JP5107573B2 - 増殖抑制性脂質由来生物活性化合物の全身送達方法およびシステム - Google Patents

Description

本発明はナノテクノロジーの分野に関する。より特定的には本発明は、治療用生物活性脂質化合物および／または疎水性化学療法剤および／またはヌクレオチド／遺伝子薬をかかる治療が必要な個体に全身送達するためのナノスケール集合体システムを提供する。

１９５９年、Richard Keynmanが“There’s a Plenty of Room at the Bottoms,”と題する講演で生存細胞の複雑さと小ささに言及し、「我々に必要なことをなし得る極小物を作製すること」を科学界に喚起した。この講演が端緒となり、それ以来、ナノテクノロジーは生命科学と分かち難く結び付いている（Feynman,R.P.,1959,入手アドレス：http://www.zyvex.com/nanotech/feynman.html）。商業的なナノバイオテクノロジーはいまだ揺籃期にとどまっているが、過去十年間のナノスケール集合体システムの開発速度は指数関数的に加速しており、その理由は、これらのシステムが薬物の送達および治療法に独特の利点を与えるからである。いくつかのナノスケール集合体システムの例には、リポソーム、デンドリマーおよびヒドロゲルのような重合体構造、並びに、量子ドットと呼ばれる金属または半導体のナノ粒子がある。

生存可能な細胞に転写活性ＤＮＡを導入するため、また、機能性ペプチドやタンパク質さえをも導入するために有効な多くの試薬が可用である。しかしながら、生存細胞に生物活性脂質を送達する方法が一般的に可用であるとはいえない。生物活性スフィンゴ脂質およびリン脂質の代謝産物、類似体、模擬体または誘導体の送達とそれらの細胞内インターカレーションとは、これらの脂質を疎水性および細胞不透過性にする細胞の物理的−化学的特性によって妨害される。

セラミドは細胞分化、細胞周期の停止および／またはアポトーシスの誘導を変調する脂質由来の第二メッセンジャーとして作用するスフィンゴ脂質であり、外的投与に問題がある生物活性脂質の一例である。増殖因子の欠損、サイトカイン、化学療法およびその他の細胞障害剤、電離放射線、熱ショックのような多数の刺激、および、種々の環境要因の結果として細胞内にセラミドが蓄積する。これらの刺激は、Ａｋｔ生存促進経路の阻害およびカスパーゼ活性の刺激のようなセラミド仲介シグナル伝達カスケードを開始させ、最終的にＤＮＡの断片化および細胞死に導くことが観察された。このように、セラミドが細胞の増殖、分化および致死の調節能力をもつこと、および、セラミドが離散的キナーゼをターゲットしまた増殖および／または生き残りに導くシグナル伝達経路をターゲットする天然分子であるという事実に基づいて、セラミドが癌および心血管疾患の治療薬であると確認された。

薬物溶出プラットフォームから細胞透過性セラミド類似体Ｃ_６の局所送達を臨床使用することは、先にＣｈａｒｌｅｓら(Circ.Res.2000 Aug.18:87(4):282-8)によって証明された。より詳細には、セラミドをコートしたバルーンカテーテルは、伸展傷害を生じた血管平滑筋細胞中で細胞周期の停止を誘導することが示された。セラミド被覆された膨張バルーンからのＣ_６−セラミドの送達によって血管系への直接送達は可能であるが、癌の化学療法またはアテローム性動脈硬化症の散在性病巣および脆弱なプラークのターゲティングのような全身投与によるセラミドの送達には幾つかの障碍が存在する。細胞透過性の向上した短鎖の誘導体を使用するとしても、特にセラミドの全身送達には３つの重大な障害が存在する。

第一に、Ｃ_２、Ｃ_６およびＣ_８−セラミドのような短鎖の細胞透過性セラミド類似体はやはり脂質であり、従って本来的に極めて疎水性であり、ＤＭＳＯまたはエタノールビヒクル中で細胞培地に添加すると微細な脂質ミセル懸濁液として沈殿する。第二に、短鎖セラミド類似体は長鎖の生理的セラミド（Ｃ_１８−Ｃ_２４−セラミド）よりも細胞透過性は大きいが、それらのスフィンゴ系主鎖が形質膜へのそれらのインターカレーションを制限する。最後に、循環性および細胞内セラミダーゼの存在により、生物活性セラミドの、プロアポトーシスの低下した代謝産物への変換が促進される。

細胞へのセラミドの送達を増進するために有機溶媒系が検討された。培養培地に不溶性のドデカン／エタノール溶媒系をセラミドと共に沈殿させ、形質膜と融合する極小液滴またはミセルを形成させることが提案された。このような沈殿性溶媒の使用は粒度の不均一性および細胞膜へのアクセスによって制限される。ウシ血清アルブミンのようなタンパク質アジュバントも非特異的脂質／タンパク質相互作用を介してｉｎ ｖｉｔｒｏのセラミド送達を支援できるが、十分な量のＣ_６−セラミドを全身ターゲットに効率的に送達することはできなかった。

従って、生物活性脂質または遺伝子治療薬の有効な治療効果を発揮させるために、このような疎水性のまたは帯電した化学治療用化合物を治療が必要な動物またヒトの生存細胞に送達する改良された全身送達システムが要望されている。

本発明は、増殖抑制性で、プロアポトーシスの(pro-apoptotic)脂質由来生物活性薬および／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬をこれらの薬剤が必要な動物またはヒトにナノスケール集合体システム(nanoscale assembly system)を使用して送達する全身送達を最適に行うシステムおよび方法を提供することによってこの差し迫った要望に応えようとするものである。

本発明は、増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性治療用化合物および／または遺伝子治療薬をそれらによる治療が必要な動物またはヒトの生存細胞にナノスケール集合体システムを使用して送達する全身送達を最高度に行うシステムおよび方法を提供する。ナノスケール集合体システムは例えば、リポソーム、吸収性非凝集性の分散ナノ粒子、金属または半導体のナノ粒子、または、デンドリマーもしくはヒドロゲルのような高分子材料であり、これらの材料の各々は、改善された脂質溶解度、細胞透過性、延長された循環半減期、および、腫瘍もしくは血管へのターゲティング効率の改善を伴う薬物動態プロフィルを有している。

本発明の１つの実施態様では、本文中で「ＰＥＧ修飾(pegylated)」リポソームと呼ぶ、生物活性脂質、タンパク質および治療薬の送達に好適なポリエチレングリコール４５０リポソームが、増殖抑制性脂質由来の生物活性化合物および／または遺伝子治療薬および／またはコレステロールからなる１つまたは複数の膜を有するように処方される。これらのＰＥＧ修飾リポソームは、分子量７５０〜５０００のサイズ範囲のＰＥＧ Ｃ８（ＰＥＧ修飾細胞透過性セラミド）および／または分子量２０００〜５０００のサイズ範囲のＰＥＧ ＤＳＰＥ（ジステロイルホスファチジルエタノールアミン）を含有するように処方されている。本発明の実施態様では、脂質二重層を安定化するためにＰＥＧ Ｃ８を使用しており、これにより、このリポソームが遊離生物活性Ｃ６セラミドを高モル量（即ち、３０％）で含有できる。更に、この実施態様では、ＰＥＧ Ｃ８を、生物活性セラミドおよび／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬を含有するリポソームの一体的成分として使用している。尚、ＰＥＧ−Ｃ８が配合されたリポソームは、カベオリン富化脂質ラフトへの遊離セラミドの最適なインターカレーション(intercalation)および局在化を確保するが、このことは、膜インターナリゼーション(internalization)およびミトコンドリアのような細胞小器官への移入に必要な前提条件であり、その結果としてターゲット組織または腫瘍のアポトーシスまたはプログラム細胞死が誘導されるのである。「ステルス(stealth)」リポソームとしても知られたＰＥＧ修飾リポソームは、網状内皮系（ＲＥＳ）による循環からのクリアランスを回避でき、これは循環半減期および組織ターゲティングの改善に導く。抗体および／または受容体リガンドのような、体内の特定の細胞または組織へのターゲット指向性(targeted)蓄積を促進する特定のターゲティング成分をコンジュケートすることによってターゲティング効率の向上を果たし得る。追加実施態様では、脂質治療薬がまた、ＰＥＧ−Ｃ_８の存在下または非存在下で、負に帯電したオリゴヌクレオチドを有効に送達するためのカチオン性脂質からなる「カチオン性」リポソームに配合できること、または、ＰＥＧ−Ｃ_８の存在下または非存在下で、「融合性(fusogenic)」リポソーム（この場合、リポソームの膜全体がターゲット部位の細胞膜に融合しリポソームの構成成分および内容物が細胞内部に送達される。）として配合できることを主張する。

本発明の別の実施態様では、カルシウムホスホ−シリケート(calcium phospho-silicate)（ＣＰＳ）シェルを有している吸収性ナノ粒子が提供される。この実施態様では、増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物および／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬が、吸収性ナノ粒子に充填されている。本発明の吸収性ナノ粒子は、普通なら循環によって輸送できない化学治療用の疎水性脂質もしくは薬物または遺伝子治療薬を生存細胞に全身送達できる。吸収性ナノ粒子の合成の根幹を成す要件は、ナノ粒子が水性液体媒体に適切に分散すること（凝集しないこと）である。分散液を得るための１つの方法では、シリケート含有シェルナノ粒子用に特別に修正された(modified)サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する。ナノ粒子の分散液を得るための別の方法では、有機、無機または金属−有機分散剤をＣＰＳ外殻に結合させる。更に、ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子の「分散した」非凝集状態をいっそう確実にするためおよびＰＥＧカップリング剤に対するターゲティング部分のコンジュゲート点を提供するために、カルボジイミド仲介(mediated)ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤をアルキルアミンシランまたはアルキルカルボン酸のカップリング剤に結合させることもでき、こうすればナノ粒子が特定の細胞内薬物送達部位をターゲットし得る。

本発明の別の実施態様では、「バイオスマート(bio-smart)」、即ち、物理的または化学的刺激に応答性であり、同時にｉｎ ｖｉｖｏで生物分解性であり、さらに増殖抑制性の脂質由来生物活性化合物および／または遺伝子治療薬を充填できる材料を形成するために、個々のポリマーを組合せることができる。

本発明は、増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性治療用化合物および／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬をかかる治療が必要な動物またはヒトの生存細胞にナノスケール集合体システムを利用して送達する全身送達を最高度にかつ高いターゲティング効率で行う方法およびシステムを提供する。ナノスケール集合体システムは、リポソーム、吸収性で非凝集性のナノ粒子、金属もしくは半導体のナノ粒子、または、デンドリマーもしくはヒドロゲルのような高分子材料、などである。このようなナノ粒子の各々が、改善された脂質溶解度、細胞透過性、延長された循環半減期、および、腫瘍または血管へのターゲティング効率の改善を伴う薬物動態プロフィルを示す。

本明細書中で使用した「増殖抑制性(growth arresting)」という用語は、近傍組織から放出される増殖因子またはサイトカインにもはや応答しない生存細胞を意味する。「増殖抑制」という用語は更に、細胞がそれらのＤＮＡを複製せず増殖しないことを含意する。

本明細書中で使用した「プロアポトーシスの(pro-apoptotic)」という用語は、プログラム細胞死の過程を経験する生存細胞または腫瘍組織について言及するものである。

本明細書中で使用した「脂質由来」という用語は、生物膜に見出される天然脂質の代謝産物である物質を意味する。

本明細書中で使用した「生物活性」という用語は、情報を変換し、細胞の形質膜から核へのシグナル伝達カスケードを開始させる作用因子を意味する。これによって、特定の遺伝子が活性化されるかまたは不活性化され、その結果として細胞の表現型が変化する（即ち、増殖抑制および／またはアポトーシス）。

本文中で使用した「ナノスケール」および「ナノサイズ」という用語は、粒子がほぼ３００ｎｍよりも小さい平均寸法を有すること、および、バルク相に通常は付随しない特性例えば量子光学効果を示すことを含意する特別な微細分割状態を意味する。

本明細書中で使用した「疎水性化学療法剤」という成句は、細胞増殖を低下させおよび／または細胞アポトーシスを誘導するための薬物として使用され水性環境に比較的不溶性である小分子、ペプチド、タンパク質、ペプチド模擬体および脂質模擬体を意味する。

本明細書中で使用した「ナノ複合粒子」および「ナノ粒子」という用語は互換的である。

本明細書中で使用した「凝集」という用語は、物理的な力（例えば、ファン・デル・ワールス力または疎水力）または静電気の力による懸濁液中の凝結体（粒状サブユニットからなる凝集塊）の形成を意味する。形成された構造を「凝集体」と呼ぶ。

本明細書中で使用した非凝結性という用語は、「分散した」生物粒体の状態を意味する。

より特定的には本発明は、化学治療用疎水性化合物をかかる治療が必要な動物またはヒトに送達するための、ナノスケール集合体システムと増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物または遺伝子治療薬とを含む、全身性、持続性またはターゲット指向性の送達システムおよび方法を提供する。ナノスケール集合体システムの非限定例は、リポソーム、カルシウムホスホ−シリケート（ＣＰＳ）シェルによってカプセル化できる吸収性ナノ粒子、または、生物応答性（バイオスマート）および生物分解性の双方であるように形成できるデンドリマーもしくはヒドロゲルのような高分子材料である。

増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物または遺伝子治療薬は、癌、新生物、動脈炎症疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、脆弱なプラークまたは糖尿病のような増殖機能異常を含む病態を治療するために、静脈内、カテーテル送達、注入ポンプ、ミクロスフェア、または、軟膏を介して全身送達される。

増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物の非限定例は、生理的セラミドおよび／または誘導体、炭素数２〜１０のユニットからなる短鎖脂肪酸をＳＮ−２位に有している細胞透過性セラミドおよび／または誘導体、ジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、エーテル結合ジグリセリド、エーテル結合ホスファチジン酸、スフィンゴシンまたはスフィンガニンである。遺伝子治療薬の非限定例は、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡ−ザイム、プラスミド、アンチセンスまたはコンベンショナルＳｉ−ＲＮＡまたはウイルス（ＡＡＶ，ＡＶまたはレンチ）発現Ｓｉ−ＲＮＡである。

本発明の１つの実施態様では、増殖抑制性の脂質由来生物活性化合物または遺伝子治療薬および／またはコレステロールからなる１つまたは複数の膜を有する、疎水性生物活性脂質、タンパク質および治療薬の送達に好適で本明細書中で「ＰＥＧ修飾」リポソーム類と呼ぶＰＥＧ−７５０−Ｃ_８および／またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ（分子量２０００〜５０００）リポソームが処方される。網状内皮系（ＲＥＳ）による循環からのクリアランスを逃れることができ、また、体内の特定の細胞または組織をターゲットする抗体または受容体リガンドのような結合因子と結合できる、「ステルス」リポソームとしても知られている、ＰＥＧ−７５０−Ｃ_８およびＰＥＧ−ＤＳＰＥ（２０００〜５０００）で「ＰＥＧ修飾された」リポソームが処方され得る。リポソームは、他のコロイド粒子と同様に、通常はＲＥＳ、主として肝臓のクッパー細胞によって循環から速やかにクリアランスされて脾臓のマクロファージに定着する。ＲＥＳによるリポソーム取込み速度は、リポソームのオプソニン作用またはオプソニン不作用のプロセスに関係があると考えられる。従って、リポソームの治療有効性は、ＲＥＳによる認識を逃れて循環中により長期間滞留できる能力に左右される。「ステルス」リポソームという用語は、この回避性を表しており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質のような二重層適合種を含有する膜をもつリポソームに与えられた用語である。このように「ステルス」またはＰＥＧ修飾リポソームは、ＲＥＳから逃れることによって薬物放出リポソームの親水性および生体利用性を改善する能力を有しており、ＰＥＧ修飾リポソームの調製方法は、Ｂｌｕｍｅ，Ｇ．ら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０２９：９１−９７，１９９０）に報告されているように多年来公知である。更に、抗体および／または受容体リガンドのような、体内の特異的細胞または組織にターゲット指向性蓄積を促進する特定のターゲティング部分をＰＥＧにコンジュゲートすることによってターゲティング効率の向上を果たし得る。あるいは、この実施態様が、負に帯電したオリゴヌクレオチドを効果的に送達するために使用されるジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンのようなカチオン性脂質を含んでもよい。更に、リポソームの膜全体がターゲット部位の細胞膜と融合しリポソームの構成成分および内容物を細胞内に送達する「融合性」リポソームとして処方することもできる。融合性脂質は、水溶液中でヘキサゴナルコンホメーション(hexagonal conformation)を形成する不安定脂質であり、エンドサイトーシスプロセスまたは「融合性」プロセスを介して細胞膜に結合する逆ミセルを形成する。

従って、本発明のリポソームビヒクルは、Ｃ_６セラミドのような脂質由来生物活性化合物の全身送達に付随する主要な問題を、生物活性脂質が溶液から沈殿することを阻止し、より効果的に細胞に送達できるようにすることによって改善する。更にこの実施態様は、脂質二重層を安定化し、リポソームが少なくとも４０モルパーセントまでの濃度の遊離生物活性Ｃ_６セラミドを含有できるようにＰＥＧ−Ｃ８を使用している。更にこの実施態様は、ＰＥＧ−Ｃ８を生物活性セラミドおよび／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬を含有しているリポソームの一体的成分として使用している。更に、ＰＥＧ−Ｃ８が配合されたリポソームは、カベオリン富化脂質ラフトへの遊離セラミドの最適なインターカレーションおよび局在化を確保するが、このことは、膜インターナリゼーションおよびミトコンドリアのような細胞小器官への移入に必要な前提条件であり、その結果としてターゲット組織または腫瘍のアポトーシスまたはプログラム細胞死が誘導されるのである。

更に、本発明のリポソームは、治療用セラミド類似体の局所および全身送達に使用できる。例えば、塞栓摘出カテーテルのセラミド被覆バルーンからのＣ_６セラミドの直接局所送達は、伸展傷害後のウサギの新血管内膜過形成（再狭窄）を制限することが証明された（Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２０００Ａｕｇ．１８：２８２−８）。別のグループは、槽内および静脈内の双方に送達したＤＭＳＯビヒクル中の細胞透過性セラミド類似体が巣状脳虚血後のラットに神経保護効果を誘導することを証明した。リポソーム小胞中に追加治療薬と共に含有されたＣ_６セラミドのパッケージ化送達の臨床的可能性は重要である。複数の研究は、セラミドがパクリタクセルおよびフェンレチニドのような化学療法剤と相乗的に作用し得ることを示した。従って、Ｃ_６−配合リポソーム中の化学療法剤の組み合せ送達は、アポトーシス作用をいっそう増強し、同時にリポソーム製剤に使用した各薬剤の濃度を効果的に低下させることによって副作用を減らすであろう。更に、腫瘍特異的抗体または受容体リガンドとコンジュゲートしたターゲット指向性イムノリポソームにもＣ_６セラミド組込みが有益な効果を与えるであろう。

アポトーシスプログラムにセラミドが関与するメカニズムはほとんどわかっていないが、ポリ（Ａ）ＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＮＡ断片化、ホスファチジルセリン露出およびトリパンブルー取込みのようなアポトーシスの指標となるいくつかの現象にセラミド蓄積が関連していると考えられる（Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｎ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６０：６４３−６６５，１９９８）。更に、内因性セラミドは、ミトコンドリアの膜内部に蓄積し、その一部はシトクロムＣの放出を誘導し、その結果としてミトコンドリアの機能障害および最終的にアポトーシスを誘導する。セラミドは細胞内部の種々の代謝経路で産生され得る。例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、抗−Ｆａｓ、血清の回収およびその他の薬剤などによる細胞の種々の処理に応答して、酵素スフィンゴミエリナーゼがスフィンゴミエリンをセラミドにストレス誘導代謝変換させることがわかっている。更に、セラミドは、ｄｅ ｎｏｖｏ合成経路で産生され得る。この経路では、セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよび／またはセラミドシンターゼの活性化が重要な役割を果たすであろう（Ｇａｒｚｏｔｔｏ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：２２６０−２２６４，１９９８）。外部から添加されたセラミドは一般に、ストレス誘導アポトーシスを立体特異的に模倣でき、いくつかのケースでは、セラミドの形成阻害がアポトーシスの進行を阻害することが判明した（Ｗｉｅｓｎｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９８６８−９８７６，１９９７）。形質膜のカベオリン富化脂質ラフト内に外因性セラミドがインターカレーションして蓄積すると、ミトコンドリアのような細胞小器官内へのこれらのドメインのインターナリゼーションが促進されるであろう。

アポトーシスは計画的に編成された細胞の死を意味しており、生物が免疫系のような組織および系の増殖中、または、癌、再狭窄もしくはアテローム性動脈硬化症にしばしば観察される炎症を生じた調節不全の細胞もしくは組織中で、ホメオスタシスを維持するための重要な手段であることがわかっている（Ｆｒａｓｃａ，Ｌ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：５６９−５９４，１９９８）。実際、アポトーシスコントロールの消失は、発癌の指標となる現象である。セラミド類似体がｉｎ ｖｉｔｒｏの腫瘍形成性細胞中で細胞アポトーシスを誘導することは判明している。しかしながら、全身送達に関する問題が十分に解決されていないので、ｉｎ ｖｉｖｏのセラミドのアポトーシス作用および化学治療作用を証明する研究は今日まで存在していない。アポトーシスという用語はしばしばプログラムされた細胞死と互換的に使用されている。付随炎症応答が存在しないのが壊死による死との違いである。アポトーシスの特徴は、ミトコンドリア完全性の消失、核の凝縮、膜の気泡形成、クロマチンの断片化または膜の完全性の消失などを含む１つまたは複数のイベントが誘起され、結果的にホスファチジルセリン露出およびトリパンブルー取込みが生じることである（Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７３：１８９−１９７，１９９７）。これらの細胞性特徴の各々を調節する生化学的メカニズムはほとんど解明されていない。しかしながら、カスパーゼとして知られたシステインプロテアーゼファミリーの活性化がアポトーシスプロセスの進行に重要な役割を果たすと考えられている（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３１２−１３１６，１９９８）。このカスパーゼファミリーのうちのイニシエーターカスパーゼがアポトーシス刺激によって活性化され、次いで下流のエフェクターカスパーゼ類を活性化する。これらのエフェクターカスパーゼ類は多くの細胞内基質を有しており、これらの基質のうちには細胞ホメオスタシスに不可欠な成分もある。これらの基質の１つまたは複数が開裂されると細胞機能が調節不能になり、アポトーシスプログラムに特有の形態学的特徴が顕著になる（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３１２−１３１６，１９９８）。膜へのインターカレーションおよびインターナリゼーションとその後のアポトーシス誘導とに有効な遊離生物活性セラミドを約４０パーセントまでのモル比で含有できるようにＰＥＧ−Ｃ８がリポソームを安定化するメカニズムは本発明の上位概念に包含される。それゆえに、Ｃ_６セラミドのような化合物によるアポトーシスプロセスの変調を有効な治療方法にできるからである。

本発明の別の実施態様では、増殖抑制性の脂質由来生物活性化合物および／または遺伝子治療薬が、カルシウムホスホ−シリケート（ＣＰＳ）シェルと薬物コアとを有している薬物用および遺伝子治療用の吸収性ナノ粒子に充填されている。本発明の吸収性ナノ粒子は、普通なら循環中で輸送できない疎水性脂質またはタンパク質薬または遺伝子治療薬を生存細胞に全身的に送達できる。吸収性ナノ粒子は、１〜３００ｎｍの範囲、好ましくは５０ｎｍ未満、最も好ましくは２０ｎｍ以下の直径を有し得る。約２０ｎｍ以下の直径を有しているナノ粒子は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過でき、従って中枢神経系に直接の薬物送達が可能である。これは脳または神経の発癌性病巣を治療するための重要な利点である。これらのナノシステムはまた、腺癌、メラノーマ、前立腺、直腸、肺（エアロゾル送達）および乳の腫瘍を非限定例とする固形腫瘍、並びに、白血病のような非固形腫瘍にも適している。薬物コアは固体として送達されてもよくまたは水溶液中で送達されてもよい。コア−シェル粒子の製造手順の概略を図１に示す。

より特定的には、吸収性ナノ粒子の合成方法は、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ^ＴＭ ５２０ ＣＯ）のような非イオン性界面活性剤、または、極性ヘッド基と非極性テールとを有している他の任意の両親媒性化合物の使用を含む。これを、水とシクロヘキサンまたはイソ−オクタノールのような疎水性の非水性溶媒と組合せて逆ミセル構造を形成する。増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来化合物または遺伝子治療薬は、水と薬物または水と遺伝子治療薬との溶液、懸濁液またはミセル混合物として水相中に懸濁できる。活性薬物をコアに含有している得られた逆ミセルを、生理的環境、即ち、等張性環境で生物分解される無機の吸収可能なコーティングで被覆する。ＣＰＳは吸収可能なコーティングの一例であり、以下の組成を有している：Ｃａ_ｘ（ＰＯ_４）_ｙｚＳｉＯ_２、ここに０．１≦ｘ≦１０、０．１≦ｙ≦１０および０≦ｚ≦１０。この組成は生理的環境でシェルが種々の吸収速度を示すように調整できる。シリカ濃度が高いほど、また、カルシウムおよびリン酸塩の濃度が低いほど吸収速度が遅くなる。

吸収性ナノ粒子の合成の根幹を成す要件は、ナノ粒子を液体媒体中に適正に分散させることである。適当な液体の非限定例は、脱イオン水、生理的塩類溶液、水−エタノール混合物、または、生理的環境および／または何らかの追加プロセス段階、例えば、経口送達錠剤配合に先立つ噴霧−乾燥のような造粒プロセスに適した他の液体懸濁媒体である。このためには、ナノ粒子の最適分散が確実に得られるように先ずナノ粒子を洗浄して余剰の両親媒性化合物および他の何らかのイオンまたは添加剤を除去する。更に、薬物または遺伝子治療薬を十分な薬用量で送達する十分に高い濃度の懸濁液が得られるように洗浄中に懸濁液を濃縮する必要がある。このためには、シリケート含有シェルをもつナノ粒子専用に修正されたサイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する。接触しているナノ粒子間で固体ブリッジが形成されその結果として持続性の凝集が生じることを防止するためにこのような修正が必要である。本発明の方法に従って製造された一次ナノ粒子は、約１．０〜３００ｎｍの範囲のサイズを有し得る。この手順によれば、準弾性光散乱または光学密度測定を伴う遠心もしくは沈降のような粒度分布測定技術によって測定した値が１ミクロンを十分に上回る大きさになるまでナノ粒子が凝集することを防止する。即ち、本明細書中に記載のように処理しなかったナノ粒子懸濁液では、洗浄および回収の段階中に凝集が生じるので、一次サイズのナノ粒子に比べてフローユニットが有意に変化している。

ＳＥＣの不可欠な修正は、ナノ粒子の収集および洗浄の段階に直径約２０ミクロンの微孔質シリカ粒子を収容した短縮溶出カラムを使用すること、および、化学的改質を含む。化学的改質の非限定例では、均質なナノ粒子懸濁液が得られるようにナノ粒子の合成後に逆ミセル懸濁液にエタノールまたは別の適当なアルコールを添加する。典型的な水またはアセトンの使用をアルコールで代替すると、一次ナノ粒子サイズのフローユニットよりもはるかに大きいフローユニットをもつナノ粒子の凝集塊の形成が阻止される。欠くことのできない別の重要な化学的改質は、ナノ粒子の永続的凝集を防止するエレクトロステリック層を設けるためにナノ粒子の表面に作用する有機または無機の分散剤を結合させることである。適当な有機分散剤の非限定例は、クエン酸、酒石酸または酢酸である。適当な金属−有機分散剤の非限定例は、アルキルアミンシランカップリング剤、例えば、アミノプロピルトリクロロシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルシリルセスキオキサン、３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、トリメトキシシリル−プロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、３−トリメトキシシリルプロピルコハク酸無水物、および、アルキルカルボン酸シランカップリング剤、例えば、アミド結合したカルボキシル基である。適当なイオン性分散剤の非限定例は、過剰量のリン酸カルシウムまたはピロリン酸カルシウムである。

更に、カラム通過中のナノ粒子が微孔質シリカ表面に付着することを防止する静電バリアーが生じるように、ＳＥＣカラムの充填に使用する微孔質シリカ粒子を同じ分散剤で表面処理する必要がある。また、ＳＥＣによるナノ粒子の濃縮および洗浄段階中にｐＨレベルをコントロールすることも必要である。即ち、ｐＨレベルを約６〜８の範囲内に維持するために、必要に応じて硝酸、酢酸もしくは塩酸を非限定例とする酸、または、水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムを非限定例とする塩基を添加する。ｐＨが８よりも高い場合には、ナノ粒子の表面の電荷が低すぎて凝集が生じる。ｐＨが６未満の場合には、酸または塩基の濃度が高すぎて、結果的なイオン強度が洗浄段階中の凝集を惹起する。セラミドおよび他の脂質由来生物活性メディエイターは酸性またはアルカリ性のこれらの手順のすべてに耐性である。

更に、カルボジイミド仲介ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤は、アルキルアミンシランまたはアルキルカルボン酸カップリング剤に結合してｉｎ ｖｉｖｏのナノ粒子の分散状態をさらに確保し、また、抗体または発現受容体のリガンドのような結合因子にＰＥＧカップリング剤との結合点を提供し、これによって、セラミドを富化またはカプセル化したナノ粒子によるターゲットとなる腫瘍特異的部位への細胞内薬物送達を可能にする。

本発明の別の実施態様では、ナノスケール集合体システムが、デンドリマーまたはヒドロゲルのような高分子材料からなり、これらに増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物および／または遺伝子治療薬が充填されている。デンドリマーまたはヒドロゲルは、組み合わさってｉｎ ｖｉｖｏでバイオスマート即ち刺激応答性および生物分解性の双方である材料を形成する個別のポリマーである。スマートセグメントと分解可能な疎水性および／または親水性のセグメントとを併有している材料が薬物送達に使用できることは研究および実験作業によって知見された。セグメントは、材料における共有結合した一つの部分であると考えられており、複数の重合ユニットを有し得る。例えば、１つのセグメントは、数個の重合モノマーユニットから約数千個までの重合モノマーユニットを含み得る。これらのセグメントはいかなる長さおよびいかなる分子量を有していてもよいが、各ポリマーセグメントは、各々に期待された望ましい特性に近似するように概して大きい分子量を有しているのが好ましい。

単独で使用されたときの高分子材料には、最善の材料でない、または、生物分解性でないという限界がある。従って、スマートポリマーセグメントを生物分解性ポリマーセグメントと組合せることによって個々の材料よりもかなり多能な材料が得られる。生物応答性ポリマーと生物分解性ポリマーとを組合せることによって、生物分解性および生理的刺激に応答性という双方の特性をもつ薬物送達システムを設計し得る。特に、スマートセグメントと生物分解性セグメントとを含み、生物分解性セグメントが疎水性セグメント（化学療法剤との結合または相互作用に好適）と親水性セグメントとを含む多機能ポリマー材料が提供される。

天然および合成の多くの生物分解性ポリマーが公知である。ポリエステル、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ビオチニル化ポリ（エチレングリコール−ブロック−乳酸）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）およびポリ（イプシロン−カプロラクトン）；ポリ無水物、例えば、ポリ（ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸）（ＰＣＰＰ−ＳＡ）、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、ポリウレタンおよびポリ（アミノ酸）；多糖類、例えば、デキストランなどのポリマーがマイクロカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ヒドロゲルおよびミセルの形態で試験された。本発明では、このような生物分解性ポリマーのすべてを多機能材料のセグメントとして意図する。

上記のポリマーは、主鎖の加水分解性または酵素分解性開裂によって分解し、従って、薬物消耗後に無毒性および非炎症性である。ポリマーの分解性は、それらの化学組成、タクチシティ（立体規則度）、結晶化度、モル質量、形態学、サイズおよび形状に依存し、また、ｐＨおよび温度にも依存する。生物分解性ポリマーの化学的および物理的特性が薬物放出パターンに影響を与えることは公知であり、充填された薬物の放出キネティクスは薬物拡散およびポリマー分解の双方によってコントロールされる。

デンドリマーおよびヒドロゲルの分解速度を操作する別の方法では、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）の電荷、親水性およびターゲティング能力を利用して、疎水性材料例えばＰＬＡおよびＰＬＧＡマイクロ／ナノ粒子をＰＬＬでコーティングまたはグラフトする。例えば、ＰＬＬをグラフトしたポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−Ｌ−リシン）からなるマイクロ粒子はＰＬＬ側鎖のない粒子に比べてローダミンＢの放出速度が有意に増加することがわかっている。更に、ＰＬＬミセルをグラフトしたＰＬＧＡは、ＰＬＬに比べて十倍の高いトランスフェクション効率および五分の一の低い細胞毒性を示す。本発明は、親水性−疎水性分解可能セグメントを設けるためにこのようなコーティングおよびグラフト技術の使用を意図する。

デンドリマーは、比較的単分散性の樹木状または世代(generational)構造に至る規則的な高度に枝分かれしたセグメントと定義される。デンドリマーは、３つの顕著な立体構造的特徴、即ち、コアと、コアに放射状に結合し次々と枝分かれした繰返し単位または世代(generations)を含む内側領域と、最も外側の世代に結合した末端部分からなる外側すなわち表面領域とを有している。これらの３つの立体構造要素を調整することによってデンドリマーを多彩な構造に形成できる。高度に枝分かれした反応性の三次元マクロ分子であるデンドリマーは、高度な分子均一性、狭い分子量分布、内部ボイドおよびキャビティのような特定のサイズの興味深い構造特性、ならびに高度に官能性の末端表面を有するので生物医学用途における重要性は増すばかりである。空間配置された官能基は、多様な分子と反応でき、例えば、血液循環時間を延長するためにＰＥＯのような親水性分子、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に使用するためにコントラスト剤、所望の組織部位に局在するためのターゲティング分子と反応できる。

現在可用なデンドリマーは、ベンジルエーテル、プロピレンイミン、アミドアミン、Ｌ−リシン、エステルおよびカルボシラン樹状セグメントを含む。これらのうちでも、カチオン性ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが広く研究されており、デンドリマー−ＤＮＡ比、デンドリマーのサイズおよび特に柔軟性に応じて多種多様な細胞への高レベルの遺伝子トランスフェクションを仲介すると報告された。ＰＡＭＡＭデンドリマーはターゲット指向性送達システムであると考えられており、ある種の腫瘍の微小血管系内部での蓄積を増進し、腫瘍組織への血管外遊出を増大させ得る。ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）デンドリマーは、多数の表面アミンを含有しているもう一つのポリカチオン性デンドリマーであり、核酸、細胞外マトリックスに見出されるプロテオグリカンおよび細胞膜のリン脂質のようなポリアニオンとの静電相互作用が可能であると考えられている。これらのポリマーは、増殖抑制性で、プロアポトーシスで、脂質由来生物活性の代謝産物または作用物質のような薬物を、ターゲット膜に局在させることができる。

しかしながら、ポリカチオン性デンドリマーにはまだｉｎ ｖｉｖｏ毒性の問題が残っており、体内で分解抵抗性であり、従って薬物送達に適し難い。ＰＡＭＡＭデンドリマーの細胞毒性を改善するために、デンドリマーのカチオン性アミン末端基をアニオン性カルボキシレート末端基によって置換できる。本発明の新規な材料は、スマートかつ分解性のセグメントをデンドリマー構造のアーム、枝またはデンドロンとして組合せることによって個別成分から製造されたデンドリマー構造の欠点をある程度解消する。このようなデンドリマー材料は、熱応答性ポリマーセグメントを生物分解性ポリマーセグメントに化学結合形成反応でカップリングすることによって製造できる。

デンドリマーはまた、ナノサイズの粒子として製造できる。約１ｎｍ〜１０００ｎｍのサイズを有している粒子は、炎症組織、増殖組織または形質転換組織に薬物を運搬しターゲットさせるための重要な利点を保持していると考えられる。薬物は、吸着、閉じ込めおよび共有結合によってナノサイズのデンドリマーに充填され、脱着、拡散、ポリマーエロージョンまたはこれらのメカニズムのいくつかまたは全部の組み合わせによってナノサイズのデンドリマーから放出される。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの実験は、デキストランで安定化されｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０でコーティングされたナノサイズのデンドリマーが長い血液循環時間および低いＲＥＳ取込みを示すことを証明した。ナノサイズのデンドリマーは、血管または固形腫瘍と相互作用でき、次いでエンドサイトーシスによってこれらの細胞に取込まれる。このように循環半減期が延長されるのでデンドリマーが腫瘍形成組織または炎症／増殖組織に薬物を送達する高い能力を有するものと考えられる。

最近のナノテクノロジーの進歩は、疎水性治療薬の制御送達およびターゲット指向性放出に膨大な可能性を与えた。本発明のナノスケールデンドリマー集合体システムは、温度刺激に応答性で同時に加水分解的に生物分解性であり、固形腫瘍に対してＣ_６のターゲット指向性および持続的送達を行うことが可能である。Ｃ_６を温度感受性の「スマート」デンドリマーに充填できること、および、この薬物−ポリマー複合体が、ＭＤＡエストロゲン陰性乳癌細胞の増殖を有効に阻害し、そのアポトーシスを誘導できることが証明された。固形腫瘍の領域に温熱パックまたは超音波によって急性の局所的高温(local hyperthermia)を加えると、疾病組織へのＣ_６の放出がトリガされる。このように、熱応答性ナノスケールデンドリマーは、固形腫瘍組織にセラミドのような治療薬のターゲット指向性および制御送達を行うための最適な解決手段になり得る。この構想を、「生理的加温薬物送達(physiological hyperthermic drug delivery)」という新造語で表す。

薬物送達におけるデンドリマー
リポソーム薬物送達テクノロジーは、薬物送達の面で数々の新しい利点をもつ安定なナノ粒子を作製するためにポリマー化学テクノロジーを取込んだより進歩した薬物送達システムにゆっくりと凌駕されつつある。例えば、高分子ナノ粒子は、長期間の体内利用性、疾病細胞のターゲティング、および、生体応答性の薬物制御放出が可能である（１７）。薬物は、吸着、閉じ込め、および共有結合によって高分子ナノ粒子に充填され、脱着、拡散、ポリマーエロージョンまたはこれらのメカニズムのいずれかまたは全部の組み合わせによってナノ粒子から放出される。高度に枝分かれした反応性の三次元ナノ粒子であるデンドリマーは、高度な分子均一性、狭い分子量分布、内部ボイドおよびキャビティのような特定のサイズの興味深い構造特性、ならびに高度に官能性の末端表面を有するので生物医学用途に好適である。本発明のデンドリマーは、ポリカチオン性ポリマー（ポリ（Ｌ−リシン），ＰＬＬ）と、生物分解性ポリマー（ポリ（Ｌ−乳酸），ＰＬＬＡ）と、熱応答性ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド），ＰＮＩＰＡＡＭ）とからなる。Ｃ_６のような疎水性薬物をＰＬＬＡとの疎水性−疎水性相互作用によって１０００ｍｇ／ｍｌまでの濃度でデンドリマーに充填する。生物分解性ポリマーに応答性ポリマーを組込むと、温度のような生理的刺激に応答して薬物が持続放出されるという利点が得られる。

スマートまたは応答性ポリマーは、温度、溶媒組成、ｐＨ、イオン強度、圧力、電場、光および代謝産物のような物理的、化学的または生物的刺激に応答性である。熱応答性ポリマーのうちでは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡＭ）が薬物制御送達に広く使用されている。なぜなら、このポリマーが、水溶液中の下部臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）に特有の溶解度変化を３２℃の近傍で示すからである。このポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温に冷却されると膨張および膨潤し、ＬＣＳＴよりも高温に加熱されると収縮して崩壊する。疎水性および親水性のユニットと架橋剤とをＰＮＩＰＡＡＭに組込むことによってＰＮＩＰＡＡＭのＬＣＳＴを操作して薬物の充填および放出をコントロールできる。

重要なのは、ＰＮＩＰＡＡＭ基材のポリマーが、部位特異的薬物送達の可逆的ターゲティング部分として使用できることである。本発明では、３７℃〜４２℃の範囲のＬＣＳＴをもつようにポリマーを設計する。３７℃の体温はＬＣＳＴよりも低いので、ポリマーは生理的流体に可溶であり、体内の網状内皮系（ＲＥＳ）を逃れて充填薬物の血液循環時間を延長する。局所超音波および／または温熱パッチなどによってターゲティング部位をポリマーのＬＣＳＴよりも高温の４２℃に上昇させると、ポリマーがターゲティング部位に蓄積し高い局所濃度で治療薬を放出する。マウスにおいては、４０℃のＬＣＳＴをもつポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−アクリルアミド）の全身注射が、局所的高温によって、加熱および非加熱の対照グループの２倍程度にコポリマーを固形腫瘍に蓄積させることがわかっている。更に、４０℃のＬＣＳＴを用いてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）からなる生物分解性で熱応答性のミセルが製造された。ＬＣＳＴよりも高温の４２．５℃では細胞によるミセルの取込みが加速されるので、ミセルに充填された抗癌剤アドリアマイシンのウシ大動脈内皮細胞に対する細胞毒性は遊離アドリアマイシンの細胞毒性よりも大きいことがわかった。本発明の樹状ナノ粒子は、ポリマーＰＮＩＰＡＡＭをポリカチオン性ＰＬＬ（疎水性および安定性）および生物分解性ＰＬＬ（疎水性、制御放出）に共有結合させたので、ＰＮＩＰＡＡＭの熱応答性によって膨張する。更に、乳癌細胞アポトーシスを誘導するプロアポトーシス脂質Ｃ_６をこの多機能デンドリマーに充填できる。

ヒドロゲルは、水性環境中で大量の水を吸収することによって膨潤しながらもその構造は維持している三次元の架橋ポリマーネットワークである。ヒドロゲルは、高い含水量、生体適合性、特有の機械的特性を有しているため、薬物送達および組織工学のような生物医学用途で多方面から注目されている。本発明の環境感受性ヒドロゲルは、温度、ｐＨ、電気信号、イオン強度などの環境刺激に応答しそれらの構造を変化させることによって薬物放出をコントロールできる。共有結合的または非共有結合的（物理的）に架橋した温度感受性、生物分解性ゲルがヒドロゲルとして好ましい材料である。

より詳細にはヒドロゲルは、スマートなまたは応答性の成分となるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）またはその誘導体、加水分解により分解可能な疎水性成分となるポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）またはその誘導体、酵素的に分解可能な親水性成分となるデキストランまたはその誘導体からなる共重合ネットワークとして製造される。成分またはセグメントは、約３モノマーユニットから約１０，０００モノマーユニットまでの範囲内の任意の長さ、例えば、約３〜５００ユニットの長さを有し得る。材料またはセグメントは更に、材料特性を調整する別のモノマーユニットを含み得る。例えば、ヒドロゲルは、ｐＨおよびイオン強度に対するゲルの感度を向上させるアニオン性（アクリル酸）およびカチオン性（アクリルアミン）のユニットも含み得る。

ＰＮＩＰＡＡＭ−ＰＬＬＡ−デキストランヒドロゲルは、熱応答性であり、約３２℃に下部臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を示す。それらの膨潤特性は温度変化、親水性／疎水性成分のバランス、ＰＬＬＡ成分の分解に大きく左右される。ＰＬＬＡ成分中のエステル結合の加水分解開裂によって生じたヒドロゲルの分解は、ＡＴＲ−ＦＴＩＲおよび減量測定法で測定すると、ＬＣＳＴよりも低温の２５℃にて、ＬＣＳＴよりも高温の３７℃の場合よりも速い。

理論には拘束されないが、増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物および／または遺伝子治療薬のような治療用化合物が、リポソーム、吸収可能な非凝集性ナノ粒子、または、デンドリマーもしくはヒドロゲルのような高分子材料などのナノスケール集合体システムに組込まれているとき、癌細胞へのそれらの全身送達が増進され、増殖抑制性で、プレアポトーシス性化合物の有効性が大幅に向上する。更に、セラミドを富化またはカプセル化したナノテクノロジーを、併用療法として低用量の別の疎水性化学療法剤または遺伝子治療薬を送達するように設計して、副作用を抑えて有効性を向上させることができる。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施態様をより詳細に説明するためのものであり、限定性のものではない。当業者は、常套の域をでない実験作業を使用して本文に記載された特定の物質および手順と等価である多くの物質および手順を認識または確認することができるであろう。

リポソーム送達による乳癌細胞のＣ _６ セラミド誘導アポトーシス
材料および細胞培養物
卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨ）、ポリエチレングリコール（２０００〜５０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、Ｄ−エリスロ−ヘキサノイル−スフィンゴシン（Ｃ_６−セラミド）、ポリエチレングリコール−７５０−Ｃ_８−セラミド（ＰＥＧ−Ｃ８）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチル−アンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ジ−ヒドロ−エリスロヘキサノイル−スフィンゴシン（ＤＨＣ_６）はＢｉｏｍｏｌ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入した。［^３Ｈ］−Ｃ_６はＡＲＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、［^３Ｈ］−チミジンはＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）から購入し、コレステリル−１，２−^３Ｈ（Ｎ）ヘキサデシルエーテル（［^３Ｈ］−ＣＨＥ）はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。シリカゲル６０薄層クロマトグラフィープレートは、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコートした４００メッシュの銅グリッドは、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ）から購入し、ポリ−Ｌ−リシンはＳｉｇｍａ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。

リン酸化−Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）およびＡｋｔ−１，２，３に特異的な抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ウェスタンブロット法に用いる４％〜１２％プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手し、ＥＣＬ試薬は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手した。ＴＵＮＥＬアポトーシス検出キットは、ＵｐＳｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。Ｖｙｂｒａｎｔアポトーシスアッセイキット＃３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入し、Ａｐｏ−ＯＮＥ均質カスパーゼ３／７アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。ＲＮアーゼは、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、プロピジウムヨージド（ＰＩ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ）乳腺癌細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ １６４０中、３７℃で増殖させた。この細胞系は、高度に活動的な転移性でエストロゲン受容体陰性のヒト乳癌モデルである。

リポソームの配合および押出
脂質を配合し、薬物送達小胞にＣ６を取込むその能力を試験した。簡単に説明すると、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）に溶解した脂質を特定のモル比で組合せ、脂質の転移温度よりも高温の窒素流下で乾燥し、滅菌したリン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）で水和した。得られた溶液を２分間音波処理し、次いで、１００ｎｍのポリカーボネート膜から押出した。取込み効率は、微量の［３Ｈ］Ｃ６を配合物に組込んで、構成脂質をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２：１）に抽出し、シンチレーションカウンターを使用して押出前と押出後との放射能を比較することによって測定した。ｉｎ ｖｉｖｏ投与用の配合物は、ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（５０００）：Ｃ８−セラミド−ＰＥＧ（７５０）：Ｃ６−セラミド（３．７５：１．７５：０．７５：０．７５：３．０、モル比）から構成した。ＰＥＧ（７５０）−Ｃ_８を添加すると３０モル％までのＣ_６−セラミドが許容される。これらのＰＥＧ修飾配合物の生物活性を４１０．４乳腺癌細胞で確認した。配合したリポソームの組成は、構成脂質をクロロホルム／メタノール（２：１）に抽出し、次いで予熱したシリカゲル６０薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ｄｄＨ２Ｏ（６０：２５：４）溶媒系を使用して分解することによって検証した。脂質をヨウ素室で可視化した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して配合リポソームのサイズおよび形態のキャラクタリゼーションを行った。

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ＴＥＭを使用して配合リポソームのサイズおよび形態のキャラクタリゼーションを行った。最初に、疎水性グリッドへの小胞の結合を促進するためにｆｏｒｍｖａｒカーボン−コートした４００メッシュの銅グリッドをポリ−Ｌ−リシンで１０分間コーティングした。次に、乾燥したグリッドにリポソームサンプルを塗布し、５分間付着させた。乾燥したグリッドに１％ホスホタングステン酸（ｐＨ７．０）を更に５分間作用させることによってネガティブ染色法を行った。６０ｋＶの加速電圧を用い２１，５０００Ｘの倍率でサンプルを観察した。

ＴＥＭ分析は、全部の配合物でＣ_６を取込んだリポソームビヒクルが直径８５〜１４０ｎｍの範囲の均質なサイズ分布で製造されたことを追認した（図２Ａ）。図２Ｂは、リポソーム配合物の平均サイズを示している。慣用の配合物に微量の［３Ｈ］Ｃ６を組込むと、押出プロセス中にセラミドの有意な減損が生じないことが観察された（図２Ｃ）。更に、慣用のリポソームから得られた脂質抽出物をＴＬＣプレートにかけると、押出プロセス中に脂質成分の目に見える減少が生じないことが確認された（図２Ｄ）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物動態
リポソーム送達の量を非リポソーム投与に比較して定量するために微量の［^３Ｈ］Ｃ_６をリポソーム配合物に組込んだ。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ）乳腺癌細胞を、２４−ウェルプレートに３．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳを含有する培地で一夜増殖させた。次に、１％ＦＢＳを補給した培地中、微量の［^３Ｈ］Ｃ_６または［^３Ｈ］ＣＨＥを含有するリポソームＣ_６または非リポソームＣ_６で細胞を様々な時間間隔で処理した。リポソームＣ_６は細胞培地に直接添加し、非リポソームＣ_６はジメチルスルホキジト（ＤＭＳＯ）ビヒクル中に最終濃度≦０．１％（ｖ／ｖ）として添加した。指定の時点毎に、培地を取り出し、細胞を低温のＰＢＳで一回洗浄してリポソーム／膜−非特異的相互作用を解離した。次に、細胞を１％ＳＤＳで可溶化し、ＭＤＡ細胞への［^３Ｈ］Ｃ_６または［^３Ｈ］ＣＨＥの蓄積をシンチレーションカウンターで測定した。

結果は、１％ＦＢＳの存在下でリポソーム配合物が非リポソーム投与よりもＣ_６をより効果的かつ効率的に送達することを示した（図３Ａ）。カチオン性リポソーム送達の結果として、ＭＤＡ細胞によるセラミド蓄積は２倍に増加し、約１６時間後に最大蓄積が観察された。慣用のＰＥＧ修飾リポソームも同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物動態プロフィルを有することが観察された。

次に、Ｃ_６がリポソームビヒクルから放出されて細胞膜に転移するメカニズムを調べた。非転移性のコレステロール脂質マーカー［^３Ｈ］ＣＨＥをリポソーム／細胞膜会合のプローブとして使用し、リポソームに［^３Ｈ］Ｃ_６または［^３Ｈ］ＣＨＥをタグ付けし、ＭＤＡ細胞と共に指定の時間にわたってインキュベートした。図３Ｂに示すように、リポソームは薬物ビヒクルから細胞膜へのＣ_６の転移を仲介したがコレステロールは仲介しなかった。更に、Ｃ_６蓄積は経時的に増加したが、ＣＨＥ蓄積はバックグラウンドレベルを有意に上回る増加を示すことができなかった。セラミドとコレステロールとの蓄積の差は用量依存的にも観察される（図３Ｃ）。これは、会合したリポソーム／細胞膜が融合しなくても、Ｃ_６をリポソーム層から形質膜二重層に分配する脂質転移プロセスを介してＣ_６が送達されることを示唆する。

［ ^３ Ｈ］−チミジン細胞増殖
短鎖セラミドをＭＤＡ細胞に送達する慣用の脂質配合物の有効性を判定するために、［^３Ｈ］チミジン増殖アッセイを実施した。簡単に説明すると、ＭＤＡ細胞を２４−ウェルプレートに３．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、２４時間の血清飢餓を行う前に一夜増殖させた。血清飢餓の１２時間目に、細胞をリポソームＣ_６または非リポソームＣ_６で処理し、残りの血清飢餓を続行した。血清飢餓の後、培地にＦＢＳ（１０％最終濃度）を補給して更に１２時間維持し、処理の最後の４時間に０．５ｍＣｉ／ｍｌの［^３Ｈ］チミジンを添加して細胞増殖を検定した。細胞を低温のＰＢＳで一回、次いで１０％のトリクロロ酢酸で１０分間ずつ二回洗浄した。細胞を０．３ＮのＮａＯＨで可溶化し、酸不溶性ＤＮＡ内への［^３Ｈ］チミジンの取込みをシンチレーションカウンターで測定した。

図４Ａに示すように、Ｃ_６を補給した卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）およびコレステロール（ＣＨ）を含有している慣用のリポソームはＭＤＡ細胞増殖の有意な用量依存的阻害を示した（実線）。小胞不安定化脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を慣用の配合物に添加したときにもＣ_６の生物活性が増進した。１０％ＦＢＳの存在下で１２時間処理したＭＤＡ細胞は、２５μＭ以上のリポソームＣ_６で処理したときに完全に増殖阻害されていた。リポソーム配合物中のＣ_６の送達は、ＩＣ５０を約１／３に減少させ、非リポソームの１５μＭがリポソームでは５μＭまで減少した。これらの慣用の配合物は、ＤＭＳＯビヒクル中のＣ_６の非リポソーム投与（点線、白抜きの丸印）に比べてＭＤＡ細胞の用量依存的増殖阻害の改善を示しており、力価および有効性の改善を表す。Ｃ_６非含有リポソーム（ゴースト；点線、白抜き角印）およびＰＢＳ対照はいずれも有意な増殖阻害を示さなかった。これはＣ_６が唯一の生物活性物質であることを示唆する。この試験は、Ｃ_６を配合した慣用のリポソームが遊離状態で投与されたＣ_６よりも増殖抑制剤として有効であることを証明した。

次に、カチオン性脂質配合物にＣ_６を組込んだ場合を試験した（図４Ｂ）。正に帯電した脂質ジオレオイル１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）を配合したゴーストカチオン性リポソームは単独ではＭＤＡ細胞増殖を増進させたが（点線、白抜きの三角印）、Ｃ_６を組込んだカチオン性リポソームはＭＤＡ細胞増殖を用量依存的に減退させた（実線、白抜きの三角印）。このカチオン性配合物は、非リポソームＣ_６の投与よりも有効であったが（実線、白抜きの丸印）、慣用の配合物ほど有効ではなかった（実線、白抜きの四角印）。これは、生物活性セラミドを送達するためにカチオン性リポソーム配合物を使用したときにも細胞増殖を用量依存的に阻害できたことを表す。

次に、Ｃ_６の生物活性をさらに増進させるＰＥＧ修飾脂質の役割を試験した。Ｃ_８−セラミド（ＰＥＧ−Ｃ８）を選択したが、その理由は、このセラミドがリポソーム／膜融合を促進するという追加効果を有している可能性があるからである。更に、ＰＥＧ−Ｃ８の混在がリポソーム二重層の徐放性を助長することが知られており、体内利用性の延長という追加効果もある。更に、この実施態様は脂質二重層を安定化するためにＰＥＧ Ｃ８を使用しており、このリポソームは遊離生物活性Ｃ_６セラミドを少なくとも３０モル％濃度まで含有し得る。更に、この実施態様は、生物活性セラミドおよび／または疎水性化学療法剤および／または遺伝子治療薬を含有するリポソームの一体的成分としてＰＥＧ Ｃ８を使用している。更に、ＰＥＧ−Ｃ８が配合されたリポソームは、カベオリン富化脂質ラフト内で遊離セラミドの最適なインターカレーションおよび局在化を確保するが、これは、膜インターナリゼーションおよびミトコンドリアのような細胞小器官への転移を生じさせ、次いで、ターゲット組織または腫瘍のアポトーシスまたはプログラム細胞死を誘導するために必要な前提条件である。

ＰＥＧ修飾リポソームはＭＤＡ細胞増殖に顕著に影響しなかった。これは、ＰＥＧ−Ｃ８が生化学的に不活性であることを示す。しかしながら、Ｃ_６を組込んだＰＥＧ修飾リポソームによる増殖阻害効果は、１０および２５μＭで慣用のリポソームを上回ることはないにしても同程度に有効であった（図４Ｃ）。これは、全身薬物送達用に設計されたＰＥＧ修飾リポソーム配合物もまた、ＭＤＡ細胞増殖のＣ_６仲介阻害に有効なビヒクルであることを表す。総合的に考察すると、多重リポソーム配合物として送達されたＣ_６は、非リポソームＣ_６に比較して改善された用量応答増殖阻害を示し、これは力価および有効性の改善を表す。

ＭＴＳ細胞毒性アッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用したＰＥＧ修飾配合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を測定するために、これらの配合物をネズミの４１０．４乳腺癌細胞で試験した。４１０．４細胞を９６−ウェルのプレートで平板培養し、ＦＢＳを１％まで補給した培養培地中でＰＥＧ修飾リポソームＣ_６または遊離Ｃ_６によって２４時間処理した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示通りに使用して細胞毒性を測定した。ＰＥＧ修飾リポソーム−Ｃ_６送達は、細胞毒性を増強した。リポソーム−Ｃ_６配合物の投与は、ＤＭＳＯビヒクル中のＣ_６の遊離投与に比べてＣ_６のＩＣ_５０を減少させた（図５）。これらのデータは、ＰＥＧ−Ｃ_８リポソーム配合物によって送達されたときにＣ_６セラミドのＩＣ_５０が３５〜４０％減少することを表す。処理は、１％ＦＢＳの存在下で２４時間行った。

カスパーゼアッセイ
アポトーシスはカスパーゼ活性の正の調節に付随する。従って、ＭＤＡ細胞をＰＥＧ修飾リポソームで処理した後のカスパーゼ−３／７活性を測定した。簡単に説明すると、ＭＤＡ細胞を９６−ウェルプレートに６．０×１０^３細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳを含有している培養培地で４８時間増殖させた。次に細胞を、１％ＦＢＳを含有している培地中でリポソームＣ_６または非リポソームＣ_６で２４時間処理した。カスパーゼ−３／７の酵素活性レベルを、Ａｐｏ−ＯＮＥ均質カスパーゼ−３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し当業界で公知の標準プロトコルに従って測定した。

結果は、ＰＥＧ修飾リポソームセラミドで処理したＭＤＡ細胞が非リポソームセラミドで処理した細胞よりも有意に多いカスパーゼ−３／７活性を表したことを示した（図６）。ゴースト処理ではカスパーゼ−３／７活性の有意な変化は全く観察されなかった。総合的に考察すると、これらの結果は、Ｃ_６−配合リポソームがＣ_６の非リポソーム投与よりも効果的であり、ＭＤＡ細胞増殖を有意に阻害し、最終的にアポトーシスによる細胞死を誘導することを表す。

アポトーシス検出
Ｃ_６依存性増殖阻害がアポトーシスの増進に相関関係を有しているか否かを判断するための試験を行った。Ｃ_６の送達がＭＤＡ細胞のアポトーシスに導くことを確認するために、細胞アポトーシスの指標となる開裂ＤＮＡを染色するＴＵＮＥＬ分析（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を行った（図７Ａ）。

リポソームＣ_６および非リポソームＣ_６で処理した循環性の血清栄養ＭＤＡ細胞のＴＵＮＥＬ染色は、８時間でＤＮＡ断片化が全く生じないことを示した。リポソームＣ_６処理および非リポソームＣ_６処理はＤＮアーゼ陽性対照に対して同様のＤＮＡ断片化を誘導した。処理１６時間で開裂３’−ＯＨ ＤＮＡの染色が観察されたが、この時点はＣ_６送達のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物動態プロフィルに一致する。ゴースト配合物ではアポトーシスが全く観察されなかった。

Ｃ_６誘導アポトーシスを定量するために、処理した循環性ＭＤＡ細胞のアネキシンＶ染色およびアネキシンＶ染色細胞のフローサイトメトリー解析をＶｙｂｒａｎｔアポトーシスアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して行った。

２４時間の処理後、ＰＥＧ修飾リポソームＣ_６は非リポソームＣ_６に比較して有意に多い量のアネキシンＶ染色を誘導したが、ゴースト配合物は全く効果がなかった（図７Ｂ）。

プロ−サバイバルキナーゼである活性化ＡＫＴの測定
Ｃ_６のリポソーム配合物または非リポソーム配合物で処理したＭＤＡ細胞中のセラミド調節Ａｋｔシグナル伝達経路をウェスタンブロット分析を使用して調べた。簡単に説明すると、ＭＤＡ細胞を６０ｍｍプレートに４．０×１０^５細胞／ウェルで播種し、一夜増殖後に血清飢餓状態に２４時間維持した。血清飢餓の１６時間目に細胞をリポソームＣ_６または非リポソームＣ_６で処理し、残り時間の血清飢餓を維持した。２４時間の血清飢餓の後、細胞培地にＩＧＦ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えて１５分間維持した。細胞を低温のＰＢＳで一回洗浄し、次いで氷上で１５０μｌの低温溶解バッファ（１％のトリトンＸ−１００、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２．５ｍＭのＮａ_４Ｐ_２Ｏ_７、１ｍＭのβグリセロホスフェート、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、ｄｄＨ_２Ｏ中に１μｇ／ｍｌのロイペプチン、ｐＨ７．５）を加えた。細胞を氷上で１５分間溶解させ、細胞溶解液を収集し、１５，０００×Ｇで１５分間遠心した。３５μｇのタンパク質を４％〜１０％のプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルに充填し、ｐＡｋｔをプローブした。均等な充填を証明するためにブロットを剥ぎ取ってＡｋｔ−１，２，３を再度プローブした。ＥＣＬケミルミネセンスを使用してタンパク質バンドを可視化し、密度測定法によって定量した。結果は、ＰＥＧ修飾リポソームＣ_６が非リポソームセラミドよりもＩＧＦ−１−刺激ｐＡｋｔレベルを有効に低下させることを示した。他方、ゴースト配合物はｐＡｋｔレベルに全く効果を有していなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。リポソームジヒドロ−エリスロ−ヘキサノイル−スフィンゴシン（ＤＨＣ_６）も非リポソームＤＨＣ_６に比較してＩＧＦ−１刺激Ａｋｔリン酸化の阻害を示した。８時間というＣ_６処理時間を選択したが、この時点がＭＤＡ細胞中のＣ_６の蓄積がほぼ最大になる時点に対応するからである。この試験は、リポソームＣ_６がＡｋｔシグナル伝達カスケードの長期間阻害を介して細胞増殖阻害およびアポトーシスを誘導したことを裏付けた。

コンフォーカル試験
４１０．４ネズミ乳腺癌細胞内のＣ_６の蓄積を実証するために、リポソーム−Ｃ_６配合物をＣ_６マーカーとなる１０モル％ＮＢＤ−Ｃ_６と共に投与した。参照用に細胞をＤＡＰＩ（核）およびＭｉｔｒｏＴｒａｋｅｒレッド（ミトコンドリア）でカウンター染色した。倍率６０×のコンフォーカル顕微鏡法によってＣ_６送達を評価した。リポソーム小胞から細胞へのＮＢＤ−Ｃ_６送達のコンフォーカル顕微鏡像（図９Ａ）。ＮＢＤ−Ｃ_６（グリーン）はミトコンドリア（Ｍｉｒｏ Ｔｒａｋｅｒレッド）と共に局在した；ブルーの染色は、ＤＡＰＩ−染色された核を表す。

ショ糖勾配
全細胞中および小嚢富化脂質ラフト中のＣ_６の時間依存的細胞内蓄積を測定するために、リポソーム配合物に微量の［^３Ｈ］−Ｃ_６を組込んだ。これらの脂質ラフトはセラミドも含めた多重経路のシグナル伝達を促進すると考えられているので、リポソーム−Ｃ_６を投与すると脂質ラフトでＣ_６の蓄積が促進されるはずである。この現象を実証するために、細胞溶解液のショ糖勾配（５％、３５％および４５％ショ糖）処理を行って、小嚢富化脂質ラフトを単離した。勾配の画分（合計１２の画分）から各１ｍｌの等量アリコートを取り出してシンチレーションカウンターでカウントした。全Ｃ_６用マーカーとして［^３Ｈ］−Ｃ_６を使用すると、リポソーム送達の結果として小嚢脂質のシグナル伝達ラフトにセラミドが時間依存的に蓄積した（図９Ｂ）。セラミドは、ショ糖勾配の画分Ｎｏ．４および５に蓄積したが、これはカベオリン−１富化脂質ラフト（小嚢）を表していた（図９Ｂ）。

ｉｎ ｖｉｖｏ概論
ｉｎ ｖｉｖｏマウス乳腺癌モデル系を使用し、固形腫瘍治療用のＣ_６の全身送達方法を確立した。ｉｎ ｖｉｖｏデータは、４１０．４腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＰＥＧ修飾リポソーム配合物の有望な抗癌活性を示唆する（図１０Ａ〜Ｂ）。これらのｉｎ ｖｉｖｏ結果は、空のゴーストリポソームに比較してリポソームＣ_６による腫瘍体積の用量応答的縮小を示す。これは、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍形成モデルで全身投与Ｃ_６配合物の有効性が証明された最初の試験である。更に、ｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態解析は、リポソームＣ_６の全身送達の結果として腫瘍組織でＣ_６が定常状態の生物活性濃度に到達し２４時間以上この濃度に維持されることを証明した（図１１Ａ〜Ｂ）。Ｃ_６が血液および主要な初期通過器官から速やかにクリアランスされるにもかかわらずこの定常状態生物活性濃度は維持されていた。総合的に考察すると、全身投与Ｃ_６配合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの双方で有利な薬物動態を伴う有効性を示すことが判明した。更に、スイスウェブスターマウスに使用したＰＥＧ修飾リポソーム−Ｃ_６配合物は、１００ｍｇ／ｋｇまで静注後に毒性副作用を全く示さなかったが、ＤＭＳＯ中の遊離Ｃ_６の注入は１０ｍｇ／ｋｇの量でマウスの５０％を致死させた。

ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果
全身性リポソーム−Ｃ_６送達のｉｎ ｖｉｖｏ効果を測定するために、５×１０^６の４１０．０細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスの右後脇腹に皮下注射した。４１０．４細胞注入の４日後にマウスにリポソーム−Ｃ_６、空のリポソーム（ゴースト）または０．９％ＮａＣｌを静注（ｉ．ｖ．）した。マウスを隔日に処理した。処理直前に、マウスを計量し、腫瘍を測定した。腫瘍のサイズはカリパスで測定し、腫瘍の体積は半楕円体に関する式：Ｖ＝π／６×Ｌ×Ｗ^２を使用して算出した。式中、Ｖ＝腫瘍体積、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅。

リポソーム−Ｃ_６［ＤＳＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ−ＰＥＧ（５０００）／Ｃ_８−ＰＥＧ（７５０）／Ｃ_６−セラミド（３．７５：１．７５：０．７５：０．７５：３．０］の送達は、セラミド誘導アポトーシスによる用量依存的抗腫瘍活性を示した。リポソーム−Ｃ_６の全身送達は、空のゴーストリポソームに比較して腫瘍増殖を用量依存的に阻害した（図１０Ａ）。４０ｍｇ／ｋｇのリポソーム−Ｃ_６による処理の一週後に腫瘍を摘出し、組織学的分析用の冷凍切片を作製した（図１０Ｂ）。誘導されたアポトーシスの程度；ＤＡＰＩ−染色核を測定するために腫瘍切片をＴＵＮＥＬキットで染色した。

ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態
Ｃ_６送達のマーカーとして［^３Ｈ］−Ｃ_６を使用し、腫瘍保有マウスに１０および４０ｍｇ／ｋｇのリポソーム−Ｃ_６を注射し、選択した時点に血液、腫瘍、脾臓、腎臓、肝臓および心臓の組織を採取した。組織を計量し、可溶化し、シンチレーションカウンターでカウントした。組織１ｍｇ（または血液１ｍｌ）あたりの全Ｃ_６の質量を採取組織毎に計算し、薬物動態プロフィルを実証した。Ｃ_６の分布に対するリポソームビヒクルの送達を追跡するために、送達ビヒクルのマーカーとして［^３Ｈ］−ＣＨＥをリポソーム配合物に組込んだ。

投与用量１０および４０ｍｇ／ｋｇのリポソーム−Ｃ_６は一次キネティクスに従うらしいことが観察され、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＣ_５０に相関する十分な血漿濃度が２４時間維持されていた（図１１Ａ）。これらの用量で腫瘍組織中のＣ_６が約３０分で定常状態濃度に到達した。４０ｍｇ／ｋｇの用量は、所望のＩＣ_５０を十分に上回る濃度を２４時間以上維持した。ＰＥＧ修飾リポソームビヒクルのマーカーとして［^３Ｈ］−ＣＨＥを使用すると、リポソームが腫瘍組織に時間依存的に蓄積するらしいことが観察された。これは、ＰＥＧ修飾リポソームの継続的蓄積によって代謝Ｃ_６が腫瘍に補給されるので、腫瘍組織中のＣ_６の定常状態濃度が持続することを意味するものであろう。

Ｃ _６ セラミド用薬物送達ビヒクルとなるデンドリマー
デンドリマーの合成
ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）デンドロンとＰＬＬＡをグラフトしたＰＮＩＰＡＡＭとをコンジュゲートすることによってデンドリマーを合成した。ＰＬＬＡをグラフトしたＰＮＩＰＡＡＭは、フリーラジカル重合によって合成した（図１２）。

デンドリマーの熱応答性
ＵＶ−ｖｉｓ顕微鏡法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｄａ ２５，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を使用し、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中、５００ｎｍのデンドリマーの透過率を１℃／３０分で温度を上昇させながら種々の濃度で試験した（図１３Ａ）。デンドリマーは熱応答性であり、１，０．５，０．１および０．０５ｍｇ．ｍｌ^−１の濃度で下部臨界溶液濃度（ＬＣＳＴ）（最大透過率の９５％になる温度と定義）はそれぞれ３１，３２，３４および３９℃であった。デンドリマーの濃度を低下させるとＬＣＳＴが不明になった。ＬＣＳＴよりも高温では、ポリマーの相互作用の増加が原因で透過率の値が濃度の増加に伴って減少した。ＰＮＩＰＡＡＭおよびＰＬＬＡグラフトＰＮＩＰＡＡＭのＬＣＳＴは、対数濃度に伴って直線状に低下し、ＰＬＬＡが疎水性なのでどの濃度でも後者は前者よりも２℃低い値であった。しかしながら、ＰＬＬＡグラフトＰＮＩＰＡＡＭの両端にＰＬＬをコンジュゲートすると、デンドリマーのＬＣＳＴは対数濃度と非直線状の関係を示し、他の２種類のポリマーに比較して最も高い値になった。その理由はＰＬＬの正電荷および疎水性である。

動的光散乱（ＤＬＳ）（ＡＬＶ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して温度に対するデンドリマーの流体力学的サイズを測定することによってデンドリマーの熱応答性を更に確認した。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の３種類の濃度１，０．５および０．１ｍｇ．ｍｌ^−１のデンドリマーの見掛け流体力学的直径（Ｄ_ｈ）は、それぞれ３つの領域で温度依存性を示した（データ示さず）。低いほうの温度範囲でＤ_ｈは溶液温度の上昇に伴って僅かに縮小した。これは、個々の鎖の収縮を反映している。中間の温度範囲でＤ_ｈはそれらの最大値に到達するまで拡大した。これはデンドリマーのナノ粒子が鎖間会合によって互いに凝集したことを示す。高いほうの温度範囲でＤ_ｈは凝集温度の上昇に伴って鎖間収縮が原因で縮小した。デンドリマーのＬＣＳＴは２９（２５〜２９℃の範囲でよい）、３０および３１℃であり、これらを３種類の濃度：１，０．５および０．１ｍｇ．ｍｌ^−１のそれぞれのＤ_ｈ−温度曲線の初期区切り点と定義する。低いほうおよび中間の双方の温度範囲でＤ_ｈは濃度の増加に伴って拡大したが、その理由は濃度の増加に伴って鎖間相互作用も増加したからである。同じ溶液濃度でもＤＬＳによって測定したＬＣＳＴはＵＶ−ｖｉｓ顕微鏡法によって測定したＬＣＳＴよりもやや低い値であった。その理由は、測定用の計器が違うからである。ＤＬＳおよびＵＶ−ｖｉｓの双方の結果が、ＬＣＳＴが濃度増加に伴って低下することを示した。

Ｃ _６ セラミドおよびバイオスマートナノデンドリマー
ＬＣＳＴよりも低温および高温であるそれぞれ２５℃および３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の１ｍｇ．ｍｌ^−１のデンドリマーの動的分解を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用してデンドリマーのモル質量の経時的変化を測定することによってプローブした。デンドリマーの数モル質量（Ｍ_ｎ）は、一ヶ月まで経時的に減少し、２５℃のときよりも３７℃のときのほうが迅速に減少し、双方の温度で１９日後に比較的安定な値に到達した。注目すべきは、１９日後の安定なＭ_ｎが約２７００ｇ．ｍｏｌ−１であり、初期Ｍ_ｎ（約４２００ｇ．ｍｏｌ^−１）との差が約１５００ｇ．ｍｏｌ^−１というＰＬＬＡの値に等しい値だったことである。この結果は、デンドリマーが分解したこと、また、その分解の原因がデンドリマーのＰＬＬＡ成分の加水分解による分解であるらしいことを示唆する。この所見の裏付けをとるために、デンドリマーのＦＴＩＲスペクトルおよび粘度をそれぞれ経時的に測定した（データ示さず）。ＰＬＬＡのエステルＣ＝Ｏ伸縮に帰属する〜１７６０ｃｍ^−１のピーク強度は明らかに経時的に低下し、１９日後に消失することが観察された。ＰＮＩＰＡＡＭおよびＰＬＬのアミドＣ＝Ｏ伸縮に帰属する〜１６６０ｃｍ^−１のピークは比較的安定だったので、〜１７６０ｃｍ^−１のピーク強度を正規化する標準ピークとしてこれらを使用した。得られたピーク高パーセンテージは経時的に減少し、１９日後に０になった（データ示さず）。更に、デンドリマーの粘度（Ｃａｎｎｏｎ−Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅタイプ粘度計によってＡＳＴＭ Ｄ ４４５およびＩＳＯ ３１０４の手順に従って測定）は時間に伴って減少し、２５℃のときよりも３７℃のときのほうが減少が迅速であり、１９日後に安定値に到達した（データ示さず）。従って、ＦＴＩＲの結果は、粘度計およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ結果と同様に、設計したデンドリマーがＰＬＬＡ成分の加水分解による分解が原因で生物分解性であることを強力に示唆した。

Ｃ_６充填効率化の方法
蒸留水、エタノールおよびＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（蒸留水／エタノール／ＤＭＦ｛５：５：３ ｖ／ｖ／ｖ｝）からなる溶媒系でＣ_６とデンドリマーとを３：１の割合（Ｃ_６：デンドリマー、ｗ／ｗ）で１ｍｇ／ｍｌの濃度に混合し、シールし、室温で７時間保存した。Ｃ_６／デンドリマー溶液をセルロース膜（ＭＷＣＯ−３５００）に入れ、エタノール（５０ｍｌ）に透析して、膜内部から遊離Ｃ_６を除去した。セルロース膜の内部および外部のＣ_６の量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロホトメトリーで測定した。膜の内部および外部の双方の溶液を２，５−ジヒドロキシ安息香酸のマトリックス溶液と１：９（サンプル：マトリックス）に混合した。Ｃ_１６−セラミド（Ｃ_１６）を内部標準材料として使用し、各溶液に添加した。時間の経過（２，４，６および１０時間）に伴うＣ_６の量を、それぞれ４２４および５６２ｍ／ｚにおけるＣ_６およびＣ_１６の質量ピークの相対強度によって計算した。３：１（Ｃ_６：デンドリマー）の割合でデンドリマーにＣ_６を充填したときの充填効率は約３５．９±１．２％であった。

デンドリマーからＣ_６を放出する方法
Ｃ_６とデンドリマーとの相互作用を測定するためには、デンドリマーによるＣ_６放出キネティクスを評価する必要がある。Ｃ６の放出率（Ｍ_ｔ／Ｗ_ω、Ｍ_ｔは時刻ｔのＣ_６の放出量、Ｗ_ωはＣ_６の最大放出量）はデンドリマーの加水分解による分解によって経時的に増加した。デンドリマー−Ｃ_６複合体を滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に溶解し、セルロース膜（ＭＷＣＯ＝３５００）に入れ、０．５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有している滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（５０ｍｌ）に透析した。Ｃ_６が極めて疎水性なので、ＳＤＳのような界面活性剤の存在下で透析を行うことが必須であった。デンドリマーの最終濃度を０．０２、０．０５、０．１および０．５ｍｇ／ｍｌとし、ＬＣＳＴよりも低温（２５℃）および高温（３７℃）で連続磁気攪拌を用いた。放出されたＣ_６の濃度を測定するために、選択した時間間隔（０から３０日の間）毎に１ｍｌのバッファを除去し、新しいバッファに交換した。デンドリマーによるＣ_６放出を定量するために、セルロース膜の内外のＣ_６の量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロホトメトリーでＣ_１６を内部標準として測定した。デンドリマーのＬＣＳＴよりも高温の３７℃では、デンドリマーの疎水性が進んでおり、従って、Ｃ_６充填デンドリマーからのＣ_６の放出プロフィルがゆるやかであった（図１３Ｂ）。

デンドリマーの分解特性
前述のように重合ナノ粒子がリポソームテクノロジーに比べていくつもの利点をもつので、我々は、温度誘導送達戦略を使用して固形腫瘍をターゲットするために温度感受性デンドリマーにＣ_６を充填した。我々の特許デンドリマーナノ粒子は、ＰＬＬＡとＰＬＬとＰＮＩＭＰＡＭとからなる。前述同様にＵＶ−ｖｉｓ顕微鏡法を使用して温度上昇に伴うデンドリマー溶液の透過率をモニターすると明らかな変化が観察され、これらのデンドリマーが真に熱応答性であることを確認した。これらの原型デンドリマーのＬＣＳＴの概数値は１００μｇ／ｍｌで約３４℃であると判明した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロホトメトリーを使用してデンドリマーのモル質量が経時的に減少することを証明し、これらもまた生物分解性であることを立証した（データ示さず）。コンフォーカル顕微鏡法で分析すると、デンドリマーはＬＣＳＴを下回る温度（２５℃）のときよりも上回る温度（３７℃）のときに優先的にＭＤＡ細胞に蓄積したが、その理由は恐らく疎水性が進んだためであろう。更に、フローサイトメトリーを使用してＦＩＴＣ−標識デンドリマーの細胞内蓄積および取込みを定量し、ＬＣＳＴを下回る温度（２５℃）のときよりも上回る温度（３７℃）のときに有意に多い量のデンドリマーがＭＤＡ細胞に取込まれることを証明した（図１４Ｂ）。もっと重要な知見は、これらのＣ_６充填デンドリマーでＭＤＡ細胞を処理すると有意な増殖阻害／細胞毒性が生じたが、デンドリマー単独は細胞毒性を全く示さなかったことである（図１５Ａ）。Ｃ_６富化デンドリマーは増殖抑制の誘導に加えてＭＤＡ細胞のアポトーシスを誘導した（図１５Ｂ）。総合的に考察すると、我々の予備データは、デンドリマーが抗癌薬Ｃ_６の放出を効果的にコントロールすることを証明している。この実施態様の最適な実現は、生理的加温薬物送達を可能にするために生理的温度よりもやや高いＬＣＳＴをもつポリマーデンドリマーの設計を含む。

Ｃ _６ セラミド用の薬物送達ビヒクルとなるデンドリマー：充填および放出
第一の目的は、Ｃ_６と複合体を形成でき、静注によって投与でき、血流中で長時間可溶性であり、固形腫瘍にターゲット指向性および持続的な治療薬送達を果たし得る生物分解性および温度感受性の樹状ナノ粒子を製造することである。デンドリマーを固形腫瘍に熱ターゲティングする約４０℃のＬＣＳＴをもつデンドリマーを創製するためには、ＮＩＰＡＡＭと疎水性ＰＬＬＡと親水性ＰＬＬとの相対的モル比が極めて重要な役割をもつ。ホモポリマーＰＮＩＰＡＡＭが３２℃のＬＣＳＴを有していることは公知である｛Ｅｅｃｋｍａｎ，２００１ ＃５２｝。このＬＣＳＴは疎水性成分または親水性成分の組込み量を増加することによってそれぞれ低下または上昇するであろう｛Ｅｅｃｋｍａｎ，２００１ ＃５２｝。

生理的温度以上の局部的超高熱の誘導によってＣ_６を放出する生物応答性感受性デンドリマーを作製するためにデンドリマー構造を最適化した。３７℃をやや上回る最適なＬＣＳＴをもつデンドリマーを設計するために、我々は、ＰＬＬＡに代えて、より撓み易いアモルファスポリマー、例えば、モル質量８００、２０００および４０００ｇ／ｍｏｌのポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）を使用した。第二に、我々は、３、４または５のような複数継代のＰＬＬ（樹状構造の連続同心環）を使用した。最後に我々は、ＰＤＬＬＡマクロマーとＮＩＰＡＡＭモノマーとのモル比として０．０２、０．０５および０．１ｍｏｌ％などの複数の値を使用した。得られたデンドリマーのＬＣＳＴは、透過率を温度の関数として測定するＵＶｖｉｓ顕微鏡法、および、流体力学的サイズを温度の関数として測定する光散乱によって測定した。

デンドリマーのＬＣＳＴは、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＮＩＭＡＡＭ）との共重合によって上昇した。得られたデンドリマーは、ＮＩＰＡＡＭモノマーが５０、６０および７０％となるようなＮＩＭＡＡＭモノマーの増加に伴ってそれぞれ３６、４２および４４℃というＬＣＳＴの上昇を示した。このようにして我々は、局部的超高熱を介した腫瘍ターゲティングによって増殖抑制性で、プロアポトーシス脂質由来第二メッセンジャーなどの疎水性化学療法剤を固形腫瘍に放出するように作製できるバイオスマートデンドリマーを設計した。局部腫瘍温度をデンドリマーのＬＣＳＴよりも高温に上昇させるためには超音波デバイスまたは温熱パッチデバイスを使用して限局的に熱を加える。このプロセスは「生理的加温薬物送達」と言う新造語で表す。

デンドリマーの細胞生存適性
以下の実施例でより詳細に説明する。

全身送達用のカルシウムホスホ−シリケートシェルをもつセラミド内包吸収性ナノ粒子
非イオン性界面活性剤ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ−５２０、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）をそれ以上精製しないで使用して逆ミセルを調製した。シクロヘキサン、脱イオン水およびＣ_６セラミドは入手したものをそのまま合成に使用した。

４ｍＬのＩｇｅｐａｌと１０ｍＬのシクロヘキサンと脱イオン水とからなる総量２０ｍＬのマイクロエマルジョンを、周囲温度で３０ｍＬのバイアルに入れて急激に撹拌することによって調製した。得られた均一混合物に微量のＣ_６を水と薬物とのミセル状混合物の水相として添加した。得られたＣ_６含有ミセル構造をＣａ_ｘ（ＰＯ_４）_ｙｚＳｉＯ_２組成をもつＣＰＳでコーティングした。式中、０．１≦ｘ≦１０、０．１≦ｙ≦１０、０≦ｚ≦１０。水と界面活性剤との比（Ｒ＝［水］／［界面活性剤］）を変更することによって得られるナノ粒子のサイズをコントロールした。

逆ミセルをＣＰＳコーティングに封入した後、シェルをもつＣ_６内包ナノ粒子専用に修正されたサイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してナノ粒子を洗浄および濃縮した。約２０ミクロン径の粒径をもつ微孔質シリカ粒子を収容している普通より短い溶出カラムを使用し、カラムに溶出溶媒としてエタノールを添加した。ナノ粒子を分散させるために、アルキルアミンシランカップリング剤、アミノプロピルトリクロロシラン、を懸濁液に添加した。このカップリング剤は、ＳＥＣカラムの充填に使用した微孔質シリカ粒子にも添加した。必要に応じて酢酸または水酸化ナトリウムを加えて懸濁ナノ粒子のｐＨをほぼ７．０に維持した。更に、カルボジイミド仲介ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤をアルキルアミンカップリング剤に結合させた。

Ｃ _６ セラミド放出ビヒクルとなるヒドロゲル
熱応答性および生物分解性という双方の特性をもつ９種類の多機能ヒドロゲルを合成し特性決定した。ヒドロゲルは、熱応答性成分であるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）と加水分解的に分解性の疎水性成分であるポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）と酵素分解的に分解性の親水性成分であるデキストランとから構成された共重合ネットワークである。多機能特性を有しているので、設計したヒドロゲルは薬物送達および組織工学のような生物医学用途に適している（図１６）。

ヒドロゲルは熱応答性を示し、ＬＣＳＴはＰＮＩＰＡＡＭのＬＣＳＴの典型的な値である約３２℃であった。ヒドロゲルはまた加水分解的に生物分解性であり、約４箇月後に細孔サイズが拡大していた。ヒドロゲルの膨潤挙動はＬＣＳＴよりも高温（３７℃）か低温（２５℃）かで違っており、また、コポリマーの親水性および疎水性にも大きく左右された。結論として、ヒドロゲルは、コポリマーの組成と熱応答性および生物分解性を変更することによってＣ_６セラミドを制御かつ持続的に放出できると可能性が有力である。

本明細書中に記載の実施例および実施態様が単なる代表例であり、これらの記載に基づく多くの変形および変更が当業者に示唆されており、それらが本出願の要旨および範囲に包含されることを理解されたい。

吸収可能なコーティングを備えた薬物送達用コア−シェル粒子の製造手順の概略図である。 リポソーム配合物のキャラクタリゼーション。球形の形態および均一サイズ分布をもつリポソーム配合物が得られる。（Ａ）ＰＥＧ修飾リポソーム小胞［ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｃ_８／Ｃ６（４：３：１：１：１）］の代表的ＴＥＭ。慣用のリポソーム配合物［ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／Ｃ_６（６：０．５：１．５：２）］でも同様の顕微鏡図が観察された（データ示さず）。小胞サイズは直径８５〜１４０ｎｍの範囲であった。縮尺は１００ｎｍを表す。脂質溶液の押出は、リポソーム小胞によるＣ_６の取込みを有意に減少させない。（Ｂ）リポソーム配合物の平均サイズを表すグラフ。 リポソーム配合物のキャラクタリゼーション。（Ｃ）ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／Ｃ６（６：０．５：１．５：２）と微量の［^３Ｈ］Ｃ_６とから構成され、記載したような慣用のリポソームを製造するために押出処理した最終濃度１０ｍｇ／ｍｌのミセル配合物。平均±標準偏差，ｎ＝３の個別実験。リポソーム小胞を製造するために脂質ミセル溶液の押出を行った後も脂質組成は変わっていなかった。（Ｄ）ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／ｄｄＨ_２Ｏ（６０：２５：５）溶媒系を使用して分離した慣用のリポソーム配合物［ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／Ｃ６（３．５：３：２：１．５）およびＥＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／ＤＨＣ_６（３．５：３：２：１．５）］の代表的ＴＬＣ。予想した通り、Ｃ_６はヨウ素で染色されたがＤＨＣ_６は染色されなかった。その理由は、ＤＨＣ_６ではＣ_４−５二重結合が存在しないからである。 Ｃ_６送達のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物動態。Ｃ_６のリポソーム送達の結果として、Ｃ_６の細胞蓄積は非リポソーム送達よりも経時的に増加した。（Ａ）ＭＤＡ細胞に対するセラミド送達のキネティクスを測定するためにリポソームに微量の［^３Ｈ］Ｃ_６を配合した。細胞に加えたリポソームＣ_６および非リポソームＣ_６の総カウント数を１００％に設定した。２０μＭで、Ｃ_６蓄積は約１６時間でピークに達する。平均±標準偏差，ｎ＝３の個別実験。＊リポソームＣ_６蓄積と非リポソームＣ_６蓄積とを比較するときｐ＜０．０５。 Ｃ_６送達のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物動態。リポソームＣ_６は時間（Ｂ）および用量（Ｃ）の関数としてＭＤＡ細胞膜に分配されるがコレステリル−１，２−^３Ｈ（Ｎ）は分配されないことを表すグラフ。指定時間中のＭＤＡ細胞に対するセラミド（１０μＭ）送達のメカニズムを検証するために、ＰＥＧ修飾リポソーム［ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｃ８／Ｃ_６（４：３：１：１：１）］に微量の［^３Ｈ Ｃ_６］および［^３Ｈ ＣＨＥ］を配合した。セラミド送達の用量依存的メカニズムを１０時間の処理期間で観察した。細胞に送達された脂質の量をｐｍｏｌ／１０^６細胞として計算した。平均±標準偏差，ｎ＝３の個別実験。＊それぞれの配合物中のＣ_６蓄積とＣＨＥ蓄積とを比較するときｐ＜０．０５。 エストロゲン受容体陰性ＭＤＡ乳癌細胞中でリポソームＣ_６送達が非リポソームＣ_６よりも明白であることを示すチミジン取込み増殖アッセイ。（Ａ）慣用のリポソーム；（Ｂ）カチオン性リポソーム。 エストロゲン受容体陰性のＭＤＡ乳癌細胞中でリポソームＣ_６送達が非リポソームＣ_６よりも有効であることを示すチミジン取込み増殖アッセイ。 ＰＥＧ修飾リポソームＣ６［ＤＳＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ−ＰＥＧ（５０００）／Ｃ_８−ＰＥＧ（７５０）／Ｃ_６−Ｃｅｒ（３．７５：１．７５：０．７５：０．７５：３．０）］の送達は、Ｃ６の抗増殖活性を増強する。リポソーム送達は、４１０．４腺癌細胞中のＣ６のＩＣ５０を減少させる。０．７５までＰＥＧ−Ｃ_８を組込むと３０モルパーセントまでのＣ_６取込みが可能である。結果は、３つの個別実験の平均±標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。 リポソームＣ６の送達は、アポトーシスの尺度となるＭＤＡ細胞中のカスパーゼ３／７活性を増加させる。 リポソームＣ_６の送達は細胞内Ｃ_６のアポトーシス促進活性を増加させる。断片化３’−ＯＨ ＤＮＡのＴＵＮＥＬ染色は、Ｃ_６処理（２０μＭ）がＭＤＡ細胞中でアポトーシスを誘導することを追認する。約１６時間のインキュベーションでアポトーシスの発生が観察された。非リポソームＣ_６（２０μＭ）および慣用のリポソームＣ_６［ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／Ｃ_６（６：０．５：１．５：２）］（２０μＭ）はＤＮアーゼ陽性対照と同様にＤＮＡ断片化を誘導した。アネキシンＶ染色によって測定すると、リポソームＣ_６の送達の結果として有意な細胞アポトーシスが誘導される。 ＭＤＡ細胞を、非リポソームＣ_６（２５μＭ）、ＰＥＧ修飾リポソームＣ_６［ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｃ８／Ｃ_６（４：３：１：１：１）］（２５μＭ）、または、ゴーストリポソームで２４時間処理し、ＦＩＴＣ−アネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。平均±標準偏差，ｎ＝３の個別実験。＊ｐ＜０．０５；＃非処理対照と比較するときｐ＜０．００５。 リポソームＣ_６の送達は、増殖阻害および／またはアポトーシスに関連するシグナル伝達カスケードを変調する。リポソームＣ_６の送達は、ＭＤＡ細胞中のＡｋｔリン酸化を阻害する。（ＡおよびＢ）細胞を非リポソームＣ_６（５０μＭ）、ＰＥＧ修飾リポソームＣ_６［ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｃ８／Ｃ_６（４：３：１：１：１）］（５０μＭ）またはゴーストリポソームで８時間前処理し、次いで２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で更に１５分間刺激した。タンパク質溶解液に対して、Ａｋｔの天然形および活性形（リン酸化形態）をプローブした。（Ａ）ｎ＝３の個別実験の代表的ブロット。（Ｂ）平均±標準偏差，ｎ＝３の個別実験。＊ＩＧＦ刺激した非処理対照と比較するときｐ＜０．０５。 リポソームＣ６の送達の結果として、小嚢およびミトコンドリア構造にＣ６が蓄積する。（Ａ）リポソーム小胞から細胞へのＮＢＤ−Ｃ６送達のコンフォーカル顕微鏡図は、Ｃ６も細胞ミトコンドリアに蓄積することを示す。ＮＢＤ−Ｃ６はミトコンドリアにも局在していた。（Ｂ）全Ｃ６のマーカーとして［^３Ｈ］−Ｃ６を使用すると、ＰＥＧ修飾リポソームの送達は、小嚢脂質シグナル伝達ラフトにセラミドを時間依存的に蓄積させる。セラミドは、カベオリン−１富化脂質ラフト（小嚢）に相当するショ糖勾配の画分＃４−５に蓄積した。 腫瘍体積に対するＰＥＧ修飾リポソームＣ_６［ＤＳＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＣ−ＰＥＧ（５０００）／Ｃ_８−ＰＥＧ（７５０）／Ｃ_６−Ｃｅｒ（３．７５：１．７５：０．７５：０．７５：３．０）］の効果。４１０．４腺癌細胞を接種した動物の腫瘍体積を、１２、２４および３６ｍｇ／ｋｇのリポソームＣ_６および空のリポソームビヒクルで処理中および処理後に測定した。結果をグループあたり５匹の動物の平均±標準偏差で表す。（Ｂ）４０ｍｇ／ｋｇで１週間処理した腫瘍の冷凍切片を染色し、ポジティブＴＵＮＥＬ染色法でアポトーシスを証明する。ゴーストおよび非処理の腫瘍切片では染色が殆どわからない。グループあたり３匹の動物から採取した代表スライドの腫瘍切片あたり１０個のランダム視野。 ４１０．４腫瘍保有Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＰＥＧ修飾リポソームＣ６の薬物動態。（Ａ）用量１０および４０ｍｇ／ｋｇのリポソーム−Ｃ６は一次キネティクスに従って挙動するらしく、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＣ５０に相関する十分な血漿濃度が２４時間維持された。（Ｂ）これらの用量で、腫瘍組織中のＣ６は約３０分後に定常濃度に到達する。４０ｍｇ／ｋｇの用量は、所望のＩＣ５０を十分に上回る濃度を２４時間維持する。 熱応答性および生物分解性を有しているＰＬＬ、ＰＬＬＡおよびＮＩＰＡＡＭポリマーから構成された特許樹状構造。 デンドリマーの熱応答性および薬物放出特性。（Ａ）Ｕｖｖｉｓスペクトロスコピーを使用して０．５および０．１ｍｇ／ｍｌの合成デンドリマーの透過率を検査した。約３４℃で溶液混濁度の明らかな変化が観察された。これはデンドリマーのＬＣＳＴを表す。（Ｂ）Ｃ_６充填デンドリマーは特徴的な放出キネティクスおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの生物有効性を示す。３７℃および２５℃で０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含有する蒸留水中でＣ_６充填デンドリマーから放出されるＣ_６の分量を時間の関数として測定した。デンドリマーのＬＣＳＴよりも高温の３７℃では、デンドリマーがより疎水性になり、その結果としてＣ_６充填デンドリマーから放出されるＣ_６はより緩徐な放出プロフィルを示す。デンドリマーの濃度は１２２μｇ／ｍｌであった。 デンドリマーのＬＣＳＴよりも低温（２５℃）およびＬＣＳＴよりも高温（３７℃）の温度における１００μｇ／ｍｌの濃度のデンドリマーのＭＤＡ細胞による取込みを１時間観察した。（Ａ）＆（Ｂ） デンドリマーをグリーンＦＩＴＣで標識しＭＤＡ細胞核をブルーＤＡＰＩで染色した。コンフォーカル顕微鏡図は、デンドリマーがＬＣＳＴよりも高温（３７℃）でＭＤＡ細胞に優先的に蓄積することを示す。左上段はブルーＤＡＰＩで染色した核、右上段はグリーンＦＩＴＣ−デンドリマー、左下段は位相／対比、右下段はオーバーレイ。（Ｃ）フローサイトメトリー分析は、デンドリマーのＬＣＳＴを下回る温度（２５℃）よりもＬＣＳＴを上回る温度（３７℃）のときのほうが有意に多いデンドリマーがＭＤＡ細胞にインターナリゼーションしたことを示す。＊ｐ≦０．００５。 Ｃ_６セラミド充填デンドリマーはｉｎ ｖｉｔｒｏで抗癌作用を示す。（Ａ）５％ＦＢＳの存在下、Ｃ_６充填デンドリマーはセラミドをＭＤＡ細胞に送達でき、その結果生じたＣ_６誘発細胞毒性は、ＤＭＳＯ中の遊離Ｃ_６の投与に比べて増加しないとしても同等である。（Ｂ）Ｃ_６充填デンドリマーはＤＭＳＯ中の遊離Ｃ_６の投与に比べてＣ_６誘導アポトーシスを有意に増加させる。＊ｐ≦０．０５。 ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＰＬＬ−ｃｏ−デキストランヒドロゲルの構造。Ｒは−ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２またはＨを表し、ｍおよびｎは約１から数１０００までの整数を表す。ＮＩＰＡＡＭセグメントも約１０から数１０００までの構造単位を有し得る。

Claims (41)

1. 治療用化合物をその送達が必要な動物またはヒトに送達するための組成物であって、治療用化合物の全身送達を可能にするナノ粒子の吸収性を与えるカルシウムホスホ−シリケートシェルを有しているナノ粒子を含み、前記シェルが増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物を含有し、前記の増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物がセラミドまたはＣ２〜２４セラミドを含む、組成物。
2. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が、セラミド、ジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、エーテル結合ジグリセリド、エーテル結合ホスファチジン酸、スフィンゴシンおよびスフィンガニンからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
3. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が短鎖Ｃ２〜１０セラミドである請求項１に記載の組成物。
4. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が、炭素数２〜１０の短鎖脂肪酸をＳＮ−２位に含有するセラミドを含む請求項１に記載の組成物。
5. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が、炭素数１２〜２４の長鎖脂肪酸をＳＮ−２位に含有する生理的セラミドを含む請求項１に記載の組成物。
6. 吸収性ナノ粒子が、静脈内、カテーテル送達、注入ポンプ、ミクロスフェアまたは軟膏を介して全身送達される請求項１に記載の組成物。
7. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が、機能異常細胞の増殖を含む病態を治療するために全身送達される請求項１に記載の組成物。
8. 病態が、癌、新生物、動脈炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄または脆弱なプラークおよび糖尿病からなる群から選択される請求項７に記載の組成物。
9. 吸収性ナノ粒子が１〜３００ｎｍの範囲の平均粒径を有している請求項１に記載の組成物。
10. 吸収性ナノ粒子が５０ｎｍ未満の平均粒径を有している請求項１に記載の組成物。
11. 吸収性ナノ粒子が２０ｎｍ以下の平均粒径を有している請求項１に記載の組成物。
12. （ａ）非イオン性界面活性剤と疎水性有機溶媒と水と増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物とを混合することによって逆ミセルを調製する段階と、
    （ｂ）逆ミセルをカルシウムホスホ−シリケートシェルでコーティングする段階と、
    （ｃ）カルシウムホスホ−シリケートシェルに分散剤を添加する段階と、
    （ｄ）溶出カラムと粒径２０ミクロンの微孔質シリカ粒子とからなる修正型サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー技術を使用して吸収性ナノ粒子を洗浄し濃縮する段階と、
    を含み、カルシウムホスホ−シリケートシェルに添加した分散剤と同じ分散剤を微孔質シリカ粒子に添加することを特徴とする請求項１に記載の吸収性ナノ粒子の合成方法。
13. 分散剤が、酸、金属−有機化合物または無機化合物である請求項１２に記載の方法。
14. 酸が、クエン酸、酒石酸および酢酸からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
15. 金属−有機化合物がアルキルアミンシランカップリング剤またはアルキルカルボン酸シランカップリング剤である請求項１３に記載の方法。
16. アルキルアミンシランカップリング剤が、アミノプロピルトリクロロシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルシルセスキオキサン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＳ）、トリメトキシシリル−プロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、３−トリメトキシシリルプロピルコハク酸無水物、および、アルキルカルボン酸シランカップリング剤からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
17. アルキルカルボン酸シランカップリング剤がアミド結合カルボキシル基である請求項１６に記載の方法。
18. 無機化合物が、カルシウム、リン酸塩およびピロリン酸塩からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
19. 結合因子のための結合点を提供するために、カルボジイミド仲介ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤を分散剤に添加する段階を更に含む請求項１２に記載の方法。
20. 結合因子が、発癌性または炎症性または増殖性の体内細胞または体内組織をターゲットする抗体または受容体リガンドである請求項１９に記載の方法。
21. 修正型サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー技術が、溶出カラムを短縮することと、水またはアセトンの代わりにエタノールを使用することとを含む請求項１２に記載の方法。
22. 機能異常細胞の増殖を含む病態を治療するための医薬の製造における、請求項１に記載の吸収性ナノ粒子の使用。
23. 吸収性ナノ粒子に含まれる増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が１０００ｍｇ．ｍｌ^−１以下の濃度である請求項２２に記載の使用。
24. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が組成物の４０重量％を構成する請求項２３に記載の使用。
25. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物をそれらの送達が必要な動物またはヒトに全身送達するためのナノ粒子集合体システムであって、全身送達を可能にするナノ粒子の吸収性を与え、且つ増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物を含むカルシウムホスホ−シリケートシェルナノ粒子を含んでなり、増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物がセラミドを含む、システム。
26. 吸収性ナノ粒子が２０ｎｍ以下の粒径を有している請求項２５に記載のナノ粒子集合体システム。
27. セラミドが、ＳＮ−２位に炭素数２〜１０の短鎖脂肪酸またはＳＮ−２位に炭素数１２〜２４の長鎖脂肪酸を含む請求項２６に記載のナノ粒子集合体システム。
28. ナノ粒子の凝集を防止するためにカルシウムホスホ−シリケートシェルに分散剤が結合しており、前記分散剤が、アミノプロピルトリクロロシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルシルセスキオキサン、３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、トリメトキシシリル−プロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、３−トリメトキシシリルプロピルコハク酸無水物、およびアルキルカルボン酸シランカップリング剤からなる群から選択される請求項２７に記載のナノ粒子集合体システム。
29. 結合因子のための結合点を提供するために、カルボジイミド仲介ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤が分散剤に添加されている請求項２８に記載のナノ粒子集合体システム。
30. 機能異常細胞の増殖を含む病態を治療するために増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物を全身送達する請求項２９に記載のナノ粒子集合体システム。
31. 病態が、癌、新生物、動脈炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、脆弱なプラークおよび糖尿病からなる群から選択される請求項３０に記載のナノ粒子集合体システム。
32. 機能異常細胞の増殖を含む病態を治療するための医薬の製造における、請求項２５に記載のナノ粒子集合体システムの使用。
33. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が医薬の４０重量％を構成する請求項３２に記載の使用。
34. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が遊離セラミドを含む請求項１に記載の組成物。
35. 吸収性ナノ粒子が疎水性化学療法剤を更に含む請求項１に記載の組成物。
36. 吸収性ナノ粒子が遺伝子治療薬を更に含む請求項１に記載の組成物。
37. 遺伝子治療薬が、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、アンチセンスまたはＳｉ−ＲＮＡからなる群から選択される請求項３６に記載の組成物。
38. 増殖抑制性で、プロアポトーシスの脂質由来生物活性化合物が遊離セラミドを含む請求項２５に記載のナノ粒子集合体システム。
39. オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、アンチセンスまたはＳｉ−ＲＮＡからなる群から選択される遺伝子治療薬を更に含む、請求項２５に記載のナノ粒子集合体システム。
40. 疎水性化学療法剤を更に含む請求項２５に記載のナノ粒子集合体システム。
41. 脂質由来生物活性化合物がジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、エーテル結合ジグリセリド、エーテル結合ホスファチジン酸、スフィンゴシンおよびスフィンガニンを更に含む請求項２５に記載のナノ粒子集合体システム。

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