NO870299L - Liposom/antrakinon-legemiddelpreparat og fremgangsmaate for dets fremstilling. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et terapeutisk liposom/- antrakinon-preparat som har redusert lipidoksydasjon og friradikal-skade samt fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av preparatet.

Referanser

Aubel-Sadron, G., et al., Biochemie, 66:333 (1984), Augustin, M.A., J. Am. Oil Chem., 60:105 (1983),

Forssen, E.A., et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 78(3) 1873

(1981),

Gabizon. A, et al., Cancer Res. 42:4734 (1982),

Gabizon. A, et al., Cancer Res. 43:4730 (1983),

Gabizon. A, et al., Brit. J. Cancer, 51:681 (1985), Goormaghtigh, E. et al., Res. Commun. Chem. Path. and Pharm. 42(1):149 (1983),

Goormaghtigh, E. et al., Biochem. Biophys. Acta, 779:271

(1984),

Gutteridge, J.M.C., Biochem. Pharm., 33(11);1725 (1984a), Gutteridge, J.M.C., FEBS, 172(2):245,

Juliano, R.L., et al., Biochem. Pharmacol., 27:21 (1978), Klein, R.A., Biochem. Biophys. Acta, 210:486 (1970),

Mayhew, E. , et al., Cancer Treat Repts, 63 ( 11-12 ):1923

(1979),

Myers, CE. , et al., Cancer Treat Repts, 60(7):961 (1976), Olson, F., et al., Eur. J. Clin. Oncol, 18(2):167 (1982), Poznansky, M.L., et al., Pharm. Revs. 36(4):277 (1984), Rahman, A., et al., Cancer Res. 40:1532 (1980),

Samuni, A., et al., Cancer Res. in press,

Sikle, B.I., et al., Science, 228:1544 (1985),

Sonneveld, P., Cancer Treat Repts., 62 (7):1033 (1978), Stuart-Harris , R.C., et al., Biochem. Pharmacol., 12:1

(1984),

Sunamoto, J., et al., Biochem. Biophys. Acta, 833:144 (1985), Szoka, F., et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980), Tomasz, M., Chem-Biol. Interact. 13:89 (1976),

Wang, Y.M., et al., Cancer Res., 40:1022 (1980),

Young, R.C., et al., N. Eng. J. Med., 305:139 (1981).

Liposom-avgivelsessystemer har vært foreslått for en rekke forskjellige legemidler, spesielt de som administreres parenteralt. Liposomer er i besittelse av muligheten til å tilveiebringe en regulert "depot"-frigivelse av det admini-strerte legemidlet over en forlenget tidsperiode, og til å redusere toksiske bivirkninger av legemidlet, ved å begrense konsentrasjonen av fritt legemiddel i blodstrømmen. Liposomer kan også endre vevfordelingen og opptaket av legemidler, og den endrede vevfordeling kombinert med andre av de nettopp nevnte fordeler, kan øke den terapeutiske effektiviteten til legemidlet i betydelig grad. Liposom/legemiddel-preparater kan også øke anvendeligheten av terapi ved å tillate høyere legemiddeldosering og mindre hyppig legemiddeladministrasjon. I Poznansky et al. er det gitt en generell redegjørelse for liposom-legemiddelavgivelsessysterner.

En gruppe legemidler hvis anvendelse i lipsom-avgivelsessystemer har blitt omfattende studert er klassen av antracen-kinoner, inkludert spesielt antracykllnglykosid-antibiotika, eksemplifisert ved anti-tumorlegemidlet doksorubicin eller "Adriamycin", doksorubicinol, daunorubicin og daunorubicinol, og deres cyanomorfolinylderivater. Doksorubicin (DXR) er et kraftigvirkende kjemoterapeutisk middel som er effektivt mot et bredt spektrum av neoplasmaer (Aubel-Sadron et al. og Young). Bruk av legemidlet i oppløselig form er imidlertid begrenset av alvorlige bivirkninger. Dets akutte toksisitet i mennesker omfatter illebefinnende, kvalme, oppkast, myelo-suppresjon og sterk alopesi. I tillegg forekommer kumulativ og irreversibel hjerteskade med gjentatt administrasjon hvilket i alvorlig grad begrenser bruken av legemidlet ved langvarig behandling (Young).

Tidligere dyremodellstudier tyder på at når DXR administreres i liposomform, så bibeholder legemidlet sin terapeutiske effektivitet mot dyretumorer , men er betydelig mindre toksisk, bedømt ut fra den reduserte dødelighet (Forssen, Gabizon 1985). Den legemiddel-beskyttende effekt til liposomer kan i det minste delvis skyldes en endring i vevavset-ning og legemiddel-frigjøringshastighet av det injiserte legemidlet (Gabizon 1982; Gabizon 1983; Juliano).

Den kardiomyopati som observeres ved DXR-behandling ligner hjertemuskellesjonene som observeres i forsøksdyr under betingelser for cx-tokoferol (oc-T)-mangel (Tomasz), hvilket antyder at de legemiddelinduserte lesjonene er forårsaket av forøkede friradikal-reaksjoner som involverer membranlipider. DXR og andre antrakinoner som har den generelle struktur vist i figur 1 inneholder både kinon- og hydrokinongrupper og kan således forventes å fremme peroksydasjonsreaksjoner som innebærer elektronoverføring til eller fra kinonene eller hydrokinonene. I tillegg vil binding av legemidlet til lipider gjennom antracendelen forventes å lette lipid-deltagelse i peroksydasjonsreaksjoner. Det er f.eks. kjent at DXR bindes sterkt til kardiolipin, en hovedlipidkomponent i mitokondrier, og enzym-katalysert elektrontransport resulterer i dannelse av kovalente bindinger mellom legemidlet og lipid (Goormaghtigh).

Friradikal-mekanismen ved hjertetoksisitet foreslått for DXR antyder at en lipofil f r iradikal-undertrykker slik som vitamin E ville være effektiv med hensyn til å redusere legemiddel toksisitet og dette har faktisk blitt funnet (Myers; Wang; Sonneveld). De refererte dyrestudier har vist at vitamin E er effektivt når det gjelder å redusere kardiotoksisitet når det administreres før eller samtidig med DXR-administrasjon. Nyligere studier har vist at et liposom-legemiddelsystem som omslutter både DXR og vitamin E er mindre toksisk i mus, og gir mindre kardiomyopati, enn vitamin E/DXR eller liposom/DXR-kombinasjoner alene (Olson). Den reduserte toksisiteten til liposomer som omslutter både DXR og vitamin E resulterer tydeligvis fra en kombinasjon av den endrede legemiddelfordeling og/eller lavere nivåer av fritt legemiddel -- på grunn av liposomal omslutning av legemidlet — og fra redusert friradikalskade — på grunn av friradikal-undertrykkelsesaktiviteten til vitamin E.

Sammenfatningsvis indikerer dyrestudier som hittil er foretatt at liposomer kan redusere kardiotoksisiteten til DXR og at tilstedeværelsen av vitamin E i liposomene ytterligere kan redusere kardiotoksiske bivirkninger. Studiene foreslår imidlertid ikke om liposomer har evne til å redusere mer kortvarige og generaliserte toksiske bivirkninger som ses hos mennesker, slik som kvalme, illebefinnende, håravfall og benmargundertrykkelse, hvilket vanligvis er forbundet med DXR-behandling. I denne sammenheng bemerkes det at noen av bivirkningene ved DXR-administrasjon, spesielt kvalme, kan bedres ved intranøs administrasjon av legemidlet ved langsom drypping, typisk over en periode på 2-4 dager, slik det har blitt beskrevet i den tidligere teknikk. Ved denne metode utsettes pasienten for sentralvene-kateterisering og utstyres med en gjenfyllbar pumpe som anvendes for å levere den valgte dosen over en total doseringsperiode på typisk flere dager. Denne metoden har ikke blitt utbredt benyttet på grunn av de ulemper og logistiske problemer som er involvert. Heller ikke gir metoden en betydelig reduksjon i hyppigheten av alopesi.

Videre har de hittil utførte dyrestudier ikke undersøkt eller forstått graden og effekten av lipid- og legemiddeloksydasjon som kan forekomme ved lagring av legemiddel/liposom-preparater. Det har ved studier utført til støtte for foreliggende oppfinnelse blitt funnet at legemidlet og lipider i et slikt preparat kan gjennomgå vesentlig kjemisk modifikasjon ved lagring, selv under anoksiske lagringsbetingelser. Slik skade øker toksisiteten til 1 egemiddelpreparatet og synes å forrringe legemidlet terapeutiske virkning.

Foreliggende oppfinnelse omfatter et 1iposom/antrakinon-preparat som har antioksyderende egenskaper beregnet for å redusere lipidoksydasjon og friradikal-skade på både lipid-komponenten og legemiddelkomponenten i preparatet.

Ifølge oppfinnelsen er det oppdaget at legemiddel- og lipid-skade som er relatert til oksydative og friradikal-mekanismer vesentlig reduseres ved at det i liposompreparatet innbefattes et lipofilisk friradikal-rensemiddel, slik som a-T, og et vannoppløselig trihydroksamsyre-chelateringsmiddel, slik som ferrioksamin, som har en høy og selektiv bindingsaffi-nitet for ferri-jern. Beskyttelsesgraden mot lipid-peroksydasjon og friradikal-skade er mye større enn den som gis av friradikal-undertrykkere alene eller av chelateringsmidler, slik som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), som hittil har blitt benyttet. Chelateringsmidlet er tilstede i et molart overskudd over ferri-jernet i suspensjonen.

Et foretrukket 1iposompreparat inneholder DXR (eller en farmakologisk akseptabel analog, derivat, eller salt derav) ved et molart forhold på minst ca. 2,5 mol-# i liposomer omfattende 20-50 mol-$ kolesterol, 10-40 mol-$ negativt ladet fosfolipid, slik som fosfatidylglyserol (PG), fosfatidylserin (PS) eller fosfatidylinositol (PI) og fosfatidylkolin (PC). Liposomene er hovedsakelig i størrelsesområdet på 0,05-0,5 pm og fortrinnsvis mellom ca. 0,05-0,25 pm, og mengden av fritt legemiddel i suspensjonen, dvs. legemiddel som ikke er forbundet med liposomer, er fortrinnsvis mindre enn ca. 15$ av det totale legemidlet i suspensjonen. Ferrioksamin inneholdes i suspensjonen i en mengde på ca. 50 pm, og a-T i liposomene ved en konsentrasjon på minst ca. 0,2 mol-%.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for behandling av humanneoplasmer med et DXR/liposom-preparat, fortrinnsvis preparatet som angitt ovenfor. Kliniske forsøk på mennesker med kreft innen rammen av et fase I-studium indikerer signifikant reduksjon av mange bivirkninger slik som ubehag (malaise), hodepine, kvalme, oppkast, lokal smerte ved inj eksj onsstedet, og alopesi, som ofte er forbundet med behandling med fri DXR. Terapeutisk effektivitet mot humane primære og sekundære neoplasmer i leveren har blitt demon- strert i pasienter som ikke har reagert eller har stoppet å reagere overfor andre former for terapi, i noen tilfeller inkludert terapi med fri doksorubicin.

Mer generelt innbefatter dette aspekt ved oppfinnelsen en fremgangsmåte for betydelig reduksjon av kvalme og alopesi med adriamycin-administrasjon, ved administrasjon av adriamycin ved terapeutisk effektive doser i liposom-omsluttet form, og en metode for behandling av primære og sekundære neoplasmer i leveren hos mennesker ved administrasjon av DXR i liposomal form i blodstrømmen.

Det er et generelt formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et 1 iposompreparat som inneholder et omsluttet antrakinon-legemiddel, i hvilket in vitro-peroksydativ skade på lipid-og legemiddelkomponentene i preparatet er vesentlig redusert.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en generell metode for nedsettelse, i et liposom/antrakinon-preparat, av lipid- og legemiddeltoksisitet som er relatert til oksydasjons- og friradikalreaksjoner.

Et spesielt formål er å tilveiebringe et slikt preparat for behandling av human neoplasma, hvor legemidlet er DXR eller en farmakologisk akseptert analog, derivat eller salt derav.

Et beslektet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en metode for behandling av human neoplasma og spesielt primære og metas tati ske levertumorer, hematopeietiske proliferative forstyrrelser og leukemier med liposom-omsluttet DXR med betydelig bedring av normale legemiddelbivirkninger.

Disse og andre formål og trekk ved oppfinnelsen vil fremgå fra følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen i sammenheng med de medfølgende tegninger.

Figurene 1A-1C viser de generelle strukturene for klasse I og klasse II antracyklinaminoglykosider (IA og IB, respektivt) og mitoxantron (1C); Figur 2 viser de fluoriscerende emisjonsspektra for DXR i oppløselig (øvre stiplede linje) og liposom-"bundet (øvre heltrukne linje) form, og et DXR-Fe (III) kompleks i oppløselig (nedre stiplede linje) og friskt fremstilt 1iposom-bundet (nedre heltrukne linje) form; Figur 3 illustrerer oksydative og friradikal-mekanismer som kan bidra til legemiddel- og lipidmodlfikasjoner i nærvær av ferrijern, oksygen og umettede lipider; Figur 4 illustrerer f e r r i j e r n - c h e 1 a t e r i ng med et frihydroksamsyre-chelateringsmiddel; Figur 5 viser UV-spektra for lipider isolert fra liposomer inkubert i nærvær (spektrum A) eller fravær (spektrum B) av ferrioksamin; Figur 6 viser plotting av effektene på overlevelse av mus for graderte doser av fri DXR (F-DXR) og liposom-omsluttet DXR (L-DXR) etter en enkelt Injeksjon; Figurene 7 og 8 viser plottinger av overlevelseskurvene for hann- og hunnmus, respektivt, etter gjentatt administrasjon av graderte doser av F-DXR og L-DXR; og Figur 9 er en grafisk fremstilling som viser plasma-molar-konsentrasjon av adriamycin som en funksjon av timer etter administrasjon av fritt legemiddel (heltrukne linjer) og liposom-omsluttet legemiddel (stiplede linjer ).

I. Fremstilling av liposom/ legemiddel- preparat

A. Antrakinon- legemidlet

Antrakinon-legemidlet benyttet ved fremstilling av foreliggende preparat er et anti-neoplastisk antrakinon-legemiddel som har en antracen-ringstruktur og kinon-, semlkinon- eller hydrokinon-funksjonaliteter på ringstrukturen. Mer presist, og slik uttrykket er definert heri, innbefatter antrakinon-legemidler de antrakinonstrukturer som har en kinon- og hydrokinongruppe på tilstøtende ringer i antracen-ringstrukturen. Ahti-neoplastiske antrakinoner som har disse trekk kan klassifiseres i tre grupper som er illustrert i figurene 1A-1C.

Den første gruppen er klasse I antracenglykosidene som er illustrert i figur IA. Innbefattet i denne gruppen er en rekke klinisk viktige anti-neoplastiske legemidler slik som doksorubicin (DXR, vanlig kjent som Adrlamycin), daunomycin, karcinomycin , N-acety1 adr iamycin , N-acetyldaunomycin , rubidazon og 5-imidodaunomycin. Tabell I nedenfor gir de strukturelle variasjonene for disse klasse I legemidlene uttrykt ved RI-, R2- og R3-gruppene i figur IA. Mer nylig har et cyanomorf ol inoder ivat av DXR blitt rapportert (Sikic). Legemidler i denne klassen er kjent for å ha anti-neoplastiske effekter mot en rekke forskjellige krefttyper, inkludert akutt leukemi, brystkreft, Hodgkins sykdom, ikke-Hodgkins-lymfomer og sarkomer. Den primære mekanismen til legemidlene synes å være interkalasjon 1 DNA og DNA-skade (Young, Goormaghtigh 1984), skjønt membranbinding (Goormaghtigh 1984) og enzym-katalysert friradikal-dannelse (Aubel-Sadron) også har vært foreslått som mulige medvirkende mekanismer til legemiddelvirkning.

Den andre gruppen innbefatter klasse II antracenglykosldene som adskiller seg fra klasse I forbindelsene ved mere komplekse (multimere) aminoglykosidrester, som det fremgår fra figur IB. Disse forbindelsene deler de samme generelle terapeutiske og toksiske egenskapene til deres klasse I motstykker. Representative klasse II antracenaminoglykosider er angitt i tabell II, under henvisning til RI-, R2- og R3-gruppene vist i figur IB.

Den tredje gruppen av antrakinoner omfatter de som har den generelle ringstrukturen vist i figur IA, dvs. med kinon- og hydrokinongrupper på tilstøtende antracenringer, men som mangler de glykosIdgruppene som er karakteristiske for antracyklin-antibiotika. Et viktig legemiddel i denne gruppen er mitoxantron, et ant i-neopl astisk legemiddel som er rapportert for å være effektivt mot en rekke forskjellige krefttyper, inkludert brystkreft, men som kan ha reduserte bivirkninger, inkludert kardiotoksisitet, sammenlignet med fri DXR (Stuart-Harris).

Studier angående bindingen av ferrijern til DXR som har blitt utført i samarbeid med en av oppfinnerne viser at antrakinon-legemidlene, og spesielt de antracykliske aminoglykosidene, danner stabile metallkomplekser med ferrijern (Samuni). Studiene omfattet undersøkelse av bindingen av DXR ti ferrijern, både I nærvær og fravær av små unilamellære vesikler (SUV'er) dannet fra det mettede fosfolipidet dimyristylfosfatidylkolin (DMPC). Under henvisning til figur 2 viser det fluorescerende emisjonsspekteret til DXR ved 480 nm eksitasjonsbølgelengde (øver stiplede linje) topper ved ca. 590 og 560 nm, og dette spekteret forandres meget lite når legemidlet er forbundet med SUVer (øvre heltrukne linje). Når DXR er kompieksdannet med ferrijern i nærvær av ADP, ble det observert et fluorescens-emisjonsspektrum som hadde nesten samme form, men betydelig mindre redusert intensitet (nedre stiplede linje). Den reduserte intensiteten resulterer antageligvis fra undertrykkereffekten til jern. Når DXR-Fe (III )komplekset ble tilsatt til DMPC SUVer, ble mindre undertrykkereffekt observert, hvilket fremgikk fra et f luorescens-emisj onsspektrum som var intermediært i intensitet mellom det til det frie legemidlet og DXR-Fe(III)-komplekset i oppløsning (nedre heltrukne linje). De samme emisjonsspektra for DXR-Fe(III)-komplekset i forbindelse med liposomer ble observert enten jern ble tilsatt før eller etter legemiddelbindlng til liposomene, hvilket indikerer at legemiddel-j ernkomplekset lett dannes med lipid-bundet legemiddel.

Av interesse med hensyn til foreliggende oppfinnelse var det funn at DXR gjennomgår relativt hurtig og irreversibel kjemisk modifikasjon når det kompleksdannes med ferrijern i nærvær av SUVer dannet med mettede og/eller umettede fosfoliplder. Et mål for denne modifikasjon er en endring i 590/560 nm-forholdet til fluorescensspektrene, som ville resulterer fra modifikasjon av antracenringen. 590/560 nm-forholdet til DXR-Fe(III) i forbindelse med DMPC er innledningsvis ca. 1,9. I nærvær av ferrijern, ved et jern:legemiddel-forhold på 2:1, faller dette forholdet til ca. 0,9 i løpet av en fem timers periode ved 30°C. Med et stort molart overskudd av ferrijern, er fallet for 590/560 betydelig hurtigere, idet det minsker til mindre enn 0,8 i løpet av to timer. Det modifiserte DXR, når det er ekstrahert fra liposomene, har et 590/560-forhold på ca. 0,6. Det modifiserte legemidlet viser også forøket hydrofobisitet hvilket fremgår ved dets oppdelingsegenskaper i et standard tofase-partisjonssystem. Denne endring kan skyldes spalting av den mer hydrofile sukkerdelen fra antracen-ringstrukturen. Det bemerkes at legemiddel-modifikasjonsreaksjonene forekommer enten i nærvær eller fravær av oksygen, i liposomer bestående enten av mettede eller umettede fosfolipider. Dvs. de forhold som leder til 1 egemiddelmodifikasjon synes ikke å kreve oksygenavhengig elektronoverføring eller friradikaldannelse som innebærer umettede lipider. Som det vil fremgå i det nedenstående, bidrar imidlertid både oksygen og umettede lipider til legemiddelmodifikasjon i legemiddel/1iposompreparatet, og under disse betingelsene kan betydelig lipidperoksydativ skade også inntreffe. Et av de viktigste trekkene ved foreliggende preparat er, slik det vil fremgå i det nedenstående, en betydelig reduksjon i slike legemiddel-og lipidmodifikasjoner.

B. Lipidkomponenter

Liposomene i preparatet dannes fra standard vesikkel-dannende lipider som generelt omfatter nøytrale og negativt ladede fosfolipider og en sterol , slik som kolesterol. Valget av lipider styres av betraktninger med hensyn til (a) legemiddel -fr igjøringshastIghet i serum, (b) legemiddel-oms lutningsef f ekt i v i tet, (c) liposom-toksisitet og (d) biofordeling og målrettingsegenskaper.

Når det gjelder effekten til lipidkomponentene på in vivo-legemiddel-frigjøringshastigheter er de mest viktige sammen-setningsmessige faktorer kjedelengde, umetningsgrad og hovedgruppe-ladning og sidegrupper i fosfo1ipidene. Legemiddel-frigjøringshastighetens avhengighet av lipidsammensetning skyldes delvis forskjeller i utvekslings-hastigheten for amfipatisk legemiddel med det ytre liposom-bilaget, og delvis den varierende stabilitet til liposomer som har forskjellige lipidsammensetninger. Fra de nedenfor angitte studier vil det fremgå at negativt ladede fosfolipider, slik som fosfatidylglyserol (PG) og fosfatidylserin (PS), har tendens til å fremme legemiddel-liposomstabilitet målt ved DXR-frigjøring i 50$ plasma, mens kardiolipin (CL) gir en markert destabiliserende effekt på liposomene. Den sistnevnte effekten kan relateres til det tydeligvis sterke samvirke mellom DXR og kardiolipin som reflekteres ved legemiddel- og lipid-kryssbinding som også inntreffer in vivo (Goormaghtigh 1983 ). Nøytrale fosfolipider, spesielt fosfatidylkolin (PC), og negativt ladede fosfolipider, slik PG, PS og fosfatidylinositol (PI), som har acylkjedekomponenter med valgte kjedelengder og metningsgrad, er tilgjengelige fra kommersielle kilder eller kan fremstilles ved hjelp av kjente teknikker.

En annen lipidkomponent som er viktig for llposomstabllitet og derfor for legemiddel-frigjøringshastighet, er kolesterol. I et studium utført i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ble In vitro-frigjøringen av DXR fra liposomer hvis lipidkomponenter inneholdt varierende mengder av kolesterol, PC, og PG, PS eller Cl, undersøkt. Liposomene ble fremstilt vesentlig som beskrevet i eksempel I nedenfor, men inneholdt de molprosentandeler av PC, PG og kolesterol som er angitt i nedenstående tabell III. Forut for hver test ble llposom-suspensjonene frigjort for fritt (oppløselig) legemiddel ved molekylarsikt-kromatografi. DXR/liposom-preparatene ble hvert inkubert ved 37° C i en time i nærvær av 50% humanplasma og det llposom-tilknyttede legemidlet ble deretter separert fra frigjort, oppløselig legemiddel, enten ved molekylarsikt-kromatografi eller ultrasentrifugering. Mengden av DXR holdt tilbake i liposomene ble beregnet som en prosentandel av det totale opprinnelige legemidlet. Resultatene er vist i tabell

III:

Som det fremgår fra tabellen, gir 20 mol-% kolesterol en 2-gangers til 3-gangers forøkning i legemiddelretensjon i PC-liposomer, skjønt ingen ytterligere forbedring ses opp til et kolesterol-molforhold på 50%. I liposomer dannet med 30 mol-% PG, ble god legemiddelretensjon oppnådd i fravær av kolesterol, med gradvis større stabilitet observeres med økende mengder kolesterol. PS, et annet negativt ladet fosfolipid, gir vesentlig det samme resultatet som det som ble funnet med PG. Ytterligere studier som ikke er rapportert her, indikerer at den forøkede legemiddel-retensjon ses over et område for negativt ladet fosfolipid på mellom ca. 10 og 40 mol-%. Det er Interessant at tilstedeværelsen av bare 10 mol-% kardio lipin (difosfatidylglyserol) , som inneholder en dobbelt negativt ladet hovedgruppe, vesentlig eliminerte kolesterol-effekten, hvilket gir dårlig legemiddel-retensjon selv ved 50 mol-% kolesterol.

Legemiddelomslutningseffekt, en annen faktor som skal tas i betraktning ved valg av en lipidsammensetning, refererer til den totale mengde legemiddel som kan innføres i liposomer, uttrykt som et forhold for legemiddel pr. mol pr. liposom-lipid. Høy omslutningseffektivitet er ønskelig både hva angår preparatkostnader og for maksimering av mengden av legemiddel som kan avgis i liposomal form i et gitt volum av liposomer. Forsøk utført til støtte for foreliggende oppfinnelse har undersøkt effektiviteten av DXR-omslutning i både store og mindre sonikerte liposomer, og med et antall forskjellige 1 ipidsammensetninger . Liposom- og 1 ipidsammensetnings-variablene er vist i nedenstående tabell IV. I denne tabellen refererer MLV til multi 1 ame 1lære vesikler, som typisk inneholder heterogene liposomstørrelser hvis gjennomsnitt er mellom ca. 0,5 og 5 pm, og SUVer til sonikerte, men ufrak-sjonerte vesikler. Den siste angivelsen er for vesikler som har blitt sonikert og fraksjonert for å fjerne større vesikler, hvilket gir hovedsakelig små liposomer som er betegnet SUV(F). DPPG og DPPC er forkortelser for dipalmitoyl PG og dipamitoyl PC, respektivt, til forskjell fra PC og PG, som er avledet fra egglipider og som inneholder en blanding av både mettede og umettede fosfolipidkomponenter.

Data angående MLVer antyder at et negativt ladet fosfolipid, enten CL eller PS, er nødvendig for god omslutningseffektivitet, men at kolesterol bare har en mindre effekt, om noen i det hele tatt, på legemiddelomslutning. Med SUVer ble det observert en mindre økning i omslutningseffektivitet med enten CL eller PG eller PS. Omslutningseffektivitet var også relativt dårlig når mettede fosfolipider (DPPG alene eller med DPPC) ble benyttet istedenfor de mer umettede egg-lipidene, og i de hovedsakelig meget små SUV(F)-liposomene. Dataene i tabellene III og IV sett sammen, antyder at den optimale 1 iposomsammensetningen for oppnåelse av både høy omslutningseffektivitet og god legemiddelretensjon in vitro (i serumplasma), inneholder mellom 10 og 40 mol-% negativt ladet fosfolipid, spesielt PG, men unntatt kardiolipin (CL); mellom 20 og 50 mol-% kolesterol; og minst ca. 40 mol-% av et naturlig fosfolipid, slik som PC. Innen dette området av 1 Ipidkomponenter kan graden av acylkjedemetning og -kjedelengde varieres for oppnåelse av de ønskede legemiddel- frigjøringsegenskapene in vivo, skjønt det ville være forventet at et preparat inneholdende en høy prosentandel av mettede lipider ville ha en redusert legemiddel-omslutningseffektivitet.

En annen viktig betraktning ved valget av lipidkomponenter er toksisiteten til legemiddel/1iposom-preparatet som fremstilles. Siden det oppløselige legemidlet generelt er mer toksisk enn liposom-omsluttet legemiddel, er det ønskelig at liposomene har både god omslutningseffektivitet og god legemiddelretensjon in vivo. Lipidsammensetningsfaktorene som bevirker 1egemiddelretensjon og -omslutning er omtalt ovenfor. I tillegg kan lipidenes acylkjedesammensetning gi toksisitetsef f ekter som er urelatert til mengden av legemiddel som er tilstede i liposomene. Forsøk utført til støtte for foreliggende oppfinnelse for å bestemme toksisiteten til tomme liposomer (ikke inneholdende omsluttet legemiddel) på laboratoriedyr ga følgende resultater: (1) Liposomer bestående hovedsakelig av mettede lipider, slik som DPPG og DPPC, var mer toksiske enn liposomer dannet fra tilsvarende umettede fosfolipider. (2) Selv om umettede lipider er mindre toksiske, er de også mye mer mottagelige for lipid-peroksyda-sjonsskade ved lagring, og liposomer med vesentlig lipidoksydasjonsskade er betydelig mer toksiske, uttrykt i LD50-verdier, enn tilsvarende friske liposomer. Det ville også være forventet at lipidoksydasjonsskade ville øke toksisiteten til et legemiddel/liposom-preparat gjennom nedsatt legemiddelretensjon. Som det vil fremgå, innebærer et viktig aspekt ved oppfinnelsen nedsettelse av peroksydativ skade på lipid- og legemiddelkomponenter i et antrakinon/1iposom-preparat ved en kombinasjon av beskyttende midler, og derfor er de umettede lipiders mottagelighet for oksydativ skade av mindre interesse. Dvs., foreliggende preparat bidrar til redusert toksisitet delvis ved å tillate bruken av umettede lipider, som både er mindre toksiske og viser større legemiddel-omslutning, uten samtidig lipidperoksydativ skade, som ville forøke toksisitetseffektene.

Bi of or del ing og liposom-målretting kan påvirkes av liposom-størrelse, overflateladning og tilstedeværelsen av spesifikke over f 1 atebundede molekyler som virker slik at de målretter liposomene til spesifikke steder i legemet. Av spesiell interesse for foreliggende oppfinnelses vellykkethet er den forøkede akkumulering av 1 egemi ddel /1 iposomer i visse målorganer, slik som lever og milt, og den reduserte akkumulering i Ikke-målorganer slik som nyre og hjerte, hvor legemiddel toksisitet er sterkt lokalisert. Ifølge et trekk ved foreliggende oppfinnelse oppnås optimal blofordeling i et valgt størrelsesområde av liposomer, som omtalt nedenfor under henvisning til liposom-graderlng.

C. Beskyttende midler

Samvirke for et antrakinon-legemiddel med ferrijern i nærvær av lipid, og den kjemiske modifikasjon av legemidlet som kan inntreffe in vitro har blitt beskrevet i del A. Som der angitt, forekom legemiddel-modifikasjonsreaksjonen under anoksiske betingelser, og kun i nærvær av mettede lipider. I del B fremgår det at, av en rekke grunner, er naturlige fosfolipider (inneholdende både mettede og umettede fosfolipider) generelt fordelaktige i legemiddel/lipidpreparater ifølge oppfinnelsen. Videre er det rimelig å forvente at fremstillingen og håndteringen av preparatet vil innebære en viss eksponering for molekylært oksygen slik at oksydative reaksjoner og friradikal-reaksjoner vil innebære umettede lipider og oksygen kan også forventes å gi lipid- og legemiddel-modifikasjoner i preparatet. Denne delen, del C, undersøker den oksydative mekanismen og friradikal-mekanismen som kan lede til en slik legemiddel- og lipid-modifikasjon og demonstrerer hvordan slike modif ikasj onsreaksj oner i stor grad kan reguleres ved innbefatning i preparatet av en kombinasjon av lipofilt og vannoppløselig beskyttende middel som virker ved forskjellige punkter i peroksydasjon/- friradlkal-baner.

Et skjema som viser sannsynlige oksydative og friradikal-reaksjoner i et preparat inneholdende et antrakinon-legemiddel, lipid og ferrijern, er angitt i figur 3. Her, som i del A, er 1iposom/antrakinon-preparatet indikert ved Lip/AnQ; acylk j ede-1 ipidkomponentene som danner liposomene kan være mettede, umettede eller en blanding av begge deler. Den øvre venstre delen av figuren viser dannelse av Lip/AnQ-Fe(III)-komplekset, beskrevet 1 del A. I nærvær eller fravær av oksygen og enten eller umettet lipid, er det sannsynlig at de forhold som leder til legemiddel-modifikasj on innebærer, først, mulig dannelse av et semi-kinon-Fe( II )-kompleks, og inter- eller lntramolekylær friradikal-skade på legemidlet. Siden det modifiserte legemidlet (DXR) er betydelig mer hydrofobt enn det opprinnelige molekylet, er det mulig at modifikasjon innebærer spalting av den hydrofile amino-glykosid-resten fra antracenringen. Reaksjonen kan også innebære elektronoverførIng fra semi-kinonmaterialet til andre funksjonali teter i ringstrukturen, spesielt til hydrokinongruppene, hvilket virker slik at radikalet på antracenringen delokaliseres. Omdannelsen av AnQ-Fe(III)-komplekset til modifisert legemiddel er vist til venstre i f iguren.

Som også vist i figuren, kan AnQ-Fe(II)-komplekset kombinere med molekylært oksygen, hvilket leder til hydrogenperoksyd-dannelse, og til slutt hydroksylradikaler som deretter kan bevirker friradikal-reaksjoner. Denne oksygen-formidlede bane er foreslått ved tidligere studier på de mulige mekanismene til DXR-stimulert membranskade in vivo, hvor innledende semi-kinondannelse kan inntreffe ved enzym-katalysert elektron-overførlng (Goormaghtigh 1984), og in vitro, hvor direkte oksygendeltagelse var involvert (Gutteridge 1984a).

Når liposomene inneholder et umettet lipid (UL), kan en separat bane som innebærer oksydasjon og friradikalskade også være involvert, som illustrert til høyre i figur 3. Innledende reaksjon av lipidet med molekylært oksygen leder til et oksygenert element som kan kompieksdanne med ferrijern, som angitt. Lipidkomplekset kan etter å ha gjennomgått en redoks-reaks j on for dannelse av et j ern/1 ipid-radikal-kompleks, danne både peroksyd- og oksyd-lipidradikaler som igjen kan propagere friradikal-reaksjoner i lipid- og legemiddelkomponentene i preparatet og lede til legemiddel-og lipidmodifikasjoner, som angitt. Denne bane som innebærer lipidoksydas j on og f riradikal-propagering er foreslått ved studier av mekanismen for peroksydativ skade i liposomale membraner (se f.eks. Gutteridge 1984b og Sunamoto).

Hittil har forsøk på å begrense peroksydativ skade i liposomer vært fokusert på fr i radikal-rensing, typisk ved innbefatning i liposomene av et lipofilt, friradikalt rensemiddel slik som a-T. I teorien har slike friradikal-rensemidler evne til å blokkere friradikal-propagering i lipider og 1ipid-tilknyttede legemidler slik som antrakinoner, og derfor å begrense peroksydasjon-relativ skade til den oppnådd ved tidligere radikaldannelsesreaksoner. Ved å anta at de radikaldannende hendelser er relativt milde sammenlignet med f r iradikal-propagering, ville det være forventet at liten ytterligere beskyttelse utover det som gis av a-T kunne oppnås. Et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er derfor den oppdagelse at betydlig større reduksjon i lipid- og legemiddelmodlfikasjon i et antrakinon/liposom-preparat kan oppnås ved en kombinasjon av lipofilisk friradikal-undertrykker og et vannoppløselig beskyttende middel som virker ved nivået for friradikal-dannelse.

Det lipofile friradikal-rensemidlet som benyttes i foreliggende preparat er fortrinnsvis a-T, eller en farmakologisk akseptabel analog eller ester derav, slik som a-T-succinat. Andre egnede friradikal-rensemidler omfatter butylert hydroksytoluen (BHT), propylgallat (Augustin), og deres farmasøytisk akseptable salter og analoger. Ytterligere lipofile friradikal-undertrykkere som er akseptable for parenteral administrasjon I mennesker, ved et effektivt nivå i liposomer, kan også benyttes. Fr i radikal -undertrykkeren blir typisk innbefattet i de lipidkomponenter som benyttes ved fremstilling av liposomene, ifølge konvensjonelle metoder. Foretrukne konsentrasjoner av den beskyttende forbindelsen er mellom ca. 0,2 og 2 mol-% av de totale lipidkomponentene som utgjør liposomene; høyere nivåer av forbindelsen, spesielt a-T eller dens succinatanalog, er imidlertid forenelige med liposomstabilitet og er farmakologisk akseptable.

Det vannoppløselige beskyttende midlet er et jern-spesifikt chelateringsmiddel valgt fra klassen bestående av naturlige og syntetiske trihydroksamsyrer og er kjennetegnet ved en meget høy bindingskonstant for ferrijern (av størrelsesorden IO<30>) og en relativt lav bindingskonstant for toverdige kationer slik som kalsium og magnesium. En rekke forskjellige trihydroksamsyrer av naturlig opprinnelse har blitt beskrevet, inkludert forbindelser i ferrikrom-klassen slik som ferrikrom, ferrikrom A, og albomycin; forbindelser i ferrioksamin-klassen inkludert ferrioksaminer og ferrimyciner; og forbindelser i fusaramin-klassen. Stukturen og jern-koordina-s j onsegenskapene til disse forbindelsene har blitt omtalt (Emery).

Et foretrukket chelateringsmiddel er ferrioksamin B, også kjent i varierende grad som ferrioksamin, deferoksamin, desferrioksamin B og Desferal. Denne forbindelsen viser eksepsjonell j ernb indingsaf f initet og har vist seg å være sikker for parenteral bruk i mennesker ved behandling av jern-lagringssykdom og jern-forgifting (Keberle). Strukturen til jern-koordinert deferoksamin er vist i figur 4. Som det fremgår her har forbindelsen tre hydroksamsyregrupper

(-C(O)N(O)-) som kan ordnes oktaedrisk om det chelarte jernet, til dannelse av seks symmetriske Fe-oksygen-ligand-bindinger. Bindingskonstantene til ferrioksamin for jern og flere toverdige metaller, inkludert Fe<2+>, er gitt i tabell V.

Chelateringsmidlet er tilstede i preparatet i en konsentrasjon som er i molart overskudd i forhold til ferrijernet i 1iposomsuspensjonen. Vandige media benyttet ved liposomfremstilling inneholder typisk minst ca. 1-2 pm ferrijern og kan inneholde opptil 100 pm mer ferrijern. For vandig medium inneholdende opptil ca. 20 pm jern, er konsentrasjoner av chelateringsmiddel på ca. 50 pm foretrukket.

Chelateringsmidlet blir fortrinnsvis tilsatt til vesikkel-dannende lipider ved tidspunktet for liposomdannelse, slik at lipidene er beskyttet mot legemiddelunderstøttet lipidoksydasjonsskade under liposomfremstilling. Metoder for fremstilling av liposomer ved tilsetning av en vandig oppløsning av chelateringsmiddel er beskrevet nedenfor. Det skal her bare bemerkes at 1iposomsuspensjonen dannet ved denne metoden inneholder chelateringsmiddel både i den vandige massefasen og i den innkapslede formen, dvs. innen det vandige interne 1 iposomområdet. Chelateringsmidlet kan alternativt innbefattes i suspensjonen etter liposomdannelse.

Forsøk utført til støtte for foreliggende oppfinnelse har undersøkt beskyttelsesgraden for lipid- og legemiddel-kdmponenter i et preparat som inneholder både a-T og ferrioksamin. I et studium ble liposomer inneholden DXR og a-T fremstilt vesentlig som i eksempel I, enten i nærvær eller fravær av 50 pm ferrioksamin. Legemiddel/liposom-preparatene ble deretter lagret under anoksiske betingelser i 1 dag ved 4°C, og lipidene ble ekstrahert konvensjonelt med kloroform/- metanol. De ekstraherte lipidene ble oppløst i heptan og UV-spektrene ( 190-300 nm) ble overvåket med et dobbeltstråle-spektrofotometer. Figur 5 viser spektrene oppnådd for lipider inkubert i nærvær (spektrum A) eller fravær (spektrum B) av chelateringsmiddel. Spekteret i figur 5B viser sterke topper ved ca. 233 nm, tilsvarende konjugert diendannelse og ved ca.

275, tilsvarende konjugert triendannelse. Spekteret vist med heltrukken linje i figur 5A viser små eller Ingen tegn på

dien- eller triendannelse, og spektral subtraksjon viser at dien- og triendannelse ble inhibert mer enn ca. 99% i det ferrioksaminholdige preparatet.

I et annet studium ble DXR/liposomer fremstilt vesentlig som beskrevet i eksempel I under nitrogen eller luft, og i nærvær eller fravær av a-T og ferrioksamin, som angitt i nedenstående tabell VI. Som i forsøket beskrevet ovenfor, besto liposomene av PG:PC:kolesterol, i et molforhold på 3:7:4. cx-T

var, når det ble benyttet, tilstede i en konsentrasjon på ca.

1,5 mol-% og ferrioksamin var, når det ble benyttet, tilstede i en konsentrasjon på 50 pm. Liposomene ble lagret tinder anoksiske betingelser i en dag ved 4°C, som ovenfor. Kjemisk modifikasjon av legemidlet ble detektert både ved fluorescens-emisjonsspektroskopi og ved analyse av endringen i legemiddel mot et mer lipofilt materiale, som beskrevet i del A ovenfor.

Høyre kolonne i tabell VI viser 590/560 nm fluorescens-intensitetsforholdene til det hydrofobe derivatet av DXR for de fem preparatene. Dataene indikerer to typer av legemiddel-modif ikasjon, som omtalt ovenfor: (1) mulig spalting av sukkerdelen til dannelse av et mer hydrofobt DXR-produkt, og (2) skade på antracenringen, hvilket påvirker 590/560-forholdet til legemidlet. Som angitt I del A, er 590/560-forholdet størst i umodifisert DXR, og avtar med antracen-ring-modifIkasjon. De observerte forholdene viser at a-T alene og ferrioksamin alene begge ga moderate beskyttelser mot legemiddelmodlfikasjon, idet ferrioksamin har en større beskyttende effekt. Av betydning er at kombinasjonen av cx-T og ferrioksamin ga meget større beskyttelse enn hvert beskyttende middel alene, eller enn det som ville kunne forutsies fra en sum av de to individuelle middeleffektene. Den observerte verdien 1,9 var vesentlig den samme som den observert umiddelbart etter 1iposomfremstilling under nitrogen, hvilket indikerer nesten fullstendig beskyttelse av legemidlet gjennom lagringsperioden.

De ovenfor omtalte studier antyder at den beskyttende mekanismen til ferrioksamin er kvalitativt forskjellig fra den til a-T. Det er sannsynlig at ferrioksamin primært virker til å inhibere peroksydutvikling og annen "tidlig" fr i radikal-utvikl ing, mens a-T virker til å undertrykke fr i radikal-reaksjoner som propageres i lipid-bilaget. De sannsynlige punktene for inhibering med trihydrokamsyre-chelateringsmiddel er angitt med doble linjer i figur 3.

Den inhiberende effekten til trihydroksamsyre-chelatering på peroksydas j onsskade i liposomer står også i motsetning til den peroksydasjons-stimulerende effekten som observeres når et konvensjonelt chelateringsmiddel av tetraeddiksyretypen, slik som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), tilsettes til liposomer. Den observerte forskjell mellom trihydroksamsyre-og tetraeddiksyre-chelateringsmidler, med hensyn til deres evne til å beskytte mot peroksydativ skade i liposomer kan skyldes forskjellen i antall jern-koordinasjonssteder som er tilgjengelige i de to materialene. Mens et trihydroksamsyre-chelateringsmiddel er i stand til å danne oktaedrisk-ligand-binding til alle seks ferrijern-koordinasjonsstedene, er tetraeddiksyre-chelateringsmidler begrenset til fire-steds-binding, og etterlater to jern-koordinasjonssteder tilgjengelige for deltagelse i redoks-reaks j oner. I dette henseende bemerkes det at DTPA, et pentaeddiksyre-chelateringsmiddel, også viser en beskyttende effekt på antrakinon-modifikasjon in vitro, i nærvær av lipider og ferrijern, hvilket foreslår at f em-stedskoordinas j on også kan være effektiv når det gjelder å redusere jerndeltagelse i redoks-reaksjoner.

D. Liposom- fremstilling

Fremgangsmåter for fremstilling av legemiddelholdige liposom-suspensjoner følger generelt konvensjonelle liposom-frem-stillingsmetoder slik som de som er omtalt av Szoka et al. I en foretrukken fremgangsmåte blir vesikkel-dannende lipider opptatt I et egnet organisk oppløsningsmiddel eller opp-løsnlngsmiddelsystem, og tørket i vakuum eller under en inert gass til en lipidfilm. Legemidlet blir fortrinnsvis innbefattet i lipidene som danner filmen. Konsentrasjonen av legemiddel i 1 ipidoppløsningen er fortrinnsvis i molar-overskudd i forhold til den sluttelige maksimale konsentrasjon av legemiddel i liposomene, for dannelse av maksimal 1egemiddel-omslutning i liposomene. Ved fremstilling av liposom/DXR-preparatet beskrevet i eksempel I, ble en film av lipider hydratisert med en vandig suspensjon av DXR ved en sluttelig legemiddel-til-fosfolipid-konsentrasjon på ca. 2:10. Dette ga vesikler med en DXR-konsentrasjon, etter fjerning av fritt DXR, på ca. 10 mol-%.

Det vandige medium benyttet ved hydratisering av det tørkede lipidet eller lipid/legemidlet er et fysiologisk forenelig medium og fortrinnsvis pyrogenfritt fysiologisk saltvann slik som benyttet for parenteral væskeerstatning. Oppløsningen blandes med en steril oppløsning av chelateringsmiddel til en sluttelig ønsket chelateringsmiddel-konsentrasjon, tilsettes til filmen, og lipidene får hydratisere under hurtige (med rysting) eller langsomme (uten rysting) betingelser. Lipidene hydratiserer til dannelse av en suspensjon av multilamellære vesikler (MLVer) hvis størrelser typisk varierer mellom ca. 0,5 pm og 10 pm eller større. Generelt kan størrelses-fordelingen til MLVer i den ovenfor angitte metode forskyves mot mindre størrelser ved å hydratisere lipidfilmen raskere, med rysting. Liposomene inneholder innkapslet chelaterings middel ved en konsentrasjon som er omtrentlig lik den vandige massef asekonsentrasj onen.

E. Liposom- gradering

Liposomsuspensj onen kan størrelsesgraderes for oppnåelse av en selektiv størrelsesfordeling av vesikler i et størrelses-område mindre enn ca. 1 pm og fortrinnsvis mellom ca. 0,05 og 0,5 pm, og mest foretrukket mellom ca. 0,05 og 0,25 pm. Størrelsesgraderingen tjener til å eliminere større liposomer og til å gi et definert størrelsesområde som har optimale farmakokinetiske egenskaper.

Flere teknikker er tilgjengelige for redusering av størrel-sene og størrelsesheterogeniteten til liposomer. Sonikering av en liposom suspensjon enten ved bad- eller probe-sonikering gir en progressiv størrelsesreduksjon ned til mindre uni 1 amel lære veksikler (SUVer) mindre enn ca. 0,05 pm i størrelse. En sonikeringsmetode benyttet ved redusering av 1iposomstørrelser til ca. 0,2 pm eller mindre er beskrevet i eksempel I. Homogenisering er en annen metode som baserer seg på skjærenergi for å fragmentere større liposomer til mindre. I en typisk homogeniseringsmetode blir MLVer resirkulert gjennom en standard emulsjonshomogenisator inntil valgte 1iposomstørrelser , typisk mellom ca. 0,1 og 0,5 pm er observert. I begge metoder kan partikkelstørrelsesfordelingen overvåkes ved konvensjonell laserstråle-partikkelstørrelses-skj eining.

Ekstrudering av liposomer gjennom en polykarbonatmembran med små porer er en effektiv metode for redusering av liposom-størrelser ned til en relativt veldefinert størrelses-fordeling hvis gjennomsnitt er i området mellom ca. 0,1 og 1 pm, avhengig av membranens porestørrelse. Suspensjonen blir typisk sirkulert gjennom membranen flere ganger inntil den ønskede liposomstørrelsesfordelingen er oppnådd. Liposomene kan ekstruderes gjennom membraner med suksessivt mindre porestørrelser for oppnåelse av en gradvis reduksjon i liposomstørrelse.

Sentrifugering og molekylarsiktkromatografi er andre metoder som er tilgjengelige for frembringelse av en llposomsuspen-sjon med partikkel størrelser under en valgt terskelverdi mindre enn 1 pm: Disse to metodene innebærer begge selektiv fjerning av større liposomer, istedenfor omdannelse av større partikler til mindre. Liposomutbytter blir tilsvarende redusert.

Studier som tar sikte på bestemmelse av biofordelingen og legemiddel-"clearance" for DXR/liposomer som en funksjon av liposomstørrelse har blitt utført og rapportert tidligere (Gabizon 1982, 1983). Mer nylige studier utført i forbindelse med foreliggende oppfinnelse har sett på organfordeling for DXR 1, 5 og 24 timer etter administrasjon av DXR enten i fri form eller i liposomer som har medianstørrelser på 35±14 nm eller 115±25 nm. Resultatene av studiet er gitt i tabell VII, hvor data på hvert tidspunkt representerer et gjennomsnitt for tre dyr. Organvektene, gitt i parentes, er også beregnet som et gjennomsnitt for tre dyr.

Dataene i tabell VII viser at liposomer, og spesielt 115 nm liposomene, viser økede legemiddelnivåer i leveren og milten og nedsatte legemiddelnivåer i hjerte, lunge, tarm, nyre og sk j elettmuskler , sammenlignet med det frie legemidlet. Liposomene er således spesielt fordelaktige ved behandling av lever- og mi ltlokaliserte tumorer og for redusering av toksisitet relatert til legemiddelnivåer i ikke-målvev, spesielt hjerte. En annen viktig fordel med 115 nm liposomene som ses fra dataene, er langsommere legemiddel-"clearance" 1 lever- og miltvev. Nevnte legemlddel-"clearance" i dyr som mottok de mindre (35 nm) liposomene fulgt nærmere den til det frie legemidlet. Den forbedrede biofordeling og lengre "clearance"-tider observert med 115 nm-vesiklene observeres i 1 iposomstørrelsesområdet ned til ca. 0,05 pm. Under dette området begynner 1 egemiddelfordel ingen og "clearance"-egenskapene å nærme seg de for det frie legemidlet, slik det fremgår. Det er også blitt funnet at legemiddel-ladnings-faktoren (mengde av legemiddel/liposomlipid) er relativt lav i SUVer antageligvis på grunn av den spente konfigurasjonen til SUV-bilag, og på grunn av at SUVer er mindre stabile i plasma enn liposomer av større størrelse.

For en rekke forskjellige grunner er den optimale øvre stør rel sesgr ense for liposomene ca. 0,5 pm og fortrinnsvis ca. 0,25 pm. For det første er de ønskede målvev-områdene, slik som lever-sinusoider og parenkym, milt og benmarg, mer tilgjengelige for liposomer mindre enn ca. 0,25 pm. For det annet kan liposomer i 0,25 pm-størrelsesområdet lett sterili-seres ved filtrering gjennom et dypdefilter. Mindre vesikler viser også mindre tendens til å aggregere ved lagring, hvilket derved reduserer et potensielt alvorlig problem når preparatet administreres parenteralt. Sluttelig viser liposomer som har blitt størrelsesgradert ned til sub-pm-området mer ensartet biofordeling og legemiddel-"clearance'*-egenskaper fordi de har mer ensartede størrelser.

F. Fjerning av fritt legemiddel

Fritt legemiddel, dvs. legemiddel som er tilstede i den vandige massefasen i mediet, blir fortrinnsvis fjernet for å øke forholdet for liposom-omsluttet legemiddel til fritt legemiddel. Dette er særlig nyttig dersom liposomene har blitt fremstilt under betingelser med overskudd legemiddel for å maksimere legemiddel/lipid-forhold i liposomene. Under fremstillingsbetingelsene beskrevet i eksempel I f.eks., inneholdt liposomene mellom ca. 50 og 60% av det totale DXR tilsatt innledningsvis, hvilket betyr 40-50% fritt DXR. Legemiddelfjerningen er beregnet for å redusere den sluttelige konsentrasjon av fritt legemiddel til mindre enn ca. 20% og fortrinnsvis mindre enn ca. 10% av det totale legemiddel som er tilstede i preparatet.

Flere metoder er tilgjengelige for fjerning av fritt antrakinon-legemiddel fra en 1 iposomsuspens jon. Som angitt ovenfor kan den størrelsesgraderte 1iposomsuspensjonen pelletiseres ved high-speed-sentrifugering, hvilket etterlater fritt legemiddel og meget små liposomer i superna-tanten. Alternativt kan gelfiltrering anvendes for å separere større 1 iposompartikler fra molekyler av oppløst materiale (fritt legemiddel). Det er naturligvis nødvendig å inkludere chelateringsmidlet i elueringsbufferen eller å tilsette chelateringsmiddel til de eluerte liposomene, fordi selve gelmatrisen vil fjerne chelateringsmidlet fra den opprinnelige suspensjonen.

En foretrukken metode for fjerning av fritt legemiddel benytter en ioneutvekslingsharpiks som er i stand til å binde legemiddel i fri, men ikke i liposombundet, form. Med DXR er den foretrukne harpiksen en kationutveksler fordi legemidlet er positivt ladet ved nøytral pH. En fordel ved ioneutveks-lingsmetoden er at fritt legemiddel kan fjernes under légemiddeladministrasjon idet legemiddelpreparatet strømmer fra en beholder til injeksjonsstedet. Dette systemet har den fordel at vesentlig alt fritt legemiddel kan fjernes fra suspensjonen, og liposomene administreres før legemiddellekkasje fra liposomet til den vandige massefasen inntreffer. Systemet kan også være effektivt når det gjelder fjerning av frie pyrogener med riktig valg av harpiks(er).

II. Terapeutiske anvendelser ved tumorbehandling

Foretatte studier, omtalt ovenfor, har vist at små, lege-middelbærende liposomer kan konsentrere liposom-tilknyttet legemiddel i vevsområder, slik som lever-sinusoider og parenkym, milt og benvev som er tilgjengelig for små liposomer (mindre enn ca. 0,2 pm i størrelse). Disse funn har riktige implikasjoner for behandling av metastatiske sykdommer i leveren, primære hepatomer, lymfoid-proliferative sykdommer og leukemier, hvilke alle er hovedkrefttyper, både hva angår antall og geografisk fordeling.

Et av de mest effektive ant i-tumorlegemidlene og et legemiddel som velges i mange tilfeller, er DXR, en beslektet antracyklinglykosidforbindelse, eller mitoxantron. For disse antrakinon-1 egemidlene er utfordringen for forbedret anti-tumorterapi å nedsette toksisiteten og bivirkningene til det terapeutiske 1 iposompreparatet uten å forringe legemidlets terapeutiske effekt. Med hensyn til DXR, som har en meget spesifikk toksisitet for hjertemuskelen, har man vist at et DXR/1 iposom-preparat formulert på riktig måte, i betydelig grad kan nedsette opptaket av legemiddel av hjertemuskelen og redusere alvorligheten av histopatologiske endringer i mus behandlet med lignende doser fritt DXR.

En annen kilde for toksisitet er oksydativ skade på lipid- og legemiddelkomponentene i 1iposompreparatet. Som vist i del I fremmer antrakinon-legemidler aktivt peroksydative reaksjoner i nærvær av lipider, hvilket leder til betydelig modifikasjon av både lipid- og legemiddelkomponenter i legemiddel/liposompreparatet. Det modifiserte preparatet er mer toksisk på grunn av den peroksydative skaden til lipidene og forøket legemiddellekkasje, og selve legemidlet kan tap terapeutisk effektivitet med modifikasjon.

Toksisiteten og den terapeutiske effektiviteten til et DXR/liposom-preparat (L-DXR) fremstilt ifølge oppfinnelsen er undersøkt i eksempler II-V. Eksempel II viser at betydelig høyere doser av DXR i liposomal form kan administreres uten dødelighet. Resultatene er oppsummert i figur 7. Eksempel III, som ser på effektene av gjentatt administrasjon av graderte doser av fritt legemiddel (F-DXR) og L-DXR, finner betydelig reduksjon i (a.) dødelighet, (b) tap av legemsvekt, (c) endringer i blodkolesterol og triglyseridnivåer og (d) organpatologi når L-DXR-behandling er sammenlignet med F-DXR.

Kliniske forsøk som benytter L-DXR for å behandle pasienter som lider av forskjellige typer kreft, inkludert metastatisk og primær leverkreft, har blitt utført. Innledende kliniske forsøk er rapportert i eksempel IV. Funnene der indikerer en betydelig forbedring i total pas lentcomfort, på grunn av signifikant reduksjon i forekomsten av mage/tarm-toksisitet (kvalme, oppkast, diaré og stomatitis).

Omfattende kliniske forsøk for å undersøke legemiddeltoksisitet og bivirkninger med terapeutisk effektive doser av L-DXR er rapportert i eksempel V. Disse studiene viser signifikant redusert hyppighet av kvalme og oppkast, fra f r itt-legemlddelnivåer fra ca. 20-55% til ca. 6%, og en betydelig reduksjon i hyppigheten av total og delvis alopesi, fra rapportert fritt-legemiddelnivå fra ca. 85-100% til ca. 46%. Dosene av L-DXR som ble administrert i forsøkene var sammenlignbare med f r i tt-legemiddeldoser benyttet i kreft-kjemoterapi hos mennesker. Oppfinnelsen tilveiebringer således en metode for betydelig redusering av hyppigheten kvalme og alopesi som er forbundet med intravenøs administrasjon av doksorubicin til mennesker, i bolus-injeksjonsform. Metoden innbefatter omslutnlng av doksorubicin i liposomer og administrasjon av liposomene intravenøst ved hurtigdrypp-injeksjon i en terapeutisk effektiv mengde. Den her benyttede betegnelse "hurtigdrypp" er ment å innbefatte intravenøs eller intra-arterlal administrasjon i bolus form eller i dråpeform som krever mellom flere minutter opptil noen timer for innføring av en terapeutisk effektiv dose av L-DXR-preparatet.

Farmakokinetiske studier utført til støtte for foreliggende oppfinnelse antyder at liposomal avgivelse av DXR følger et langsomt frigjøringsmønster. Typisk frigjøringskinetikk for DXR administrert i fri (heltrukne linjer) og liposomal (stiplede linjer) form er vist i figur 9. Dataene ble oppnådd ved analyse av plasmaprøver fra pasienter i de omfattende kliniske forsøkene (eksempel 5). Legemiddel-konsentrasjons-kurvene vist på figuren ble analysert ved best-tllpasning til en bi-eksponensialkurve, beskrevet ved en hurtig fordelings- fase og en langsommere terminalfase. Som det fremgår har både fri og liposomal DXR omtrent den samme halveringstiden gjennom f or del ingsf asen, beregnet til å være ca. 10-15 minutter. I terminalfasen er imidlertid halveringstiden for det frie legemidlet ca. 25 timer, mens den for liposomalt legemiddel er ca. 67 timer (midlet av seks studier). Fra disse data vil det forstås at det liposomale preparatet er effektivt når det gjelder å gi en regulert langsom frigjøring av legemiddel i blodstrømmen.

De kliniske forsøk rapportert i eksempel V viser også at metoden ifølge oppfinnelsen for administrasjon av DXR i liposomal form er terapeutisk effektiv mot både primære og sekundære neoplasmer i leveren. Terapeutiske reaksjoner i omtrent halvparten av pasientene med primære eller sekundære neoplasmer i leveren ble observert, både når L-DXR ble administrert intravenøst eller intra-arterielt. Alle pasientene i forsøkene var eller hadde blitt motstandsdyktige mot andre behandlingsmodaliteter, inkludert i noen tilfeller administrasjon av fritt DXR intravenøst eller intra-arterielt. Oppfinnelsen innbefatter også en metode for behandling av primære og sekundære neoplasmer i leveren ved følgende trinn: (a) tilveiebringelse av en vandig suspensjon av liposomer hvis størrelser hovedsakelig er mellom ca. 0,05 og 0,25 pm, og som inneholder minst ca. 2,5 mol-% DXR eller en farmakologisk akseptabel analog, derivat, og (b) administrasjon av en farmakologisk akseptabel mengde av preparatet til pasienten via blodstrømmen.

Følgende eksempler illustrerer forskjellige fremgangsmåter og preparater ifølge oppfinnelsen.

Materialer

Adriamycin (doksorubicin HC1, inneholdende laktose) ble oppnådd fra Farmitalia (Milano, Italia); fosfoliplder (kromatografisk testet, over 99% renhet) fra Lipid Products (Surrey, England) eller Avanti Lipids (Birmingham, AL); kolesterol (kromatografisk testet, over 99% renhet); fysiologisk saltoppløsning, fra Baxter Travenol (Ashdod, Israel); ferrioksamin (Desferal), fra Ciba-Geigy (Basel, Sveits); og (a-T), fra Sigma Chemicals (St. Louis, Missouri).

Eksempel I

Fremstilling av liposom- omsluttet DXR ( L- DXR)

En oppløsning av vesikkel-dannende lipider inneholdt 360 mg kolesterol, 33 mg a-T, 1750 mg egg PC og 750 mg PG (egg, natrlumsalt) i 100 ml kloroform. Molforholdet for lipidkomponenter var PC: PG: kolesterol (7:3:4). Oppløsningen ble oppdelt, tilsatt til to 500 ml kolber med rund bunn og inndampet under vakuum i en rotasjonsfordamper. Videre fjerning av organiske oppløsningsmidler og tørking av filmen ble oppnådd ved lyofilisering i en lyofiliserlngsanordning ved et trykk på 150 mTorr.

Legemiddeloppløsnlngen inneholdt 300 mg DXR (6 ampuller inneholdende 50 mg doksorubicin HC1 og 250 mg laktose hver) oppløst i saltoppløsning (steril, pyrogenfri fysiologisk NaCl-oppløsning) inneholdende ferrioksamin (~50 jjM). Den sluttelige oppløsningen inneholdt DXR med 5 mg/ml og ferrioksamin ved 30 jjg/ml i et totalvolum på 60 ml. DXR-opp-løsningen ble tilsatt til kolber med rund bunn inneholdende lipidflimene (30 ml/kolbe). Dette innledende fosfolipid-til-DXR-molarforholdet var 10:2. Blandingen ble utsatt for virvelbevegelse, deretter likevektsinnstilt i en riste-anordning ved 100 slag/min. i 2 timer ved 15-20°C.

Den oppnådde multHamellære vesikkel (MLV)-dispersjonen ble sonikert ved ultralydbestråling under anvendelse av en 12,5 mm safir-bundet probe, med puls-sonikering i løpet av 15 minutter (60%, eller 9 minutters sonikeringstid) under optimale effektbetingelser. Sonikerlng ble utført under en strøm av nitrogen (eller argon) med beholderen neddykket i isvann. Sonikeringsmetoden ble standardisert ved å bestemme den optimale densiteten til dispersjonen ved en 380 nm bølgelengde. Spesifikt ble sonikeringen utført inntil en 1:100-fortynning av dispersjonen i saltoppløsning ga en O.D.-verdi på mindre enn 0,9. Dersom O.D.-verdien var større enn 0,9, ble sonikeringen fortsatt i ytterligere 3 minutter. 0 . D .-startverdiene for MLV-dispersjonene er i området 1300-1500. De sonikerte dispersjonene ble sentrifugert i en laboratoriesentrifuge (2000 omdr./min., 10 min.) for å fjerne store titanpartikler. Alternativt ble liposomene ekstrudert flere ganger gjennom polykarbonatmembran med porer på 0,2 pm inntil en O.D.-verdi mindre enn 0,9 ble oppnådd. Fritt legemiddel ble fjernet ved ultrasentrifugering. De størrelsesgraderte liposomene ble sterilisert ved filtrering gjennom et 0,2 pm polykarbonatfilter.

De steriliserte liposomene ble lagret i vakuumforseglede sterile glassflasker ved 4°C i mørket. De DXR-holdige liposomene (L-DXR) hadde følgende egenskaper: (a) Totalt DXR i liposomene var over 50% i den innledende mengde av legemiddel; (b) Fosf ol ipid-konsentras j on (bestemt ved tilstedeværende organisk fosfat) var 10-13 pmol/ml; (c) Mengden av fritt DXR (bestemt ved DXR/fosfolipid-molar-forhold før og etter passasje gjennom Sephadex G-50-kolonne) var mindre enn 5% av det totale DXR; (d) Størrelsesfordelingen var mellom 0,05 og 0,2 pm; (e) Lipidoksydasjon (bestemt ved en modifikasjon av metoden ifølge Klein) var mindre enn 1% av totalt fosfolipid, basert på den abnormale, spektrale absorbansen ved 233

nm, på grunn av dien-konjugasjon;

(f) Stabilitet i humanplasma (målt ved DXR-retensjon i DXRliposomer i 50% plasma ved 37°C i 1 time) var over 80%; (g) Liposomene var sterile, bestemt ved tilsetning (3-4 ml)

av 1iposomsuspensjonen til Bactec 7 ml-flasker (aerobe og

anaerobe mikrobiologiske kulturer) i 7 dager; og

(h) Kanin-pyrogenisitetstesten var negativ.

Liposomsuspensjonene var stabile i tre måneder ved kjøleskap-temperatur, uten betydelige endringer i noen av de ovenfor angitte egenskaper.

Eksempel II

Enkelln. 1 eks, 1 on- overlevelse med graderte doser av F- DXR og

L- DXR

L-DXR ble fremstilt som i eksempel I til DXR-sluttkonsentra-sjoner på 1, 1,5, 2 og 2,5 mg/ml med tilsvarende fosfolipid-konsentrasjoner på 16, 24, 32 og 40 jjmol/ml, respektivt, og kolesterolkonsentrasjoner på 6,4, 9,6, 12,8 og 16 pmol/ml, respektivt. Fritt DXR (F-DXR) ble fremstilt i steril, pyrogenfri , fysiologisk saltoppløsning til sluttkonsentra-sjoner på 1, 1,5, 2 og 2,5 mg/ml.

BALB / C-hannmus ble behandlet intravenøst med fire forskjellige doser av F-DXR og L-DXR: 10, 15, 20 og 25 mg/kg, ved administrasjon av ca. 1% av den totale dyrevekt av det tilsvarende F-DXR- eller L-DXR-preparat. Overlevelseskurven registrert i en periode på 90 dager er vist i figur 7. Som det fremgår er det en markert nedgang i toksisitet for legemidlet i den liposom-innkapslede formen. Ingen dødelighet ble registrert blant dyr behandlet med 15 og 10 mg/kg av L-DXR og 60% av musene injisert med 20 mg/kg overlevde i 90 dager. F.DXR forårsaket 100% dødelighet i gruppene injisert med 25, 20 og 15 mg/kg og 20% i gruppen som mottok 10 mg/kg.

Dødelighetsmønsteret var blandet for noen mus, spesielt de fra de høydose-behandlede gruppene, og døde i løpet av de to første ukene etter injeksjon (en måned i tilfellet for den 25 mg/kg L-DXR-behandlede gruppen), og andre mus døde med en betydelig forsinkelse på 6-7 uker eller mer etter legemiddeladministrasjon. Obduksjon av mus som døde i den akutte fasen viste sterk mage/tarm-toksisitet med hypersekresjon og di latasjon av tarmslyngene, mens i de mus som døde i den forsinkede fasen var de mest signifikante funn nedgang i legemsvekt og hypotrofi i bukorganene.

Eksempel III

Effekter av gjentatt administras. 1 on av graderte doser av F- DXR og L- DXR

L-DXR ble fremstilt som i eksempel I, til DXR-sluttkonsentra-sjoner på 0,5, 0,75 og 1,0 mg/ml, tilsvarende fosfolipid-konsentrasjoner på 8, 12 og 16 pmol/ml, respektivt, og kolesterol-konsentrasjoner på 3,2, 4,8 og 6,4 jjmol/ml, respektivt. Fritt DXR (F-DXR) ble fremstilt i steril, pyrogenfri, fysiologisk saltoppløsning til sluttkonsentra-sjoner på 0,5, 0,75 og 1 mg/ml.

Sabra-mus ble oppdelt i grupper på 15 mus. Tre forskjellige doser av hver av F-DXR eller L-DXR ble testet: 5, 7,5 og 10 mg/kg legemsvekt. Hvert dosenivå ble testet på 15 hannmus og 15 hunnmus. Behandling ble administrert som en bolus-injeksjon gjennom en halevene på dager 0, 14, 28, 42, 56, 70, 84 og 98 i forsøket. Injeksjonspulsskjemaet ble benyttet for det formål å oppnå høye kumulative doser, under forlengelse av den periode dyrene ble eksponert for legemidlet, og ved etterligning av den måte DXR vanligvis administreres på i klinisk praksis. I betraktning av toksisiteten observert etter enkel-injeksjon (eksempel IX), ble DXR administrert ved et maksimum på 10 mg/kg dosering slik at forekomsten av akutt toksisitet ville bli redusert eller være null. For å unngå den overlappende mye lo-undertrykkelse av suksessiv behandling, ble det gitt adgang for 14 dager mellom suksessive injeksjoner, basert på tidligere observasjoner at full regenerering av aktiviteten til myeoloide sentere i milten etter behandling med 10 mg/kg av DXR inntraff mellom 7 og 12 dager etter legemiddeladministrasjon.

I løpet av forsøket ble mus inspisert daglig og overlevelses-kurver ble opptegnet. Når det var mulig, ble mus obdusert og en begrenset prøve av organer avsendt for histopatologisk undersøkelse. Blodtellinger og legemsvekter ble kontrollert ukentlig. Blodtelllngene ble foretatt i en Coulter-analysator med en 20 pl prøve oppnådd fra de retro-orbitale blodsinuser. En tredjedel av musene i hver gruppe ble avlivet på dag 42 etter 3 injeksjoner. En annen tredjedel ble avlivet på dag 84 etter 6 injeksjoner. De gjenværende mus ble avlivet på dag 180, 82 dager etter den 8. og siste injeksjonen. Før avliv-ning ble musene tappet for blod under lett eterbedøvelse for oppnåelse av serum for de biokjemiske testene. Dyrene ble deretter dissekert og de fjernede organene ble etter veiing fiksert i Bouins oppløsning og bearbeidet for lysmikroskopisk undersøkelse med hematoksylin-eosin-fosformolybdensyre: lys grønn farge.

(a) Effekter ved overlevelse.

Overlevelseskurvene til hann- og hunnmus er vist i figurene 8 og 9. Signifikant dødelighet ble observert i alle gruppene infisert med fritt legemiddel. I motsetning til dette ble 100% overlevelse etter 180 dager funnet i gruppene injisert med den mellomliggende dosen (7,5 mg/kg) og lav dose (5 mg/kg) av L-DXR. Den høye dosen (10 mg/ml) av L-DXR forårsaket en vesentlig dødelighet, skjønt en mindre gruppe av dyrene overlevde en kumulativ dose av DXR på 80 mg/kg. Det var en liten tilbøyelighet til høyere toksisitet i hannmus sammenlignet med hunnmus med høye og mellomliggende doser av

F-DXR.

(b) Effekter på perifere blodtellinger.

Blodtellinger tatt 7 og 14 dager etter hver injeksjon viste mindre reduksjoner bare i tellingen av hvite celler. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de F-DXR- og L-DXR-behandlede gruppene. Hemoglobin-konsentrasjonen ble ikke særlig påvirket i løpet av forsøket.

(c) Effekter på kropps- og organvekter.

Tabell II viser effekten på kropps- og organvekter ved gjentatt administrasjon av F-DXR og L-DXR, ved et doserings-nivå på 10 mg/kg. Vektmålingene ble foretatt 42, 84 og 180 dager etter innledende legemiddelinjeksjon. Kropps- og organvektene er uttrykt i prosent i forhold til ubehandlede mus. Prosent overlevende ved hvert av de tre tidspunktene er angitt ved toppen i tabellen: strekene (-) indikerer ingen overlevende.

Når vektene av lever, milt, nyrer og hjerte i de forskjellige forsøksgruppene sammenlignes, er det tydelig at F-DXR forårsaket en vesentlig vektreduksjon som er merkbar etter 3 injeksjoner (dag 42) og 6 injeksjoner (dag 84). L-DXR-behandling forårsaket ingen signifikant nedgang i organvekter, unntatt hos hannmus på dag 180.

Ulik de akutte toksisitetsdødsfall observert med dyrene injisert med enkle høye doser av DXR (eksempel XI), var dødsfallene observert med multippel-injeksjoner generelt kjennetegnet ved en nedgang i kroppsvekt med forsvinning av bukfett og subkutant fett, organkrymping og mangel på mage/tarm-toksisitet. Desto lavere den mottatte dose var, desto mindre tydelig var reduksjonene i kropps- og organvekt for døde mus. Alle hann- og hunnmus som mottok multippel-doser ved 7,5 eller 5 mg/kg L-DXR overlevde til dag 180. Dyr som døde etter behandling med 7,5 og 5 mg/kg F-DXR viste ofte pleurale og peritoneale effusjoner, kardiomegali og lunge-kongestisjon. Et funn som bare ble notert hos mus behandlet med F-DXR, 10 mg/kg, var en markert svakhet i bena uforklart av de histopatologiske funn i skjelettmuskulaturen og som kunne relateres til en neuropatisk effekt.

d ) Effekter på blod- blokjemi- verdier

Blodnivåer av glukose, kolesterol, triglyserider, urea, urinsyre, kreatin og totalt protein ble målt ved 42, 84 og 180 dagtIdspunkter. Blodenzymnivåer av alkalisk fosfatase, aspartataminotransferase og alaninaminotransferase ble også analysert ved disse tidspunktene.

De viktigste forskjellene i blodkjemi mellom F-DXR- og L-DXR-administrasjon forekom i b1odglukose-, kolesterol- og triglyserid-nivåer. Disse forskjeller fremgår fra nedenstående tabell III som angir data for hunnmus som mottok 10 mg/kg av både F-DXR og L-DXR. Glukose-, kolesterol- og tr ig1yser idni våe r er uttrykt som prosent kontroll (ubehandlet)-dyr, og "nm" betyr "ikke målt".

Som det fremgår viser dyr behandlet med fritt legemiddel nedsatt blodglukose, hyperkolesterolemi og hyperglyseridemi. I motsetning til dette ble redusert blodglukose are sett ved 180 dager for L-DXR-behandling og forhøyede kolesterol- og triglyseridnivåer ble ikke observert selv ved 180 dager.

Selv om det ikke er vist i tabellen, ble det også notert at dyr som mottok lavere fritt-legemiddeldoseringer (7,5 og 5 mg/kg) viste forøkede kreatinnivåer ved 180 dager, hvilket indikerer alvorlig nyrefunksjonssvekkelse. Forøkede nivåer av kreatin ble ikke observert i L-DXR-behandlede mus, selv ved doser på 10 mg/kg.

Forøkede leverenzymer, alkalisk fosfatase og aminotrans-ferase, ble observert i dyr behandlet med enten F-DXR eller L-DXR, skjønt i begge forsøksgruppene oppsto et fall i alaninaminotransferase ved 180 dager.

(e) Effekter på vevpatologi.

De histopatologiske undersøkelsene viste redusert patologisk skade, spesielt i nyre, hjerte og eggstokker hos dyr som mottok L-DXR, sammenlignet med administrasjon av fritt legemiddel.

Eksempel IV

Kliniske forsøk med L- DXR

Åtte kreftpasienter ble behandlet med L-DXR-preparatet i eksempel III. Administrasjonen av legemidlet ble foretatt under anvendelse av en 120 ml "Voluset" ved en konsentrasjon på omkring 0,5 mg/ml i isotonlsk saltoppløsning og i en mengde på 2-3 ml pr. min. For intraarterielle injeksjoner ble peristaltiske pumper benyttet, idet infusjonshastigheten var~1,5 ml/min. To pasienter fikk det liposomale legemidlet levert intraarterielt i leveren uten noen bivirkninger. Dette ble foretatt ved å trekke fordel av tidligere implanterte pumper. Hos begge pasientene var perfusjonen av leveren med pumpen på forhånd undersøkt med en Tc-99-merket makroaggre-gert albumin-skanning.

Forbigående myeloundertrykking som påvirket tellingen av hvite blodlegemer ble observert i to pasienter: pasient #3 (tabell IV), etter å ha mottatt den tredje dosen (høyeste dose gitt, 100 mg DXR) og pasient #6 (forbehandlet med røntgenbestråling og med 5-fluoracil, og Mitomycin-C) etter 80 mg DXR. Det laveste punkt for pasient #3 var 1900 celler/- mm<5>og for pasient #6 2300 celler /mm3 .

Håravfall var signifikant hos bare 50% av pasientene. Feber relatert til administrasjonen av L-DXR fra pyrogenfrie porsjoner ble observert i to tilfeller. Temperaturstigningen ble forutgått av frysninger og nådde 39-40° C. Det inntraff flere timer etter behandlingen. I begge tilfeller ga den seg av seg selv. Med en av de to pasientene var feber et konstant trekk etter administrasjon av F-DXR. Ingen mage/tarm-toksi-sltet, hverken umiddelbart (kvalme, oppkast, diaré) eller forsinket (stomatitis) ble observert hos noen av pasientene. Elektrokardiografiske endringer ble ikke observert etter behandling. Ingen lokal smerte i injeksjonsstedet ble notert av noen pasient.

Hos en pasient som lider fra heptoma og tidligere har mislykket med flere forskjellige legemidler, inkludert DXR, bevirket 1-DXR injisert intraarterleit en signifikant krymping av levertumoren. Kumulative detaljer for de behandlede pasienter er angitt i nedenstående tabell X.

Eksempel V

Omfattende kliniske forsøk med L- DXR

19 kreftpasienter ble bedømt i ytterligere kliniske forsøk for å undersøke umiddelbar og forsinket reaksjon overfor enkelt- og multippel-dosebehandling med L-DXR under anvendelse av det samme L-DXR-preparatet som benyttet i eksempel

IV.

Kriteriene for pasientkval if ikasj on I studiet var: (a) fremherskende neoplastisk implikasjon av leveren og/eller det hematopoietiske rom; (b) mislykket konvensjonell terapi; (c) dersom pasienten tidligere har mottatt fritt DXR, ville den totale akkumulerte dose av F-DXR pluss L-DXR ikke overskride 550 mg/mm<2>av legemets overflateareal; (d) intet tegn på hjertesvikt, og normal venstre ventrikkel-ejeksjonfraksjon og (e) angitt samtykke. Pasientegenskapene er gitt i nedenstående tabell XI.

Et formål med studiet var å bedømme umiddelbar og forsinket toksisitet og bivirkninger ved terapeutisk effektive doseringsnivåer. Dosen pr. gang og det totale antall ganger pr. pasient benyttet i forsøkene er gitt i tabell XII nedenfor. Som det fremgår er dosenivåer av L-DXR så høye som 70 mg/m<2>legemsoverflateareal pr. administrert pasient. Den maksimale akkumulerte dose for en enkelt pasient var 210 mg/m2 . L-DXR-preparatet, som inneholdt mellom ca. 0,5 og 1 mg DXR/ml og mellom ca. 15 og 30 mg liposomfosfolipid/ml, ble administrert intravenøst ved hurtigdrypping (ca. 3 ml/min.). Flere administreringer ble foretatt hver tre uker.

A. Toksisitet og bivirkninger

Toksisiteten og bivirkninger observert i forsøkene er oppsummert i tabell XIII. Med hensyn til de umiddelbare effektene observeres det at kvalme og oppkast ble observert i 2 av i alt 32 behandl ingsganger (ca. 6%). Dette kan sammenlignes med en hyppighet for kvalme og oppkast på mellom ca. 21 og 55% når fri adriamycin administreres i bolusform, selv ved lave doser. Hyppigheten av hypotensjon og frysninger var også lav og ingen ECG-endringer og smerte ved injeksjonsstedet ble notert.

Ved betraktning av de forsinkede bivirkninger fremgår det at den signifikante alopesi forekom hos 6 av de 15 pasientene som ble studert. To av pasientene i denne gruppen mottok DXR-Injeksjoner på 30 mg/m<2>eller mindre, og er derfor ikke tellet med i studiet, fordi alopesi ikke alltid observeres når fritt DXR gis ved dette nivået. Den korrigerte hyppighet av alopesi er derfor 6/13 eller ca. 46%. Dette lar seg sammenligne med den rapporterte hyppighet for signifikant alopesi med fri adriamycin-dosering, som er mellom ca. 85 og 100%. Hyppigheten av benmarg-undertrykkelse er noe lavere enn rapportert for fritt legemiddel. Den akkumulerte behandlings-dose var ikke ved det nivået hvor kronisk kardiotoksisitet observeres, slik at sammenligninger med fritt legemiddel er ikke avgjørende.

B, Terapeutiske effekter

Pasientene med leverimplikasjon (primære eller sekundære lever-neoplasmer) ble ytterligere studert med henblikk på (a) endring i tumorstørrelse, som bestemt ved hjelp av bilder og (b) leverfunksjonstest og tumormarkører. Som angitt ovenfor hadde pasientene valgt for de kliniske forsøk ikke reagert eller hadde stoppet å reagere overfor konvensjonell terapi, inkludert i to tilfeller, administrasjon av fritt DXR. Blant de studerte pasientene viste to pasienter med primære levertumorer og en med en mykvev-sarkom som hadde metastatert til leveren, forbedring etter flere gangers behandling med L-DXR, slik det fremgår av tumorkrymping 25-50% og forbedring i leverfunksjon. To av disse pasientene hadde tidligere vist en viss reaksjon overfor fritt DXR, men hadde opphørt å reagere overfor det frie legemidlet før behandling med liposomal DXR. En fjerde pasient med primær leverneoplasma viste en stabil respons over L-DXR-administråsjon som vist ved en stabilisering av leverfunksjon og svak krymping (mindre enn 25%) av tumoren. Totalt viste halvparten av pasientene som var studert og hadde primære eller sekundære levertumorer, en viss forbedring selv om disse samme pasientene hadde vært motstandsdyktige overfor andre behandlingsmodaliteter.

En annen pasient som ikke er inkludert i toksisitetsstudiene hadde tidligere blitt behandlet med intra-arteriell injeksjon (i den hepatiske arterien) med fritt DXR, uten forbedring. Denne pasienten viste ved behandling med L-DXR administrert intra-arterielt en signifikant nedgang i tumorstørrelse hvilket indikerer at det liposomale preparatet er mer effektivt enn det frie legemidlet selv når det administreres direkte ved stedet.

Claims (20)

1. Antrakinon/liposom-preparat, karakterisert ved at det omfatter:

   liposomer inneholdende minst ca. 0,1 mol-% av et lipofilt friradikal-rensemiddel,

   omsluttet i lipid-bilagområdet i liposomene, et antrakinon-1 egemi ddel som har kinon- og hydrokinon-funksjonaliteter på tilstøtende antracenringer, og

   et trihydroksamsyre chelateringsmiddel ved en konsentrasjon i molart overskudd av ferri-jern i preparatet.
2. 2.

   Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at legemidlet er et antracyklinglykosid-antibiotikum.
3. 3.

   Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at legemidlet er doksorubicin, eller en farmasøytisk akseptabel analog, derivat eller salt derav.
4. 4.

   Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at friradikal-rensemidlet er cx-tokoferol eller en farmakologisk akseptabel analog, derivat eller ester derav.
5. 5.

   Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at trihydroksamsyre er ferrioksamin.
6. 6.

   Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at liposomene er i en vandig suspensjon og chelateringsmidlet er tilstede i vesentlig like konsentrasjoner inne i og på utsiden av liposomene.
7. 7.

   Preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at liposomene hovedsakelig har en størrelse mellom ca. 0,05 og 0,2 pm.
8. 8.

   Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at liposomene inneholder mellom ca. 20 og 50 mol-% kolesterol, mellom ca. 10 og 50 mol-% av et negativt ladet fosfolipid valgt fra gruppen bestående av fosfatidylglyserol,

   fosfatidylinositol og fosfatidylserin.
9. 9.

   Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at liposomene er i en vandig suspensjon og at legemidlet er tilstede i liposomene i en vesentlig mettende mengde.
10. 10.

    Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at det har blitt behandlet for å fjerne fritt legemiddel som ikke er forbundet med liposomene.
11. 11.

    Preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at liposomene er i lyofilisert form.
12. 12.

    Fremgangsmåte for behandling av en primær eller sekundær neoplasma i leveren, karakterisert ved at man tilveiebringer en vandig suspensjon av liposomer hvis størrelser hovedsakelig er mellom ca. 0,05 og 0,25 pm, og som inneholder minst ca. 2,5 mol-% doksorubicin eller en farmakologisk akseptabel analog, derivat, og

    administrerer en farmakologisk akseptabel mengde av preparatet til pasienten via blodstrømmen.
13. 13.

    Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at liposomene inneholder minst ca. 0,1 mol-% av et

    lipofilt f riradikal-rensemiddel; og at den vandige suspensjonen inneholder et trihydroksansyre-chelateringsmiddel som er tilstede i den vandige massefasen av suspensjonen i en konsentrasjon i molart overskudd over ferrijern i suspensjonen.
14. 14.

    Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at chelateringsmidlet er ferrioksamin eller en farmakologisk akseptabel analog eller salt derav.
15. 15.

    Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at liposomene tilveiebringes slik at de innbefatter mellom ca. 10 og 40 mol-% av et negativt ladet fosfolipid valgt fra gruppen bestående av fosfatidylglyserol ,

    fosfatidylinositol og fosfatidylserin.
16. 16.

    Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at liposomene omfatter mellom ca. 20 og 50 mol-% kolesterol.
17. 17.

    Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte tilveiebringelse innbefatter behandling av suspensjonen for å fjerne doksorubicin som er tilstede i ubundet form i den vandige massefasen av suspensjonen.
18. 18.

    Fremgangsmåte for betydelig redusering av hyppigheten av kvalme og alopesi hos mennesker produsert ved intranøs bolus-administrasjon av en terapeutisk effektiv mengde fritt doksorubicin, karakterisert ved at man omslutter doksorubicinet i liposomer, og administrerer liposomene ved hurtigdrypping til blodstrømmen.
19. 19.

    Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den liposomomsluttede adriamycin anvendes ved behandling av neoplasmer i leveren.
20. 20.

    Fremgangsmåte for fremstilling av et antrakinon/1iposom-preparat i alt vesentlig som beskrevet og eksemplifisert heri.