CN103933024B - 用于抗肿瘤的脂质体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：所述脂质体组合物内包裹有大蒜素和白藜芦醇。本发明还提供了所述脂质体组合物的制备方法。本发明所述的脂质体组合物通过工艺调整，克服了包裹多种成分包裹率不高、不稳定的问题，同时，通过药效研究，达到了极好的抑制肿瘤的效果，开拓了抗肿瘤脂质体领域的新篇章。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于抗肿瘤的脂质体组合物。
背景技术
脂质体(liposomes)是一种类似生物膜结构的双分子层囊泡。自20世纪60年代英国学者Bangham等首次报道脂质体结构以来，脂质体得到了越来越多的重视。1971年英国科学家Rymen等人开始将脂质体作为药物载体，使其在药学领域中得到了广泛应用，迅速发展为新型药物输送系统。脂质体具有长效、降低毒性及保护包封药物的优点，同时还存在一些缺点：一般的脂质体的靶向性主要集中于网状内皮细胞丰富的器官，若想对其他组织器官进行治疗其靶向性不明显；脂质体的稳定性不够，用常规方法制得的脂质体易于聚集和融和，有效期较短；脂质体内容物的泄漏，通常脂质体在保存过程中，内容物或多或少都会发生泄漏，尤其是对某些水溶性药物；对不同的药物，脂质体的包封率和载药量差别很大，有些药物的载药量极低，这就很难发挥药物的作用。
在国际医药发展回归自然、传统医药发掘及应用的新形势下，中药制剂的现代化研究已成为医药领域研究的热点，通过查阅，可以看到中药脂质体的制备方法与西药相比要少，许多新的方法都未能使用，脂质体存在的上述问题，中药脂质体也不例外，而且受到中药有效成分的制约。目前中药脂质体的制备还处在不断的摸索研究阶段。
白藜芦醇对心血管疾病和肿瘤的预防保健作用已经引起深入研究，但是由于白藜芦醇难溶于水，并且对光不稳定等缺陷，其在体内吸收差，生物利用度高，从而导致临床效果不够理想，目前已有文献关于白藜芦醇脂质体的研究，但使用方法相对传统，且无法解决靶向、脂质体稳定性、泄露等问题。而关于多成分的组合物脂质体，由于针对不同成分选择的方法不同，因此，组合物脂质体的研究少之又少。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种用于抗肿瘤的脂质体组合物，是含有白藜芦醇与大蒜素两种有效成分，且具有靶向稳定性的脂质体组合物。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：所述脂质体组合物内包裹有大蒜素和白藜芦醇。
所述大蒜素与白藜芦醇的质量比为3-4: 1。
本发明还提供了所述脂质体组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）合成靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物：由固相合成法合成RGD肽-6-氨基己酸臂复合物；
2）称取重量比的白藜芦醇和大蒜素，与磷脂、稳定剂、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂按一定比例溶于乙醚，加入一定体积的PBS，冰水浴中超声搅拌，形成乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发，再调高真空度继续减压蒸发，形成水性悬液，用氩气吹拂，再加入蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声，用高压均质机均值，0.2微米聚碳酸酯末挤出，PVDF膜无菌过滤，分装入西林瓶，冷冻干燥，西林瓶中通氩气，压盖密封。
进一步地，步骤1）中所述RGD肽序列为：甘氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸。
进一步地，步骤2）中所述的磷脂为氢化饱和磷脂，优选氢化饱和大豆磷脂、氢化饱和卵磷脂或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
进一步地，步骤2）中所述的稳定剂为胆固醇和多羟基物质的组合，所述胆固醇与多羟基物质的重量比为1:2-4。
所述多羟基物质为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、环糊精、乙二醇、木糖醇、山梨醇或甘油。
进一步地，步骤2）中所述磷脂、稳定剂、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂的重量比为10:1-1.5:0.025-0.030:0.5-0.6:100，优选10:1.1:0.027：0.5:100。
进一步地，步骤2）中大蒜素与磷脂的质量比为：2.1-2.9：1。
本发明还提供一种含有所述脂质体组合物的制剂，所述脂质体组合物包裹在海藻酸盐-壳聚糖胶囊内。这种制剂可使脂质体组合物安全通过胃的酸性环境而到肠道的中性环境，使之顺利吸收。
本发明所述的脂质体组合物通过工艺调整，克服了包裹多种成分包裹率不高、不稳定的问题，同时，通过药效研究，达到了极好的抑制肿瘤的效果，开拓了抗肿瘤脂质体领域的新篇章。
附图说明
图1为本发明所述的肿瘤体积变化的统计图。
具体实施方式
以下实施例靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物由上海华大天源生物科技有限公司合成，所用试剂均为市售。
实施例1
一种用于抗肿瘤的脂质体组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）称取大蒜素21g,白藜芦醇7g，氢化饱和大豆磷脂10g，胆固醇0.25g，环糊精0.75g，RGD肽-6-氨基己酸臂复合物0.025g, DSPC-PEG2000为0.5g,非离子表面活性剂100g;
2）合成靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物：由固相合成法合成RGD肽-6-氨基己酸臂复合物，RGD肽序列为：甘氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸；
3）将已经称好的配比量的的白藜芦醇和大蒜素，与氢化饱和大豆磷脂、胆固醇、环糊精、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂溶于乙醚，加入150ml的PBS，冰水浴中超声搅拌，形成乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发，再调高真空度继续减压蒸发，形成水性悬液，用氩气吹拂，再加入50ml蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声，用高压均质机均值，0.2微米聚碳酸酯末挤出，PVDF膜无菌过滤，分装入西林瓶，冷冻干燥，西林瓶中通氩气，压盖密封。
实施例2
一种用于抗肿瘤的脂质体组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）称取大蒜素29g,白藜芦醇7g，氢化饱和卵磷脂10g，胆固醇0.3g，葡萄糖1.2g，RGD肽-6-氨基己酸臂复合物0.030g, DSPC-PEG2000为0.6g,非离子表面活性剂100g;
2）合成靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物：由固相合成法合成RGD肽-6-氨基己酸臂复合物，RGD肽序列为：甘氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸；
3）将已经称好的配比量的的白藜芦醇和大蒜素，与氢化饱和卵磷脂、胆固醇、葡萄糖、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂溶于乙醚，加入150ml的PBS，冰水浴中超声搅拌，形成乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发，再调高真空度继续减压蒸发，形成水性悬液，用氩气吹拂，再加入50ml蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声，用高压均质机均值，0.2微米聚碳酸酯末挤出，PVDF膜无菌过滤，分装入西林瓶，冷冻干燥，西林瓶中通氩气，压盖密封。
实施例3
一种用于抗肿瘤的脂质体组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）称取大蒜素24g,白藜芦醇6g，二硬脂酰磷脂酰胆碱10g，胆固醇0.4g，山梨醇0.8g，RGD肽-6-氨基己酸臂复合物0.028g, DSPC-PEG2000为0.55g,非离子表面活性剂100g;
2）合成靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物：由固相合成法合成RGD肽-6-氨基己酸臂复合物，RGD肽序列为：甘氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸；
3）将已经称好的配比量的的白藜芦醇和大蒜素，与二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、山梨醇、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂溶于乙醚，加入150ml的PBS，冰水浴中超声搅拌，形成乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发，再调高真空度继续减压蒸发，形成水性悬液，用氩气吹拂，再加入50ml蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声，用高压均质机均值，0.2微米聚碳酸酯末挤出，PVDF膜无菌过滤，分装入西林瓶，冷冻干燥，西林瓶中通氩气，压盖密封。
针对实施例1-3所制备的脂质体组合物的各项性能检测如下，所用的的实验动物模型构建方法为：SPF级BALB/c雌性裸鼠，体质量为18±2g，4周龄，将肺腺癌细胞A549培养至对数生长期，胰酶消化，然后用无血清培养液稀释成细胞悬液，取1×106个（1ml）细胞接种于BALB/c裸鼠右腋皮下。肿瘤大小的计算方法，肿瘤体积V（mm3）=实体瘤最长径（mm）×实体瘤最短径（mm）2/2。
1.实施例1-3所制备的脂质体组合物的包封率
实施例1-3所制备的脂质体组合物经11000r/min超滤1h后，收集下清液，高效液相色谱法分别测定其中的大蒜素和白藜芦醇含量，记为W游离，将脂质体组合物经无水乙醇完全破膜后，高效液相色谱法分别测定其中的大蒜素和白藜芦醇含量，记为W总，包封率=（W总-W游离）/W总×100%,经测定大蒜素的包封率为（96.05±2.12）%，白藜芦醇的包封率为（94.13±2.09）%。
2.实施例1-3所制备的脂质体组合物稳定性试验
将实施例1-3所制备的脂质体组合物在10℃长期储存和在室温下储存，用水复溶后，结果见表1和表2：
表1 脂质体组合物在10℃长期储存稳定性结果
| 时间（月） | 0 | 6 | 12 | 18 | 24 |
| 实施例1 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
| 实施例2 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
| 实施例3 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
表2 脂质体组合物在室温下储存稳定性结果
| 时间（h） | 0 | 12 | 24 | 36 | 48 |
| 实施例1 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
| 实施例2 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
| 实施例3 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 | 无结晶析出，均匀不聚集 |
3.检测脂质体组合物的组织分布
荷瘤裸鼠模型的肿瘤大小生长至100-200mm3时，分为2组，每组5只，分别尾静脉注射大蒜素和白藜芦醇形成的组合物（对照组），实施例1所制备的脂质体组合物（实验组），分别在药物注射后0.15，0.6，1，2，4，8h，取小鼠的心、肝、脾、肺、肾，肿瘤清洗称重，组织匀浆、通过HPLC法测定组织内药物的量。
实验发现脂质体中药物释放较为缓慢，在注射后8h时，仍能测出较高的浓度，具体药物组织分布如表3所示，可以看出肿瘤细胞中药物的累计量有所提高，而心、肝、脾和肾中药物分布有所减少。
表3 药物的组织分布
| 心 | 肝 | 脾 | 肺 | 肾 | 肿瘤 | |
| 对照组大蒜素分布 | 0.81 | 1.25 | 0.99 | 0.89 | 1.06 | 0.48 |
| 对照组白藜芦醇分布 | 0.29 | 0.34 | 0.51 | 0.23 | 0.33 | 0.12 |
| 实验组大蒜素分布 | 0.41 | 0.92 | 0.28 | 0.50 | 0.39 | 2.98 |
| 对照组白藜芦醇分布 | 0.11 | 0.40 | 0.15 | 0.20 | 0.09 | 0.87 |
4.不同剂型脂质体组合物的体内抑瘤作用
荷瘤裸鼠模型建立7天后，随机分为6组，每组5只，取实施例1所制备的脂质体组合物用0.9%的NaCl溶液复溶，分别尾静脉给药，给药方式为：等体积的0.9%的NaCl溶液（对照组），取实施例1所制备的脂质体组合物浓度分别为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg（实验组），第7天起观察荷瘤小鼠的状况，同时每周2次侧体重和肿瘤体积，当对照组肿瘤大小超过2000 mm3时结束观察，称重，眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠并剥离肿瘤，记录瘤重，瘤重变化如图1所示。肿瘤抑制率计算公式：抑制率=[（对照组瘤重-给药组瘤重）/对照组瘤重]×100%，结果见表4所示。通过试验结果发现，实施例1所制备的脂质体组合物具有良好的抗肿瘤效果。
表4 肿瘤抑制率计算
| 瘤重（g） | 抑制率 | |
| 对照组 | 2.32±0.032 | 0 |
| 实验组10mg/kg | 1.12±0.213 | 51.90 |
| 实验组20mg/kg | 0.83±0.098 | 64.29 |
| 实验组40mg/kg | 0.57±0.099 | 75.24 |
| 实验组80mg/kg | 0.92±0.141 | 60.48 |
Claims (5)
1.用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：所述脂质体组合物内包裹有大蒜素和白藜芦醇；所述大蒜素与白藜芦醇的质量比为3-4: 1；
所述脂质体组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）合成靶向RGD肽-6-氨基己酸臂复合物：由固相合成法合成RGD肽-6-氨基己酸臂复合物；
2）称取重量比的白藜芦醇和大蒜素，与磷脂、稳定剂、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂按一定比例溶于乙醚，加入一定体积的PBS，冰水浴中超声搅拌，形成乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发，再调高真空度继续减压蒸发，形成水性悬液，用氩气吹拂，再加入蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声，用高压均质机均值，0.2微米聚碳酸酯末挤出，PVDF膜无菌过滤，分装入西林瓶，冷冻干燥，西林瓶中通氩气，压盖密封；
步骤1）中所述RGD肽序列为：甘氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸；
步骤2）中所述的稳定剂为胆固醇和多羟基物质的组合，所述胆固醇与多羟基物质的重量比为1:2-4；所述多羟基物质为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、环糊精、乙二醇、木糖醇、山梨醇或甘油；步骤2）中所述磷脂、稳定剂、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂的重量比为10:1-1.5:0.025-0.030:0.5-0.6:100；步骤2）中大蒜素与磷脂的质量比为：2.1-2.9：1。
2.根据权利要求1所述的用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：步骤2）中所述的磷脂为氢化饱和磷脂。
3.根据权利要求2所述的用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：步骤2）中所述的磷脂为氢化饱和大豆磷脂、氢化饱和卵磷脂或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
4.根据权利要求1所述的用于抗肿瘤的脂质体组合物，其特征在于：步骤2）中所述磷脂、稳定剂、RGD肽-6-氨基己酸臂复合物、DSPC-PEG2000和非离子表面活性剂的重量比为10:1.1:0.027：0.5:100。
5.一种权利要求1-4任一项所述的脂质体组合物的制剂，其特征在于：所述脂质体组合物包裹在海藻酸盐-壳聚糖胶囊内。
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