CN1756533B - 非聚乙二醇化的长期循环的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于肠胃外施用的长期循环的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物及其制备方法。它在swiss白化小鼠体内的循环时间至少比常规非脂质体组合物长25倍。所述非聚乙二醇化的脂质体是稳定的，具有低毒性，并且业已发现在不同的肿瘤模型中是有效的。

Description

非聚乙二醇化的长期循环的脂质体
发明领域
本发明涉及用于肠胃外施用的非聚乙二醇化的、长期循环的脂质体以及它的生产，它可用于包含并且送递诊断剂或治疗剂。
发明背景
脂质体通常由磷脂和/或固醇组成，并且由基于环绕含水腔室的脂双层的囊状结构组成。它们的物理化学特性有很大的不同，如大小，表面电荷和磷脂组成。
作为诊断剂或治疗剂的可能的载体，脂质体受到越来越多的关注。例如，业已将脂质体用于送递诊断剂，如用于磁成像的造影剂如Gd：二亚乙基三胺五乙酸螯合物(Gd-DTPA)(例如，参见美国专利号6,132,763)和治疗剂，如蒽环霉素试剂，业已证实它具有对多种肿瘤的显著的活性。(例如，参见美国专利号4,769,250)。
不过，脂质体在血液中通过它们与各种血浆蛋白的相互作用会导致聚合，并且被网状内皮系统(RES)捕获。例如，肝脏中的肝巨噬细胞或脾脏中的固定的巨噬细胞在脂质体达到预期的目标之前会吸收它们。被RES捕获使得将脂质体选择性地送递到目标组织或细胞变得非常困难。
除了被RES捕获之外，脂质体还会遇到与血浆蛋白的静电，疏水性和范德瓦耳斯相互作用。这些相互作用导致了脂质体的去稳定化，导致小泡通常在达到它们的目标之前从循环系统中被快速清除。
另外，除了脂质体与细胞或蛋白相互作用之外，在生产包含某些药物的脂质体方面业已产生了困难，这是因为所述药物与脂质体的磷脂的相互作用。例如，蒽环霉素业已表现出对磷脂小泡双层的表面活性剂或去污剂样作用，它会导致泄漏并且产生脂质体小泡不稳定性。因此，对循环环境和/或它的内含物不稳定的脂质体会在到达肿瘤位点之前过早泄漏抗肿瘤剂。由于产生“泄漏”脂质体，并且产生破坏性毒性的结果，科学家业已尝试了开发能够外渗到肿瘤位点的长期循环的脂质体，所述位点天然是高度血管化的。
由于大部分常用的抗癌药物并非只专门针对肿瘤细胞有毒性，而是对它们所接触到的所有组织都有毒性，所以它们与正常组织的相互作用产生了不希望的副作用。例如，盐酸阿霉素是用于癌症化疗的最常用的细胞毒性蒽环霉素抗生素之一，并且业已证实对多种肿瘤具有活性。盐酸阿霉素在治疗多种实体瘤和白血病方面是有效的。它在治疗与多疗法相关的乳腺癌方面是特别有效的。盐酸阿霉素是用于治疗与艾滋病相关的卡波西肉瘤的常规方法。盐酸阿霉素对卵巢，肺，睾九，前列腺，子宫颈，头部和颈部肿瘤，雌激素肉瘤和尤因肉瘤的各种肿瘤具有显著活性。
盐酸阿霉素的常见组合物以冷冻干燥的产品形式提供或作为溶解在水中的盐酸阿霉素溶液提供。冷冻干燥的产品在施用之前需要用水重建以便注射。这两种上市的产品在通过静脉内途径施用时与多种毒性相关。严重的骨髓抑制作用通常是剂量限制因素。其他毒性包括恶心和呕吐，脱毛，粘膜炎(包括口炎和食管炎)以及心脏毒性，它们制约了盐酸阿霉素的使用。盐酸阿霉素是有效的起疱剂，它可能导致在注射位点或在接触皮肤的任何位点的外渗和坏死。“阿霉素发红(flare)”是常见的现象，并且以位于注射位点的红斑条纹为特征。“阿霉素发红”通常在半小时之后消失。
盐酸阿霉素的作用机制尚未确切了解，不过，业已研究并且描述了多种可能性。主要机制涉及盐酸阿霉素插入DNA的能力。DNA的完整性受到了显著损害，并且通常导致改变的DNA功能。由于盐酸阿霉素与DNA的相互作用，所以单链和双链妨碍也是常见的。盐酸阿霉素的另一种机制涉及它的产生能诱导DNA和细胞膜破坏的自由基的能力。盐酸阿霉素还能抑制拓扑异构酶II，使得DNA的复制效率低。
盐酸阿霉素所产生的某些毒性作用包括心脏毒性，过敏反应，催吐性(emetogenicity)，骨髓抑制，muccocytis，皮肤毒性，脱毛，以及对注射位点的毒性(Cancer Investigation，19(4)：424-436(2001))。理论上讲，延长的循环系统(缓慢释放)能向肿瘤和肿瘤细胞附近有效送递和释放药物，是更为有利的。因此，需要能够对诸如盐酸阿霉素的试剂进行被囊化的稳定的脂质体，它不会将它们的内含物过早释放到健康的或非癌组织中。
采取了若干途径，以便增加脂质体的循环时间，并且从而确保脂质体内含物向目标组织的送递；包括以下措施：采用唾液酸残基涂层掩盖脂质体使其不能被网状内皮系统识别(美国专利号4,501,728)；用鞘磷脂或中性磷脂硬化(rigidify)脂质体膜，它们主要具有含有5-20％醣脂的饱和酰基链(美国专利号4,920,016)；形成药物与脂类比例比传统脂质体制剂高出3-80倍的脂质体，所述传统脂质体制剂是在试剂，双层和含有柠檬酸的释放抑制缓冲液的3区室系统中的(美国专利号6,083,530)；将胆固醇掺入脂质体(Alberto A.Gabizon，CancerInvestigation，19(4)424-436(2001))；和用聚乙二醇对磷脂进行衍生化(聚乙二醇化的脂质体)(美国专利号5013556和6132763)。
不幸的是，以上方法在延长脂质体在体内的循环时间方面只表现出有限的潜力。例如，业已确定了用唾液酸掩盖脂质体只具有延长脂质体在体内的循环半衰期的有限的能力(美国专利号4,920,016)。为了克服这些问题，科学家业已用诸如聚乙二醇(PEG)的亲水性聚合物对脂质体表面进行了涂覆，以便防止各种血浆蛋白吸附到脂质体表面上。(参见，例如，美国专利号5,013,556，和美国专利号5,676,971。)所述聚乙二醇化的脂质体业已被称作空间稳定化的脂质体或秘密脂质体(stealthliposome)。聚乙二醇化的脂质体似乎能减弱由于释放它们的内含物所导致的某些毒性作用，不过，不幸的是，由于聚乙二醇的存在，出现了新的毒性作用。例如，含有聚乙二醇化的磷脂的脂质体制剂业已导致了皮肤毒性，即一般被称为“手足综合征”，它导致了手掌和脚底的疹/渍疡(Kenneth B.Gordon，Cancer，Vol.75(8)，1995，2169-2173)。
使用聚乙二醇化的脂质体的另一个缺点是，大分子(PEG)在脂质体表面上的存在，可能减弱脂质体与细胞的相互作用，并且妨碍脂质体进入肿瘤组织，因此可能减少脂质体药物在肿瘤组织中的积累(ClinicalCancer Research，(5)，1999，3645-3652)。
因此，仍然需要不会导致诸如“手足综合征”的有害作用的，稳定的，长期循环的脂质体，以及生产这种脂质体和基于所述脂质体的组合物的方法。本发明满足了这一需求，并且提供通过施用本发明的脂质体治疗各种状况的方法。
因此，本发明的主要目的是开发脂质体阿霉素组合物，它具有长的循环时间，并且不会产生手足综合征。本发明的另一个目的是减弱与施用阿霉素相关的毒性和其他不利作用，如恶心，呕吐和脱毛。本发明的另一个目的是开发能支持诸如阿霉素的抗肿瘤剂的组合物的脂质体。
发明概述
本发明提供了用于生产长期循环的非聚乙二醇化的脂质体的方法，包括：
通过从包含一种或多种磷脂、固醇和溶剂的脂类溶液中蒸发溶剂来形成脂类膜，用含水水合介质水合所得到的脂类膜，以形成非聚乙二醇化的脂质体；其中所使用的含水水合介质的量为在每毫摩尔存在于脂类溶液中的磷脂使用10-35ml。
所使用的含水水合介质的量优选为每毫摩尔所述脂类溶液中的磷脂使用30ml。
本发明还提供了用于生产长期循环的非聚乙二醇化的分级脂质体的方法，包括将一种或多种磷脂和固醇溶解在溶剂或溶剂的混合物中；在通过添加含水水合介质水合所述磷脂之前或之后除去所述溶剂，以便形成非聚乙二醇化的脂质体；其中，所使用的含水水合介质的量为每毫摩尔所述脂类溶液中的磷脂使用10-35ml；将所述非聚乙二醇化的脂质体分级为大约0.06μm-0.16μm，以便形成脂质体组合物；并用蔗糖-组氨酸缓冲溶液从所述脂质体组合物中除去脂质体外(extraliposomal)水合盐，以便形成非聚乙二醇化的分级脂质体。
所述用于生产非聚乙二醇化的脂质体的方法还可以包括用治疗剂或诊断剂加载所述脂质体。治疗剂优选是抗肿瘤试剂，如盐酸阿霉素，盐酸柔红霉素和盐酸表阿霉素。盐酸阿霉素是更优选的。
优选的是磷脂与固醇的摩尔比为大约1∶0.1-1∶2，更优选大约1∶0.7。
优选的含水水合介质包括硫酸铵和蔗糖，且在所述含水水合介质中硫酸铵的浓度不低于125毫摩尔/升。
优选的磷脂的相变温度为大约40℃-60℃，其脂肪酸链具有最少十六个碳，并且选自下列一组：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和这些磷脂的衍生物。优选的磷脂是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)并且优选的固醇是胆固醇。
所述方法可能还包括对非聚乙二醇化的脂质体进行分级。优选通过孔径为0.4μm-0.05μm的过滤器连续挤压对它们进行分级。
本发明的另一种实施方案提供了可以通过本文所描述的方法获得的脂质体。
所述脂质体包括在它们的生产方法中所述比例的成分，并且所获得的脂质体的平均大小为0.06μm-0.16μm。
本发明还提供了用于肠胃外施用的长期循环的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物，其包括非聚乙二醇化的阿霉素非聚乙二醇化脂质体，盐酸组氨酸和蔗糖；
其中，所述的阿霉素非聚乙二醇化脂质体除盐酸阿霉素外包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、蔗糖；其中，脂质体的平均大小为0.06-0.160μm；和
其中，当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，所述非聚乙二醇化的阿霉素脂质体在血液中的循环时间为用ADRIAMYCIN获得的时间的至少25倍。
被囊化在脂质体中的盐酸阿霉素浓度为1-10mM，优选为3mM-7mM，更优选为6.9mM，最优选为3.45mM。
二硬脂酰磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比为1∶0.6-1∶0.8；优选为1∶0.7。
盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2-1∶15，更优选为1∶3.5。
蔗糖浓度优选为0.1M-0.5M，更优选0.25M-0.3M。
盐酸组氨酸的浓度为1mM-100mM，优选8-12mM，更优选大约10mM。
脂质体的优选的平均大小为0.08μm-0.12μm。
示例性的组合物是以2mg/ml存在的盐酸阿霉素；并且阿霉素与磷脂的摩尔比大约为1∶3.5；并且磷脂与胆固醇的比例大约为1∶0.7。
另一种示例性的组合物是以4mg/ml存在的盐酸阿霉素，并且阿霉素与磷脂的摩尔比大约为1∶3.5，而磷脂与胆固醇的比例大约为1∶0.7。当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，该组合物在血液中的循环时间(t1/2)优选为用ADRIAMYCIN获得的时间的40倍。
本发明还提供了用于减弱肿瘤生长的方法，包括施用本发明的组合物。
本发明还提供了用于生产长期循环的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法。
本发明的组合物是新的，并且迄今为止没有报导过。
发明详述
本发明提供了稳定的，长期循环的非聚乙二醇化的脂质体，以及它的生产方法。聚乙二醇化的脂质体是用聚乙二醇(PEG)涂覆的脂质体。在脂质体的表面上装饰有数千个PEG链，该过程被称为“聚乙二醇化”。所述PEG链使得脂质体的表面“多毛(hairy)”，并且由此抑制了脂质体向血蛋白表面的快速吸收。这种快速吸收加快了脂质体从血液中快速除去。相反，聚乙二醇化的脂质体是受到保护的，并且以更缓慢的速度从血液中除去。与没有用PEG制备的脂质体相比，聚乙二醇化的脂质体更稳定，并且更少被网状内皮系统(RES)的细胞吸收，并且在循环时任何被囊化的试剂或药物发生泄漏的倾向较小。例如，与非聚乙二醇化的脂质体阿霉素或游离的阿霉素相比，包有阿霉素的PEG-脂质体的药物代谢动力学以长期循环的半衰期，缓慢的血浆清除和较小的分布体积为特征。聚乙二醇化的脂质体的长期循环和通过肿瘤脉管系统外渗的能力导致了阿霉素定位于肿瘤组织中，增加了肿瘤反应增加的可能性，这是因为特别是在高度血管生成的肿瘤中增加了药物的积累。同样，与常规脂质体相比聚乙二醇化的脂质体的较高的稳定性导致了药物在敏感器官的组织的可利用性，并因此减少了毒性和其他不利作用，如恶心，呕吐和脱毛。不过，业已报导了在临床使用聚乙二醇化的脂质体时产生的被称作“手足综合征”的严重的副作用，其中，在手掌和脚底上观察到了疹或渍疡(Kenneth B.Gordon，Cancer，Vol.75(8)，1995，2169-2173)。聚乙二醇化的脂质体的另一个缺点是，大分子(PEG)在脂质体表面上的出现，可能减弱脂质体与细胞的相互作用，并且妨碍脂质体进入肿瘤组织，从而有可能减少脂质体药物在肿瘤组织中的积累。
本发明的方法提供了稳定的，长期循环的，低毒性非聚乙二醇化的脂质体，它展示聚乙二醇化的脂质体的稳定性，具有如上文所述的长的循环半衰期和减弱了的毒性。不过，由于本发明的脂质体不需要使用PEG来获得上述结果，所以它们不会导致“手足综合征”。
在本发明的方法中，脂质体的水合是在蒸发用于溶解脂类的溶剂之前或之后进行的。适合本发明的溶剂是有机溶剂，磷脂能够溶解在它里面。本领域技术人员可以理解在生产脂质体时常用的和合适的溶剂。示例性的合适溶剂包括，但不局限于，三氯甲烷，二氯甲烷，乙醇，甲醇，丙酮。
当脂类的水合是在溶剂蒸发之后进行时，诸如三氯甲烷、二氯甲烷的溶剂是优选的溶剂。
当脂类的水合是在溶剂蒸发之前进行时，诸如乙醇，甲醇，丙酮的水可混溶溶剂是优选的溶剂。
当水合是在溶剂蒸发之后进行时，所述方法包括通过从包括一种或多种磷脂，固醇和溶剂或溶剂的混合物的脂类溶液中蒸发溶剂形成脂类膜。
溶剂蒸发可以通过任何蒸发技术完成，如，但不局限于，通过让惰性气体流从溶液上面通过，通过加热，通过真空，或通过在真空下加热来进行蒸发。通常，采用旋转式蒸发器烧瓶。
当水合是在溶剂蒸发之前进行时，所述方法包括从含有溶剂的含水脂质体悬浮液中蒸发所述溶剂。所述溶剂的蒸发可以通过任何蒸发技术实现，例如，但不局限于，通过让惰性气体流从溶液上面通过，通过加热，通过真空，或通过在真空下加热来进行蒸发。通常，采用旋转式蒸发器烧瓶。在将溶剂或溶剂混合物蒸发之后，只留下含水悬浮液形式的脂质体。
适合制备脂质体的任何磷脂都可用于本发明中。合适的磷脂包括倾向于降低脂质体膜的通透性的磷脂。含有具有长的脂肪酸链的磷脂的脂质体更为适合，并且会导致该试剂比由具有较短的脂肪酸链的磷脂组成的脂质体更缓慢的释放。随着脂肪酸的碳链长度的增加，相变温度也会提高。由具有较高相变温度的磷脂组成的脂质体比由较低相变磷脂组成的脂质体更缓慢地释放它们的内含物。较高的相变温度使得能够缓慢地从脂质体的内部释放内含物到血流中，因为磷脂膜是半透性的。影响膜通透性和稳定性的其他磷脂特征包括饱和度和电荷。
本发明的脂质体优选包括中性脂类，优选相变温度为40℃-65℃，更优选约50℃-54℃的中性脂类。优选的磷脂具有至少十六个碳的脂肪酸链。
本发明的合适的磷脂包括，但不局限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或所述磷脂的衍生物。磷脂酰胆碱是优选的中性脂类。优选的磷脂是1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，它通常被称作二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。DSPC的分子量为790，并且它的分子式为C44H88NO8P。
将固醇与磷脂一起掺入脂质体中，以便改变脂质体膜的刚性和通透性。示例性的固醇是胆固醇及其衍生物或类似物。胆固醇倾向于提高脂质体膜的刚性和降低通透性。胆固醇是两亲性分子，并且将它自身插入磷脂膜中，使它的羟基朝向含水的表面。胆固醇的掺入浓度能为脂质体膜提供最佳通透性，不过还能保持所述膜的刚性。磷脂与胆固醇的比例的选择决定了内容物从脂质体中分离的速度。本发明脂质体的磷脂与固醇的摩尔比为1∶0.1-1∶2。优选为1∶0.5-1∶1.5。磷脂与固醇的优选摩尔比在二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)是磷脂，而胆固醇是固醇时为1∶0.6-1∶0.8。优选的摩尔比为大约1∶0.7。
溶剂或溶剂的混合物是在真空条件下蒸发的。当水合是在除去溶剂之后进行时，所形成的脂类膜是用含水水合介质水合的，以便形成脂质体。通过搅拌或者在混合条件下将含水水合介质添加到所述膜中，以便使所述脂类膜水合，并且形成脂质体。本领域技术人员可以理解适合使用的含水水合介质。优选的含水水合介质包括缓冲液/盐，以便随后过程中能够建立化学梯度，以有助于将各种试剂加载到脂质体中。示例性的水合介质包括，但不局限于，氢氧化铵，硫酸铵，碳酸铵和碳酸氢铵。优选的含水水合介质包括硫酸铵。同样，所述含水水合介质包括等渗剂，如，但不局限于蔗糖，氯化钠，葡萄糖或甘露糖醇。所述等渗剂优选是与该溶液的其他成分和脂质体本身不起反应的。等渗剂优选是蔗糖，因为它是反应性最低的。当含水水合介质包括硫酸铵时，所述等渗剂优选是蔗糖。蔗糖有助于保护并且硬化脂质体膜，并且还能保持脂质体组合物的等渗性。
与用于常规脂质体和聚乙二醇化的脂质体生产的水合介质的量相比，所述含水水合介质的体积是受控制的/减少的。通过减少含水水合介质的体积，所述磷脂能够更紧密地堆积在一起，形成较厚的脂质体膜或“壳”。所述较厚的“壳”提供了稳定的、长期循环的缓慢释放，并且降低了所述脂质体内容物的毒性，而不需要PEG。所使用的水合介质的体积越小，所述磷脂就越紧密地堆积在一起，且所述壳就越厚。“受控制的/减少的”表示用于本发明的含水水合介质的体积低于以前公知的或认可的含水水合介质的量。使用优选的减少体积的水合介质(即每毫摩尔磷脂30ml)，和优选浓度的胆固醇，所得到的脂质体组合物将具有刚性磷脂双层。
这种水合体积的减少还可以根据在脂类溶液中每摩尔磷脂所使用的缓冲液的体积的比例来观察。在本发明中，含水水合介质的用量范围为每毫摩尔脂类溶液中的磷脂使用10-35ml。含水水合介质的体积优选为每毫摩尔脂类溶液中的磷脂使用20-30ml。更优选的是，含水水合介质的体积为每毫摩尔脂类溶液中的磷脂使用30ml。
对脂质体进行适当地分级。本领域技术人员理解脂质体分级的公知方法。在压力下进行匀浆是所述方法之一。另一种合适的方法包括通过孔径与所需脂质体大小吻合的过滤器挤压所述脂质体。由于本发明的脂质体具有紧凑的层叠膜，分级倾向于比常规脂质体更为困难。因此，优选通过一系列具有逐渐变小的孔径的过滤器进行分级。例如，在水合之后，首先让脂质体通过孔径为0.40μm的过滤器，然后连续通过孔径为约0.05μm的更小孔径的过滤器。所得到的脂质体的平均大小为0.06μm-0.2μm。优选的平均大小为0.08μm-0.12μm。
除去水合介质中的脂质体外盐，或者从脂质体中洗掉。使用透析介质的透析方法是除去脂质体外水合介质盐的示例性方法。可以将任何合适的缓冲溶液用于透析。除去存在于脂质体组合物中的脂质体外盐，产生了跨越脂质体膜的从内到外的化学梯度，它随后被用于加载所述脂质体。用于除去脂质体外盐的其他合适方法包括超滤或柱层析。
本发明的脂质体提供了用于治疗剂或诊断剂的长期循环的，缓慢释放的送递机制。任何已知方法都可用于用需要的治疗剂或诊断剂加载脂质体。示例性的方法包括在对脂类膜进行水合之前将所述试剂添加到脂类膜中，通过pH梯度，或通过化学梯度，将所述试剂直接掺入水合介质。优选方法涉及用化学梯度加载试剂。在通过主动加载方法加载所述脂质体时，在高于或等于磷脂的相变温度的温度下将药物溶液与空白脂质体悬浮液混合。
使用化学梯度，可方便地控制试剂的用量，并且一旦将试剂加载到脂质体内，向脂质体外介质中泄漏就是最小的。另外，如果在水合步骤中使用包括缓冲液/盐的水合介质的话，那么在除去上述脂质体外水合介质盐之后，生成这种梯度变得非常可行。可用于制备化学梯度的一种这样的示例性的水合介质含有硫酸铵，所述化学梯度可用于脂质体加载。不过，用硫酸铵溶液进行的水合使得与氯化钠等渗(参见美国专利5,316,771)，这导致脂质体在储存时泄漏。脂质体组合物的游离药物内容物在储存时增加，反过来又增加了毒性。因此，有必要强化脂质体膜。因此，本发明提供了等渗剂的同时使用，这种等渗剂不会与该溶液中的其他成分和水合介质中的脂质体本身起反应。优选的等渗剂是蔗糖。业已发现使用蔗糖对脂质体膜具有保护作用。蔗糖有助于保护并且硬化脂质体膜，并且还能保持脂质体组合物的等渗性。在冷冻干燥之前，业已使用糖类对脂质体膜进行了对脱水的保护，如海藻糖，蔗糖，麦芽糖(美国专利4,880,635)。
因此，本发明提供了用蔗糖和硫酸铵作为水合介质，得到了更刚性并且在保存时不泄漏包在它们里面的试剂的脂质体。通过向水合介质中添加蔗糖，蔗糖保持在脂质体膜的内表面和外表面上，硬化脂质体膜的两侧，从而减少了药物的泄漏。蔗糖在水合介质中的浓度优选为0.1M-0.5M。优选0.25M-0.3M。
水合介质中硫酸铵的浓度在来自脂质体的药物泄漏方面起着关键作用。只要当浓度低于125mM的硫酸铵被用于水合时，所形成的脂质体在储存时就表现出药物泄漏。因此，在优选的生产方法中，水合介质中硫酸铵的浓度高于125mM，并依次生产了在储存时具有较少泄漏的脂质体组合物。因此，在优选方法中，硫酸铵溶液的浓度不低于125毫摩尔/升，并且所述水合介质含有蔗糖。
在进行透析时，除去了脂质体外盐，即，硫酸铵，但是，没有除去脂质体内硫酸铵，由此产生了从内到外的跨过脂质体膜的化学梯度。
有很多合适的缓冲溶液可用于将药物加载到脂质体中，并且用于将所得到的脂质体组合物稀释到需要的药物浓度。由于脂质体主要包括磷脂，它在约6.0-8.0的中性pH左右是稳定的，所以用于加载和稀释脂质体的缓冲溶液还应当具有中性pH。同样，理想的缓冲溶液应当适合肠胃外制剂。适合本发明的用于将药物加载到脂质体中并且稀释脂质体组合物的用于肠胃外制剂的最常用的缓冲溶液是甘氨酸，磷酸，柠檬酸，乙酸和组氨酸缓冲液。组氨酸缓冲液是优选的，因为它在中性范围内具有最稳定的pH。所述缓冲溶液优选包括蔗糖和盐酸组氨酸，其摩尔比为29∶在MRI期间提供清晰的图像。MRI是一种特殊类型的诊断方法，它利用磁铁和计算机在身体内部的某些区域生成图像或“图片”。与x-射线不同，它不涉及离子辐射。示例性的MRI诊断剂包括卡道地阿米；钆喷酸(gadopentetate)；钆三碘醇；钆弗塞胺(gadoversetamide)，Gd：二亚乙基三胺五乙酸螯合物(Gd-DTPA)(美国专利号6,132,763)。
一旦加载了脂质体，并且除去了未被囊化的治疗剂/诊断剂，就可以对所述脂质体组合物进行灭菌过滤，以便进行灭菌，使它适合用于肠胃外施用。理想的过滤器是至少为0.2μm的过滤器。然后将脂质体组合物过滤到无菌脱热原(depyrogenated)的大型容器中。然后将所述无菌组合物无菌填充到无菌的脱热原的较小的容器中，如玻璃小瓶。通过用诸如氮气的惰性气体净化排出位于容器顶部空间的空气，并且密封所述容器。“适合肠胃外施用的”表示该组合物是无菌的，等渗的，并且控制了细菌内毒素。
本发明还提供了稳定的，长期循环的，低毒性的非聚乙二醇化的脂质体。所述脂质体优选是通过本文所描述的方法生产的。本发明的脂质体是长期循环的非聚乙二醇化的脂质体，当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，它的血液循环半衰期至少比常规非-脂质体制剂(ADRIAMYCIN)长25倍。优选的血液循环半衰期为用ADRIAMYCIN获得的半衰期大约40倍。
本发明的非聚乙二醇化的脂质体由磷脂和胆固醇组成。上面描述了磷脂与胆固醇的可接受的比例，并且摩尔比优选为1∶0.1-1∶2。磷脂与固醇优选的摩尔比为大约1∶0.7。磷脂酰胆碱是优选的磷脂，而二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)是特别优选的。
可以用诊断剂或治疗剂加载非聚乙二醇化的脂质体。所述试剂是公知的并且如上文所述。本发明的非聚乙二醇化的脂质体优选是用上文所述的化学梯度加载的。本发明的优选的非聚乙二醇化的脂质体是用盐酸阿霉素加载的，并且是使用上述方法制备的。在一种实施方案中，在用上文所述的主动加载方法加载盐酸阿霉素时，将所述药物溶解在合适的缓冲溶液(如上文所述)中，然后加载，以便得到至少25mM的浓度。当所述主动加载方法涉及硫酸铵梯度时，硫酸铵与盐酸阿霉素起反应，以便形成硫酸阿霉素。硫酸阿霉素是不溶性的，并且在加载之后保留在脂质体内部。一旦从加载的脂质体中除去了任何未捕获的或游离的药物，在MRI期间提供清晰的图像。MRI是一种特殊类型的诊断方法，它利用磁铁和计算机在身体内部的某些区域生成图像或“图片”。与x-射线不同，它不涉及离子辐射。示例性的MRI诊断剂包括卡道地阿米；钆喷酸(gadopentetate)；钆三碘醇；钆弗塞胺(gadoversetamide)，Gd：二亚乙基三胺五乙酸螯合物(Gd-DTPA)(美国专利号6,132,763)。
一旦加载了脂质体，并且除去了未被囊化的治疗剂/诊断剂，就可以对所述脂质体组合物进行灭菌过滤，以便进行灭菌，使它适合用于肠胃外施用。理想的过滤器是至少为0.2μm的过滤器。然后将脂质体组合物过滤到无菌脱热原(depyrogenated)的大型容器中。然后将所述无菌组合物无菌填充到无菌的脱热原的较小的容器中，如玻璃小瓶。通过用诸如氮气的惰性气体净化排出位于容器顶部空间的空气，并且密封所述容器。“适合肠胃外施用的”表示该组合物是无菌的，等渗的，并且控制了细菌内毒素。
本发明还提供了稳定的，长期循环的，低毒性的非聚乙二醇化的脂质体。所述脂质体优选是通过本文所描述的方法生产的。本发明的脂质体是长期循环的非聚乙二醇化的脂质体，当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，它的血液循环半衰期至少比常规非-脂质体制剂(ADRIAMYCIN)长25倍。优选的血液循环半衰期比用ADRIAMYCIN获得的半衰期大约长40倍。
本发明的非聚乙二醇化的脂质体由磷脂和胆固醇组成。上面描述了磷脂与胆固醇的可接受的比例，并且摩尔比优选为1∶0.1-1∶2。磷脂与固醇优选的摩尔比为大约1∶0.7。磷脂酰胆碱是优选的磷脂，而二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)是特别优选的。
可以用诊断剂或治疗剂加载非聚乙二醇化的脂质体。所述试剂是公知的并且如上文所述。本发明的非聚乙二醇化的脂质体优选是用上文所述的化学梯度加载的。本发明的优选的非聚乙二醇化的脂质体是用盐酸阿霉素加载的，并且是使用上述方法制备的。在一种实施方案中，在用上文所述的主动加载方法加载盐酸阿霉素时，将所述药物溶解在合适的缓冲溶液(如上文所述)中，然后加载，以便得到至少25mM的浓度。当所述主动加载方法涉及硫酸铵梯度时，硫酸铵与盐酸阿霉素起反应，以便形成硫酸阿霉素。硫酸阿霉素是不溶性的，并且在加载之后保留在脂质体内部。一旦从加载的脂质体中除去了任何未捕获的或游离的药物，就用含水的缓冲溶液稀释所述药物加载的脂质体，以便获得需要的药物浓度。所使用的优选的缓冲溶液是蔗糖-组氨酸缓冲溶液，正如前面所描述的。
示例性的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物包括2mg/ml盐酸阿霉素。另一种示例性的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物包括4mg/ml盐酸阿霉素。使用本发明的方法，能够以两倍于最终需要的组合物中的浓度将阿霉素加载到非聚乙二醇化的脂质体中。然后可以用合适的缓冲溶液(如上文所述)稀释加载的脂质体，以便获得每ml脂质体组合物的需要的阿霉素浓度。在稀释时，脂质体悬浮在它里面的外部介质被稀释，而脂质体内部的药物保持不被稀释。
在优选实施方案中，盐酸阿霉素与磷脂的摩尔比为大约1∶2-大约1∶15。优选的摩尔比为大约1∶3.5。
本发明还提供了非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物。该组合物包括存在于合适的可以药用的载体中的如上文所述的非聚乙二醇化的脂质体，所述载体是本领域所公知的。业已用盐酸阿霉素加载了脂质体。所述组合物适用于肠胃外施用，并且是长期循环的。
一种实施方案提供了用于肠胃外施用的长期循环的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物。所述脂质体组合物包括存在于可以药用的载体中的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体。合适的可以药用的载体为本领域所公知。在优选药用组合物中，盐酸阿霉素的浓度在1mM-10mM之间波动。更优选大约6.9mM，最优选大约3.45mM。肠胃外组合物的磷脂的摩尔浓度在10mM-15mM之间波动。更优选的含量为大约12.15mM。
所述组合物还包括二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇，盐酸组氨酸和蔗糖。所述脂质体的平均大小优选为0.06μm-0.16μm。
所述盐酸阿霉素的含量优选为1-10mM，更优选所述盐酸阿霉素的含量为3.45mM。
在本发明的组合物中，二硬脂酰磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比为1∶0.6-1∶0.8，优选1∶0.7。
在本发明的组合物中，盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2-1∶10，优选1∶2-1∶8，更优选1∶3.5。
蔗糖含量为0.1M-0.5M，更优选0.25M-0.3M。
在本发明的组合物中，盐酸组氨酸的含量为1mM-100mM，优选8-12mM，更优选10mM。
在本发明的组合物中，脂质体的平均大小为0.08μm-0.12μm。
在本发明的一种实施方案中，盐酸阿霉素以4mg/ml存在，而阿霉素与DSPC的摩尔比为1∶3.5，DSPC与胆固醇的比例为1∶0.7。
在本发明的另一种实施方案中，盐酸阿霉素以2mg/ml存在，阿霉素与DSPC的摩尔比为1∶3.5，DSPC与胆固醇的比例为1∶0.7。
当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，所述组合物中的阿霉素脂质体在血液中的1/2循环时间(t1/2)优选为ADRIAMYCIN的40倍。
本发明的另一种实施方案提供了通过施用非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物减弱肿瘤生长的方法。该方法包括施用治疗有效量的本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物。由于非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物具有长的循环时间，具有较弱的毒性，并且不存在“手足综合征”问题，所以它们提供了用于减弱肿瘤生长的可行的治疗方法。技术人员能够使用本文所提供的数据以及剂量用量，用药时间，以及施用途径的公知知识，通过使用本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体治疗患有易受盐酸阿霉素治疗影响的肿瘤的个体。本发明2mg/ml和4mg/ml盐酸阿霉素浓度的组合物可用于减弱肿瘤生长的治疗。
本发明还提供了以与组合物中相同的比例用所述成分生产组合物的方法。该方法包括
(a)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和胆固醇溶解在一种溶剂或几种溶剂的混合物中，
(b)在通过添加含水水合溶液进行水合之前或之后除去所述溶剂，其中，所述含水水合溶液包括硫酸铵和蔗糖，并且，其量为每毫摩尔DSPC使用10ml-35ml；
(c)将在步骤(b)结束时获得的脂质体组合物中的脂质体分级为大约0.060μm-0.16μm；
(d)从业已在步骤(c)中进行分级的脂质体组合物中除去脂质体外的硫酸铵，使用包括盐酸组氨酸和蔗糖的蔗糖-组氨酸缓冲溶液；
(e)将盐酸阿霉素溶解在所述蔗糖-组氨酸缓冲溶液中，以便获得浓度至少为25mM盐酸阿霉素的溶液；
(f)混合在步骤(e)中获得的盐酸阿霉素溶液和在步骤(d)结束时获得的脂质体组合物，以便获得盐酸阿霉素加载的脂质体组合物；
(g)通过任何一种下述方法从所述脂质体组合物中除去脂质体外的盐酸阿霉素：切向流过滤，柱层析或用树脂处理，如基于微孔苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的树脂；
(h)用所述蔗糖-组氨酸缓冲溶液补足在步骤(g)结束时获得的脂质体组合物的体积，以便获得具有所需浓度的盐酸阿霉素的脂质体组合物；
(i)通过使用无菌0.2μ灭菌级过滤器将所述脂质体组合物灭菌过滤到无菌容器中，以便获得所述脂质体阿霉素组合物。
含水水合介质中硫酸铵的浓度不低于125mM。
业已显示本发明的含有盐酸阿霉素的非聚乙二醇化的脂质体与常规盐酸阿霉素制剂(ADRIAMYCIN)和聚乙二醇化的脂质体盐酸阿霉素制剂(CAELYX)相比具有较低的毒性作用。下面的表1提供了在小鼠中的急性毒性和药物代谢动力学研究的结果。将按照实施例II所提供的参数生产的本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体与商业可获得的聚乙二醇化的脂质体阿霉素制剂ADRIAMYCIN和CAELYX进行比较。本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体的LD50比ADRIAMYCIN和CAELYX的高，因此证实了本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体具有较低的毒性。
表1：在小鼠中的急性毒性和药物代谢动力学研究
参数 实施例II的组合物   CAELYX(聚乙二醇化的脂质体阿霉素)   ADRIAMYCIN(常规的非脂质体阿霉素)
 LD<sub>50</sub>(mg/kg)   16.13   13.5   10.29
 MTD(mg/kg)   8   8   5
参数 实施例II的组合物   CAELYX(聚乙二醇化的脂质体阿霉素)   ADRIAMYCIN(常规的非脂质体阿霉素)
 C<sub>max</sub>(μg/ml)   267.54   285.74   26.8
 T<sub>max</sub>(小时)   0.085   0.085   0.085
 Kel   0.0997   0.07109   4.851811
 T<sub>1/2</sub>(小时)   6.948   9.748   0.143
 AUC(μg-h/ml)   1694.024   2083.215   1.244
 Vd(ml)   1.480   1.688   41.42
 Vd(ml/kg)   59.20   67.52   1656.79
 Cl(ml/h)   0.15   0.12   200.96
缩写：MTD＝最大耐受剂量；Cmax＝在血浆中达到的最大药物浓度；Tmax＝在血浆中达到最大药物浓度所需要的时间；Kel＝消除常数；T1/2＝血浆中药物浓度降低50％所需要的时间；AUC＝“浓度”对“时间”曲线下面的面积；Vd＝分配体积；Cl＝药物的清除速度
将本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体用在植入了MCF-7人乳腺瘤的小鼠上。在下面的表2中提供了结果。通过T/C％(测定相对于对照的百分比)测量肿瘤重量和有效性的差异。在本研究中(实施例VI)，使用CAELYX的T/C的最大比例在12mg/kg下为-78，而在6mg/kg下为-34.7，而使用本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体，在12mg/kg下为-93.4，而在6mg/kg下为-89.43。以上结果证实了本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体组合物在降低肿瘤重量方面似乎比市场上现有的聚乙二醇化的脂质体制剂CAELYX更有效。
表2：对植入裸鼠的MCF-7人乳腺瘤的效果
Figure G2003801100257D00171
测定了本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体对L1210小鼠白血病细胞的抗肿瘤活性。在下面的表3中提供了测定结果。该测定的结果(实施例VI)表明，本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体组合物与聚乙二醇化的脂质体(CAELYX)一样有效。
表3：对L1210小鼠白血病模型的抗肿瘤活性
T/C％：测定相对于对照的百分比
在上面表1-3中的结果证实了本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物具有较低的毒性转征和较长的循环时间，并且业已证实了在体内针对MCF-7和L1210肿瘤模型的抗肿瘤活性效果。
为了使本领域技术人员能够更全面地理解本发明，提供了下面的实施例，该实施例描述了本发明脂质体制剂的制备，表征，以及在动物模型中的体内化疗应用。提供这些实施例仅仅是用于说明目的的，而不是要以任何方式限定本发明的范围。
实施例
用于这些实施例的盐酸阿霉素是肠胃外级的，符合美国药典(USPharmacopoeial)规定。用于这些实施例中的磷脂是肠胃外级的。用于这些实施例中的胆固醇符合美国药典规定。用于这些实施例中的水是肠胃外级的，符合注射用水的规定。用于这些实施例中的所有其他添加剂是肠胃外级的。所有处理都是在受控制的环境区域进行的。
将由Ben Venue Laboratories，美国生产的CAELYX(聚乙二醇化的脂质体阿霉素制剂)和由Pharmacia & Upjohn，美国生产的ADRIAMYCIN(常规非-脂质体阿霉素制剂)用于动物研究，用于与本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物进行对比评估。ADRIAMYCIN在此处也称为“常规非脂质体阿霉素组合物”，是用于注射的冷冻干燥的无菌粉末，每一个小瓶装有盐酸阿霉素10mg，乳糖50mg，羟基苯甲酸甲酯1mg。在使用之前，用5ml水重建冷冻干燥的粉末，所述水是在包装中提供的注射用水。
为了进行血液学测定，使用了细胞计数器(Sysmex AutomatedHematology Analyzer-KX-21)。
实施例I：制备含有盐酸阿霉素的脂质体组合物的方法。
脂类膜制备：将DSPC(1.565g)和胆固醇(0.521g)先后溶解在装在旋转蒸发器烧瓶中的三氯甲烷(40ml)中。对它们进行混合，直到形成清澈溶液。将所述烧瓶与旋转蒸发器连接，并且将水浴温度调节到60℃。在真空条件下将溶剂蒸发掉，以便在烧瓶的壁上形成脂类的膜。在解除真空之后，旋转所述烧瓶大约5分钟，同时让氮气进入所述烧瓶，以便使任何残留的溶剂干燥。
水合：然后用60ml含有硫酸铵的含水水合介质水合所述烧瓶中的脂类膜。所述水合介质由10.0gm的蔗糖，2.04gm的硫酸铵和100ml的水组成。在温度保持在65-68℃的水浴上旋转装有脂类膜和水合介质的烧瓶30分钟，以便形成脂质体。
通过挤压缩小脂质体的尺寸：通过孔径为0.4μm-0.05μm的过滤器连续挤压对通过上述方法获得的脂质体悬浮液进行分级。
形成硫酸铵梯度：用蔗糖-组氨酸缓冲溶液对分级的脂质体悬浮液进行透析，以便除去脂质体外硫酸铵，从而形成化学梯度。将装有300KD盒的切向流过滤系统用于透析。用Nesseler试剂检测硫酸铵的缺乏。
用于透析和药物加载(参见下文)的蔗糖-组氨酸缓冲溶液如下：170.0gm的蔗糖，3.40gm的盐酸组氨酸，1.7升的水，和其用量足以将pH调节到6.0-6.5的氢氧化钠。
药物加载：在圆底烧瓶中，制备了存在于蔗糖-组氨酸缓冲溶液(如上文所述)中的15mg/ml盐酸阿霉素溶液，以便加载脂质体制剂，并且得到盐酸阿霉素的浓度为4mg/ml的药物加载的脂质体。将从上面得到的分级的和透析的脂质体缓慢添加到圆底烧瓶中，并且在65℃混合1小时。将药物加载的脂质体与DOWEX混合30分钟，以便除去未捕获的药物。用蔗糖-组氨酸缓冲溶液将药物加载的脂质体稀释到浓度为2mg/ml，然后用无菌的0.22μm的膜滤器进行灭菌过滤。然后将经过过滤的脂质体阿霉素组合物灭菌过滤到无菌脱热原的玻璃小瓶中，并且在氮气的覆盖下用Teflon涂覆的橡胶塞密封。
实施例II：聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物，非脂质体阿霉素组合物，和本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的LD50比较。
制备以下脂质体阿霉素组合物：
每ml的组合物具有
DSPC          -9.55mg
胆固醇        -3.15mg
盐酸阿霉素    -2.01mg
蔗糖          -95mg
盐酸组氨酸    -2mg
所述组合物是按照与实施例I相同的方法制备的。将盐酸阿霉素(216mg)溶解在14ml蔗糖-组氨酸缓冲溶液中，并且添加到40ml分级的脂质体中，并且混合1小时。然后让所得到的药物加载的脂质体分散体通过DOWEX柱，以便除去未捕获的药物。
通过DOWEX柱之后所获得的产物具有以下特征：
产物分析
总的盐酸阿霉素含量        3.98mg/ml
捕获的盐酸阿霉素含量      3.94mg/ml
上述产物在用组氨酸缓冲液稀释到2mg/ml的浓度之后，分析以下参数：
外观：红色透明液体
PH：6.1
粒度：平均粒度0.093μm
DSPC含量：9.55mg/ml
胆固醇含量：3.15mg/ml
盐酸阿霉素含量：2.01mg/ml
蔗糖含量：9.35％w/v
盐酸组氨酸含量：阳性
细菌内毒素：低于2.2EU/mg的盐酸阿霉素
无菌性：无菌
在小鼠中对该组合物进行急性毒性研究。
“聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”(CAELYX)，“常规非脂质体阿霉素组合物”(ADRIAMYCIN)和“本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”的LD50比较。
使用的动物：任意性别的swiss白化小鼠。
动物的重量范围：20-22gm.
组的数目：3
每组的动物数目：10
将动物分成3个组，并且每组由十只动物组成。第一组接受实施例II的组合物，第二在接受CAELYX，而第三组接受ADRIAMYCIN。
所有动物都是通过静脉内途径接受注射的。在给动物施用之前，用葡萄糖(5％w/v)溶液适当地稀释所述药物溶液。然后观察所述动物14天时间。观察这些动物的任何临床毒性和死亡率。
在表1中提供了研究过的不同的阿霉素制剂的LD50值。
发现LD50剂量为16.13mg/kg，而市场上销售的常规制剂(ADRIAMYCIN)的LD50剂量为10.29mg/kg。市场上销售的聚乙二醇化的脂质体制剂CAELYX的LD50为13.5mg/kg。以上结果证实，与其他阿霉素制剂和聚乙二醇化的-脂质体阿霉素制剂相比，本发明的非聚乙二醇化的脂质体具有较低的毒性。
实施例III：“本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”与“聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”(CAELYX)和“常规非脂质体阿霉素组合物”(ADRIAMYCIN)的亚急性毒性的比较。
使用的动物：任意性别的swiss白化小鼠
组的数目：11
每组的动物数目：8
动物的重量范围：19-23gm
施用途径：静脉内
将动物分成11组，每组由八只动物组成。第一组接受5％葡萄糖注射，第二组接受本发明的空白脂质体(药物加载之前的脂质体)，第三组，第四组和第五组接受不同剂量的实施例II的组合物，第六组，第七组和第八组接受不同剂量的CAELYX，第九组，第十组和第十一组接受不同剂量的ADRIAMYCIN。在表4中提供了所述剂量。
表4：用于在小鼠中进行重复的剂量毒性研究的阿霉素制剂的剂量
所有的组都是隔天接受注射，通过静脉内途径注射十四天时间。在给动物施用之前，用5％葡萄糖注射液适当地稀释所述制剂。在14天时间的研究过程中现察所述动物的以下指标：
→死亡率
→临床病征和症状
→体重
→食物消耗
→器官重量
结果
死亡率：记录了所有制剂的14天时间的百分比死亡率。
表5：各种剂量的阿霉素制剂的百分比死亡率
Figure G2003801100257D00231
临床病征：在研究过程中，在所有阿霉素处理过的组中都观察到了尾巴皮肤脱落和脱毛。进行五次注射之后在动物中观察到尾巴皮肤脱落。剂量依赖性脱毛是在所有阿霉素处理过的动物中观察到的。表6详细示出了在本研究过程中的脱毛。
表6：在用各种阿霉素制剂处理过的小鼠中的脱毛发病率
  制剂   脱毛等级
  葡萄糖   -
  空白脂质体   -
  实施例II的组合物(1mg/kg)   +
  实施例II的组合物(2mg/kg)   +
  实施例II的组合物(3mg/kg)   ++
  CAELYX(1mg/kg)   竖毛#
  CAELYX(2mg/kg)   +
  CAELYX(3mg/kg)   ++
  制剂   脱毛等级
  ADRIAMYCIN(1mg/kg)   +
  ADRIAMYCIN(2mg/kg)   ++
  ADRIAMYCIN(3mg/kg)   ++++
#在处理的第12天，在8只动物中的一只上观察到竖毛(毛提起)
+8只动物中有一只表现出脱毛
++8只动物中有两只表现出脱毛
+++8只动物中有三只表现出脱毛
++++8只动物中有四只表现出脱毛
体重：在第1，第4，第7和第14天记录动物体重。在2mg/kg和3mg/kg的剂量下，在所有药物处理组中都观察到了体重下降。所述体重下降与对照明显不同。接受空白脂质体的动物的体重与葡萄糖组的体重相当。
食物消耗：从第4到第14天，阿霉素处理的动物普遍表现出食物消耗下降。
器官重量：收集存活动物的器官并且称重。发现所有动物的平均器官重量在所有药物处理组中相当。
实施例IV：在小鼠中进行的“本发明的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”与“聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”(CAELYX)和“常规非脂质体阿霉素组合物”(ADRIAMYCIN)的药物代谢动力学评估。
使用的动物：任意性别的swiss白化小鼠
组的数目：3
每组的动物数目：48
动物体重：25-30gm
用于药物代谢动力学研究的剂量：10mg/kg
时间点：5分钟，30分钟，1小时，2小时，5小时，10小时，15小时，20小时
每个时间点的小鼠数目：6只小鼠
施用途径：静脉内
血液样品在收集之后于4000rpm离心20分钟，并且分离血浆，在-20℃下冷冻直到进行分析。将冷冻的血浆解冻并且用于分析。
将1ml的乙腈添加到100μL血浆中，涡旋10分钟，于3250rpm离心10分钟。取出上清液，并且向其中添加0.5ml的饱和的ZnSO4溶液，将所得到的溶液涡旋5分钟，然后于3250rpm离心10分钟。然后取出上部有机相，并且在无氧气的氮气中，在60℃下干燥。然后用含有ZnSO4的200μL的溶剂A重建所获得的残余物。然后将100μL的该溶液注射入HPLC柱。
仪器：Shimadzu Liquid Chromatograph LC-10ATVP
柱：C8Thermoquest hypersil MOS(250X 4.6mm，5μ)
柱温：环境温度
流动相：
溶剂A：酸化水(pH 2.5，用60％高氯酸调节)&四氢呋喃(80：1，v/v)
溶剂B：乙腈
溶剂A：溶剂B(40：60)
流速：1ml/分钟
检测仪：荧光检测仪(RF-10AXL Shimadzu；Ex 460nm和Em550nm)
运行时间：15分钟
统计学分析
将斯氏t-检验用于对三种制剂进行比较。结果总结在表1中。
实施例V：“本发明的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”与“常规非脂质体阿霉素组合物”(ADRIAMYCIN)在狗中的亚急性毒性的比较
使用的动物：狗
组的数目：3
每组的动物数目：3
动物的重量范围：10-20kg
剂量&施用：通过静脉内输注用20分钟时间施用1mg/kg。每周施用1次(即7天之后施用)，施用4剂。
药理学评估：
→毒性的临床病征
→体重
→血液动力学参数
→血液学
→生物化学参数
表7：毒性的临床病征：
体重：ADRIAMYCIN处理过的组表现出体重的降低，而对照和实施例II的组合物处理的组体重表现出无变化。
表8：血液动力学参数：
研究过的血液学参数：
→RBC
→总的WBC和差别WBC
→血红蛋白
→血细胞比容
→平均细胞体积
→血小板
在所有组中，研究过的上述所有参数都在正常范围内。
生物化学参数：在ADRIAMYCIN处理过的组中观察到了肌酸酐磷酸激酶和乳酸脱氢酶水平的提高，而在对照和实施例II的组合物组中，没有观察到明显的变化。
肝脏功能测试(LFT)：在ADRIAMYCIN处理组中观察到了天冬氨酸转氨酶，丙氨酸转氨酶和总的胆红素水平的提高，而在对照和实施例II的组合物组中没有观察到显著的变化。
肾脏功能测定(KFT)：在ADRIAMYCIN处理组中观察到了血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的增加，而在对照组中没有表现出增加。用实施例II的组合物处理的动物组表现出BUN和肌酸酐水平的增加，不过，这种增加明显低于ADRIAMYCIN处理组。
实施例VI：“本发明的非聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”与“聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物”(CAELYX)对植入裸鼠的L1210小鼠白血病和MCF-7人乳腺瘤的抗肿瘤活性的评估。
剂量制备：用无菌的物理盐水(0.9％)将上述两种阿霉素制剂稀释到1mg/ml。根据体重给各个实验组施用合适体积的药物溶液，以便所述动物按表9和10所示接受药物。
将六周大的雌性NCr裸鼠(nu/nu)用于这两种模型。
按照Guide for Care and Use of Laboratory Animals(ILARpublication，1996，National Academy Press)的规定将动物圈养在聚碳酸酯micorisolator笼子中。用50％的新鲜空气对笼室进行很好的通风(每小时超过10次空气交换)。保持12小时光照/12小时黑暗的光周期。将室温保持在18-26℃。
在肿瘤接种之前使研究动物适应至少3天时间。
总体说明：用两种浓度在L1210小鼠白血病和MCF-7人乳腺瘤模型中对上述两种脂质体制剂进行测试，分别与接受盐水的对照组进行比较。
L1210模型
肿瘤细胞：L1210小鼠白血病细胞系是从ATCC获得的，并且采用标准的体外细胞扩增方法繁殖。让所述细胞在含有合适的补料和10％胎牛血清(FBS)的培养基中生长。让培养物在35T-225烧瓶中生长到80-90％汇合。通过离心收获细胞，并且将沉淀的细胞重新悬浮在无血清RPMI中，达到106活细胞/ml。使用25G针用0.1ml的细胞悬浮液对所述动物进行注射。
组和剂量：每个组由5只动物组成。用106肿瘤细胞/小鼠的用量对小鼠进行腹膜内接种。在第1，5和9天以表9所示的剂量通过静脉内途径使用这两种脂质体制剂。在处理之后观察动物30天时间，并且记录死亡率。
表9
  组编号   雄性/雌性数目   物品  总剂量(mg/kg)   剂量/注射(mg/kg)   总剂数
  1   0/5   盐水  NA   NA   3
  2   0/5   CAELYX  12   4   3
  3   0/5   CAELYX  6   2   3
4 0/5   实施例II的组合物 12   4 3
5 0/5   实施例II的组合物 6   2 3
每天检查所述动物，并且每周称重两次，并且记录重量。记录在研究过程中的任何死亡率。
通过将每个处理组的平均存活时间与接受盐水的对照的平均存活时间相比，评估两种脂质体制剂的抗肿瘤活性。结果表示为T/C比例，该比例是按照下式计算的：
Figure G2003801100257D00291
将T/C≥125％视为显著活性
在表3中提供了对L1210小鼠白血病模型的抗肿瘤活性结果。
在第一次注射(第1天)之后，死亡率在15-26天波动。接受盐水的对照组的平均存活时间为16.5天。在两个药物处理组中都观察到了存活时间的延长。两个药物处理组在平均存活时间方面表现出类似的差异(T/C％)，表明了在抗L1210肿瘤模型方面，实施例II的组合物与CAELYX一样有效。
MCF-7模型：
肿瘤细胞：MCF-7人乳腺瘤细胞系是从ATCC获得的，并且使用标准体外细胞扩增方法繁殖。让细胞在含有合适的补料和10％FBS的培养基中生长。然后让培养物在35T-225烧瓶中生长到80-90％汇合。通过离心收获细胞，并且对沉淀的细胞进行胰蛋白酶消化，并且重新悬浮在无血清RPMI中，达到107活细胞/ml。使用25G针用0.1ml的细胞悬浮液对所述动物进行注射。
组和剂量：每个组由5只动物组成。在接种之前5天将雌激素片植入小鼠体内。用107肿瘤细胞/小鼠对小鼠进行皮下接种。让肿瘤生长达到大小为30-100mm3。一旦达到了合适的大小(接种后5天)，就在第1，5和9天按表10所示用测试物品对小鼠进行静脉内给药。每周两次用卡尺测量肿瘤大小，直到处理开始之后30天。
表10
  组编号   雄性/雌性数目   物品   总剂量(mg/kg)   剂量/注射(mg/kg)   总剂数
  1   0/5   盐水   -   -   -
  2   0/5   CAELYX   12   4   3
  3   0/5   CAELYX   6   2   3
4 0/5 实施例II的组合物 12 4   3
  5   0/5   实施例II的组合物   6 2 3
每天一次检查所述动物，并且每周称两次重量，并且记录重量。每周两次使用卡尺测量每只小鼠的肿瘤的长度和宽度，并且使用以下长椭球的体积公式计算来自肿瘤尺寸的(mm×mm)的大约的肿瘤重量(mg)：
L &times; W 2 2
其中L是两次测量中较长的一个。
通过比较处理组的肿瘤重量相对接受盐水的对照组的肿瘤重量的变化，评估两组脂质体制剂的抗肿瘤活性。
通过从最终评估日(处理后30天)的组平均肿瘤重量中减除在接种肿瘤细胞之后第5天的组平均肿瘤重量，计算肿瘤重量的改变。
υWt＝Wt最终-Wt最初
按以下方法计算所有测定组的T/C比例：
T/C％＝υWt测定/测定的Wt最初×100
T/C≤20％被认为是表现中等活性所必需的。T/C≤10％被认为是显著活性。
在表2中列出了针对MCF-7人乳腺瘤模型的抗肿瘤活性。
表11-在各个动物组中的早期死亡
  组   剂量   死亡率
  对照   0   0/5
  实施例II的组合物   6mg/kg   0/5
  实施例II的组合物   12mg/kg   0/5
  CAELYX   6mg/kg   2/5
  CAELYX   12mg/kg   1/5
对照组的肿瘤在本研究的整个期间持续生长，直到在第26天达到最大116.4mg，而处理过的小鼠的肿瘤在研究过程中显著退化。接受12mg/kg的实施例II的组合物制剂的组的肿瘤完全消失，表明实施例II的组合物能有效抗MCF-7人乳腺瘤。
在表11所示出的各个组中出现了若干早期死亡。不过，死亡原因似乎与肿瘤无关。在盐水对照组中没有死亡，该组具有最大的肿瘤。对某些死亡的动物进行了尸体剖检，并且所有这些动物都发现具有增厚的、异常的膀胱。在本研究结束时，很多安乐死的小鼠同样具有增厚的膀胱。对增厚的膀胱之一进行的组织病理学检查没有发现肿瘤转移的证据。由于尿生殖疾病的发生，雌激素化的，植入肿瘤的裸鼠提前死亡。
实施例VII：在具有A121人卵巢肿瘤的无胸腺裸鼠体内测定本发明的阿霉素脂质体的最大耐受剂量(MTD)和估计治疗效力。
本发明的阿霉素脂质体在带有人A121卵巢肿瘤的无胸腺裸鼠体内的最大耐受剂量和治疗效力的评估是通过与常规非-脂质体制剂(ADRIAMYCIN)和聚乙二醇化的脂质体制剂(CAELYX)比较进行的。
通过套针植入用人A121卵巢肿瘤对无胸腺裸鼠Ncr-nu/nu小鼠[4只小鼠/组(对照组中10只)]进行皮下植入。一共将46只动物用于本实验。一共将46只动物用于本实验。通过静脉内途径评估相同剂量的ADRIAMYCIN，CAELYX和实施例II的组合物。在肿瘤植入之后第5和第12天，通过小鼠的尾静脉静脉内施用药物。
所有处理组表现出良好的抗肿瘤效力。
下面提供了剂量方案。
对照小鼠：对照小鼠不接受治疗。
ADRIAMYCIN
12mg/kg(6mg/kg x2次注射)
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
36mg/kg(18mg/kg x2次注射)
CAELYX
12mg/kg(6mg/kg x2次注射)
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
36mg/kg(18mg/kg x2次注射)
实施例II的组合物
12mg/kg(6mg/kg x2次注射)
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
36mg/kg(18mg/kg x2次注射)
所有接受最大剂量的36mg/kg的游离的药物(18mg/kg x2ADRIAMYCIN)的小鼠和接受中等剂量的24mg/kg的四只小鼠中有三只由于药物毒性而死亡。因此，ADRIAMYCIN的最大耐受剂量(MTD)低于24mg/kg。
小鼠能耐受CAELYX和实施例II的组合物。这两种制剂在36mg/kg都被良好地耐受。不过，CAELYX似乎会产生比实施例II的组合物更大的毒性，并且使接受高剂量(36mg/kg)的小鼠产生较大的重量损失。
本研究证实了实施例II的组合物比市场上出售的聚乙二醇化的脂质体制剂(CAELYX)和常规非-脂质体制剂(ADRIAMYCIN)可被更好地耐受。
实施例VIII：在无胸腺裸鼠中评估本发明的脂质体阿霉素组合物的效力，所述裸鼠中植入了多种药物抗性，Pgp阳性，人结肠DLD1肿瘤异种移植物。
在皮下植入了药物抗性(Pgp+)DLD-1人结肠肿瘤的无胸腺裸鼠体内对实施例II的组合物和CAELYX和ADRIAMYCIN进行效力研究。
通过套针植入用人DLD-1结肠肿瘤对动物无胸腺裸鼠，4只小鼠/组(在对照组中有10只)进行皮下植入。
对照：无处理
ADRIAMYCIN
12mg/kg(6mg/kg x2次注射)
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
CAELYX
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
36mg/kg(18mg/kg x2次注射)
48mg/kg(24mg/kg x2次注射)
实施例II的组合物
24mg/kg(12mg/kg x2次注射)
36mg/kg(18mg/kg x2次注射)
48mg/kg(24mg/kg x2次注射)
一共将42只动物用于本实验。
结果：
在施用36mg/kg游离的药物之后，根据在实施例VII中观察到的毒性，ADRIAMYCIN的剂量在本研究中降低到12和24mg/kg。相反，CAELYX和实施例II的组合物的剂量提高到48mg/kg，以在它们各自的MTD将它们的效力和毒性与所述游离药物进行比较。所有试剂都是在用多种药物抗性Pgp阳性，人结肠肿瘤异种移植物进行皮下肿瘤植入之后第5和12天通过尾静脉在静脉内给无胸腺裸鼠施用的。
所有处理组都表现出抗肿瘤效力。
不过，接受任意一种脂质体制剂的小鼠都表现出明显更大的抗肿瘤效力。在相等的游离药物剂量(24mg/kg)下，观察到了通过游离药物产生的平均肿瘤生长延迟了10天，而所有施用了脂质体制剂的小鼠的肿瘤在第40天低于600nm3。对于CAELYX或实施例II的组合物来说，在36mg/kg的剂量下没有明显毒性。
在两种脂质体药物制剂(24mg/kg x2，CAELYX或实施例II的组合物)的最大剂量(48mg/kg)下，小鼠表现出＞15％的重量减少，并且上述组中每一组中的4只动物中有1只因为药物毒性提前死亡(第17，19天)。因此，这两种脂质体制剂的MTD是类似的，并且表现出低于48mg/kg。
与ADRIAMYCIN相反，两种脂质体制剂[CAELYX-(聚乙二醇化的阿霉素)和实施例II的组合物(非聚乙二醇化的-阿霉素)]表现出对无胸腺裸鼠中皮下植入的Pgp阳性，多种药物抗性人DLD1结肠肿瘤的显著的抗肿瘤效力。在24mg/kg的相等剂量下，与游离的药物相比，两种脂质体制剂表现出提高的效力。另外，与游离的药物相比，两种脂质体制剂表现出较低的毒性，使得可以使用更多的药物。ADRIAMYCIN的MTD似乎为脂质体制剂的约1/2。36mg/kg的脂质体药物剂量可被很好地耐受。
实施例IX-XIII：
在下面的表12中提供了实施例IX-XIII的组合物和方法。
表12
方法：
在实施例X，XI和XII中，采用了实施例I的方法。
在实施例IX中，采用了实施例I的方法，所不同的是，脂质体的尺寸的缩小是通过用0.4μ-0.2μ的膜挤压完成的，使平均大小在0.15μm-0.25μm范围内。
在实施例XIII中，采用了实施例II的方法，所不同的是水合的体积加倍。
在表13中提供了毒理学测定结果。
表13
Figure G2003801100257D00361
实施例XIV：没有蔗糖的脂质体阿霉素组合物。
脂类膜制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1.565g)和胆固醇(0.521g)先后溶解在装在旋转蒸发器烧瓶中的三氯甲烷(40ml)中。对它们进行混合，直到形成清澈的溶液。将烧瓶连接在旋转蒸发器上，并且将水浴温度调节到60℃。在真空条件下蒸发溶剂，以便在烧瓶的壁上形成脂类的膜。在解除真空之后，旋转烧瓶大约5分钟，同时将氮气充入所述烧瓶，以便排除任何残余的溶剂。
水合：用60ml的含水水合介质水合所述脂类膜。所述含水水合介质是溶解在水中的2.04％w/v硫酸铵。将装有脂类膜和水合介质的烧瓶在保持在65-68℃的水浴中旋转30分钟，以便形成空白脂质体。
通过挤压降低空白脂质体的尺寸：通过连续经过孔径为0.4μm-0.05μm的过滤器挤压对上面所获得的脂质体悬浮液进行分级。
透析：用pH 6.5的0.2％w/v盐酸组氨酸溶液对所述分级的脂质体的悬浮液进行透析。将切向流过滤系统用于透析。持续进行透析，直到除掉脂质体外硫酸铵。通过使用Nesseler试剂证实在脂质体外介质中没有硫酸铵。
药物加载：通过将216mg的盐酸阿霉素溶解在14ml的盐酸组氨酸溶液(如上文所述)中，在圆底烧瓶中制备盐酸阿霉素的15mg/ml的溶液。将来自从上面获得的定量体积(40ml)的分级的和透析过的脂质体缓慢添加到圆底烧瓶中，并且在65℃下混合1小时。
用DOWEX处理药物加载的脂质体，以便除去未捕获的药物。
通过高效液相层析(HPLC)分析用DOWEX处理之前和之后所获得的组合物样品的盐酸阿霉素含量。结果如下表所示：
 总盐酸阿霉素含量(DOWEX处理之前)   4.02mg/ml
 捕获的盐酸阿霉素含量(DOWEX处理之后)   4mg/ml
使用盐酸组氨酸和蔗糖的溶液将除去游离的药物之后的盐酸阿霉素加载的脂质体稀释到2mg/ml的盐酸阿霉素浓度(如上文所述)。然后使用0.22μm的无菌膜滤器将由此获得的脂质体组合物灭菌过滤到无菌脱热原的容器中，并且分析以下参数：
外观：红色透明液体
PH：6.3
粒度：平均粒度0.097μm
盐酸阿霉素含量：2.05mg/ml
细菌内毒素：低于2.2EU/mg的盐酸阿霉素。
无菌性：无菌
对本实施例中获得的组合物进行了稳定性研究，并且在表14中提供了观察结果。
实施例XV：用120mM硫酸铵溶液制备脂质体阿霉素组合物的方法
脂类膜制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1.565g)和胆固醇(0.521g)先后溶解在旋转蒸发器烧瓶中的三氯甲烷(40ml)中。对它们进行混合，直到形成清澈溶液。将烧瓶连接在旋转蒸发器上，并且将水浴温度调节到60℃。在减压下蒸发溶剂，以便在烧瓶壁上形成脂类膜。在解除真空之后，旋转烧瓶大约5分钟，同时将氮气充入烧瓶，以便排出任何残余的溶剂。
水合：用60ml的含水水合介质水合脂类膜。所述含水水合介质由存在于水中的蔗糖10％w/v，硫酸铵1.58％w/v组成。在温度保持在65-68℃的水浴中将装有脂类膜和水合介质的烧瓶旋转30分钟，以便形成空白脂质体。
通过挤压降低空白脂质体的尺寸：通过连续经过孔径为0.4μm-0.05μm的过滤器挤压对从上面所获得的脂质体悬浮液进行分级。
透析：用蔗糖组氨酸缓冲溶液对所述分级的脂质体的悬浮液进行透析。将切向流过滤系统用于透析。持续进行透析，直到除掉脂质体外硫酸铵。通过使用Nesseler试剂证实在脂质体外介质中没有硫酸铵。用于透析和药物加载(参见下文)的盐酸组氨酸溶液如下：170.0gm的蔗糖，3.40gm的盐酸组氨酸，1.7升的水，和氢氧化钠，其用量足以将pH调节到6.0-6.5。
药物加载：通过将216mg的盐酸阿霉素溶解在14ml的盐酸组氨酸溶液中(如上文所述)，在圆底烧瓶中制备15mg/ml的盐酸阿霉素溶液。将来自从上面获得的定量体积(40ml)的分级的和透析过的脂质体缓慢添加到圆底烧瓶中，并且在65℃下混合1小时。
用DOWEX处理药物加载的脂质体，以便除去未捕获的药物。
通过高效液相层析(HPLC)分析用DOWEX处理之前和之后所获得的组合物样品的盐酸阿霉素含量。结果如下表所示：
 总盐酸阿霉素含量(DOWEX处理之前)   4.11mg/ml
 捕获的盐酸阿霉素含量(DOWEX处理之后)   4.10mg/ml
使用盐酸组氨酸和蔗糖的溶液将除去游离的药物之后的盐酸阿霉素加载的脂质体稀释到2mg/ml的盐酸阿霉素浓度(如上文所述)。然后使用0.22μm的无菌膜滤器将由此获得的脂质体组合物灭菌过滤到无菌脱热原的容器中，并且分析以下参数：
外观：红色透明液体
PH：6.35
粒度：平均粒度0.09μm
盐酸阿霉素含量：2.03mg/ml
细菌内毒素：低于2.2EU/mg的盐酸阿霉素。
无菌性：无菌
对在该实施例中获得的组合物进行了稳定性研究，并且在表14中提供了观察结果。
实施例XVI：在增加的温度(25℃)下对实施例XIV，实施例XV和本发明的组合物(实施例II)进行短期稳定性研究
在表14中提供了阿霉素含量的结果：
表14
本实施例显示蔗糖的存在对于减少被囊化的阿霉素的泄漏是必要的和水合介质中硫酸铵的浓度是重要的。120mM的浓度导致了被囊化阿霉素的泄漏，因此是令人不满意的。不过，实施例II的组合物含有浓度为155mM的蔗糖和硫酸铵，不会在研究期间泄漏被囊化的阿霉素。
实施例XVII：在水合之后通过除去溶剂的方法制备脂质体阿霉素组合物。
将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1.565g)和胆固醇(0.521g)先后溶解在乙醇(20ml)中，在压力下缓慢地泵送到持续地搅拌的含水水合介质中。所述含水水合介质由溶解在水中的蔗糖10％w/v，硫酸铵2.04％w/v组成。将含有溶剂乙醇的该脂类溶液转移到旋转蒸发器烧瓶中。该烧瓶与旋转蒸发器连接，并且将水浴温度调节到60℃。在真空条件下除去乙醇。
通过挤压降低空白脂质体的尺寸：通过连续经过孔径为0.4μm-0.05μm的过滤器挤压对上面所获得的脂质体悬浮液进行分级。
透析：用组氨酸溶液对所述分级的脂质体的悬浮液进行透析。将切向流过滤系统用于透析。持续进行透析，直到除掉脂质体外硫酸铵。通过使用Nesseler试剂证实在脂质体外介质中没有硫酸铵。用于透析和药物加载(参见下文)的盐酸组氨酸溶液如下：170.0gm的蔗糖，3.40gm的盐酸组氨酸，1.7升的水，和氢氧化钠，其用量足以将pH调节到6.0-6.5。
药物加载：通过将216mg的盐酸阿霉素溶解在14ml的盐酸组氨酸溶液中，在圆底烧瓶中制备15mg/ml的盐酸阿霉素溶液(如上文所述)。将上面所获得的定量体积(40ml)的分级的和透析过的脂质体缓慢添加到圆底烧瓶中，并且在65℃下混合1小时。
用DOWEX处理药物加载的脂质体，以便除去未捕获的药物。
使用盐酸组氨酸和蔗糖的溶液将除去游离的药物之后的盐酸阿霉素加载的脂质体稀释到2mg/ml的盐酸阿霉素浓度(如上文所述)。然后使用0.22μm的无菌膜滤器将由此获得的脂质体组合物灭菌过滤到无菌脱热原的容器中。
所进行的毒理学和效力研究的总结如下：
实施例II-与非-脂质体盐酸阿霉素制剂(ADRIAMYCIN)和聚乙二醇化的脂质体盐酸阿霉素制剂(CAELYX)相比，本发明的含有盐酸阿霉素的非聚乙二醇化的长期循环的脂质体具有降低的毒性作用。本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体的LD50高于CAELYX和ADRIAMYCIN的，因此证实了本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体具有较低的毒性。
实施例III-在亚急性毒性研究中，在CAELYX和实施例II的组合物组中观察到了类似的毒性模式，而ADRIAMYCIN显示有毒性。
实施例IV-在药物代谢动力学研究中，实施例II的组合物和CAELYX表现出相当的血浆半衰期。表观分配体积大体上等于总的血量，这表明了正常组织对脂质体的较少的吸收，并且与CAELYX类似。ADRIAMYCIN表现出更快的清除速度和高的分配体积，表明了游离阿霉素在正常组织中的吸收。
实施例V-在狗毒性研究中，发现实施例II的组合物比ADRIAMYCIN可被更好地耐受。
实施例VI-在L1210小鼠白血病和MCF-7人乳腺瘤的肿瘤模型中，发现实施例II的组合物是有效的。
实施例VII-在肿瘤植入的小鼠中发现实施例II的组合物的最大耐受剂量远远高于ADRIAMYCIN的最大耐受剂量。
实施例VIII-在用多种药物抗性，Pgp阳性，人结肠DLD1肿瘤异种移植物植入的无胸腺裸鼠中，发现实施例II的组合物的有效的。
以上实施例明确证实了本发明的组合物在减弱肿瘤生长方面是非常有用的。它涉及到肠胃外施用治疗有效量的本发明的非聚乙二醇化的阿霉素脂质体。所述非聚乙二醇化的盐酸阿霉素脂质体具有延长的循环时间，具有较低的毒性，并且不存在“手足综合征”问题，因此，可将它们用于减弱肿瘤生长。

Claims (49)

1.生产长期循环的非聚乙二醇化的脂质体的方法，包括：
将一种或多种磷脂以及固醇溶解于溶剂或溶剂的混合物中，其中，所述磷脂与固醇的摩尔比为1∶0.1到1∶2和
通过添加含水水合介质水合所述磷脂之前或之后蒸发所述溶剂以形成非聚乙二醇化的脂质体，
其中所使用的含水水合介质的量为每毫摩尔存在于所述脂类溶液中的磷脂使用10-35ml的范围，其特征在于
i)所述含水水合介质包括硫酸铵和蔗糖，其中，在所述含水水合介质中硫酸铵的浓度不低于125mmol/l，所述蔗糖的浓度为0.1M到0.5M；
ii)所述非聚乙二醇化的脂质体是通过从孔径为0.4μm-0.05μm的一系列过滤器中连续挤压以进行分级，从而使得所述脂质体的平均大小为直径0.06μm-0.16μm。
2.如权利要求1的方法，其中，所使用的含水水合介质的量为每毫摩尔所述脂类溶液中的磷脂使用30ml。
3.如权利要求1的生产非聚乙二醇化的脂质体方法，还包括用治疗剂或诊断剂加载所述脂质体。
4.如权利要求3的方法，其中，所述治疗剂是抗肿瘤剂。
5.如权利要求4的方法，其中，所述抗肿瘤剂选自：盐酸阿霉素、盐酸柔红霉素和盐酸表阿霉素。
6.如权利要求5的方法，其中，所述抗肿瘤剂是盐酸阿霉素。
7.如权利要求1的方法，其中，所述磷脂与固醇的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
8.如权利要求7的方法，其中，所述磷脂与固醇的摩尔比为1∶0.7。
9.如权利要求1的方法，其中，所述磷脂的相变温度为40-60℃。
10.如权利要求9的方法，其中，所述磷脂具有最少十六个碳的脂肪酸链。
11.如权利要求9或10的方法，其中，所述磷脂选自：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱。
12.如权利要求1至11中任一项的方法，其中，所述磷脂是二硬脂酰磷脂酰胆碱，并且，其中所述固醇是胆固醇。
13.用权利要求1的方法生产的脂质体。
14.如权利要求13的脂质体，其中，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱，并且所述固醇包括胆固醇。
15.如权利要求14的脂质体，其中，所述非聚乙二醇化的脂质体还包括治疗剂或诊断剂。
16.如权利要求15的脂质体，其中，所述治疗剂为抗肿瘤剂。
17.如权利要求16的脂质体，其中，所述抗肿瘤剂选自：盐酸阿霉素、盐酸柔红霉素和盐酸表阿霉素。
18.如权利要求17的脂质体，其中，所述抗肿瘤剂是盐酸阿霉素。
19.用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物，包括阿霉素，
前述任一项权利要求所制备的非聚乙二醇化的脂质体，
浓度为1-100mM的盐酸组氨酸，和浓度为0.1M-0.5M的蔗糖；
其中，被囊化在脂质体中的阿霉素的浓度为1mM-10mM，以盐酸阿霉素形式表示，
所述的非聚乙二醇化的脂质体包括一种或多种脂质，胆固醇和蔗糖，
其中，所述的一种或多种脂质为选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱；
其中，所述磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比为1∶0.6-1∶0.8；其中，所述脂质体的直径平均大小为0.06μm-0.16μm；和
其中，当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，所述非聚乙二醇化的阿霉素脂质体在血液中的循环时间是阿霉素制剂ADRIAMYCIN的至少25倍。
20.如权利要求19的组合物，其中，所述盐酸阿霉素的浓度为3mM-7mM。
21.如权利要求20的组合物，其中，所述盐酸阿霉素的浓度为3.45mM。
22.如权利要求20的组合物，其中，所述盐酸阿霉素的浓度为6.9mM。
23.如权利要求19的组合物，其中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比为1∶0.7。
24.如权利要求19的组合物，其中，所述盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2-1∶15。
25.如权利要求24的组合物，其中，所述盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶3.5。
26.如权利要求19的组合物，其中，所述蔗糖的浓度为0.29M。
27.如权利要求19的组合物，其中，所述盐酸组氨酸的浓度为8-12mM。
28.如权利要求27的组合物，其中，所述盐酸组氨酸的浓度为10mM。
29.如权利要求19的组合物，其中，所述脂质体的直径平均大小为0.08μm-0.12μm。
30.如权利要求19的组合物，其中，所述盐酸阿霉素以2mg/ml存在；且
其中盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶3.5；和
其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱与胆固醇的比例为1∶0.7。
31.如权利要求19的组合物，其中，所述盐酸阿霉素以4mg/ml存在；且
其中，盐酸阿霉素与二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶3.5；和
其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱与胆固醇的比例为1∶0.7。
32.如权利要求19的组合物，其中，当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，其在血液中的循环时间是用阿霉素制剂ADRIAMYCIN获得的循环时间的至少40倍。
33.生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，包括
(a)将一种或多种磷脂和固醇溶解在一种溶剂或溶剂的混合物中，
(b)在通过添加含水水合介质水合脂类之前或之后蒸发所述溶剂，以便在脂质体组合物中形成脂质体，其中，所述含水水合介质包括硫酸铵和蔗糖，并且，其中，所述含水水合介质是以每毫摩尔磷脂10ml-35ml的量添加的；
(c)将在步骤(b)结束时获得的脂质体组合物中的脂质体经过滤器中连续挤压以分级为0.060μm-0.16μm；
(d)使用包括盐酸组氨酸和蔗糖的蔗糖-组氨酸缓冲溶液进行透析从业已在步骤(c)中进行分级的脂质体组合物中除去脂质体外的硫酸铵，其中，所使用的蔗糖-组氨酸缓冲溶液中蔗糖与盐酸组氨酸的摩尔比为29∶0.1到29∶10；
(e)将盐酸阿霉素溶解在所述蔗糖-组氨酸缓冲溶液中，以便获得浓度至少为25mM盐酸阿霉素的溶液；
(f)混合在步骤(e)中获得的盐酸阿霉素溶液和在步骤(d)结束时获得的脂质体组合物，以便获得盐酸阿霉素加载的脂质体组合物；
(g)通过选自：切向流过滤、柱层析和用树脂处理的方法从所述脂质体组合物中除去脂质体外的盐酸阿霉素；
(h)用所述蔗糖-组氨酸缓冲溶液补足在步骤(g)结束时获得的脂质体组合物的体积，以便获得具有所需浓度的盐酸阿霉素的脂质体组合物；
(i)通过使用无菌0.2μ灭菌级过滤器将所述脂质体组合物无菌过滤到无菌容器中，以便获得所述脂质体阿霉素组合物。
34.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，还包括将所述脂质体盐酸阿霉素组合物填充到无菌脱热原的容器中，并且在惰性气体的覆盖下密封所述容器。
35.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中所述含水水合介质中硫酸铵的浓度不低于125mM/l。
36.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中在蔗糖-组氨酸缓冲溶液中，蔗糖与盐酸组氨酸的摩尔比为29∶1。
37.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述盐酸阿霉素的浓度为1mM-10mM。
38.如权利要求37的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述盐酸阿霉素的浓度为3.45mM。
39.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱∶胆固醇的摩尔比为1∶0.6-1∶0.8。
40.如权利要求39的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱∶胆固醇的摩尔比为1∶0.7。
41.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，盐酸阿霉素∶二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔为1∶2-1∶15。
42.如权利要求41的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，盐酸阿霉素∶二硬脂酰磷脂酰胆碱的摩尔为1∶3.5。
43.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述蔗糖的浓度为0.1M-0.5M。
44.如权利要求43的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述蔗糖的浓度为0.25M-0.3M。
45.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述盐酸组氨酸的浓度为1mM-100mM。
46.如权利要求45的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述盐酸组氨酸的浓度为8mM-12mM。
47.如权利要求46的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中，所述盐酸组氨酸的浓度为10mM。
48.如权利要求33的生产用于肠胃外施用的长期循环的非-聚乙二醇化的脂质体阿霉素组合物的方法，其中当以相等的剂量在swiss白化小鼠中测定时，其在血液中的1/2循环时间是用阿霉素制剂ADRIAMYCIN获得的时间的至少25倍。
49.生产长期循环的非-聚乙二醇化的分级的脂质体的方法，包括；
将一种或多种磷脂和固醇溶解在溶剂或溶剂的混合物中，其中，所述磷脂与固醇的摩尔比为1∶0.1到1∶2；
通过添加含水水合介质水合磷脂之前或之后蒸发所述溶剂，以形成非聚乙二醇化的脂质体；
其中，所使用的含水水合介质的量为每毫摩尔存在于脂类溶液中的磷脂使用10-35ml；
所述含水水合介质包括硫酸铵和蔗糖，其中，在所述含水水合介质中硫酸铵的浓度不低于125mmol/l，所述蔗糖的浓度为0.1M到0.5M；
所述非聚乙二醇化的脂质体是通过从孔径为0.4μm-0.05μm的一系列过滤器中连续挤压以进行分级，从而使得所述脂质体的平均大小为直径0.06μm-0.16μm以便形成脂质体组合物；
用蔗糖-组氨酸缓冲溶液从所述脂质体组合物中除去脂质体外水合盐，以便形成非聚乙二醇化的分级的脂质体。
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