ES2339228T3 - Complejos de platino y sus usos en terapia. - Google Patents
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Abstract
Un complejo de platino en la configuración trans de fórmula general (I): (I)[Pt(X)(Y)(Am1)(Am2)] en la que: - X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato; - Am1 representa una amina seleccionada de amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina alifática heterocíclica no planar o una amina aromática heterocíclica; y - Am2 representa una amina alifática heterocíclica no planar; a condición de que se excluyan trans-[Pt(piperidina)2Cl2] y trans-[Pt(morfolina)2Cl2].
Description
Complejos de platino y sus usos en terapia.
La presente invención se refiere a nuevos
complejos de platino y sus usos.
El cisplatino,
cis-[PtCl_{2}(NH_{3})_{2}] es uno de los
tres agentes clínicos más ampliamente utilizados en el tratamiento
de una variedad de tumores sólidos (^{1}). Se cree que mata
células tumorales uniéndose irreversiblemente al ADN,
principalmente a dos guaninas adyacentes en la misma hebra,
induciendo un bucle en el ADN que es reconocido por las proteínas
celulares que se unen al ADN modificado con cisplatino (^{2}). Son
los aductos Pt-ADN los responsables de la inducción
de la apoptosis y la eventual muerte celular (^{3}). A pesar de
su eficacia en el tratamiento de diversas enfermedades neoplásicas,
incluyendo tumores testiculares y ováricos, su utilidad clínica es
limitada por su baja solubilidad, su toxicidad y especialmente la
resistencia tumoral (^{4}). Los fármacos de segunda generación
tales como carboplatino (Pt(CBDCA)(NH_{3})_{2},
CBDCA = 1,1-ciclobutandicarboxilato) exhiben
nefrotoxicidad reducida pero no logran superar la resistencia
tumoral probablemente debido al hecho de que forman el mismo
espectro de aductos de ADN que el cisplatino (^{5}).
Superar la resistencia es uno de los principales
objetivos en el desarrollo de nuevos fármacos de platino, por lo
tanto se han diseñado, sintetizado y seleccionado (^{6}) nuevos
compuestos que se apartan de la relación clásica
actividad-estructura (SAR). La SAR, formulada
primero por Cleare y Hoeschele, influyó sobre los químicos
medicinales para dirigir sus esfuerzos hacia la preparación de
complejos neutros de platino (II) con dos ligandos inertes en la
configuración cis y dos grupos salientes grupos salientes
semilábiles (^{7}).
En general se aceptaba que una configuración
cis de dos grupos salientes es esencial para la actividad
anti-
tumoral de cis-diaminadicloroplatino (cis-DDP). Esta fue la situación durante más de dos décadas hasta que
Farrell et al informaron que reemplazar uno o ambos ligandos NH_{3} en el trans-PtCl2(Am_{1})(Am_{2}), donde Am_{1},
Am_{2} = NH_{3}, o ligandos de tipo amina planares tales como quinolina, tiazol, piridina o benzotiazol (por ejemplo trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piridina)], trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(tiazol)], trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(quinolina)] y trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(benzotiazol)]), aumenta sustancialmente la citotoxicidad de la geometría trans ^{(8)}. Nguyen, H.D. et al. Vietnam J. of Chem. (2001) 39(4), 111-114 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen quinolina y aminas secundarias y primarias y discuten sus espectros de ^{1}H-RMN. Tran, T.D. et al. Tap Chi Duoc Hoc (2001) 6, 6-8 describen complejos cis-PtCl_{2} que contienen dos ligandos que contienen amina, siendo una de ellas una piridina aromática o bencilaminas y la otra una amina cíclica alifática (morfolina o piperidina) y discuten los espectros IR y Raman de los complejos. Tran T.D. et al. Vietnam J. of Chem. (2001) 39(3), 99-102 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen piperidina y amina aromática o una amina sustituida con una amina aromática, sus espectros IR. Raman y UV. Además, los complejos se ensayaron en cuanto a su citotoxicidad celular sobre células de cáncer hepático humano. Tran, T.D. et al. Tap Chi Duoc Hoc (Vietnam J. of Chem). (1997). 35(2), 21-23 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen quinolina y una amina seleccionada de morfolina, ciclohexilamina, piperidina o bencilamina, sus espectros UV e IR y su actividad biológica para reducir la germinación de semillas. Jonson Matthey Pub. Ltd. Co. EP-A-0727430 (1996) describe complejos cis-Pt de fórmula Pt(X)(Z)(A)_{2} y su actividad contra células cancerosas. A es un grupo saliente (por ejemplo halógeno, hidroxi, carboxilato, o juntos forman un carboxilato bidentado, o sulfato) y X es NH_{3} o NH_{3} sustituido con mono o dialquilo. Z es una amina sustituida, preferiblemente una amina policíclica de 8-10 miembros o monocílica de 5 o 6 miembros, especialmente piridina sustituida o amina bicíclica donde la amina está coordinada a través del átomo de nitrógeno. Ivanova, N.A. et al. Russian J. Coord. Chem. (1993) 19(12) 856-863 describen la síntesis de complejos de PtX_{2} con piperazina, donde X puede ser Cl o Br. Se analizaron los complejos sintetizados con espectroscopia vibracional para dilucidar la conformación de la piperazina. Cattalini, L. et al. J. Chem. Soc. Dalton Transactions (1993) 233-236 describen complejos cis y trans de PtCl_{2} que contienen dos ligandos amina, eligiéndose la amina entre piridina, piridina sustituida, morfolina, piperidina y dimetilamina; Shionogi & Co. EP-A-0273315 (1988) desvelan complejos de cis-PtX_{2} (NH_{3})(Am). X puede ser Cl, I, nitro o un resto cíclico y Am es un C_{2-7}N sustituido y su actividad antitumoral. Wong et al. Chem. Rev. (1999) 99(9), 2451-2466 revisan fármacos antitumorales basados en platino mencionando complejos de cis-Pt.
tumoral de cis-diaminadicloroplatino (cis-DDP). Esta fue la situación durante más de dos décadas hasta que
Farrell et al informaron que reemplazar uno o ambos ligandos NH_{3} en el trans-PtCl2(Am_{1})(Am_{2}), donde Am_{1},
Am_{2} = NH_{3}, o ligandos de tipo amina planares tales como quinolina, tiazol, piridina o benzotiazol (por ejemplo trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piridina)], trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(tiazol)], trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(quinolina)] y trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(benzotiazol)]), aumenta sustancialmente la citotoxicidad de la geometría trans ^{(8)}. Nguyen, H.D. et al. Vietnam J. of Chem. (2001) 39(4), 111-114 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen quinolina y aminas secundarias y primarias y discuten sus espectros de ^{1}H-RMN. Tran, T.D. et al. Tap Chi Duoc Hoc (2001) 6, 6-8 describen complejos cis-PtCl_{2} que contienen dos ligandos que contienen amina, siendo una de ellas una piridina aromática o bencilaminas y la otra una amina cíclica alifática (morfolina o piperidina) y discuten los espectros IR y Raman de los complejos. Tran T.D. et al. Vietnam J. of Chem. (2001) 39(3), 99-102 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen piperidina y amina aromática o una amina sustituida con una amina aromática, sus espectros IR. Raman y UV. Además, los complejos se ensayaron en cuanto a su citotoxicidad celular sobre células de cáncer hepático humano. Tran, T.D. et al. Tap Chi Duoc Hoc (Vietnam J. of Chem). (1997). 35(2), 21-23 describen la síntesis de complejos cis-PtCl_{2} que contienen quinolina y una amina seleccionada de morfolina, ciclohexilamina, piperidina o bencilamina, sus espectros UV e IR y su actividad biológica para reducir la germinación de semillas. Jonson Matthey Pub. Ltd. Co. EP-A-0727430 (1996) describe complejos cis-Pt de fórmula Pt(X)(Z)(A)_{2} y su actividad contra células cancerosas. A es un grupo saliente (por ejemplo halógeno, hidroxi, carboxilato, o juntos forman un carboxilato bidentado, o sulfato) y X es NH_{3} o NH_{3} sustituido con mono o dialquilo. Z es una amina sustituida, preferiblemente una amina policíclica de 8-10 miembros o monocílica de 5 o 6 miembros, especialmente piridina sustituida o amina bicíclica donde la amina está coordinada a través del átomo de nitrógeno. Ivanova, N.A. et al. Russian J. Coord. Chem. (1993) 19(12) 856-863 describen la síntesis de complejos de PtX_{2} con piperazina, donde X puede ser Cl o Br. Se analizaron los complejos sintetizados con espectroscopia vibracional para dilucidar la conformación de la piperazina. Cattalini, L. et al. J. Chem. Soc. Dalton Transactions (1993) 233-236 describen complejos cis y trans de PtCl_{2} que contienen dos ligandos amina, eligiéndose la amina entre piridina, piridina sustituida, morfolina, piperidina y dimetilamina; Shionogi & Co. EP-A-0273315 (1988) desvelan complejos de cis-PtX_{2} (NH_{3})(Am). X puede ser Cl, I, nitro o un resto cíclico y Am es un C_{2-7}N sustituido y su actividad antitumoral. Wong et al. Chem. Rev. (1999) 99(9), 2451-2466 revisan fármacos antitumorales basados en platino mencionando complejos de cis-Pt.
Además, Navarro-Ranniger y
colaboradores demostraron que el
trans-PtCl_{2}[NH_{2}CH(CH_{3})_{2}][NH(CH_{3})_{2}]
posee propiedades farmacológicas interesantes (^{9}) y Natile
et al. informaron que el
trans-PtCl_{2}(iminoéter)_{2}
también es activo contra varias líneas de cánceres humanos
^{(10)}. Otro ejemplo de un complejo no clásico que está en fase
2 de ensayos clínicos es el complejo trinuclear de Pt BBR3464 que es
un catión cuádruplemente cargado ^{(11)}.
La importancia de los compuestos no clásicos de
platino deriva del hecho de que están diseñados para formar un
espectro de aductos de ADN que es distinto de aquel formado por el
cisplatino y el carboplatino y por lo tanto pueden sortear la
resistencia al Pt adquirida ^{(12)}.
Generalmente, los análogos
trans-diaminadicloroplatino(II) poseen inferior
solubilidad en solución acuosa que sus contrapartidas cis,
dando como resultado una limitada biodisponibilidad. Una forma de
incrementar la solubilidad en agua es añadir una carga al complejo.
Farrell et al. han dirigido sus esfuerzos a superar la
escasa solubilidad en agua de los compuestos del tipo
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(Am_{1})] (Am_{1} =
ligando planar), reteniendo al mismo tiempo la orientación
trans del NH_{3} y el ligando planar y la
electroneutralidad de la especie plano-cuadrada. Se
sintetizaron el complejo trans-platino
trans-[PtCl(PyAc-N,O)(NH_{3})] (PyAc =
piridin-2-il acetato, los dadores de
N son trans) y su isómero cis y el isómero trans ha
demostrado mayor solubilidad (aproximadamente 4-5
mmol L^{-1}) en agua, en comparación con los complejos análogos
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(Am_{1})] (Am_{1} =
ligando planar) (^{13}). Por otra parte, las cargas catiónicas de
los complejos de platino preparados por Farrell et al. y
también por Hollis et al. se localizan en el metal central y
resultan de la sustitución de uno o de los ligandos cloruro
aniónicos por un ligando neutro (^{14}).
La presente invención se refiere, conforme al
primero de sus aspectos, a nuevos complejos de platino (complejos de
Pt) en la configuración trans que poseen la fórmula general (I):
(I)[Pt(X)(Y)(Am_{1})(Am_{2})]
en la
que:
- X e Y, que pueden ser iguales o diferentes,
representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato;
- Am_{1} representa una amina seleccionada de
amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina
alifática heterocíclica no planar o una amina aromática
heterocíclica; y
- Am_{2} representa una amina alifática
heterocíclica no planar,
a condición de que se excluyan
trans-[Pt(piperidina)_{2}Cl_{2}] y
trans-[Pt(morfolina)_{2}Cl_{2}].
\vskip1.000000\baselineskip
El complejo de Pt de la invención puede estar en
forma de un dímero en el que cada unidad monomérica es un complejo
de Pt según lo definido, unido al otro complejo de Pt,
independientemente, a través del ligando Am_{1} o a través del
ligando Am_{2} o a través de un ligador conectado a dicho Am_{1}
o Am_{2}.
Conforme a otro aspecto, la invención se refiere
a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo
farmacéuticamente aceptable y como principio activo una cantidad
terapéuticamente efectiva de un complejo de Pt en la configuración
trans de la fórmula general:
(I)[Pt(X)(Y)(Am_{1})(Am_{2})]
en la
que:
- X e Y, que pueden ser iguales o diferentes,
representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato;
- Am_{1} representa una amina seleccionada de
amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina
alifática heterocíclica no planar o una amina aromática
heterocíclica; y
- Am_{2} representa una amina alifática
heterocíclica no planar,
a condición de que se excluyan
trans-[Pt(piperidina)_{2}Cl_{2}] y
trans-[Pt(morfolina)_{2}Cl_{2}].
\vskip1.000000\baselineskip
La composición farmacéutica puede comprender el
complejo de Pt de la invención en forma de monómero, o en forma de
dímero, según lo definido más arriba.
Los complejos de platino de la invención pueden
utilizarse para lograr un efecto terapéutico, administrando a un
sujeto que lo necesita una cantidad de un complejo de platino (en
forma de monómero o dímero), siendo la cantidad suficiente para
lograr dicho efecto terapéutico y el complejo de Pt está en
configuración trans y comprende la fórmula general (I):
(I)[Pt(X)(Y)(Am_{1})(Am_{2})]
en la
que:
- X e Y, que pueden ser iguales o diferentes,
representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato;
- Am_{1} representa una amina seleccionada de
amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina
alifática heterocíclica no planar o una amina aromática
heterocíclica; y
- Am_{2} representa una amina alifática
heterocíclica no planar,
a condición de que se excluyan
trans-[Pt(piperidina)_{2}Cl_{2}] y
trans-[Pt(morfolina) _{2}Cl_{2}].
\vskip1.000000\baselineskip
Las Fig. 1A-1B muestran la
captación por células cancerosas C-26 (Fig. 1A) o
células cancerosas OV-1063 (Fig. 1B) de cisplatino
(-?-); transplatino (-\splitvert-);
trans-[(PtCl_{2})(4-picolina)(piperidina)]
(-
\circun{1}-);
trans-[PtCl_{2})(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl (-\splitvert-) y trans-[PtCl_{2}(NH_{3}) (piperidino-piperidina)]\cdotHCl (-\medcirc-). El contenido de Pt se determinó por Espectroscopía de Absorción Atómica (AAS).
Las Fig. 2A-2B muestran los
niveles de platinación del ADN en células cancerosas
C-26 (Fig. 2A) o células cancerosas
OV-1063 (Fig. 2B) de cisplatino (-?-); transplatino
(-\splitvert-);
trans-[PtCl_{2})(4-picolina)(piperidina)]
(-
\circun{1}-);
trans-[PtCl_{2})(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
(-\splitvert-) y
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(-\medcirc-). El contenido de Pt se determinó por Espectroscopía
de Absorción Atómica (AAS).
La Fig. 3 muestra la dependencia de la
fluorescencia de EtBr en diferentes concentraciones de ADN
modificada por cisplatino (-\splitvert-); transplatino
(-
\circun{1}-);
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdotHCl
(-\splitvert-);
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
(-x-) y
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(-?-). Los puntos de datos se midieron por triplicado, los que
variaron en promedio en \pm3%.
La Fig. 4 muestra la actividad de
Caspasa-3 en células OV-1063, que se
trataron con valores de IC_{50} de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(6,5 \muM,
trans-[PtCl_{2}(4-pic)(pip)]),
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
(7,5 \muM o 6,5 \muM, respectivamente,
trans-[PtCl_{2}(4-pic)(pz)]\cdotHCl),
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(4 \muM o 6 \muM, respectivamente,
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(pipo-pip)]\cdotHCl)
o cisplatino (2 \muM o 1 \muM, respectivamente) en comparación
con células (control) no tratadas. Tanto las células tratadas con
fármaco como las células de control posteriormente se cosecharon, se
lisaron y se ensayaron después del lapso indicado de tiempo, según
se describe en el protocolo del kit.
La Fig. 5 muestra la curva de unión de
Ubiquitina a cisplatino (-?-); transplatino (-\splitvert-);
trans-[PtCl_{2})(NH_{3})
(piperidina)] (-
(piperidina)] (-
\circun{1}-); y
trans-[PtCl_{2})(NH_{3})(piperazina)]\cdotHCl
(-\splitvert-).
La Fig. 6 muestra la actividad antitumoral de
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(-\splitvert-) en comparación con cis-DDP (-\splitvert-)
en ratones hembra BALB/C inoculados con carcinoma de colon
C-26 y tratados conforme al cronograma descrito en
la presente memoria más abajo.
La presente invención se basa en el hallazgo
sorprendente de que la inclusión de un ligando de tipo amina
alifática heterocíclica no planar a un complejo de Pt, posee
ventajas terapéuticas, por ejemplo en el campo del tratamiento del
cáncer. El complejo de Pt conforme a la invención incluye al menos
un ligando de tipo amina heterocíclica no planar, que es flexible y
posee un dador de enlaces puente de hidrógeno que puede interactuar
con otras sustancias, tales como con ADN, para formar lesiones. El
ligando es también lo suficientemente voluminoso para afectar la
cinética y la citotoxicidad del complejo resultante.
De este modo, la presente invención proporciona,
conforme a uno de sus aspectos, un complejo de platino (complejo de
Pt) en la configuración trans de la fórmula general (I):
(I)[Pt(X)(Y)(Am_{1})(Am_{2})]
en la
que:
- X e Y, que pueden ser iguales o diferentes,
representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato;
- Am_{1} representa una amina seleccionada de
amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina
alifática heterocíclica no planar o una amina aromática
heterocíclica; y
- Am_{2} representa una amina alifática
heterocíclica no planar,
a condición de que se excluyan
trans-[Pt(piperidina)_{2}Cl_{2}] y
trans-[Pt(morfolina)_{2}Cl_{2}].
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "complejo de Pt" según
se utiliza en la presente memoria se refiere en su sentido más
amplio a cualquier complejo de Pt que comprende dos ligandos que
contienen amina, donde al menos un ligando es una amina alifática
heterocíclica no planar. Estos complejos son regioisómeros
trans (sujetos a la salvedad citada más arriba en este
documento). El complejo de Pt puede incluir Pt(II) coordinado
o Pt(IV) coordinado como metal central. Además, el complejo
de Pt puede estar en forma de un dímero en el que cada unidad
monomérica es un complejo de Pt según lo definido más arriba, unido
a otro complejo de Pt, independientemente, través de uno de sus
ligandos amina, directamente, o a través de un ligador conectado a
dicho Am_{1} o Am_{2}. Los dos ligandos amina también pueden
formar juntos un anillo cíclico, tal como un anillo de piperazina
coordinado con cada átomo metálico de Pt a través de un átomo de
nitrógeno.
Conforme a una realización preferida, X e Y son
iguales o diferentes y representan cloruro o yoduro y más
preferiblemente, X e Y ambos representan un cloruro.
Conforme a la invención Am_{1} puede
representar amoniaco; una amina primaria tal como, sin limitarse a
las mismas, metilamina, etilamina, n-propilamina,
isopropilamina, n-butilamina,
n-hexilamina, n-heptilamina o
n-nonilamina; una amina secundaria tal como, sin
limitarse a las mismas, dimetilamina, dietilamina, dipropilamina,
dibutilamina; una amina alifática heterocíclica no planar, tal como,
sin limitarse a las mismas, piperazina,
2-metilpiperazina, piperidina, 2-, 3- o
4-hidroxipiperidina,
4-piperidino-piperidina,
pirrolidina, 4-(2-hidroxietil)piperazina y
3-aminopirrolidina; o una amina aromática
heterocíclica, tal como, sin limitarse a las mismas, piridina, 2-,
3- o 4-aminopiridina, 2-, 3- o
4-picolina, quinolina, 3- o
4-aminoquinolina, tiazol, imidazol,
3-pirrolina, pirazina,
2-metilpirazina,
4-aminoquinaldina.
El Am_{2} conforme a la invención es una amina
heterocíclica no planar tal como, sin limitarse a las mismas,
piperazina (citada en la presente memoria, a veces, mediante la
abreviatura "pz"), 2-metilpiperazina,
piperidina (citada en la presente memoria, a veces, mediante la
abreviatura "pip"), 2-, 3- o
4-hidroxipiperidina,
4-piperidino-piperidina (citada en
la presente memoria, a veces, mediante la abreviatura
"pip-pip"), pirrolidina,
4-(2-hidroxietil)piperazina y
3-aminopirrolidina.
Según lo indicado más arriba, los complejos de
Pt de la invención se refieren a los regioisómeros trans de los
complejos que poseen la fórmula general (I) identificada más arriba.
Los ejemplos específicos incluyen:
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)];
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-hidroxipiperidina)];
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-piperidino-piperidina)];
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4,4'-bipiperidina)];
-
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)];
-
trans-[PtCl_{2}(piperidina)_{2}];
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdotHCl;
-
trans-[PtCl_{2}(isopropilamina)(piperazina)]\cdotHCl;
-
trans-[PtCl_{2}(n-butilamina)(piperazina)]\cdotHCl;
-
trans-[PtCl_{2}(n-nonilamina)(piperazina)]\cdotHCl
-
trans-[PtCl_{2}(piperidina)(piperazina)]\cdotHCl;
-
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
-
trans-[PtCl_{2}(piperazina)(piperazina)]\cdotHCl;
-
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})[4-(2-hidroxietil)piperazina)]\cdotHCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Según lo indicado más arriba, el ligando de tipo
amina heterocíclica no planar es flexible y posee un dador de
enlaces puente de hidrógeno que puede interactuar con el ADN para
formar lesiones y es lo suficientemente voluminoso para afectar la
cinética y la citotoxicidad del complejo resultante. Además, algunos
de los ligandos de tipo amina tales como piperazina confieren al
complejo una carga positiva, asegurando de ese modo la solubilidad
en agua adecuada y la rápida interacción del complejo con moléculas
polianiónicas, tales como el ADN.
El complejo también puede estar en forma de
dímero. Por consiguiente, dos complejos de Pt se asocian a través
de un enlace de valencia, un anillo cíclico formado entre la amina
sustituyente de cada complejo de Pt (por ejemplo formando juntos un
anillo de piperazina) o mediante un ligador conectado a los ligandos
Am_{1} o Am_{2} de cada complejo. Ejemplos no restrictivos de
ligadores incluyen cadenas cortas de polietilenglicol (PEG),
diaminoalcanos cortos (por ejemplo
1,6-diaminohexano,
1,8-diaminooctano). Un ejemplo específico para un
ligador es la cadena de
4,7,10-trioxa-1,13-tridecano
y un dímero específico en el que los dos complejos de Pt están
asociados mediante este ligador es
Bis-[{trans,trans-(PtCl_{2}piperazina)_{2}}
(4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiamina)]\cdot2HCl.
La invención también se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable
y como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva del
complejo de Pt de la invención según lo definido más arriba.
El complejo de Pt de la presente invención se
administra y se dosifica de acuerdo con la buena práctica médica,
teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual, el
sitio y procedimiento de administración, cronograma de
administración, edad del paciente, sexo, peso corporal y otros
factores conocidos por los profesionales médicos. La "cantidad
terapéuticamente efectiva" a los fines de la presente memoria
de ese modo se determina mediante consideraciones tales como se
conocen en la técnica. La cantidad debe ser efectiva para lograr
mejoría, incluyendo, pero sin limitación, tasa de supervivencia
mejorada o recuperación más rápida de un estado de enfermedad
tratado con el principio activo de la invención, o mejoría o
eliminación de síntomas asociados con el estado de enfermedad y
otros indicadores seleccionados como medidas apropiadas por aquellos
expertos en la técnica.
La cantidad efectiva típicamente se determina en
ensayos clínicos adecuadamente diseñados (estudios de variación de
dosis) y la persona versada en la técnica sabrá cómo conducir
apropiadamente dichos ensayos a fin de determinar la cantidad
efectiva. Tal como se sabe en general, una cantidad efectiva depende
de una variedad de factores que incluyen la afinidad del complejo
de Pt respecto, por ejemplo, del ADN, para formar un aducto
Pt-ADN, el perfil de distribución del complejo de
Pt dentro del cuerpo, una variedad de parámetros farmacológicos
tales como vida media en el cuerpo, de efectos colaterales no
deseados, si los hubiera, de factores tales como edad y sexo,
etc.
Pueden emplearse muchos modos de administración
para la administración del complejo de Pt, y éstos necesitarán el
uso de diferentes vehículos, adyuvante, elixires y similares, según
se conoce en la técnica.
Evidentemente, los vehículos farmacéuticamente
aceptables empleados conforme a la invención generalmente se
refieren a agentes de relleno sólidos o líquidos no tóxicos,
inertes, diluyentes o material de encapsulado en la medida en que
estos no impidan o interfieran con el efecto terapéutico deseado del
complejo de Pt y no reaccionen con el complejo de Pt de la
invención.
El complejo de Pt puede administrarse por vía
oral, subcutánea o parenteral incluyendo la administración
intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal e
intranasal así como la administración intratecal y mediante
técnicas de infusión. Además, el complejo de Pt puede suspenderse en
propelentes de clorofluorocarbono o hidrofluorocarbono para la
administración a través de un inhalador a los pulmones.
Alternativamente, el complejo de Pt puede formularse en una matriz
(lactosa, etc.) o vehículo (por ejemplo, liposomas, etc.), que
permitirán la administración por vía oral, sublingual o por
supositorio.
Las dosis pueden ser dosis únicas o dosis
múltiples durante un período de varios días. El tratamiento
generalmente posee una duración proporcional a la duración del
proceso de la enfermedad y efectividad del principio activo y
especie de paciente que está siendo tratado. Además, la
administración del complejo de Pt de la presente invención puede
ser regular, o en una tasa gradual, o continua, constante o
controlada a un paciente. El huésped o paciente para el tratamiento
terapéutico que utiliza compuestos de platino descritos en la
presente memoria generalmente son mamíferos, tales como humanos,
perros y roedores, etcétera.
Al administrar el complejo de Pt de la invención
por vía parenteral, generalmente se formulará en una forma
inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión,
emulsión). La formulación farmacéutica apropiada para inyección
incluye soluciones acuosas o dispersiones estériles y polvos
estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones
estériles inyectables. El vehículo puede ser un disolvente o medio
dispersante que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol, lípido, polietilenglicol y
similares), mezclas apropiadas de los mismos y aceites vegetales.
Los vehículos no acuosos tales como aceite de semilla de algodón,
aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz,
aceite de girasol, o aceite de maní y ésteres tales como el
miristato de isopropilo, también pueden utilizarse como sistemas
disolventes para el complejo de Pt de la invención.
Además, se pueden añadir diversos aditivos que
aumentan la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las
composiciones que contienen el complejo de Pt de la invención,
incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes y tampones.
La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse
mediante diversos agentes antibacterianos y antimicóticos, por
ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y
similares.
La composición farmacéutica de la invención
también puede administrarse por vía oral a un sujeto que lo
necesita. Son útiles los procedimientos convencionales tales como
la administración del compuesto activo en comprimidos,
suspensiones, soluciones, emulsiones, cápsulas, polvos, jarabes y
similares. Son preferibles las técnicas conocidas que la
administran por vía oral o intravenosa y retienen la actividad
biológica de la misma.
Conforme a una realización preferida, el
complejo de Pt de la invención es atrapado por o se carga en un
liposoma. El término "liposoma" según se utiliza en la
presente memoria incluye todas las esferas o vesículas de lípidos
formadores de liposomas que pueden formar vesículas en forma
espontánea o no espontánea, por ejemplo fosfolípidos que son
glicéridos donde al menos un grupo acilo es reemplazado por un éster
de ácido fosfórico complejo.
El término "cargado" o
"atrapado" significa atrapado dentro del interior del
liposoma, expuesto o presente en la superficie del liposoma,
incrustado en la membrana del liposoma.
Los liposomas conforme a la invención pueden
formarse a partir de cualquier lípido formador de liposomas
conocido. Según se utiliza en la presente memoria, la expresión
"lípido formador de liposomas" denota cualquier
sustancia anfipática fisiológicamente aceptable que contiene grupos
con propiedades característicamente diferentes, por ejemplo
propiedades tanto hidrofílicas como hidrofóbicas o una mezcla de
tales moléculas, y que con la dispersión de las mismas en un medio
acuoso forma vesículas liposomales. Los liposomas pueden estar
compuestos por una única sustancia anfipática o a partir de una
mezcla de dichas sustancias.
La sustancia anfipática incluye, inter
alia, fosfolípidos, esfingolípidos, glicolípidos, tales como
cerebrósidos y gangliósidos, lípidos PEGilados y esteroles, tales
como colesterol y otros. Cualquier lípido formador de liposomas
comúnmente conocido es apropiado para el uso mediante el
procedimiento de la presente invención. La fuente del lípido o su
procedimiento de síntesis no es crítico: se puede utilizar cualquier
lípido de origen natural, con y sin modificación, o un fosfátido
sintético.
Las sustancias anfipáticas formadoras de
liposomas preferidas son moléculas naturales, semisintéticas o
completamente sintéticas; lípidos, fosfolípidos o esfingolípidos
con carga negativa o positiva, opcionalmente combinados con un
esterol, tal como colesterol; y/o con lipopolímeros, tales como
lípidos PEGilados.
Los liposomas empleados por la invención pueden
"adaptarse" a los requerimientos de cualquier reservorio
específico, incluyendo diversos fluidos biológicos, que mantienen
su estabilidad sin agregación o separación cromatográfica, y de
esta manera permanecen bien dispersos y suspendidos en el fluido
inyectado. La fluidez in situ cambia debido a la
composición, temperatura, salinidad, iones bivalentes y presencia de
proteínas. Los liposomas pueden utilizarse con o sin ningún otro
disolvente o tensioactivo.
Una combinación de fosfolípidos preferida
conforme a la invención incluye una mezcla de (HSPC):colesterol:
PEG^{2000}-DSPE (refiriéndose HSPC a
fosfatidilcolina de soja hidrogenada mientras que
PEG^{2000}-DSPE se refiere a
Diestearoil-fosfatidil-etanolamina a
la que PEG^{2000} se une al grupo principal) o alternativamente,
diacilglicol-PEG (que posee dos cadenas de estearoil
acilo) o colesterol-PEG.
La composición de la invención está destinada a
lograr un efecto terapéutico, incluyendo el efecto terapéutico la
formación de un aducto entre el complejo de Pt de la invención y una
molécula de ácido nucleico tal como un ADN. El efecto terapéutico
puede comprender la inhibición de la proliferación celular no
deseada o la inducción de la apoptosis de células no deseadas.
De este modo, la composición de la presente
invención puede utilizarse para el tratamiento o prevención de un
estado de enfermedad, estando el estado de enfermedad asociado a la
proliferación celular no deseada. La expresión "tratamiento o
prevención" según se utiliza en la presente memoria se
refiere a la administración de una cantidad terapéutica de la
composición de la invención que sea efectiva para aliviar los
síntomas no deseados asociados al estado de enfermedad, para
impedir la manifestación de tales síntomas antes de que sucedan,
para retardar el avance de la enfermedad (tal como puede ser
evidente a partir de la tasa de proliferación del tejido afectado),
retardar el deterioro de los síntomas, potenciar el principio del
período de remisión, retardar el daño irreversible causado en la
etapa crónica progresiva de la enfermedad (por ejemplo, en
enfermedades autoinmunes), retrasar la aparición de dicha etapa
progresiva, disminuir la severidad o curar la enfermedad, mejorar
la tasa de supervivencia o lograr una recuperación más rápida, o
impedir que la enfermedad suceda o una combinación de dos o más de
los anteriores.
De este modo, los complejos de platino de la
invención pueden utilizarse en un procedimiento para lograr un
efecto terapéutico, comprendiendo el procedimiento administrar a un
sujeto que lo necesita una cantidad de un complejo de platino
conforme a la invención, siendo la cantidad suficiente para lograr
dicho efecto terapéutico. Conforme a una realización, el complejo
de Pt de la invención se utiliza como agente
anti-cáncer.
La invención ahora además se explicará mediante
los siguientes ejemplos no restrictivos. Si bien la descripción
precedente describe en detalle solamente unas pocas realizaciones
específicas de la invención, los expertos en la técnica entenderán
que la invención no se limita a los mismos y que pueden ser posibles
otras variaciones en forma y detalles sin apartarse del alcance y
espíritu de la invención definidos por las reivindicaciones, que se
deben leer incluidas dentro de la divulgación de la memoria
descriptiva.
En la siguiente descripción R se refiere a
cualquiera de los siguientes derivados de piperidina: piperidina,
4-hidroxipiperidina,
4-piperidino-piperidina,
1,4'-bispiperidina. Para mayor referencia, los
derivados obtenidos se identificarán mediante un número de
referencia que aparece entre paréntesis.
Se suspendió
cis-diamminodicloroplatino(II) (300 mg, 1 mmol) en 30
ml de agua bidestilada DDW. Se añadieron dos equivalentes (eq.) del
derivado de piperidina, y la suspensión se calentó a 85ºC durante 3
h. Durante este tiempo la suspensión amarilla se convirtió en una
solución transparente incolora (en algunos casos se formó un
precipitado negro). La mezcla de reacción se enfrió hasta
temperatura ambiente, se filtró y se añadió gota a gota 1 ml de HCl
concentrado. La temperatura se elevó a 90ºC durante 6 horas, durante
las que el producto amarillo,
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(derivado de piperidina)],
precipitó. Se dejó en reposo la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante 4 h, después de lo que se recolectó el producto
amarillo mediante filtración y se lavó con 40 ml de DDW, 10 ml de
EtOH y 40 ml de éter dietílico.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)]}
(1): Rendimiento 86,9%. Análisis (C_{5}H_{14}Cl_{2}N_{2}Pt)
C,H,N. ^{195}PtRMN(\delta, DMF):
-2167 ppm.
-2167 ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(4\text{-}hidroxipiperidina)]}
(2): Rendimiento 80,0%. Análisis
(C_{5}H_{14}aCl_{2}N_{2}OPt) C,H,N.
^{195}PtRMN(\delta, DMF): -2172 ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(4\text{-}piperidino\text{-}piperidina)]}
(3): Rendimiento 78,5%. Análisis (C_{10}H_{24}Cl_{3}N_{3}Pt)
C,H,N. ^{195}PtRMN(\delta, H_{2}O): -2170 ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(4,4'\text{-}bipiperidina)]}
(4): Rendimiento 85,9%. Análisis (C_{10}H_{24}Cl_{3}N_{3}Pt)
C,H,N. ^{195}PtRMN
(\delta, H_{2}O): -2175 ppm.
(\delta, H_{2}O): -2175 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió K_{2}PtCl_{4} (200 mg, 0,482
mmol) en 30 ml de DDW. Se añadió 4-picolina (2,5
eq., 117,3 \mul; 1,2 mmol) y la mezcla se agitó durante toda la
noche a temperatura ambiente. Se recolectó el precipitado amarillo,
cis-[PtCl_{2}(4-picolina)_{2}]
[^{195}PtRMN(DMF) = -1964 ppm], mediante filtración y se
lavó con 50 ml de DDW y 40 ml de éter dietílico. Se suspendió
cis-[PtCl_{2}(4-picolina)_{2}]
(226 mg, 0,5 mmol) en 40 ml de DDW con 2 eq. de piperidina (99
\mul, 1 mmol), y la suspensión se calentó a 80ºC durante 3 h. La
solución se volvió transparente e incolora con alguna formación de
un precipitado negro. Se dejó enfriar la mezcla de reacción hasta
temperatura ambiente y el material precipitado se filtró. Al
filtrado incoloro, se añadió 1 ml de HCl concentrado y la mezcla se
calentó a 90ºC. El calentamiento se mantuvo durante 6 h, tiempo
durante el que se formó un precipitado amarillo. Se dejó enfriar la
mezcla de reacción hasta temperatura
ambiente y se recolectó el precipitado (180 mg) y se lavó con 50 ml de DDW, 10 ml de EtOH y 30 ml de éter dietílico.
ambiente y se recolectó el precipitado (180 mg) y se lavó con 50 ml de DDW, 10 ml de EtOH y 30 ml de éter dietílico.
Rendimiento: 81%. Análisis
(C_{11}H_{18}C_{12}N_{2}Pt): C,H,N.
^{195}PtRMN(\delta, DMF): -2087 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió K_{2}PtCl_{4} (415 mg, 1 mmol)
en 50 ml de DDW a lo que se añadió (1,330 gr., 8 mmol) KI y la
solución roja se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A
la solución agitada se añadió piperidina (202 \mul, 2 mmol)
lentamente. Después de 1 hora de agitación a temperatura ambiente el
precipitado amarillo se recolectó y se lavó con 50 ml de DDW y
después con 50 ml de éter. Se tomó
cis-(PtI_{2}(Pip)_{2}] (300 mg., 0,484
mmol) en 20 ml DMF y, se añadieron 164,5 mg (0,97 mmol) de
AgNO_{3} (98 \mul, 1,94 mmol) y la mezcla se agitó durante toda
la noche a temperatura ambiente. Después de filtrar el precipitado
la solución se evaporó a sequedad. A la goma se añadieron 20 ml de
DDW y se agitó durante 30 minutos. Los materiales insolubles se
filtraron y se añadieron 2 ml de HCl concentrado. La solución
acidificada se calentó a 90ºC durante 5 horas. Después de enfriar
hasta temperatura ambiente se recolectó el precipitado amarillo y se
lavó con 50 ml de DDW y 40 ml de éter.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(piperidina)_{2}]}
(6): Rendimiento: 91%. Análisis (C_{10}H_{22}Cl_{2}N_{2}Pt):
C,H,N. ^{195}PtRMN(8, DMF): -2080 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió K_{2}PtCl_{4} (415 mg, 1 mmol)
en 50 ml de DDW, y se añadieron 8 eq. de KI (1,328 g, 8 mmol). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. y después se
añadieron lentamente 2 eq. de piperidina (198 \mul, 2 mmol). La
mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, durante la
que se formó un precipitado amarillo. El precipitado se recolectó y
se lavó completamente con 50 ml de DDW, y con 20 ml de una mezcla
(1:1) de acetona:éter dietílico. Después del secado, el precipitado
amarillo (500 mg, 0,8 mmol) se suspendió en una mezcla de 20 ml de
DDW y 40 ml de etanol, a lo que se añadió 1 ml de ácido perclórico
(70%). Se agitó la suspensión a temperatura ambiente durante 8 días.
Durante este período, el precipitado amarillo se volvió marrón. El
precipitado marrón se recolectó mediante filtración y se lavó con 40
ml de DDW y 20 ml de acetona:éter dietílico (1:1). Después del
secado, el precipitado se re-suspendió en 20 ml de
DDW, se añadió gota a gota 0,5 ml de NH_{4}OH al 25%, y la mezcla
se agitó enérgicamente durante 24 horas, durante las que el
precipitado de color marrón se volvió amarillo. El precipitado
amarillo se recolectó y se lavó completamente con 50 ml de DDW, y
10 ml de acetona-éter dietílico y se secó mediante aspiración
continua. El producto se caracterizó como
cis-amina-piperidina-diiodoplatino(II)
mixto [^{195}PtRMN(\delta, DMF) = - 3260 ppm].
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se suspendió
cis-amina-piperidina-diiodoplatino(II)
(300 mg, 0,54 mmol) en 20 ml de DDW y se añadieron 2 eq. de
AgNO_{3} (184,9 mg, 1.08 mmol). La suspensión se agitó
enérgicamente en la oscuridad durante 24 h. El precipitado de AgI
se filtró, y el filtrado acuoso se transfirió en un recipiente de 50
ml, al que se añadió 0,5 g de KCl. La solución incolora se volvió
amarillenta, y el producto
dicloro-diaminoplatino(II) comenzó a
precipitar. Después de 4 h a temperatura ambiente el precipitado
amarillento (260 mg) se recolectó y se lavó completamente con 50 ml
de DDW y se secó mediante el lavado con 100 ml de éter
dietílico.
Rendimiento total de
\underline{\mathit{cis}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)]}
(7): 69%. Análisis (C_{5}H_{14}Cl_{2}N_{2}Pt) C,H,N.
^{195}PtRMN (\delta, DMF): -2159 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objetivo de la investigación presentada en la
presente memoria fue diseñar y preparar complejos de platino que
sean solubles en agua, reaccionen rápidamente con el ADN y sean
capaces de formar aductos con el ADN que sean diferentes de los
formados por el cisplatino y transplatino. Esto llevó al diseño y
síntesis de varios derivados trans-Pt con
piperazina como ligando. Se eligió este ligando ya que éste
conferiría carga positiva al complejo y de ese modo aseguraría
solubilidad en agua y rápida interacción con el ADN polianiónico; el
mismo es un ligando de tipo amina heterocíclica no planar que es
flexible y posee un dador de enlaces puente de hidrógeno que puede
interactuar con el ADN para formar una lesión; y es lo
suficientemente voluminoso para afectar la cinética y la
citotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
cis-diamino-dicloroplatino(II) (300
mg, 1 mmol) en 30 ml de DMF y 2 eq. (372,52 mg, 2 mmol) de
1-piperazincarboxilato de ter-butilo y se
añadieron 2 eq. (339,76 mg, 2 mmol) de AgNO_{3} simultáneamente
con la agitación. Se continuó la agitación en la oscuridad durante
24 h a temperatura ambiente. El precipitado se filtró a través de
un vidrio sinterizado con celite y se evaporó el filtrado a sequedad
a presión reducida. La goma resultante se disolvió en 30 ml de DDW
y se añadieron 2 ml de HCl concentrado y la mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Los precipitados
coloreados se eliminaron y la solución se calentó a
85-90ºC durante 60 min. Después de enfriar hasta
temperatura ambiente la mezcla de reacción se filtró y el filtrado
se enfrió a 0ºC durante 72 h. El precipitado amarillo se filtró y se
lavó con 10 ml de DDW fría con hielo y 30 ml de éter dietílico.
Después del secado, el producto amarillo (300 mg) se caracterizó
como la sal clorhidrato de
trans-amino-piperazina-dicloroplatino(II)
deseada (8)
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdot
HCl} (8) Rendimiento: 74%. Análisis Calculado para
C_{4}H_{14}Cl_{3}N_{3}PtH_{2}O:
C, 11,34%; H, 3,81%; N, 9,92%. Experimental C, 11,27%; H, 3,56%; N, 9,86%. ^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2177 ppm.
C, 11,34%; H, 3,81%; N, 9,92%. Experimental C, 11,27%; H, 3,56%; N, 9,86%. ^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2177 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente descripción Am1 se refiere a
cualquiera de las siguientes aminas: n-butilamina,
isopropilamina, 4-picolina, piperidina,
piperazina.
Síntesis del intermediario
cis-[PtI_{2}(1-piperazincarboxilato
de ter-butilo)_{2}]: se disolvió
tetracloroplatinato de potasio (1 g, 2,4 mmol) en 40 ml de DDW y se
añadieron 8 eq. (3,2 g, 19,27 mmol) de KI. La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 15 min. Se añadieron dos eq. (0,9 g,
4,8 mmol) de 1-piperazincarboxilato de
ter-butilo y la mezcla se agitó enérgicamente durante 1 h a
temperatura ambiente A lo largo de este período de tiempo el
diiododiaminoplatino(II) deseado precipitó. El precipitado
amarillo se recolectó mediante filtración, se lavó con 50 ml de DDW
y se secó mediante aspiración.
\underline{\mathit{Cis}\text{-}[PtI_{2}(1\text{-}piperazincarboxilato
\ de \ \mathit{ter}\text{-}butilo)_{2}}: Rendimiento: 89%,
^{195}Pt-RMN(\delta, DMF): -3264 ppm.
Se disolvió
cis-[PtI_{2}(1-piperazincarboxilato
de ter-butilo)_{2} (411 mg, 0,5 mmol) en la
oscuridad en 15 ml de DMF y se añadieron 2 equivalentes (169,88 mg,
1 mmol) de AgNO_{3} simultáneamente con 2 eq. de la amina
correspondiente (98,83 \mul de n-butilamina, 85,17
\mul de isopropilamina, 97,4 \mul de
4-picolina, 99 \mul de piperidina o 186 mg de
1-piperazin-carboxilato de
ter-butilo). Se continuó la agitación en la oscuridad
durante 24 horas a temperatura ambiente. El precipitado se filtró a
través de un vidrio sinterizado con celite. El filtrado se evaporó
a sequedad a presión reducida. La goma resultante se disolvió en 30
ml de DDW y se añadieron 2 ml de ácido clorhídrico concentrado y la
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h.
Los precipitados coloreados se eliminaron y la solución se calentó
a 85-90ºC durante 60 min. Después de enfriar hasta
temperatura ambiente la mezcla de reacción se filtró y el filtrado
se enfrió a 0ºC durante 24 horas. El precipitado amarillo se filtró
y se lavó con 20 ml de DDW enfriada con hielo y 30 ml de éter
dietílico. Después del secado, los productos amarillos se
caracterizaron como sales clorhidratos del complejo
trans-diamino-dicloroplatino(II)
deseado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(isopropilamina)(piperazina)]\cdot
HCl} (9): Rendimiento 71%,
^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2226
ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(n\text{-}butilamina)(piperazina)]\cdot
HCl} (10): Rendimiento 67%,
^{195}N-RMN(\delta, H_{2}O): -2221
ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(n\text{-}nonilamina)(piperazina)]\cdot
HCl} (11): Rendimiento 77%,
^{195}N-RMN(\delta, H_{2}O): -2236 ppm.
25,06%, H: 3,82%, N: 8,55%, ^{195}Pt-RMN(8,
H_{2}O): -2086 ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(piperidina)(piperazina)]\cdot
HCl} (12): Rendimiento 56%,
^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2230
ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(4\text{-}picolina)(piperazina)]\cdot
HCl} (13): Rendimiento 61,2%, Análisis Calculado para
C_{10}H_{18}Cl_{3}N_{3}Pt: C: 24,99%, H: 3,56%, N: 8,74%,
Experimental: C: 25,06%, H: 3,82%, N: 8,55%,
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(piperazina)(piperazina)]\cdot
HCl} (14): Rendimiento 83%,
^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2238
ppm.
\underline{\mathit{Trans}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})[4\text{-}(2\text{-}hidroxietil)piperazina)]\cdot
HCl} (15): Rendimiento 83%,
^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2238
ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron tetrafenilfosfonio
tricloro-monoamino-platino(II)
(300 mg, 0,45 mmol) en 10 ml de una mezcla 1:1 de acetona/DDW. A la
solución de color naranja se añadió 1 equivalente (77,53 mg, 0,45
mmol) de 1-piperazincarboxilato de
ter-butilo. La mezcla se agitó en un recipiente cerrado a
temperatura ambiente durante 7 días. Después de evaporar la
solución a sequedad a presión reducida so tomó el sólido amarillo en
10 ml de etanol absoluto y se añadió 0,5 ml de ácido clorhídrico
concentrado y se dejó la mezcla en reposo durante toda la noche. El
precipitado amarillo se recolectó mediante filtración y se lavó con
10 ml de etanol.
\underline{\mathit{Cis}\text{-}[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdot
HCl}: Rendimiento: 58%,
^{195}Pt-RMN(\delta, H_{2}O): -2187
ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Una línea celular de carcinoma ovárico humano
(OV-1063), establecido en el hospital de la
Universidad de Hadassah y una línea celular de carcinoma de colon
humano (C-26) se mantuvieron en medio
RPMI-1640 suplementado con FCS al 10%, antibióticos
y glutamina. Todos los componentes del medio de cultivo se
adquirieron en Biological Industries (Beit-HaEmek,
Israel). Ambas líneas celulares se mantuvieron a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} con camisa de agua.
Además, se emplearon tres pares de líneas
celulares de cáncer resistentes y sensibles al cisplatino
(A2780/
A2780cisR, 41M,/41McisR y CHl/CHlcisR) (^{15}). Esos pares de líneas celulares se seleccionaron sobre la base de abarcar todos los mecanismos principales conocidos de resistencia al cisplatino: siendo 41McisR básicamente resistente a través del transporte de fármaco reducido (16), CHlcisR a través de la reparación/tolerancia aumentada del ADN ^{(17)} y A27780cisR a través de una combinación de captación reducida, aumento de la reparación/tolerancia del ADN y niveles elevados de GSH ^{(18)}.
A2780cisR, 41M,/41McisR y CHl/CHlcisR) (^{15}). Esos pares de líneas celulares se seleccionaron sobre la base de abarcar todos los mecanismos principales conocidos de resistencia al cisplatino: siendo 41McisR básicamente resistente a través del transporte de fármaco reducido (16), CHlcisR a través de la reparación/tolerancia aumentada del ADN ^{(17)} y A27780cisR a través de una combinación de captación reducida, aumento de la reparación/tolerancia del ADN y niveles elevados de GSH ^{(18)}.
\vskip1.000000\baselineskip
El cisplatino y transplatino fueron
suministrados por (Sigma, St. Louis, MO, USA). Todos los fármacos se
disolvieron en solución salina normal inmediatamente antes de los
experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
La citotoxicidad de los complejos sintetizados
se probó mediante el ensayo de tinción con azul de metileno (MB)
(^{19}). Se colocó un número fijo de células en crecimiento
exponencial en 200 \mul de medio en placas con la parte inferior
plana de 96 micropocillos. Para cada uno de los complejos ensayados,
se utilizaron 4 pocillos. Después de 24 horas en cultivo, se
añadieron 20 \mul de diferente concentración de los complejos a
cada pocillo que contenía células no tratadas. Se añadió solución
salina normal a los controles. Las células se expusieron a los
complejos durante 4, 24 o 72 horas. Al final de la exposición
durante un intervalo de tiempo fijo, las células tratadas así como
las células de control paralelo se lavaron y la incubación continuó
en medio fresco hasta la finalización del experimento. Después de
72 horas de crecimiento, las células se fijaron añadiendo 50 \mul
de glutaraldehído al 2,5% a cada pocillo durante 15 minutos. Las
células fijas se enjuagaron 10 veces con agua desionizada fresca y
una vez con tampón de borato (0,1 M, pH=8,5), se secaron y se
tiñeron con MB (100 \mul de solución al 1% en tampón 0,1 M de
borato, pH=8,5) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células
teñidas se lavaron completamente con agua desionizada para eliminar
cualquier colorante unido a alguna célula y después se secaron. El
MB unido a las células fijas se extrajo mediante incubación a 37ºC
con 200 \mul de HCl 0,1N durante 1 hora, y la densidad óptica neta
(OD) del colorante en cada pocillo se determinó mediante un
espectrofotómetro de placas (Labsystems Multyskan BICHROMATIC,
Finlandia) a 620 nm.
La ventaja del procedimiento de MB con placas de
96 micropocillos es la posibilidad de realizar una amplia variedad
de experimentos sobre la tasa de proliferación y supervivencia
celular con un gran número de puntos de datos, donde las células se
cultivan en la misma placa y se ensayan en las mismas condiciones
para diferentes complejos experimentales. La validez del ensayo de
MB para evaluar la supervivencia celular está respaldada por la
alta correlación entre los resultados del ensayo colorimétrico de MB
y el ensayo de unidades formadoras de colonias (^{20}).
\vskip1.000000\baselineskip
También se ensayó la citotoxicidad de los
complejos sintetizados mediante el procedimiento de MTS (^{21}).
Por consiguiente, los compuestos se incubaron durante 24 horas con
las correspondientes líneas celulares y se evaluó la supervivencia
celular en cultivos tratados con los compuestos.
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Se sembraron células durante 48 horas antes que
se añadiera uno de los complejos al medio de cultivo. Después de 24
horas de exposición, se eliminaron los complejos y se lavaron las
células dos veces con PBS frío con hielo y se peletizaron. Las
células (1x10^{6}) se secaron y se mineralizaron calentando
durante 10 minutos en HNO_{3} al 65% (BDH, Inglaterra) (^{22}).
Se disolvieron las muestras en agua desionizada y cada muestra se
midió en dos diluciones diferentes mediante espectrómetro de
absorción atómica sin llama de Zeeman (FAAS). Las curvas de
calibración incluyeron 5 estándares de soluciones patrón de
K_{2}PtCl_{4} con concentraciones que variaban de 50 a 250 ng
de platino por ml. El contenido de platino se expresó como picomoles
de platino por cada 1x10^{6} células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células durante 48 horas antes de
que se añadiera uno de los fármacos al medio de cultivo. Después de
24 horas de exposición, se eliminaron los complejos y se lavaron las
células dos veces con PBS frío con hielo y se peletizaron. El ADN
del material que contenía platino (2x10^{6} células) se extrajo
del pélet celular mediante Kit de Sangre de ADN QIAamp (QIAGEN,
Alemania) conforme a las instrucciones del fabricante. Se determinó
el rendimiento de ADN midiendo la concentración de ADN en el eluato
por absorbancia a 260 nm. El ADN aislado de cada muestra promedió
50\pm10 \mug/ml. Se determinó la pureza calculando la relación
entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm; el grado de purificación
de ADN fue 95% en promedio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un plásmido (4,8 kbp) que contenía un
gen que codifica la hormona de crecimiento humana, el plásmido
pS16-hGH, según se describió previamente (^{23}).
Se analizó el ADN recién preparado mediante electroforesis en gel
de agarosa (1%) utilizando post-tinción con el
colorante fluorescente Verde I SYBR (Molecular Probes, Eugene, OR).
Se realizó el análisis cuantitativo del plásmido superenrollado
^{(24)} y se demostró que el ADN del plásmido era
85-90% en forma superenrollada. La espectroscopía UV
no mostró presencia de proteína o contaminación de ARN en ninguno
de los lotes de ADN. La relación entre las absorbancias a 260 nm y a
280 nm estuvo siempre entre 1,8 y 1,9.
Los ADN fueron modificados por los complejos de
platino en NaClO_{4} 10 mM (pH 7,0) a 37ºC en la oscuridad
durante 24 horas. Las mediciones de fluorescencia de EtBr se
realizaron en un espectrómetro de luminiscencia LS50B (Perkin
Elmer, Norwalk, CT). Se realizaron las mediciones de fluorescencia
del ADN modificado por platino en presencia de EtBr utilizando la
longitud de onda de excitación de 546 nm (ranura de 10 nm) y la
longitud de onda de emisión de 590 nm (ranura de 10 nm) a 25ºC. Las
concentraciones fueron 0,01 mg/ml para el ADN y 0,04 mg/ml para
EtBr, lo que correspondió a la saturación de todos los sitios de
intercalación de EtBr en el ADN.
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Se evaluó la apoptosis mediante dos
abordajes:
(1) Por tinción de células C-26
y OV-1063 con Merocianina 540 (MC 540) (Molecular
Probes, Oregon, EE.UU.) y diclorhidrato de
4',6-diamidino-2-fenilindona
(DAPI) (Molecular Probes, Oregon, EEUU). Este ensayo se basó en la
observación de que pronto después de la iniciación de la apoptosis,
la fosfatidilserina (PS) se transloca desde la cara interna de la
membrana plasmática a la superficie celular. En este punto, la PS
puede detectarse fácilmente tiñendo con MC 540, que posee una
fuerte afinidad con respecto a PS(^{25}). Se evaluó la
condensación de cromatina tiñendo con DAPI, que preferentemente
tiñe ADN de doble hebra. En los siguientes experimentos se
cultivaron muestras que contenían 5x10^{5} células sobre placas de
6 pocillos cubiertas con un cubreobjetos de vidrio. Después del
tratamiento de las células con la IC_{50} de los complejos, se
lavaron las células con PBS y se incubaron durante 2 minutos en la
oscuridad en 500 \mul de PBS que contenía 2,5 \mul de MC 540 (1
mg/ml). Después de eso se lavaron las células con PBS, se fijaron
con formaldehído al 4% y se tiñeron con 300 \mul de DAPI (3
\muM). Después de eso, se colocó un cubreobjetos de vidrio sobre
una placa de vidrio y se fotografió utilizando un microscopio
confocal de fluorescencia.
(2) Mediante el Kit de Ensayo de
Caspasa-3 EnzChektm (Molecular Probes, Eugene, OR).
Este kit permite la detección de apoptosis analizando los
incrementos en las actividades de caspasa-3 y otra
proteasa específica de DEVD (por ejemplo,
caspasa-7). La base para el ensayo es rodamina 110
bis-(amida del ácido
N-CBZ-aspartil-L-glutamil-L-valil-aspártico)
(Z-DEVDR110). Este sustrato es un derivado de
bisamida de la rodamina 110 (R110) que contiene péptidos de DEVD
covalentemente unidos a cada uno de los grupos amino de R110. Tras
la ruptura enzimática, el sustrato de bisamida no fluorescente se
convirtió en R110 fluorescente, que puede cuantificarse mediante un
lector de microplacas para fluorescencia utilizando excitación a
485\pm10 nm y detección de emisión a 535\pm10 nm.
En síntesis, se trataron células
C-26 y OV-1063 con la IC_{50} de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(5) (4,5 \muM y 6,5 \muM, respectivamente) y de
trans-[PtC_{2}(4-picolina)(piperazina)\cdotHCl]
(12) (5 \muM y 7,5 \muM, respectivamente) durante 5 o 16 hr.
Ambas células "inducidas" y "de control" después se
cosecharon y se lisaron. Se realizaron las reacciones enzimáticas en
placas de 96 pocillos con 50 \mug de proteínas citosólicas (55
minutos de incubación) y con una concentración final de sustrato
Z-DEVD-R110 25 \muM según se
describe en el protocolo del kit.
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Se evaluaron los derivados de
trans-platino(II),
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-piperidino-piperidina)]
(3) en cuanto a su toxicidad y eficacia antitumoral en comparación
con cis-DDP.
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La toxicidad de
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-piperidino-piperidina)]
se evaluó en ratones BALB/C hembra de 8 semanas y se comparó con
cis-DDP. Se inyectaron por vía i.v. este nuevo complejo y
cis-DDP en diferentes concentraciones, tres veces a
intervalos semanales, y se evaluaron el peso del animal y la
supervivencia.
Se inyectaron por vía i.p. ratones BALB/C hembra
(en el intervalo de peso de 17-20 g) con 1x10^{6}
de células de carcinoma de colon C-26. La viabilidad
de estas células fue >90% por exclusión de azul tripán.
Se estudió la eficacia terapéutica de
trans-[PtCl_{2}
(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl (3) y
se comparó con cis-DDP. El tratamiento comenzó el
día 3 después de la incubación tumoral y se repitió dos veces para
un total de tres inyecciones a intervalos semanales.
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La baja solubilidad de los compuestos neutros de
diaminodicloro platino(II), que da como resultado una escasa
biodisponibilidad, fue una de las razones para el diseño y síntesis
de los complejos con carga positiva de fórmula general
[PtCl_{2}(Am)(pz)]\cdotHCl. Se demostró que los
compuestos presentados en la presente memoria son más solubles que
sus contrapartidas neutras, teniendo solubilidades en el orden de 20
mM en comparación con 6,3 mM para cisplatino y 0,8 mM para
transplatino. Por ejemplo,
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
(13) exhibió una solubilidad en DDW (a 37ºC) de 7,5 mg/ml (18,0
mM).
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A fin de evaluar la actividad antitumoral de los
complejos trans y cis sintetizados se incubaron
células C-26 y OV-1063 durante 4,
24 o 72 horas con estos complejos. El ensayo de citotoxicidad con MB
reveló que reemplazar uno o ambos grupos (NH_{3}) del
transplatino aumenta considerablemente (más de cuatro veces) la
citotoxicidad de los nuevos compuestos trans-PtCl_{2} en
ambas líneas celulares de cáncer C-26 y
OV-1063 (Tabla 1).
El reemplazo de un grupo NH_{3} por una amina
planar aromática (4-picolina) para dar
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-picolina)]
o por una amina no planar alifática (piperidina) para dar
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)] (1) aumentó
la actividad citotóxica respecto del transplatino (Tabla 1). Debe
observarse que el complejo (1) fue más citotóxico que el derivado
[trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-picolina)],
lo que sugiere que la activación de la posición trans puede
lograrse mediante ligandos amina estéricamente impedidos. La
piperidina está más estéricamente impedida que la
4-picolina debido a los átomos de hidrógeno que
apuntan en direcciones opuestas a diferencia de los hidrógenos
planares del anillo aromático de la 4-picolina, lo
que puede estar correlacionado con la actividad citotóxica.
Además, el reemplazo del segundo NH_{3} en
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-picolina)]
con piperidina para dar la
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
mixta (5) aumentó la citotoxicidad del compuesto en un factor
2-3 (Tabla 1). Esta observación puede explicarse por
una estructura más impedida estéricamente del complejo (5). La
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
fue 3 veces menos activa que el cisplatino y los valores superiores
de IC_{50} de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
fueron coherentes con el nivel inferior de los aductos
Pt-ADN según se muestra en las Figs. 1A y 1B.
La citotoxicidad de los compuestos estéricamente
impedidos de la geometría trans se comparó con la de sus
contrapartidas
cis-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-picolina)]
y cis-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)] (7). En
oposición al efecto del reemplazo de un NH_{3} en los nuevos
complejos trans-Pt, un reemplazo similar de un NH_{3} del
cisplatino por un ligando de tipo amina planar aromática
(4-picolina) o por una amina no planar alifática
(piperidina) dio como resultado una actividad citotóxica inferior en
comparación con el propio cisplatino. El complejo
cis-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)] es un análogo
de la nueva
cis-[Pt(NH_{3})(2-picolina)] activa
(AMD473), un nuevo compuesto antitumoral estéricamente impedido
diseñado para sortear la resistencia a los fármacos de platino y
está actualmente en etapa de ensayos clínicos ^{(26)}.
También se determinó la citotoxicidad de varios
de los complejos de Pt que contienen piperazina sobre líneas
celulares de cáncer sensibles y resistentes al cisplatino. En
particular, se emplearon tres pares de líneas celulares sensibles y
resistentes al cisplatino (A2780/A2780cisR, 41M/41McisR y
CH1/CH1cisR).
Los complejos se incubaron durante 24 horas con
las líneas celulares antes mencionadas y se evaluó la supervivencia
celular en cultivos tratados con el compuesto mediante el
procedimiento MTS (microcultivo con tetrazolio) según lo informado
previamente. Los resultados de los estudios de IC_{50} se muestran
en la Tabla 2A-2B.
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\vskip1.000000\baselineskip
En términos de SAR, el reemplazo de uno o ambos
ligandos amina del transplatino con piperazina aumenta marcadamente
la actividad antitumoral con respecto al transplatino indicando que
el ligando amina no planar con carga positiva (piperazina) puede
activar la geometría trans. La característica más
sorprendente de estos estudios de citotoxicidad es que los
complejos son al menos tan activos como el cisplatino contra la
línea celular A2780cisR que es resistente a través de la
reparación/tolerancia aumentada del ADN y los niveles elevados de
GSH. Son especialmente evidentes los factores de resistencia (RF)
muy bajos de trans-[PtCl_{2}(NBA)(pz)]\cdotHCl (10)
contra las tres líneas celulares (RF < 2), lo que indica la
eficiente solución temporal de la resistencia al cisplatino.
Una posible explicación para el aumento de la
actividad antitumoral de estos complejos de transplatino es que los
ligandos estéricamente impedidos pueden disminuir la destoxificación
por tioles. La reducción de la reactividad hacia tioles y tioéteres
biológicos (proteínas y péptidos) se considera beneficiosa ya que se
cree que la reacción del cisplatino con ligandos biológico que
contienen azufre está en la fuente de resistencia adquirida y los
efectos colaterales tóxicos del fármaco.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de determinar la acumulación de fármaco en
células tumorales, se expusieron células C-26 y
OV-1063 a los compuestos citotóxicos
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(5) y
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)\cdotHCl]
(13) durante 24 horas y se compararon con la captación
farmacológica de cisplatino y transplatino en condiciones
idénticas. El contenido de Pt asociado con las células se midió por
Espectroscopía de Absorción Atómica (AAS). Se descubrió que
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(5) penetra las células muy eficientemente en ambas líneas
celulares (6 veces más que el cisplatino), según se muestra en la
Fig. 1A.
También, en comparación con el transplatino la
penetración de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(5) fue 7 veces mayor en células OV-1063 y 30 veces
mayor en células C-26, según se muestra en la Fig.
1B. Se observó un incremento dependiente del tiempo en la
acumulación de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
(5) durante las 4 (datos no mostrados) a 24 horas de exposición del
fármaco. La acumulación de Pt dependiente del tiempo en las células
fue consistente con la reducción en los valores de IC_{50} (Tabla
1). El trans-[PtCl_{2}
(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl (13) mostró los
mayores valores de penetración en ambas líneas celulares (22 veces
mayor en comparación con el cisplatino) (Figs. 1A y 1B).
Para determinar la platinación del ADN celular,
se expusieron células C-26 y OV-1063
a estos complejos de transplatino durante 4 horas o 24 horas y se
compararon con el cisplatino y se midió el contenido de platino en
el ADN mediante un espectrómetro AA. La platinación de ADN con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
fue la misma que la del Cis-Pt en células
C-26 y OV-1063 y los valores de
moléculas de Pt intercaladas con ADN del complejo
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
fueron 7 veces mayores que los de Cis-Pt en ambas
líneas celulares (Figs. 2A y 2B).
También se examinó la formación de platinación
de ADN de timo de ternera. Con este fin, se incubó ADN de timo de
ternera con diferentes compuestos (Tabla 3) en los que se
determinaron los siguientes parámetros:
t1/2 - tiempo medio (en minutos) de la unión de
los compuestos al ADN de timo de ternera en NaClO_{4} 10 mM, a
37ºC, r_{i}= 0,08 determinado por polarografía de pulso
diferencial;
\Delta_{\Delta\varepsilon max} - el máximo
de la banda CD positiva a aproximadamente 275 nm, la diferencia
entre el control y el ADN de timo de ternera platinado;
\DeltaT_{m} - la diferencia en la
temperatura de fusión del ADN de timo de ternera platinado y no
platinado;
desenrollado - el ángulo de desenrollado por
aducto;
%IEC/aducto - frecuencia de entrecruzamientos
interhebra.
Tal como se puede observar, tanto los complejos
que contienen piperazina como los que contienen piperidina se unen
al ADN a una velocidad considerablemente mayor que el
cisplatino.
Se utilizó EtBr, como sonda fluorescente, para
distinguir entre perturbaciones inducidas en el ADN por aductos de
compuestos de platino (II) (^{14}). La unión al EtBr por
intercalación se bloquea en forma estequiométrica por formación de
los aductos bifuncionales, a partir de Cis-Pt, lo
que da como resultado una pérdida de intensidad de fluorescencia.
Por otra parte, la formación de aductos monofuncionales solamente da
como resultado una leve disminución de la fluorescencia del
EtBr.
Las mediciones de platinación de ADN del ADN
modificado por
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
mostraron una disminución considerable en la fluorescencia que
concuerda con la formación de aductos bifuncionales. Por otra
parte, la disminución de intensidad de fluorescencia por aductos de
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
fue menor que la del cisplatino, aunque mayor que la del
transplatino. El mejor aducto se formó con
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(Tabla 4 y también en la Fig. 3).
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La conclusión extraída de este modo fue que
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)
forma aductos monofuncionales y también bifuncionales que son
capaces de inhibir la intercalación de EtBr en el ADN y, por ello,
disminuir la intensidad de fluorescencia del EtBr.
Además, el ADN incubado con
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(3) durante 24 horas mostró disminución considerable en la
fluorescencia del EtBr (levemente mayor que la del cisplatino)
(Fig. 4). La diferencia entre el complejo (3) y
cis-DDP fue mayor a baja concentración, lo que
sugiere que el complejo (3) posee mayor afinidad por el ADN. La
disminución de la intensidad de fluorescencia por los aductos de
cis-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdotHCl (8)
fue similar a la del cisplatino (Fig. 4).
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La apoptosis, también conocida como muerte
celular programada, está involucrada en la regulación del número de
células en el organismo pluricelular, y la patogénesis de varias
enfermedades, incluyendo el avance tumoral, trastornos
neurodegenerativos e infecciones virales. Se ha demostrado en la
mayoría de los tipos celulares que la fosfatidilserina (PS), un
lípido normalmente confinado a la hojuela interna de la membrana
plasmática de la célula normal. En la célula que sufre apoptosis la
PS se exporta a la hojuela externa de la membrana plasmática en la
etapa temprana de la apoptosis. La exposición a PS en células
C-26 y OV-1063 tratadas se detectó
por tinción con MC 540, que posee una fuerte afinidad respecto de PS
y se evaluó la condensación de la cromatina tiñendo con DAPI, que
tiñe preferentemente el ADN de doble hebra.
Se observaron características distintivas de la
apoptosis en células OV 1063 tratadas con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
según lo evidenciado por la aparición de fluorescencia roja en la
membrana celular y una creciente fluorescencia verde del núcleo en
oposición a las células no tratadas sin color rojo (resultados no
mostrados). Los resultados de esta tinción demostraron que una gran
proporción de las células OV-1063 parecieron ser
apoptóticas después de 5 horas de tratamiento con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
6,5 \muM. La superficie celular de las células
C-26 adquirió una leve fluorescencia roja después de
5 horas de tratamiento con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
4,5 \muM (resultados no mostrados) en oposición a ninguna
fluorescencia roja en las células no tratadas (resultados no
mostrados).
Recientemente, se ha descubierto que miembros de
la familia de proteasas caspasas (CED-3/ICE) son
mediadores cruciales de los complejos eventos bioquímicos asociados
con la apoptosis(^{27}). En particular, se ha demostrado
que la activación de la caspasa-3, que escinde un
número de diferentes proteínas, incluyendo la
poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), la
proteína quinasa C\delta y la actina, es importante para la
iniciación de la apoptosis (^{28}). De este modo, se midió la
activación de la caspasa-3 en células
C-26 y OV-1063 tratadas con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)].
Se descubrió que las células OV-1063 tratadas
durante 5 horas con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
6,5 \muM o con
trans-[PtCl_{2}[(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
7,5 \muM activaron la caspasa-3 (incremento de
\sim2 veces en la fluorescencia en células tratadas en comparación
con células no tratadas). Además, después de 16 horas de
tratamiento de células OV-1063 con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
o con
trans-[PtCl_{2}[(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
hubo un incremento de tres veces en la fluorescencia en las células
tratadas en comparación con las células no tratadas (no se
muestra).
Para confirmar que la señal fluorescente
observada se debía a la activación de la caspasa-3,
se añadió el inhibidor Ac-DEVD-CHO
reversible de proteasas similares a la caspasa-3 a
las muestras de control y a las muestras tratadas. Se descubrió una
drástica disminución en la señal fluorescente en las muestras
tratadas con el inhibidor
Ac-DEVD-CHO (no se muestra), lo que
da argumentos en favor de la activación específica de la
caspasa-3. No se encontró señal fluorescente en las
células C-26 tratadas con
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)]
4,5 \muM.
Para determinar si las células
OV-1063 o C-26 tratadas con
cisplatino sufren apoptosis, estas líneas celulares fueron tratadas
durante 5 o 16 horas con concentraciones 2 \muM o 1,5 \muM,
respectivamente. No se encontró ninguna señal fluorescente en las
células OV-1063 o células C-26
tratadas con cisplatino. Estos descubrimiento concuerdan con los
datos de L. Szmigiero et al. que demostraban que no hay ADN
degradado detectado por electroforesis en gel de agarosa en células
L 1210 tratadas con cisplatino (^{29}). También esto concordó con
varios descubrimientos que han demostrado que las células de cáncer
de colon se auto-protegen segregando un
factor(es) soluble(s) que inhibe(n)
la apoptosis (^{30})y mediante la activación aberrante de c-kit que protege a las células de carcinoma de colon de la apoptosis.
la apoptosis (^{30})y mediante la activación aberrante de c-kit que protege a las células de carcinoma de colon de la apoptosis.
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Debido a que la mayoría de los derivados de
platino(II) que se administran por vía intravenosa se unen a
proteínas dentro de las 24 horas, se determinó la cinética de unión
de dos proteínas modelo, la Ubiquitina (PM 8565) y la Mioglobina
Cardíaca (PM 16951), a complejos de Pt. Para este fin, se llevó a
cabo una reacción 1:1 entre los complejos de platino y las
proteínas en concentraciones de 1-2 mM, en tampón de
fosfato 10 mM, pH 6,4 a 37ºC. Se midieron las cinéticas de unión a
las proteínas directamente sobre las mezclas de reacción, por
Espectrometría de Masas con Ionización por Electroaspersión
(ESI-MS). La Figura 5 muestra que mientras la
trans-PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina) neutra se une
rápidamente a las proteínas, seguida, con respecto a la velocidad
de unión, por el cisplatino y el transplatino, los complejos de
piperazina cargados no produjeron ninguna unión considerable a las
proteínas. La combinación de unión muy rápida al ADN con unión
ineficiente y lenta a las proteínas es una propiedad muy deseable
de un fármaco antitumoral a base de platino.
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Se descubrió que el
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
y el cis-DDP eran no tóxicos a la concentración de 5 mg/kg, y
que el
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl
era no tóxico a la concentración de 20 mg/kg.
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Se inyectaron por vía i.p. ratones BALB/C hembra
(en el intervalo de peso de 17-20 g) con 1x10^{6}
células de carcinoma de colon C-26. La viabilidad de
esas células era >90% por exclusión de azul tripán.
Se estudió la eficacia terapéutica del
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
y se comparó con el cisplatino. El tratamiento fue realizado
conforme al cronograma descrito más arriba. Los resultados se
presentan en la Tabla 5 y en la Fig. 6.
Se disolvió
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(10 mg/ml) en NaCl al 0,9% a 65ºC y se dejó a esta temperatura
durante 1 hora. Se disolvieron lípidos
(HSPC:colesterol:PEG^{2000}-DSPE 51:44:5) en
etanol. Se hidrataron los lípidos añadiendo esta solución etanólica
a la mezcla del fármaco. La concentración final de lípidos fue 150
mg/ml (15%) en etanol al 25%, a 65ºC. La mezcla se mantuvo en
agitación durante 1 hora a 65ºC, después se extruyó a 65ºC, 5 veces
a través de filtros de policarbonato de 25 mm con tamaño de poro de
200 nm utilizando una extrusora Lipex (Nothern Lipids Inc,
Vancouver, Canadá), seguido de extrusión 11 veces a través de un
filtro de policarbonato de tamaño de poro de 100 nm. Se permitió que
los liposomas de dimensiones adecuadas (\sim100 nm) se enfriaran
hasta temperatura ambiente. Durante el enfriamiento, se formó un
precipitado pesado, y se recolectó el sobrenadante. Después se
enfrió el sobrenadante a 4ºC durante toda la noche y se recolectó
el sobrenadante nuevamente. Se recolectó el sobrenadante y se
dializó contra tampón de histidina 10 mM (pH=6,5) que contenía
sacarosa al 10% y NaCl 1 mM un total de 5 veces contra 100
volúmenes de tampón y 1 vez contra 200 volúmenes a 4ºC. En estas
condiciones, debe producirse una equilibración completa con el
tampón. La dispersión final de liposomas fue blanca translúcida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se caracterizaron los liposomas en cuanto a su
distribución de tamaños a 25ºC mediante dispersión dinámica de luz
(DLS) con un Coulter modelo N4 SD (Coulter Electronics, Hialeah, FL,
EE.UU.).
La concentración de los fosfolípidos (PL) se
controló mediante el contenido de fósforo en los lípidos
(procedimiento de Bartlett modificado) ^{(31)}.
La concentración de platino en los liposomas se
midió mediante un espectrómetro de absorción atómica sin llama de
Zeeman (FAAS). La concentración de platino se calculó conforme a una
curva de calibración que incluyó 5 estándares de solución patrón de
K_{2}PtCl_{4} con concentraciones que variaban de 50 a 250 ng de
platino por ml.
Se caracterizaron los SSL que contenían
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
mediante los siguientes parámetros: Tamaño - 102 nm; Concentración
de
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
en la formulación: 1 mM; Concentración de lípidos en la formulación:
94 mM; y porcentaje de encapsulación (relación Pt/Pl en
liposomas/relación inicial Pt/Pl x 100) = 8%.
\vskip1.000000\baselineskip
El glutatión que contiene azufre (GSH) se conoce
como un fuerte platinófilo. Por eso se eligió para los experimentos
de liberación del platino del liposoma. Su rápida reacción con el
platino y el fuerte desplazamiento químico que la unión de su
azufre induce sobre el ^{195}Pt-RMN nos permitirá
detectar solamente el diaminodicloroplatino en el intervalo de
interés. Un derivado activo con carga positiva fue el
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl
(3).
Todos los espectros de RMN se registraron en un
espectrómetro Varian Inova de 500 MHz utilizando una sonda
conmutable de 5 mm. Los espectros de ^{195}PtRMN se referenciaron
externamente respecto de K_{2}PtCl_{4} en HCl (-1624 ppm).
\vskip1.000000\baselineskip
A 0,5 ml de la suspensión de liposomas (0,5
mg/ml) en tubo de RMN, se añadieron 2 eq. de glutatión (GSH) y la
suspensión se agitó enérgicamente durante 2 minutos. El ensayo de
^{195}Pt-RMN indicó que el complejo dentro del
liposoma estaba intacto (\delta= -2134.597 ppm). La muestra se
dejó a 37ºC. Se realizó el seguimiento de
^{195}Pt-RMN después de 1, 2 y 7 días. En los
primeros 2 días el resto de platino estaba intacto. La
^{195}Pt-RMN que se realizó en el séptimo día
reveló la total desaparición del desplazamiento químico
característico del resto diamminodicloroplatino(II).
Para evaluar el efecto de (GSH) sobre la
liberación del fármaco con platino se repitió el anterior
experimento sin GSH. La ^{195}Pt-RMN reveló que el
complejo está intacto en el interior aun después de 10 días a 37ºC
(\delta= -2132,585 ppm) con un producto menor a \delta=
-2661,428 ppm.
En síntesis, los resultados indicaron claramente
que se libera el complejo cargado
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidino-piperidina)]\cdotHCl,
en oposición al cisplatino. La desaparición total del
desplazamiento químico característico del
diamminodicloroplatino(II) significa que los ligandos en la
esfera de coordinación han cambiado. No obstante, el hecho de que no
se evidencie ningún cambio en el experimento libre de GSH no es un
indicio de falta de liberación. Para eso la solución exterior debe
filtrarse y deben utilizarse absorción atómica (AA) y (si es
posible) ^{195}Pt-RMN a fin de verificar la
existencia del resto platino fuera del liposoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Continuando con los esfuerzos por sintetizar
complejos de platino no clásicos, se sintetizaron complejos de
bisplatino tetra-funcionales cargados positivamente
de acuerdo con el siguiente esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
cis-PtCl_{2}(BOC-Pz)_{2} (1
g, 2,41 mmol) en 20 ml de DDW. A la mezcla agitada, se añadieron 2
eq. (0,9 g, 4,84 mmol) de 1-piperazincarboxilato de
ter-butilo y la mezcla se calentó a 70ºC. La agitación y
calentamiento continuaron durante 50 minutos, después se recolectó
el precipitado amarillo y se lavó dos veces con 40 ml de DDW.
Después del secado, el producto amarillo se caracterizó utilizando
^{195}Pt-RMN(DMF) y se utilizó sin mayor
purificación.
^{195}Pt-RMN(DMF):
\delta= -2239,4 ppm, -2267,8 ppm
\vskip1.000000\baselineskip
En la oscuridad, se disolvió
cis-PtCl_{2}(Boc-Pz)_{2}
(538 mg, 1 mmol) en 50 ml de DMF. A la solución amarilla agitada,
se añadió 1 eq. (169,88mg, 1 mmol) de nitrato de plata y la mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La
^{195}Pt-RMN(DMF) indicó la formación del
mono-nitrato/DMF mono-cloro
diaminoplatino(II) (\delta=-2002,987 ppm, -2123,995) con
pocas trazas de material de partida a (\delta=-2240,477 ppm). En
esta etapa el precipitado de AgCl se filtró y se añadió 0,5 eq. (110
mg, 0,5 mmol) de
4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiamina.
La mezcla se agitó en la oscuridad durante toda la noche. La
^{195}-RMN(DMF) mostró la formación del
mono-cloro-triamino platino
(\delta= -2542,974 ppm, -2570,911 ppm). El filtrado amarillento se
tomó y los disolventes se evaporaron a presión reducida hasta
sequedad. La goma se disolvió en 20 ml de etanol y se añadió 1 ml de
ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se agitó a temperatura
ambiente hasta la solubilización total, y después la temperatura se
elevó hasta reflujo durante 50 minutos. A lo largo de este período
de tiempo se formó el precipitado amarillento. Se permitió que la
mezcla de reacción se enfriara a temperatura ambiente y se recolectó
el precipitado, se lavó con 20 ml etanol y se secó.
^{195}Pt-RMN(H_{2}O):
\delta= -2224,396 ppm, -2238,142 ppm, -2248,194 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (20)
1. Un complejo de platino en la configuración
trans de fórmula general (I):
(I)[Pt(X)(Y)(Am_{1})(Am_{2})]
en la
que:
- -
- X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, representan un grupo halógeno, carboxilato, fosfato o sulfato;
- -
- Am_{1} representa una amina seleccionada de amoniaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina alifática heterocíclica no planar o una amina aromática heterocíclica; y
- -
- Am_{2} representa una amina alifática heterocíclica no planar;
a condición de que se excluyan
trans-[Pt(piperidina)_{2}Cl_{2}] y
trans-[Pt(morfolina)_{2}Cl_{2}].
\vskip1.000000\baselineskip
2. El complejo de la reivindicación 1, en la
forma de un dímero en el que cada unidad monomérica es un complejo
de Pt según se define en la reivindicación 1, unido a otro complejo
de Pt, independientemente, a través del grupo Am_{1} o a través
del grupo Am_{2} o a través de un ligador conectado a dicho
Am_{1} o Am_{2}.
3. El complejo de la reivindicación 1 o 2, en el
que dichos X e Y son iguales o diferentes y representan cloruro o
yoduro.
4. El complejo de la reivindicación 3, en el que
dichos X e Y representan ambos un cloruro.
5. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho Am_{1}
representa amoniaco.
6. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho Am_{1}
representa una amina primaria seleccionada de metilamina, etilamina,
n-propilamina, isopropilamina,
n-butilamina, n-hexilamina,
n-heptilamina o n-nonilamina.
7. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho Am_{1}
representa una amina secundaria seleccionada de dimetilamina,
dietilamina, dipropilamina, dibutilamina.
8. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho Am_{1}
representa una amina alifática heterocíclica no planar seleccionada
de piperazina, 2-metilpiperazina, piperidina, 2-, 3-
o 4-hidroxipiperidina,
4-piperidino-piperidina,
pirrolidina, 4-(2-hidroxietil)piperazina y
3-aminopirrolidina.
9. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicho Am_{1}
representa una amina aromática heterocíclica seleccionada de
piridina, 2-, 3- o 4-aminopiridina, 2-, 3- o
4-picolina, quinolina, 3- o
4-aminoquinolina, tiazol, imidazol,
3-pirrolina, pirazina,
2-metilpirazina,
4-aminoquinaldina.
10. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que dicho Am_{2}
representa una amina heterocíclica no planar seleccionada de
piperazina, 2-metilpiperazina, piperidina, 2-, 3- o
4-hidroxipiperidina,
4-piperidino-piperidina,
pirrolidina, 4-(2-hidroxietil)piperazina y
3-aminopirrolidina.
11. El complejo de la reivindicación 1,
seleccionado de
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperidina)];
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-hidroxipiperidina)];
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4-piperidino-piperidina)];
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(4,4'-bipiperidina)];
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperidina)];
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})(piperazina)]\cdotHCl;
trans-[PtCl_{2}(isopropilamina)(piperazina)]\cdotHCl;
trans-[PtCl_{2}(n-butilamina)(piperazina)]\cdotHCl;
trans-[PtCl_{2}(n-nonilamina)(piperazina)]\cdotHCl
trans-[PtCl_{2}(piperidina)(piperazina)]\cdotHCl;
trans-[PtCl_{2}(4-picolina)(piperazina)]\cdotHCl;
trans-[PtCl_{2}(piperazina)(piperazina)]\cdotHCl;
y
trans-[PtCl_{2}(NH_{3})[4-(2-hidroxietil)piperazina)]\cdotHCl.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El complejo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, estando cargado
positivamente.
13. El complejo de la reivindicación 2, en el
que dicho ligador comprende una cadena de
4,7,10-trioxa-1,13-tridecano.
14. El complejo de la reivindicación 13, que es
Bis-[{trans,trans-(PtCl_{2}piperazina)_{2}}(4,7,10-trioxa-1,13-tridecan-
diamina)]\cdot2HCl.
diamina)]\cdot2HCl.
15. Una composición farmacéutica que comprende
un vehículo farmacéuticamente aceptable y como principio activo una
cantidad terapéuticamente efectiva de un complejo de platino (Pt) de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-14.
16. La composición de la reivindicación 15, para
lograr un efecto terapéutico, comprendiendo el efecto terapéutico
formar un aducto entre dicho complejo de Pt y ADN.
17. La composición de la reivindicación 15, para
lograr un efecto terapéutico, comprendiendo el efecto terapéutico
inhibir la proliferación celular no deseada.
18. La composición de la reivindicación 17 para
inducir la apoptosis de células no deseadas.
19. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, cargada en un liposoma.
20. Un complejo de platino definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso
como agente anti-cáncer.
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