途中的安全性及稳定性的观点考虑，优选为单层脂质体。
脂质体只要是能够内含药物的脂质体，则其形态并无特别限定。“内含”是指对于脂质体，药物包含于内水相及膜本身的形态。例如，可列举将药物封入由膜形成的封闭空间内的形态、膜本身内含的形态等，也可以是这些的组合。
脂质体的平均粒径通常为10nm～1000nm，优选为20nm～500nm，更优选为30～300nm，进一步优选为30nm～200nm，更进一步优选为150nm以下，例如30nm～150nm，尤其优选为70～150nm。
脂质体采用球状或与其接近的形态。
从脂质选择构成脂质体的脂质双层的成分。作为脂质，能够使用溶解于水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂的物质。
本发明中的脂质体包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分。
脂质体是由使用如上所述的脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，通常作为成为形成脂质双层膜的基材的脂质，可列举具有两条酰基链的磷脂质，例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成磷脂质或将这些氢化而成的物质(例如，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC))等。
在本发明中，作为成为形成脂质双层膜的基材的脂质，使用具有两条酰基链的磷脂质、二氢鞘磷脂。
通过使用二氢鞘磷脂，能够提高血液中的脂质体的滞留性。
通过将二氢鞘磷脂用作脂质体膜的基材，能够提高该脂质体膜的阻挡性，从而能够防止所内含的药物的泄漏。推测这是因为二氢鞘磷脂所具有的酰胺键具有很强的氢键合能力，通过彼此强烈地进行相互作用，能够形成紧固且阻挡性高的膜。并且，与本发明中同时使用的胆固醇的羟基强烈地进行相互作用，进而能够制作阻挡性高的膜。这成为通过具有酯键的HSPC和卵磷脂等通用的脂质是无法实现的功能。
并且，相对于虽然具有酰胺键但在酰基链上具有不饱和键的鞘磷脂，全部饱和的二氢鞘磷脂的熔点高，所形成的膜的迁移率变低，因此，推测相对于鞘磷脂，二氢鞘磷脂也能够制作阻挡性高的膜。
二氢鞘磷脂通常在分子内具有2个长链烷基，可列举：具有碳原子数为16的2个长链烷基的化合物；具有碳原子数为16和碳原子数为18的长链烷基的化合物；及具有碳原子数为16和碳原子数为20～24的长链烷基的化合物。
作为二氢鞘磷脂，就防止药物从脂质体泄漏的观点而言，优选使用具有碳原子数为16和碳原子数为18的长链烷基的下述化合物。这是因为，碳原子数越多，熔点变得越高，能够制作阻挡性高的脂质体膜。
[化学式编号1]
作为二氢鞘磷脂，例如可以使用通过使用通常的方法还原来自于天然物的鞘磷脂而获得的二氢鞘磷脂，也可以使用通过合成来获得的二氢鞘磷脂。
来自于鸡蛋等天然物的二氢鞘磷脂中，通常具有碳原子数为16的2个长链烷基的化合物占大部分，因此，就可高纯度地获得具有碳原子数为16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂的方面而言，优选使用通过化学合成来获得的化合物。
脂质体膜的构成成分(构成脂质体的总脂)中的二氢鞘磷脂的比率优选为30～80摩尔％，更优选为40～70摩尔％，进一步优选为50～60摩尔％。
作为经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺中的亲水性高分子，例如可列举聚乙二醇类、聚甘油类、聚丙二醇类、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、合成聚氨基酸等。上述亲水性高分子能够分别单独使用或组合使用2种以上。
这些中，从组合物的血中滞留性的观点考虑，优选聚乙二醇类、聚甘油类及聚丙二醇类，更优选聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)及它们的衍生物。
从通用性及血中滞留性的观点考虑，进一步优选聚乙二醇(PEG)及其衍生物。作为聚乙二醇(PEG)的衍生物，可列举甲氧基聚乙二醇等，但并无特别限定。
聚乙二醇类的分子量并无特别限定，为500～10,000道尔顿，优选为1,000～7,000道尔顿，更优选为2,000～5,000道尔顿。
二酰基磷脂酰乙醇胺中的酰基的碳原子数优选为16以上，例如优选为碳原子数16以上且30以下，更优选为碳原子数16以上且24以下，进步一步优选为碳原子数20。
作为由聚乙二醇类修饰而成二酰基磷脂酰乙醇胺，例如可列举1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-PEG2000(Nippon Oil&Fats Co.,Ltd.制)、1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-PEG5000(Nippon Oil&Fats Co.,Ltd.制)及二硬脂酰甘油酯-PEG2000(Nippon Oil&FatsCo.,Ltd.制)等1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
在脂质体膜的构成成分(构成脂质体的总脂)中，经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺的比率优选为1～15摩尔％，更优选为2～10摩尔％。
作为胆固醇类，能够列举将环戊烷多氢菲作为基本骨架，其一部分或所有的碳被氢化的胆固醇及其衍生物。例如，优选为胆固醇。若将脂质体的平均粒径微细化而使其成为100nm以下，则脂质膜的曲率会变高。在脂质体中排列的膜的变形也会变大。为了填补基于脂质的膜的变形(膜稳定化效果)而添加胆固醇等为有效。
在脂质体中，胆固醇类的添加可期待通过填补脂质体的膜的空隙等而降低脂质体的膜的流动性。
脂质体膜的构成成分(构成脂质体的脂质)中的胆固醇的比率优选为20摩尔％～50摩尔％，更优选为30摩尔％～45摩尔％，进一步优选为35～43摩尔％。
脂质体中，除了上述成分以外，为了改善血中滞留性可以添加亲水性高分子等，作为膜结构的稳定剂可以添加脂肪酸或二乙酰磷酸酯(diacetyl phosphate)等，作为抗氧化剂可以添加α-生育酚等。本发明中，优选不使用在医药用途中未认可在静脉注射用途中使用的分散助剂等添加剂，例如表面活性剂等。
(药物)
本发明的脂质体组合物内含药物。
药物的种类并无特别限定，能够使用以下例示的抗癌剂。具体而言，可列举：阿霉素、柔红霉素及表柔比星等蒽环霉素系抗癌剂；
顺铂及奥沙利铂等顺铂系抗癌剂；
紫杉醇及多西他赛等紫杉烷系抗癌剂；
长春新碱及长春碱等长春花生物碱系抗癌剂；
博莱霉素等博莱霉素系抗癌剂；
西罗莫司等西罗莫司系抗癌剂；
拓扑替康(也称为nogitecan)、伊立替康、karenitecin(注册商标)(也称为BNP1350)、依沙替康、勒托替康、gimatecan(也称为ST1481)及贝洛替康(也称为CKD602)等喜树碱系抗癌剂；
长春新碱等长春花生物碱系抗癌剂；
甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷及培美曲塞等抗代谢药；以及
伊马替尼(Gleevec(注册商标))、依维莫司(Afinitor(注册商标))、厄洛替尼(Tarceva(注册商标))、吉非替尼(Iressa(注册商标))、舒尼替尼(Sutent(注册商标))、索拉非尼(Nexavar(注册商标))、达沙替尼(Sprycel(注册商标))、他米巴罗汀(Amnolake(注册商标))、维甲酸(Vesanoid(注册商标))、硼替佐米(Velcade(注册商标))及拉帕替尼(Tykerb(注册商标))等分子靶向药物。
上述中，优选拓扑替康(也称为nogitecan)、阿霉素、伊立替康或舒尼替尼，更优选拓扑替康。
药物可以以盐的形式使用。
作为药物的盐，能够列举通常已知的氨基等碱性基团、羟基及羧基等酸性基团中的盐。
作为碱性基团中的盐，例如可举出与盐酸、氢溴酸、磷酸、硼酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天冬氨酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐。
作为酸性基团中的盐，例如可列举：与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土类金属的盐；铵盐；以及与三甲胺、三乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙胺、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N-苄基-β-苯乙胺、1-二苯羟甲胺及N,N'-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。
脂质体组合物中的药物的含量并无特别限定，相对于脂质体组合物，优选为0.025～20mg/ml，更优选为0.25～10mg/ml。
从自脂质体的释放速度、脂质体内部的渗透压力或由沉淀的药物引起的脂质体形状的观点考虑，相对于形成脂质体膜的脂质的内含于脂质体的药物量，以摩尔比计优选为0.1～1.5，更优选为0.2～0.3。
若药物量与脂质的摩尔之比太低，则脂质体膜相对于单位药物量的面积增加，从而药物从脂质体的释放速率增加，并且损坏提高血中滞留性的功能。另一方面，若药物量与脂质的摩尔之比太高，则脂质体内部的渗透压力随着药物的溶解量的增加而上升并且破坏脂质体或药物在脂质体内部沉淀时，已沉淀的固体物质较大地生长而导致脂质体形状的变形。
(内水相中的硫酸铵)
本发明中的脂质体的内水相包含硫酸铵。并且，作为本发明的第一方式的脂质体组合物中，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上，优选为0.4以上。内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比更优选为0.4以上且1.8以下，进一步优选为0.6以上且1.8以下。通过如上所述那样设定内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比，能够抑制药物从血液中的脂质体泄漏。若内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比太低，则由药物的硫酸盐导致的固体物质的形成会不完整，在脂质体内脂质体膜的透过性变高的溶解状态的药物的浓度得以提高，药物容易从脂质体泄漏，并且会损害提高血中滞留性的效果。并且，若内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比过高，则脂质体内部的渗透压变高，从而导致脂质体结构的破坏，因此药物容易从脂质体泄漏，并且会损害提高血中滞留性的效果。
并且，本发明中脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子与脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率(硫酸根离子的内水相率)优选至少为80％，更优选为90％以上，同时，脂质体的内水相中所含有的药物与脂质体组合物整体的药物的比率(药物的内水相率)优选至少为80％，更优选为90％以上。
脂质体中的药物浓度例如能够通过液相色谱法/紫外可见吸光度检测法进行测定。并且，脂质体的内水相的硫酸根离子浓度例如能够通过离子色谱法进行测定。
(外水相的pH)
本发明的脂质体组合物能够包含内含药物的脂质体及使上述脂质体分散的水性溶剂(外水相)。外水相的pH优选为中性，具体而言，pH优选为5.5～8.5左右。
若过度抑制药物的泄漏，则还可以抑制药物在患部、尤其是肿瘤部中的泄漏从而有可能无法获得预期的药效。
本发明的脂质体组合物兼具令人惊讶的机构：抑制药剂在血液中的泄漏，向肿瘤部输送足够量的药物，进一步在肿瘤部中迅速释放药物。
在肿瘤部，具有相比血中等其他器官铵浓度高的性质(引用论文：Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and medicien,11(2015)1841-1850)，本发明的脂质体组合物在如肿瘤那样在谷氨酰胺分解增强而铵浓度高(5mmol/L)的环境下，药物的释放会大大增加。
本发明的脂质体组合物中，铵浓度为1mmol/L以下的血浆中药物自脂质体的释放速率在37℃下为20％/24小时以下，铵浓度为4～6mmol/L的血浆中药物自脂质体的释放速率为60％以上/24小时以下，更优选为，铵浓度为1mmol/L以下的血浆中药物自脂质体的释放速率在37℃下为15％/24小时以下，铵浓度为4～6mmol/L的血浆中药物自脂质体的释放速率为70％以上/24小时以下。
(脂质体组合物的制造方法)
本发明的脂质体组合物的制造方法并无特别限定，作为一例，能够通过如下步骤来制造：
(a)油相的制备；
(b)水相的制备；
(c)通过乳化形成脂质体粒子；
(d)基于挤出机的整粒；
(e)通过透析置换脂质体外水相液；
(f)通过远程加载使药物内含于脂质体粒子；及
(g)通过透析去除外水相药物；
可以进行(d)基于挤出机的整粒，也可以不进行。
＜(a)油相的制备＞
(a)油相的制备中，将构成脂质体的各成分(经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇类)和有机溶剂进行混合，并加热混合物使上述成分溶解，由此能够制造油相。
油相中使用的有机溶剂并无特别限定，例如，能够使用可与水任意混合的水溶性有机溶剂。
作为水溶性有机溶剂，例如可列举：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇及叔丁醇等醇类；甘油、乙二醇及丙二醇等二醇类；聚乙二醇等聚亚烷基二醇类等。这些中，优选醇类。作为醇类，优选为选自乙醇、甲醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少1种，更优选为选自乙醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少1种，进一步优选为乙醇。
构成脂质体的各成分的浓度并无特别限定，能够适当地进行调整。
＜(b)水相的制备＞
作为水相，能够使用水(蒸馏水、注射用水等)、生理盐水、各种缓冲液或糖类(蔗糖等)的水溶液及这些的混合物(水性溶剂)。本发明中，在通过后述的远程加载将药物内含于脂质体中时，作为水相，优选使用硫酸铵水溶液。
作为缓冲液，并不限定于有机系、无机系，优选使用在接近体液的氢离子浓度附近具有缓冲作用的缓冲液，且可列举磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液及Good's缓冲液(Good's buffers)等。关于脂质体的内水相，在制造脂质体时，可以是分散脂质体的水溶液，也可以是新添加的水、生理盐水、各种缓冲液或糖类水溶液及这些的混合物。用作外水相或内水相的水优选不包含杂质(尘埃、化学物质等)。
生理盐水是指调整成与人体等渗的无机盐溶液，且还可以具有缓冲功能。作为生理盐水，可列举含有0.9w/v％(质量/体积％)的氯化钠的盐水、PBS及三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水等。
本发明中，水相是指包含外水相及内水相这两者。
本发明中的外水相是指分散脂质体的水溶液。例如为注射剂的情况下，进行药瓶或预充式注射器包装而保管的占脂质体的分散液的脂质体的外侧的溶液成为外水相。并且，关于通过所添加的分散用溶液或其他溶解液给药时用时分散的溶液也相同，占脂质体的分散液的脂质体外侧的溶液成为外水相。
本发明中的内水相是指隔着脂质体的脂质双层膜的封闭囊泡内的水相。
＜(c)通过乳化形成脂质体粒子＞
乳化工序中，能够将油相与水相进行混合，并搅拌包含脂质的水溶液来进行乳化。将脂质溶解于有机溶剂中的油相及水相进行混合并搅拌，且进行乳化，由此制备油相及水相乳化成O/W型(水中油型)的乳化液。混合后，通过蒸发去除源自油相的有机溶剂的一部分或全部，由此形成脂质体。或者，油相中的有机溶剂的一部分或全部在搅拌、乳化的过程中蒸发而形成脂质体。
作为搅拌的方法，为了粒子微细化而利用超声波或机械剪切。并且，为了粒径的均匀化，能够进行通过一定孔径的过滤器的挤出机处理或微射流机处理。若使用挤出机等，则能够分散附随形成的多囊脂质体而使其成为单囊脂质体。
乳化工序只要是进行乳化的工序则并无限定，优选为施加高剪切，且在包含有机溶剂的乳化工序中进行微粒子化的工序。高剪切由乳化机的搅拌叶片的圆周速度定义，优选为5m/s～32m/s，尤其优选为20m/s～30m/s。根据需要，能够通过使在乳化工序中所使用的有机溶剂蒸发(去溶剂)而形成脂质体。
制造脂质体时的乳化工序的液温能够适当进行调整，优选设为使用油相与水相的混合时的液温的脂质的相转变温度以上，例如，使用相转变温度为35～40℃的脂质时，优选设为35℃～70℃。
乳化工序中，可以使有机溶剂和水从包含脂质体的水溶液中蒸发。在此所谓蒸发可以是作为蒸发工序强制去除源自油相的有机溶剂和源自水相的水的一部分或全部的工序，也可以是源自油相的有机溶剂和源自水相的水的一部分或全部在搅拌、乳化的过程中自然蒸发的工序。
蒸发的方法并无特别限定，例如进行通过对有机溶剂和水进行加热而使其蒸发的工序、乳化后静置或持续缓慢搅拌的工序及进行真空脱气的工序中的至少一个即可。
＜(d)基于挤出机的整粒＞
所获得的脂质体能够使用透析法、过滤法或挤压处理等使粒径变得均匀。
挤压处理是指，使脂质体通过具有细孔的过滤器，由此实施物理剪切，并进行微粒化的工序。使脂质体通过时，将脂质体分散液及过滤器保持在构成脂质体的膜的相转变温度以上的温度，由此能够迅速进行微粒化。
另外，可以进行基于挤出机的整粒，也可以不进行。
＜(e)通过透析置换脂质体外水相液＞
在本发明中，在通过远程加载使药物内含于脂质体中时，可以通过透析置换脂质体外水相液。作为透析液，能够使用0.05～5质量％的NaCl水溶液，但并无特别限定。通过使用上述透析液透析脂质体液，由此去除存在于外水相的硫酸铵，能够获得用透析液置换外水相的脂质体。
＜(f)通过远程加载法使药物内含于脂质体粒子中＞
在本发明中，优选通过远程加载法使药物内含于脂质体中。
本发明中，远程加载法是指，制造没有内含有药物的空脂质体，并通过向脂质体外液添加药物而向脂质体中导入药物的方法。关于远程加载的方法并无特别限定，优选使用铵盐的方法，更优选使用硫酸铵的方法。
远程加载法中，添加到外液中的药物积极地转移到脂质体中并摄入到脂质体。作为该驱动力，可使用溶解度梯度、离子梯度、pH梯度等。例如有使用隔着脂质体膜而形成的离子梯度将药物导入到脂质体内部的方法。例如有利用Na+/K+浓度梯度通过远程加载法预先形成的脂质体中添加药物的技术。
离子梯度中也通常使用质子浓度梯度，例如，可列举具有使脂质体膜的内侧(内水相)pH低于外侧(外水相)pH的pH梯度的形式。pH梯度具体而言能够由铵离子梯度的浓度梯度等来形成。
＜(g)通过透析去除外水相药物＞
内含药物的脂质体液为了去除不包含于脂质体中的药物而可以进行透析。例如，使用规定浓度的蔗糖/组氨酸缓冲液作为透析液，通过对内含药物的脂质体液进行透析来去除存在于外水相的药物，从而能够获得用透析液置换外水相的脂质体组合物。
＜无菌过滤＞
上述所获得的脂质体组合物优选进行无菌过滤。作为过滤的方法，能够使用中空纤维膜、反渗透膜或膜过滤器等从包含脂质体的水溶液中去除多余物质。本发明中，优选通过具有能够灭菌的孔径的过滤器(优选0.2μm的过滤灭菌过滤器)进行过滤。
为了防止因脂质体的变形给平均粒径带来的影响，优选在构成脂质体的脂质的相转变温度以下的温度下进行无菌过滤工序及后述的无菌填充工序。例如，当脂质的相转变温度为50℃附近时，优选为0～40℃左右，更具体而言，优选在5～30℃左右的温度下制造。
＜无菌填充＞
无菌过滤后获得的脂质体组合物优选作为医疗用途而进行无菌填充。无菌填充的方法能够应用公知的方法。通过向容器无菌地填充而能够制备作为医疗用而优选的脂质体组合物。
(医药组合物)
本发明的脂质体组合物可以包含与给药途径有关，且医药学上容许的等渗剂、稳定剂、抗氧化剂及pH调整剂中的至少1种。即，本发明的脂质体组合物能够作为医药组合物而提供。
作为等渗剂，并无特别限定，例如可列举如氯化钠、氯化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾之类的无机盐类、如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇之类的多元醇类、如葡萄糖、果糖、乳糖或蔗糖之类的糖类。
作为稳定剂，并无特别限定，例如可列举如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖或蔗糖之类的糖类。
作为抗氧化剂，并无特别限定，例如可列举抗坏血酸、尿酸、生育酚同系物(例如，维生素E、生育酚α、β、γ、δ这4个异构体)、半胱氨酸、EDTA(乙二胺四乙酸)等。稳定剂及抗氧化剂能够分别单独使用或组合使用2种以上。
作为pH调整剂，例如可列举氢氧化钠、柠檬酸、乙酸、三乙醇胺、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等。
本发明的脂质体组合物可以含有药物学上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠、糖类、生物体内降解性聚合物、无血清培养基、作为药品添加物而容许的添加物。
填充本发明的脂质体组合物的容器并无特别限定，优选为透氧性低的材质。例如，可列举由具有塑料容器、玻璃容器、铝箱、铝蒸镀膜、氧化铝蒸镀膜、氧化硅蒸镀膜、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚偏二氯乙烯等来作为阻气层的层压薄膜制成的袋(bag)等，还能够根据需要通过采用使用了着色玻璃、铝箔或铝蒸镀膜等的袋等来遮光。
填充脂质体组合物的容器中，为了防止由存在于容器内的空间部的氧引起的氧化，优选用氮气等非活性气体置换容器空间部及药液中的气体。例如，可列举对注射液进行氮气鼓泡，且在氮气环境下进行向容器的填充。
作为本发明的医药组合物的给药途径，优选非口服给药。例如，能够列举点滴等静脉内注射(静注)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射及髓腔内注射。作为给药方法，可列举基于注射器或点滴的给药。
本发明的医药组合物的给药量及给药次数根据药物的种类、患者的状态等适当地设定即可，作为有效成分的药物量通常能够设定在每天0.01mg/kg～100mg/kg的范围。作为有效成分的药物量，能够设定在每次2mg～10mg的范围。但是，并不限定于这些给药量。
本发明的医药组合物能够优选用作抗癌剂。
作为本发明的医药组合物的适用对象的癌症的种类并无特别限定，例如，可列举肺癌(尤其是小细胞肺癌)、卵巢癌、小儿实体瘤、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、颈部鳞状上皮细胞癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、骨髓转移癌、肉瘤、软组织肿瘤、慢性粒单核细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤等。
实施例
以下，通过实施例详细说明本发明。但是，本发明并不限定于实施例。
SM表示鞘磷脂(Sphingomyelin)(COATSOME NM-10、NOF CORPORATION制)。
来自于鸡蛋的DHSM表示通过将来自鸡蛋的SM进行氢化而获得的二氢鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)(对COATSOME NM-10(NOF CORPORATION制)进行氢化而得的合成品)。该来自于鸡蛋的DHSM为具有碳原子数16的2个烷基链的化合物为整体的70～80％，剩余包含烷基链长不同的DHSM的混合物。
全合成DHSM表示以含有98％以上的具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的下述化合物的方式通过化学合成制作的二氢鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)。
[化学式编号2]
作为PEG磷脂质(在表中标记为PEG)，使用了SUNBRIGHT DSPE-020CN、NOFCORPORATION制(以下，设为DSPE-PEG)。
作为胆固醇(在表中标记为Chol)，使用了Cholesterol HP(NIPPON FINECHEMICAL CO.,LTD.制)。
＜比较例1～10＞
(a)油相的制备
关于比较例1，分别称取了11.52g、4.32g、4.32g的SM、PEG磷脂质及胆固醇。关于比较例2～10，以成为表1中记载的比率的方式改变了SM或来自鸡蛋的DHSM、PEG磷脂质及胆固醇的量。将该脂质与381mL的乙醇进行混合，在65℃下溶解而制成油相。
(b1)水相1的制备
将硫酸铵25.2g溶解于水1118.5g中，制备了水相1。
(b2)水相2的制备
将硫酸铵5.04g溶解于水223.7g中，制备了水相2。
(c)通过乳化形成脂质体粒子
将(b1)中制备的水相1加热至65℃，添加(a)中制备的全量的油相之后，使用精密乳化分散机以圆周速度26m/s混合了60分钟。接着，添加室温的水相2之后，一边在65℃下加热一边以圆周速度0.1m/s继续搅拌而蒸发有机溶剂和水，并且在液体浓缩至600mL为止的时点停止加热和搅拌并停止蒸发。
(e)通过透析置换脂质体外水相液
作为透析液使用了3.15质量％的NaCl水溶液。使用该透析液对在(c)中获得的液体在室温下使用交叉流式过滤，并去除存在于外水相的硫酸铵，获得了用透析液置换外水相的脂质体。
(f)通过远程加载使拓扑替康内含于脂质体粒子中
将注射用水添加到拓扑替康盐酸盐(Biocompounds公司制)制成5mg/mL的溶液。进而，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使拓扑替康溶解。向该拓扑替康溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在60℃下加热了60分钟。
(g)通过透析去除外水相拓扑替康
作为透析液制备了包括9.4质量％蔗糖、10mmol/L组氨酸的蔗糖/组氨酸缓冲液。使用该透析液对在(f)中获得的液体在室温下使用交叉流式过滤，并去除存在于外水相的拓扑替康，获得了用透析液置换外水相的含有拓扑替康的脂质体。
＜比较例11及比较例12＞
(a)油相的制备
关于比较例11，分别称取了0.517g及0.233g的来源于鸡蛋的DHSM及胆固醇。关于比较例12，以成为表1中记载的比率的方式改变了SM及胆固醇的量。将脂质体以DiI(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine Perchlorate：1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐)标记，因此称量相对于总脂成为0.2mol％的分量的DiI，并将其溶解于乙醇中。将乙醇添加到DiI乙醇溶液中，总量计设为1.5mL，将称取的脂质与该有机溶剂进行混合，加热至65℃以溶解脂质而制成油相。
(b)水相的制备
将硫酸铵0.9g及蔗糖2.16g溶解于水13.5g中，从而制备了水相。
(c)通过油相与水相的混合形成脂质体粒子
将(b)中制备的水相加热至65℃，使用磁搅拌器进行搅拌(3000rpm)。使用热板将(a)中制备的全量的油相加热至65℃，使用注射器抽吸油相总量，使用热板加热5分钟。将油相经30秒钟滴加到正在加热的水相中。
(d)基于挤出机的整粒
在70℃的加热下使用挤出机(Mini Extruder，Avanti Polar Lipids,Inc.制)，并通过使(c)中获得的液体依次通过过滤器来进行了整粒。
(e)通过透析置换脂质体外水相液
作为透析液使用了0.09质量％的NaCl水溶液。使用该透析液对(c)或(d)中获得的液体在室温下进行透析，并去除存在于外水相的硫酸铵，获得了用透析液置换外水相的脂质体。
(f)通过远程加载使拓扑替康内含于脂质体粒子中
将注射用水添加到拓扑替康盐酸盐(Biocompounds公司制)制成5mg/mL的溶液。进而，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使拓扑替康溶解。向该拓扑替康溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在60℃下加热了120分钟。
(g)通过透析去除外水相拓扑替康
作为透析液制备了包括9.4质量％蔗糖及10mmol/L组氨酸的蔗糖/组氨酸缓冲液。使用该透析液对(f)中获得的液体在室温下进行透析，并去除存在于外水相的拓扑替康，获得了用透析液置换外水相的含有拓扑替康的脂质体。
＜实施例1～8＞
(a)油相的制备
关于实施例1，分别称取了11.52g、4.32g及4.32g的来自于鸡蛋的DHSM、PEG磷脂质(SUNBRIGHT DSPE-020CN、NOF CORPORATION制、以下，设为DSPE-PEG)及胆固醇。关于实施例2～8，以成为表2中记载的比率的方式改变了DHSM、DSPE-PEG及胆固醇的量。将该脂质与381mL的乙醇进行混合，在65℃下溶解制成油相。
(b1)水相1的制备
将硫酸铵25.2g溶解于水1118.5g中，制备了水相1。
(b2)水相2的制备
将硫酸铵5.04g溶解于水223.7g中，制备了水相2。
(c)通过乳化形成脂质体粒子
将(b1)中制备的水相1加热至65℃，添加(a)中制备的全量的油相之后，使用精密乳化分散机以圆周速度26m/s混合了60分钟。接着，添加室温的水相2之后，一边在65℃下加热一边以圆周速度0.1m/s继续搅拌而蒸发有机溶剂和水，并且在液体浓缩至600mL为止的时点停止加热和搅拌并停止蒸发。
(e)通过透析置换脂质体外水相液
作为透析液使用了3.15质量％的NaCl水溶液。使用该透析液对在(c)中获得的液体在室温下使用交叉流式过滤，并去除存在于外水相的硫酸铵，获得了用透析液置换外水相的脂质体。
(f)通过远程加载使拓扑替康内含于脂质体粒子中
将注射用水添加到拓扑替康盐酸盐(Biocompounds公司制)制成5mg/mL的溶液。进而，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使拓扑替康溶解。向该拓扑替康溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在60℃下加热了60分钟。
(g)通过透析去除外水相拓扑替康
作为透析液制备了包括9.4质量％蔗糖及10mmol/L组氨酸的蔗糖/组氨酸缓冲液。使用该透析液对在(f)中获得的液体在室温下使用交叉流式过滤，并去除存在于外水相的拓扑替康，获得了用透析液置换外水相的含有拓扑替康的脂质体。
＜实施例9及实施例10＞
(a)油相的制备
关于实施例9，分别称取了0.412g、0.153g及0.153g的来自鸡蛋的DHSM、DSPE-PEG及胆固醇。关于实施例10，以成为表2中记载的比率的方式改变了来自鸡蛋的DHSM、DSPE-PEG及胆固醇的量。为了用DiI标记脂质体，因此称取相对于总脂成为0.2mol％的分量的DiI，并使其溶解于乙醇中。向该DiI乙醇溶液添加乙醇，总量设为11.25mL，进一步添加乙酸乙酯3.75mL。将称量的脂质与该有机溶剂混合，加热至60℃并使脂质溶解而成为油相。
(b)水相的制备
将硫酸铵0.9g溶解于水40g中，从而制备了水相。
(c)通过乳化形成脂质体粒子
将(b)中制备的水相加热至70℃，添加了(a)中制备的油相总量之后(容积比：水相/油相＝8/3)，通过乳化机(EXCEL自动均质器ED-3、NIHONSEIKI Corporation制)以3000rpm(rotation per minute(每分钟转速)：1/60s-1)混合了30分钟。接着，通过一边在65℃下加热一边以300rpm继续搅拌而蒸发有机溶剂和水，并且在液体浓缩至15g为止的时点停止加热和搅拌并停止蒸发。
(d)基于挤出机的整粒
在70℃的加热下使用挤出机(Mini Extruder，Avanti Polar Lipids,Inc.制)，并通过使(c)中获得的液体依次通过过滤器来进行了整粒。
(e)通过透析置换脂质体外水相液
作为透析液使用了0.09质量％的NaCl水溶液。使用该透析液对(c)或(d)中获得的液体在室温下进行透析，并去除存在于外水相的硫酸铵，获得了用透析液置换外水相的脂质体。
(f)通过远程加载使拓扑替康内含于脂质体粒子中
将注射用水添加到拓扑替康盐酸盐(Biocompounds公司制)制成5mg/mL的溶液。进而，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使拓扑替康溶解。向该拓扑替康溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在60℃下加热了120分钟。
(g)通过透析去除外水相拓扑替康
作为透析液制备了包括9.4质量％蔗糖、10mmol/L组氨酸的蔗糖/组氨酸缓冲液。使用该透析液对(f)中获得的液体在室温下进行透析，并去除存在于外水相的拓扑替康，获得了用透析液置换外水相的含有拓扑替康的脂质体。
[物性测定及评价]
＜平均粒径＞
本发明中，平均粒径是指通过动态光散射法测定的累积量平均粒径。表中记载的各实施例及比较例的平均粒径是利用带有自动进样器的浓厚系粒径分析仪FPAR-1000AS(OTSUKA ELECTRONICS Co.,LTD制)通过动态光散射法测定而得的累积量平均粒径。将测定结果示于表1及表2。
＜拓扑替康浓度测定＞
使用HPLC(高效液相色谱法)装置Nexera-i LC-2040C(Shimadzu Corporation制)测定样品，将对拓扑替康浓度进行定量的结果示于表1及表2。具体的测定方法如下所述。
在表1及表2的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的药物与脂质体组合物整体的药物的比率除比较例10以外至少为95％。比较例10为59％。
脂质体制剂中的拓扑替康量的测定
将制备的脂质体液溶解于甲醇中，使用将通过过滤器过滤的试样溶液及拓扑替康盐酸盐进行稀释而制备的校准曲线标准液，通过液相色谱法/紫外可见吸光度检测法进行了测定。
内水相拓扑替康浓度通过从全水相拓扑替康浓度减去外水相拓扑替康浓度来计算。
各水相的拓扑替康浓度以如下方式进行了测定。
(全水相拓扑替康浓度)
称取50μL的脂质体分散液，并添加甲醇950μL，在涡流下搅拌了1分钟。称取100μL的该液体，并添加900μL的milli-Q水，在涡流下搅拌1分钟，制成HPLC分析用样品。
(外水相拓扑替康浓度)
称取50μL的脂质体分散液，添加450μL的9.4wt％蔗糖/10mM组氨酸水溶液进行稀释。在100μL的该稀释液中添加200μL的PBS，进行了翻转混合。将该分散液超速离心(200,000g，20℃，60分钟)，并将上清液作为HPLC分析样品。超速离心机使用了Hitachi,Ltd.制himacCP80WX。
a)校准曲线标准液的制备
称量约20mg的拓扑替康盐酸盐，使其溶解于20mL的10质量％甲醇水溶液中。将milli-Q水添加到该液体中，制备拓扑替康盐酸浓度0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0或100.0ppm的溶液，制成校准曲线标准液。
b)试样溶液的制备
(1)用MICROMAN(注册商标)称取约50μL的试样(脂质体制剂溶液)，并向其中添加了用MICROMAN称取的约950μL的甲醇。此时，振动约1分钟，目视确认到溶液变得透明。
(2)用MICROMAN称取100μL的上述(1)的溶液，并添加了用微量吸移管称取的约900μL的milli-Q水。将该液体振动约1分钟之后，进行约1分钟超声波处理，进一步振动约10秒钟。
(3)将使用DISMIC(注册商标)过滤器(孔径0.45μm)过滤上述(2)的溶液而得的溶液作为试样溶液。
c)测定
通过液相色谱法/紫外可见吸光度检测法在以下条件下进行了测定。
测定波长：382nm、柱：资生堂CAPCELLPAK C18 ACR 3μm_3.0mm*75mm
柱温：接近40℃的恒温
流动相A、B均为水/甲醇/三氟乙酸混合液，流动相的送液通过改变流动相A及B的混合比来控制浓度梯度。
流量：每分钟1.0mL、注入量：10μL、自动进样器温度：在接近25℃的恒温下进行了测定。
＜硫酸根离子浓度测定＞
使用离子色谱装置883Basic IC plus(Metrohm Japan Ltd.制)测定样品，并对硫酸根离子浓度进行了定量。将测定硫酸根离子与拓扑替康的摩尔比的结果示于表1及表2。在表1及表2的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子与脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率至少为90％。
内水相硫酸根离子浓度通过从全水相硫酸根离子浓度减去外水相硫酸根离子浓度进行计算。
各水相的硫酸根离子浓度以如下方式进行了测定。
(全水相硫酸根离子浓度)
称取50μL的脂质体分散液，并添加甲醇950μL，实施15秒钟的超声波处理并进行了混合。称取90μL的该液体，并添加810μL的注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.制)，实施30秒钟的超声波处理并进行了混合。在该溶液中添加900μL的乙酸乙酯，充分摇动以将脂质类提取到乙酸乙酯相中。称取适量的水相溶液，用于离子色谱分析。
(外水相硫酸根离子浓度)
称取100μL的脂质体分散液，添加900μL的5％葡萄糖溶液(OtsukaPharmaceutical Co.,Ltd.制)进行了稀释。通过超滤处理450μL的该溶液，将该滤液作为离子色谱分析样品。
离心条件为7400g，5℃，30分钟。离心分离机使用了Hitachi,Ltd.制himacCF15RXII。
＜AUC的测定＞
关于给予制备的含有拓扑替康的脂质体的小鼠(给药量以药物量计为1mg/kg)，在给药后在0.25、2、6、24小时进行采血。血液以800xg离心10分钟，回收了血浆。针对所采集的血浆，利用液相色谱法/质量分析/质量分析(LC/MS/MS)进行了拓扑替康浓度的定量。使用药代动力学分析软件WinNonlin(注册商标)(Certara)从所获得的拓扑替康浓度转变计算单次给药后直至无线时间的血液中浓度-时间曲线下面积(AUC)。AUC的单位为时间×ng/mL(在表中，标记为hr*ng/mL)。另外，非专利文献1中记载的脂质体的AUC被计算为68152小时×ng/mL。
[表1]
[表2]
由表1及表2的结果可知，在包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂及胆固醇作为作为脂质体膜的构成成分的脂质体组合物中，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子与全水相药物的摩尔比为0.36以上的实施例1～10中，显示AUC的测定值成为200000以上，并能够实现高的血中滞留性。另一方面，在未使用二氢鞘磷脂的比较例1至比较例8、内水相硫酸根离子与全水相药物的摩尔比小于0.36的比较例9及比较例10、未使用经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺的比较例11及比较例12中，显示AUC的测定值小于200000，并且比实施例1至实施例10差。
＜使用了A549皮下移植小鼠模型的药效试验＞
对Balb/c/nu/nu小鼠(雌性、6周龄)，将作为人肺癌细胞株的A549细胞1×107个移植到右腹侧部皮下。从移植后第15天开始给予实施例10中制备的含有拓扑替康的脂质体(作为药物量为4mg/kg及2mg/kg、将每周1次给药进行2次)、在比较例12中制备的含有拓扑替康的脂质体(作为药物量为4mg/kg及2mg/kg、将每周1次给药进行2次)。并且，作为阴性对照给予生理食盐溶液。并且，作为比较对照，给予拓扑替康水溶液(作为药物量为2mg/kg)。从给药开始每周2次测定体重及肿瘤体积。将体重的测定结果示于图1及图2，并将肿瘤体积的测定结果示于图3及图4。
由图3及图4的结果可知，与比较例12中制备的拓扑替康溶液相比，实施例10中制备的含有拓扑替康的脂质体显示高的药效，效果依赖于用量。
＜实施例11～16、比较例13～16＞
针对实施例11～16，改变了DHSM、DSPE-PEG及胆固醇的量，以使调整油相时的胆固醇的添加量和来自于鸡蛋的DHSM的添加量成为表3中记载的比率，除此以外，以与实施例1相同的方式制作。例如，关于实施例11，针对调整油相时的胆固醇的添加量和来自鸡蛋的DHSM的添加量，将胆固醇改变为3.6g、将来自鸡蛋的DHSM改变为12.9g，除此以外，以与实施例1相同的方式制作。
关于比较例13～16，改变了SM、DSPE-PEG及胆固醇的量以成为表3中记载的比率。
同样地将测定粒径、全水相拓扑替康浓度、内水相硫酸根离子浓度、AUC的结果示于表3。并且，将相对于各胆固醇量的AUC的值示于图5。
在表3的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的药物与脂质体组合物整体的药物的比率除比较例13以外至少为98％。比较例13为68％。
在表3的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子与脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率除比较例13以外至少为90％。比较例13为71％。
[表3]
由实施例11～16、比较例1、2、4、7、13～16的结果可知，在使用了来自鸡蛋的DHSM的脂质体的宽度比SM脂质体的宽度宽的胆固醇的添加比率中，本发明能够实现良好的AUC。并且，在本发明的来自鸡蛋的DHSM脂质体中，可知尤其在胆固醇比率为35～43摩尔％的范围内AUC更良好。
＜实施例17～24、比较例17～24＞
＜脂质体分散液的制作＞
关于实施例17～24、比较例17～24，如表4那样设定调整油相时的各脂质的添加量，并且，如表4那样设定通过远程加载内含于脂质体粒子中的药物，除拓扑替康以外的药剂在下述＜通过远程加载使各抗癌剂内含于脂质体粒子中＞所记载的方法中内含药剂，除此以外，以与实施例1相同的方式制作。并且，关于实施例17～24、比较例17～24，将各自的脂质构成比示于表5。
[表4]
全合成DHSM/g 鸡蛋DHSM/g Chol/g PEG/g 药剂种
实施例17 11.52 - 4.32 4.32 拓扑替康
实施例18 - 11.52 4.32 4.32 拓扑替康
实施例19 11.52 - 4.32 4.32 阿霉素
实施例20 - 11.52 4.32 4.32 阿霉素
实施例21 11.52 - 4.32 4.32 舒尼替尼
实施例22 - 11.52 4.32 4.32 舒尼替尼
实施例23 11.52 - 4.32 4.32 伊立替康
实施例24 - 11.52 4.32 4.32 伊立替康
比较例17 11.52 - 4.32 4.32 拓扑替康
比较例18 - 12.98 4.26 4.20 拓扑替康
比较例19 11.52 - 4.32 4.32 阿霉素
比较例20 - 12.98 4.26 4.20 阿霉素
比较例21 11.52 - 4.32 4.32 舒尼替尼
比较例22 - 12.98 4.26 4.20 舒尼替尼
比较例23 11.52 - 4.32 4.32 伊立替康
比较例24 - 12.98 4.26 4.20 伊立替康
[表5]
＜通过远程加载使各抗癌剂内含于脂质体粒子＞
阿霉素的包封(实施例19、20、比较例19、20)：将注射用水添加到阿霉素盐酸盐(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制)中，制成4mg/mL。此外，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使阿霉素盐酸盐溶解。将脂质体以1/1的容积比添加到该阿霉素溶液之后，将pH调整为7.0的分散液在62℃加热60分钟。
舒尼替尼的包封(实施例21、22、比较例21、22)：将注射用水添加到苹果酸舒尼替尼(Toronto Reserch chemicals Inc.制)中，制成5mg/mL。此外，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使苹果酸舒尼替尼溶解。向该舒尼替尼溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在62℃下加热了60分钟。
伊立替康的包封(实施例23、24、比较例23、24)：将注射用水添加到伊立替康盐酸盐(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制)中，制成4mg/mL。此外，一边充分搅拌液体一边添加8mol/L的HCl溶液，将pH调整为约3而使伊立替康盐酸盐溶解。向该伊立替康溶液以1/1的容积比添加脂质体之后，在62℃下加热了60分钟。
关于实施例17～22、比较例17～22，将在本实施例中以与上述方法相同的方法测定AUC的结果示于表6。
[表6]
药剂 脂质 AUC
hr*ng/mL
实施例17 拓扑替康 全合成DHSM 227177
实施例18 拓扑替康 来自鸡蛋的DHSM 201266
比较例17 拓扑替康 SM 164034
比较例18 拓扑替康 HSPC 86692
实施例19 阿霉素 全合成DHSM 506246
实施例20 阿霉素 来自鸡蛋的DHSM 539688
比较例19 阿霉素 SM 481802
比较例20 阿霉素 HSPC 433691
实施例21 舒尼替尼 全合成DHSM 37661
实施例22 舒尼替尼 来自鸡蛋的DHSM 26421
比较例21 舒尼替尼 SM 19904
比较例22 舒尼替尼 HSPC 6453
由实施例17～22、比较例17～22的结果，成为如下结果：即使在使用拓扑替康及舒尼替尼中的任一种药剂的情况下，相较于SM脂质体及HSPC脂质体，使用了DHSM的脂质体的一方血中滞留性得到提高。并且，可知与来自鸡蛋的DHSM相比使用了具有碳原子数16和18的烷基链的DHSM具有98％以上的纯度的全合成DHSM作为DHSM的脂质体的血中滞留性能够提高。
关于实施例17～24、比较例17～18、21～24，将测定了粒径、拓扑替康浓度、硫酸根离子浓度、释放率的结果示于表7。粒径、拓扑替康浓度、硫酸根离子浓度在本实施例中以与上述方法相同的方式进行了测定。
在表7的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的药物与脂质体组合物整体的药物的比率至少为95％。
在表7的脂质体中，脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子与脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率至少为95％。
在各浓度的含有氯化铵的PBS缓冲液中将脂质体制剂稀释20倍，测定了培养4小时的时点的释放率。释放率定义为将泄漏到外水相的API浓度处以初始的全水相API浓度计算而得的值的百分率。
作为各浓度的氯化铵含有PBS缓冲液，使用了将
在实施例17、18、比较例17、18(内含拓扑替康的脂质体的评价)中，氯化铵4.8mmol/L、
在实施例19、20、比较例19、20(内含阿霉素的脂质体的评价)中，氯化铵200mmol/L、
在实施例21、22、比较例21、22(内含舒尼替尼的脂质体的评价)中，氯化铵100mmol/L、
在实施例23、24、比较例23、24(伊立替康内包脂质体的评价)中，氯化铵4.8mmol/L溶解而得的PBS缓冲液。
[表7]
由实施例17～24、比较例17～18、21～24的结果，成为如下结果：即使在使用任一种药剂的情况下，也能够期待相较于SM脂质体及HSPC脂质体，使用了DHSM的脂质体的释放率降低，血中滞留性提高。并且，可知使用了具有碳原子数16和18的烷基链的DHSM具有98％以上的纯度的全合成DHSM作为DHSM时，内含拓扑替康的脂质体及内含阿霉素的脂质体、内含伊立替康的脂质体中，释放率能够大大降低，并抑制血液中的泄漏，因此更优选。
＜不溶性微粒测定＞
关于实施例2、3、4，使用液中粒子计数器(HACH ULTRA)分别测定在5℃下保管后1个月的样品，并测定每1小瓶制剂(2mL)所含有的大于10μm的粒子及大于25μm的粒子的个数(以下，只要没有特别说明，大于10μm的粒子是指粒径大于10μm的粒子。大于25μm的粒子是指粒径大于25μm的粒子。)。实施例2、3、4中，脂质浓度为23mmol/L，若以每1μmol的脂质的粒子的个数定义，关于大于10μm的粒子，实施例2为0.7个、实施例3为1.1个、实施例4为0.3个。并且，关于大于25μm的粒子，实施例2为0.09个、实施例3为0.5个、实施例4为0个。已知内含拓扑替康的脂质体在泄漏并暴露于中性环境时分解成难溶性的二聚体，成为不溶性微粒。该结果由于通过本发明能够极好地抑制泄漏，因此能够减少不溶性微粒的产生，这是令人惊讶的结果。
关于比较例8，在5℃下保管后1个月的样品中测定1小瓶制剂(2mL)中的不溶性微粒。若换算成每1μmol的脂质的粒子的个数，大于10μm的粒子为251个且大大超过150个，并且大于25μm的粒子的个数为17个，大大超过了15个。
＜铵离子对释放率的依赖性＞
释放率以相对于全水相药剂浓度的泄漏的药剂浓度(外水相浓度)的百分率来计算。测定了实施例17中制作的内含拓扑替康的DHSM脂质体、内含阿霉素的HSPC脂质体(DOXIL(注册商标)20MG、Janssen Pharmaceutical K.K.)在将未添加氯化铵的血浆(LAMPIRE制、小鼠血浆、产品名：Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep、目录编号7315511)与5mmol/L的氯化铵进行溶解而得的血浆中的释放率。将其结果示于图6。在肿瘤环境中，谷氨酰胺分解增强，其结果，产生大量的铵，据报道产生约5mmol/L(引用论文：Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and medicien,11(2015)1841-1850)。
DOXIL(注册商标)20MG为内含由HSPC组成的阿霉素的脂质体。可知DOXIL(注册商标)在血液中进行模拟的环境中泄漏极少，在肿瘤环境中进行模拟的高铵环境中几乎没有释放。相对于此，本发明的实施例17中记载的含有拓扑替康的脂质体在血液中进行模拟的环境中泄漏极少且获得高的血中滞留性，另一方面，在模拟肿瘤环境的高铵环境中为86％，非常高，不会在血液中泄漏，而将大量的药物通过脂质体输送到肿瘤，通过脂质体输送的药物在肿瘤中大量释放，这成为值得期待的结果。将该结果示于图6。
并且，采集将人卵巢癌细胞株ES-2实际移植到BALB/c裸鼠的皮下而得的肿瘤，装载于孔径5μm的离心过滤器上，以400g离心10分钟，由此获得了肿瘤间质液。在肿瘤间质液30μL中分别添加实施例17中制作的本发明的拓扑替康脂质体(作为药物量为30ng)、内含阿霉素的HSPC脂质体(DOXIL(注册商标)20MG、Janssen Pharmaceutical K.K.)(作为药物量为30ng)，在37℃下培养24小时的释放率在实施例17中为85％，在内含阿霉素的HSPC脂质体为6％，在从实际的肿瘤环境中采取的肿瘤间质液中，如所期待那样观察到释放性的差异。

Claims (14)

1.一种脂质体组合物，其包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂、及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，
其中，所述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.36以上，
脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺的比率为1～15摩尔％，二氢鞘磷脂的比率为30～80摩尔％，胆固醇类的比率为30～45摩尔％。
2.根据权利要求1所述的脂质体组合物，其中，
药物为拓扑替康或其盐、阿霉素或其盐、伊立替康或其盐、舒尼替尼或其盐。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
内水相硫酸根离子相对于全水相药物的摩尔比为0.6以上且1.8以下。
4.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺为经聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺。
5.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺的比率为2～10摩尔％。
6.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
脂质体膜的构成成分中的二氢鞘磷脂的比率为50～60摩尔％。
7.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
脂质体膜的构成成分中的胆固醇类的比率为35～43摩尔％。
8.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
粒径为150nm以下。
9.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
外水相的pH为5.5～8.5。
10.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
二氢鞘磷脂为包含碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，内含药物为拓扑替康或其盐。
11.根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其中，
脂质体的内水相中所含有的硫酸根离子相对于脂质体组合物整体的硫酸根离子的比率至少为80％，脂质体的内水相中所含有的药物相对于脂质体组合物整体的药物的比率至少为80％。
12.一种医药组合物，其包含权利要求1或2所述的脂质体组合物。
13.根据权利要求11所述的医药组合物，其为抗癌剂。
14.一种脂质体组合物，其包含经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺、二氢鞘磷脂、及胆固醇类作为脂质体膜的构成成分，
其中，所述脂质体组合物内含药物，内水相包含硫酸铵，
二氢鞘磷脂为具有碳原子数16和碳原子数18的长链烷基的二氢鞘磷脂，
脂质体膜的构成成分中的经亲水性高分子修饰的二酰基磷脂酰乙醇胺的比率为1～15摩尔％，二氢鞘磷脂的比率为30～80摩尔％，胆固醇类的比率为30～45摩尔％。
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