JPH02196713A - 両親媒性分子を有効に充填かつ制御放出するリポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トランスメンプラン勾配を利用して。

両親媒性薬剤や化学薬品をリポソームに効率よく充填す
るための、簡単で、効率のよい、安全で。

経済的で、迅速な改良されたトランスメンプラン充填法
に関する。両親媒性薬剤を充填して得られたリポソーム
は、安定かつ安全である。この方法は、リポソームに封
入された薬剤の緩徐放出にも同様に利用できる。

（従来の技術） 近年、製薬科学によって、新規な製剤要素として、脂質
を基材にした担持媒体であるリポソームが開発された。

最近１通常のリポソーム類もしくはリン脂質のリポソー
ム類が、広範囲の化合物の治療活性を改良し、簡便な薬
剤放出系を提供する製薬剤として急速に受は入れられる
ようになっている。リポソームによる薬剤放出系は、　
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４３：　４７３０　（１９８３）　；　Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ、Ｒｅｖ、、　３６：　２７７−３３６（１９８４
）；　Ｌｉ　ｏｓｏｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕ　　Ｃａｒｒ
ｉｅｒｓ＋　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ。

Ｇ、編集、　Ｗｉｌｅｙ、　　ニューヨーク（１９８Ｂ
）に詳細な総説が記載されている。

リポソームは、非経口的、経口的９局所的、および吸入
による。薬剤の投与に適切な放出用媒体である。リポソ
ームは、配合法を改良し、放出持続性を与え、治療比率
を改善し、各投与後の治療活性を延長し、頻繁な投与の
必要性を減らし、薬剤の必要量および／または粘膜組織
などの組織が吸収する量を減らす。

薬剤のリポソームへの充填度が、薬剤の効力の尺度であ
ることが証明されている。充填度が少なければ、活性薬
剤が大きく失われ、リポソームを薬学的媒体として使う
ことが不経済になる。近年。

リポソームに、薬剤と生物物質とを充填する各種方法の
システム開発に少なからぬ努力がなされている（Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ、Ｒｅｖ、、　３６：　２７７−３３６　
（１９８４）：Ｌｉ　ｏｓｏｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕ　　
Ｃａｒｒｉｅｒｓ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　ｃ。

編集、　Ｗｉｌｅｙ、　　ニューヨーク　（１９８８）
）。

これまで、リポソームに薬剤を充填する方法は。

いくつも開発されている。最も単純な薬剤充填法は、脂
質成分を中和することによって、乾燥した脂質膜に、水
溶性薬剤を受動的に封入する方法である。この方法の充
填効率は、リポソームの封入体積と、リポソームを製造
するのに用いる脂質の量とによって決まるので、一般に
低い（尉ト見Ｊ丸ｕ工ｕ匹並、　４０：　３３３−３４
５　（１９８６）；およびＭｅｔｈｏｄｓ　１ｎＢｉｏ
ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ａｎａｌ　ｓｉｓ、　３３：　３
３７　（１９８Ｂ））　、この方法の欠点は、低い封入
性、不均一な大きさ、および押出しもしくは音波処理の
ような二次的処理工程が必要なことである。薬剤をリポ
ソームに受動的に封入する方法の改良が、脱水・再水和
法を利用することによって達成された。この方法は。

予め形成されたリポソームを薬剤の水溶液に添加し、得
られた混合物を、凍結乾燥もしくは蒸発させるか、また
は多重ラメラ小胞の凍結・解凍を繰り返して行う凍結・
解凍処理法で脱水することによって、水和を改良し充填
度を増大させる方法である。この方法の欠点は、不均一
な大きさ、標準化が困難なこと、および低い再現性であ
る。

リポソームに薬剤を高い効率で封入することは。

高濃度の脂質を用いかつ脂質成分の特別な組合せによっ
て実施できる。例えば９両親媒性アミンのドキソルビシ
ンは、負の電荷を有するリポソームメンブランには一層
よい効率で封入することができるＣＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ、、　４２　：　４７３４−４７３９　（１９８２）
）。しかし、一般に、この薬剤充填法には問題点が残っ
ている。

リポソームへの薬剤充填の効率は、薬剤の化学的性質に
も依存している。一般に、水溶性もしくは脂質に溶解性
の薬剤は処理が容易である。その理由は、脂質に溶解性
の化合物は、リポソーム形成中、脂質二重層内に容易に
取り込まれ、水溶性の化合物は、リポソームの内側に向
いているホスホリピドの極性基を持つ頭部（ｐｏｌａｒ
　ｈｅａｄ　ｇｒｏｕｐ）と相互作用してリポソーム内
に隔離されるからである。他方１両親媒性化合物は、脂
質二重層を急速に透過し、結合しないのでリポソーム内
に保持することは最も難しい。両親媒性分子をリポソー
ムに充填する方法として提案された方法が＋　Ｃｈｅｍ
。

釉Ｌ」Ｊ［鎖、　４０：　３３３−３４５　（１９８６
）に記載されているが、この方法は、イオンｐｉ（勾配
に対応して薬剤を充填する方法であって、リポソーム内
部のｐＨが外部の媒体のｐＨより低い場合に１両親媒性
薬剤をリポソーム内に蓄積する方法である。

１９８６年６月１６日付で出願された国際特許出願ｐｃ
Ｔ／ＵＳ８７１０１４０１号には、制御されたｐｉ（の
水性環境で製造され１次いで比較的強い酸性ｐＨかまた
は比較的強い塩基性ｐＨの浴媒体に曝露されたイオン化
可能な脂質もしくはイオン化可能なタンパクを含有する
非対称的リポソーム小胞が記載されている。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６０：８０２
−８０８　（１９８５）に記載されている両親媒性薬剤
の充填法は、トランスメンブランＮａ”／Ｋ”勾配を利
用する方法である。局所麻酔剤であるジブカインの充填
の改良が認められたのは、ナトリウムとカリウムとの両
イオンが使用された場合だけであり、ナトリウム／カリ
ウムの勾配をパリノマイシンと組み合わせて使用した場
合に、約５２％の充填が達成された。パリノマイシンは
、殺虫剤、殺線虫剤、殺菌剤、およびイオン透過担体と
して周知のものであるから、薬剤処方物への添加剤とし
て望ましいものではない。抗新生物薬のリポソーム小胞
への受動封入法が、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ
、　Ａｃｔａ、、８１６：２９４−３０２　（１９８５
）に記載されているが、これはパリノマイシン依存性の
に゛の拡散電位に応答して薬剤を小胞に取り込むのを利
用する方法である。

リポソーム小胞に両親媒性薬剤のアドリアマイシンを充
填する他の方法が、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ
、Ａｃｔａ　＋８５７：１２３−１２６　（１９８５）
に記載されているが、　ｐＨ勾配に応答してリポソーム
にアドリアマイシンを取り込む方法である。この方法は
非生理学的に酸性のｐ）Ｉ下と１強塩基であるＫＯ）Ｉ
の存在下と（両方とも脂質の加水分解を起こす）で行わ
れることを除けば、充填はかなり効率的に行われるよう
である。

また、得られたリポソーム−薬剤の小胞は不安定であり
、約２４時間で薬剤がかなり漏出する。

１９８５年８月７日付で出願された国際特許出願ｐｃＴ
／ＵＳ８５１０１５０１号には、水性媒体に溶解した場
合に荷電状態で存在しうる脂質親和性のイオン化可能な
抗新生物薬を、トランスメンプラン電位によって受動充
填することによって、抗新生物薬をリポソームに封入す
る方法が記載されている。最初。

低ｐＨ緩衝液を（受動的に）封入し９次いで塩基を添加
して外部のｐＨを上昇させることによって、プロトンの
勾配が形成される。トランスメンプラン電位は、パリノ
マイシンの存在下、ナトリウム／カリウムの化学的勾配
によって達成される。充填は温度依存性で、最高の結果
は、６０’Ｃの温度で得られる。

水溶性薬剤をリポソームに高封入度で充填する方法が、
細菌、米国特許第４．７５２，４２５号に記載されてい
る。しかし、この方法の欠点は、高い脂質濃度での受動
封入に基づいてないということである。

これらの方法すべての基本的な欠点は、リポソームの脂
質を低いｐＨの環境に長時間曝露し、そのため脂質の加
水分解をもたらし、リポソームからの薬剤の漏出が起こ
ること、充填に長時間と高温とが必要なこと、および安
定性の問題であ名。

（発明の要旨） 本発明は、リポソーム小胞のメンプランの両面間にアン
モニウムイオン（ＮＨ４”）の勾配を生成させることに
よって、リポソームへ薬剤を充填し。

かつ薬剤を徐放するだめの単純で迅速、安定、経済的、
安全、および効率のよいシステムを提供するものである
。このシステムは従属的な方法ではない。すなわち、リ
ポソーム製造法の全部と、すべての種類のリポソームと
を本発明を実施するのに使用することができる。また、
このシステムは。

リポソームのアンモニウムイオンの勾配を、超音波によ
る画像形成を促進する超音波エコー導性を有するＣ（ｈ
　（ｈｙｐｅｒｅｃｈｏｇｅｎｉｃ　Ｃｏｇ）の起源と
して利用することによって、超音波画像形成法を行うの
に有用である。

本発明のある局面は１両親媒性薬剤をリポソームに充填
し、制御して徐放するのに用いる。単純で、安全、迅速
、安定、好効率、および経済的なアンモニウムトランス
メンプラン勾配システムである。

本発明の他の局面は１両親媒性薬剤のリポソームへの充
填が、リポソーム小胞の内部と外部との水性相関のＮＨ
４’とｐＨとの勾配に依存するシステムである。そして
、これらの勾配は、リポソームをアンモニウム溶液内で
形成させ１次に得られたリポソームの外部水性相のアン
モニウムを除去するか、または希釈することによって形
成され、その結果生成したアンモニウムの勾配によって
、内部水性相から外部水性相へ向かう中性アンモニアの
流出がおこり、従って内部水性相内にアンモニアが残し
たプロトンが蓄積することによって外側から内側へ向か
う逆のｐＨ勾配が形成される。脱プロトン化した両親媒
性薬剤は、　ｐＨ勾配によって、リポソーム内に流入し
て流出したアンモニウムに取って換わる。

本発明のさらに他の局面は、リポソームのアンモニウム
勾配を、超音波による画像形成用のＣＯ２を発生させる
のに利用することである。

両親媒性薬剤をリポソームに有効に充填する本発明のシ
ステムは、アンモニウム化合物またはアンモニウム塩の
存在下でリポソーム懸濁液を調製し、該懸濁液を緩衝剤
または塩で希釈して、内部水性相と外部水性相との間に
、内側から外側へ向かうアンモニウム勾配と、リポソー
ムの内側のｐＨが外側のｐＨより酸性側であるようなｐ
Ｈ勾配とを与えることを包含する。

両親媒性分子をリポソーム内に有効に充填する本発明の
方法は、（ａ）硫酸アンモニウムの存在下でリポソーム
の懸濁液を調製すること；（ｂ）該工程（ａ）で得られ
た懸濁液の外部水性相を適切な塩もしくは緩衝剤で希釈
するか、またはアンモニアを除去することによって、内
側から外側へ向かうアンモニウム勾配と、外側から内側
へ向かうｐＨ勾配とを形成させること；および（ｃ）脱
プロトン化した両親媒性薬剤をリポソームの外側から内
側へ充填することを包含する。

本発明のリポソームとアンモニウム塩との懸濁液は、リ
ポソームの外側水性相を希釈するか、またはこの水性相
からアンモニウムを除去して、リポソームの内側水性相
から外側水性相へ向かうアンモニウム勾配を形成させる
ことによって１両親媒性薬剤をリポソームに充填するの
に適切であり。

内側から外側へ向かう該アンモニウム勾配によって、外
側から内側へ向かうｐＨ勾配が形成され５両親媒性薬剤
がリポソーム内に充填される。

本発明の他のリポソームとアンモニウム塩との懸濁液は
、リポソームの内部水性相から外部水性相へ向かう逆の
ｐＨ勾配を形成することによって。

両親媒性薬剤をリポソームから放出するのに適切である
。

本発明の両親媒性薬剤充填用のアンモニウムリポソーム
は、塩または緩衝剤でリポソーム懸濁液のアンモニウム
を希釈するか、または除去することによって形成された
。内側から外側へ向かうアンモニウム勾配を有する。

本発明の他のアンモニウムリポソームは、二酸化炭素を
発生し、該二酸化炭素を組織に放出して。

超音波画像形成法における超音波エコー導性を高めるの
に適切である。

（発明の構成） ト１　の量　なジ゛Ｈ 両親媒性薬剤をリポソームに充填し１次いで該薬剤をリ
ポソームから制御して放出する本発明の新規なシステム
は、リポソームの内部水性相と外部水性相との間にアン
モニウムイオン（ＮＨ４つの勾配を形成させたことに基
づいたものである。このアンモニウムイオンの勾配は１
両親媒性分子の充填もしくは放出の所望の比率にしたが
って、外部水性相のアンモニウムイオンを除去するか、
もしくは希釈することによって形成される。このような
除去処理によって、内部相のアンモニウムイオンの濃度
が外部相より高くなる。リポソーム内の水性相のアンモ
ニウムイオンの濃度が高いと。

内部媒体から外部媒体へと中性アンモニア分子（ＮＨ３
）の拡散が起こる。リポソームから流出するＮｉｂ分子
毎に、１つのプロトンが残る。このようにｐＨ勾配が形
成され、リポソームの内部水性相は外部媒体よりも酸性
になる。この勾配の大きさは、外部（Ｎ）１４”）／内
部（Ｎ１４４”）の比で測定される。

弱い両親媒性化合物は、リポソームの内部よりも高いア
ルカリ性ｐＨの外部相を有するシステムが形成されたな
らば１通常は透過できないメンプランでも通過できるは
ずである。このようなシステムは、自然に平衡化しよう
とする。すなわち、内側と外側とのｐＨが同じになろう
とする。このようなｐＨの平衡化が可能かどうか、また
はその平衡化がどの位に速く起こるかは、リポソーム内
部水性相を外部水性相から隔てているメンプランの化学
的特性と、媒体の組成とによって決まる。リポソームは
、その脂質二重層によって、上記の平衡化に対して自然
に抵抗する最適のメンプランバリヤーを提供する。リポ
ソーム自体は、硫酸アンモニウムのような適当な媒体中
で形成され、この媒体の一部が、ある程度リポソーム内
に封入され、ある内部ｐＨを有する硫酸アンモニウム含
有リポソームを形成する。このｐＨは、リポソーム内部
に充填された硫酸アンモニウムの量と、リポソーム外部
の硫酸アンモニウムの量との差によって決まる。

この外部と内部との量が同じならば９両方のｐＨは。

硫酸アンモニウム溶液のｐ）Ｉと同一か、または緩衝液
が硫酸アンモニウムに添加される場合は、緩衝液／硫酸
アンモニウムのｐＨと同一である。しかし。

外部の硫酸アンモニウムが異なる塩で、置換、希釈、も
しくは交換されると、リポソームの内部は。

迅速に反応してｐＨを酸性側に変化させる。

リポソーム内で、硫酸アンモニウムは、硫酸アニオとア
ンモニウムカチオンに解離し、またこのカチオンはさら
に解離して中性のアンモニアとプロトン（Ｈ゛）とにな
る。リポソームメンプランを自由に透過できる中性のア
ンモニアは１本発明を実施する際、他の化合物９例えば
両親媒性の脱プロトン化薬剤と交換することができる。

このような薬はリポソーム内に浸透し、アンモニアが脱
離して残っている遊離のプロトンが、該薬剤と結合する
。このようにして薬剤は、プロトン化されてリポソーム
の外へ透過せず、逆のｐＨ勾配状態が起こると、リポソ
ーム内で、プロトンと脱プロトン化された薬剤とに解離
し、その結果リポソームから外に透過可能になる。

外部のアンモニウムイオン量を低下させることによって
リポソームの内部から外部に向かうアンモニウムイオン
勾配を形成すると、内部のアンモニウムイオンは、外部
に向かって透過してトランスメンブラン・アンモニウム
平衡に到達しようとし、その結果、アンモニアが排除さ
れ、プロトンＨ゛が残ることによって、　ｐＨの非平衡
状態が起こり。

ｐ）ｌはリポソームの内部の方が小さくなる。このよう
にして、リポソームメンプランを透過することが可能で
あり、脱プロトン化できるいずれの入手しうる両親媒性
薬剤も充填できる。ある数のアンモニウム分子がリポソ
ームから離脱すると、同数の両親媒性薬剤分子が、外部
環境から供給されて。

離脱したアンモニウム分子に入れ換わってリポソームに
入る。それ故に、脱プロトン化された形態で、リポソー
ムメンプランを透過することができ。

外部環境に存在するいずれの薬剤も、上記の方法によっ
てリポソーム中に効率よく充填することができる。リポ
ソーム内で薬剤はプロトン化され。

そのためトラップされて漏出することができず。

リポソーム内に弱い両親媒性物質が蓄積される。

アンモニウム勾配を形成するシステムをスキーム１に示
す。

スキーム１ リポソーム このスキームに示す水酸化アンモニウムは、スキーム１
に従って、リポソーム内で解離して中性のアンモニアと
プロトンＨ゛とになる。硫酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、炭酸水素アンモニウム、または他のアンモニウ
ム化合物で取り換えることができる。Ｈは１例えばスキ
ームに示す第一級アミノ基のような反応部位を有する両
親媒性分子である。

このようにして、かなりの測定可能な量の弱い両親媒性
薬剤をリポソームに充填することができ。

充填度と充填速度とを操作することができ、またリポソ
ームからの薬剤の放出も同じシステムで制御することが
できる。勾配の安定性は、リポソームの脂質の組成と、
脂質二重層が無傷なことが関与する。形成されるｐＨ勾
配は１両親媒性薬剤の。

リポソームへの充填と、リポソームからの放出との両方
を制御するのに利用することができる。この勾配は１両
親媒性薬剤を充填する起プロトン力として作用し、また
逆に、薬剤を放出する力として作用する。

この方法は、他の類似の勾配充填法に対して次のような
改良点を示している。すなわち１本発明の方法は、特別
な化学薬剤や装置を必要としないので、簡単であり、ま
たリポソームに薬剤を充填するのに、ごく短時間しか必
要としないので迅速である。また、この方法は、脱水な
どの保存法を用いる必要なしに、２週間以上安定な薬剤
充填リポソームを提供し、高いｐ）Ｉもしくは高温によ
って起こる加水分解から脂質を保護し、また最も安価で
容易に入手しうる化学薬品と装置だけを使うので経済的
であり、また強い酸もしくは塩基を必要とせずに中性の
硫酸アンモニウム勾配を利用する点で安全であり、遊離
の薬剤を余分に必要とすることに起因する損失なしで封
入可能な薬剤のほとんど１００％をリポソームに封入で
きるので効率的である。

リポソームの内側と外側との間にｐＨ勾配を形成するシ
ステムは、水酸化物のようなアンモニウム化合物、また
は硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、炭酸水素アンモニウムのような塩をリポソーム
小胞内に封入し、外部の硫酸アンモニウムを、非透過性
のアニオンを有する異なる塩で交換することによるもの
である。

適切な塩としては、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩。

炭酸塩、シアン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、炭
酸水素塩などと、ナトリウム、カリウム。

カルシウム、リチウム、バリウム、マグネシウム。

アルミニウム、ニッケル、銅などの塩、臭化物。

塩化物、ヨウ化物、フン化物などがあるが、塩化ナトリ
ウムもしくは塩化カリウムが好ましく、またリン酸緩衝
剤、炭酸緩衝剤、炭酸水素緩衝剤のように広く知られ、
当該技術分野で用いられている緩衝剤は、すべて本発明
の方法に用いることができる。

当該技術分野で用いられ認められている方法。

特に希釈法、ゲル排除法、透析、透析濾過などで外部の
アンモニウムを有効に除去すると、このようにして形成
された内部のアンモニウムの勾配によって、リポソーム
から中性のアンモニウムが直ちに放出されてリポソーム
内にプロトンが蓄積され、その結果、リポソーム内の水
性相が酸性になる。硫酸アンモニウムが解離した後、リ
ポソーム内に残った水素イオンもしくは硫酸イオンは、
高品質の脂質を用いた場合、容易には漏出しない。

さらに、適正な試験条件が満たされれば、アンモニウム
の勾配は少なくとも２週間以上安定である。

この方法には、いくつもの利点がある。第１に。

０．５５〜０．０００５５Ｍの硫酸アンモニウムを含有
する溶液に、硫酸アンモニウムと、塩化ナトリウムもし
くは塩化カリウムのような塩または炭酸、炭酸水素もし
くはリン酸の緩衝液とを異なる比率で含有する溶液で、
硫酸アンモニウムによるリポソーム懸濁液を希釈するこ
とによって、前記勾配の大きさを制御できることである
。このことは第１図に示しである。希釈度によって、０
〜４９Ｈ単位の範囲でｐＨの勾配を得ることができる。

リポソームからのＮＨ２イオンの流出は、　ＮＨ，“の
勾配によって決まる。勾配が大きい程、　ｐＨは低ぐな
り、　ＮＨ３イオンの流出が速くなり、リポソームに充
填されるべき分子の流入が速くなる。硫酸アンモニウム
リポソーム：塩の比を操作することによって、　０．２
５ｐＨ単位のような小さな勾配の変化または３〜４のｐ
Ｈ単位のような大きな勾配の変化を得ることができる。

あるいは、このシステムは、　０．０１〜ＩＭ、好まし
くは０．０５〜０．１５Ｍの範囲のより高いモル濃度も
しくはより低いモル濃度の硫酸アンモニウム溶液中のリ
ポソームを用いることによって、より大きいもくしはよ
り小さいアンモニウム勾配を得ることができ、その結果
、より大きいもしくはより小さいｐＨ勾配が得られる。

（以下余白） 上記の方法は、リポソームの製造法とは別個のものであ
る。したがって、リポソームは、脂質膜が薄いか厚いか
にかかわらず（薄い脂質膜が好ましい）、脂質の水和を
含む溶媒注入法、逆相蒸発法、凍結乾燥、または凍結と
解凍とを繰り返すことによって、多重ラメラ小胞（ＭＬ
Ｖ）として作製することができる。この方法は、小さな
単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、すなわち音波処理；フレンチ
圧力セルを用いてＭＬＶを高圧下で小さな穴を通過させ
る処理；エーテル類またはアルコール類のような溶媒を
用いる溶媒注入法によって製造される小さなリポソーム
を得るのに、同様にうまく適用しかつ同様に利用できる
。同様に、この方法は、透析、カラムクロマトグラフィ
ー、バイオ・ビーズＳト２（ｂｉｏ−ｂｅａｄｓ　５Ｍ
−２）＋　　逆相蒸発法（Ｒ１！Ｖ）を用いて界面活性
剤を除去するか、または高圧押出によって中間の大きさ
の単ラメラ小胞を形成させることによって製造される大
きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、安定な多ラメラ小胞（ｓ
ｔａｂｌｅ　ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃ
ｌｅ（ＳＰＬＶ）　）もしくはオリゴラメラ小胞（ＯＬ
Ｖ）を得るために適用される（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ紅虹■ｎ、　３３：３３７
　（１９８８））。当該技術分野で知られている。これ
らおよび他のリポソーム製造法は。

本発明を実施するのに有用である。これらの方法は、米
国特許第４，２３５，８７１号、第４，２４１，０４６
号。

第４，５２９．５６１号、第４．７３７．３２３号、お
よび第４，７５２．４２５号に開示されており、これら
の特許は５本願に援用する。

本発明の方法を用いてリポソームに充填できる薬剤は１
弱塩基性もしくは弱酸性の部分を有するすべての弱い両
親媒性化合物であり、数ある中で次のようなものが含ま
れる。すなわち、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウ
ノルビシン、カルジノマイシン、Ｎ−アセチルアドリア
マイシン、リビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ
−アセチルダウノマイシン、すべてのアントラシリン薬
剤、ダウノリリン、プロプラノロール、ペンタミジン。

ジブカイン、テトラカイン、プロ力イン、クロルプロマ
ジン、ビンプラスチン。ビンクリスチン。

マイトマイシンＣ１ピロカルピン、フィゾスチグミン、
ネオスチグミン、クロロキン、アモジアキン、クロログ
アニド、プリマキン、メフロキン。

キニーネ、プリジノル、プロジピン、ベンズトロピン・
メシルレート、塩酸トリヘキシフェニジル。

プロプラノール、チモロール、ピンドロール、キナクリ
ン、ベナドリル、ベンダドリル、ドパミン。

セロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メ
タトン、モルフイン、アトロビン、デシクロミン、メチ
キセン、プロバンチリン、イミプラミン、アミトリプチ
リン、デキセピン、デシプラミン、キニジン、プロプラ
ノロール、リドカイン。

クロルプロマジン、ベンダドリル、ペルフェナジン、ア
グリシン・オレンジ、プロスタグランジン。

フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、およびこ
れらの化合物に類似の他の分子である。

ｐＨによる充填法は、過去に発表されているが。

本発明の新規なシステムは、他の方法に対して。

いくつもの独特の利点がある。簡単なリポソームの希釈
によって前記勾配を容易に制御する性能は。

独特の利点であるが、この種の薬剤放出システムの新規
な特徴である。充填率は予想可能であり。

達成される最終の薬剤濃度は、充填される物質のｐＫ値
と、薬剤の化学的修飾によって改変できるその脂質／水
分配係数から測定されるその疎水性とによって決まる。

本発明の薬剤充填法は、迅速かつ容易で高性能の装置や
特別の化学薬品を必要とせず、すなわち２種の緩衝液さ
えも必要としない。

過去に用いられた他の類似のシステムを凌駕する主要な
進歩性は、リポソームを充填前に、その内面だけを、ご
く短時間、低ｐＨに暴露し１次いで充填と放出とを３７
°Ｃで行うことができるという方法でアンモニウムの勾
配を形成することである。

このことは、リポソームの外部環境が変化すると。

アンモニアが漏出し、内部水性相のｐＨが低下するが、
外部水性相のｐＦＩは変化しないということに起因して
いる。薬剤を充填中、特に充填開始時、薬剤が急激に流
入すると、ｐＨが部分的に２、速に上昇し、そのためリ
ポソームの低ｐＨへの曝露が低下する。このことは、脂
質小胞の安定性にとっては重要な結果である。その理由
は、リン脂質類を酸性の低ｐＨに、長時間、曝露すると
、その分解をもたらすからである。

゛本発明の他の重要な特徴は、リポソーム薬剤が安定な
ことである。本発明のシステムを用い、リポソームの脂
質組成物を設計することによって。

リポソーム薬剤の安定性は著しく改善される。これは、
薬剤の充填と放出とを３７°Ｃで行うことによるもので
ある。このことは非常に重要である。なぜならば、４°
Ｃで数週間もの間にわたる貯蔵中に。

薬剤がごく低い速度でしか漏出しないということが見出
されたからである。他方、高温の約５０°Ｃでは、薬剤
がかなり漏出した。また、薬剤のリポソームからの漏出
は、リポソームの脂質組成物に依存し、　ＥＰＣ／コレ
ステロールの製剤は５例えばＤＰＰＣ／コレステロール
小胞よりも大きな速度で漏出する。これらの結果を表４
に示す。リポソームからの漏出速度は、使用するリン脂
質の選択と、コレステロールのレベルとによって制御す
ることができる。例えば、転移温度が５６°ＣのＤＳＰ
Ｃを添加すると、広範囲の温度にわたって漏出による放
出が城少する。ＤＰＰＧは両親媒性薬剤と特定の複合体
を形成するが、これを添加すると、やはり異なる放出速
度が得られる。

本発明のシステムの表１に示す他の重要な利点は、非常
に多量の薬剤を、リポソーム内に、イオン透過担体を添
加したり、それが存在することなしで、充填する性能で
ある。このシステムは、３単位より大きいｐＨ勾配をほ
とんど瞬間的に自ら形成するので１弱塩基が、少なくと
も１　：　１０００の比率で小胞の内部と外部とに分配
されている。というのは、この分配は、外部と内部とに
おけるＮＨ４”の比率に対して１次で依存しているから
である。

この比率は、充填中の薬剤の濃度と、水溶液中の薬剤の
溶解度とに依存している。外部媒体中の薬剤の濃度を最
適化し、最初の充填封入時に高濃度のアンモニウムを封
入する方法でアンモニウムリポソームを製造することに
よって、充填効率をほとんど１００％に到達させること
ができる。この場合、リポソーム中の薬剤／脂質の比は
、薬剤が過剰に存在している場合より低い。

本発明のシステムで利用できるリポソームは。

種々の小胞形成脂質で製造される。その脂質としては、
リン脂質類のような二脂肪族鎖脂質類；ジグリセリド類
；二指肪族糖脂質ニスフィンゴミエリンやグリコスフィ
ンゴリピドのような単一脂質類；コレステロールおよび
その誘導体が挙げられ、これらの単独もしくは組み合わ
せ、および／またはリポソームメンプラン硬化剤を用い
るか、もしくは用いずに利用される。

本願で定義される「リン脂質類」には、ホスファチジン
酸（ＰＡ）とホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホ
スファチジルコリン（ＰＣ）　、ホスファチジルエタノ
ールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐ
Ｉ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、プラスマローゲ
ン類、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＳＣ
）のようなホスファチジルコリンリピド誘導体、卵ホス
ファチジルコリン（ＲＰＣ）　、　　部分水素化卵ホス
ファチジルコリン（ＰＨＲＰＣ）　、　　ジステアリル
ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）　、ホスファチジル
グリセロール（ＰＧ）などが含まれる。これらのホスホ
リピド類は、完全に飽和されていてもよく、または一部
が水素化されていてもよい。これらは天然産でも合成品
でもよい。

本願で用いられる「糖脂質」という用語には。

２つの脂肪酸鎖を有し、その１つがスフィンゴシンの炭
化水素鎖であり、さらに１つまたはそれ以上の糖残基を
有するような脂質類が含まれる。本発明を実施するのに
適切な糖脂質類の例には、セレプロシド類、ガラクトセ
レプロシド類、グリコセレプロシド類、スフィンゴミエ
リン類、　ＧＭ、、スルファチド類、および極性基を持
つ頭部として二ｔ！類や三糖類を有するスフィンゴリピ
ド類、すなわちジヘキソシド類およびトリへキソシド類
が含まれる。

本願で用いられる［ポリエチレンオキシド類」という用
語は、エチレンオキシドを重合させることによって製造
される分子量が５００〜２０，０００のポリエーテル類
を意味する。その代表的なものは。

ポリエチレングリコールである。これらポリエチレンオ
キシド類、好ましくはグリコール類は１他の脂質類、特
にリン脂Ｉｊｔ類と結合するのに適切で。

いわゆるＰＥＧリポソーム類を形成する。これらのリポ
ソームからなるメンプランは、リン脂質リポソーム類だ
けで製造されたメンプランとは異なる性質を持っている
。ホスファチジルのシステムは。

薬剤をこれらのリポソーム類に充填するのに特に適切で
ある。

大部分の小胞形成脂質類を形成するのに好ましい、リン
脂質類のような二脂肪族鎖の脂質類では。

その脂肪族鎖は、長さが少なくとも約１２個の原子のも
のが好ましく、最適なのは、約１５〜２４個の原子から
なる長さのものである。この鎖は部分的もしくは実質的
に飽和されていてもよく、また後者の場合は、各鎖が多
くても１つの不飽和結合を持っているにすぎないことを
意味する。飽和脂肪族鎖によって、リポソーム内に、よ
り良好な脂質の充填が起こり、その結果、酸化的／過酸
化的な脂質の損傷をなくすことにより、リポソーム処方
物の安定性を顕著に拡大する。このような酸化物損傷が
ないことは、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシトル
エン（ＢＩＴ）、もしくはビタミンＥのような脂質親和
性の遊離基捕獲剤が存在しない場合でも認められ、これ
らと他の脂質保護剤は、有効量で任意に添加することが
できる。同様に、ステロイドタイプの脂質類をリポソー
ム類に含める場合は、コレステロールおよびその類似物
のような飽和物が好ましい。

本発明のリポソーム組成物を製造するのに用いる脂質は
、電荷を持っていても、中性であってもよい。リポソー
ム組成物の保持を促進するには。

全リポソームの表面が負に帯電しているのが好ましいの
で、中性もしくは負に帯電した脂質が好ましい。

本発明の処方物に用いるのに好ましいＲＰＣ，ＤＰＰＧ
、　ＤＰＰＣ，ＰＨＥＰＣ，およびＤＳＰＣは、Ｃ１□
〜Ｃ２□、　好ましくはＣい〜Ｃ２゜の各種鎖長の、飽
和脂肪酸と不飽和脂肪酸とのほぼ同量ずつで構成されて
いる。

脂質の酸化を減少させるために、使用時には、主として
多不飽和脂肪酸を水素化してモノ不飽和脂肪酸にする。

リポソーム組成物は、さらに、コレステロール。

コレステリル・ヘミスクシネート、コレステリルスルフ
ェート、コレステリル、およびコレステロールの他の誘
導体を含有していてもよい。リポソーム組成物は、さら
に、少量の脂肪アルコール。

脂肪酸、および／またはコレステロールエステル類、あ
るいは他の薬学的に容認可能であって１表面電荷、メン
プランの流動性に影響しかつ薬剤のリポソームへの取込
みを増大させる賦形剤を含有させて処方してもよい。

（以下余白） ユ」ＬムニＡ（２υ」袈 ＭＬＶ、　ＬＵＶ、　ＯＬＶ、　ＳＵＶ、　ＦＴＭＬＶ
および５ＰＬＶのリポソーム類を調製した。これらはす
べて、リン脂質類（ＰＬ）　、好ましくはｔｉＰｃ、　
ＤＰＰＣ，０５ＰＣ，ＤＳＰＧおよびＰＨＥＰＣと、コ
レステロールと（ＰＬ／ＣＨＯＬ　；　２／１；モル１
モル）、必要に応じて加えられた１〜１０モル％のＰＥ
Ｇとで構成されている。ＭＬＶは、　ＣｈｅＩＩＩ。

Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　１巻、　２２５〜２４６
頁、　１９６７年とＭｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ａｎａｌ、　３３巻、　３３７〜４６２頁、　１
９８８年、とに記載されている薄層水和法で調製した。

５ＰＬＶは、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　２４
巻、　２８３３〜２８４２頁。

１９８５年にしたがって、ジエチルエーテルのような有
機溶媒中で実施される脂質水和法で調製した。

鉄イオンの影響またはドキソルビシンの分解および脂質
の過酸化を最少にするために、　０．５　ｍＭのデスフ
ェラルが、米国特許第４，７９７，２８５号（本願に援
用される）に記載の手順にしたがって、リポソーム調製
に用いられる全水溶液に添加される。ＰＥＧ−ＰＬ、　
ＭＬＶ、　ＯＬＶ、　ＳＵＶ、　５ＰＬＶもしくはＦＴ
ＭＬＶを含むすべてのタイプのリポソーム類が、この発
明の範囲内にあると考えられる。リポソームは、アンモ
ニウム溶液の存在下、適切な方法で調製するか。

またはアンモニウムなしで予め作っておいて９次にアン
モニウム溶液に入れてまたはそのような環境下において
調製される。あるいは、アンモニウムを、適切な封入法
を用いて、リポソームに封入してもよい。

１ポソーム　ＮＨ９の リポソームは、リポソームの調製に一般に用いられてい
るいずれの方法でも調製することができる。一般に、リ
ポソーム調製に選択された脂質成分が１種以上存在する
場合には１例えばホスファチジルコリンとコレステロー
ルの２＝１の比率のような最適の比率でこれらを混合し
、有機溶媒に溶解させ、室温でエバボレートして乾固さ
せる。

上記有機溶媒には１例えば、ジクロロメタン、四塩化炭
素、塩化エチレン、メチルクロロホルム。

ベンゼン、トルエン、塩化エチル、塩化イソプロピル、
クロロベンゼン、ブロモベンゼン、フルオロベンゼンな
どがあり、好ましくはクロロホルムが用いられる。ｐＨ
を生成する系もしくは化合物。

例えば硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素
アンモニウム、水酸化アンモニウムなどを。

リポソーム内に適切な内部ｐＨを生じさせる量で。

残留物である薄い脂質フィルムに加え２次いで。

デスフエラルまたは他のキレート化剤と、他の水溶性抗
酸化剤（例えば、可溶性ビタミンＥ、ビタミンＣ，グル
タチオン、尿酸）とを安定化のために加える。あるいは
１通常用いられる親油性抗酸化剤がリポソーム形成中に
リポソーム膜に組込まれ、これが過酸化的損傷に対する
保護剤として働く。上記抗酸化剤としては９例えばブチ
ル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエ
ン（ＢＨＴ）　、ブチル化ヒドロキシアセトン（ＢＨＡ
）　、　　α−トコフェロール、α−トコフエロールス
クシナート、およびプロピルガラードがある。　　ＭＬ
Ｖ、　ＳＵＶ。

ＬＵＶ、　ＱＬＶ、　５ＰＬＶ、　ＦＴＭＬＶなどのよ
うなリポソーム類は、押出し法または音波処理、均質化
法などのようなその外の適切な方法で調製される。

アンモニウムリポソームの　　Ｈ 例えば０．１５ＭのＮａＣ１もしくはＭＣＩ溶液のよう
な種々のインオスミック塩の溶液で予め平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０に、リポソームを含有する硫酸アン
モニウムを通過させて、外側の硫酸アンモニウムのすべ
てもしくは一部を有効に除去し塩化ナトリウムまたは塩
化カリウムで置換する。その結果、リポソームの内側と
外側との間に硫酸アンモニウムの匂配が生成する。中性
のアンモニア（Ｎｉｂ）はこのリポソーム膜を自由に通
過できるので、　ｐＨの匂配は、このようにして形成さ
れ、内部水性相が外部よりも酸性になる。その原理を実
施例１〜４で説明する。

ｐＨ匂配の存在を証明するために、リポソームの内部ｐ
Ｈを測定する２つの別々の測定法が用いられた。まず、
ピラニン（８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリス
ルホナート）をリポソーム内に封入して。

その螢光強度を実施例４にしたがって測定した。

ピラニンの螢光強度はｐｉ（依存性である。なぜなら。

ｐＫ＝７．２のピラニン分子の８−ヒドロキシ基を滴定
するとその吸光係数が明らかに変化するからである。実
施例４の校正曲線は、リポソームの外部媒体）ｐＨを７
．５の一定に保持し、リポソーム小胞内のｐＨを５．０
〜７．５の範囲で変化させて作製した。

曲線の左のシフトは、小胞の外表面に静電気的に結合し
た少量のピラニン染料によるものである。

この校正曲線は、溶液を希釈して硫酸アンモニウム：塩
化カリウムの比率を低下させた場合の、硫酸アンモニウ
ムリポソームの内部ｐ）ｌの変化を定量するのに用いた
。硫酸アンモニウムの濃度の外側：内側の種々の比率は
、外側硫酸アンモニウムを種々の塩で希釈して形成した
。

硫酸アンモニウムリポソーム内に封入されたピラニンの
螢光強度の変化を、硫酸アンモニウムの外部対内部の濃
度の比率として第１図に示す。第１図は、硫酸アンモニ
ウムの外部／内部の濃度の比率を低下させると内部のｐ
Ｈが下がることを示している。ピラニンを充填したリポ
ソームを、　ｐＨ７，５の０．１５Ｍ塩化カリウムで予
め平衡化したセファデックスＧ−５０カラムを通過させ
た後に、ピラニンの螢光は、リポソームの内部ｐＨの変
化が少なくとも３単位であることを示している。曲線の
矢印は。

第１図への挿入図からの硫酸アンモニウムリポソームの
内部ｐＨを示す。挿入したグラフは、リポソームに封入
されたピラニンの螢光とリポソームの内部ｐＨとの関係
を示す校正曲線である。さらにアンモニウムの匂配の存
在を実証するために、アクリジン　オレンジのような他
の化合物を使って上記したのと同じ試験を繰返した。細
胞毒性薬剤のアクリジン　オレンジは両親媒性の弱塩基
（ｐに＝９．２５）であり、螢光を発する長所がある。

硫酸アンモニウムリポソーム内にピラニンを封入する代
わりに、アクリジン　オレンジを含有する溶液にリポソ
ームを添加した。リポソームの水性相に分配し、実施例
５に記載の試験計画を利用して、上記の溶液の消光状態
を監視し、第２図に示した。

第２図は、リポソームの内側と外側との間の硫酸アンモ
ニウムの匂配の、アクリジン　オレンジの螢光の消光に
対する影響を示す、挿入グラフは。

試験の一例である。アクリジン　オレンジの螢光強度（
Ｆ、１．）の百分率を連続的に監視しくａ）とじて示す
。所定の時間（ｂ）において、リポソームを添加し消光
を追跡した。定常状態で、５μｍのナイジェリシンを添
加し〔（ｃ）で示す〕、消光の解除（ｒｅｌｅａｓｅ）
の度合を、螢光強度に依存する硫酸アンモニウム匂配を
計算するのに用いた。試験の詳細は実施例５に示す。

外部の硫酸アンモニウムが除去されたリポソームでは、
アクリジン　オレンジは９６．５％消光し。

これはリポソーム内部の水性区画が大きく酸性化してい
ることを示している。

雷ポソームのドキソルビシンによる ドキソルビシンは、いくつかの物理特性がアクリジン　
オレンジに類偵した両親媒性薬物である。

それはアミノ基を有する両親媒性の弱塩基である（ｐＫ
＝８．２５）。従って、この薬物は、リポソームの内側
と外側との間に生じたｐＨ匂配によって、リポソームの
内部水性区画にドキソルビシンを充填させる。アクリジ
ン　オレンジと１（３４の性質を有する。この薬物を充
填させるために、実施例１〜＼ ３により形成された硫酸アンモニウムリポソームを、　
０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で予め平衡化したセファ
デックスＧ−５０カラムを通過させてｐｏ匂配を作り、
実施例ＩＣ〜３Ｃの方法により、生理食塩水−デスフェ
ラルによるドキソルビシン溶液に添加した。薬物取込み
の動力学を、第３図に示す。

リポソームの２つの製剤を用いた。その一方は。

２：１のモル比のＥＰＣおよびコレステロールによ　　
７り構成され、２番目は、２：１のモル比のＤＰＰＣお
よびコレステロールにより構成される。

／ 第３図は、ドキソルビシンの硫酸アンモニウム　′リポ
ソームへの充填の動力学を示す。この充填は。

封入されていない外側の硫酸アンモニウムを、セファデ
ックスＧ−５０ゲル排除クロマトグラフイで除いた後に
開始した３、ドキソルビシンは、　　ＥＰＣ／コレステ
ロール・リポソームととも＆＝２５°Ｃで所定時間イン
キュベートしく＋←−で示す）。

あるいは別個にＤＰＰＣ／コレステロール・リポソーム
とともに５０°Ｃで所定時間インキュベートした（−一
一〇−−−０−−−で示す）。加温終了後、取込まれて
いないドキソルビシンをダウエックス５０Ｗカラムに吸
着させて除去し５次いでリン脂質および薬物の濃度を測
定してドキソルビシン／脂質比を計算するのに用いた。

遊離の封入されていないドキソルビシン（ＤＸＲ）を、
カチオン交換樹脂ダウエックス５ＷＸ−４（２００〜４
００メツシユ）を用いてリポソーム・ドキソルビシン製
剤から除去した。上記の樹脂は、　Ｂｉｏｃｈｅｓ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ＋　８１８巻、　３４３−３
５１頁、　１９８５年に記載の方法を若干改変した方法
によってそのナトリウム塩の形で調製した。得られたダ
ウエックス樹脂をリポソーム・ドキソルビシン製剤に添
加し。

室温で２０分間ゆるやかに振盪した。上記保期間中。

正に帯電した遊離のドキソルビシンはこのダウエックス
樹脂に結合し、一方封入されたドキソルビシンは、負に
帯電したリポソームと結合して残る。

ダウエックス樹脂は、混合物を、５．０μ−のナルジエ
ン（Ｎａｌｇｅｎｅ）濾過用漏斗〔ナルゲ社（Ｎａ１ｇ
ｅＣｏｎ＋ｐａｎｙ）　＋米国、ニューヨーク州、ロチ
ェスター〕で減圧濾過することによってリポソーム・ド
キソルビシンから除去された。ダンエックス樹脂はデス
フェラルに結合するので、ダウエックス樹脂で遊離の薬
物を除去した後、直ちに０．５＋ｍＭの最終濃度でデス
フェラルを添加した。

第３図かられかるように、上記のプロセスは。

最初の１時間の速い相と、その後の遅い相との２相で構
成され、後者の相は約２４時間続く。ＤＰＰＣ／コレス
テロール・リポソームに取込まれた薬物の量は、　　Ｅ
ＰＣ／コレステロール・リポソームに取込まれた量の２
倍であった。内外のｐＨ匂配をもたない硫酸アンモニウ
ムリポソームは、使用した特定の脂質の分配係数と利用
しうる内部体積とから予想される程度にしか薬物を取込
まなかった。最終の比率は脂質の濃度に依存していた。

の　Ａの　　に　　る 例えばアクリジンの誘導体のようなその他の両親媒性弱
塩基は、　ｐＨ匂配に応答して、リポソームの内部水性
相に、ドキソルビシンより著しく速く分配される。ダウ
ノルビシンは、水酸基を欠いたドキソルビシンの同族体
であり、従って、ドキソルビシンよりも疎水性であるが
、ダウノルビシンを充填したリポソームは、試験条件下
で、上記の傾向を有することが証明された。ダウノルビ
シン取込みの速度はドキソルビシンより高かったが。

これは恐らくダウノルビシンの疎水性が約１０倍高いこ
とによるものであり、その取込みは１時間未満で完了し
た。

リポソーム　のドキソルビシンの リポソーム内に充填された薬物の濃度を測定するために
、小胞の内部の水性浸透体積を測定した。

この測定は、非測定的（ｎｏｎ−ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ
）放射性トレーサー３Ｈイヌリンを封入して行った。補
足されなかったイヌリン除去の前後のリン脂１ｔ１モル
あたりの放射能を比較し、これを１個々の実施例に記載
された方法を用いて、封入体積（ｔｒａｐｐｅｄｖｏｌ
ｕｍｅ）を測定するのに利用した。得られたデータから
、２つの製剤、すなわちＥＰＣ／コレステロールおよび
ＤＰＰＣ／コレステロールの小胞の内部体積を計算して
表１に要約した。ＤＰＰＣ／コレステロール製剤の内部
封入体積は、　　ＥＰＣ／コレステロール製剤のほとん
ど２倍（つまり、後者の１．５ｄ１モルに対して２．７
ｍ１モル）であった。これは。

表１に示すように、これら２つのリポソームの集団間の
大きさの差と良好な相関関係を有している。

また、これら２つの製剤中のドキソルビシンの計算平衡
濃度を表１に示す。２つの製剤の内部のドキソルビシン
濃度は、リポソームの大きさに差があるにもかかわらず
、はとんど同一であるが、先に述べた脂質比に対する薬
物の差異を説明している。２種の小胞中のドキソルビシ
ンの濃度が同一であるということは、システムがその限
界に達していることを示唆している。

１ポソーム　での゛キソルビシンの リポソームへの薬物、の充填に際して出合うことが多い
問題の一つは、充填に限界があるということがあり、す
なわち薬物のある量しか充填できず、その限界に達した
ならば、薬物はリポソーム内で凝集体を形成することが
多い。このことは。

ドキソルビシンで最もよく示すことができる。

約１μｌより高い濃度では、ドキソルビシンは二量体を
形成し、高分子量の凝集体になるということは、すでに
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　２１巻、　３９２７〜３
９３２頁、　１９８２年に記載されている。硫酸アンモ
ニウムリポソーム内で達成される濃度はこの限界をはる
かに超えるので、この薬物の小胞内での物理的状態を研
究した。凝集によって変化する最も単純なパラメータは
、薬物の吸光スペクトルである。４７０ｎｍの吸光度：
　５５０ｎｍの吸光度の比率は、この薬物の凝集状態の
半定量的なパラメータを提供することができる。表２に
、ドキソルビシンの高濃度溶液についての上記の比率と
、ドキソルビシンが充填されたリポソームからの同じパ
ラメータについてのデータを示す。測定はパーキン・エ
ルマーλ３Ｂ型デュアルビーム分光光度系で実施した。

リポソーム内の上記比率により、同じ脂質組成を用い同
じ方法で対照用に作製した“空°゛のリポソームすなわ
ちドキソルビシンを含有していないリポソームでは異な
るスペクトルが得られた。この方法を用いて、リポソー
ムの光の散乱が修正された。

両方の場合において、薬物がかなり凝集していることが
データから推測することができる。しかし。

このような凝集は、ドキソルビシンのリポソームからの
放出に全く悪影響を与えない。

封入されたドキソルビシンの螢光の研究を、溶液中の遊
離のドキソルビシンの螢光強度を、リポソームに封入さ
れた薬物の螢光強度と平行してその濃度の関数として研
究することによって実施した。測定は、パーキン・エル
マーＭＰＦ−４４分光螢光計で、励起／発光波長の４７
０ｎｎ＋と５９０ｎｍとを用いて行った。ドキソルビシ
ンは１表３に示す濃度まで生理食塩水で希釈した。薬物
の螢光は、約１０−５Ｍより高い濃度では消光すること
がわかった。この試験は、各濃度ごとの螢光と、同じ溶
液の１０−’Ｍより低い濃度に希釈したものの螢光を比
較して行った。溶液の自己消光の研究には、内部フィル
ター効果の問題がある。表３でわかるように、リポソー
ム内のドキソルビシンの螢光は、はとんど１００％消光
される。これは、実施例１〜４で作製したリポソームの
螢光と、　０．７５Ｍ　１（ｃＩを１０％含有するイソ
プロパツールで１０倍に希釈した後の同じ混合物の螢光
との差から算出した。このような溶液は、リポソームを
完全に可溶化するので、ドキソルビシンの濃度は１０’
倍以上希釈される。水中および酸性イソプロパツール溶
液中でのドキソルビシンの螢光の差の修正を、これら２
つの溶液における°“遊離”の薬物の螢光の測定値から
推測して行った。少量の消光されていないドキソルビシ
ンは、恐らく、小胞から漏出したいくらかの遊離の薬物
によるものである。

ドキソルビシンの１ボソームか゛の この発明の重要な態様のひとつは、薬物のリポソームか
らの漏出である。この漏出は、速くて制御できない場合
または非常に遅い場合には、リポソームの薬物封入によ
って得られた利点を完全に打消してしまう場合がある。

他方、この漏出を１時間的に制御して時間的に放出がで
きれば１組織に対する薬物の放出において大きな利点と
改良とを達成することができる。

ドキソルビシンの螢光の自己消光性によって。

リポソームからのドキソルビシンの漏出を測定する直接
的で容易な方法が提供される。螢光強度の増大〔これは
デクエンチング（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　）の影響で
ある〕を監視することによって、実施例６の方法に従っ
て、放出された薬物の正確な量を監視することができる
。取込まれていないドキソルビシンを除去すると薬物の
強い勾配が生成するので、ある程度の漏出は推定される
ことがわ′かるであろう。

表４および第４図は、前記２つのタイプのリポソームか
らの漏出速度に関するデータを示す。第４図はリポソー
ムからのドキソルビシンの漏出を示す。この図は、膜に
結合したドキソルビシンまたは水性相に封入されたドキ
ソルビシンを有する。

リポソームからの漏出を比較している。水性相に封入さ
れたドキソルビシンを有するリポソームは。

ＤＰＰＣ／コレステロール（−・−・−）およびＥＰＣ
／コレステロール（−−−−−）のリポソームを用いて
、実施例に記載されている硫酸アンモニウム充填法で調
製した。膜に結合したタイプのリポソームは、　　（７
／３／４　７モル１モル１モル）の比率のＲＰＣ／ＥＰ
Ｇ　／コレステロールで構成され、痕跡量の３トコレス
テアリルリルアートを含有しいる。

リポソーム　ＣＯのアンモニウム 本発明はまた。気体、特にＣＯ□を超音波影像化用のハ
イパーエコージェニックエンハン”ｊ−（ｈｙｐｅｒｅ
ｃｈｏｇａｎｉｃ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　）として発生さ
せるのに有用である。その方法と結果を実施例９および
第５図に示す。

ＣＯ□はハイパーエコージェニックであるので超音波影
像化用のエンハンサ−として作用する。ＣＯｔがλを標
的器官に形成することは、今まで困難であった。この発
明を利用する方法は、超音波影像化法で診断すべきヒト
の標的組織に１例えば炭酸水素アンモニウムを封入した
リポソームのようなアンモニウムリポソームを投与する
方法である。そのリポソーム内で、炭酸水素アンモニウ
ムは、アンモニウムカチオンと炭酸水素アニオンとに解
離し、前者のカチオンはさらに遊離水素のプロトンと中
性のアンモニアとに解離し、後者のアニオンは水と二酸
化炭素とに解離する。次いで二酸化炭素と中性アンモニ
アは、アンモニウム勾配によってリポソーム膜を透過す
る。このようにして、アンモニウムリポソームは、第５
図に示すに５組織内で二酸化炭素発生体として作用する
。そのプロセスをスキーム２に示す。

Ｎ）１３　　　　　　　　　（ｃＯ２）ｃＡｓこの方法
の主な長所は、リポソームが一定の組織を目標に定める
ことが可能であり、またｃｏ２放出のプロセスが正しい
時期わく内にあれば、リポソームが到達しうる器官と組
織の適切な影像エンハンサ−になるということである。

実際に、リポソームの水性区画を、アンモニウム勾配に
よって酸性にすると、リポソーム内に封入されたＮＨ４
１１ＣＯ２からＣＯｔガスが発生する。ＮＨ４ＨＣＯ，
は、リポソームを酸性にするのに用いられ、またＣＯｔ
源として利用される。この態様は、超音波影像の強化だ
けでなく、ガスや他の化合物を制御して遠隔放出させる
ことを要しかつ通常の技術では近づけない部位を意のま
まに酸性化する必要がある他のシステムにも用いること
ができる。

以下の実施例は１本発明の新規な方法を形成し利用する
方法を示すが１本発明の範囲を限定するものではない。

宜■牲 本発明のシステムの主な有用性は、リポソームを充填前
のごく短時間だけその内表面のみ、低いｐＨに暴露しそ
の結果充填と放出を３７“Ｃで行うことができるという
方法で、２つの系（ｐＨおよびアンモニウム）の勾配の
示すを形成することによって。

両親媒性薬物を容易にかつ効率的に、リポソームに充填
し、またリポソームから放出することである。充填およ
び／または放出の速度は、勾配を変えることによって容
易に操作することができる。

このシステムは生理学的に受容可能でかつ非毒性であり
、また両親媒性薬物を、その場でリポソームに充填する
のに適しており２例えば、血液循環系から過剰投与量の
両親媒性化合物を除去したりまたは診断影像化のために
その場でＣＯ□の集中を起こさせるのに有用である。リ
ポソームの低ｐＨに対する短時間の暴露は、充分に許容
できることであり、その結果、リポソームが低い酸性の
ｐＨに長期間暴露されてリン脂質が分解するに至る場合
に比べて、脂質の分解するに至る場合に比べて、脂質小
胞の安定性が大きく改良される。ｐＨ勾配による効率的
な薬物充填は、適正に作製した脂質組成物と１両親媒性
薬物のリポソームからの所望の放出速度とで達成される
ので上記のことは特に重要である。硫酸アンモニウムの
リポソームは、マウスに投与された時に非毒性であるこ
とが見出され。

毒性の徴候または毒性に起因する死亡を示さなかった。

（以下余白） Ｍニョ１ 脂質類：卵ホスファチジルコリン（ＲＰＣ）はＡｖａｎ
ｔｉＰｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ社（米国、アラバマ州、
バーミンガム）から購入し；９５％ＲＰＣはアサヒ社（
日本）から購入し；コレステロールはＳｉｇｍａ社（米
国、ミズーリ州、セントルイス）から入手し；ドキソル
ビシンはＣａｒｌｏ　Ｅｒｂａ社（イタリー、ミラノ）
から入手した。

ｐＨ指示薬：ピラニン（８−ヒドロキシピレン−１，３
゜６−ドリスルホナート）はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ
ｏｂｅｓ社（米国、オレゴン州、オイゲン）から購入し
；アクリジンオレンジはＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した
。

ナイジェリシンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（米国、カリ
フォルニア州、マウンテン・ビュー）から購入し。

ダウノルビシンはＳｉｇｍａ社から入手し、α−トコフ
エロールスクシナートとＤＬ−α−トコフェロール、セ
ファデックスＧ−５０，セファロース６Ｂ　（Ｐｈａａ
＋ａｃｉａ社製）およびダウエックス５０ＷＸ−４（２
００〜４００メツシュ）　　（Ｄｏｗ　Ｃｈｅ＋＊１ｃ
ａ１社製）はＳｉｇｍａ社から入手した。デスフエロキ
サミンメシル酸（デスフエラル）はＣ１ｂａ　Ｇｅｉｇ
ｙ社（スイス、バーゼル）から入手し、ポリカーボネー
トフィルターはＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ社（米国、カリフ
ォルニア州、プレザントン）から入手した。

この実施例は、１．０より小さい、内側から外側への硫
酸アンモニウム匂配を有するＥＰＣ／コレステロールリ
ポソームの調製と、これらリポソームへの薬剤の充填を
例示する。

Ａ、−１里ｙ：≦すλ狐製 ５Ｉｄのクロロホルムに溶解した１００■のＥＰＣを丸
底フラスコに注入し２次いで２５■のコレステロールを
添加した。減圧下でフラッシュエバポレータを用いてク
ロロホルムを蒸発、乾固させた。フラスコの表面に生成
した薄い脂質フィルムに、０．５ｓＭのデスフェラルを
含有する０、１１Ｍ硫酸アンモニウムの水溶液５　ｍｌ
を添加し、約３０分間激しく振盪して、上記脂質を上記
溶液中に分散させた。得られた多重ラメラ小胞（ＭＬＶ
）を、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過装置で、アルゴンガス
による１５０ｐｓｉの圧力下、ステンレススチール製の
押出しセルを用いて、０．４μｍのＮｕｃｌｅｏｐｏｒ
ｅ社のポリカーボネートフィルターを通して３回、およ
び０．２μｍのポリカーボネートフィルターを通して３
回押出した。この全工程は室温で実施した。１９８５年
１２月６日に出願された米国特許出願第８０６．０８４
号（参考文献として本願に示されている）に記載の方法
に従って、劣化過程に対して脂質類とドキソルビシンを
保護するために、デスフェラルを添加した。

生成されたＭＬＶは、直接使用してＭＬＶと呼称される
か、またはさらに加工され、凍結と解凍（ｆｒｅｅｚｉ
ｎｇ　ａｎｄ　ｔｈａｗｉｎｇ）によってＦＴＭＬＶを
提供するか、もしくは押出しによって押出しオリゴメラ
メ小胞（ＯＬＶ）を提供する。

ＦＴＭＬＶは、　Ｂｉｏｃｈｉｎ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、　８１７巻。

１９３頁、　１９８５年にしたがって、液体空気と２５
°Ｃの温度で凍結・解凍のサイクルを１０回繰り返して
上記のＭＬＶから調製された。

押出しＯＬＶは、　１５０ｐｓｉのアルゴンガスの圧力
を用いて、直径２５胴の０．４μｍポリカーボネートフ
ィルター通して３回１次いで直径２５鵬の０．２μｍポ
リカーボネートフィルターを通して３回押出すことによ
って上記ＭＬＶから調製された。改良されたＭｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ限外濾過装置を上記の押出しに用いた。全押出
し工程は３０分間より短い時間で実施した。パスソニケ
ータ−（ｂａｔｈ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ）（Ｔｒａｎｓ
ｏｎｉｃ４６０１８、３５ＫＨｚ周波数、２８５ワット
、　Ｅｌｍａ　Ｂｅｒｇｗｉｅｓ社、オーストリア）内
で１０秒間、超音波にさらすと、押出されたＯＬＶの品
質と特性に影響を及ぼすことなく押出しが容易になる。

安定な多ラメラ小胞（ＳＰＬＶ）は、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）、　７５巻、　４１９
４−４１９８頁、　１９７８年に記載の逆相蒸発小胞に
関連するものである。５ｐＬＶは、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　２４巻、　２８３３〜２８４２頁、　１９
８５年に記載されているのと同様にして、　０．５ｍＭ
のデスフェラルを含有する１１０ｍＭの硫酸アンモニウ
ム溶液を用いて、脂質が非常な高濃度で存在するエーテ
ル／水の乳濁液からジエチルエーテルを除去することに
よって調製された。すべての小胞の洗浄は上記の硫酸ア
ンモニウム溶液中で行った。

リポソームの大きさの分布を、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　Ａｎａｌ、＋　３３巻、　３３
７−４６２頁、　１９８８年に従って、　Ｍａｌｖｅｒ
ｎ　４７００自動測定システムを用い、準弾性光散乱法
（ＱＥＬＳ）で測定した。

リポソームのタイプの、アンモニウム匂配に依存するド
キソルビシンの充填に対する影響。表５では、３種の多
重ラメラ小胞（Ａｖａｎｔｉ）　　ＥＰＣ／コレステロ
ールリポソームにドキソルビシンをアンモニウムイオン
の匂配によって充填した場合の比較を示す。すべての場
合において、硫酸アンモニウムを充填した後、リポソー
ムをゲル排除クロマトグラフィーに付すことによってア
ンモニウムの匂配を得た。取り込まれたドキソルビシン
を、室温下で２４時間インキュベートした後、ダウエッ
クス樹脂で除去し、ドキソルビシンのリン脂質類に対す
るモル比（ＤＸＲ／ＰＬ）を測定した。表５は、充填効
率が５ＰＬＶ＞ＦＴＭＬＶ　＞ＭＬＶの順であることを
示している。この順位は、これら３種のＭＬＶの封入体
積に関連している。ＭＬＶの方が５ＰＬＶもしくはＦＴ
ＭＬＶよりも漏出しやすいことは重要であり、後者の２
種のＭＬＶＯ方がよくアニールされていることを示唆し
ている。

ドキソルビシンを充填したリポソームの安定性を、硫酸
アンモニウム匂配法でドキソルビシンを充填した卵ＰＣ
／コレステロールリポソームの物理的および化学的安定
性を確認することによって測定した。ＤＸＲの漏出は温
度依存性であり、その活性化エネルギーはかなり高い。

物理的安定性の研究の第１段階は９表５に記載した３種
の方法で製造されたＭＬＶのＤＸＲ／リン脂質のモル比
の変化を追跡することであった。

データから、４°Ｃにおける漏出がリポソームの製造法
に依存していることが明らかである。漏出速度に基づい
た物理的安定性はＦＴＭＬＶ　＞　５ＰＬＶ　＞　ＭＬ
Ｖの順である。漏出が一次の速度式に従うと仮定すると
、流体の脂質（Ｔａ＋＜３７°Ｃ）からなるリポソーム
は、遠隔充填に用いるのに最も適している。

上記のデータは、これらリポソームの安定性にっいての
主な問題が、　ＤＸＲとリン脂質類の化学的安定性では
なくて、　ＤＸＨの漏出であることを示している。後者
の問題は、高温度の相転移点を有するリン脂質を用いれ
ば、軽減し得る。

Ｂ、飢旦配叫生虞 上記のようにして得たリポソームを、　０．５＋Ｈのデ
スフェラルを含有する０、１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で
予め平衡化したセファデックスＧ−５０のカラムにかけ
て、同じ溶液で溶出させた。大きな小胞（ＭＬＶ、　５
ＰＬＶおよびＦＴＭＬＶ　）の損失を減少させるために
、小胞の分散液を、バスソニケーター中で１０秒間、音
波処理を行った。リポソームを含有する排除容積部を集
めて次のステップＣに用いた。

代わりに、小胞を上記のＮａＣ１溶液で希釈して。

リポソームと外部媒体間に所望の硫酸アンモニウム匂配
を得た。例えば、　０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液でリ
ポソームを１　、０００倍に希釈して、内側から外側へ
１からｉ　、　ｏｏｏの硫酸アンモニウム匂配を得た。

他の実験では、塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウム
を用いた。

Ｃ，リポソームのドキソルビシンによるｌＯ■／ｄのド
キソルビシン塩酸の塩水−デスフェラル溶液ＩＩｄを、
ステップＢでリポソームをセファデックスＧ−５０カラ
ムでゲル濾過した後のリポソーム分散液ｌｌｌ１に添加
した。混合物を室温で約２４時間インキュベートした。

このインキュベーシッン時間は、ある種の速度論の研究
ではさらに短かった。インキュページジン期間終了後。

混合物を、ダウエックス５０ＷＸ−４（Ｓｅｒｖａ）の
カラムを通過させ、遊離の取り込まれていない薬剤を吸
着させた。６０■という少量の樹脂で、１５分間より短
い時間で１■もの遊離のドキソルビシンを吸着すること
ができた。リポソームに取込まれたドキソルビシンは、
ダウエックス樹脂には全く吸着されずにリポソームに残
った。乾燥重量が１〜２ｇの樹脂を含有するカラムは、
取込まれていない全薬剤を吸着するのに充分なものであ
った。取込まれた薬剤のリポソーム脂質に対する比を測
定するために。

リン脂質とドキソルビシンの濃度を測定した。ＰＣ濃度
は、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、、　１０４巻、
　１０−１４頁、　１９８０年の方法を、検定の有機相
にドキソルビシンが分配されるのを避けるため、２０μ
ｌのＩＯＭ　ＨＣＩを検定混合物に添加するように改変
して測定した。標準曲線を得るためにＥＰｃを用いた。

ドキソルビシンの濃度は、　０．７５？Ｉ　ＨＣＩ水溶
液を１０％含有するイソプロピルアルコールにリポソー
ムを溶解した後に測定した。溶液の吸光度は、４８０ｎ
ｍの波長と、　１２６００Ｍ−’ＣＭ−’という酸性イ
ソプロピルアルコール中でのドキソルビシンの吸光係数
ヲ用いて、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｒ１５ｅｒλ３Ｂ　ＵＶ／
ＶＩＳデュアルビーム分光光度計で測定した。可溶化さ
れたリポソームのＨＰＬＣを用いて、　Ｊ、　Ｐａｒｅ
ｎｔ、　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、３９巻、２２０〜
２２４頁、　１９８５年に記載された方法にしたがって
ドキソルビシンの完全性を評価した。

この実施例は、１．０より小さい外側から内側への硫酸
アンモニウム匂配を有するジパルミトイルホスファチジ
ルコリン／コレステロールリポソームの調製と、これら
のリポソームへの薬剤の充填を例示する。

Ａ、ユヱヱ二人豊璽製 ５Ｍｉのクロロホルムに溶解した１００■のｏｐｐｃを
丸底フラスコに注入し、２５■のコレステロールを加え
た。フラッシュエバポレーターを用いて減圧下でクロロ
ホルムを蒸発、乾固させた。フラスコの表面に生成した
薄い脂質フィルムに、水に溶解した０、５ｍＭのデスフ
ェラルを含有する０、１１Ｍ硫酸アンモニウムの溶液５
ｒｄを加えて、約３０分間激しく振盪することによって
上記脂質を上記の溶液に分散させた。得られたＭＬＶを
、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過装置で、アルゴンガスにら
る１５０ｐｓ　ｉの圧力を用いて。

０．４μ−のポリカーボネートフィルターを通して３回
、０．２μｍのポリカーボネートフィルターを通して３
回押出した。全工程は、リン脂質の転移温度より充分高
い５０°Ｃで実施した。

Ｂ、姐匁ｙ夏主底 上記のようにして得られたリポソームを、　０．５ｍＭ
のデスフェラルを含有する０、１５Ｍ塩化ナトリウム溶
液で予め平衡化したセファデックスＧ−５０カラムにか
けて、同じ溶液で溶出させた。リポソームを含有する排
除容積部を集めて次のステップＣに用いた。

代わりに、小胞を上記のＮａＣ１溶液で希釈して。

リポソームと外部媒体間に所望の硫酸アンモニウム匂配
を得た。例えば、　０．１５１’ｌ塩化ナトリウム溶液
でリポソームを１．０００倍に希釈することによって、
外側から内側へ１からｉ　、　ｏｏｏの硫酸アンモニウ
ム匂配を得た。

他の実験では、塩化ナトリウムの代わりに０，１５Ｈの
塩化カリウムを用いた。

Ｃ，リポソームのドキソルビシンによる塩水−デスフエ
ラルに溶解したドキソルビシン塩酸の１０■／ｄ溶液１
　ｍｌを、リポソームをセファテックスロー５０カラム
でゲル濾過した後のリポソーム分散液１ｄに添加した。

混合物を室温で約２４時間インキュベートした。インキ
ュベーション時間終了後、混合物を、ダウエックス５０
ＷＸ−４（Ｓｅｒｖａ）カラムを通過させて、遊離の取
り込まれていない薬剤を吸着させた。６０■の少量の樹
脂で、１５分間より短い時間で１■もの遊離のドキソル
ビシンを吸着させることができるが、一方リポソームに
取り込まれたドキソルビシンは、ダウエックス樹脂に全
く吸着せず、リポソームに残っている。乾燥重量が１〜
２ｇの樹脂を含有するカラムは、取り込まれていない全
薬剤を吸着するのに充分なものであった。取り込まれた
薬剤のリポソーム脂質に対する比率を測定するために、
リン脂質とドキソルビシンの濃度を実施例１に記載した
のと同様にして測定した。

この実施例は９１．０より小さい、内側から外側への硫
酸アンモニウム匂配を有する９５％ＥＰＣ／コレステロ
ールリポソームの３周製と、これらのリポソームへの薬
剤の充填を例示する。

Ａ、−史崖ｙ：タリ引既製 ５Ｉｄのクロロホルムに溶解した９５％品の卵ホスファ
チジルコリン（アサヒ社）１００■を丸底フラスコに注
入し１次に２５■のコレステロールを加えた。フラッシ
ュエバポレーターを用いて減圧下でクロロホルムを蒸発
、乾固させた。フラスコの表面の薄い脂質フィルムに、
水に溶解した０、５ｍＭのデスフエラル（ｃｉｂａ−Ｇ
ｅｉｇｙ社から入手）を含有する０、１１Ｍ硫酸アンモ
ニウムの水溶液５ｄを添加し。

約３０分間激しく振盪することによって上記脂質を溶液
中に分散させた。得られた５ＰＬＶを、　Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ濾過装置で、アルゴンガスによる１５０ｐｓｉの
圧力下。

のステンレススチール類の押出しセルを用いて。

０．４μｍのポリカーボネートフィルターを通して３回
１次に０．２μｍのポリカーボネートフィルターを通し
て３回押出した。全工程を室温で実施した。デスフエラ
ルを添加した。

Ｂ、吐旦配■生虞 上記のようにして得られた５ＰＬＶを、　０．５ｍＭの
デスフェラルを含有する０、１５Ｍ塩化ナトリウム溶液
で予め平衡化したセファデックスＧ−５０カラムにかけ
て同じ溶液で溶出させた。リポソームを含有する排除容
積部を集めてステップＣに用いた。

代わりに、小胞を、上記ＮａＣ１溶液で希釈してリポソ
ームと外部媒体間に、所望の硫酸アンモニウム匂配を得
た。リポソームを、　０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液
で１　、０００倍に希釈して、外側から内側へ１から１
．０００の硫酸アンモニウム匂配を得た。

他の実験では、塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウム
を用いた。

Ｃ，リポソームのドキソルビシンによる塩水−デスフエ
ラルに溶解したドキソルビシン塩酸の１０■／戚溶液Ｉ
Ｉｄを、リポソームをセファデックスＧ−５０カラムで
ゲル濾過した後のリポソーム分散液１ｒ１１に添加した
。混合物を約２４時間室温でインキエベートした。この
インキュベーション時間はある種の速度論の実験よりも
短かった。インキュベーション時間経過後、混合物をダ
ウエックス５０ＷＸ−４カラムを通過させて遊離の薬剤
を吸着させた。樹脂は、１■もの遊離のドキソルビシン
を１５分間で吸着することができるが、一方隔離された
リポソームに取り込まれたドキソルビシンはリポソーム
に残っている。乾燥重量が１〜２ｇの樹脂を含有するカ
ラムは、取り込まれていない全薬剤を吸着するのに充分
なものであった。取り込まれた薬剤のリポソームの脂質
に対する比率を測定するために、リン脂質とドキソルビ
シンの濃度を上で記載したのと同様にして測定した。

この実施例は、硫酸アンモニウムを含有するリポソーム
への、螢光化合物であるピラニンの充填と、ピラニンの
螢光を測定することによるこれらリポソーム内部のｐＨ
の測定を例示する。

４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン
スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤を最終濃度１０ｍＭ、
　ｐＨ７，５で含有する水和溶液に０．５μＨのピラニ
ン（８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホナ
ート）を含有させること以外、上記実施例２と同様にし
て、リポソームを調製した。０．５　ｄデスフェラルと
）！ＥＰｎＳ緩衝液を含有する０、１１Ｍ硫酸アンモニ
ウム溶液で予め平衡化したセファデックスＧ−５０カラ
ムでゲル濾過することによって、取込まれていないピラ
ニンを除去した。酸性化するために、リポソームを、　
ＨＥＰＢＳで緩衝された塩化カリウム溶液で予め平衡化
されたセファデックスカラムを通過させるか、または硫
酸アンモニウムと上記溶液との異なる比率の混合物で希
釈して、硫酸アンモニウムの所望の外側／内側の比率を
得た。小胞の内部のｐｉ＋は、ピラニンの相対螢光発光
度を測定することによって測定した。２０ｍＭの４−モ
ルホリノエタンスルホン酸ＣＭＢＳ）のｐＨ５と６の緩
衝液と１０ｍＭのＨＢＰＥＳ緩衝液との滴定で異なるｐ
Ｈに調節したリポソームの塩化ナトリウム溶液を調製す
ることによって校正曲線を作成した。上記と同様にセフ
ァデックスカラムＧ−５０を通過させて、外部ｐＨを７
．５に固定し内部のｐＨが異なる一連のリポソーム製剤
を調製した。すべての場合、　ｐＨ勾配と、内外のｐＨ
の平衡化の破壊は、最終濃度５μ門までナイジェリシン
を添加して行った。ピラニンの螢光は、４６０１５２０
ｎｍの励起／発光波長を用い、　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ＋
＋＋ｅｒＬＳ−５螢光分光計で測定した。校正曲線を第
１図に示す。

この実施例は、リポソームへのアクリジンオレンジの充
填を例示する。アクリジンオレンジはｐＫ９．２５の両
親媒性の弱塩基であり、その主な利点は螢光性をもって
いることである。

１μｍｏｌのアクリジンオレンジを、塩化カリウムと硫
酸アンモニウムとを異なる比率で含有する溶液に添加し
た。上記溶液は、リポソームを添加した時に、硫酸アン
モニウムの種々の内外間の勾配が得られるように設計さ
れた。リポソームを２００倍に希釈するように計算し、
実施例２Ａと同様にして調製した少量のリポソーム懸濁
液を、キュベツト内のアクリジンオレンジと混合し、　
Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩＩＩＩｅｒ　ＬＳ−５螢光分光計を
用いて、螢光の消光を連続してモニターした。この時、
　４９０ｎｍの励起光と。

小胞に取り込まれたアクリジンオレンジの量の指標とし
て５２５ｎｍの発光を用いた。平衡化した後。

ナイジェリシンを添加し最終濃度５μｍとした。

螢光の回復をモニターした。ナイジェリシン添加の前後
の螢光の比率を用いて１次式によってアクリジンオレン
ジの螢光の消光を計算した。

Ｆに こでＦｏは、消光のプラトーに到達した後に得られた螢
光であり、ＦＮはナイジェリシン添加後に回復した螢光
強度である。消光はｐＨ勾配の定性的指標として役立つ
、結果を第２図に要約して示す。

ドキソルビシン含有のリポソームを、実施例ＩＡもしく
は２人のそれぞれと正確に同じにして調製した。得られ
たリポソームを塩水で１　、０００倍に希釈し、混合物
の螢光を、２２°Ｃと４９°Ｃの制御された温度条件下
で、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｂｌｍｅｒ　ＭＰＦ−４４螢光分
光計で連続的にモニターした。すべての場合に、連続し
て直線的に螢光が増大するのが認められた。

各実験後、リポソームを、　０．７５Ｍ　ＨＣＩ水溶液
を１０％含有するイソプロピルアルコールで１０倍に希
釈した。上記溶液ではリポソームが完全に溶解し。

消光が起こらない程度にドキソルビシンが希釈されてい
るので、この溶液の螢光は、リポソーム内の薬剤の合計
量の尺度であった。漏出量は、リポソーム内に残ってい
る薬剤の量の百分率で表されるが、漏出後に得た螢光の
増加量と、ドキソルビシンの合計量との比率から算出し
た。結果を表４に示す。

２：１モル比の新しい９５％ＥＰＣ／コレステロールを
用いて実施例３Ａに記載したのと同様にしてリポソーム
を調製した。実施例ＩＡ、２Ａおよび３Ａに記載したの
と同様にしてゲル排除クロマトグラフィーによって外部
の硫酸アンモニウムを除去してｐＨ勾配を形成させた。

得られたリポソームの半量を９本発明の方法を用いてド
キソルビシンを充填するのに使用した。残りの半量は、
　３５０　ｔａｇＰＣ／ｋｇのレベルで６匹のＢＡＬＢ
−Ｃマウスの尾の静脈に注射した。これらのマウスを６
力月追跡した。

マウスは１匹も死なず、すべて正常に挙動した。

このレベルでは硫酸アンモニウムリポソームは非毒性で
あった。

硫酸アンモニウムリポソームを、上記実施例２Ａと正確
に同じにして調製した。取り込まれていない硫酸アンモ
ニウムをセファデックスＧ−５０で分離した後、１１１
のリポソーム分散液を、５０°Ｃの１−に溶解した１０
■のダウノルビシンと混合し、特定の時間間隔をおいて
、一部分を採取した。遊離のダウノルビシンを、実施例
ＩＡ、２Ａおよび３Ａでドキソルビシンについて記載し
たのと同じダウエックス法で除去し、ダウノルビシンの
濃度を。

ドキソルビシンについて示したのと同様にして測定した
。この充填は１時間で完了することが判明し、ダウノル
ビシンのリン脂質に対する最終モル比は１：６であった
。

０ｃｕｓｃｏｎ　１２８　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ　
Ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（米国、カリフォ
ルニア州、オクスコン）をこの試験全体で使用した。モ
ニタ一方法を改良するために、化粧用品質の水溶性で、
かつ塩を含まないＬａｒｇｏ　５ｃａｎ−１１超微粒子
スキャニングゲル（Ｂｉｏｓｅｔｒｉｘ社、イスラエル
、イエルサレム）で超音波プローブをコートした。

ＣＯ８ガスが炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）
を含有する媒体を酸性にすることによって生成したこと
の証明は、超音波プローブで行った。このため、炭酸ア
ンモニウム（０，１２Ｍ）をビーカーに入れた。超音波
プローブをビーカーに接触させた。

何のシグナルも認められなかった。ＨＣＩを加えてｐ）
ｌを４．０に低下させた時、大きなシグナルがスコープ
に現われ、　ＮＨ４ＣＯ５の酸性化によって生成したＣ
Ｏ２が実際にハイパーエコジェニックであることを証明
した。

リポソーム内のアンモニウム勾配が、超音波プローブで
モニターできるＣ０８ガスを発生させるのに利用できる
ことを証明するために、８０■のＲＰＣと２０■のコレ
ステロールを用いて、実施例１に記載したのと同様にし
て５ＰＬＶを調製した。脂質をジエチルエーテルに溶解
させた。０．１２モルのＮＨ４ＨＣＯ３０，５ｄを添加
した。他のステップはすべて、上述のものと同じであっ
た。連続熱線照射下でエーテルを蒸発させた後、得られ
たペーストをｌｄの０゜１２Ｍ　ｔｕｔ４ｕｃｏ、ニ分
散させた。ＮＨ，）ＩｃＯ，をＮａＣ１（０゜１５Ｍ）
におき変えたためにアンモニウム勾配が形成されないこ
と以外同じ条件を用いて対照の５ＰＬＶを調製した。ｌ
ｉｄのリポソーム分散液を透析バッグに入れた。０ｃｕ
ｓｃｏｎプローブを透析バッグに付け１両者をＮＨ４Ｃ
Ｏ５（０，１２Ｍ）もしくはＮａＣ１（０゜１５Ｍ）の
入ったビーカーに入れた。表６に記載した４つの異なる
組合せについて試験した。

ビーカー内のＮａＣ１に対して透析された時に、　ＮＨ
４ＣＯ５ たという知見は、そのシグナルがＮＨ４＋の勾配による
ものであることを示している。このシグナルは、数時間
もの長時間にわたって続いた。これは。

発生したＣＯｔが、徐々に形成されたか、または徐々に
放出された結果であろう。

超音波影像化を強化する可能性がマウスで証明された。

ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（２７ｇ）をベンドパルビタール
で麻酔した。次いでＮＨ，ＨＣＯ３含有の５ＰＬＶＯ，
５ｍｌを尾の静脈に注射した。マウスの内臓を。

超音波プローブと２表示されたソノグラムによってモニ
ターした。ソノグラムに認められた黒点が。

アンモニウム勾配リポソームのハイパーエコジエニシテ
ィを示した。

（以下余白） 紅 ｌ土 濃度（Ｍ） ＯＤｔ７＋１０Ｄｓｓ。

表主 キソルビシンの　　の 濃度（Ｍ） 消光（χ） …活性化エネルギーはにｃａｌ　ｍｏｌｅ−’テ表わす
。

表」− ｌ旦 （以下余白） （発明の要約） 本発明は、トランスメンプラン勾配を利用して。

両親媒性薬剤や化学薬品をリポソームに効率よく充填す
るための、改良されたトランスメンプラン充填法に関す
る。この方法は、簡単かつ効果的であり、安全かつ経済
的であり、そして迅速に行い得る。薬剤または化学薬品
を充填して得られたリポソームは、安定かつ安全である
。保存し得る形態の充填可能なリポソームは長期間にわ
たって安定である。この方法はリポソームに封入された
薬剤の緩徐放出にも同様に適用し得る。

４、　゛　　の　　　な皆　日 第１図は硫酸アンモニウムを含有するリポソーム中への
薬剤の封入を示すグラフ図である。第２図はリポソーム
の内部水性相と外部水性相との間における硫酸アンモニ
ウム分布のｐＨ勾配に対する効果を示すグラフ図である
。第３図は硫酸アンモニウムリポソームへの薬剤充填の
速度論を示すグラフ図である。第４図は硫酸アンモニウ
ムリポソームからの薬剤の放出を示すグラフ図である。

第５図はリポソームのアンモニウム勾配を利用すること
によるＣＯ□ガスの発生を示すグラフ図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、両親媒性薬剤をリポソームに有効に充填するシステ
   ムであって、 アンモニウム化合物またはアンモニウム塩の存在下でリ
   ポソーム懸濁液を調製し、該懸濁液を緩衝剤または塩で
   希釈して、内部水性相と外部水性相との間に、内側から
   外側へ向かうアンモニウム勾配と、リポソームの内側の
   ｐＨが外側のｐＨより酸性側であるようなｐＨ勾配とを
   与えることを包含する、システム。 ２、前記アンモニウム化合物が、硫酸アンモニウム、水
   酸化アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、または炭酸
   アンモニウムである、請求項１のシステム。 ３、前記両親媒性薬剤が、ドキソルビシン、ダウノルビ
   シン、クロロキノン、プロプラノロール、ペンタミジン
   、エピルビシン、カルシノマイシン、Ｎ−アセチルアド
   リアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン
   、Ｎ−アセチルダウノマイシン、すべてのアントラシリ
   ン薬剤、ダウノリリン、プロプラノロール、ペンタミジ
   ン、ジブカイン、テトラカイン、プロカイン、クロルプ
   ロマジン、ビンプラスチン、ビンクリスチン、マイトマ
   イシンＣ、ピロカルピン、フィゾスチグミン、ネオスチ
   グミン、クロロキン、アモジアキン、クロログアニド、
   プリマキン、メフロキン、キニーネ、プリジノール、プ
   ロジピン、ベンズトロピン・メシレート、塩酸トリヘキ
   シフェニジル、プロプラノロール、チモロール、ピンド
   ロール、キナクリン、ベンダドリル、プロメタジン、ド
   パミン、セロトニン、エピネフリン、コデイン、ナペリ
   ジン、メタトン、モルフィン、アトロピン、デシクロミ
   ン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミ
   トリプチリン、ドキセピン、デシプラミン、キニジン、
   プロプラノロール、リドカイン、クロルプロマジン、プ
   ロメタジン、ペルフェナジン、アグリシン・オレンジ、
   プロスタグランジン、フルオレセイン、およびカルボキ
   シフルオレセインである、請求項２のシステム。 ４、両親媒性分子が、その濃度によってリポソームから
   流出するアンモニウムと入れ換わってリポソーム内に充
   填され、薬剤の充填度が、外側と内側との硫酸アンモニ
   ウムの比率と、内部水性相のｐＨとに依存する、請求項
   ３のシステム。 ５、両親媒性分子をリポソーム内に有効に充填する方法
   であって、 （ａ）硫酸アンモニウムの存在下でリポソームの懸濁液
   を調製すること； （ｂ）該工程（ａ）で得られた懸濁液の外部水性相を適
   切な塩もしくは緩衝剤で希釈するか、またはアンモニア
   を除去することによって、内側から外側へ向かうアンモ
   ニウム勾配と、外側から内側へ向かうｐＨ勾配とを形成
   させること；および （ｃ）脱プロトン化した両親媒性薬剤をリポソームの外
   側から内側へ充填すること、 を包含する方法。 ６、前記両親媒性薬剤が、アンモニウム勾配によって、
   アンモニウムが流出するのに入れ換わって流入して、リ
   ポソームに充填される、請求項５の方法。 ７、リポソームの外側水性相を希釈するか、またはこの
   水性相からアンモニウムを除去して、リポソームの内側
   水性相から外側水性相へ向かうアンモニウム勾配を形成
   させることによって、両親媒性薬剤をリポソームに充填
   するのに適切な、リポソームとアンモニウム塩との懸濁
   液であって、内側から外側へ向かう該アンモニウム勾配
   によって、外側から内側へ向かうｐＨ勾配が形成され、
   両親媒性薬剤がリポソーム内に充填される、 リポソームとアンモニウム塩との懸濁液。 ８、塩または緩衝剤でリポソーム懸濁液のアンモニウム
   を希釈するか、または除去することによって形成された
   、内側から外側へ向かうアンモニウム勾配を有する、両
   親媒性薬剤充填用のアンモニウムリポソーム。 ９、リポソームの内部水性相から外部水性相へ向かう逆
   のｐＨ勾配を形成することによって、両親媒性薬剤をリ
   ポソームから放出するのに適切な、リポソームとアンモ
   ニウム塩との懸濁液。 １０、二酸化炭素を発生し、該二酸化炭素を組織に放出
   して、超音波画像形成法における超音波エコー源性を高
   めるのに適切なアンモニウムリポソーム。