KR101171045B1 - 장기간 순환성 비-페길레이테드 리포좀을 함유하는 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

장기간 순환성 비-페길레이테드 리포좀을 함유하는 조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101171045B1
KR101171045B1 KR1020117014172A KR20117014172A KR101171045B1 KR 101171045 B1 KR101171045 B1 KR 101171045B1 KR 1020117014172 A KR1020117014172 A KR 1020117014172A KR 20117014172 A KR20117014172 A KR 20117014172A KR 101171045 B1 KR101171045 B1 KR 101171045B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
liposome
doxorubicin
composition
liposomes
sucrose
Prior art date
Application number
KR1020117014172A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110075051A (ko
Inventor
궈탐 비노드 다프타리
스리칸트 안나파 파아이
산기타 하누르메쉬 리반카르
Original Assignee
자이더스 비에스브이 파마 프라이빗 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 자이더스 비에스브이 파마 프라이빗 리미티드 filed Critical 자이더스 비에스브이 파마 프라이빗 리미티드
Publication of KR20110075051A publication Critical patent/KR20110075051A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101171045B1 publication Critical patent/KR101171045B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 비경구 투여용의 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 상기 조성물의 순환 시간은 스위스 알비노 생쥐에서의 일반적인 비-리포좀성 조성물에 비해 최소한 25배 이상 길다. 비-페길레이테드 리포좀은 안정하고, 낮은 독성을 나타내며 다른 종양 모델에서 효능이 있는 것으로 확인되었다.

Description

장기간 순환성 비-페길레이테드 리포좀을 함유하는 조성물 및 그의 제조방법{Composition Comprising A Long-Circulating Non-Pegylated Liposomes and Its Manufacture}
본 발명은 비경구 투여용 비-페길레이테드 (non-pegylated) 장기간 순환성 리포좀 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 리포좀 함유 조성물은 진단제 또는 치료제를 포함하고 이를 전달하는데 사용될 수 있다.
일반적으로 리포좀들은 인지질 및/또는 스테롤을 포함하며 액상 구성물을 둘러싸는 지질 이중층에 기초한 소포체 (vesicular) 구조로 구성된다. 상기 리포좀들은 크기, 표면 전하 및 인지질 조성물과 같은 그들의 물리화학적 특성에 따라 광범위하게 다양하다.
진단제 또는 치료제에 대한 허용가능한 담체로서 리포좀에 대한 관심이 증가하고 있다. 예를 들어, Gd:디에틸렌트리아민펜타세드산 킬레이트 (Gd-DTPA) (참조예 미합중국 특허 제6,132,763호)과 같은 자기 이미지를 수행하기 위한 조영제와 같은 전달 진단제 및 안쓰라사이클린제 (anthracyclin agent)와 같은 치료제로서 사용되었으며, 광범위한 종양에 대해 명백한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다 (참조예, 미합중국 특허 제4,769,250호).
그러나, 리포좀은 다양한 혈장 단백질과의 상호작용으로 인해 혈액내에서 응집을 유발할 수 있으며 세망내피 시스템 (RES)에 의해 포획될 수 있다. 예를 들어, 간에 있는 성상 세포 (kupfer cell) 또는 비장에 있는 고정 대식세포는 그들이 의도하는 타겟에 도달하기 전에 리포좀을 포착한다. RES에 의한 포획 (capture)은 리포좀이 타겟 조직 또는 세포로 선택적으로 전달되는 것을 어렵게 한다.
RES에 의한 포획과 더불어, 리포좀은 혈장 단백질과 정전기 작용, 소수성 작용 및 반데르 발스 작용을 하기 쉽다. 이러한 작용은 리포좀의 불안정화를 유발함으로써 순환되는 동안 종종 이의 타겟에 도착하기 전에 소포로부터의 급속한 제거를 유도한다.
또한, 리포좀과의 세포적 및 단백질 상호작용에 추가하여, 약물이 리포좀의 인지질과 상호작용하기 때문에 특정 약물을 캡슐화하는 리포좀을 생산하는데 어려움이 있다. 예를 들어, 안쓰라사이클린은 인지질 소포체 이중층에서 표면활성제 또는 계면활성제-유사 작용을 함으로써 누출 (leakage)을 유발하고 리포좀 소포체의 불안정성을 유발한다. 따라서, 리포좀은 순환 환경에서 불안정하며/또는 이의 함유물이 종양 부위에 도달하기 전에 항종양제 (antineoplastic agent)를 조기에 누출시킨다. "누출되는" 리포좀의 결과로서 이에 의해 독성이 파괴되며, 과학자들은 종양 부위에서 분출할 수 있으며 혈관에서 매우 많이 분출할 수 있는 장기간-순환하는 리포좀을 개발하기 위해 노력하고 있다.
가장 광범위하게 사용되는 항-암 약물은 종양 세포에 특이적으로 독성을 나타내지 않으며 그들이 접촉하는 모든 조직에 독성을 나타내기 때문에, 상기 약물은 정상 조직과 상호작용의 결과로서 바람직하지 않은 부작용을 유발한다. 예를 들어, 독소루비신 하이드로클로라이드는 암 화학요법에서 가장 광범위하게 사용되는 세포독성 안쓰라사이클린 항체 중의 하나이며, 다양한 종양에 대해 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 독소루비신 하이드로클로라이드는 수많은 고형암과 백혈병의 치료에 효과적이다. 이는 특히 복합치료와 관계있는 유방암의 치료에 효과적이다. 독소루비신 하이드로클로라이드는 AIDS와 연관된 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma)에 대한 프로토콜 치료제이다. 또한, 독소루비신 하이드로클로라이드는 난소암, 폐암, 정소암, 전립샘암, 자궁암, 두경부암, 에스트로겐성 육종 및 에윙 육종 (Ewing's sarcoma)에 대해 탁월한 활성을 보인다.
일반적인 독소루비신 하이드로클로라이드 조성물은 동결-건조된 산물 또는 독소루비신 하이드로클로라이드가 물에 녹아있는 용액의 형태로써 사용 가능하다. 동결건조된 산물은 투여하기 전에 주사용 물로 녹이기 위해 필요하다. 이러한 제조품 모두는 정맥내 투여할 때에 수많은 독성을 나타낸다. 일반적으로 심각한 골수억제는 투여량을 제한하는 인자가 된다. 구역질 및 구토, 탈모, 점막염 (구내염 및 식도염을 포함) 및 심장독성을 포함하는 다른 독성은 독소루비신 하이드로클로라이드의 용도를 제한할 수 있다. 독소루비신 하이드로클로라이드는 효능이 있는 수포제 (vesicant)로서 주사 부위 또는 노출된 피부의 어느 부위에서든 혈관밖유출 (extravasation) 및 괴사를 유발할 수 있다. "독소루비신 발적 (Doxorubicin flare)"은 눈에 띄는 것이 아니며 주사 부위에서 홍반의 흔적에 의해 특징된다. 일반적으로 "독소루비신 발적"은 약 반시간 정도에 가라앉는다.
독소루비신 하이드로클로라이드의 작용 메카니즘에 대해서는 정확히 알려져 있지 않으나 많은 가능성이 연구되고 개시되어 있다. 일차 메카니즘은 DNA 속으로 삽입되는 독소루비신 하이드로클로라이드의 작용과 관계있다. DNA의 보전은 상당히 절충되어 있으며 이에 의해 DNA 기능 변화가 유발된다. 또한, 일반적으로 단일 및 이중 가닥의 파괴는 DNA로의 독소루비신 하이드로클로라이드 삽입에 의해 유발된다. 독소루비신 하이드로클로라이드의 다른 메카니즘은 DNA 및 세포막 파괴를 유발하는 자유 라디칼을 형성하게 하는 능력과 관계한다. 또한, 독소루비신 하이드로클로라이드는 토포아이소머레이즈 Ⅱ를 억제시킴으로써, DNA의 재생산이 무력화되게 한다.
독소루비신 하이드로클로라이드에 의해 유발되는 독성 작용 중의 일부는 심장 독성, 초과민 반응, 구토 유발, 골수 억제, 점막염, 피부 독성, 탈모 및 주사 부위에서의 독성을 포함한다 (Cancer Investigation, 19(4): 424-436 (2001)). 학설에 따르면, 지연된 순환 시스템 (느린 분비)이 종양 및 종양 세포의 근처에 약물을 효과적으로 전달하고 분비시키므로 훨씬 더 이점이 있다. 따라서, 독소루비신 하이드로클로라이드와 같은 제제를 캡슐화할 수 있는 안정한 리포좀이 필요하며, 이는 건강한 조직 또는 비-종양 조직에 그의 내용물을 조기에 분비시키기 않게 한다.
리포좀의 순환 시간을 늘이고 리포좀의 내용물이 타겟 조직에 전달될 수 있도록 하려는 몇가지 노력이 다음과 같이 시도되고 있다: 시알린산 잔기 코팅을 이용한 세망내피 시스템 인식으로부터 리포좀을 은폐시키는 (masking) 방법 (미합중국 특허 제4,501,728호); 스핑고마이엘린 또는 5 내지 20%의 당지질을 포함하는 압도적으로 포화된 아실 사슬 (chain)을 갖는 중성 인지질을 이용하여 리포좀 막을 단단하게 만드는 방법 (미합중국 특허 제4,920,016호); 제제, 이중층 및 시트르산을 포함하는 분비 억제 완충제의 3-구분 시스템 내에 일반적인 리포좀 제형에 비해 지질에 대한 약물의 비율이 3-80배 더 높은 리포좀을 제조하는 방법 (미합중국 특허 제6,083,530호); 리포좀 내에 콜레스테롤을 삽입시키는 방법 (Alberto A. Gabizon, Cancer Investigation, 19(4) 424-436 (2001)); 및 폴리에틸렌 글리콜 (페길레이테드 리포좀)을 이용하여 인지질을 유도하는 방법 (미합중국 특허 제5013556호 및 제6132763호).
불행하게도, 상기와 같은 시도는 인 비보에서 리포좀의 순환시간을 연장하고자 하는 제한된 잠재성 만을 나타내었다. 예를 들어, 시알린산으로 리포좀을 은폐시키는 방법은 오직 인 비보 리포좀의 순환 반감기를 연장시키고자 하는 제한된 능력을 가지고 있음이 확인되었다 (미합중국 특허 제4,920,016호). 이러한 문제점을 극복하기 위해, 과학자들은 리포좀의 표면을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 친수성 폴리머로 코팅함으로써 다양한 혈장 단백질이 리포좀 표면에 흡착하는 것을 억제시키고자 하였다 (참조예, 미합중국 특허 제5,013,556호 및 미합중국 특허 제5,676,971호). 상기 페길레이테드 리포좀은 입체적으로 안정한 리포좀 또는 스텔스 (stealth) 리포좀으로 명명되었다. 이러한 페길레이테드 리포좀은 그의 내용물의 분비에 의해 유도되는 독성 작용의 일부를 감소시키는 것처럼 보였으나, 불행하게도 폴리에틸렌 글리콜의 존재에 의해 신규한 독성 작용이 나타났다. 예를 들어, 페길레이테드 인지질을 포함하는 리포좀성 제형은 일반적으로 손바닥 및 발 전체에 피부 발진/궤양을 유발하는"수-족 증후군 (Hand-Foot syndrome)"으로 알려져 있는 피부 독성을 유발한다 (Kenneth B. Gordon , Cancer , Vol . 75(8), 1995, 2169-2173).
페길레이테드 리포좀의 다른 단점은 리포좀 표면에 거대 분자 (PEG)가 존재하는 것이며, 이는 세포와의 리포좀의 작용을 감소시킬 수 있으며 종양 조직으로의 리포좀의 투입을 방해하고, 이에 의해 종양 조직에 있는 리포좀성 약물의 축적을 감소시킬 가능성이 있다 (Clinical Cancer Research, (5), 1999, 3645-3652).
따라서, "수-족 증후군"과 같은 유해한 작용을 유발하지 않는 안정하고, 장기간 순환하는 리포좀, 이러한 리포좀의 제조방법 및 이에 기초한 조성물이 여전히 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킬 뿐만 아니라, 본 발명의 리포좀을 투여함으로써 다양한 상태를 치료할 수 있는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 주 목적은 장시간 동안 순환할 수 있고 수-족 증후군을 유발하지 않는 리포좀성 독소루비신 조성물을 개발하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 독성 및 독소루비신의 투여에 의해 유발되는 구역질, 구토 및 탈모와 같은 다른 부작용을 감소시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 독소루비신과 같은 항종양제 조성물을 지지할 수 있는 리포좀을 개발하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 하기 단계를 포함하는 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀의 제조방법을 제공한다:
하나 이상의 인지질, 하나의 스테롤 및 하나의 용매를 포함하는 액체 용액으로부터 용매를 증발시킴으로써 지질 필름을 제조하는 단계; 및 상기 지질 필름을 액상 수화 미디어로 수화시킴으로써 비-페길레이테드 리포좀을 제조하는 단계;
상기에서 사용된 액상 수화 미디어의 양은 지질 용액에 존재하는 각 인지질의 m㏖ 당 10 내지 35 ㎖인 것을 특징으로 함.
상기 사용된 액상 수화 미디어의 바람직한 양은 지질 용액에 존재하는 각 인지질의 m㏖ 당 30 ㎖이다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 장기간 순환하는 비-페길레이테드 크기 분리된 리포좀의 제조방법을 제공한다:
하나 이상의 인지질 및 하나의 스테롤을 하나의 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키는 단계; 액상 수화 미디어를 첨가하여 인지질을 수화시키는 단계를 수행하기 전 또는 후에, 상기 용매를 제거함으로써 비-페길레이테드 리포좀을 제조하는 단계, 상기 사용된 액상 수화 미디어의 양은 지질 용액 내에 존재하는 각 인지질 m㏖ 당 10 ㎖ 내지 35 ㎖인 것을 특징으로 함; 상기 비-페길레이테드 리포좀의 크기가 약 0.06 ㎛ 내지 0.16 ㎛가 되도록 크기 분리 (sizing)하는 단계; 및 수크로즈-히스티딘 완충용액을 이용하여 상기 리포좀성 조성물로부터 잔류하는 리포좀성 수화 염을 제거함으로써 비-페길레이테드 크기 분리된 리포좀을 제조하는 단계.
상기 비-페길레이테드 리포좀의 제조방법은 치료제 또는 진단제를 이용하여 리포좀을 로딩하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 치료제는 독소루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 에피루비신 하이드로클로라이드와 같은 항종양제이다. 독소루비신 하이드로클로라이드가 더욱 바람직하다.
스테롤에 대한 인지질의 몰비는 바람직하게는 약 1:0.1 내지 1:2이며 더욱 바람직하게는 약 1:0.7이다.
바람직한 액상 수화 미디어는 암모늄 설페이트 및 수크로즈를 포함하며, 상기 액상 수화 미디어 내에 있는 암모늄 설페이트의 농도는 125 m㏖/ℓ 이상이다.
바람직한 인지질은 약 40℃ 내지 60℃의 상전이 (phase transition) 온도를 가지며, 최소한 16개 탄소 사슬의 지방산을 가지며, 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC, distearoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC, dipalmitoyl phosphatidylcholine), 수화 소야 포스파티딜콜린 (HSPC, hydrogenated soya phosphatidylcholine) 및 이러한 인지질의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 인지질은 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)이고, 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
또한, 본 발명의 방법은 비-페길레이테드 리포좀의 크기 분리와 관련이 있다. 비-페길레이테드 리포좀은 0.4 ㎛ 내지 0.05 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터를 통해 연속적으로 사출성형 (extrude)함으로써 크기 분리된다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 본원에 개시된 방법에 의해 수득할 수 있는 리포좀을 제공한다.
상기 리포좀은 상기 제조방법에 개시된 부분에 있는 성분을 포함하며, 이에 의해 수득된 리포좀의 평균 크기는 0.06 ㎛ 내지 0.16 ㎛이다.
또한, 본 발명은 장기간 순환하는 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀, 히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈를 포함하는 비경구 투여용 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물을 제공한다;
상기 독소루비신 비-페길레이테드 리포좀은 독소루비신 하이드로클로라이드에 추가로 디스테아로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 수크로즈를 포함하며; 상기 리포좀은 0.06 ㎛ 내지 0.160 ㎛의 평균 크기를 갖고; 상기 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀은 혈액내에서의 순환 시간이 스위스 알비노 생쥐에서 동량으로 테스트했을 때 아드리아마이신 (ADRIAMYCIN) 보다 최소한 25배 이상 긴것을 특징으로 한다.
상기 리포좀에 캡슐화된 독소루비신 하이드로클로라이드의 농도는 1 mM 내지 10 mM이며, 바람직하게는 3 mM 내지 7 mM이며, 더욱 바람직하게는 6.9 mM이고, 가장 바람직하게는 3.45 mM이다.
상기 콜레스테롤에 대한 디스테아로일포스파티딜 콜린의 몰비는 1:0.6 내지 1:0.8이며; 바람직하게는 1:0.7이다.
상기 디스테아로일포스파티딜 콜린에 대한 독소루비신 하이드로클로라이드의 몰비는 바람직하게는 1:2 내지 1:15이며; 더욱 바람직하게는 1:3.5이다.
상기 수크로즈 농도는 바람직하게는 0.1 M 내지 0.5 M이고, 더욱 바람직하게는 0.25 M 내지 0.3 M이다.
상기 히스티딘 하이드로클로라이드 농도는 1 내지 100 mM이고, 바람직하게는 8 내지 12 mM이며, 더욱 바람직하게는 약 10 mM이다.
상기 리포좀의 바람직한 평균 크기는 0.08 ㎛ 내지 0.12 ㎛이다.
일례의 조성물은 2 ㎎/㎖ 농도로 존재하는 독소루비신 하이드로클로라이드이고; 상기 인지질에 대한 독소루비신의 몰비는 약 1:3.5이며; 상기 콜레스테롤에 대한 인지질의 몰비는 약 1:0.7이다.
다른 예의 조성물은 4 ㎎/㎖ 농도로 존재하는 독소루비신 하이드로클로라이드이고, 상기 인지질에 대한 독소루비신의 몰비는 약 1:3.5이며, 그리고 상기 콜레스테롤에 대한 인지질의 비는 약 1:0.7이다. 상기 조성물의 혈액내에서의 순환 시간 (t1/2)은 바람직하게는 스위스 알비노 생쥐에서 동량으로 테스트했을 때 아드리아마이신보다 40배 이상 길다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 종양 성장의 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 장기간-순환하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 신규한 것이며, 지금까지는 공지되어 있지 않다.
본 발명은 안정하고, 장기간 순환하는, 비-페길레이테드 리포좀 및 이의 제조방법을 제공한다. 페길레이테드 리포좀은 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 코팅된 리포좀이다. 리포좀의 표면은 수천 가닥의 PEG로 데코레이트되어 있으며, 이러한 방법을 "페길레이션 (pegylation)"이라고 부른다. 상기 PEG 가닥은 리포좀의 표면을 "털 (hairy)"과 같이 만들며, 이것은 리포좀이 혈액 단백질 표면으로 빠르게 흡착하는 것을 방해한다. 이러한 빠른 흡착은 혈액으로부터 리포좀이 급속히 제거되도록 촉진시킨다. 반대로, 상기 페길레이테드 리포좀은 훨씬 느린 속도로 혈액으로부터 방어되고 제거된다. PEG를 사용하지 않고 제조한 리포좀과 비교하여, 페길레이테드 리포좀은 훨씬 더 안정하며 세망내피 시스템 (RES)의 세포에 의해 훨씬 약하게 포획되며, 순환되는 동안 어떠한 캡슐화제 또는 약물의 누출을 감소시키는 경향이 있다. 예를 들어, 독소루비신을 캡슐화한 PEG-리포좀의 약동학은 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 또는 프리 독소루비신과 비교하여 긴 순환 반감기, 느린 혈장 제거 및 감소된 분포 부피로 특징된다. 페길레이테드 리포좀의 장기간 순환 및 종양 혈관계를 통한 혈관밖 유출에 대한 능력은 증가된 종양 반응 가능성의 증가와 함께 종양 조직에 독소루비신의 위치화를 유발하는데, 이는 특히 신생 종양에서 약물 축적을 증가시키기 때문이다. 또한, 일반적인 리포좀과 비교하여 페길레이테드 리포좀의 증가된 안정성은 민감한 기관의 조직에서 약물의 유용성을 감소시키며, 이에 의해 독성이 감소하고 구역질, 구토 및 탈모와 같은 다른 부작용이 유발된다. 그러나, 손바닥 및 발 전체에서 피부 발진 또는 궤양이 관찰되는 "수-족 증후군"으로 알려진 심각한 부작용은 페길레이테드 리포좀을 임상적으로 사용함으로서 유발된다고 보고되었다 (Kenneth B. Gordon, Cancer, Vol. 75(8), 1995, 2169-2173). 페길레이테드 리포좀의 다른 단점은 세포와의 리포좀의 상호작용을 감소시키고 종양 세포로의 리포좀의 진입을 방해할 수 있는 리포좀성 표면에 있는 거대 분자 (PEG)의 존재이며, 이에 의해 종양 조직에 있는 리포좀성 약물의 축적을 감소시킬 가능성이 있다.
본 발명의 제조방법은 긴 순환 반감기를 가지면서 페길레이테드 리포좀의 안정성을 나타내고, 상기에 개시한 바와 같은 감소된 독성을 가지는 안정하고, 장기간 순환하며 낮은 독성을 갖는 비-페길레이테드 리포좀을 제공한다. 그러나, 본 발명의 리포좀은 상기의 결과를 나타내기 위해 PEG의 사용을 필요로하지 않으며, "수-족 증후군"을 유발하지 않는다.
본 발명의 제조방법에서, 지질의 수화 단계는 용매의 증발 단계 전에 수행하거나 용해 지질에 사용되는 용매의 증발 단계 이후에 수행할 수 있다. 본 발명에 적합한 용매는 인지질이 용해될 수 있는 유기 용매이다. 당업자라면 일반적으로 사용되고, 리포좀의 제조에 적절한 용매를 용이하게 파악할 수 있다. 예를 들어 적합한 용매는 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에탄올, 메탄올 및 아세톤을 포함하며 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
용매의 증발 단계 수행 후에 지질의 수화 단계가 수행될 때에는, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드와 같은 용매가 바람직하다.
용매의 증발 단계 수행 전에 지질의 수화 단계가 수행될 때에는, 에탄올, 메탄올 및 아세톤과 같은 물 혼화성 용매가 바람직하다.
용매의 증발 단계 수행 후에 수화 단계가 수행될 때, 상기 방법은 하나 이상의 인지질, 하나의 스테롤 및 하나의 용매 또는 용매 혼합물을 포함하는 지질 용액으로부터 용매를 증발시킴으로써 지질 필름을 제조하는 단계를 포함한다.
용매의 증발 단계는 하기와 같은 어떠한 증발 기술에 의해서도 수행될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다: 용매 상으로 비활성 기체의 스트림을 통과, 가열, 진공, 또는 진공하에서의 가열에 의한 증발.
일반적으로는, 회전 증발기 플라스크가 사용된다.
용매의 증발 단계 수행 전에 수화 단계가 수행될 때, 상기 방법은 용매를 포함하는 액상의 리포좀성 현탁액으로부터 용매를 증발시키는 단계를 포함한다. 용매의 증발 단계는 하기와 같은 어떠한 증발 기술에 의해서도 수행될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다: 용매 상으로 비활성 기체의 스트림을 통과, 가열, 진공, 또는 진공하에서의 가열에 의한 증발. 일반적으로는, 회전 증발기 플라스크가 사용된다. 용매 또는 용매 혼합물이 증발되고 난 뒤에, 액상의 현탁 제조물에는 오직 리포좀 만이 잔류한다.
리포좀을 제조하기에 적합한 인지질은 어떤 것이든지 본 발명에 사용할 수 있다. 적합한 인지질은 리포좀성 막의 투과성을 감소시키는 경향이 있는 것들을 포함한다. 긴 지방산 사슬을 가진 인지질을 포함하는 리포좀이 훨씬 더 적합하며, 이는 더 짧은 지방산 사슬을 가진 인지질을 포함하는 리포좀에 비해 제제를 훨씬 느리게 분비시킨다. 또한, 지방산의 탄소 사슬 길이가 길어짐에 따라, 상전이 (phase transition) 온도도 올라간다. 높은 상전이 온도를 가진 인지질을 포함하는 리포좀은 낮은 상전이 인지질을 포함하는 리포좀에 비해 그의 내용물을 훨씬 느리게 분비시킨다. 높은 상전이 온도는 내용물이 리포좀의 내부로부터 반투과성인 인지질 막과 같은 혈류로 느리게 분비될 수 있게 한다. 인지질의 다른 특성은 막 투과성 및 포화도와 전하도를 포함하는 안정성에 영향을 준다.
바람직하게는, 본 발명의 리포좀은 중성 지질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 중성 지질은 40℃ 내지 65℃의 상전이 온도를 갖으며, 더욱 바람직하게는 약 50℃ 내지 54℃의 온도를 갖는다. 바람직한 인지질은 최소한 16개 탄소의 지방산 사슬을 가진다.
본 발명의 적합한 인지질은 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC), 수화 소야 포스파티딜콜린 (HSPC) 또는 이러한 인지질의 유도체를 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포콜린이며, 이는 일반적으로 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)으로 알려져 있다. DSPC의 분자량은 790이며 분자식은 C44H88NO8P이다.
스테롤은 인지질와 함께 리포좀에 삽입되며, 리포좀 막의 강도 및 투과성을 변화시킨다. 실례의 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체 또는 이의 아날로그이다. 콜레스테롤은 리포좀성 막의 강도를 증가시키고 투과성을 감소시키는 경향이 있다. 콜레스테롤은 양쪽 친매성 분자이며 상기 분자는 그의 하이드록실 그룹이 액상 표면으로 향하게 하여 인지질 막 내부로 투입된다. 콜레스테롤은 농축액 내에 투입됨으로써 리포좀 막으로의 최적 투과성을 제공하며, 또한 막의 강도를 유지시켜준다. 콜레스테롤에 대한 인지질의 선택비는 리포좀으로부터의 내용물의 용해율을 나타낸다. 본 발명의 리포좀은 스테롤에 대한 인지질의 몰비가 1:0.1 내지 1:2이다. 바람직한 몰비는 1:0.5 내지 1:1.5이다. 디스테아로일 포스파티딜 콜린 (DSPC)이 인지질이고 콜레스테롤이 스테롤인 경우의 스테롤에 대한 인지질의 바람직한 몰비는 1:0.6 내지 1:0.8이다. 바람직한 몰비는 약 1:0.7이다.
용매 또는 용매 혼합물은 진공하에서 증발된다. 용매를 제거하고 난 뒤에 수화단계가 수행될 때의 제조방법에서, 액상의 수화 미디어를 이용해 제조된 지질 필름을 수화시킴으로써 리포좀을 제조한다. 교반 및 혼합 하에서 액상의 수화 미디어를 필름에 첨가시킴으로써 지질 필름을 수화시키고 리포좀을 제조한다. 당업자라면 사용해야 할 적절한 액상 수화 미디어를 용이하게 파악할 수 있다. 바람직한 액상 수화 미디어는 완충체/염을 포함하며, 이는 제조방법의 후기에 화학 구배 (chemical gradient)를 형성하는데 용이하게 함으로써, 다양한 로딩제가 리포좀에 삽입될 수 있도록 보조한다. 실례의 수화 미디어는 암모늄 하이드록사이드, 암모늄 설페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 바이카보네이트를 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 액상 수화 미디어는 암모늄 설페이트를 포함한다. 또한, 액상 수화 미디어는 수크로즈, 소듐 클로라이드, 덱스트로스 또는 만니톨과 같은 등삼투압제 (iso-osmotic agent)를 포함하며 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 등삼투압제는 용액의 다른 성분 및 리포좀 자체와 반응하지 않는 것이 바람직하다. 상기 등삼투압제는 바람직하게는 수크로즈이며, 이는 반응성이 최소이기 때문이다. 액상 수화 미디어가 암모늄 설페이트를 포함할때, 바람직한 등삼투압제는 수크로즈이다. 수크로즈는 리포좀성 막을 방어하고 단단하게 하도록 도와주며, 또한 리포좀성 조성물의 등장성삼투압 (isotonicity)을 유지시켜 준다.
일반적인 리포좀 및 페길레이테드 리포좀 제조에서 사용되는 수화 미디어의 양과 비교하였을때 액상 수화 미디어의 부피는 조절되고/감소된다. 액상 수화 미디어의 부피를 감소시킴에 따라, 인지질은 서로 밀접하게 채울 수 있으며, 이에 의해 더 두꺼운 리포좀 막 또는 "껍데기 (shell)"를 형성한다. 상기 두꺼운 "껍데기"는 PEG의 필요없이 안정하고, 장기간-순환하며, 느리게 분비되며 리포좀 내용물의 감소된 독성을 제공한다. 상기 사용된 수화 미디어의 부피가 감소되고, 인지질이 채워지면 서로 가까워지고 껍데기가 점점더 두꺼워지게 된다. "조절된/감소된"은 본 발명에서 사용된 액상 수화 미디어의 부피가 기존에 알려지거나 액상 수화 미디어의 양으로 받아들여지는 것보다 적은 것을 의미한다. 바람직한 감소된 부피의 수화 미디어 (즉, 인지질의 각 m㏖ 당 30 ㎖) 및 바람직한 농도의 콜레스테롤을 사용하면 리포좀성 조성물이 견고한 인지질 이중층을 가지도록 유도한다.
또한, 이러한수화 부피의 감소는 지질 용액에 있는 인지질의 몰 당 사용된 완충제의 부피의 비로 환산하여 표시될 수 있다. 본 발명에서, 사용된 액상 수화 미디어의 양은 지질 용액내에 있는 인지질의 각 몰당 10 내지 35 ㎖이다. 바람직하게는 액상 수화 미디어의 부피는 지질 용액 내에 있는 인지질의 각 몰당 20-30 ㎖이다. 더욱 바람직하게는, 액상 수화 미디어의 부피는 지질 용액 내에 있는 인지질의 각 몰당 30 ㎖이다.
리포좀은 적절하게 크기 분리된다. 당업자라면 리포좀의 크기 분리 방법을 용이하게 파악할 수 있다. 가압하에서의 균질화가 이러한 방법 중의 하나이다. 다른 적합한 방법은 일정한 포어 사이즈를 갖는 필터를 통해 리포좀을 사출성형시킴으로써 바람직한 리포좀 크기를 매치시키는 단계를 포함한다. 왜냐하면 본 발명의 리포좀이 훨씬 밀접하게 패킹된 막을 가지고 있으며, 크기 분리가 통상적인 리포좀을 이용하는 것보다 훨씬 더 어렵기 때문이다. 따라서, 점점 감소하는 작은 포어 크기를 갖는 필터로 단계별로 통과시킴으로써 크기분리하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수화 단계를 거치고 난 뒤에, 리포좀은 0.40 ㎛의 포어 크기를 갖는 필터를 통해 최초로 통과시키고, 그리고 난 뒤에 약 0.05 ㎛의 더 작은 포어사이즈를 갖는 필터를 통해 통과시킴으로써 연속적으로 크기 분리된다. 제조된 리포좀의 평균 크기 범위는 0.06 ㎛ 내지 0.2 ㎛이다. 바람직한 평균 크기 범위는 0.08 ㎛ 내지 0.12 ㎛이다.
수화 미디어 내에 있는 잔류의 리포좀성 염은 리포좀으로부터 제거되거나 세척된다. 투석 미디움을 이용한 투석은 잔류의 리포좀성 수화 미디어 염을 제거하는 일례의 방법이다. 적합한 완충 용액 어느것이든지 투석에 사용될 수 있다. 리포좀성 조성물 내에 존재하는 잔류의 리포좀성 염을 제거하는 것은 리포좀성 막을 관통해 내부에서 외부로의 화학 농도구배를 유발하며, 이는 후에 리포좀의 로딩을 위해 요청된다. 잔류하는 리포좀성 염을 제거하기 위한 다른 수단은 초미세여과 (ultrafiltration) 또는 컬럼 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 리포좀은 치료제 또는 진단제에 대해 장기간 순환하고, 느린 분비 전달 매커니즘을 제공한다. 바람직한 치료제 또는 진단제를 이용해 리포좀을 로딩하기 위해 어떠한 공지된 방법이든지 사용될 수 있다. 실례의 방법은 지질 필름을 수화하기 전에 지질 필름에 제제를 첨가하는 방법 및 pH 구배 또는 화학 구배를 이용하여 제제를 수화 미디어로 직접적으로 삽입하는 방법을 포함한다. 바람직한 방법은 화학 구배를 이용하여 제제를 로딩하는 방법을 포함한다. 리포좀이 활성 로딩 방법에 의해 로딩될 때, 약물 용액은 인지질의 상전이 온도와 동일하거나 높은 온도에서 블랭크 리포좀성 현탁액과 함께 혼합된다.
화학 구배를 이용하면, 제제의 양을 손쉽게 조절할 수 있으며 일단 제제를 리포좀 내로 로딩시키면, 잔류하는 리포좀성 미디어 내로의 누출이 최소이다. 또한, 완충제/염을 포함하는 수화 미디어가 수화 단계에서 사용될 경우, 이러한 구배 형서은 상기에 개시한 바와 같은 잔류의 리포좀성 수화 미디어 염을 제거하고 난 뒤에 훨씬 더 형성될 가능성이 커진다. 리포좀 로딩에서 유용한 화학 구배를 형성하기 위해 사용될 수 있는 실례의 수화 미디어는 암모늄 설페이트를 포함한다. 그러나, 소듐 클로라이드를 이용하여 등장성을 나타내는 암모늄 설페이트 용액을 이용한 수화는 (참조 미합중국 특허 제5,316,771호) 리포좀이 저장물을 누출시키게 하는 결과를 유발한다. 리포좀성 조성물에 있는 프리 약물의 함량은 저장되는 동안 증가하며, 이는 독성을 증가시킨다. 따라서, 리포좀성 막을 강화시킬 필요가 있다. 그러므로, 본 발명은 용액의 다른 성분 및 수화 미디어 내에 있는 리포좀 자체와 반응하지 않는 등삼투압제의 부수적인 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 등삼투압제는 수크로즈이다. 수크로즈의 용도가 리포좀성 막을 방어하는 것으로 확인되었다. 수크로즈는 리포좀성 막을 방어하고 강화시키도록 도와주며, 또한 리포좀성 조성물의 등장성을 유지시킨다. 리포좀성 막은 동결건조하기 전에 탈수시키기 위해 트레할로스, 수크로즈 및 말토오즈와 같은 사카라이드를 사용하여 방어시켰다 (미합중국 특허 제4,880,635호).
따라서, 본 발명은 리포좀이 훨씬 더 견고하도록 하고 저장하는 동안 내부에 캡슐화된 제제를 누출시키지 않게 하는 수화 미디움으로써 암모늄 설페이트와 함께 수크로즈를 이용하는 방법을 제공한다. 수화 미디움에 수크로즈를 첨가함으로써, 리포좀성 막의 내부 및 외부 표면에 수크로즈가 잔류하게 되어 리포좀성 막의 양면을 모두 강화시키며, 이에 의해 약물의 누출을 감소시킨다. 수화 미디어 내에 있는 수크로즈의 바람직한 농도는 0.1 M 내지 0.5 M이다. 0.25 M 내지 0.3 M의 농도가 더욱 바람직하다.
수화 미디어 내에 있는 암모늄 설페이트의 농도는 리포좀으로부터의 약물의 누출에 있어서 중요한 기능을 한다. 125 mM 이하 농도의 암모늄 설페이트 용액이 리포좀을 제조하기 위한 수화 단계에 사용될 때면 언제든지 저장된 약물의 누출이 확인되었다. 따라서, 바람직한 제조방법에서, 수화 미디어 내에 있는 암모늄 설페이트의 농도는 125 mM 이상이며, 이는 저장 상에서 누출을 감소시키는 리포좀성 조성물을 생산하게 한다. 따라서, 바람직한 방법에서 암모늄 설페이트 용액의 농도는 125 m㏖/ℓ 이상이며, 수화 미디어는 수크로즈를 포함한다.
투석이 수행될 때, 잔류하는 리포좀성 염, 즉 암모늄 설페이트를 제거하지만 내부-리포좀성 암모늄 설페이트는 제거하지 않으므로 리포좀 막을 관통하여 내부-외부로의 화학 구배가 유발된다.
약물을 리포좀에 로딩시키고, 제조된 리포좀성 조성물을 바람직한 농도의 약물에 희석시키기 위해 수많은 적절한 완충 용액이 사용될 수 있다. 리포좀이 일차적으로 약 6.0 내지 8.0의 중성 pH에서 안정한 인지질을 포함하기 때문에, 리포좀을 로딩하고 희석하기 위해 사용하는 완충 용액은 중성의 pH를 가져야 한다. 또한, 이상적인 완충용액은 비경구 투여용으로 적합해야 한다. 본 발명에서 약물을 리포좀으로 로딩하고 리포좀성 조성물을 희석하기 위해 비경구 투여에 사용되는 가장 일반적인 완충 용액의 일부가 적절한 것이며, 본 발명의 적절한 완충제는 글리신, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 히스티딘 완충제이다. 히스티딘 완충 용액은 중성 범위에서 가장 안정한 pH를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 완충 용액은 수크로즈와 히스티딘 하이드로클로라이드를 포함하고 이의 몰비가 29:0.1 내지 29:10인 것이며, 더욱 바람직하게는 약 29:1인 것이다. 수크로즈의 사용은 리포좀성 막을 방어하고 견고하도록 도와주며, 또한 리포좀성 조성물의 등장성을 유지시켜준다.
리포좀이 로딩되고 난 뒤에, 포착되지 않은 제제는 모두 제거된다. 적합한 방법은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 젤 여과 크로마토그래피, 투석법, 미세동공 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머 레진 (도웩스, DOWEX)를 이용한 처리방법 및 적절한 여과 방법을 포함한다. 도웩스 처리 방법은 이의 간편한 사용으로 인해 바람직한 방법이다. 투석법이 사용되는 경우, 잔류하는 리포좀성 수화 미디어 염을 제거할 때 상기에 개시된 동일한 방법으로 수행하는 것이 바람직하다.
상기에 언급한 바와 같이, 액상 수화 미디어의 양을 조절하거나 감소시킴으로써, 제조된 리포좀은 단위 부피 당 증가된 인지질 함량을 갖는다. 인지질 함량의 증가는 리포좀의 안정성을 증가시키고, 투과성을 감소시키며, 이로인해 포착된 제제 모두의 분비를 감소시킨다.
본 발명의 리포좀에 로딩하기에 적합한 제제는 이온화 그룹을 가진 수용성 양쪽 친매성 화합물이다. 양쪽 친매성 제제는 친수성 및 친유성 특성을 모두 나타내며, 치료제 또는 진단제가 될 수 있다. 치료제는 바람직한 어떠한 제제이든지 될 수 있으며 항종양제를 포함한다.
항종양제는 종양 세포를 억제하고, 사멸시키거나 이의 성장과 확장을 차단하는 약물이다. 수많은 적절한 항종양제가 있으며, 이의 일부는 알트레타민 (Altretamine); 아스파라기나아제; BCG; 블레오마이신 설페이트 (Bleomycin sulfate); 부설판 (Busulfan); 카보플라틴 (Carboplatin); 카무스틴 (Carmustine); 클로르암부실 (Chlorambucil); 시스플라틴-시스-플래티뭄 (Cisplatin-cis-platimum), 시스-디아민-디클로로플래티넘 (cis-diammine-dichloroplatinum); 클라드리빈 (Cladribine), 2-클로로데옥시아데노신 (2-chlorodeoxyadenosine); 사이클로포스파마이드 (Cyclophosphamide); 사이타라빈-사이토신 아라비노시드 (Cytarabine-cytosine arabinoside); 다카바진 이미다졸 카복사미드 (Dacarbazine imidazole carboxamide); 닥티노마이신 (Dactinomycin); 다우노루비신-다우노마이신 (Daunorubicin-daunomycin), 다우노루비신 하이드로클로라이드 (Daunorubicin hydrochloride); 덱사메타손 (Dexamethasone); 독소루비신 (Doxorubicin), 독소루비신 하이드로클로라이드 (Doxorubicin hydrochloride); 에피루비신 (Eporubicin); 에토포시드-에피포도필로톡신 (Etoposide-epipodophyllotoxin); 플록스유리딘 (Floxuridine); 플루오로유라실 (Fluorouracil); 플루옥시메스테론 (Fluoxymesterone); 플루타미드 (Flutamide); 플루다라빈 (Fludarabine); 고세렐린 (Goserelin); 하이드록시유레아 (Hydroxyurea); 아이다루비신 HCl (Idarubicin HCl); 아이포스파마이드-아이소포스파마이드 (Ifosfamide-Isophosphamide); 인터페론 알파; 인터페론 알파 2a; 인터페론 알파 2b; 인터페론 알파 n3; 이리노테칸 (Irinotecan); 류코보린 칼슘 (Leucovorin calcium); 류프롤리드 (Leuprolide); 레바미졸 (Levamisole); 로뮤스틴 (Lomustine); 메게스트롤 (megestrol); 멜팔란-L-페닐알라닌 머스타드 (Melphalan-L-phenylalanine mustard), L-사코라이신 (L-sarcolysin); 멜팔란 하이드로클로라이드; 메클로레타민 (Mechlorethamine), 나이트로젠 머스타드; 메틸프레드니솔론 (Methylprednisolone), 메토트렉세이트-아메톱테린 (Methotrexate-Amethopterin), 마이토마이신-마이토마이신-C; 마이토잔트론 (Mitoxantrone); 머캅토퓨린 (Mercaptopurine), 파클리탁셀 (Paclitaxel); 플리카마이신-미트라마이신 (Plicamycin-Mithramycin); 프레드니손 (Prednisone); 프로카바진 (Procarbazine); 스트렙토조신-스트렙토조토신 (Streptozocin-Streptozotocin); 타목시펜 (Tamoxifen); 6-티오구아닌 (6-thioguanine); 티오테파-트리에틸렌 티오포스포라마이드 (Thiotepa-triethylene thiophosphoramide); 빈블라스틴 (Vinblastine); 빈크리스틴 (Vincristine); 또는 비노렐빈 타트레이트 (vinorelbine tartrate)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 항종양제는 독소루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 에피루비신 하이드로클로라이드를 포함한다.
또한, 본 발명은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 MRI (자기 공명 영상, magnetic resonance imaging)를 수행하는 동안에 깨끗한 이미지를 제공하는데 도움을 주기 위해 사용되는 MRI 조영제 (또한 상자성제로 일컫어짐)를 포함하는 진단제를 이용하여 리포좀을 로딩하는 방법을 제공한다. MRI는 몸 속 특정 부위의 이미지 또는 "영상 (picture)"를 형성하게 하기 위해 자석과 컴퓨터를 사용하는 특별한 진단 방법 중의 하나이다. 엑스-레이와는 달리, 상기 방법은 이온화 방사선과는 관련이 없다. 예를 들어 MRI 진단제는 가도디아미드 (Gadodiamide); 가도펜테테이트 (Gadopentetate); 가도테리돌 (Gadoteridol); 가도버세타미드 (Gadoversetamide), Gd:디에틸렌트리아민펜트아세드산 킬레이트 (Gd-DTPA)를 포함한다 (미합중국 특허 제6,132,763호).
일단 리포좀이 로딩되고, 캡슐화되지 않으며, 치료제/진단제가 제거되면, 리포좀성 조성물은 비경구 투여용으로 적합하도록 멸균시키기 위해 무균적으로 여과될 수 있다. 이상적인 필터는 최소한 0.2 ㎛의 필터이다. 그리고 난뒤, 상기 리포좀성 조성물은 무균의 비발열성 벌크 컨테이너로 필터된다. 그 다음으로, 상기 멸균된 조성물은 유리 바이알과 같은 무균의 비발열성 작은 컨테이너로 무균적으로 채워진다. 상기 컨테이너의 상부공간에 있는 공기는 질소와 같은 비활성 기체로 퍼지시킴으로써 제거되며 상기 컨테이너는 밀봉된다. "비경구 투여용으로 적합한"이란 표현은 조성물이 무균이고, 등장성이며 박테리아 내독소에 대해 컨트롤된 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 안정하고, 장기간-순환하며, 낮은 독성의 비-페길레이테드 리포좀을 제공한다. 상기 리포좀은 바람직하게는 본원에 개시된 방법에 의해 제조된다. 본 발명의 리포좀은 스위스 알비노 생쥐에서 동량으로 테스트했을 때 일반적인 비-리포좀성 제형 (아드리아마이신)보다 최소한 25배 이상 긴 혈액 순환 반감기를 가지는 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀이다. 바람직한 혈액 순환 반감기는 아드리아마이신보다 약 40배 더 길다.
본 발명의 비-페길레이테드 리포좀은 인지질 및 콜레스테롤을 포함한다. 콜레스테롤에 대한 인지질의 적합한 비율은 상기에 개시되어 있으며, 바람직하게는 약 1:0.1 내지 1:2의 몰비이다. 스테롤에 대한 인지질의 바람직한 몰비는 약 1:0.7이다. 포스파티딜 콜린은 바람직한 인지질이며 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)이 특히 바람직하다.
비-페길레이테드 리포좀은 진단제 또는 치료제를 이용하여 로딩될 수 있다. 이러한 제제는 공지되어 있으며 상기에서 언급하였다. 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀은 바람직하게는 상기에 언급한 바와 같은 화학 구배를 이용하여 로딩된다. 본 발명의 바람직한 비-페길레이테드 리포좀은 독소루비신 하이드로클로라이드를 이용하여 로딩되며 상기에 언급한 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 상술한 활성 로딩 방법을 이용하여 독소루비신 하이드로클로라이드를 로딩할때, 약물은 최소한 25 mM 농도가 되도록 로딩되기 전에 적절한 완충 용액 (상술한 바와 같은)에 용해된다. 활성 로딩 방법이 암모늄 설페이트 구배와 관련이 있을 때, 암모늄 설페이트가 독소루비신 하이드로클로라이드와 반응함으로써 독소루비신 설페이트가 제조된다. 독소루비신 설페이트는 로딩하고 난 뒤에 불용성이며 리포좀 내부에 잔류한다. 일단 포착되지 않은 약물 또는 프리 약물 모두가 로딩된 리포좀으로부터 제거되면, 약물이 로딩된 리포좀은 요구되는 약물 농도를 맞추기 위해 액상 완충 용액을 이용해 희석된다. 사용된 완충 용액은 상술한 바와 같은 수크로즈-히스티딘 완충 용액인 것이 바람직하다.
일례의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물은 2 ㎎/㎖ 독소루비신 하이드로클로라이드를 포함한다. 다른 예의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물은 4 ㎎/㎖ 독소루비신 하이드로클로라이드를 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 독소루비신은 최종적으로 요구되는 조성물에서 요구되는 농도의 2배로 비-페길레이테드 리포좀에 로딩될 수 있다. 그리고 난 후 로딩된 리포좀은 리포좀성 조성물의 ㎖ 당 독소루비신의 바람직한 농도를 맞추기 위해 적절한 완충 용액 (상술한 바와 같은)을 이용하여 희석될 수 있다. 희석하는 동안, 리포좀이 현탁된 외부의 미디어는 희석되며, 반대로 리포좀의 내부에 있는 약물은 희석되지 않은 상태로 잔류한다.
바람직한 실시예에서, 인지질에 대한 독소루비신 하이드로클로라이드의 몰비는 약 1:2 내지 약 1:15이다. 바람직한 몰비는 약 1:3.5이다.
또한, 본 발명은 비-페길레이테드 독소루비신 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 당업계에 공지된 약제학적으로 허용가능한 적합한 담체로써 상술한 바와 같은 비-페길레이테드 리포좀을 포함한다. 상기 리포좀은 독소루비신 하이드로클로라이드를 이용하여 로딩된다. 상기 조성물은 비경구 투여용으로 적합하며 장기간 순환한다.
본 발명의 일실시예에서는 비경구 투여용 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물을 제공한다. 상기 리포좀성 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀을 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 약제학적 조성물에서, 독소루비신 하이드로클로라이드의 농도는 1 mM 내지 10 mM로 다양하며, 보다 바람직하게는 약 6.9 mM이며, 가장 바람직하게는 약 3.45 mM이다. 인지질의 몰 농도는 비경구 조성물 내에 10 mM 내지 15 mM로 다양하다. 더욱 바람직한 함량은 약 12.15 mM이다.
상기 조성물은 디스테아로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤, 히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈를 추가로 포함한다. 바람직하게는 상기 리포좀은 0.06 ㎛ 내지 0.16 ㎛의 평균 크기를 갖는다.
바람직한 독소루비신 하이드로클로라이드의 함량은 1 내지 10 mM이며, 더욱 바람직한 독소루비신 하이드로클로라이드 함량은 3.45 mM이다.
본 발명의 조성물에서, 콜레스테롤에 대한 디스테아로일포스파티딜 콜린의 몰비는 1:0.6 내지 1:0.8이며, 바람직하게는 1:0.7이다.
본 발명의 조성물에서, 디스테아로일포스파티딜 콜린에 대한 독소루비신 하이드로클로라이드의 몰비는 1:2 내지 1:10이고, 바람직하게는 1:2 내지 1:8이며, 더욱 바람직하게는 1:3.5이다.
상기 수크로즈의 함량은 0.1 M 내지 0.5 M이며, 더욱 바람직하게는 0.25 M 내지 0.3 M이다.
본 발명의 조성물에서, 히스티딘 하이드로클로라이드의 함량은 1 mM 내지 100 mM이며, 바람직하게는 8 내지 12 mM이며, 더욱 바람직하게는 10 mM이다.
본 발명의 조성물에서, 상기 리포좀은 0.08 ㎛ 내지 0.12 ㎛의 평균 크기를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 독소루비신 하이드로클로라이드는 4 ㎎/㎖로 존재하고, DSPC에 대한 독소루비신의 몰비는 1:3.5이며, 콜레스테롤에 대한 DSPC의 몰비는 1:0.7이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 독소루비신 하이드로클로라이드는 2 ㎎/㎖로 존재하고, DSPC에 대한 독소루비신의 몰비는 1:3.5이며, 콜레스테롤에 대한 DSPC의 몰비는 1:0.7이다.
조성물 내에 있는 상기 독소루비신 리포좀은 바람직하게는 스위스 알비노 생쥐에서 동량으로 테스트했을 때 아드리아마이신보다 40배 이상 긴 혈액 순환 반감기 (t1/2)를 가진다.
본 발명의 다른 실시예에서는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물을 투여하는 단계를 수행함으로써 종양의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물을 치료학적으로 효과적인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물이 연장된 순환 기간을 가짐에 따라, 감소된 독성을 나타내며 "수-족 증후군"을 나타내지 않아 종양 성장을 감소시키기에 유용한 치료방법을 제공한다. 숙련된 기술자라면 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀을 가진 독소루비신 하이드로클로라이드를 이용하여 종양 민감성을 가진 개인을 치료하기 위해, 본원에 개시된 데이터 뿐만 아니라 일반적으로 공지된 투여량, 투여시간 및 투여 경로를 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 종양 성장을 감소시키는 치료를 하기 위해서는 2 ㎎/㎖ 및 4 ㎎/㎖ 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드가 유용하다.
또한, 본 발명은 상기 조성물과 비슷한 비율의 성분을 가진 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 및 콜레스테롤을 한개의 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키는 단계;
(b) 액상 수화 용액을 첨가함으로써 지질을 수화시키는 단계를 수행하기 전 또는 후에 상기 용매를 제거하는 단계, 상기 액상 수화 용액은 암모늄 설페이트 및 수크로즈를 포함하고, 상기 액상 수화 용액은 각 DSPC m㏖ 당 10 ㎖ 내지 35 ㎖의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 함;
(c) 상기 단계 (b)의 마지막에 수득한 리포좀성 조성물내에 있는 리포좀이 약 0.060 ㎛ 내지 0.16 ㎛의 크기가 되도록 크기 분리 (sizing)하는 단계;
(d) 히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈를 포함하는 수크로즈-히스티딘 완충용액을 이용하여, 상기 단계 (c)에서 크기 분리 단계를 거친 리포좀성 조성물로부터 잔류하는 리포좀성 암모늄 설페이트를 제거하는 단계;
(e) 상기 수크로즈-히스티딘 완충용액에 독소루비신 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써 최소한 25 mM 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드 용액을 수득하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)에서 수득한 독소루비신 하이드로클로라이드 용액과 상기 단계 (d)의 마지막에 수득한 리포좀성 조성물을 혼합함으로써 독소루비신 하이드로클로라이드가 로딩된 리포좀성 조성물을 수득하는 단계;
(g) 접선방향 (tangential) 플로우 투석방법, 컬럼 크로마토그래피 또는 미세다공성 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머를 기초로 하는 레진을 이용한 처리방법과 같은 어떠한 방법이든지 이용하여 상기 리포좀성 조성물로부터 잔류하는 리포좀성 독소루비신 하이드로클로라이드를 제거하는 단계;
(h) 상기 단계 (g)의 마지막에 수득한 상기 리포좀성 조성물의 부피를 상기 수크로즈-히스티딘 완충용액으로 채움으로써 요구되는 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드를 가진 리포좀성 조성물을 수득하는 단계;
(i) 상기 리포좀성 조성물을 0.2 μ 멸균 등급 필터를 통해 멸균 컨테이터로 통과시킴으로써 상기 리포좀성 독소루비신 조성물을 수득하는 단계.
상기 액상 수화 용액 내에 있는 암모늄 설페이트의 농도는 125 mM 이상이다.
본 발명의 독소루비신 하이드로클로라이드를 포함하는 비-페길레이테드 리포좀은 일반적인 독소루비신 하이드로클로라이드 제형 (아드리아마이신) 및 페길레이테드 리포좀 독소루비신 하이드로클로라이드 제형 (캘릭스, CAELYX)과 비교하여 감소된 독성 작용을 나타내었다. 하기 표 1은 생쥐에서 실험한 급성 독성 및 약동학 실험의 결과를 나타낸다. 하기 실시예 Ⅱ에 세팅된 파라미터에 따라 제조된 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀을 상업적으로 이용가능한 페길레이테드리포좀 독소루비신 제형, 캘릭스 및 아드리아마이신과 비교하였다. 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀의 LD50은 아드리아마이신과 캘릭스보다 높았으며, 이는 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀이 낮은 독성을 가지고 있음을 증명해준다.
생쥐에서의 급성 독성 실험 및 약동학 실험
파라미터 실시예 Ⅱ의 조성물 캘릭스
(페길레이테드 리포좀성 독소루비신)		 아드리아마이신
(일반적인 비-리포좀성 독소루비신)
LD50(㎎/㎏) 16.13 13.5 10.29
MTD(㎎/㎏) 8 8 5
Cmax(㎍/㎖) 267.54 285.74 26.8
Tmax(시간) 0.085 0.085 0.085
Kel 0.0997 0.07109 4.851811
T1/2(시간) 6.948 9.748 0.143
AUC(㎍-h/㎖) 1694.024 2083.215 1.244
Vd(㎖) 1.480 1.688 41.42
Vd(㎖/㎏) 59.20 67.52 1656.79
Cl(㎖/h) 0.15 0.12 200.96
약어: MTD = 최대 내성 투여량; Cmax = 혈장에 도달된 약물의 최대 농도; Tmax = 혈장에 존재하는 약물의 최대 농도에 도달하는데 걸린 시간; Kel = 제거 (elimination) 상수; T1/2 = 혈장에 존재하는 약물 농도가 50%까지 감소하는데 걸리는 시간; AUC = "농도"vs "시간"커브 하의 면적; Vd = 분포 부피; Cl = 약물의 제거율.
본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀을 MCF-7 인간 유방암이 이식된 생쥐에 사용하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 종양 무게 및 효과의 차이는 T/C% (대조군에 대한 실험군의 퍼센트)로 측정하였다. 본 실험에서 (실시예 Ⅵ), 캘릭스를 사용할 때의 가장 높은 T/C 비율은 12 ㎎/㎏에서 -78이고 6 ㎎/㎏에서 -34.7이며, 반대로 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀을 사용할 때의 가장 높은 T/C 비율은 12 ㎎/㎏에서 93.4이고 6 ㎎/㎏에서 -89.43이다. 이러한 결과는 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀성 조성물이 최근에 판매되는 페길레이테드 리포좀성 제형인 캘릭스에 비해 종양의 무게를 줄이는데 훨씬 더 효과적임을 증명해 준다.
누드 생쥐에 이식된 MCF-7 인간 유방암에 대한 효과
일 평균 종양 무게 (㎎)
식염수
대조군		 실시예 Ⅱ의 조성물
(6㎎/㎏)		 실시예 Ⅱ의 조성물
(12㎎/㎏)		 캘릭스
(6㎎/㎏)		 캘릭스
(12㎎/㎏)
1 36.5 31.5 68.4 38.3 57.88
5 36.75 45.33 81.6 44.3 50.75
9 63.13 40.17 43.6 41.5 31.38
12 52.38 42.83 46.1 60.17 32
16 78.13 5.33 16.2 25 27.8
19 94 3.33 8 25 22.8
23 95.38 3.33 4.5 16 16.6
26 94.38 3.33 4.5 25 12.6
Wt 43.4 -28.17 -63.9 -13.3 -45.2
T/C% NA -89.43 -93.4 -34.7 -78
L1210 생쥐 백혈병 세포에서, 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀의 항-종양 활성을 실험하였다. 결과는 하기 표 3에 나타낸다. 이 실험 (실시예 Ⅵ)의 결과는 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀성 조성물이 페길레이테드 리포좀 (캘릭스) 만큼 효과적임을 나타내 준다.
L1210 생쥐 백혈병 모델에서의 항-종양 활성
그룹 투여량(㎎/㎏) 생쥐 생존시간(일) 평균생존시간(일) T/C%

식염수
대조군

NA

 1/5 17

16

NA
2/5 16
3/5 17
4/5 16
5/5 16


실시예 Ⅱ

6

 1/5 20

20.4

128
2/5 20
3/5 22
4/5 20
5/5 20


실시예 Ⅱ

12

 1/5 23

21.2

132
2/5 20
3/5 20
4/5 20
5/5 23


캘릭스

6

 1/5 18

20.4

128
2/5 22
3/5 20
4/5 20
5/5 22


캘릭스

12

 1/5 18

20.6

129
2/5 22
3/5 20
4/5 23
5/5 20
T/C% 대조군에 대한 실험군의 퍼센트
상기 표 1 내지 3의 결과는 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물이 낮은 독성과 긴 순환 시간을 가지며, MCF-7 및 L1210 종양 모델에 대하여 인 비보에서 항-종양 활성의 효력을 가짐을 증명해준다.
당업자가 본 발명을 좀더 완벽히 이해할 수 있도록 하기 위해, 본 발명의 리포좀 제형의 제조방법, 특징 및 동물 모델에서의 인 비보 화학치료 적용방법을 기술한 하기 실시예가 제공된다. 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명이 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
본 발명의 실시예에서 사용된 독소루비신 하이드로클로라이드는 미합중국 악전 설명서에 따른 비경구 등급의 것이다. 본 발명의 실시예에서 사용된 인지질은 비경구 등급의 것이다. 본 발명의 실시예에 사용된 콜레스테롤은 미합중국 악전 설명서에 따른 비경구 등급의 것이다. 본 발명의 실시예에 사용된 물은 주사용 물 설명서에 따른 비경구 등급의 것이다. 본 발명의 실시예에서 사용된 모든 다른 첨가물은 비경구 등급의 것이다. 모든 과정은 조절된 환경의 구역에서 실시된다.
미합중국의 벤 베뉴 실험실에서 제조된 캘릭스 (페길레이테드 리포좀성 독소루비신 제형) 및 미합중국의 파마시아 ＆ 유폰 사에 의해 제조된 아드리아마이신 (일반적인 비-리포좀성 독소루비신 제형)은 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 제형과 비교 평가를 하기 위해 동물 실험에 사용하였다. 또한 본원에서 "일반적인 비-리포좀성 독소루비신 조성물"이라고 일컫어지는 아드리아마이신은 주사용 동결 건조된 무균 파우더이며, 각 바이알은 독소루비신 하이드로클로라이드 10 ㎎, 락토오스 50 ㎎ 및 메틸하이드록시벤조에이트 1 ㎎을 포함한다. 사용하기 전에, 상기 동결 건조된 파우더는 팩으로 제공되는 주사용 물 5 ㎖로 용해된다.
혈액학적 실험을 수행하기 위해, 세포 계수기 (Sysmex Automated Hematology Analyzer-KX-21)가 사용되었다.
실시예 Ⅰ : 독소루비신 하이드로클로라이드를 포함하는 리포좀성 조성물의 제조방법
지질 필름 제조 : DSPC (1.565 g) 및 콜레스테롤 (0.521 g)을 회전 증발 플라스크에 있는 클로로포름 (40 ㎖)에 순차적으로 용해시켰다. 상기 물질들이 맑은 용액이 형성될 때까지 혼합하였다. 상기 플라스크를 회전 증발기에 연결시켰으며 수조의 온도를 60℃로 맞추었다. 상기 용매를 진공하에서 증발시켜 플라크의 벽에 얇은 지질 필름이 형성되게 하였다. 진공을 느슨하게 한 다음, 질소를 상기 플라스크로 통과시키면서 상기 플라스크를 약 5분 동안 회전시켜 잔류하는 모든 용매가 건조되어 제거되게 하였다.
수화 : 상기 플라스크에 있는 지질 필름을 암모늄 설페이트를 포함하는 액상 수화 미디어 60 ㎖로 수화시켰다. 상기 수화 미디어는 10.0 g의 수크로즈, 2.04 g의 암모늄 설페이트 및 100 ㎖의 물로 구성되어 있다. 지질 필름과 수화 미디어를 포함하는 상기 플라스크를 65-68℃의 온도로 유지되는 수조에서 30분 동안 회전시켜 리포좀을 제조 하였다.
사출성형에 의한 리포좀의 크기 감소 : 상기로부터 수득한 리포좀성 현탁액을 0.4 ㎛ 내지 0.05 ㎛의 동공 크기를 갖는 필터로 연속적으로 사출성형시킴으로써 크기분리시켰다.
암모늄 설페이트 구배의 전개 : 수크로즈-히스티딘 완충용액을 이용하여 상기 크기 분리된 리포좀 현탁액을 투석함으로써 잔류의 리포좀성 암모늄 설페이트를 제거하였으며, 이를 통해 화학 구배를 형성시켰다. 투석하기 위해 300 KD 카세트로 장착된 접선방향 플로우 투석 시스템을 사용하였다. 암모늄 설페이트의 부재 여부는 네슬러제 (Nesseler agent)를 이용하여 측정하였다.
투석에 사용된 수크로즈-히스티딘 완충용액 및 약물 로딩 (하기)은 다음과 같다: 170.0 g의 수크로즈, 3.40 g의 히스티딘 HCl, 1.7 리터의 물 및 pH 6.0 내지 6.5로 적정하기에 충분한 양의 소듐 하이드록사이드.
약물 로딩 : 둥근 바닥 플라스크에서, 리포좀성 제형을 로딩하고 4 ㎎/㎖ 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드를 갖는 약물 로딩된 리포좀을 수득하기 위해 수크로즈-히스티딘 완충용액 (상술한)에 15 ㎎/㎖의 독소루비신 HCl이 들어있는 용액을 제조하였다. 상기로부터 수득한 크기 분리되고 투석된 리포좀을 둥근 바닥 플라스크에 천천히 첨가시켜 준 후 65℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 약물이 로딩된 리포좀을 도웩스와 함께 30분 동안 혼합하여 포착되지 않은 약물을 제거하였다. 수크로즈-히스티딘 완충액을 이용하여 상기 약물 로딩된 리포좀을 2 ㎎/㎖ 농도가 될때까지 희석하였으며, 그리고 난 후 멸균된 0.22 ㎛ 막 필터를 이용하여 무균적으로 여과하였다. 그리고 난 뒤, 상기 여과된 리포좀성 독소루비신 조성물을 멸균된 비발열성 유리 바이알 내에 무균적으로 첨가하였으며 테플론 코팅된 고무 마개 덮개 하에서 밀봉하였다.
실시예 Ⅱ : 페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물, 비-리포좀성 독소루비신 조성물 및 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물의 LD50 비교
하기를 포함하는 리포좀성 독소루비신 조성물을 제조하였다:
조성물은 각 ㎖ 당 하기를 포함한다
DSPC - 9.55 ㎎
콜레스테롤 - 3.15 ㎎
독소루비신 하이드로클로라이드 - 2.01 ㎎
수크로즈 - 95 ㎎
히스티딘 하이드로클로라이드 - 2 ㎎
상기 조성물은 실시예 Ⅰ에 개시된 방법과 유사하게 제조하였다. 독소루비신 하이드로클로라이드 (216 ㎎)를 14 ㎖의 수크로즈-히스티딘 완충용액에 용해시켰으며, 40 ㎖의 크기분리된 리포좀에 첨가하여 1시간 동안 혼합하였다. 그리고 난 뒤 제조된 약물 로딩된 리포좀성 분산액을 도웩스 컬럼을 통해 통과시킴으로써 포착되지 않은 약물을 제거하였다.
도웩스 컬럼을 통해 통과하고 난 뒤에 수득한 생산물은 하기의 특징을 갖는다:
생산물 분석
전체 독소루비신 HCl 함량 3.98 ㎎/㎖
포착된 독소루비신 HCl 함량 3.94 ㎎/㎖
2 ㎎/㎖의 농도가 되도록 히스티딘 완충제로 희석한 상기 생산물을 하기 파라미터에 대해 분석하였다:
형태 : 붉은색의 투명 액체
pH : 6.1
입자크기 : 평균 입자크기 0.093 ㎛
DSPC 함량 : 9.55 ㎎/㎖
콜레스테롤 함량 : 3.15 ㎎/㎖
독소루비신 HCl 함량 : 2.01 ㎎/㎖
수크로즈 함량 : 9.35% w/v
히스티딘 HCl 함량 : 양성
박테리아 내독소 : 독소루비신 하이드로클로라이드의 2.2 EU ㎎ 보다 낮음
멸균도 : 무균
상기 조성물을 생쥐에서의 급성 독성 연구에 사용하였다.
"페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물" (캘릭스), "일반적인 비-리포좀성 독소루비신 조성물" (아드리아마이신) 및 "본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"의 LD50 비교
사용된 동물 : 어느 한쪽 성의 스위스 알비노 생쥐
동물의 체중범위 : 20-22 g
그룹수 : 3
그룹당 동물수 : 10
동물들을 3 그룹으로 나누었으며 각 그룹은 10마리의 동물을 포함하도록 하였다. 그룹 1에는 실시예 Ⅱ의 조성물을 투여하였고, 그룹 2에는 캘릭스를 투여하였으며, 그룹 3에는 아드리아마이신을 투여하였다.
모든 동물들에게 정맥내 경로를 통해 주사하였다. 동물에게 투여하기 전에 상기 약물 용액을 덱스트로스 (5% w/v) 용액으로 적당하게 희석하였다. 그리고 난 후 동물들을 14일 동안 관찰하였다. 임상 독성 및 생존율을 관찰하였다.
실험한 다른 독소루비신 제형의 LD50 값을 표 1에 나타내었다.
본 발명의 제형의 LD50 용량은 16.13 ㎎/㎏으로 확인된 반면 상업적으로 판매되는 제형 (아드리아마이신)의 LD50 용량은 10.29 ㎎/㎏으로 확인되었다. 상업적으로 판매되는 페길레이테드 리포좀성 제형 캘릭스의 LD50은 13.5 ㎎/㎏이었다. 이러한 결과는 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀이 다른 독소루비신 제형 및 페길레이테드 리포좀성 독소루비신 제형에 비해 감소된 독성을 가짐을 나타내어 준다.
실시예 Ⅲ : "본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"과 "페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"(캘릭스) 및 "일반적인 비-리포좀성 독소루비신 조성물" (아드리아마이신)의 아급성 독성 비교
사용된 동물 : 어느 한쪽 성의 스위스 알비노 생쥐
그룹수 : 11
그룹당 동물수 : 8
동물의 체중범위 : 19-23 g
투여 경로 : 정맥내
동물들을 11개의 그룹으로 나누고, 각 그룹이 8마리의 동물을 포함하게 하였다. 그룹 1에 덱스트로스 5%를 주사하였고, 그룹 2에는 본 발명의 블랭크 리포좀 (약물을 로딩하기 전)을 투여했으며, 그룹 3, 4 및 5에는 실시예 Ⅱ의 조성물을 다른 용량으로 투여했고, 그룹 6, 7 및 8에는 캘릭스를 다른 용량으로 투여했으며, 그룹 9, 10 및 11에는 아드리아마이신을 다른 용량으로 투여했다. 투여 용량은 하기 표 4에 기재되어 있다.
생쥐에서의 반복 투여량 독성 실험을 위한 독소루비신 제형의 투여 용량
그룹 번호 그룹 투여용량(㎎/㎏ 체중) 축적용량(㎎/㎏ 체중)
1 덱스트로스 - -
2 블랭크 리포좀 - -
3 실시예 Ⅱ의
조성물
 1 7
4 2 14
5 3 21
6
캘릭스
 1 7
7 2 14
8 3 21
9
아드리아마이신
 1 7
10 2 14
11 3 21
14일 동안 격일로 모든 그룹에 정맥내 투여했다. 상기 제형은 동물에 투여하기 전에 덱스트로스 5% 주사액으로 적절하게 희석시켰다. 14일의 실험 기간 동안 다음의 항목에 따라 실험동물을 관찰하였다:
→ 사망율
→ 임상적 징후 및 증상
→ 체중
→ 먹이 소비량
→ 기관의 무게
결과
사망율 : 모든 제형에 대하여 14일 동안의 사망율 퍼센트를 기록하였다.
다양한 용량의 독소루비신 제형에 대한 퍼센트 사망률
그룹 용량(㎎/㎏체중) 퍼센트 사망률
덱스트로스 - 0
블랭크 리포좀 - 0
실시예 Ⅱ의
조성물
 1 0
2 0
3 0

캘릭스
 1 0
2 0
3 0

아드리아마이신
 1 0
2 0
3 12.5
임상 징후 : 실험 기간 동안, 모든 독소루비신 처리 그룹에서 꼬리 피부 쉐딩 (shedding) 및 탈모가 관찰되었다. 꼬리 피부의 쉐딩은 5회 주입후에 동물에서 관찰되었다. 용량 의존적 탈모는 모든 독소루비신 처리된 동물에서 관찰되었다. 표 6은 이 실험 과정 동안의 탈모를 자세히 나타내어 준다.
다양한 독소루비신 제형으로 처리한 생쥐에서의 탈모증 발생수
제형 탈모증 정도
덱스트로스 -
블랭크 리포좀 -
실시예 Ⅱ의 조성물(1㎎/㎏) ＋
실시예 Ⅱ의 조성물(2㎎/㎏) ＋
실시예 Ⅱ의 조성물(3㎎/㎏) ＋＋
캘릭스(1㎎/㎏) 털세움＃
캘릭스(2㎎/㎏) ＋
캘릭스(3㎎/㎏) ＋＋
아드리아마이신(1㎎/㎏) ＋
아드리아마이신(2㎎/㎏) ＋＋
아드리아마이신(3㎎/㎏) ＋＋＋＋
＃ 처리한지 12일째에 8마리의 동물중 1마리에서 털세움이 관찰됨.
＋ 8마리의 동물중 1마리가 탈모증을 보임.
＋＋ 8마리의 동물중 2마리가 탈모증을 보임.
＋＋＋ 8마리의 동물중 3마리가 탈모증을 보임.
＋＋＋＋ 8마리의 동물중 4마리가 탈모증을 보임.
체중 : 동물의 체중을 1일, 4일, 7일 및 14일 째에 측정하였다. 2 ㎎/㎏ 및 3 ㎎/㎏의 투여량에서, 모든 약물 처리 그룹에서 체중의 감소가 관찰되었다. 체중 감소는 대조군과는 유의적으로 차이났다. 블랭크 리포좀을 투여받은 동물의 체중은 덱스트로스 그룹과 비슷했다.
먹이 소비량 : 4 내지 14일의 기간 동안 독소루비신 처리한 동물들은 먹이 소비에 있어서 일반적인 감소를 보였다.
기관의 무게 : 생존한 동물의 기관을 수득한 뒤 무게를 측정했다. 모든 동물의 평균 기관 무게는 약물 처리한 그룹과 비슷하였다.
실시예 Ⅳ : "본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"과 "페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"(캘릭스) 및 "일반적인 비-리포좀성 독소루비신 조성물" (아드리아마이신)의 약동학 평가
사용된 동물 : 어느 한쪽 성의 스위스 알비노 생쥐
그룹수 : 3
그룹당 동물수 : 48
동물 체중 : 25-30 g
약동학 실험을 위한 투여량 : 10 ㎎/㎏
시간 포인트 : 5분, 30분, 1, 2, 5, 10, 15 및 20시간
시간 포인트 당 생쥐수 : 6마리 생쥐
투여 경로 : 정맥내
수득한 혈액 샘플을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 혈장을 분리한 뒤, 분석할 때까지 -20℃에 동결하였다. 동결된 혈장을 녹인 뒤 분석에 사용하였다.
1 ㎖의 아세토니트릴을 100 ㎕의 혈장에 첨가하여 10분 동안 강하게 혼합한 뒤 3250 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 난 뒤 0.5 ㎖의 포화된 ZnSO4 용액을 첨가하였다. 제조한 용액을 5분 동안 강하게 혼합시킨 뒤 3250 rpm 속도에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상부의 유기층을 버리고 난 뒤 60℃에서 산소가 없는 질소 가스 하에서 건조시켰다. 그리고 난 뒤 잔류물을 ZnSO4를 포함하는 200 ㎕의 용매 A로 재현탁하였다. 그리고 난 뒤 상기 용액 중 100 ㎕를 HPLC 컬럼에 주입하였다.
장비 : 시마드쥬 액체 크로마토그래피 LC-10ATvp
컬럼 : C8 써모퀘스트 하이퍼실 MOS (250 ×4.6 mm, 5 μ)
컬럼 온도 : 주변온도
이동상 : 용매 A: 산성화된 물 (pH 2.5, 60% 퍼클로르산으로 적정)
＆ 테트라하이드로퓨란 (80:1, v/v)
용매 B: 아세토니트릴
용매 A : 용매 B (40:60)
유속 : 1 ㎖/분
검출기 : 형광 검출기 (RF-10 AXL 시마드쥬; Ex 460 nm 및 Em 550 nm)
작동 시간 : 15분
통계학적 분석
스튜던트 t-테스트를 사용하여 세가지 제형간을 비교하였다. 그 결과는 표 1에 요약하였다.
실시예 Ⅴ : "본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"과 "일반적인 비-리포좀성 독소루비신 조성물" (아드리아마이신)의 개에서의 아급성 독성 비교
사용된 동물 : 개
그룹수 : 3
그룹당 동물수 : 3
동물의 체중범위 : 10-20 ㎏
용량 및 투여 방법 : 20분 동안 1 ㎎/㎏을 정맥내 관류.
1주일에 한번씩 (즉, 7일 뒤) 4회 투여.
약동학적 평가 :
→ 독성의 임상적 징후
→ 체중
→ 혈류역학 (haemodynamic) 파라미터
→ 혈액학
→ 생화학적 파라미터
독성의 임상적 징후
징후 대조군
(덱스트로스 5% 주입)		 아드리아마이신 실시예 Ⅱ의 조성물
진피 병터 이 그룹에서는 어떤 징후도 나타나지 않음


 3차 투여후에 탈모증 병터, 홍반 병터가 나타남 이 그룹에서는 어떤 징후도 나타나지 않음
구토 1차 및 2차 투여에서-2/3
3차 및 4차 투여에서-1/3
설사 2차, 3차 및 4차 투여에서 1/3
그외 식욕부진
체중 :
아드리아마이신 처리된 그룹은 체중 감소를 보였으나, 대조군 및 실시예 Ⅱ의 조성물은 체중 변화가 나타나지 않았다.
혈류역학 파라미터
파라미터 대조군
(덱스트로스 5% 주입)		 아드리아마이신 실시예 Ⅱ의 조성물
혈압 정상 정상 정상
심장박동수 정상 평균 ＋29.17% 증가 정상
혈류속도 정상 평균 -42.12% 감소 정상
체온 투여 동안 및 투여 후에 체온 상승 (임상학적으로 비-유의적)
측정한 혈액학적 파라미터:
→ RBC
→ 전체 WBC 및 특징적인 WBC
→ 헤모글로빈
→ 적혈구용적율 (haematocrit)
→ 평균 혈구 부피
→ 혈소판
상기 측정한 모든 파라미터는 모든 그룹에서 정상 범위내에 있었다.
생화학적 파라미터 - 아드리아마이신 처리 그룹에서 크레아틴 포스포키나아제 및 락테이트 디하이드로게나아제 레벨의 증가가 확인되었으나, 대조군 및 실시예 Ⅱ의 조성물에서는 유의적인 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
간기능 테스트 (LFT) - 아드리아마이신 처리 그룹에서 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 및 전체 빌리루빈 레벨의 증가가 확인되었으나, 대조군 및 실시예 Ⅱ의 조성물에서는 유의적인 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
신장기능 테스트 (KFT) - 아드리아마이신 처리 그룹에서 혈액 유레아 질소 (BUN) 및 크레아틴의 증가가 확인되었으나, 대조군에서는 증가하지 않은 것으로 확인되었다. 실시예 Ⅱ의 조성물을 투여한 동물 그룹은 BUN 및 크레아틴 레벨 모두가 증가하는 것으로 확인되었으나, 그 정도는 아드리아마이신 처리 그룹에 비해 유의적으로 낮았다.
실시예 Ⅵ : "L1210 생쥐 백혈구 및 MCF-7 인간 유방암이 이식된 누드 생쥐에서의 본 발명의 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물"과 "페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물" (캘릭스)의 항종양 활성의 평가
투여물의 제조 : 상기 독소루비신 제형 모두를 멸균된 식염수 (0.9%)로 희석하여 1 ㎎/㎖이 되게 하였다. 적당한 부피의 약물 용액을 체중에 기초하여 다양한 처리 그룹에 투여하여 동물들이 표 9 및 10에 표시된 바와 같은 약물을 투여받도록 하였다.
6주된 암컷 NCr 누드 (nu/nu) 생쥐를 모델 모두에 사용하였다.
실험 동물 사육 및 사용에 대한 지침서 (ILAR publication, 1996, National Academy Press)에 기재된 내용에 따라 동물들을 폴리카보네이트 미코리솔레이터에서 사육하였다. 방을 50% 신선한 공기로 충분히 환기 (시간당 10 공기 이상 변화시킴)시켰다. 12시간 낮/12시간 밤의 광주기로 유지하였다. 실내 온도는 18-26℃로 유지시켰다.
실험 동물은 종양 접종하기 최소한 3일 전에 순응시켰다.
일반적 기술 : L1210 생쥐 백혈병 및 MCF-7 인간 유방암 모델에서 상기에 열거된 리포좀성 제형 모두를 식염수를 투여한 대조군에 대해 각각 두 종류의 농도로 테스트하였다.
L1210 모델
종양 세포 : L1210 생쥐 백혈병 세포주는 ATCC로부터 수득하였으며 표준 인 비트로 세포 증식 방법을 이용해 재분화시켰다. 적절한 첨가물 및 10% 송아지 혈청 (FBS)을 포함하는 배양 미디어를 이용해 상기 세포를 배양하였다. 그리고 난 뒤 배양물을 35 T-225 플라스크에서 배양하여 세포 밀집도가 80-90%가 되게 하였다. 원심분리로 상기 세포를 수득한 뒤 펠렛 형성된 세포를 혈청이 없는 RPMI에 재현탁하여 106 생존 세포/㎖ 농도가 되게 하였다. 25게이지 바늘을 이용하여 0.1 ㎖의 세포 현탁액을 동물에 주입하였다.
그룹 및 투여량 : 각 그룹은 5마리의 동물로 구성된다. 생쥐당 106 종양세포를 복막내로 접종하였다. 리포좀성 제형 모두를 하기 표 9에 나타난 바와 같은 용량으로 1, 5 및 9일 째에 정맥내에 투여하였다. 처리후 30일 동안 상기 동물들을 관찰하고 사망률을 기록하였다.
그룹 번호 수컷/암컷의 수 항목 전체 투여량
(㎎/㎏)		 투여량/주입
(㎎/㎏)		 전체 투여횟수
1 0/5 식염수 NA NA 3
2 0/5 캘릭스 12 4 3
3 0/5 캘릭스 6 2 3
4 0/5 실시예 Ⅱ의
조성물		 12 4 3
5 0/5 실시예 Ⅱ의
조성물		 6 2 3
상기 동물들을 매일 관찰하였으며 주 당 2회씩 체중을 측정하여 기록하였다. 실험하는 기간 동안의 모든 사망률을 기록하였다.
식염수를 투여한 대조군에 대해 각 처리군에서의 평균 생존 시간을 비교함으로써 리포좀성 제형 모두의 항-종양 활성을 평가하였다. 그 결과는 하기와 같이 계산되는 T/C 비율로 표시하였다:
Figure 112011046561750-pat00001
T/C ≥125%는 유의적으로 활성이 있는 것으로 간주된다.
L1210 생쥐 백혈병 모델에 대한 항-종양 활성 결과는 표 3에 나타내었다.
일차 주입 (1일) 후 15 내지 26일의 사망률. 식염수를 투여한 대조군의 평균 생존시간은 16.5일이었다. 약물 처리한 그룹 모두에서 생존시간의 증가가 관찰되었다. 약물 처리한 그룹 모두는 평균 생존 시간 (T/C%)에 있어서 유사한 차이를 나타내었고, 이는 실시예 Ⅱ의 조성물이 L1210 종양 모델에서의 캘릭스 만큼의 효능을 가짐을 나타내어 준다.
MCF-7 모델:
종양 세포 : MCF-7 인간 유방암 세포주는 ATCC로부터 수득하였으며 표준 인 비트로 세포 증식 방법을 이용해 재분화시켰다. 상기 세포를 적절한 첨가물 및 10% FBS를 포함하는 배양 미디어로 배양하였다. 그리고 난 뒤 상기 배양물을 35 T-225 플라스크에서 배양하여 세포 밀집도가 80-90%가 되게 하였다. 원심분리로 세포를 수득한 뒤 펠렛 형성된 세포를 트립신 처리하고 혈청이 없는 RPMI에 재현탁하여 107 생존 세포/㎖ 농도가 되게 하였다. 25게이지 바늘을 이용하여 0.1 ㎖의 세포 현탁액을 동물에 주입하였다.
그룹 및 투여량 : 각 그룹은 5마리의 동물로 구성된다. 접종하기 5일 전에 에스트로겐 펠렛을 생쥐에 이식하였다. 생쥐 당 107 종양 세포를 피하에 접종하였다. 투여한 종양의 크기가 30 내지 100 ㎣에 도달할 때까지 놓아 두었다. 일단 적당한 크기에 도달하면 (접종한 후 5일째), 하기 표 10에 나타난 바와 같은 실험 항목 (article)을 1, 5 및 9일 째에 생쥐의 정맥내에 투여하였다. 처리를 시작한지 30일이 될때까지 일주일에 2회 캘리퍼 (caliper)를 이용하여 종양 크기를 측정하였다.
그룹 번호 수컷/암컷의 수 항목 전체 투여량
(㎎/㎏)		 투여량/주입
(㎎/㎏)		 전체 투여 횟수
1 0/5 식염수 - - -
2 0/5 캘릭스 12 4 3
3 0/5 캘릭스 6 2 3
4 0/5 실시예 Ⅱ의
조성물		 12 4 3
5 0/5 실시예 Ⅱ의
조성물		 6 2 3
동물들을 매일 관찰하고, 매주 2회씩 체중을 측정하였으며, 측정한 체중을 기록하였다. 캘리퍼를 이용하여 각 생쥐의 종양 길이 및 너비를 측정하였으며, 하기의 편장 타원체 (prolate ellipsoid) 부피에 대한 수학식을 이용하여 종양 면적 (㎜ ×㎜)에 대한 대략적인 종양 무게 (㎎)를 계산하였다.
Figure 112011046561750-pat00002
상기 L은 두개의 길이의 측정값이다.
식염수를 투여한 대조군에 대한 실험군의 종양 무게 변화를 비교함으로써 리포좀성 제형 모두의 항-종양 활성을 평가하였다.
종양 무게의 변화는 마지막 평가일 (처리후 30일째)의 그룹 평균 종양 무게로부터 종양 세포를 접종한 지 5일 후의 그룹 평균 종양 무게를 뺌으로써 계산하였다.
υWt = Wt최종 - Wt최초
모든 처리 그룹에 대한 T/C 비율은 다음과 같이 계산하였다:
T/C% = 처리군의 υWt / 처리군의 Wt최초 × 100
T/C ≤20%는 보통 활성을 나타내는 것으로 간주된다. T/C ≤10%는 유의적인 활성이 있는 것으로 간주된다.
MCF-7 인간 유방암 모델에 대한 항-종양 활성은 표 2에 표로 나타내었다.
다양한 동물 그룹에서의 조기 사망
그룹 용량 사망률
대조군 없음 0/5
실시예 Ⅱ의 조성물 6㎎/㎏ 0/5
실시예 Ⅱ의 조성물 12㎎/㎏ 0/5
캘릭스 6㎎/㎏ 2/5
캘릭스 12㎎/㎏ 1/5
대조군의 종양은 실험 기간 동안 계속적으로 성장하여 26일째에는 최대 116.4 ㎎에 도달한 반면, 처리군 생쥐의 종양은 실험 기간 동안 유의적으로 크기가 감소하였다. 실시예 Ⅱ의 조성물 제형을 12 ㎎/㎏ 투여한 그룹에서는 종양이 완벽하게 사라졌으며, 이는 실시예 Ⅱ의 조성물이 MCF-7 인간 유방암에 대해 효과가 있음을 나타내어 준다.
표 11에 나타난 바와 같이 다양한 그룹에서 조기사망이 일부 나타났다. 그러나, 사망의 원인은 종양과는 관련이 없는 것으로 여겨졌다. 가장 큰 종양을 가진 식염수 투여한 대조군에서는 사망이 관찰되지 않았다. 사망한 동물 일부를 부검하였으며, 부검한 동물 모두는 방광이 두꺼워지고 비정상적인 것으로 확인되었다. 실험의 마지막에, 안락사시킨 많은 생쥐도 유사하게 방광이 두꺼워 졌다. 두꺼워진 방광 중의 하나의 조직병리학적 검사에서는 종양 전이의 어떠한 증거도 나타나지 않았다. 에스트로겐화되고, 종양-이식된 누드 생쥐의 미숙 사망은 비뇨생식 질환의 유발 때문이다.
실시예 Ⅶ : A121 인간 난소암을 가진 가슴샘 없는 누드 생쥐에서의 본 발명의 독소루비신 리포좀의 최대 내성 투여량 (MTD)의 평가 및 치료학적 효능의 측정
A121 인간 난소암을 가진 가슴샘 없는 누드 생쥐에서의 본 발명의 독소루비신 리포좀의 최대 내성 투여량 (MTD)의 평가 및 치료학적 효능의 측정 결과는 일반적인 비-리포좀성 제형 (아드리아마이신) 및 페길레이테드 리포좀성 제형 (캘릭스)과 비교하였다.
가슴샘 없는 Ncr-nu/nu 누드 생쥐 [4 생쥐/그룹 (대조군은 10마리)]에 인간 A121 난소암을 트로카 임플란트로 피하에 이식하였다. 전체 46마리를 이 실험에 사용하였다. 동량의 아드리아마이신, 캘릭스 및 실시예 Ⅱ의 조성물을 정맥내로 투여하였다. 종양을 이식한지 5 및 12일 째에 생쥐의 꼬리 혈관을 통해 약물을 정맥내로 투여하였다.
모든 처리군은 우수한 항암 효능을 나타내었다.
투여량 스케쥴은 하기에 나타내었다.
대조군 생쥐 : 대조군 생쥐는 아무 처리도 하지 않았다.
아드리아마이신
12 ㎎/㎏ (6 ㎎/㎏ × 2회 주입)
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
36 ㎎/㎏ (18 ㎎/㎏ × 2회 주입)
캘릭스
12 ㎎/㎏ (6 ㎎/㎏ × 2회 주입)
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
36 ㎎/㎏ (18 ㎎/㎏ × 2회 주입)
실시예 Ⅱ의 조성물
12 ㎎/㎏ (6 ㎎/㎏ × 2회 주입)
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
36 ㎎/㎏ (18 ㎎/㎏ × 2회 주입)
가장 높은 용량 36 ㎎/㎏의 프리 약물 (아드리아마이신 18 ㎎/㎏ × 2)을 투여한 모든 생쥐 및 24 ㎎/㎏의 중간 용량을 투여받은 생쥐 4마리 중의 3마리는 약물 독성으로 인해 사망하였다. 따라서, 아드리아마이신의 최대 내성 투여량 (MTD)은 24 ㎎/㎏ 이하이다.
생쥐는 캘릭스 및 실시예 Ⅱ의 조성물 모두에 대해 내성을 띄었다. 상기 제형 모두는 36 ㎎/㎏에서도 내성이 우수하였다. 그러나, 캘릭스는 실시예 Ⅱ의 조성물에 비해 독성을 더 많이 유발하는 것으로 나타났으며, 고용량 (36 ㎎/㎏)을 투여받은 생쥐에서는 훨씬 많은 체중 감소를 유발하였다.
이 실험은 실시예 Ⅱ의 조성물이 일반적으로 사용가능한 페길레이테드 리포좀성 제형 (캘릭스) 및 일반적인 비-리포좀성 제형 (아드리아마이신)에 비해 우수한 내성을 가짐을 증명해 준다.
실시예 Ⅷ : 복합약물 저항성이고, Pgp 양성인 인간 대장 DLD1 종양을 이종이식받은 가슴샘 없는 누드 생쥐에서의 본 발명의 리포좀성 독소루비신 조성물의 효능 측정
효능을 실험하기 위해 캘릭스 및 아드리아마이신과 함께 실시예 Ⅱ의 조성물을 약물 저항성 (Pgp＋) DLD-1 인간 대장암으로 피하 이식받은 가슴샘 없는 누드 생쥐에 주사하였다.
그룹당 4마리 (대조군은 10마리)의 가슴샘 없는 누드 생쥐에 인간 DLD-1 대장암을 트로카 임플란트로 피하에 이식하였다.
대조군 : 처리하지 않음
아드리아마이신
12 ㎎/㎏ (6 ㎎/㎏ × 2회 주입)
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
캘릭스
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
36 ㎎/㎏ (18 ㎎/㎏ × 2회 주입)
48 ㎎/㎏ (24 ㎎/㎏ × 2회 주입)
실시예 Ⅱ의 조성물
24 ㎎/㎏ (12 ㎎/㎏ × 2회 주입)
36 ㎎/㎏ (18 ㎎/㎏ × 2회 주입)
48 ㎎/㎏ (24 ㎎/㎏ × 2회 주입)
전체 42마리의 동물을 실험에 사용하였다.
결과 :
본 실험에서는 36 ㎎/㎏의 프리 약물을 투여하고 난 뒤 실시예 Ⅶ에서 관찰된 독성을 기초로 하여 아드리아마이신의 투여량을 12 및 24 ㎎/㎏으로 낮추었다. 반대로, 캘릭스 및 실시예 Ⅱ의 조성물의 투여량은 각각의 MTD에서 프리 약물에 대한 이들의 효능 및 독성을 비교함으로써 48 ㎎/㎏으로 증가시켰다. 복합 약물 저항성 및 Pgp 양성의 인간 대장암을 가슴샘 없는 누드 생쥐의 피하에 이종이식하고 난 뒤 5일 및 12일 째에 모든 제제를 꼬리 혈관을 통해 정맥내 투여하였다.
모든 처리군은 항종양 효능을 나타내었다.
그러나, 리포좀성 제형을 투여한 생쥐 모두는 유의적으로 우수한 항종양 효능을 나타내었다. 동량의 프리 약물 투여량 (24 ㎎/㎏)에서, 프리 약물 투여시 10일 째에 평균적으로 종양의 성장이 지연되었으나, 리포좀성 제형을 투여한 모든 생쥐는 40일 째에 종양 크기가 600 nm3 이하였다. 캘릭스 또는 실시예 Ⅱ의 조성물 모두에서는 36 ㎎/㎏의 투여량에서 독성을 나타내지 않았다.
고용량의 (48 ㎎/㎏) 리포좀성 제형 모두에서 (24 ㎎/㎏ ×2회, 캘릭스 또는 실시예 Ⅱ의 조성물), 생쥐는 ＞15%의 체중 감소를 나타내었고, 각 그룹의 4마리 중 1마리는 약물 독성으로 인해 조기 (17일 및 19일 째) 사망하였다. 따라서, 리포좀성 제형 모두의 MTD는 유사하였으며, 48 ㎎/㎏ 이하인 것으로 확인되었다.
아드리아마이신과는 대조적으로, 두개의 리포좀성 제형 [캘릭스-(페길레이테드 독소루비신) 및 실시예 Ⅱ의 조성물 (비-페길레이테드-독소루비신)]은 Pgp 양성 및 복합 약물 저항성의 인간 DLD1 대장암을 가슴샘 없는 누드 생쥐에 피하이식하였을때 유의적인 항종양 효능을 나타내었다. 24 ㎎/㎏의 동량의 투여에서, 리포좀성 제형 모두는 프리 약물에 비해 증가된 효능을 나타내었다. 또한, 리포좀성 제형 모두는 프리 약물에 비해 낮은 독성을 나타내어 훨씬 많은 약물의 투여가 가능하게 하였다. 아드리아마이신에 대한 MTD는 리포좀성 제형 보다 약 절반으로 나타났다. 리포좀성 약물은 36 ㎎/㎏의 투여량에서 우수한 내성을 가졌다.
실시예 Ⅸ 내지 ⅩⅢ
실시예 Ⅸ 내지 ⅩⅢ의 조성물 및 이의 제조방법은 표 12에 나타내었다.
실시예 Ⅸ 실시예 Ⅹ 실시예 ⅩⅠ 실시예 ⅩⅡ 실시예 ⅩⅢ
변화된 파라미터 → 증가된 입자 크기
 낮은 콜레스테롤
 높은 콜레스테롤
 C14 인지질
 일반적인 수화
성분 ↓
DSPC 1.565g 1.565g 1.565g - 1.565g
DMPC - - - 1.565g -
콜레스테롤 0.521g 0.3g 0.74g 0.521g 0.521g
클로로포름 40㎖ 40㎖ 40㎖ 40㎖ 40㎖
수화 미디움 60㎖ 60㎖ 60㎖ 60㎖ 120㎖
평균 입자 크기 0.18㎛ 0.085㎛ 0.095㎛ 0.095㎛ 0.085㎛
히스티딘 완충제 1.7ℓ 1.7ℓ 1.7ℓ 1.7ℓ 1.7ℓ
독소루비신 HCl 330㎎ 330㎎ 330㎎ 330㎎ 330㎎
히스티딘 완충제(약물 용해용) 22㎖ 22㎖ 22㎖ 22㎖ 40㎖
히스티딘 완충제(희석용) 80㎖ 80㎖ 80㎖ 80㎖ -
제조과정 :
실시예 Ⅰ의 제조과정을 실시예 Ⅹ, Ⅸ 및 ⅩⅢ에서 동일하게 실시하였다.
실시예 Ⅸ에서는, 0.15 ㎛ 내지 0.25 ㎛의 평균 크기를 얻기 위해 0.4 μ 내지 0.2 μ의 막을 통해 사출성형시킴으로써 리포좀의 크기를 감소시키는 단계를 수행하는 것을 제외하고는 실시예 Ⅰ의 방법에 따라 실시하였다.
실시예 ⅩⅢ에서는, 수화 부피가 2배인 것을 제외하고는 실시예 Ⅱ의 방법에 따라 실시하였다.
독성학적 실험 결과는 표 13에 나타내었다.
관찰
실시예 Ⅸ 실시예 Ⅹ 실시예 ⅩⅠ 실시예 ⅩⅡ 실시예 ⅩⅢ
변화된 파라미터 → 증가된 입자 크기
 낮은 콜레스테롤
 높은 콜레스테롤
 C14 인지질
 통상적인 수화
결과 ↓
생쥐에서의 T1/2 2시간(Cmax 및 AUC는 비교할 수 없을 정도) 3시간 5시간(Cmax 및 AUC는 비교할 수 없을 정도) 2시간 4시간
생쥐에서의 LD50 12㎎/㎏ 10㎎/㎏ 12㎎/㎏ 10㎎/㎏ 14㎎/㎏
결론(실시예 Ⅰ의 조성물에 대한 참조를 이용) T1/2가 유의적으로 낮음 T1/2가 유의적으로 낮고 독성이 증가 Cmax 및 AUC가 유의적으로 낮음 T1/2, Cmax 및 AUC가 유의적으로 낮음 낮은 T1/2
실시예 ⅩⅣ : 수크로즈를 포함하지 않는 리포좀성 독소루비신 조성물
지질 필름 제조 : 디스테아로일포스파티딜콜린 (1.565 g) 및 콜레스테롤 (0.521 g)을 회전 증발 플라스크에 있는 클로로포름 (40 ㎖)에 순차적으로 용해시켰다. 상기 물질들이 맑은 용액이 형성될 때까지 혼합하였다. 상기 플라스크를 회전 증발기에 연결시켰으며 수조의 온도를 60℃로 맞추었다. 상기 용매를 진공하에서 증발시켜 플라크의 벽에 얇은 지질 필름이 형성되게 하였다. 진공을 느슨하게 한 다음, 질소를 상기 플라스크로 통과시키면서 상기 플라스크를 약 5분 동안 회전시켜, 잔류하는 모든 용매가 건조되어 제거되게 하였다.
수화 : 지질 필름을 액상 수화 미디어 60 ㎖로 수화시켰다. 상기 수화 미디어는 물에 2.04% w/v의 암모늄 설페이트가 녹아있는 것이다. 지질 필름과 수화 미디어를 포함하는 플라스크를 65-68℃의 온도로 유지되는 수조에서 30분 동안 회전시켜 블랭크 리포좀을 제조하였다.
사출성형에 의한 블랭크 리포좀의 크기 감소 : 상기로부터 수득한 리포좀성 현탁액을 0.4 ㎛ 내지 0.05 ㎛의 동공 크기를 갖는 필터로 연속적으로 사출성형시킴으로써 크기분리시켰다.
투석 : pH 6.5의 0.2% w/v 히스티딘 하이드로클로라이드 용액을 이용해 상기 크기 분리된 리포좀 현탁액을 투석하였다. 투석하기 위해 접선방향 플로우 투석 시스템을 사용하였다. 잔류하는 리포좀성 암모늄 설페이트가 제거될 때까지 투석을 계속하였다. 잔류의 리포좀성 미디어 내의 암모늄 설페이트의 부재 여부는 네슬러제를 이용하여 측정하였다.
약물 로딩 : 둥근 바닥 플라스크에, 14 ㎖의 히스티딘 하이드로클로라이드 용액 (상술한)에 216 ㎎의 독소루비신 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써 15 ㎎/㎖의 독소루비신 HCl 용액을 제조하였다. 상기로부터 수득한 크기 분리되고 투석된 리포좀의 측정된 부피 (40 ㎖)를 둥근 바닥 플라스크에 천천히 첨가시켜 준 후 65℃에서 1시간 동안 혼합하였다.
약물이 로딩된 리포좀에 도웩스를 처리하여 포착되지 않은 약물을 제거하였다.
고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여, 도웩스로 처리하기 전 또는 후에 수득한 조성물 샘플의 독소루비신 하이드로클로라이드 함량을 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다:
전체 독소루비신 HCl 함량 (도웩스 처리전) 4.02 ㎎/㎖
포착된 독소루비신 HCl 함량 (도웩스 처리후) 4 ㎎/㎖
히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈 용액 (상술함)을 이용하여, 프리 약물을 제거하고 난 뒤의 독소루비신 하이드로클로라이드 로딩된 리포좀이 2 ㎎/㎖ 농도가 될때까지 희석하였다. 이렇게 수득된 리포좀성 조성물을 멸균된 0.22 ㎛ 막 필터를 이용하여 무균의 비발열성 컨테이너로 여과시켰으며 하기의 파라미터를 분석하였다.
형태 : 붉은색의 투명 액체
pH : 6.3
입자크기 : 평균 입자크기 0.097 ㎛
독소루비신 HCl 함량 : 2.05 ㎎/㎖
박테리아 내독소 : 독소루비신 하이드로클로라이드의 2.2 EU ㎎의 보다 낮음
멸균도 : 무균
이 실시예에서 수득한 조성물의 안정성 실험을 실시하였으며, 관찰결과를 표 16에 나타내었다.
실시예 ⅩⅤ : 120 mM 암모늄 설페이트 용액을 이용한 리포좀성 독소루비신 조성물의 제조방법
지질 필름 제조 : 디스테아로일포스파티딜콜린 (1.565 g) 및 콜레스테롤 (0.521 g)을 회전 증발 플라스크에 있는 클로로포름 (40 ㎖)에 순차적으로 용해시켰다. 상기 물질들이 맑은 용액이 형성될 때까지 혼합하였다. 상기 플라스크를 회전 증발기에 연결시켰으며 수조의 온도를 60℃로 맞추었다. 상기 용매를 감소된 압력하에서 증발시켜 플라크의 벽에 얇은 지질 필름이 형성되게 하였다. 진공을 느슨하게 한 다음, 질소를 상기 플라스크로 통과시키면서 상기 플라스크를 약 5분 동안 회전시켜 잔류하는 모든 용매가 건조되어 제거되게 하였다.
수화 : 상기 지질 필름을 액상 수화 미디어 60 ㎖로 수화시켰다. 상기 액상 수화 미디어는 물에 녹아있는 수크로즈 10% w/v 및 암모늄 설페이트 1.58% w/v로 구성된다. 지질 필름과 수화 미디어를 포함하는 플라스크를 65-68℃의 온도로 유지되는 수조에서 30분 동안 회전시켜 블랭크 리포좀을 제조하였다.
사출성형에 의한 블랭크 리포좀의 크기 감소 : 상기로부터 수득한 리포좀성 현탁액을 0.4 ㎛ 내지 0.05 ㎛의 동공 크기를 갖는 필터로 연속적으로 사출성형시킴으로써 크기분리시켰다.
투석 : 수크로즈-히스티딘 완충 용액을 이용해 상기 크기 분리된 리포좀 현탁액을 투석하였다. 투석하기 위해 접선방향 플로우 투석 시스템을 사용하였다. 잔류하는 리포좀성 암모늄 설페이트가 제거될 때까지 투석을 계속하였다. 잔류하는 리포좀성 미디어 내의 암모늄 설페이트의 부재 여부는 네슬러제를 이용하여 측정하였다. 투석 및 약물 로딩 (하기)에 사용된 히스티딘 하이드로클로라이드 용액은 다음과 같다: 170.0 g의 수크로즈, 3.40 g의 히스티딘 HCl, 1.7 ℓ의 물 및 pH를 6.0 내지 6.5로 적정하기에 충분한 양의 소듐 하이드록사이드.
약물 로딩 : 둥근 바닥 플라스크에서, 14 ㎖의 히스티딘 하이드로클로라이드 용액 (상술한)에 216 ㎎의 독소루비신 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써, 15 ㎎/㎖의 독소루비신 HCl 용액을 제조하였다. 상기로부터 수득한 크기 분리되고 투석된 리포좀의 측정된 부피 (40 ㎖)를 둥근 바닥 플라스크에 천천히 첨가시켜 준 후 65℃에서 1시간 동안 혼합하였다.
약물이 로딩된 리포좀에 도웩스를 처리하여 포착되지 않은 약물을 제거하였다.
고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여, 도웩스로 처리하기 전 또는 후에 수득한 조성물 샘플의 독소루비신 하이드로클로라이드 함량을 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다:
전체 독소루비신 HCl 함량 (도웩스 처리전) 4.11 ㎎/㎖
포착된 독소루비신 HCl 함량 (도웩스 처리후) 4.10 ㎎/㎖
히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈 용액 (상술함)을 이용하여, 프리 약물을 제거하고 난 뒤의 독소루비신 하이드로클로라이드 로딩된 리포좀의 농도가 2 ㎎/㎖이 될 때까지 희석하였다. 이렇게 수득된 리포좀성 조성물을 멸균된 0.22 ㎛ 막 필터를 이용하여 무균의 비발열성 컨테이너로 여과시켰으며 하기의 파라미터를 분석하였다.
형태 : 붉은색의 투명 액체
pH : 6.35
입자크기 : 평균 입자크기 0.09 ㎛
독소루비신 HCl 함량 : 2.03 ㎎/㎖
박테리아 내독소 : 독소루비신 하이드로클로라이드의 2.2 EU ㎎ 보다 낮음
멸균도 : 무균
이 실시예에서 수득한 조성물의 안정성 실험을 실시하였으며, 관찰결과를 표 16에 나타내었다.
실시예 ⅩⅥ : 본 발명의 조성물 (실시예 Ⅱ)과 함께 실시예 ⅩⅣ 및 실시예 ⅩⅤ의 조성물을 상승한 온도 (25℃)에서의 단기간 안정성 시험에 사용하였다.
독소루비신 함량의 결과를 표 16에 나타내었다.

 실시예 Ⅱ의 조성물
(수크로즈 및 155mM 암모늄 설페이트 용액으로 수화됨)		 실시예 ⅩⅣ
(수크로즈를 미포함하는 155mM 암모늄 설페이트 용액으로 수화됨)		 실시예 ⅩⅤ
(수크로즈 및 120mM 암모늄 설페이트 용액으로 수화됨)
포착된것
(㎎/㎖)		 전체
(㎎/㎖)		 포착된것
(㎎/㎖)		 전체
(㎎/㎖)		 포착된것
(㎎/㎖)		 전체
(㎎/㎖)
최초 2.01 2.01 2.05 2.05 2.03 2.03
25℃-1주 2.01 2.01 1.86 2.04 1.84 2.03
이 실험은 수크로즈의 존재가 포착된 독소루비신의 누출을 감소시키는데 필수적이며, 수화 미디어 내에 있는 암모늄 설페이트 농도가 중요함을 나타내어 준다. 120 mM 농도는 캡슐화된 독소루비신의 누출을 유도하므로 이는 만족스럽지 못한 것이다. 그러나, 이 실험을 하는 동안 155 mM 농도의 수크로즈 및 암모늄 설페이트를 포함하는 실시예 Ⅱ의 조성물은 캡슐화된 독소루비신을 누출시키지 않았다.
실시예 ⅩⅦ : 수화 단계 이후에 용매 제거 단계를 거침으로써 리포좀성 독소루비신 조성물의 제조
디스테아로일포스파티딜콜린 (1.565 g) 및 콜레스테롤 (0.521 g)을 에탄올 (20 ㎖)에 순차적으로 용해시켰으며, 가압하에서 일정하게 교반되고 있는 액상 수화 미디어 내로 천천히 펌프하였다. 상기 액상 수화 미디어는 물에 녹아있는 10% w/v의 수크로즈 및 2.04% w/v의 암모늄 설페이트로 구성되어 있다. 용매 에탄올을 포함하는 액체 용액을 회전 증발기 플라스크로 전달시켰다. 상기 플라스크를 회전 증발기에 연결시킨 뒤 수조의 온도를 60℃로 맞추었다. 진공하에서 에탄올을 제거하였다.
사출성형에 의한 블랭크 리포좀의 크기 감소 : 상기로부터 수득한 리포좀성 현탁액을 0.4 ㎛ 내지 0.05 ㎛의 동공 크기를 갖는 필터로 연속적으로 사출성형시킴으로써 크기분리시켰다.
투석 : 히스티딘 완충 용액을 이용해 상기 크기 분리된 리포좀 현탁액을 투석하였다. 투석하기 위해 접선방향 플로우 투석 시스템을 사용하였다. 잔류하는 리포좀성 암모늄 설페이트가 제거될 때까지 투석을 계속하였다. 잔류의 리포좀성 미디어 내의 암모늄 설페이트의 부재 여부는 네슬러제를 이용하여 측정하였다. 투석 및 약물 로딩 (하기)에 사용한 히스티딘 하이드로클로라이드 용액은 다음과 같다: 170.0 g의 수크로즈, 3.40 g의 히스티딘 HCl, 1.7 ℓ의 물 및 pH를 6.0 내지 6.5로 적정하기에 충분한 양의 소듐 하이드록사이드.
약물 로딩 : 둥근 바닥 플라스크에서, 14 ㎖의 히스티딘 하이드로클로라이드 용액 (상술한)에 216 ㎎의 독소루비신 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써 15 ㎎/㎖의 독소루비신 HCl 용액을 제조하였다. 상기로부터 수득한 크기 분리되고 투석된 리포좀의 측정된 부피 (40 ㎖)를 둥근 바닥 플라스크에 천천히 첨가시켜 준 후 65℃에서 1시간 동안 혼합하였다.
약물이 로딩된 리포좀에 도웩스를 처리하여 포착되지 않은 약물을 제거하였다.
히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈 용액 (상술함)을 이용하여, 프리 약물을 제거하고 난 후의 상기 독소루비신 하이드로클로라이드 로딩된 리포좀을 2 ㎎/㎖ 농도가 될때까지 희석하였다. 수득한 리포좀성 조성물을 멸균된 0.22 ㎛ 막 필터를 이용하여 멸균된 비발열성 컨테이터로 무균적으로 여과하였다.
수행한 독성학 및 효능 연구의 요약은 다음과 같다:
실시예 Ⅱ - 본 발명의 독소루비신 하이드로클로라이드를 포함하는 비-페길레이테드 장기간 순환하는 리포좀은 비-리포좀성 독소루비신 하이드로클로라이드 제형 (아드리아마이신) 및 페길레이테드 리포좀성 독소루비신 하이드로클로라이드 제형 (캘릭스)과 비교하여 감소된 독성을 나타내었다. 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 제형의 LD50은 캘릭스와 아드리아마이신에 비하여 높았으며, 이는 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 리포좀이 낮은 독성을 가짐을 증명해 준다.
실시예 Ⅲ - 아급성 독성 실험에서, 아드리아마이신이 독성을 나타내는 것과는 달리 캘릭스 및 실시예 Ⅱ의 조성물에서는 유사한 패턴의 독성이 관찰되었다.
실시예 Ⅳ - 약동학 실험에서, 실시예 Ⅱ의 조성물과 캘릭스는 비교할 만한 혈장 반감기를 나타내었다. 뚜렷한 부피 분포는 정상 조직에 의해 낮은 리포좀성 흡수율로 표시되는 전체 혈액 부피와 거의 동등하였으며 캘릭스와 유사하였다. 아드리아마이신은 빠른 제거율과 높은 분포 부피를 나타내었으며, 이는 정상 조직에서 프리 독소루비신이 흡수됨을 나타내준다.
실시예 Ⅴ - 개 독성 실험에서, 실시예 Ⅱ의 조성물은 아드리아마이신에 비해 내성이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 Ⅵ - L1210 생쥐 백혈병 및 MCF-7 인간 유방암 종양 모델에서, 실시예 Ⅱ의 조성물은 효능이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 Ⅶ - 종양 이식된 생쥐에서, 실시예 Ⅱ의 조성물의 최대 내성 투여량은 아드리아마이신 보다 훨씬 높았다.
실시예 Ⅷ - 복합약물 내성 및 Pgp 양성의 인간 대장 DLD1 종양으로 이종이식한 가슴샘 없는 누드 생쥐에서, 실시예 Ⅱ의 조성물은 효능이 있는 것으로 확인되었다.
상기 실시예는 본 발명의 조성물이 종양의 성장을 감소시키기에 매우 유용함을 명백히 증명해 준다. 본 발명은 치료학적으로 효과적인 용량의 본 발명의 비-페길레이테드 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀을 비경구로 투여하는 것을 포함한다. 비-페길레이테드 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀은 연장된 순환 기간을 가지며 감소된 독성을 나타내고 "수-족 증후군"을 나타내지 않아 종양의 성장을 감소시키는데 유용하다.

Claims (17)

  1. 비경구 투여용의 안정하고 장기간 순환하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물의 제조방법으로서,
    (a) 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 및 콜레스테롤을 포함하는 비-페길레이테드 지질을 단일 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키는 단계;
    (b) 암모늄 설페이트 및 수크로즈를 포함하는 액상 수화 미디어를 각 DSPC m㏖ 당 10 ㎖ 내지 35 ㎖의 양으로 첨가하여 지질을 수화시키는 단계를 수행하기 전 또는 후에 상기 용매를 제거함으로써 리포좀성 조성물내에 리포좀을 제조하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 마지막에 수득한 리포좀성 조성물 내에 있는 리포좀이 약 0.060 ㎛ 내지 0.16 ㎛의 크기가 되도록 크기를 분리(sizing)하는 단계;
    (d) 히스티딘 하이드로클로라이드 및 수크로즈를 포함하는 수크로즈-히스티딘 완충용액을 이용하여 상기 단계 (c)에서 크기 분리 단계를 거친 리포좀성 조성물로부터 잔류하는 리포좀성 암모늄 설페이트를 제거하는 단계;
    (e) 상기 수크로즈-히스티딘 완충용액에 독소루비신 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써 최소한 25 mM 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드 용액을 수득하는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)에서 수득한 독소루비신 하이드로클로라이드 용액과 상기 단계 (d)의 마지막에 수득한 리포좀성 조성물을 혼합함으로써 독소루비신 하이드로클로라이드가 로딩된 리포좀성 조성물을 수득하는 단계;
    (g) 접선방향 (tangential) 플로우 투석방법, 컬럼 크로마토그래피 및 레진을 이용한 처리 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법을 이용해 리포좀성 조성물로부터 잔류하는 리포좀성 독소루비신 하이드로클로라이드를 제거하는 단계;
    (h) 상기 단계 (g)의 마지막에 수득한 상기 리포좀성 조성물의 부피를 상기 수크로즈-히스티딘 완충용액으로 채움으로써 요구되는 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드의 리포좀성 조성물을 수득하는 단계; 및
    (i) 상기 리포좀성 조성물을 0.2 μ 멸균 등급 필터를 통해 멸균 컨테이너로 통과시킴으로써 상기 리포좀성 독소루비신 조성물을 수득하는 단계
    를 포함하는 비-페길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 액상 수화 미디어 내에 있는 암모늄 설페이트의 농도는 리터당 125 mM 이상인 것인 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 사용한 수크로즈-히스티딘 완충용액 중의 수크로즈 대 히스티딘 하이드로클로라이드의 몰비는 29:0.1 내지 29:10인 것인 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 수크로즈-히스티딘 완충용액 중의 수크로즈 대 히스티딘 하이드로클로라이드의 몰비는 29:1인 것인 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 독소루비신 하이드로클로라이드 농도는 1 mM 내지 10 mM인 것인 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 독소루비신 하이드로클로라이드 농도는 약 3.45 mM인 것인 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 디스테아로일포스파티딜 콜린 대 콜레스테롤의 몰비는 1:0.6 내지 1:0.8인 것인 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 디스테아로일포스파티딜 콜린 대 콜레스테롤의 몰비는 약 1:0.7인 것인 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 독소루비신 하이드로클로라이드 대 디스테아로일포스파티딜 콜린의 몰비는 1:2 내지 1:15인 것인 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 독소루비신 하이드로클로라이드 대 디스테아로일포스파티딜 콜린의 몰비는 약 1:3.5인 것인 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 수크로즈 농도는 0.1 M 내지 0.5 M인 것인 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 수크로즈 농도는 0.25 M 내지 0.3 M인 것인 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 히스티딘 하이드로클로라이드 농도는 1 mM 내지 100 mM인 것인 제조방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 히스티딘 하이드로클로라이드 농도는 8 mM 내지 12 mM인 것인 제조방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 히스티딘 하이드로클로라이드 농도는 약 10 mM인 것인 제조방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 내에서의 순환 반감 시간 (t1/2)이 스위스 알비노 생쥐에서 동량으로 테스트했을 때 아드리아마이신보다 최소한 25배 이상 긴 것인 제조방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항의 제조방법으로 획득되는 비경구 투여용의 안정하고 장기간 순환하는 비-퍼길레이테드 리포좀성 독소루비신 조성물.
KR1020117014172A 2002-12-31 2003-12-31 장기간 순환성 비-페길레이테드 리포좀을 함유하는 조성물 및 그의 제조방법 KR101171045B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN1101MU2002 2002-12-31
IN1101/MUM/02 2002-12-31
PCT/IN2003/000424 WO2004058140A2 (en) 2002-12-31 2003-12-31 Non-pegylated long-circulating liposomes

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057012107A Division KR101133084B1 (ko) 2002-12-31 2003-12-31 장기간 순환성 비-페길레이티드 리포좀

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110075051A KR20110075051A (ko) 2011-07-05
KR101171045B1 true KR101171045B1 (ko) 2012-08-03

Family

ID=32500467

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057012107A KR101133084B1 (ko) 2002-12-31 2003-12-31 장기간 순환성 비-페길레이티드 리포좀
KR1020117014172A KR101171045B1 (ko) 2002-12-31 2003-12-31 장기간 순환성 비-페길레이테드 리포좀을 함유하는 조성물 및 그의 제조방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057012107A KR101133084B1 (ko) 2002-12-31 2003-12-31 장기간 순환성 비-페길레이티드 리포좀

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1435231B8 (ko)
JP (1) JP5355842B2 (ko)
KR (2) KR101133084B1 (ko)
CN (1) CN1756533B (ko)
AT (1) ATE453381T1 (ko)
AU (1) AU2003303368B2 (ko)
BR (1) BR0317882A (ko)
CA (1) CA2511464C (ko)
DE (1) DE60330745D1 (ko)
DK (1) DK1435231T3 (ko)
EA (1) EA008930B1 (ko)
ES (1) ES2337563T3 (ko)
HK (1) HK1089946A1 (ko)
IL (1) IL169364A (ko)
MX (1) MXPA05007102A (ko)
NZ (1) NZ540778A (ko)
PT (1) PT1435231E (ko)
WO (1) WO2004058140A2 (ko)
ZA (1) ZA200504850B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5634862B2 (ja) * 2007-05-16 2014-12-03 カーテーベー トゥモーアフォルシュングス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 低粘度アントラサイクリン製剤
DK2415470T3 (en) 2009-03-30 2016-09-19 Eisai R&D Man Co Ltd liposome
JP5622719B2 (ja) 2009-03-30 2014-11-12 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 リポソーム組成物の製造方法
EP2680820B1 (en) * 2011-03-01 2022-11-02 2-BBB Medicines B.V. Advanced active liposomal loading of poorly water-soluble substances
KR20190062485A (ko) * 2016-09-27 2019-06-05 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 Dna-손상제 및 dna-pk 저해제의 조합을 사용한 암 치료 방법
US11083705B2 (en) 2019-07-26 2021-08-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating tumor
CN116570775A (zh) * 2023-05-16 2023-08-11 万瑞飞鸿(北京)医疗器材有限公司 一种药物涂层、血管支架及其制备方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
WO1985000968A1 (en) * 1983-09-06 1985-03-14 Health Research, Inc. Liposome delivery method for decreasing the toxicity of an antitumor drug
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
CA1270198C (en) * 1984-08-08 1990-06-12 Marcel B Bally ENCAPSULATION OF ANTINEOPLASTIC AGENTS IN LIPOSONES
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA1338702C (en) * 1987-03-05 1996-11-12 Lawrence D. Mayer High drug:lipid formulations of liposomal- antineoplastic agents
JPH0720857B2 (ja) 1988-08-11 1995-03-08 テルモ株式会社 リポソームおよびその製法
IL91664A (en) * 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
US6132763A (en) 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
AU714992B2 (en) * 1996-08-23 2000-01-13 Alza Corporation Liposomes containing a cisplatin compound
BR9914601A (pt) * 1998-09-16 2001-10-23 Alza Corp Inibidor de topoisomerase capturado por lipossoma
KR20000061075A (ko) * 1999-03-23 2000-10-16 린 중친 리포솜의 응집을 방지하기 위한 방법 및 조성물
GB0111279D0 (en) * 2001-05-10 2001-06-27 Nycomed Imaging As Radiolabelled liposomes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1435231B1 (en) 2009-12-30
WO2004058140B1 (en) 2004-12-16
BR0317882A (pt) 2005-12-13
CA2511464C (en) 2011-08-23
ZA200504850B (en) 2006-08-30
AU2003303368B2 (en) 2010-06-17
ATE453381T1 (de) 2010-01-15
JP2006513189A (ja) 2006-04-20
KR20110075051A (ko) 2011-07-05
EA008930B1 (ru) 2007-08-31
CA2511464A1 (en) 2004-07-15
AU2003303368A1 (en) 2004-07-22
DE60330745D1 (de) 2010-02-11
MXPA05007102A (es) 2005-08-26
HK1089946A1 (en) 2006-12-15
WO2004058140A3 (en) 2004-10-28
DK1435231T3 (da) 2010-04-26
PT1435231E (pt) 2010-04-08
NZ540778A (en) 2008-04-30
ES2337563T3 (es) 2010-04-27
CN1756533B (zh) 2010-06-16
JP5355842B2 (ja) 2013-11-27
CN1756533A (zh) 2006-04-05
EP1435231B8 (en) 2010-03-03
WO2004058140A2 (en) 2004-07-15
IL169364A (en) 2012-05-31
EA200500850A1 (ru) 2006-02-24
KR20050088233A (ko) 2005-09-02
KR101133084B1 (ko) 2012-04-04
EP1435231A1 (en) 2004-07-07
IL169364A0 (en) 2007-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9005655B2 (en) Non-pegylated long-circulating liposomes
Harrington et al. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer. Part 1: preclinical development
EP1731172B1 (en) Liposome preparation
JPH0526767B2 (ko)
JP2008534525A (ja) リン脂質のポリエチレングリコール誘導体に包み込まれたアンスラサイクリン系抗腫瘍抗生物質のナノミセル製剤
US5560923A (en) Method of encapsulating anthracycline in liposomes
EP3138557B1 (en) Liposome composition and method for producing same
IL169364A (en) A process for the production of liposomes that have not undergone pegylation involves an aqueous hydration medium with sugar
KR100243933B1 (ko) 과량의 음전하를 지니는 리포솜
US11951118B2 (en) Preparation of preliposomal annamycin lyophilizate
KR100979462B1 (ko) 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜 및 이의제조방법
CN105616354A (zh) 一种新藤黄酸脂质体注射剂及其制备方法
CN110496103B (zh) 一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法
KR100768265B1 (ko) 혈액내 순환시간을 향상시키기 위한 헤파린이 수식된리포솜 및 이의 제조방법
EP1089727B1 (en) Liposomal formulations of busulphan
GS et al. Enhanced Tumor Targeting and Antitumor Activity of Gemcitabine Encapsulated Stealth Liposomes

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150730

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee