WO2018181963A1 - リポソーム組成物および医薬組成物 - Google Patents

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典之 笠置
山田　直樹
幹永 森
加藤　貴之
貴之 小林
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Definitions

  • the present invention relates to a liposome composition and a pharmaceutical composition exhibiting high blood retention.
  • a liposome composition as a pharmaceutical composition, a drug is encapsulated in a liposome composed of a lipid membrane.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe liposomes in which topotecan is encapsulated in liposomes containing sphingomyelin and cholesterol.
  • Patent Document 2 describes a liposome in which topotecan is encapsulated in a liposome containing dihydrosphingomyelin and cholesterol.
  • Patent Document 3 discloses a liposomal camptothecin preparation adapted to enhance the stability of camptothecin, wherein (a) camptothecin encapsulated in the liposome, (b) outside the liposome, pH less than 4.5 or A formulation comprising a first solution that is 5 and (c) a second solution that is inside a liposome is described. It is also described that the liposome contains dihydrosphingomyelin and cholesterol.
  • Patent Document 4 discloses a system for effectively filling an amphipathic drug into liposomes, in which a liposome suspension is prepared in the presence of an ammonium compound or an ammonium salt, and the suspension is diluted with a buffer or a salt. And providing an ammonium gradient from the inner side to the outer side between the inner aqueous phase and the outer aqueous phase, and a pH gradient such that the pH inside the liposome is more acidic than the outside pH, The system is described.
  • Patent Document 5 describes a liposome in which topotecan is encapsulated in a liposome containing purified hydrogenated soybean phospholipid or sphingomyelin, cholesterol and a hydrophilic polymer derivative lipid in the presence of ammonium sulfate.
  • topotecan is encapsulated in liposomes containing sphingomyelin or dihydrosphingomyelin to suppress the outflow of topotecan in the blood, and AUC (Area Under) It is described that the drug effect is improved by improving the blood concentration-time curve (the area under the blood concentration-time curve).
  • AUC Absolute Under
  • topotecan when topotecan leaks from the inner aqueous phase of the liposome to the outer aqueous phase and is exposed to neutral conditions, topotecan changes to an analog. Specifically, an N—N ⁇ ⁇ bis adduct (topotecanamine dimer) having extremely low solubility may precipitate and precipitate as crystals. Ultimately, many insoluble particulates are produced that deviate from the safety and quality standards set forth by US Food and Drug Administration (FDA), Japanese Pharmaceutical and Medical Device Agency (PMDA), and European Medicines Agency (EMEA). It is not preferable. In order to suppress the generation of such insoluble fine particles, in Patent Document 3, the pH of the outer aqueous phase is set to an acidic condition.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • PMDA Japanese Pharmaceutical and Medical Device Agency
  • EMEA European Medicines Agency
  • the present inventors have used diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as constituents of the liposome membrane.
  • the phase contains ammonium sulfate and that the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is 0.36 or more can provide a liposome composition that solves the above problems. It came.
  • a liposome composition comprising diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as a component of the liposome membrane, the liposome composition encapsulating a drug, and the inner aqueous phase is ammonium sulfate
  • a liposome composition having a molar ratio of inner aqueous phase sulfate ion to total aqueous phase drug of 0.36 or more.
  • the ratio of sulfate ions contained in the inner aqueous phase of the liposome to sulfate ions in the entire liposome composition is at least 80%, and the ratio of the drug contained in the inner aqueous phase of the liposome to the drug in the entire liposome composition is at least 80%.
  • the release rate of the drug from the liposome in plasma with an ammonium concentration of 1 mmol / L or less is 20% / 24 hours or less at 37 ° C.
  • the release rate of the drug from the liposome in plasma with an ammonium concentration of 4-6 mmol / L is The liposome composition according to [9], which is 60% / 24 hours or more at 37 ° C.
  • the number of particles exceeding 10 ⁇ m contained per 1 ⁇ mol of lipid in the liposome composition after storage at 5 ° C. for one month is 15 or less, and the number of particles exceeding 25 ⁇ m contained per 1 ⁇ mol of lipid in the liposome composition is 15 or less.
  • a pharmaceutical composition comprising the liposome composition according to any one of [12]. [14] The pharmaceutical composition according to [13], which is an anticancer agent. [15] A liposome composition containing diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as components of the liposome membrane, the liposome composition encapsulating a drug, and the inner aqueous phase is ammonium A liposome composition comprising a salt, wherein the dihydrosphingomyelin is a dihydrosphingomyelin having a long-chain alkyl group having 16 and 18 carbon atoms.
  • a liposome composition comprising diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer, dihydrosphingomyelin, and cholesterols as constituents of a liposome membrane, wherein the liposome composition encapsulates a drug
  • a method for treating a disease comprising administering to a subject a liposome composition wherein the phase comprises ammonium sulfate and the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is 0.36 or more.
  • Liposome composition comprising diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as components of the liposome membrane for use in the treatment of diseases (preferably cancer)
  • the liposome composition contains a drug, the inner aqueous phase contains ammonium sulfate, and the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is 0.36 or more.
  • a liposome composition comprising diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer, dihydrosphingomyelin, and cholesterols for producing a pharmaceutical composition, wherein the liposome composition encapsulates a drug,
  • the liposome composition encapsulates a drug
  • Use of a liposome composition, wherein the inner aqueous phase contains ammonium sulfate and the molar ratio of inner aqueous phase sulfate ions to the total aqueous phase drug is 0.36 or more.
  • the liposome composition and pharmaceutical composition of the present invention can exhibit high AUC.
  • FIG. 1 shows the measurement results of body weight in a drug efficacy test using an A549 subcutaneously transplanted mouse model.
  • FIG. 2 shows the measurement results of body weight in a drug efficacy test using an A549 subcutaneously transplanted mouse model.
  • FIG. 3 shows the measurement results of tumor volume in a drug efficacy test using an A549 subcutaneously transplanted mouse model.
  • FIG. 4 shows the measurement results of tumor volume in a drug efficacy test using an A549 subcutaneously transplanted mouse model.
  • FIG. 5 shows the AUC value for each cholesterol level.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the dependency of ammonium ions on the release rate.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the amount of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition unless there is a specific notice when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition. To do.
  • Retention in blood means a property in which a drug encapsulated in liposomes is present in blood in a subject administered with a liposome composition.
  • the “average particle size of liposome” means a cumulant average particle size measured using a dynamic light scattering method unless otherwise specified.
  • Examples of commercially available measuring apparatuses using dynamic light scattering include a dense particle analyzer FPAR-1000 (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.), Nanotrack UPA (manufactured by Nikkiso Co., Ltd.), and nanosizer (manufactured by Malvern). It is also possible to calculate the volume average particle diameter and the number average particle diameter of the liposome by a conversion formula specific to each manufacturer's measuring apparatus. In order to measure particles near 100 nm, the static light scattering method or the like cannot accurately grasp the particle distribution, and measurement by the dynamic light scattering method is preferable.
  • “Insoluble microparticles” are items set as safety and quality standards by regulatory authorities such as PMDA, FDA, EMEA in pharmaceutical compositions for systemic administration such as intravenous injections.
  • PMDA light-shielding particle counting method
  • the particle size contained in one drug vial of a product with a displayed amount of less than 100 mL is insoluble with a particle size of 10 ⁇ m or more. It is required that the number of fine particles is 6000 or less and the number of insoluble fine particles having a particle size of 25 ⁇ m or more is 600 or less.
  • the second method microscopic particle counting method
  • the insoluble fine particles are defined only by the size of the particles, regardless of the component of the particles.
  • the insoluble fine particles may be aggregates of the liposomes themselves, or the drug components leaked from the inside of the liposomes. Aggregation and precipitation may be sufficient, and aggregation and precipitation of the component of a liposome outer water phase may be sufficient.
  • the liposome encapsulating topotecan in the present invention is known to be a precipitate formed by the encapsulation of topotecan leaking out of the liposome and decomposing into a degradation product with low solubility. It has been.
  • a light shielding particle counting method particle counter, for example, HIAC 9703+ manufactured by Beckman Coulter, Inc., Accusizer A2000USP manufactured by Particle Sizing Systems, Inc.
  • a microscopic particle counting method in which the magnified image is visually observed and counted.
  • a liposome pharmaceutical composition particularly an injectable preparation, as defined in the Japanese Pharmacopoeia ⁇ 6.07> insoluble fine particle test method for injectables
  • 6000 particles having a particle size exceeding 10 ⁇ m are included in the pharmaceutical composition when used.
  • the number of particles having a particle size exceeding 25 ⁇ m is preferably 600 or less.
  • insoluble fine particles In injectable preparations of liposomal pharmaceutical compositions, the cause of insoluble fine particles is mostly due to aggregation, coalescence, and decomposition of liposome particle components that occur during storage, but is not limited thereto. There is a tendency that insoluble fine particles are generated depending on the amount of lipid which is a main material constituting the liposome. For example, when considering a pharmaceutical composition containing 2 mL of a liposome composition having a lipid concentration of 20 mmol / L, 150 particles or less with a particle size exceeding 10 ⁇ m per 1 mol of lipid, and 15 particles or less with a particle size exceeding 25 ⁇ m.
  • the liposome composition of the present invention it is preferable that after storage for 1 month at 5 ° C., 150 particles or less having a particle size exceeding 10 ⁇ m per 1 mol of lipid and 15 or less particles having a particle size exceeding 25 ⁇ m. . More preferably, after storage for 1 month at 5 ° C., 75 particles or less with a particle size exceeding 10 ⁇ m per 1 mol of lipid and 7.5 particles or less with a particle size exceeding 25 ⁇ m.
  • coarse particles having a particle size exceeding 10 ⁇ m often increase due to deterioration over time during storage, and preferably satisfy the above number even after storage for 3 months, and satisfy the above number even after one year storage. It is more preferable.
  • Subject refers to mammals such as humans, mice, monkeys, and livestock that require prevention or treatment of diseases, and preferably humans that require prevention or treatment of diseases and the like.
  • the liposome composition according to the first aspect of the present invention is a liposome composition containing diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as components of the liposome membrane, Encapsulated, the inner aqueous phase contains ammonium sulfate, and the molar ratio of inner aqueous phase sulfate ions to the total aqueous phase drug is 0.36 or more.
  • the liposome composition according to the second aspect of the present invention is a liposome composition containing diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer, dihydrosphingomyelin, and cholesterols as components of the liposome membrane,
  • the drug is encapsulated, the inner aqueous phase contains an ammonium salt, and the dihydrosphingomyelin is a dihydrosphingomyelin having a long-chain alkyl group having 16 and 18 carbon atoms.
  • the retention of liposomes in blood is improved by using diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer as components of the liposome membrane.
  • the inner aqueous phase contains ammonium sulfate, leakage of the drug from the liposome in the blood is suppressed, and AUC is improved.
  • the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is 0.36 or more, the leakage of the drug from the liposome in the blood is further suppressed, and a higher AUC is achieved.
  • the pH of the outer aqueous phase can be set near neutral (pH 7.4), and hydrolyzed under acidic conditions, “diacylphosphatidyl ethanol modified with a hydrophilic polymer” Amine "can be used to improve blood retention.
  • a liposome is a closed vesicle formed of a lipid bilayer membrane using lipid, and has an aqueous phase (inner aqueous phase) in the space of the closed vesicle.
  • the inner water phase includes water and the like.
  • Liposomes usually exist in a dispersed state in an aqueous solution outside the closed vesicles (outer aqueous phase). Liposomes are single lamellae (also called single-layer lamellae or unilamellar, and double-layer membranes have a single structure), but they are multi-layer lamellae (also called multi-lamellar, which have a large number of onion-like bilayer membranes). In the present invention, from the viewpoint of safety and stability in pharmaceutical use, it is a single-lamellar liposome. Is preferred.
  • the form of the liposome is not particularly limited as long as it is a liposome capable of encapsulating a drug.
  • “Encapsulation” means that the drug is in a form in which the drug is contained in the inner aqueous phase and the membrane itself.
  • a form in which a drug is enclosed in a closed space formed of a film, a form in which the drug is included in the film itself, and the like may be used.
  • the average particle size of the liposome is generally 10 nm to 1000 nm, preferably 20 nm to 500 nm, more preferably 30 to 300 nm, still more preferably 30 nm to 200 nm, and even more preferably 150 nm or less, for example, 30 nm to 150 nm. 70 to 150 nm is particularly preferable.
  • Liposomes are preferably in the form of spheres or similar.
  • the component constituting the lipid bilayer of the liposome is selected from lipids.
  • lipid one that can be dissolved in a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and an ester-based organic solvent can be used.
  • the liposome in the present invention contains diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer, dihydrosphingomyelin, and cholesterols as components of the liposome membrane.
  • a liposome is a closed endoplasmic reticulum formed by a lipid bilayer membrane using lipid as described above.
  • a lipid as a base material for forming a lipid bilayer membrane is a phosphorous having two acyl chains.
  • Lipids such as phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, cardiolipin, or hydrogenated ones (for example, , Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC)) and the like.
  • HSPC Hydrogenated soybean phosphatidylcholine
  • a phospholipid having two acyl chains is used as a lipid serving as a base material for forming a lipid bilayer membrane.
  • dihydrosphingomyelin the retention of liposomes in blood can be improved.
  • dihydrosphingomyelin as the base material of the liposome membrane, the partition property of the liposome membrane can be improved and leakage of the encapsulated drug can be prevented. This is presumed that the amide bond of dihydrosphingomyelin has a strong hydrogen bonding ability and can form a strong and highly partitionable film by strongly interacting with each other.
  • dihydrosphingomyelin that is completely saturated has a high melting point and lowers the mobility of the formed film.
  • dihydrosphingomyelin can make a membrane having a high partitioning property.
  • Dihydrosphingomyelin generally has two long-chain alkyl groups in the molecule, two long-chain alkyl groups having 16 carbon atoms, long-chain alkyl groups having 16 and 18 carbon atoms. And those having a long-chain alkyl group having 16 carbon atoms and 20 to 24 carbon atoms.
  • dihydrosphingomyelin from the viewpoint of preventing leakage of the drug from the liposome, it is preferable to use the following compounds having a long-chain alkyl group having 16 and 18 carbon atoms. This is because the higher the number of carbon atoms, the higher the melting point and the higher the ability to make a liposome membrane.
  • dihydrosphingomyelin for example, dihydrosphingomyelin obtained by reducing sphingomyelin derived from a natural product by a general method may be used, or dihydrosphingomyelin obtained by synthesis may be used. Since dihydrosphingomyelin derived from natural products such as chicken eggs generally has two long-chain alkyl groups having 16 carbon atoms, dihydrosphingomyelin having long-chain alkyl groups having 16 and 18 carbon atoms. It is preferable to use a product obtained by chemical synthesis in that it can be obtained with high purity.
  • the proportion of dihydrosphingomyelin in the constituent components of the liposome membrane is preferably 30 to 80 mol%, more preferably 40 to 70 mol%, still more preferably 50 to 60 mol%. is there.
  • hydrophilic polymer in diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer examples include, for example, polyethylene glycols, polyglycerols, polypropylene glycols, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, polyvinylpyrrolidone, synthesis Examples include polyamino acids. Said hydrophilic polymer can be used individually or in combination of 2 types or more, respectively.
  • polyethylene glycols, polyglycerols and polypropylene glycols are preferable from the viewpoint of blood retention of the composition, and polyethylene glycol (PEG), polyglycerol (PG), polypropylene glycol (PPG) and derivatives thereof. Is more preferable.
  • polyethylene glycol (PEG) and its derivatives are more preferable.
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of polyethylene glycol (PEG) derivatives include, but are not limited to, methoxypolyethylene glycol.
  • the molecular weight of polyethylene glycols is not particularly limited, but is 500 to 10,000 daltons, preferably 1,000 to 7,000 daltons, and more preferably 2,000 to 5,000 daltons.
  • the carbon number of acyl in diacylphosphatidylethanolamine is preferably 16 or more, for example, preferably 16 to 30 carbon atoms, more preferably 16 to 24 carbon atoms, and further preferably 20 carbon atoms.
  • diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol examples include 1,2-distearoyl-3-phosphatidylethanolamine-PEG2000 (manufactured by NOF Corporation), 1,2-distearoyl-3-phosphatidylethanolamine- 1,2-distearoyl-3-phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol such as PEG5000 (manufactured by NOF Corporation) and distearoylglycerol-PEG2000 (manufactured by NOF Corporation).
  • the ratio of diacylphosphatidylethanolamine modified with a hydrophilic polymer in the components of the liposome membrane is preferably 1 to 15 mol%, more preferably 2 to 10 mol%. .
  • cholesterols examples include cholesterol having cyclopentahydrophenanthrene as a basic skeleton, and part or all of which are hydrogenated, and derivatives thereof.
  • cholesterol is preferable.
  • the curvature of the lipid membrane may increase.
  • the strain of the membrane arranged in the liposome is also increased. It is effective to add cholesterol or the like in order to fill the membrane distortion caused by lipids (membrane stabilization effect).
  • the addition of cholesterol is expected to lower the fluidity of the liposome membrane by filling the gap in the liposome membrane.
  • the proportion of cholesterol in the constituent components of the liposome membrane is preferably 20 mol% to 50 mol%, more preferably 30 mol% to 45 mol%, still more preferably 35 to 43 mol%. %.
  • the liposome may be added with a hydrophilic polymer or the like for the purpose of improving blood retention, fatty acid or diacetyl phosphate as a membrane structure stabilizer, and ⁇ -tocopherol as an antioxidant. Good.
  • additives such as dispersion aids that are not approved for intravenous use in pharmaceutical applications, such as surfactants.
  • the liposome composition of the present invention contains a drug.
  • the anticancer agent illustrated below can be used. Specifically, anthracycline anticancer agents such as doxorubicin, daunorubicin and epirubicin; Cisplatin anticancer agents such as cisplatin and oxaliplatin; Taxane anticancer agents such as paclitaxel and docetaxel; Vinca alkaloid anticancer agents such as vincristine and vinblastine; Bleomycin-based anticancer agents such as bleomycin; Sirolimus anticancer drugs such as sirolimus; Camptothecin-based anticancer agents such as topotecan (also referred to as Nogitecan), irinotecan, Karenitecin (registered trademark) (also referred to as BNP1350), exatecan, roottecan, gimatecan (also referred to as ST1481) and belothecan (also referred to as
  • the drug may be used as a salt form.
  • the salt of a drug include salts that are generally known in basic groups such as an amino group and acidic groups such as a hydroxyl group and a carboxyl group.
  • salts in the basic group include salts with mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, boric acid, nitric acid and sulfuric acid; formic acid, acetic acid, lactic acid, citric acid, oxalic acid, fumaric acid, malein Acids, succinic acid, malic acid, tartaric acid, aspartic acid, salts with organic carboxylic acids such as trichloroacetic acid and trifluoroacetic acid; and methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, mesitylenesulfonic acid and naphthalenesulfonic acid And salts with sulfonic acid such as
  • salts in the acidic group include salts with alkali metals such as sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium; ammonium salts; and trimethylamine, triethylamine, tributylamine, pyridine, N, N— Nitrogen-containing organic bases such as dimethylaniline, N-methylpiperidine, N-methylmorpholine, diethylamine, dicyclohexylamine, procaine, dibenzylamine, N-benzyl- ⁇ -phenethylamine, 1-ephenamine and N, N′-dibenzylethylenediamine And a salt thereof.
  • alkali metals such as sodium and potassium
  • salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium
  • ammonium salts and trimethylamine, triethylamine, tributylamine, pyridine, N, N— Nitrogen-containing organic bases such as dimethylaniline, N-methylpiperidine, N-methylmorpholine, diethy
  • the content of the drug in the liposome composition is not particularly limited, but is preferably 0.025 to 20 mg / ml, more preferably 0.25 to 10 mg / ml with respect to the liposome composition.
  • the amount of drug encapsulated in the liposome relative to the lipid forming the liposome membrane is preferably 0.1 to 1.5 in terms of molar ratio from the viewpoint of the release rate from the liposome, the osmotic pressure inside the liposome, and the liposome shape due to the precipitated drug, 0.2 to 0.3 is more preferable.
  • the molar ratio of the drug amount to the lipid When the molar ratio of the drug amount to the lipid is too low, the area of the liposome membrane with respect to the unit drug amount is increased, so that the release rate of the drug from the liposome is increased and the function of improving the blood retention is impaired. On the other hand, if the molar ratio of the drug amount to the lipid is too high, the osmotic pressure inside the liposome rises due to an increase in the amount of drug dissolved and the liposome is destroyed, or if the drug precipitates inside the liposome The solid matter thus grown grows and the liposome shape is deformed.
  • the internal aqueous phase of the liposome in the present invention contains ammonium sulfate.
  • the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is 0.36 or more, preferably 0.4 or more.
  • the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is more preferably 0.4 or more and 1.8 or less, and still more preferably 0.6 or more and 1.8 or less.
  • the molar ratio of the internal aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug as described above, leakage of the drug from the liposome in the blood can be suppressed. If the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is too low, the formation of solids due to the sulfate of the drug will be incomplete, and the concentration of the drug in the dissolved state will increase the permeability of the liposome membrane within the liposome. The drug is likely to leak from the liposome, and the effect of improving the blood retention is impaired.
  • the ratio of sulfate ions contained in the inner aqueous phase of the liposome to the sulfate ions in the entire liposome composition is preferably at least 80%, preferably 90% or more. More preferably, at the same time, the ratio of the drug contained in the internal aqueous phase of the liposome to the total drug in the liposome composition (the internal aqueous phase ratio of the drug) is preferably at least 80%, preferably 90% or more. Is more preferable.
  • the drug concentration in the liposome can be measured by, for example, liquid chromatography / ultraviolet visible absorbance detection method.
  • the sulfate ion concentration in the inner aqueous phase of the liposome can be measured, for example, by ion chromatography.
  • the liposome composition of the present invention can comprise a liposome encapsulating a drug and an aqueous solvent (external aqueous phase) in which the liposome is dispersed.
  • the pH of the outer aqueous phase is preferably neutral, and specifically, is preferably about pH 5.5 to 8.5.
  • the liposome composition of the present invention has a surprising mechanism that suppresses drug leakage in the blood, delivers a sufficient amount of drug to the tumor site, and rapidly releases the drug in the tumor site.
  • the liposome composition of the present invention is In an environment where glutamine degradation is enhanced and the ammonium concentration is high (5 mmol / L) like a tumor, drug release is greatly increased.
  • the release rate of the drug from the liposome in plasma with an ammonium concentration of 1 mmol / L or less is 20% / 24 hours or less at 37 ° C., and the plasma has an ammonium concentration of 4 to 6 mmol / L.
  • the release rate of the drug from the liposome is 60% or more, more preferably the release rate of the drug from the liposome in plasma having an ammonium concentration of 1 mmol / L or less is 15% / 24 hours or less at 37 ° C.
  • the release rate of the drug from the liposomes in plasma at a concentration of 4-6 mmol / L is 70% or more.
  • the method for producing the liposome composition of the present invention is not particularly limited, but as an example, (A) preparation of the oil phase; (B) preparation of the aqueous phase; (C) liposome particle formation by emulsification; (D) sizing with an extruder; (E) replacement of the aqueous liposome external phase by dialysis; (F) Encapsulation of the drug in liposome particles by remote loading; and (g) Removal of the external aqueous phase drug by dialysis: It can be manufactured by the process. (D) Sizing with an extruder may or may not be performed.
  • each component constituting the liposome diacylphosphatidylethanolamine, dihydrosphingomyelin, and cholesterols modified with a hydrophilic polymer
  • an organic solvent used in an oil phase is not specifically limited, For example, the water-soluble organic solvent arbitrarily mixed with water can be used.
  • water-soluble organic solvent examples include alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol and t-butanol, glycols such as glycerin, ethylene glycol and propylene glycol, and polyethylene glycol. Examples include polyalkylene glycols. Among these, alcohols are preferable.
  • the alcohol is preferably at least one selected from ethanol, methanol, 2-propanol and t-butanol, more preferably at least one selected from ethanol, 2-propanol and t-butanol, More preferably, it is ethanol.
  • the concentration of each component constituting the liposome is not particularly limited and can be appropriately adjusted.
  • aqueous phase water (distilled water, water for injection, etc.), physiological saline, various buffer solutions or aqueous solutions of saccharides (sucrose, etc.) and mixtures thereof (aqueous solvent) can be used.
  • aqueous ammonium sulfate solution it is preferable to use an aqueous ammonium sulfate solution as the aqueous phase.
  • the buffer is not limited to organic or inorganic, but a buffer having a buffering action near the hydrogen ion concentration close to the body fluid is preferably used.
  • Phosphate buffer, Tris buffer, citric acid Examples include a buffer solution, an acetate buffer solution, and a good buffer.
  • the internal aqueous phase of the liposome may be an aqueous solution in which the liposome is dispersed when the liposome is produced, or water, physiological saline, various buffer solutions or aqueous solutions of saccharides and a mixture thereof newly added. There may be. It is preferable that the water used as the outer aqueous phase or the inner aqueous phase does not contain impurities (dust, chemical substances, etc.).
  • Physiological saline means an inorganic salt solution adjusted to be isotonic with the human body, and may further have a buffering function.
  • physiological saline examples include saline containing 0.9 w / v% (mass / volume percent) of sodium chloride, PBS, and Tris buffered physiological saline.
  • the aqueous phase includes both an outer aqueous phase and an inner aqueous phase.
  • the outer aqueous phase in the present invention means an aqueous solution in which liposomes are dispersed.
  • a solution occupying the outside of the liposome in a dispersion of liposomes stored in a vial or prefilled syringe package is the outer aqueous phase.
  • the solution occupying the outside of the liposome in the liposome dispersion is the outer aqueous phase of the dispersion dispersed at the time of administration using the attached dispersion or other solution.
  • the inner aqueous phase in the present invention means an aqueous phase in a closed vesicle separated by a lipid bilayer of a liposome.
  • the oil phase and the aqueous phase can be mixed and the aqueous solution containing lipid can be stirred and emulsified.
  • an emulsion in which the oil phase and the aqueous phase are emulsified in the O / W type (oil-in-water type) is prepared.
  • liposomes are formed by removing part or all of the organic solvent from the oil phase by evaporation. Alternatively, part or all of the organic solvent in the oil phase evaporates in the course of stirring and emulsification to form liposomes.
  • ultrasonic waves or mechanical shearing force is used for particle refinement.
  • an extruder process or a microfluidizer process through a filter having a fixed pore diameter can be performed. If an extruder or the like is used, the secondary vesicle liposomes can be separated into single vesicle liposomes.
  • the emulsification step is not limited as long as it is an emulsification step, but is preferably a step in which high shear is applied and fine particles are formed in an emulsification step including an organic solvent.
  • High shear is defined by the peripheral speed of the stirring blade of the emulsifier, and is preferably 5 m / s to 32 m / s, particularly preferably 20 m / s to 30 m / s. If necessary, liposomes can be formed by evaporating (desolving) the organic solvent used in the emulsification step.
  • the liquid temperature in the emulsification step in producing the liposome can be adjusted as appropriate, but the liquid temperature at the time of mixing the oil phase and the aqueous phase is preferably equal to or higher than the phase transition temperature of the lipid, For example, when a lipid having a phase transition temperature of 35 to 40 ° C. is used, the temperature is preferably 35 to 70 ° C.
  • the organic solvent and water may be evaporated from the aqueous solution containing liposomes.
  • the term “evaporation” as used herein may forcibly remove part or all of the organic solvent derived from the oil phase and the water derived from the aqueous phase as an evaporation step, or the organic solvent derived from the oil phase and the water derived from the aqueous phase. A part or all of these may naturally evaporate in the process of stirring and emulsification.
  • the method of evaporation is not particularly limited. For example, at least one of a step of evaporating by heating an organic solvent and water, a step of standing still or gently stirring after emulsification, and a step of performing vacuum deaeration is performed. Just do it.
  • the obtained liposome can be made uniform in particle size by using a dialysis method, a filtration method, an extrusion treatment or the like.
  • the extrusion treatment means a process of applying physical shearing force to atomize by passing the liposome through a filter having pores.
  • the liposome dispersion liquid and the filter can be rapidly atomized by keeping the temperature at a temperature higher than the phase transition temperature of the membrane constituting the liposome. Note that the sizing by the extruder may or may not be performed.
  • the liposome external aqueous phase solution may be replaced by dialysis.
  • the dialysate 0.05 to 5 mass% NaCl aqueous solution can be used, but it is not particularly limited.
  • the remote loading method means a method of producing empty liposomes in which no drug is encapsulated and introducing the drug into the liposome by adding the drug to the liposome external solution.
  • the remote loading method is not particularly limited, but a method using an ammonium salt is preferable, and a method using ammonium sulfate is more preferable.
  • the drug added to the external liquid is actively transferred to the liposome and taken into the liposome.
  • a solubility gradient, an ion gradient, a pH gradient, or the like is used as the driving force.
  • a solubility gradient, an ion gradient, a pH gradient, or the like is used.
  • a method of introducing a drug into a liposome using an ion gradient formed across a liposome membrane is used.
  • a technique in which a drug is added to liposomes that are formed in advance by a remote loading method using a Na + / K + concentration gradient.
  • a proton concentration gradient is generally used.
  • the pH of the inner side (inner aqueous phase) of the liposome membrane is lower than the outer side (outer aqueous phase) pH.
  • the pH gradient can be formed by a concentration gradient of an ammonium ion gradient or the like.
  • the liposome solution encapsulating the drug may be dialyzed to remove the drug not contained in the liposome. For example, by using a predetermined concentration of sucrose / histidine buffer as a dialysis solution, the liposome solution containing the drug is dialyzed to remove the drug present in the outer aqueous phase, and the dialysis solution is used to remove the outer aqueous phase. A substituted liposome composition can be obtained.
  • the liposome composition obtained above is preferably subjected to aseptic filtration.
  • As a filtration method an unnecessary thing can be removed from the aqueous solution containing a liposome using a hollow fiber membrane, a reverse osmosis membrane, or a membrane filter.
  • the aseptic filtration step and the aseptic filling step described below are preferably performed at a phase transition temperature or lower of the lipid constituting the liposome.
  • the lipid phase transition temperature is around 50 ° C., it is preferably about 0 to 40 ° C., and more specifically, it is preferably produced at about 5 to 30 ° C.
  • the liposome composition obtained after aseptic filtration is preferably aseptically filled for medical use.
  • a known method can be applied for aseptic filling.
  • a liposome composition suitable for medical use can be prepared by filling the container aseptically.
  • the liposome composition of the present invention may contain at least one of pharmaceutically acceptable isotonic agents, stabilizers, antioxidants, and pH adjusters in relation to the administration route. That is, the liposome composition of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition.
  • the isotonic agent is not particularly limited, but for example, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, glycerol, mannitol, sorbitol, etc.
  • inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, glycerol, mannitol, sorbitol, etc.
  • examples include polyols, sugars such as glucose, fructose, lactose, or sucrose.
  • the stabilizer is not particularly limited, and examples thereof include saccharides such as glycerol, mannitol, sorbitol, lactose, or sucrose.
  • antioxidant For example, ascorbic acid, uric acid, a tocopherol homologue (For example, four isomers of vitamin E, tocopherol alpha, beta, gamma, and delta) cysteine, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), etc. Is mentioned.
  • the stabilizer and the antioxidant can be used alone or in combination of two or more.
  • pH adjusters examples include sodium hydroxide, citric acid, acetic acid, triethanolamine, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and the like.
  • the liposome composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable organic solvent, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, Pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, phosphorus Acid buffered saline (PBS), sodium chloride, saccharides, biodegradable polymer, serum-free medium, pharmaceutical supplement It may contain additives which are acceptable ones.
  • a pharmaceutically acceptable organic solvent collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium
  • the container filled with the liposome composition of the present invention is not particularly limited, but is preferably a material having low oxygen permeability.
  • gas barrier layer made of plastic container, glass container, aluminum foil, aluminum vapor deposition film, aluminum oxide vapor deposition film, silicon oxide vapor deposition film, polyvinyl alcohol, ethylene vinyl alcohol copolymer, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polyvinylidene chloride, etc.
  • a back using a colored glass, an aluminum foil, an aluminum vapor-deposited film, or the like can be used to shield the light.
  • the gas in the container space and the chemical solution with an inert gas such as nitrogen in order to prevent oxidation due to oxygen present in the space in the container.
  • an inert gas such as nitrogen
  • the injection solution may be bubbled with nitrogen and filled into a container under a nitrogen atmosphere.
  • parenteral administration is preferable.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intraocular injection, and intrathecal injection
  • administration method include administration by syringe or infusion.
  • the dosage and number of administrations of the pharmaceutical composition of the present invention may be appropriately set according to the type of drug, the condition of the patient, etc., and generally 0.01 mg per day as the active ingredient drug mass. / Kg to 100 mg / kg can be set. The mass of the drug as the active ingredient can be set in the range of 2 mg to 10 mg per time. However, it is not limited to these dosages.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be preferably used as an anticancer agent.
  • the type of cancer to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied is not particularly limited.
  • lung cancer particularly small cell lung cancer
  • ovarian cancer childhood solid tumor, cervical cancer, breast cancer, prostate Cancer, endometrial cancer, stomach (gastric gland) cancer
  • non-small cell lung cancer pancreatic cancer
  • squamous cell carcinoma of the cervix esophageal cancer
  • bladder cancer melanoma
  • colon cancer renal cell cancer
  • non-Hodgkin Lymphoma urothelial cancer
  • multiple myeloma acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, bone marrow metastatic cancer, sarcoma, soft tissue tumor, ulcer chronic myelomonocytic
  • leukemia Hodgkin lymphoma
  • cutaneous T cell lymph and the like e.gkin lympho
  • SM stands for Sphingomyelin (COATSOME NM-10, NOF Corporation).
  • the egg-derived DHSM indicates dihydrosphingomyelin (a synthetic product obtained by hydrogenating COATSOME NM-10 (manufactured by NOF Corporation)) obtained by hydrogenating the egg-derived SM.
  • This chicken egg-derived DHSM has two alkyl chains having 16 carbon atoms, 70 to 80% of the total, and the rest is a mixture containing DHSMs having different alkyl chain lengths.
  • Fully synthetic DHSM indicates dihydrosphingomyelin produced by chemical synthesis so that the following compounds having 16-carbon and 18-carbon long-chain alkyl groups contain 98% or more.
  • DSPE-PEG SUNBRIGHT DSPE-020CN, manufactured by NOF (hereinafter referred to as DSPE-PEG) was used.
  • Cholesterol HP manufactured by Nippon Seika Co., Ltd. was used as cholesterol (indicated in the table as “Chol”).
  • the water phase prepared in (b) is heated to 65 ° C. and stirred with a magnetic stirrer (3000 rpm).
  • the whole oil phase prepared in (a) is heated to 65 ° C. with a hot plate, and the whole oil phase is sucked with a syringe and heated on the hot plate for 5 minutes.
  • the oil phase is added dropwise to the heated aqueous phase over 30 seconds.
  • Example 1 chicken egg-derived DHSM, PEG phospholipid (SUNBRIGHT DSPE-020CN, manufactured by NOF, hereinafter referred to as DSPE-PEG), and cholesterol were 11.52 g and 4.32 g, respectively. , And 4.32 g.
  • DSPE-PEG PEG phospholipid
  • (C) Liposome particle formation by emulsification The aqueous phase 1 prepared in (b1) was heated to 65 ° C., and the total amount of the oil phase prepared in (a) was added, and then mixed for 60 minutes at a peripheral speed of 26 m / s with a precision emulsification disperser. Subsequently, after adding the aqueous phase 2 at room temperature, the organic solvent and water were evaporated by continuing stirring at a peripheral speed of 0.1 m / s while heating at 65 ° C., and when the liquid was concentrated to 600 mL. Warming and agitation were stopped and evaporation was stopped.
  • Example 9 (A) Preparation of oil phase
  • 0.412 g, 0.153 g, and 0.153 g of chicken egg-derived DHSM, DSPE-PEG, and cholesterol were weighed, respectively.
  • the amounts of hen egg-derived DHSM, DSPE-PEG, and cholesterol were changed so that the ratios shown in Table 2 were obtained.
  • DiI an amount of DiI corresponding to 0.2 mol% with respect to the total lipid was weighed and dissolved in ethanol. Ethanol was added to the DiI ethanol solution to a total volume of 11.25 mL, and 3.75 mL of ethyl acetate was further added.
  • the weighed lipid and this organic solvent were mixed and heated to 60 ° C. to dissolve the lipid to obtain an oil phase.
  • the average particle diameter means a cumulant average particle diameter measured by a dynamic light scattering method.
  • the average particle size of each example and comparative example described in the table is the average particle size of cumulant measured by a dynamic light scattering method using a dense particle size analyzer FPAR-1000AS (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.) with an autosampler. The measurement results are shown in Tables 1 and 2.
  • Tables 1 and 2 show the results of measuring the sample with HPLC (High Performance Liquid Chromatography) apparatus Nexera-i LC-2040C (manufactured by Shimadzu Corporation) and quantifying the topotecan concentration.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Nexera-i LC-2040C manufactured by Shimadzu Corporation
  • a specific measurement method is as follows. In the liposomes of Tables 1 and 2, the ratio of the drug contained in the internal aqueous phase of the liposome to the drug in the entire liposome composition was at least 95% excluding Comparative Example 10. The comparative example 10 was 59%.
  • Measurement of the amount of topotecan in the liposome preparation Measured by liquid chromatography / ultraviolet-visible absorbance detection using a sample solution prepared by dissolving the prepared liposome solution in methanol and filtered and a standard curve standard solution prepared by diluting topotecan hydrochloride .
  • the inner aqueous phase topotecan concentration was calculated by subtracting the outer aqueous phase topotecan concentration from the total aqueous phase topotecan concentration.
  • the topotecan concentration of each aqueous phase was measured as follows. (Total aqueous phase topotecan concentration) 50 ⁇ L of the liposome dispersion was measured, 950 ⁇ L of methanol was added, and vortexed for 1 minute.
  • Measurement wavelength 382 nm
  • column Shiseido CAPCELLPAK C18 ACR 3 ⁇ m_3.0 mm * 75 mm
  • Column temperature constant temperature around 40 ° C.
  • the mobile phases A and B were both water / methanol / trifluoroacetic acid mixed solution, and the mobile phase was fed by changing the mixing ratio of the mobile phases A and B to control the concentration gradient.
  • Flow rate 1.0 mL / min
  • injection volume 10 ⁇ L
  • autosampler temperature measured at a constant temperature around 25 ° C.
  • the inner aqueous phase sulfate ion concentration was calculated by subtracting the outer aqueous phase sulfate ion concentration from the total aqueous phase sulfate ion concentration.
  • the sulfate ion concentration of each aqueous phase was measured as follows. (Total aqueous phase sulfate ion concentration) 50 ⁇ L of the liposome dispersion was measured, 950 ⁇ L of methanol was added, and sonication was performed for 15 seconds, followed by mixing. 90 ⁇ L of the liquid was measured, 810 ⁇ L of water for injection (manufactured by Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) was added, and sonication was performed for 30 seconds, followed by mixing.
  • aqueous phase liquid 100 ⁇ L of the liposome dispersion was measured and diluted by adding 900 ⁇ L of 5% glucose solution (manufactured by Otsuka Pharmaceutical). 450 ⁇ L of the liquid was treated by ultrafiltration, and the filtrate was used as an ion chromatography analysis sample. Centrifugation conditions are 7400 g, 5 ° C., 30 minutes. As the centrifuge, Hitachi Himac CF15RXII was used.
  • mice administered with the prepared topotecan-containing liposome (dose was 1 mg / kg as the drug amount)
  • blood was collected at 0.25, 2, 6, and 24 hours after administration.
  • the blood was centrifuged at 800 ⁇ g for 10 minutes, and plasma was collected.
  • the collected plasma was quantified for topotecan concentration using liquid chromatography / mass spectrometry / mass spectrometry (LC / MS / MS).
  • the area under the blood concentration-time curve (AUC) up to an infinite time after a single administration was calculated from the obtained topotecan concentration transition using the pharmacokinetic analysis software WinNonlin (registered trademark) (Certara).
  • AUC of the liposome described in Non-Patent Document 1 is calculated as 68152 hours ⁇ ng / mL.
  • the inner aqueous phase contains ammonium sulfate.
  • the measured value of AUC was 200,000 or more, and it was shown that high retention in blood could be achieved.
  • Comparative Examples 1 to 8 not using dihydrosphingomyelin Comparative Examples 9 and 10 in which the molar ratio of the inner aqueous phase sulfate ion to the total aqueous phase drug is less than 0.36, and diacylphosphatidylethanol modified with a hydrophilic polymer
  • Comparative Examples 11 and 12 in which no amine was used the measured value of AUC was less than 200,000, which was inferior to Examples 1 to 10.
  • a topotecan aqueous solution (drug amount 2 mg / kg) was administered.
  • Body weight and tumor volume were measured twice a week from the start of administration. The measurement results of body weight are shown in FIGS. 1 and 2, and the measurement results of tumor volume are shown in FIGS.
  • Example 11 to 16 Comparative Examples 13 to 16>
  • Example 11 to 16 except that the amounts of DHSM, DSPE-PEG, and cholesterol were changed so that the amount of cholesterol added and the amount of hen egg-derived DHSM added in the oil phase adjustment were in the ratio shown in Table 3.
  • Example 11 was prepared in the same manner as Example 1 except that the amount of cholesterol added in the oil phase adjustment and the amount of chicken egg-derived DHSM added were changed to 3.6 g of cholesterol and 12.9 g of chicken egg-derived DHSM. did.
  • the amounts of SM, DSPE-PEG, and cholesterol were changed so that the ratios shown in Table 3 were obtained.
  • Table 3 shows the results of measurement of particle diameter, total aqueous phase topotecan concentration, inner aqueous phase sulfate ion concentration, and AUC. Moreover, the value of AUC with respect to each cholesterol amount is shown in FIG.
  • the ratio of the drug contained in the internal aqueous phase of the liposome to the drug in the entire liposome composition was at least 98% except for Comparative Example 13.
  • the comparative example 13 was 68%.
  • the ratio of sulfate ions contained in the internal aqueous phase of the liposomes to sulfate ions in the entire liposome composition was at least 90% except for Comparative Example 13.
  • the comparative example 13 was 71%.
  • Example 17 to 24 Comparative Examples 17 to 24> ⁇ Preparation of liposome dispersion>
  • the amount of each lipid added in the oil phase adjustment is set as shown in Table 4
  • the drug encapsulated in the liposome particles by remote loading is set as shown in Table 4.
  • the drugs other than topotecan were prepared in the same manner as in Example 1 except that the drugs were encapsulated by the method described in ⁇ Encapsulation of anticancer drugs in liposome particles by remote loading> below.
  • Table 5 shows the lipid composition ratios of Examples 17 to 24 and Comparative Examples 17 to 24.
  • Encapsulation of each anticancer drug in liposome particles by remote loading Encapsulation of doxorubicin (Examples 19 and 20, Comparative Examples 19 and 20): Water for injection was added to doxorubicin hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 4 mg / m L. Further, 8 mol / L HCl solution was added while thoroughly stirring the solution, and the pH was adjusted to about 3 to dissolve doxorubicin hydrochloride. Liposomes were added to this doxorubicin solution at a volume ratio of 1/1, and then the dispersion adjusted to pH 7.0 was heated at 62 ° C. for 60 minutes.
  • irinotecan hydrochloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • 8 mol / L HCl solution was added while thoroughly stirring the solution, and the pH was adjusted to about 3 to dissolve irinotecan hydrochloride.
  • Liposomes were added to this irinotecan solution at a volume ratio of 1/1, followed by heating at 62 ° C. for 60 minutes.
  • Table 6 shows the results of measuring AUC for Examples 17 to 22 and Comparative Examples 17 to 22 in the same manner as the method described above.
  • liposomes using DHSM have better retention in blood than SM liposomes and HSPC liposomes. As a result.
  • liposomes using fully synthetic DHSM having a purity of 98% or more of DHSM having an alkyl chain having 16 and 18 carbon atoms as DHSM can improve retention in blood as compared to hen egg-derived DHSM.
  • Table 7 shows the results of measuring the particle diameter, topotecan concentration, sulfate ion concentration, and release rate for Examples 17 to 24 and Comparative Examples 17 to 18 and 21 to 24.
  • the particle diameter, topotecan concentration, and sulfate ion concentration were measured in the same manner as described above in this example.
  • the ratio of the drug contained in the internal aqueous phase of the liposome to the drug in the entire liposome composition was at least 95%.
  • the ratio of sulfate ions contained in the internal aqueous phase of the liposomes to sulfate ions in the entire liposome composition was at least 95%.
  • the liposome preparation was diluted 20-fold in PBS buffer containing ammonium chloride at each concentration, and the release rate when incubated for 4 hours was measured. Release rate is defined as the percentage of the API concentration leaked to the outer water phase divided by the initial total aqueous phase API concentration.
  • Examples 17 and 18 and Comparative Examples 17 and 18 evaluation of topotecan-encapsulated liposomes
  • ammonium chloride 4.8 mmol / L As PBS buffer containing ammonium chloride at each concentration, in Examples 17 and 18 and Comparative Examples 17 and 18 (evaluation of topotecan-encapsulated liposomes), ammonium chloride 4.8 mmol / L, In Examples 19 and 20 and Comparative Examples 19 and 20 (evaluation of doxorubicin-encapsulated liposomes), ammonium chloride 200 mmol / L, In Examples 21 and 22 and Comparative Examples 21 and 22 (evaluation of sunitinib-encapsulated liposomes), ammonium chloride 100 mmol / L, In Examples 23 and 24 and Comparative Examples 23 and 24 (evaluation of irinotecan-encapsulated liposomes), a PBS buffer solution in which 4.8 mmol / L of ammonium chloride was dissolved was used.
  • liposomes using DHSM have a lower release rate than SM liposomes and HSPC liposomes, As a result, improvement in blood retention was expected.
  • DHSM having 16 or 18 alkyl chain DHSM having a purity of 98% or more is used as DHSM, the release rate can be greatly reduced in topotecan-encapsulated liposomes, doxorubicin-encapsulated liposomes, and irinotecan-encapsulated liposomes. Therefore, it has been found that it is more preferable in suppressing leakage in blood.
  • Example 2 ⁇ Measurement of insoluble fine particles>
  • samples were stored for 1 month after storage at 5 ° C. with a particle counter (HACH ULTRA) in liquid, and particles exceeding 10 ⁇ m and 25 ⁇ m contained in 1 vial preparation (2 mL).
  • the number of super-sized particles was measured (hereinafter, unless otherwise specified, particles having a particle size exceeding 10 ⁇ m mean particles having a particle size exceeding 10 ⁇ m.
  • Particles exceeding 25 ⁇ m are particles having a particle size exceeding 25 ⁇ m). means.).
  • Examples 2, 3, and 4 have a lipid concentration of 23 mmol / L.
  • Example 2 When summed as the number of particles per 1 ⁇ mol of lipid, 0.7 particles in Example 2 and 1.1 particles in Example 3 are about 10 ⁇ m particles.
  • Example 4 was 0.3. Moreover, about the particle
  • insoluble fine particles in one vial preparation (2 mL) were measured even in a sample of 1 month after storage at 5 ° C. In terms of the number of particles per 1 ⁇ mol of lipid, the number of particles exceeding 10 ⁇ m was 251 and greatly exceeded 150, and the number of particles exceeding 25 ⁇ m was 17 and greatly exceeded 15.
  • the release rate was calculated as a percentage of the leaked drug concentration (outer aqueous phase concentration) with respect to the total aqueous phase drug concentration.
  • the DHSM liposome encapsulating topotecan prepared in Example 17 and the HSPC liposome encapsulating doxorubicin (Doxyl (registered trademark) 20MG, Janssen Pharma) were added to plasma without addition of ammonium chloride (manufactured by LAMPIRE, mouse plasma, product name: Control and Donor).
  • Mouse Plasma in Na Hep, catalog number 7315511) and release rate in plasma in which 5 mmol / L ammonium chloride was dissolved were measured. The result is shown in FIG.
  • Doxil (registered trademark) 20MG is a liposome encapsulating doxorubicin composed of HSPC. It has been found that Doxil (registered trademark) has very little leakage in an environment simulating blood, but is hardly released even in a high ammonium environment simulating a tumor environment.
  • the liposome containing topotecan described in Example 17 of the present invention has very little leakage in an environment simulating blood and high blood retention, while a high ammonium environment simulating a tumor environment. It was very high at 86%, and it was expected that many drugs were delivered to the tumor by liposomes without leaking in the blood, and many of the drugs carried by the liposomes were released by the tumor. The results are shown in FIG.
  • a tumor obtained by transplanting the human ovarian cancer cell line ES-2 subcutaneously into a BALB / c nude mouse is collected, placed on a centrifugal filter with a pore size of 5 ⁇ m, and centrifuged at 400 g for 10 minutes.
  • a tumor interstitial fluid was obtained.
  • the topotecan liposome of the present invention prepared in Example 17 (30 ng as the drug amount) and the HSPC liposome (Doxyl (registered trademark) 20MG, Janssen Pharma) (30 ng as the drug amount) encapsulating doxorubicin, respectively.
  • the release rate when added and incubated at 37 ° C. for 24 hours was 85% in Example 17 and 6% with HSPC liposomes containing doxorubicin.
  • the release rate Differences were observed as expected.

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Abstract

本発明の課題は、高いＡＵＣを示すリポソーム組成物および医薬組成物を提供することである。本発明によれば、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物、並びに上記リポソーム組成物を含む医薬組成物が提供される。

Description

リポソーム組成物および医薬組成物
　本発明は、高い血中滞留性を示すリポソーム組成物および医薬組成物に関する。
　リポソーム組成物によって、薬物を、がんなどの疾患部位に集積させ、長期間に渡って曝露させることが多く検討されている。医薬組成物としてのリポソーム組成物においては、脂質膜からなるリポソーム中に薬物が内包されている。
　特許文献１および非特許文献１には、スフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
　特許文献２には、ジヒドロスフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
　特許文献３には、カンプトテシンの安定性を高めるように適合されたリポソームカンプトテシン製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたカンプトテシン、（ｂ）リポソームの外部にあり、ｐＨ４．５未満または４．５である第一の溶液、および（ｃ）リポソーム内部にある第２の溶液を含む製剤が記載されている。また、リポソームがジヒドロスフィンゴミエリンおよびコレステロールを含むことが記載されている。
　特許文献４には、両親媒性薬剤をリポソームに有効に充填するシステムであって、アンモニウム化合物またはアンモニウム塩の存在下でリポソーム懸濁液を調整し、上記懸濁液を緩衝剤または塩で希釈して、内部水性相と外部水性相との間に、内側から外側に向かうアンモニウム勾配と、リポソームの内側のｐＨが外側のｐＨより酸性側であるようなｐＨ勾配とを与えることを包含する、システムが記載されている。
　特許文献５には、精製水素添加大豆リン脂質またはスフィンゴミエリン、コレステロールおよび親水性ポリマー誘導体脂質を含むリポソームに、硫酸アンモニウムの存在下でトポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
米国特許第７，０６０，８２８Ｂ２号公報 米国特許第７，８１１，６０２Ｂ２号公報 特表２００８－５１９０４５号公報 特開平２－１９６７１３号公報 米国特許第６，３５５，２６８Ｂ２号公報
AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22-26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C.Zamboni et al.
　上記した特許文献１、２および３並びに非特許文献１には、トポテカンを、スフィンゴミエリンまたはジヒドロスフィンゴミエリンを含むリポソームに内包することにより、血中でのトポテカンの流出を抑制し、ＡＵＣ（Area Under the blood concentration-time Curve：血中濃度－時間曲線下面積）を向上させることにより薬効の向上を図ることが記載されている。しかし、リポソームを構成する脂質組成、およびトポテカンを沈殿させる塩の組成の最適化がなされていないため、ＡＵＣの向上は十分なものではなく、更なる改善が求められている。
　また、トポテカンが、リポソームの内水相から外水相に漏れ、中性条件に曝されると、トポテカンは類縁体へ変化する。具体的には、極めて溶解度の低いN-N bis付加物(トポテカンアミン二量体)などが結晶として析出し沈殿することがある。最終的には、米国のFood and Drug Administration (FDA)、日本のPharmaceutical and Medical Device Agency (ＰＭＤＡ)、およびEuropean Medicines Agency (EMEA)が規定する安全基準および品質基準を逸脱する多くの不溶性微粒子が生成して好ましくない。このような不溶性微粒子の生成を抑制するために、特許文献３においては、外水相のｐＨを酸性条件にしている。しかし、外水相が酸性条件では、リポソームを構成する脂質の分解が促進し、リポソームの安定化のためには不利であった。特許文献３のリポソームにおいては、外水相を酸性にすることが必要であることから、酸性で加水分解するメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンを血中滞留性の向上のために添加することは困難である。
　本発明は、高いＡＵＣを示すリポソーム組成物および医薬組成物を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を使用し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上と することによって、上記の課題を解決したリポソーム組成物を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、下記を提供する 。
［１］
リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物。
［２］
薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である、［１］に記載のリポソーム組成物。
［３］
全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である、［１］または［２］に記載のリポソーム組成物。
［４］
親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンである、［１］から［３］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［５］
リポソーム膜の構成成分における親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率が２～１０モル％である、［１］から［４］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［６］
リポソーム膜の構成成分におけるコレステロール類の比率が３５～４３モル％である、［１］から５の何れかに記載のリポソーム組成物。
［７］
粒子径が１５０ｎｍ以下である、［１］から［６］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［８］
外水相のｐＨが５．５～８．５である、［１］から［７］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［９］
ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、内包薬剤がトポテカンまたはその塩である［１］から［８］の何れかに記載のリポソーム組成物
［１０］
リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも８０％であり、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率が、少なくとも８０％である、［１］から［９］何れかに記載のリポソーム組成物。
［１１］
アンモニウム濃度が１ｍｍｏＬ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏＬ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において６０％／２４時間以上である、［９］に記載のリポソーム組成物。
　［１２］
　５℃で１か月の保管後におけるリポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる１０μｍ超の粒子が１５０個以下、前記リポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる２５μｍを超える粒子の個数が１５個以下である、［１］から［１１］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［１３］
［１］から［１２］の何れかに記載のリポソーム組成物を含む、医薬組成物。
［１４］
抗がん剤である、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物。
［Ａ］　リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物を、対象に投与することを含む、疾患の治療方法。
［Ｂ］　疾患（好ましくは、がん）の治療において使用するための、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物。
［Ｃ］　医薬組成物の製造のための、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物の使用。
　本発明のリポソーム組成物および医薬組成物は、高いＡＵＣを示すことができる。
図１は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における体重の測定結果を示す。 図２は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における体重の測定結果を示す。 図３は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図４は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図５は、各コレステロール量に対するＡＵＣの値を示す。 図６は、リリース率へ与えるアンモニウムイオン依存性を測定した結果を示す。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
　本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する上記複数の物質の合計量を意味する。
　「血中滞留性」とは、リポソーム組成物を投与した対象において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
　「リポソームの平均粒子径」とは、特に指定しない限り動的光散乱法を用いて測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。各メーカーの測定装置固有の変換式により、リポソームの体積平均粒子径や数平均粒子径を算出することも可能である。
１００ｎｍ付近の粒子を測定するには、静的光散乱法などでは、正確に粒子の分布を捉えることができず、動的光散乱法による測定が好ましい。
　「不溶性微粒子」とは、静脈注射製剤など全身投与用の医薬品組成物における、ＰＭＤＡ、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ等の規制当局が安全性および品質基準として設定する項目であり、例えば日本における日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法において、第一法（光遮蔽粒子計数法）にて評価する場合、表示量が１００ｍＬ未満の製品の薬物バイアル１個に含まれる粒径が１０μｍ以上の不溶性微粒子は６０００個以下、粒径が２５μｍ以上の不溶性微粒子は６００個以下であることを求めている。また、第二法（顕微鏡粒子計数法）にて評価する場合、粒径が１０μｍ以上の不溶性微粒子は６０００個以下、粒径が２５μｍ以上の不溶性微粒子は６００個以下であることを求めている。
　不溶性微粒子は、その粒子の成分によらず、粒子のサイズだけによって定義されるもので、例えば、リポソーム組成物において、リポソームそのものの凝集物であっても良いし、リポソーム内部から漏出した薬物成分の凝集および析出物であっても良いし、リポソーム外水相の成分の凝集および析出物であっても良い。特に本発明におけるトポテカンを内包したリポソームは、内包されたトポテカンがリポソーム外に漏出し、溶解度の低い分解物への分解を経て生成される析出物であることが、特許文献３などの記載により知られている。
　不溶性微粒子を測定する方法として、光学的に検出する光遮蔽粒子計数法（パーティクルカウンター、例えば、ベックマン・コールター社のＨＩＡＣ　９７０３＋、パーティクルサイジングシステム社のアキュサイザーＡ２０００ＵＳＰが使用される）の他、顕微鏡での拡大像を目視で観察しカウントする顕微鏡粒子計数法が挙げられる。
　リポソーム医薬組成物、特に注射製剤の場合は、日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法に定める通り、使用時において医薬組成物に含まれる粒径が１０μｍを超える粒子が６０００個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が６００個以下であることが好ましいとされる。
　リポソーム医薬組成物の注射製剤においては、不溶性微粒子が生じる原因は、大部分が保管中に生じるリポソーム粒子成分の凝集・合一・分解に起因すると考えられるが、これに限定されるものではない。リポソームを構成する主な素材である脂質の量に応じて、不溶性微粒子が発生する傾向がある。例えば、脂質濃度２０ｍｍｏｌ／Ｌのリポソーム組成物２ｍＬを含む医薬組成物を考えた場合、脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が１５０個以下、粒径が２５μｍを超の粒子が１５個以下であると、日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法に定める基準である、医薬組成物に含まれる粒径が１０μｍを超える粒子が６０００個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が６００個以下を満たすことができる。
　本発明のリポソーム組成物においても 、５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が１５０個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が１５個以下であることが好ましい。５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が７５個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が７．５個以下であることがより好ましい。５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が２５個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が２．５個以下であることがさらに好ましい。
　また、粒径が１０μｍを超える粗大粒子は、保管時の経時劣化により増大する場合が多く、３カ月貯蔵後の状態でも上記個数を満たすことが好ましく、１年貯蔵後の状態でも上記個数を満たすことがより好ましい。
　「対象」とは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒトである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の第一の形態であるリポソーム組成物は、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であり、薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である。
また、本発明の第二の形態であるリポソーム組成物は、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であり、薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである。
　本発明においては、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を使用することによって、血中でのリポソームの滞留性を向上させている。さらに、内水相が硫酸アンモニウムを含むことにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出を抑制し、ＡＵＣを向上させている。さらに、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上とすることにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出をさらに抑制し、より高いＡＵＣを達成している。
　上記の結果、冷蔵保管中においても、内水相から外水相への薬物の漏出を抑制することができ、中性条件においても不溶性微粒子の生成を抑制することができる。即ち、本発明のリポソーム組成物においては、外水相のｐＨを中性（ｐＨ７．４）付近に設定することができ、酸性条件下で加水分解する「親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン」を、血中滞留性向上のために使用することが可能になった。
（リポソーム）
　リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラまたはユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性および安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
　リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相および膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
　リポソームの平均粒子径は、一般的には１０ｎｍ～１０００ｎｍであり、２０ｎｍ～５００ｎｍが好ましく、３０～３００ｎｍがより好ましく、３０ｎｍ～２００ｎｍがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ～１５０ｎｍが更に一層好ましく、７０～１５０ｎｍが特に好ましい。
　リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
　リポソームの脂質二重層を構成する成分は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを使用することができる。
　本発明におけるリポソームは、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含む。
　リポソームとは、先述の通り脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、一般的に脂質二重膜を形成する基材となる脂質としては二本のアシル鎖を有するリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。
　本発明においては、脂質二重膜を形成する基材となる脂質として、二本のアシル鎖を有するリン脂質、ジヒドロスフィンゴミエリンを用いる。
ジヒドロスフィンゴミエリンを使用することにより、血中でのリポソームの滞留性を向上させることができる。
　ジヒドロスフィンゴミエリンをリポソーム膜の基材として用いることで、そのリポソーム膜の隔壁性を向上させ、内包した薬物の漏出を防ぐことができる。これは、ジヒドロスフィンゴミエリンが有するアミド結合が、強い水素結合能を持ち、互いに強く相互作用することで強固で隔壁性の高い膜を形成できるためと推測する。また、本発明において同時に用いるコレステロールの水酸基とも強く相互作用し、さらに隔壁性の高い膜を作ることができる。これは、エステル結合を有するＨＳＰＣやレシチンなどの汎用されている脂質では達成し得ない機能になる。
　また、アミド結合を有するが、アシル鎖に不飽和結合を有するスフィンゴミエリンに対して、全て飽和されたジヒドロスフィンゴミエリンはその融点が高く、形成される膜の運動性が低くなることから、スフィンゴミエリンに対しても、ジヒドロスフィンゴミエリンは、隔壁性の高い膜を作ることができると推測する。
　ジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に分子内に２つの長鎖アルキル基を有しており、炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するもの、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するもの、炭素数１６と炭素数２０～２４の長鎖アルキル基を有するものが挙げられる。
　ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、薬物のリポソームからの漏出防止の観点で、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物を用いることが好ましい。これは、炭素数が多いほど、融点が高くなり隔壁性の高いリポソーム膜を作ることができるためである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、例えば、天然物由来のスフィンゴミエリンを一般的な手法で還元することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いてもよく、合成することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いても良い。
鶏卵など天然物由来のジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するものが大半を占めるため、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンが純度高く得られる点で、化学合成により得られるものを使用した方が好ましい。
　リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）におけるジヒドロスフィンゴミエリンの比率は好ましくは３０～８０モル％であり、より好ましくは４０～７０モル％であり、さらに好ましくは５０～６０モル％である。
　親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンにおける親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
　これらの中でも、組成物の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびそれらの誘導体がより好ましい。
　汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体がさらに好ましい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体としては、メトキシポリエチレングリコールなどが挙げられるが、特に限定されない。
　ポリエチレングリコール類の分子量は、特に限定されないが、５００～１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００～７，０００ダルトンであり、より好ましくは２，０００～５，０００ダルトンである。
　ジアシルホスファチジルエタノールアミンにおけるアシルの炭素数は１６以上が好ましく、例えば炭素数１６以上３０以下が好ましく、炭素数１６以上２４以下がより好ましく、炭素数２０がさらに好ましい。
　ポリエチレングリコール類で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、１、２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコールが挙げられる。
　リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）において、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率は、好ましくは１～１５モル％であり、より好ましくは２～１０モル％である。
　コレステロール類として、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが好ましい。リポソームの平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと、脂質膜の曲率が高くなることがある。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなる。脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。
　リポソームにおいて、コレステロールの添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。
　リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する脂質）におけるコレステロールの比率は、好ましくは２０モル％～５０モル％であり、より好ましくは３０モル％～４５モル％であり、さらに好ましくは３５～４３モル％である。
　リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα－トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
（薬物）
　本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包する。
　薬物の種類は特に限定されないが、以下に例示する抗がん剤を使用することができる。具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびエピルビシンなどのアントラサイクリン系抗がん剤；
シスプラチンおよびオキサリプラチンなどのシスプラチン系抗がん剤；
パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン系抗がん剤；
ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
ブレオマイシンなどのブレオマイシン系抗がん剤；
シロリムスなどのシロリムス系抗がん剤；
トポテカン（ノギテカンとも言う）、イリノテカン、カレニテシン（登録商標）（ＢＮＰ１３５０とも言う）、エキサテカン 、ルートテカン、ギマテカン（ＳＴ１４８１とも言う）およびベロテカン（ＣＫＤ６０２とも言う）などのカンプトテシン系抗がん剤；
ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
メトトレキセート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビンおよびペメトレキセドなどの代謝拮抗剤；ならびに
イマチニブ（グリベック（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、タミバロテン（アムノレイク（登録商標））、トレチノイン（ベサノイド（登録商標））、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））およびラパチニブ（タイケルブ（登録商標））などの分子標的薬が挙げられる。
　上記の中でもトポテカン（ノギテカンとも言う）、ドキソルビシン、イリノテカンまたはスニチニブが好ましく、トポテカンがより好ましい。
　薬物は、塩の形態として使用してもよい。
　薬物の塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
　塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、ホウ酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
　酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミンおよびＮ、Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有
機塩基との塩などが挙げられる。
　リポソーム組成物における薬物の含有量は特に限定されないが、リポソーム組成物に対して０．０２５～２０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２５～１０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
　リポソーム膜を形成する脂質に対するリポソーム内包された薬物量は、リポソームからの放出速度、リポソーム内部の浸透圧や沈殿した薬物によるリポソーム形状の観点から、モル比で０．１～１．５が好ましく、０．２～０．３がより好ましい。
　脂質に対する薬物量のモル比が低すぎる場合、単位薬物量に対するリポソーム膜の面積が大きくなることで薬物のリポソームからの放出速度が大きくなり、血中滞留性を向上する機能が損なわれる。一方で、脂質に対する薬物量のモル比が高すぎる場合は、リポソーム内部の浸透圧が薬物の溶解量が増加することで上昇しリポソームが破壊される、または薬物がリポソーム内部で沈殿する場合は沈殿した固形物が大きく成長してリポソーム形状が変形することになる。
（内水相における硫酸アンモニウム）
　本発明におけるリポソームの内水相は、硫酸アンモニウムを含む。また、本発明の第一の形態であるリポソーム組成物においては、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は０．３６以上であり、好ましくは０．４以上である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は、より好ましくは０．４以上１．８以下であり、さらに好ましくは０．６以上１．８以下である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比を上記の通りに設定することにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出を抑制することができる。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が低すぎると、薬物の硫酸塩による固形物の形成が不完全となり、リポソーム内でリポソーム膜の透過性が高くなる溶解状態の薬物の濃度が高まり、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。また、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が高すぎると、リポソーム内部の浸透圧が高くなり、リポソーム構造の破壊を招くため、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。
　また、本発明においてリポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率（硫酸イオンの内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、同時に、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率（薬物の内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
　リポソーム中の薬物濃度は、例えば、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定することができる。また、リポソームの内水相の硫酸イオン濃度は、例えば、イオンクロマトグラフィにより測定することができる。
（外水相のｐＨ）
　本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包するリポソームと、上記リポソームを分散する水性溶媒（外水相）とを含むことができる。外水相のｐＨは、中性であることが好ましく、具体的にｐＨ５．５～８．５程度であることが好ましい。
　薬物の漏出を極度に抑制し過ぎると、患部、特に腫瘍部での薬物の漏出をも抑制し、期待するほどの薬効が得られない場合がある。
　本発明のリポソーム組成物は、血中での薬剤漏出を抑制し、十分な量の薬物を腫瘍部に送達させ、さらに腫瘍部では速やかに薬物を放出する驚くべき機構を兼ね備えている。
　腫瘍部においては、血中などその他臓器に比べてアンモニウム濃度が高いという性質があり（引用論文：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850）、本発明のリポソーム組成物は、腫瘍のようにグルタミン分解が亢進しアンモウム濃度が高い（５ｍｍｏｌ／Ｌ）環境で、薬物のリリースが非常に増大する。
　本発明のリポソーム組成物は、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が６０％以上であり、より好ましくは、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において１５％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が７０％以上である。
（リポソーム組成物の製造方法）
　本発明のリポソーム組成物の製造方法は、特に限定されないが、一例として、
（ａ）油相の調製；
（ｂ）水相の調製；
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成；
（ｄ）エクストルーダーによる整粒；
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換；
（ｆ）リモートローディングによる薬物のリポソーム粒子への内包；および
（ｇ）透析による外水相薬物の除去：
の工程により製造することができる。（ｄ）エクストルーダーによる整粒は、行ってもよいし、行わなくてもよい。
＜（ａ）油相の調製＞
　（ａ）油相の調製においては、リポソームを構成する各成分（親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類）と有機溶媒とを混合し、混合物を加温して上記成分を溶解することにより油相を製造することができる。
　油相において使用する有機溶媒は特に限定されないが、例えば、水と任意に混じりあう水溶性有機溶媒を用いることができる。
　水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノールおよびｔ－ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２－プロパノールおよびｔ－ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２－プロパノールおよびｔ－ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
　リポソームを構成する各成分の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能である。
＜（ｂ）水相の調製＞
　水相としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類（スクロースなど）の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）を使用することができる。本発明において、後述するリモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、水相として硫酸アンモニウム水溶液を使用することが好ましい。
　緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等が挙げられる。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物であってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
　生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％（質量／体積パーセント）含有する食塩水、ＰＢＳおよびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。
　本発明において、水相とは、外水相および内水相の両方を包含する。
　本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
　本発明における内水相とは、リポソームの脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
＜（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成＞
　乳化工程では、油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型（水中油型）に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発によって除去することにより、リポソームが形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
　撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイダイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。
　乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶媒を含む乳化工程で微粒子化する工程である。高せん断は、乳化機の撹拌羽根の周速で定義され、５ｍ／ｓ～３２ｍ／ｓが好ましく、特に２０ｍ／ｓ～３０ｍ／ｓが好ましい。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
　リポソームを製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５～４０℃の脂質を使用する場合、３５℃～７０℃とすることが好ましい。
　乳化工程においては、リポソームを含む水溶液から有機溶媒と水を蒸発させてもよい。ここで言う蒸発とは、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去してもよいし、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発するものでもよい。
　蒸発の方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒と水を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
＜（ｄ）エクストルーダーによる整粒＞
　得られたリポソームは、透析法、ろ過法またはエクストルージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。
　エクストルージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液およびフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
　なお、エクストルーダーによる整粒は行ってもよいし、行わなくてもよい。
＜（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換＞
　本発明において、リモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、透析によりリポソーム外水相液を置換してもよい。透析液として、０．０５～５質量％のＮａＣｌ水溶液を使用することができるが、特に限定されない。上記した透析液を用いて、リポソーム液を透析することにより、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得ることができる。
＜（ｆ）リモートローディング法による薬物のリポソーム粒子への内包＞
　本発明においては、リモートローディング法によって薬物をリポソーム粒子へ内包させることが好ましい。
　本発明においてリモートローディング法とは、薬物が内包されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法を意味する。リモートローディングの方法については、特に限定されないが、アンモニウム塩を用いた方法が好ましく、硫酸アンモニウムを用いた方法がより好ましい。
　リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が、能動的にリポソームへと移行し、リポソームへと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配等が用いられている。例えば、リポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物をリポソーム内部に導入する方法がある。例えば、Ｎａ+／Ｋ+濃度勾配を利用してリモートローディング法により予め形成されているリポソーム中に薬物を添加する技術がある。
　イオン勾配の中でもプロトン濃度勾配が一般的に用いられ、例えば、リポソーム膜の内側（内水相）ｐＨが、外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン勾配の濃度勾配等により形成することができる。
＜（ｇ）透析による外水相薬物の除去＞
　薬物を内包したリポソーム液は、リポソームに含まれなかった薬物を除去するために、透析を行ってもよい。例えば、所定濃度のスクロース／ヒスチジンバッファーを透析液として用いて、薬物を内包したリポソーム液に対して、透析を行うことにより、外水相に存在する薬物を除去し、透析液で外水相を置換したリポソーム組成物を得ることができる。
＜無菌ろ過＞
　上記で得られたリポソーム組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。
　リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０～４０℃程度が好ましく、より具体的には５～３０℃程度で製造されることが好ましい。
＜無菌充填＞
　無菌ろ過の後に得られたリポソーム組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
（医薬組成物）
　本発明のリポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。即ち、本発明のリポソーム組成物は、医薬組成物として提供することができる。
　等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
　安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。
　酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
　ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。
　本発明のリポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
　本発明のリポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
　リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下で行うことが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与経路としては、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、薬物の種類、患者の状態などに応じて適宜設定すればよく、有効成分である薬物質量として、１日あたり、一般的には０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲で設定することができる。有効成分である薬物質量として、１回あたり、２ｍｇ～１０ｍｇの範囲で設定することができる。ただし、これらの投与量に限定されるものではない。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは抗がん剤として使用することができる。
　本発明の医薬組成物の適用対象であるがんの種類は、特に限定されないが、例えば、肺がん（特に、小細胞肺がん）、卵巣がん、小児固形腫瘍、子宮頸がん、乳がん、前立腺がん、子宮体がん、胃（胃腺）がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頚部扁平上皮がん、食道がん、膀胱がん、メラノーマ、大腸がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、骨髄転移がん、肉腫、軟部組織腫、瘍慢性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されるものではない。
　ＳＭは、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＭ－１０、日油製）を示す。
　鶏卵由来ＤＨＳＭは、鶏卵由来のＳＭを水素添加することで得たジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＭ－１０（日油製）に対し水素添加した合成品）を示す。この鶏卵由来ＤＨＳＭは、炭素数１６のアルキル鎖の２つ有したものが、全体の７０～８０％であり、残りはアルキル鎖長の異なるＤＨＳＭを含む混合物である。
　全合成ＤＨＳＭは、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物が９８％以上含むように化学合成により作製されたジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ＰＥＧリン脂質（表中ではＰＥＧと表記）としては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、日油製（以下、ＤＳＰＥ－ＰＥＧとする）を使用した。
　コレステロール（表中ではＣｈｏｌと表記）としては、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＨＰ(日本精化社製)を使用した。
＜比較例１～１０＞
（ａ）油相の調製
　比較例１については、ＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、４．３２ｇ秤量した。比較例２～１０については、表１に記載の比率になるように、ＳＭまたは鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。
（ｂ１）水相１の調製
　硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
　硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
　（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
　透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
　トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍ
Ｌとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
　透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜比較例１１および１２＞
（ａ）油相の調製
　比較例１１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、およびコレステロールをそれぞれ、０．５１７ｇおよび０．２３３ｇ秤量した。比較例１２については、表１に記載の比率になるように、ＳＭ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩ（１，１’－ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ　Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１.５ｍＬとし、秤量した脂質とこの有
機溶媒を混合し、６５℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
（ｂ）水相の調製
　硫酸アンモニウム０．９ｇおよびスクロース２．１６ｇを水１３．５ｇに溶解し、水相を調製した。
（ｃ）油相と水相混合によるリポソーム粒子形成
　（ｂ）で調製した水相を６５℃に加温し、マグネチックスターラーで攪拌する（３０００ｒｐｍ）。（ａ）で調製した油相全量をホットプレートで６５℃に加温し、油相全量をシリンジで吸って５分間ホットプレートで加温する。加温してある水相に、油相を３０秒かけて滴下する。
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
　７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ　Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
　透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
　トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
　透析液として９．４質量％スクロースおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜実施例１～８＞
（ａ）油相の調製
　実施例１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、日油製、以下、ＤＳＰＥ－ＰＥＧとする）、およびコレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、および４．３２ｇ秤量した。実施例２～８については、表２に記載の比率になるように、ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。
（ｂ１）水相１の調製
　硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
　硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成　
　（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
　透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
　トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
　透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜実施例９および１０＞
（ａ）油相の調製
　実施例９については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、コレステロールをそれぞれ０．４１２ｇ、０．１５３ｇ、および０．１５３ｇ秤量した。実施例１０については、表２に記載の比率になるように、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩで標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１１．２５ｍＬとし、さらに酢酸エチル３．７５ｍＬを加えた。秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、６０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
（ｂ）水相の調製
　硫酸アンモニウム０．９ｇを水４０ｇに溶解し、水相を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
　（ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後（容積比：水相／油相＝８／３）、乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ－３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ：１／６０ｓ-1）にて３０分間混合した。つづいて、６５℃で加温しながら３００ｒｐｍで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が１５ｇまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
　７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ　Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
　透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
　トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍ
Ｌとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
　透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
［物性測定および評価］
＜平均粒子径＞
　本発明において、平均粒子径とは、動的光散乱法により測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。表に記載の各実施例および比較例の平均粒子径は、オートサンプラー付き濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００ＡＳ（大塚電子社製）により動的光散乱法で測定したキュムラント平均粒子径である。測定結果を表１および表２に示す。
＜トポテカン濃度測定＞
　ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）装置 Ｎｅｘｅｒａ－ｉ ＬＣ－２０４０Ｃ（島津社製）にて、サンプルを測定し、トポテカン濃度を定量した結果を表１および表２に示す。具体的な測定方法は、次のとおりである。
　表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、比較例１０を除くと少なくとも９５％であった  。比較例１０は５９％であった。
リポソーム製剤中のトポテカン量の測定
　調製したリポソーム液をメタノールに溶かしフィルターろ過した試料溶液、およびトポテカン塩酸塩を希釈調製した検量線標準溶液を用いて、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定した。
　内水相トポテカン濃度は、全水相トポテカン濃度から外水相トポテカン濃度を引いて算出した。
各水相のトポテカン濃度は以下のように測定した。
（全水相トポテカン濃度）
　リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、ボルテックスで1分間攪拌した。その液を１００μＬを測り取り、ミリQ水を９００μＬを加え、ボルテックスを1分間攪拌し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
（外水相トポテカン濃度）
　リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、９．４ｗｔ％スクロース/１０ｍＭヒスチジン水溶液４５０μＬを加え希釈する。その希釈液１００μＬにＰＢＳ　２００μＬ添加し、転倒混和した。この分散液を超遠心分離（２００，０００　ｇ,　２０℃,　６０分間）し、上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。超遠心分離機は、日立製ｈｉｍａｃＣＰ８０ＷＸを使用した。
ａ）検量線標準液の調製
　トポテカン塩酸塩約２０ｍｇを量り、２０ｍＬの１０質量％メタノール水溶液に溶かした。この液にミリＱ水を加えて、トポテカン塩酸濃度０．１、１．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、または１００．０ｐｐｍの溶液を調製し、検量線標準液とした。ｂ）試料溶液の調製
　（１）試料（リポソーム製剤溶液）約５０μＬをマイクロマン（ＭＩＣＲＯＭＡＮ（登録商標））で量りとり、これにマイクロマンで量りとった約９５０μＬのメタノールを加えた。このとき、約１分間振とうし、溶液が透明になることを目視で確認した。
　（２）上記（１）の溶液１００μＬをマイクロマンで量りとり、マイクロピペットで量りとった約９００μＬのミリＱ水を加えた。この液を約１分間振とうした後、約１分間超音波処理をし、さらに約１０秒間振とうした。
　（３）上記（２）の溶液をＤＩＳＭＩＣ（登録商標）フィルター（穴径０．４５μｍ）でろ過した溶液を試料溶液とした。
ｃ）測定
　液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により以下の条件で測定した。
　測定波長：３８２ｎｍ、カラム：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＡＣＲ ３μｍ_３．０ｍｍ＊７５ｍｍ
　カラム温度：４０℃付近の一定温度
　移動相Ａ、Ｂはいずれも水／メタノール／トリフルオロ酢酸混液で、移動相の送液は移動相ＡおよびＢの混合比を変えて濃度勾配を制御した。
　流量：毎分１．０ｍＬ、注入量：１０μＬ、オートサンプラー温度：２５℃付近の一定温度で測定を行った。
＜硫酸イオン濃度測定＞
　イオンクロマト装置 ８８３ Ｂａｓｉｃ ＩＣ ｐｌｕｓ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）にて、サンプルを測定し、硫酸イオン濃度を定量した。トポテカンに対する硫酸イオンのモル比を測定した結果を表１および表２に示す。表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも９０％であった  。
　内水相硫酸イオン濃度は、全水相硫酸イオン濃度から外水相硫酸イオン濃度を引き算して、算出した。
各水相の硫酸イオン濃度は以下のように測定した。
（全水相硫酸イオン濃度）
　リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、超音波処理を１５秒実施し、混和した。その液を９０μＬを測り取り、注射用水（光製薬製）を８１０μＬを加え、超音波処理を30秒実施し、混和した。この溶液に酢酸エチル９００μＬ添加し、よく振って酢酸エチル相へ脂質類を抽出した。水相の液を適量は測り取り、イオンクロマト分析に使用した。
（外水相硫酸イオン濃度）
　リポソーム分散液を１００μＬ測り取り、５％ブドウ糖液（大塚製薬製）９００μＬを加え希釈した。その液４５０μＬを限外ろ過にて処理し、ろ液をイオンクロマト分析サンプルとした。
遠心条件は、７４００ｇ, ５℃, ３０分。遠心分離機は、日立製himac CF15RXIIを使用した。
＜ＡＵＣの測定＞
　調製したトポテカン含有リポソームを投与したマウス（投与量は薬物量として１ｍｇ／ｋｇ）については、投与後０．２５、２、６、２４時間で採血した。血液は８００×ｇ、１０分間遠心し、血漿を回収した。採取した血漿について、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、トポテカン濃度の定量を行った。得られたトポテカン濃度推移より薬物動態解析ソフトＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｃｅｒｔａｒａ）を用いて単回投与後の無限時間までの血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。ＡＵＣの単位は、時間×ｎｇ／ｍＬ（表中では、hr*ng/mLと表記）である。なお、非特許文献１に記載のリポソームのＡＵＣは、６８１５２時間×ｎｇ／ｍＬと計算される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１および表２の結果から分かるように、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロールを含むリポソーム組成物において、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である実施例１～１０において、ＡＵＣの測定値が２０００００以上となり、高い血中滞留性を達成できることが示された。一方、ジヒドロスフィンゴミエリンを使用しない比較例１から８、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６未満である比較例９および１０、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンを使用しない比較例１１および１２においては、ＡＵＣの測定値が２０００００未満であり、実施例１から１０よりも劣ることが示された。
＜Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験＞
　Ｂａｌｂ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（雌、６週齢）にヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞
１×１０7個を右腹側部皮下に移植した。移植後１５日目から実施例１０で調製したト
ポテカン含有リポソーム（薬物量として４ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ、週１回投与を２回）、比較例１２で調製したトポテカン含有リポソーム（薬物量として４ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ、週１回投与を２回）を投与した。また、陰性対照としては生理食塩液を投与した。また、比較対照としては、トポテカン水溶液（薬物量として２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与開始から週２回、体重および腫瘍体積を測定した。体重の測定結果を図１および図２に示し、腫瘍体積の測定結果を図３および図４に示す。
　図３および図４の結果から、比較例１２で調製したトポテカン溶液と比較して、実施例１０で調製したトポテカン含有リポソームは、高い薬効を示し、効果は用量に依存していることが分かった。
＜実施例１１～１６、比較例１３～１６＞
　実施例１１～１６について、油相の調整におけるコレステロールの添加量と鶏卵由来ＤＨＳＭの添加量を、表３に記載の比率になるように、ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した以外については、実施例１同様に作製した。例えば、実施例１１について、油相の調整におけるコレステロールの添加量と鶏卵由来ＤＨＳＭの添加量を、コレステロールを３．６ｇ、鶏卵由来ＤＨＳＭを１２．９ｇに変更した以外は、実施例１同様に作製した。 
比較例１３～１６について、表３に記載の比率になるよう、ＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。
　同様に粒子径、全水相トポテカン濃度、内水相硫酸イオン濃度、ＡＵＣを測定した結果を表３に示す。また、各コレステロール量に対する、ＡＵＣの値を図５に示す。
　表３のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、比較例１３を除き少なくとも９８％であった。比較例１３は、６８％であった。
　表３のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、比較例１３を除き少なくとも９０％であった  。比較例１３は、７１％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例１１～１６、比較例１、２、４、７、１３～１６の結果より、鶏卵由来ＤＨＳＭを用いたリポソームが、ＳＭリポソームより幅広いコレステロールの添加比率において、本発明は良好なＡＵＣを達成することが分かる。また本発明の鶏卵由来ＤＨＳＭリポソームにおいて、特にコレステロール比率が、３５～４３モル％の範囲でＡＵＣがより良好であることが分かる。
＜実施例１７～２４、比較例１７～２４＞
＜リポソーム分散物の作製＞
　実施例１７～２４、比較例１７～２４について、油相の調整における各脂質の添加量を表４のように設定し、また、リモートローディングによりリポソーム粒子へ内包する薬物を表４のように設定し、トポテカン以外の薬剤は、下記の＜リモートローディングによる各抗がん剤のリポソーム粒子への内包＞に記載した方法で薬剤を内包したことを除き、実施例１と同様に作製した。また、実施例１７～２４、比較例１７～２４について、それぞれの脂質構成比を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜リモートローディングによる各抗がん剤のリポソーム粒子への内包＞
　ドキソルビシンの内包（実施例１９、２０、比較例１９、２０）：ドキソルビシン塩酸塩（東京化成社製）に注射用水を加え、4 ｍｇ／ｍ
Ｌとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してドキソルビシン塩酸塩を溶解させた。このドキソルビシン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、ｐＨ ７．０に調整した分散液を６２℃で６０分間加温した。
　スニチニブの内包（実施例２１、２２、比較例２１、２２）：リンゴ酸スニチニブ（トロントリサーチケミカルズ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してリンゴ酸スニチニブを溶解させた。このスニチニブ溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６２℃で６０分間加温した。
　イリノテカンの内包（実施例２３、２４、比較例２３、２４）：イリノテカン塩酸塩（東京化成社製）に注射用水を加え、４ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してイリノテカン塩酸塩を溶解させた。このイリノテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６２℃で６０分間加温した。
　実施例１７～２２、比較例１７～２２について、本実施例中において上記した方法と同様にＡＵＣを測定した結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例１７～２２、比較例１７～２２の結果より、トポテカン及びスニチニブのどちらの薬剤を用いた場合においても、ＤＨＳＭを用いたリポソーム方が、ＳＭリポソームおよびＨＳＰＣリポソームより血中滞留性が向上する結果となった。また、ＤＨＳＭとして炭素数１６と１８のアルキル鎖を持つＤＨＳＭが９８％以上の純度を持つ全合成ＤＨＳＭを用いたリポソームが、鶏卵由来ＤＨＳＭに比べて血中滞留性が向上できることが分かった。
　実施例１７～２４、比較例１７～１８、２１～２４について、粒子径、トポテカン濃度、硫酸イオン濃度、リリース率を測定した結果を表７に示す。粒子径、トポテカン濃度、硫酸イオン濃度は、本実施例中において上記した方法と同様に測定した。
　表７のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、少なくとも９５％であった。
　表７のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも９５％であった  。
　各濃度の塩化アンモニウム含有PBS緩衝液中にリポソーム製剤を２０倍希釈し、４時間インキュベートした時点のリリース率を測定した。リリース率は、外水相へ漏れたAPI濃度を初期の全水相API濃度で割り算した値の百分率として定義される。
　各濃度の塩化アンモニウム含有ＰＢＳ緩衝液としては、
実施例１７、１８、比較例１７、１８（トポテカン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム４．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例１９、２０、比較例１９、２０（ドキソルビシン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム２００ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例２１、２２、比較例２１、２２（スニチニブ内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム１００ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例２３、２４、比較例２３、２４（イリノテカン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム４．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、を溶解したＰＢＳ緩衝液を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例１７～２４、比較例１７～１８、２１～２４の結果より、いずれの薬剤を用いた場合においても、ＤＨＳＭを用いたリポソームの方が、ＳＭリポソームおよびＨＳＰＣリポソームよりリリース率が低減し、血中滞留性の向上が期待できる結果となった。また、ＤＨＳＭとして炭素数１６と１８のアルキル鎖を持つＤＨＳＭが９８％以上の純度を持つ全合成ＤＨＳＭを用いた場合、トポテカン内包リポソーム、ドキソルビシン内包リポソーム、イリノテカン内包リポソームで大きくリリース率が低減できており、血中での漏出を抑制するうえで、より好ましいことが分かった。
＜不溶性微粒子測定＞

　液中パーティクルカウンター（ＨＡＣＨ ＵＬＴＲＡ）にて、実施例２、３、４について、それぞれ５℃保管後１か月のサンプルを測定し、１バイアル製剤（２ｍＬ）当たりに含まれる１０μｍ超の粒子および２５μｍ超の粒子の個数を測定した（以下、特に説明がない限り、１０μｍ超の粒子とは、粒径が１０μｍを超える粒子を意味する。２５μｍ超の粒子とは、粒径が２５μｍを超える粒子を意味する。）。実施例２、３、４は脂質濃度２３ｍｍｏｌ／Ｌであり、脂質１μｍｏｌ当たりの粒子の個数としてまとめると、１０μｍ超の粒子について、実施例２は０．７個、実施例３は１．１個、実施例４は０．３個であった。また、２５μｍ超の粒子について、実施例２は０．０９個、実施例３は０．５個、実施例４は０個であった。トポテカンを内包したリポソームは、漏出し中性環境に晒されると難溶性の二量体へと分解し、不溶性微粒子になることが知られている。この結果は、本発明により漏出が極めてよく抑制できたため、不溶性微粒子の発生も低減できた驚くべき結果である。
　比較例８について、５℃保管後１か月のサンプルにおいても１バイアル製剤（２ｍＬ）中の不溶性微粒子を測定した。脂質１μｍｏｌ当たりの粒子の個数に換算すると、１０μｍ超の粒子が２５１個であり１５０個を大きく超えており、また２５μｍ超の粒子の個数が１７個であり、１５個を大きく超えていた。

＜リリース率へ与えるアンモニウムイオン依存性＞
　リリース率は、全水相薬剤濃度に対する漏出した薬剤濃度（外水相濃度）の百分率で算出した。実施例１７で作製したトポテカンを内包するＤＨＳＭリポソーム、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソーム（ドキシル（登録商標）２０ＭＧ、ヤンセンファーマ）を、塩化アンモニウムを添加しない血漿（LAMPIRE製、マウス血漿、品名：Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep、カタログ番号7315511）と５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化アンモニウムを溶解した血漿中でのリリース率を測定した。その結果を図６に示す。腫瘍環境においては、グルタミン分解が亢進しており、その結果アンモニウムが多く発生しており、おおよそ５ｍｍｏｌ／Ｌの発生が報告されている（引用論文：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850）。
　ドキシル（登録商標）２０ＭＧはＨＳＰＣからなるドキソルビシンを内包したリポソームである。ドキシル（登録商標）は、血中を模した環境では漏出が極めて少ないが、腫瘍環境を模した高アンモニウム環境でもほとんど放出されないことが分かった。これに対して、本発明の実施例１７記載のトポテカンを含有するリポソームは、血中を模した環境では漏出が極めて少なく高い血中滞留性が得られる一方で、腫瘍環境を模した高アンモニウム環境で、86％と言う非常に高く、血中では漏出せず多くの薬物を腫瘍にリポソームによって送達され、リポソームによって運ばれた薬物が腫瘍で多く放出されることが期待できる結果となった。この結果を図６に示した。
　また、実際にヒト卵巣がん細胞株ES-2をBALB/cヌードマウスの皮下に移植して得た腫瘍を採取し、孔径５ μｍの遠心ろ過フィルターに載せ、４００ ｇで１０分間遠心することにより、腫瘍間質液を得た。腫瘍間質液３０μＬに、実施例１７で作製した本発明のトポテカンリポソーム（薬物量として３０ｎｇ）、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソーム（ドキシル（登録商標）２０ＭＧ、ヤンセンファーマ）（薬物量として３０ｎｇ）をそれぞれ添加し、３７℃２４時間インキュベートした際のリリース率は、実施例１７で８５％、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソームで６％となり、実際の腫瘍環境から採取された腫瘍間質液で、リリース性の差異が期待通り観察された。
 

Claims (15)

  1. リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上で  ある、リポソーム組成物。
  2. 薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  3. 全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
  4. 親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンである、請求項１から３の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  5. リポソーム膜の構成成分における親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率が２～１０モル％である、請求項１から４の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  6. リポソーム膜の構成成分におけるコレステロール類の比率が３５～４３モル％である、請求項１から５の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  7. 粒子径が１５０ｎｍ以下である、請求項１から６の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  8. 外水相のｐＨが５．５～８．５である、請求項１から７の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  9. ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、内包薬剤がトポテカンまたはその塩である請求項１から８の何れか一項に記載のリポソーム組成物
  10. リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも８０％であり、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率が、少なくとも８０％である、請求項１から９の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  11. アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において６０％／２４時間以上である、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  12. 　５℃で１か月の保管後におけるリポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる１０μｍ超の粒子が１５０個以下、前記リポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる２５μｍを超える粒子の個数が１５個以下である、請求項１から１１の何れか一項に記載のリポソーム組成物。 
  13. 請求項１から１２の何れか一項に記載のリポソーム組成物を含む、医薬組成物。
  14. 抗がん剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物。
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