JP2005501859A - 白金錯体及びガンの処置におけるそれらの使用 - Google Patents
白金錯体及びガンの処置におけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、アミンリガンドの少なくとも１つが非−平面状複素環式脂肪族アミンである新規な白金錯体に関する。白金錯体はトランス又はシス立体配置にあることができ、治療的活性を有することが見出された。かくして本発明は新規な白金錯体、それらを含む製薬学的組成物及びそれらの他の使用に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な白金錯体及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチン、シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）２］は多様な充実性腫瘍の処置において最も広く用いられる３つの臨床的薬剤の１つである（非特許文献１）。それはＤＮＡに、主に同じ鎖上の２つの隣接するグアニンに不可逆的に結合し、ＤＮＡにおける屈曲を誘導し、それがシスプラチン−改変ＤＮＡに結合する細胞タンパク質により認識されることにより腫瘍細胞を殺すと思われる（非特許文献２）。アポトーシス及び結果としての細胞死の誘導を担うのはＰｔ−ＤＮＡ付加物である（非特許文献３）。精巣及び卵巣腫瘍を含む種々の腫瘍性疾患の処置におけるその有効性にかかわらず、その臨床的有用性はその低い溶解度、毒性及び特に腫瘍の耐性により制限される（非特許文献４）。カルボプラチン（Ｐｔ（ＣＢＤＣＡ）（ＮＨ３）２，ＣＢＤＣＡ＝１，１−シクロブタンジカルボキシレート）のような第二世代薬剤は腎毒性の低下を示すが、おそらくそれらがシスプラチンが生成すると同じ範囲のＤＮＡ付加物を生成するという事のために、腫瘍の耐性を克服できない（非特許文献５）。
【０００３】
耐性の克服は新規な白金薬剤の開発における主な目標の１つであり、従って古典的な構造−活性関連性（ＳＡＲ）から離れる新規な化合物が設計され、合成され、スクリーニングされてきた（非特許文献６）。Ｃｌｅａｒｅ及びＨｏｅｓｃｈｅｌｅにより最初に公式化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＳＡＲは医化学者に、シス立体配置における２個の不活性リガンド及び２個の半−不安定離脱基を有する中性白金（ＩＩ）錯体の製造に彼らの努力を向けるように影響を与えた（非特許文献７）。
【０００４】
２個の離脱基のシス立体配置がシス−ジアミンジクロロ白金（シス−ＤＤＰ）の抗−腫瘍活性に必須であることは一般的に受け入れられた。これは、Ａｍ１、Ａｍ２＝ＮＨ３又は平面状アミンリガンド、例えばキノリン、チアゾール、ピリジン又はベンゾチアゾールであるトランス−ＰｔＣｌ２（Ａｍ１）（Ａｍ２）、（例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（チアゾール）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（キノリン）］及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ベンゾチアゾール）］）における１個もしくは両方のＮＨ３リガンドの置き換えがトランス形の細胞毒性を実質的に強化することをｆａｒｒｅｌｌ等が報告するまで２０年以上もの間の状況であった（非特許文献８）。
【０００５】
さらにＮａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｇｅｒ及び共同研究者等は、トランス−ＰｔＣｌ２［ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］［ＮＨ（ＣＨ３）２］が興味深い薬理学的性質を有することを示し（非特許文献９）、Ｎａｔｉｌｅ等はトランス−ＰｔＣｌ２（イミノエーテル）２もいくつかのヒトガン系に対して活性であることを報告した（非特許文献１０）。臨床試験の２期にある非−古典的錯体の他の例は、四重に帯電したカチオンである３核Ｐｔ錯体ＢＢＲ３４６４である（非特許文献１１）。
【０００６】
非−古典的白金化合物の重要性は、シスプラチン及びカルボプラチンにより形成される付加物と別個の範囲のＤＮＡ付加物を形成するようにそれらが設計され、従ってそれらが後天的Ｐｔ耐性を妨げることができるという事実に由来する（非特許文献１２）。
【０００７】
一般にトランス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）類似体は、それらのシスの相手より低い水溶液中における溶解度を有し、限られたバイオアベイラビリティーを生ずる。水溶解度を向上させる１つの方法は錯体に電荷を加えることによる方法である。Ｆａｒｒｅｌｌ等は、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）の型の化合物の劣った水溶解度の克服においていくらかの努力をしたが、ＮＨ３及び平面状リガンドのトランス配向及び四角形−平面状物（ｓｑｕａｒｅ−ｐｌａｎａｒ ｅｎｔｉｔｙ）の電気的中性性を保持した。トランス−白金錯体、トランス−［ＰｔＣｌ（ＰｙＡｃ−Ｎ，Ｏ）（ＮＨ３）］（ＰｙＡｃ＝ピリジン−２−イルアセテート、Ｎ−ドナーはトランス）及びそのシス異性体が合成され、トランス異性体は類似錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）と比較して水中における溶解度の向上を示した（約４〜５ミリモルＬ−１）（非特許文献１３）。他方、Ｆａｒｒｅｌｌ等により、及びまたＨｏｌｌｉｓ等により製造される白金錯体のカチオン性電荷は金属中心上にあり、アニオン性クロリドリガンドの１つの中性リガンドによる置換から生ずる（非特許文献１４）。
【非特許文献１】
Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｅ．Ｒ． ＆ Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ＤＮＡ Ａｄｄｕｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４６７−２４９８
【非特許文献２】
Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．＆ Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，１−２１
【非特許文献３】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｖ．Ｍ．；Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ａｌｏｎｓｏ Ｃ．；Ｐｅｒｅｚ Ｊ．Ｍ．著，Ｉｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｌｗａｙｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ？ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，５９，４，６５７−６３
【非特許文献４】
Ｋａｒｔａｌｏｕ Ｍ，Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ ＪＭ．著，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，２３−４３
【非特許文献５】
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｏｎ，Ｔ．Ｌ．＆ Ｒｅｅｄ，Ｅ．著，Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃ．１９９３，５０，２，１４７−１５８
【非特許文献６】
Ｗｏｎｇ，Ｅ．＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ｃ．Ｍ．著，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｄｒｕｇｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４５１−２４６６
【非特許文献７】
Ｃｌｅａｒｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｏｅｓｃｈｅｌｅ，Ｊ．Ｄ．著，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｒｏｕｐ ＶＩＩＩ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｎｉｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，２，１８７−２１０
【非特許文献８】
Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．；Ｑｕ，Ｙ．；Ｈａｍｂｌｅｙ，Ｔ．Ｗ．；Ｐｅｒｏｕｔｋａ，Ｊ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｌ．；Ｄｏｅｄｅｅ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）Ｌ］（Ｌ＝Ｐｌａｎａｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ ａｎｄ Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ Ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌｌｙ Ｐｌａｔｉｎａｔｅｄ ＤＮＡ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；３８，１５，３５３５−３５４２
【非特許文献９】
Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｅ．Ｉ．；Ｄｉａｚ，Ｓ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖａｄｉｌｌｏ，Ａ．Ｍ．；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．＆ Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．著，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｖｅｌ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ（２）（ａｍｉｎｅ）（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）］ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，２０，４２６４−４２６８
【非特許文献１０】
Ｃｏｌｕｃｃｉａ，Ｍ．；Ｎａｓｓｉ，Ａ．；Ｂｏｃｃａｒｅｌｌｉ，Ａ．；Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｄ．；Ｃａｒｄｅｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｎ．；Ｌｏｃｋｅｒ，Ｄ．；Ｌｅｎｇ，Ｍ．；Ｓｉｖｏ，Ｍ．；Ｉｎｔｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．；＆ Ｎａｔｉｌｅ，Ｇ．著，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｌｉｇａｎｄｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，３１−３５
【非特許文献１１】
Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｒｏｕｔｋａ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｆａｒｒｅｌｌ著，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，５１−５７
【非特許文献１２】
Ｋｅｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｒ；Ｓｈａｒｐ，Ｓ．Ｙ．；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｃ．Ｆ．；Ｒａｙｎａｕｄ，Ｆ．Ｉ．；Ｂｅａｌｅ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｓｏｎ，Ｉ．著，Ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，Ｉ １−２，１１１−１１５
【非特許文献１３】
Ｂｉｅｒｖａｃｈ，Ｕ．；Ｓａｂａｔ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．著，Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｎｅｖｅｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｎ，Ｏ−Ｄｏｎｏｒ Ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００；３９（９）；１８８２−１８９０
【非特許文献１４】
Ｈｏｌｌｉｓ，Ｌ Ｓ；Ａｍｕｎｄｓｅｎ，Ａ Ｒ；Ｓｔｅｒｎ，Ｅ Ｗ．著，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒｓ：ｃｉｓ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（Ｎ−ｄｏｎｏｒ）Ｃｌ］＋，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８９，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １２８−１３６
【発明の開示】
【０００８】
発明の概略
本発明は、その側面の第１に従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
を有する新規な白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金錯体に関する。
【０００９】
本発明のＰｔ−錯体はダイマーの形態にあることができ、そこにおいて各モノマー単位は、独立してＡｍ１リガンドを介して又はＡｍ２リガンドを介して又は該Ａｍ１もしくはＡｍ２に連結したリンカーを介して他のＰｔ−錯体に結合した定義されている通りのＰｔ−錯体である。
【００１０】
他の側面に従い本発明は、製薬学的に許容され得る担体ならびに活性成分として一般式：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
のＰｔ錯体であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできないＰｔ錯体の治療的に有効な量を含む製薬学的組成物に関する。
【００１１】
製薬学的組成物はモノマーの形態における、又は上記で定義したダイマーの形態における本発明のＰｔ−錯体を含むことができる。
本発明は、必要のある患者に治療的効果を達成するのに十分な量の白金錯体（モノマー又はダイマーの形態における）を投与することを含み、Ｐｔ錯体が一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示し、
但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない］
を含む治療的効果を達成するための方法にも関する。
【００１２】
図の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｂは、Ｃ−２６ガン細胞（図１Ａ）又はＯＶ−１０６３ガン細胞（図１Ｂ）によるシスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−ｏ−）の吸収を示す。Ｐｔ含有量は原子吸光分析法（ＡＡＳ）により決定された。
【００１３】
図２Ａ〜２Ｂは、Ｃ−２６ガン細胞（図２Ａ）又はＯＶ−１０６３ガン細胞（図２Ｂ）におけるシスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−ｏ−）のＤＮＡ白金化レベルを示す。Ｐｔ含有量は原子吸光分析法（ＡＡＳ）により決定された。
【００１４】
図３は、シスプラチン（−：−）；トランスプラチン（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−ｘ−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−？−）により改変された種々の濃度のＤＮＡへのＥｔＢｒ蛍光の依存性を示す。データ点は三重に測定され、それは平均で±３％変動した。
【００１５】
図４は、ＩＣ５０値のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（６．５μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（４−ｐｉｃ）（ｐｉｐ）］）、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（それぞれ７．５μＭ又は６．５μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（４−ｐｉｃ）（ｐｚ）］・ＨＣｌ）、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（それぞれ４μＭ又は６μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ｐｉｐｏ−ｐｉｐ）］・ＨＣｌ）又はシスプラチン（それぞれ２μＭ又は１μＭ）で処理されたＯＶ−１０６３細胞における、未処理の（標準細胞）と比較されるキャスパーゼ−３−活性を示す。薬剤−処理された細胞及び標準の細胞の両方を次いで回収し、溶解し、キットの案に記載されている通り、指示される長さの時間の後に検定した。
【００１６】
図５は、シスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペリジン）］（−＾−）；及びトランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）へのユビキチンの結合曲線を示す。
【００１７】
図６は、Ｃ−２６結腸ガンが接種され、本明細書下記に記載されるスケジュールに従って処置された雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、シス−ＤＤＰ（−：−）と比較されるトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−：−）の抗腫瘍活性を示す。
発明の詳細な記述
本発明は、Ｐｔ−錯体中に非−平面状複素環式脂肪族アミンリガンドが含まれることが、例えばガン処置の分野において治療的利点を有するという驚くべき発見に基づく。本発明に従うＰｔ−錯体は少なくとも１個の非−平面状複素環式アミンリガンドを含み、それは柔軟性であり且つ水素結合ドナーを有し、それは他の物質と、例えばＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる。リガンドは、得られる錯体の速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高いこともできる。
【００１８】
かくして本発明はその側面の１つに従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金錯体を提供する。
【００１９】
本明細書で用いられる「Ｐｔ−錯体」という用語は、その最も広い意味において、２個のアミン−含有リガンドを含み、少なくとも１個のリガンドが非−平面状複素環式脂肪族アミンであるいずれのＰｔ−錯体をも指す。これらの錯体はシス及びトランス位置異性体の両方を含む（但し、錯体がシス立体配置にある場合、２個のアミンリガンドは同時にはピペリジンを示さない）。Ｐｔ−錯体は、金属中心として配位されたＰｔ（ＩＩ）又は配位されたＰｔ（ＩＶ）を含むことができる。さらにＰｔ−錯体はダイマーの形態にあることができ、そこにおいて各モノマー単位は、独立してそのアミンリガンドの１つを介して直接、あるいは該Ａｍ１又はＡｍ２に連結したリンカーを介して他のＰｔ−錯体に結合している上記で定義されたＰｔ−錯体であり、２個のアミンリガンドは一緒になって、窒素結合を介してそれぞれのＰｔ金属と配位するピペリジン環のような環式環を形成することもできる。
【００２０】
好ましい態様に従うと、Ｘ及びＹは同一もしくは異なり、クロリド又はヨーダイドを示し、より好ましくはＸ及びＹは両方ともクロリドを示す。
【００２１】
本発明に従うと、Ａｍ１はアンモニア；これらに限られるわけではないがメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、ｎ−ヘプチルアミン又はｎ−ノニルアミンのような第一級アミン；これらに限られるわけではないがジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミンのような第二級アミン；これらに限られるわけではないがピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンのような非−平面状複素環式脂肪族アミン；あるいはこれらに限られるわけではないがピリジン、２−、３−もしくは４−アミノピリジン、２−、３−もしくは４−ピコリン、キノリン、３−もしくは４−アミノキノリン、チアゾール、イミダゾール、３−ピロリン、ピラジン、２−メチルピラジン、４−アミノキナルジンのような複素環式芳香族アミンを示すことができる。
【００２２】
本発明に従うＡｍ２は非−平面状複素環式アミン、例えばこれらに限られるわけではないがピペラジン（本明細書で時々「ｐｚ｝の略字により言及される）、２−メチルピペラジン、ピペリジン（本明細書で時々「ｐｉｐ」の略字で言及される）、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン（本明細書で時々「ｐｉｐ−ｐｉｐ」の略字により言及される）、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンである。
【００２３】
上記で示した通り、本発明のＰｔ−錯体は上記で定義した一般式（Ｉ）を有する錯体のすべての位置異性体を指す。１つの側面に従うと、Ｐｔ−錯体はトランス立体配置にある。特定の例には：
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ヒドロキシピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４，４’−ビピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）２］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ；
が含まれる。
【００２４】
さらに別の側面に従うと、錯体はシス立体配置にある。特定のシス異性体にはシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］又はシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌが含まれるがこれらに限られない。
【００２５】
上記で示した通り、非−平面状複素環式アミンリガンドは柔軟性であり且つＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる水素結合ドナーを有し、得られる錯体の速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高い。さらに、ピペラジンのようなアミンリガンドのいくつかは錯体に正の電荷を与え、かくして十分な水溶解度及びＤＮＡのようなポリアニオン性分子との錯体の迅速な相互作用を保証する。
【００２６】
錯体はダイマーの形態にあることもできる。従って、２個のＰｔ−錯体が原子価結合、各Ｐｔ−錯体のアミン置換基の間で形成される環式環（例えば一緒になってピペラジン環を形成する）を介して、あるいは各錯体のＡｍ１又はＡｍ２リガンドに連結するリンカーにより会合する。リンカーの制限ではない例には短いポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）、短いジアミノアルカン類（例えば１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン）が含まれる。リンカーに関する特定の例は４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン鎖であり、２個のＰｔ−錯体がこのリンカーにより会合している１つの特定のダイマーはビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２ピペラジン）２｝（４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン）］・２ＨＣｌである。
【００２７】
本発明は、製薬学的に許容され得る担体ならびに活性成分として上記で定義した本発明のＰｔ−錯体の治療的に有効な量を含む製薬学的組成物にも関する。
【００２８】
本発明のＰｔ−錯体は優れた医学的慣習に従い、個々の患者の臨床的状態、投与の部位及び方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重及び医療実施者に既知の他の因子を考慮して、投与され、投薬される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａｎｄ ｄｏｓｅｄ）。本明細書の目的のための治療的に「有効な量」は、かくして当該技術分野において既知の考察により決定される。その量は、本発明の活性成分を用いて処置される疾患状態からの生存率の向上又はより迅速な回復あるいは疾患状態と関連する症状の改善もしくは除去ならびに当該技術分野における熟練者により適した尺度として選ばれる他の指標を含むがこれらに限られない改善を達成するのに有効でなければならない。
【００２９】
有効量は典型的には適切に設計される臨床試験（投薬量範囲研究）において決定され、当該技術分野における熟練者は有効量を決定するためにそのような試験をいかにして適切に行なうかを知っているであろう。一般的に既知の通り、有効量はＰｔ−錯体の、例えばＰｔ−ＤＮＡ付加物を形成するためのＤＮＡへの親和性、体内におけるＰｔ−錯体の分布プロファイル、多様な薬理学的パラメーター、例えば体内における半減期を含む多様な因子、もしあるとしたら望ましくない副作用、年齢及び性別などのような因子に依存する。
【００３０】
Ｐｔ−錯体の送達のために多くの投与様式を用いることができ、これらは当該技術分野において既知の通り、種々の担体、添加剤、エリキサーなどの使用を必要とするであろう。
【００３１】
明らかに、本発明に従って用いられる製薬学的に許容され得る担体は一般に、それらがＰｔ−錯体の所望の治療効果を邪魔しないかもしくは妨げず且つ本発明のＰｔ−錯体と反応しない程度までの不活性無毒性固体もしくは液体充填剤、希釈剤又はカプセル封入材料を指す。
【００３２】
Ｐｔ−錯体を経口的に、皮下的に又は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内及び鼻内投与ならびに包膜内投与及び輸液法による投与を含む非経口的に投与することができる。さらに、肺への吸入器を介する送達のためにＰｔ−錯体をクロロフルオロカーボンもしくはヒドロフルオロカーボンプロペラント中に懸濁させることができる。あるいはまた、Ｐｔ−錯体をマトリックス（ラクトースなど）又は担体（例えばリポソームなど）中で調製することができ、それは経口的、舌下的又は座薬による送達を可能にするであろう。
【００３３】
投薬は１回の投薬又は数日間に及ぶ複数回の投薬であることができる。処置は一般に疾患経過の長さ及び活性成分の有効性及び処置されている患者の種に比例する長さを有する。さらに、本発明のＰｔ−錯体の投与は断続的であるか、あるいは漸次的又は連続的、一定の又は制御された割合における患者への投与であることができる。本明細書に記載される白金化合物を用いる治療的処置のための宿主又は患者は一般に哺乳類、例えば人間、犬及びネズミ類などである。
【００３４】
本発明のＰｔ−錯体を非経口的に投与する場合、それは一般に注入可能な単位投薬量の形態で調製されるであろう（溶液、懸濁剤、乳剤）。注入に適した製薬学的調剤には無菌の水溶液もしくは分散液及び無菌の注入可能な溶液もしくは分散液への再構築のための無菌の粉剤が含まれる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、脂質ポリエチレングリコールなど）、それらの適した混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。綿実油、ごま油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ひまわり油又はピーナッツ油ならびにエステル、例えばミリスチン酸イソプロピルのような非水性ビヒクルを本発明のＰｔ−錯体のための溶媒系として用いることもできる。
【００３５】
さらに、抗微生物性防腐剤、酸化防止剤及び緩衝剤を含む本発明のＰｔ−錯体含有組成物の安定性、無菌性及び等張性を増強する種々の添加剤を加えることができる。種々の抗バクテリア剤及び抗菌・カビ剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより微生物の作用の防止を確実にすることができる。
【００３６】
本発明の製薬学的組成物を必要のある患者に経口的に投与することもできる。錠剤、懸濁剤、溶液、乳剤、カプセル、粉剤、シロップなどにおいて活性化合物を投与するような通常の方法が有用である。それを経口的又は静脈内に送達し且つその生物学的活性を保持する既知の方法が好ましい。
【００３７】
１つの好ましい態様に従うと、本発明のＰｔ−錯体はリポソームにより閉じ込められるか又はその上に充填される。本明細書で用いられる「リポソーム」という用語は、自然に又は自然にではなく小胞を生ずることができるリポソーム−形成性脂質、例えば少なくとも１個のアシル基が複雑なリン酸エステルにより置き換えられているグリセリドであるリン脂質のすべての球又は小胞を含む。
【００３８】
「充填される」又は「閉じ込められる」という用語は、リポソームの内部に閉じ込められるか、リポソームの表面に露出されるかもしくは存在するか、リポソームの膜内に埋め込まれることを意味する。
【００３９】
本発明に従うリポソームはいずれの既知のリポソーム形成性脂質からも形成され得る。本明細書で用いられる場合、「リポソーム−形成性脂質」という用語は、特徴的に異なる性質、例えば親水性と疎水性の両方を有する基又はそのような分子の混合物を含有し、その水性媒体中の分散液においてリポソーム性小胞を形成する生理学的に許容され得る両親媒性物質を示す。リポソームは１種の両親媒性物質から、又はそのような物質の混合物から成ることができる。
【００４０】
両親媒性物質には中でもリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、例えばセレブロシド及びガングリオシド、ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｉｄｓ）及びステロール類、例えばコレステロール及び他が含まれる。本発明の方法による使用のために、通常既知のいずれのリポソーム−形成性脂質も適している。脂質の源又はその合成法は重要ではない：改変されたもしくは改変されない自然に存在するいずれかの脂質又は合成ホスファチドを用いることができる。
【００４１】
好ましいリポソーム−形成性両親媒性物質は天然、半−合成又は完全に合成の分子；負に又は正に帯電した脂質、場合によりコレステロールのようなステロールと；及び／又はＰＥＧ化脂質のようなリポポリマーと組み合わされていることができるリン脂質又はスフィンゴ脂質である。
【００４２】
本発明により用いられるリポソームを、種々の生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ）を含むいずれかの特定の貯蔵体（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の必要条件に適合させて作ることができ、それは凝集又はクロマトグラフィー分離なくそれらの安定性を保持し、それにより注入される流体中に十分に分散され且つ懸濁されたままである。その場の流動性は組成、温度、塩分、二価カチオン及びタンパク質の存在の理由で変化する。他の溶媒又は界面活性剤と一緒に又はそれらなしでリポソームを用いることができる。
【００４３】
本発明に従う好ましいリン脂質の組み合わせには（ＨＳＰＣ）：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの混合物（ＨＳＰＣは水素化大豆ホスファチジルコリンを指し、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはＰＥＧ２０００が頭基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）に結合したジ−ステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミンを指す）、あるいはまたジアシルグリコールＰＥＧ（２個のステアロイルアシル鎖を有する）又はコレステロール−ＰＥＧが含まれる。
【００４４】
本発明の組成物は治療的効果を達成することを目的とし、治療的効果は本発明のＰｔ錯体とＤＮＡのような核酸分子の間の付加物の形成を含む。治療的効果は望ましくない細胞増殖の阻害又は望ましくない細胞のアポトーシスの誘導を含むことができる。
【００４５】
かくして本発明の組成物を、望ましくない細胞増殖と関連する疾患状態の処置又は予防のために用いることができる。本明細書で用いられる「処置又は予防」という用語は、疾患状態と関連する望ましくない症状の改善に、そのような症状が起こる前にそれらの発現を妨げるのに、疾患の進行を遅らせるのに（病気の組織の増殖の速度から明らかになり得る）、症状の悪化を遅らせるのに、軽快期の開始を増進させるのに、疾患の進行性慢性期において引き起こされる不可逆的な損傷を遅らせるのに（例えば自己免疫疾患において）、該進行性期の開始を遅らせるのに、重度を低くするか又は疾患を治癒させるのに、生存率を向上させるか又はより急速な回復を達成するのに、あるいは疾患が起こるのを妨げるのに、あるいは上記の２つもしくはそれより多くの組み合わせのために有効である本発明の組成物の治療的量の投与を指す。
【００４６】
かくして本発明は治療的効果を達成するための方法にも関し、その方法は必要のある患者に該治療的効果の達成に十分な量の本発明に従う白金錯体を投与することを含む。１つの態様に従うと、本発明のＰｔ−錯体は抗−ガン剤として用いられる。
【００４７】
ここで以下の制限ではない実施例により本発明をさらに説明する。前記の記述は本発明のいくつかの特定の態様のみを詳細に記載しているが、本発明はそれらに制限されないことならびに特許請求の範囲により定義される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、形式及び詳細において他の変動が可能であり、それらは明細書の開示内に含まれるとして読まれるべきであることが当該技術分野における熟練者により理解されるであろう。
特定の態様の詳細な記述
【実施例１】
【００４８】
−化学合成
（１）ピペリジン−含有Ｐｔ錯体の合成
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（Ｒ）］の製造のための一般的方法
以下の記述において、Ｒは下記のピペリジン誘導体のいずれか１つを指す：ピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、１，４’−ビスピペリジン。さらなる参照のために、得られる誘導体を括弧内の参照番号により同定する。
【００４９】
シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，１ミリモル）を３０ｍＬの二回蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）、ＤＤＷ中に懸濁させた。２当量（ｅｑ．）のピペリジン誘導体を加え、懸濁液を８５℃に３時間加熱した。この時間の間に黄色の懸濁液は無色透明の溶液に変わった（いくつかの場合には黒色沈殿が生成した）。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、１ｍＬの濃ＨＣｌを滴下した。温度を９０℃に６時間上げ、その間に黄色の生成物、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン誘導体）］が沈殿した。反応混合物を室温で４時間放置し、その後黄色の生成物を濾過により集め、４０ｍＬのＤＤＷ、１０ｍＬのＥｔＯＨ及び４０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］（１）：収率８６．９％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１６７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４−ヒドロキシピペリジン）］（２）：収率８０．０％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２ＯＰｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１７２ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］（３）：収率７８．５％．分析（Ｃ１０Ｈ２４Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７０ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４，４’−ビピペリジン）］（４）：収率８５．９％．分析（Ｃ１０Ｈ２４Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７５ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （４−ピコリン）（ピペリジン）］の製造のための方法（５）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（２００ｍｇ，０．４８２ミリモル）を３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解した。４−ピコリン（２．５当量，１１７．３μＬ；１．２ミリモル）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。黄色の沈殿、シス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）２］［１９５Ｐｔ ＮＭＲ（ＤＭＦ）＝−１９６４ｐｐｍ］を濾過により集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。シス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）２］（２２６ｍｇ，０．５ミリモル）を４０ｍＬのＤＤＷ中に２当量のピペリジン（９９μＬ，１ミリモル）と一緒に懸濁させ、懸濁液を８０℃に３時間加熱した。溶液は透明且つ無色に変わり、黒色の沈殿がいくらか生成した。反応混合物を室温に冷まし、沈殿した材料を濾過した。無色の濾液に１ｍＬの濃ＨＣｌを加え、混合物を９０℃に加熱した。加熱を６時間保持し、その間に黄色の沈殿が生成した。反応混合物を室温に冷まし、沈殿（１８０ｍｇ）を集め、５０ｍＬのＤＤＷ、１０ｍＬのＥｔＯＨ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。
【００５０】
収率：８１％．分析（Ｃ１１Ｈ１８Ｃ１２Ｎ２Ｐｔ）：Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２０８７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン） ２ ］の製造のための方法（６）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、それに（１．３３０グラム，８ミリモル）のＫＩを加え、赤色の溶液を室温で２０分間攪拌した。攪拌されている溶液に（２０２μｌ，２ミリモル）のピペリジンをゆっくり加えた。室温で１時間攪拌した後、黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び次いで５０ｍＬのエーテルで洗浄した。シス−［ＰｔＩ２（Ｐｉｐ）２］（３００ミリグラム，０．４８４ミリモル）を２０ｍＬのＤＭＦ中に取り上げ、１６４．５ミリグラム（０．９７ミリモル）のＡｇＮＯ３及び（９８μｌ，１．９４ミリモル）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。沈殿を濾過した後、溶液を蒸発乾固した。ゴムに２０ｍＬのＤＤＷを加え、３０分間攪拌した。不溶性の材料を濾過し、２ｍＬの濃ＨＣｌを加えた。酸性化された溶液を９０℃に５時間温めた。室温に冷却した後、黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのエーテルで洗浄した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン） ２ ］（６）：収率：９１％．分析（Ｃ１０Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）：Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２０８０ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］の製造のための方法（７）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、８当量のＫＩ（１．３２８ｇ，８ミリモル）を加えた。混合物を室温で１５分間攪拌し、次いで２当量のピペリジン（１９８μＬ，２ミリモル）をゆっくり加えた。混合物を室温で１時間攪拌し、その間に黄色の沈殿が生成した。沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び２０ｍＬの（１：１）アセトン：ジエチルエーテル混合物で十分に洗浄した。乾燥後、黄色の沈殿（５００ｍｇ，０．８ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのエタノールの混合物中に懸濁させ、それに１ｍＬの過塩素酸（７０％）を加えた。懸濁液を室温で８日間攪拌した。この期間の間に、黄色の沈殿は褐色に変わった。褐色の沈殿を濾過により集め、４０ｍＬのＤＤＷ及び２０ｍＬのアセトン：ジエチルエーテル（１：１）で洗浄した。乾燥後、沈殿を２０ｍＬのＤＤＷ中に再−懸濁させ、０．５ｍＬの２５％ＮＨ４ＯＨを滴下し、混合物を２４時間激しく攪拌し、その間に褐色の沈殿は黄色に変わった。黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び１０ｍＬのアセトン−ジエチルエーテルで十分に洗浄し、連続的吸引により乾燥した。生成物は混合シス−アミン−ピペリジン−ジヨード白金（ＩＩ）として分析された［１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）＝−３２６０ｐｐｍ］。
【００５１】
シス−アミン−ピペリジン−ジヨード白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，０．５４ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ中に懸濁させ、２当量のＡｇＮＯ３（１８４．９ｍｇ，１．０８ミリモル）を加えた。懸濁液を暗所で２４時間激しく攪拌した。ＡｇＩ沈殿を濾過し、水性濾液を５０−ｍＬの容器に移し、それに０．５ｇのＫＣｌを加えた。無色の溶液は黄色がかり、ジクロロ−ジアミン白金（ＩＩ）生成物が沈殿し始めた。室温で４時間の後、黄色がかった沈殿（２６０ｍｇ）を集め、５０ｍＬのＤＤＷで十分に洗浄し、１００ｍＬのジエチルエーテルで洗浄することにより乾燥した。
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］（７）の全体的収率：６９％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１５９ｐｐｍ．
（２）ピペラジン錯体の合成
本明細書で示す研究の１つの目的は、水溶性であり、ＤＮＡと迅速に反応し且つシスプラチン及びトランスプラチンにより形成されるものと異なるＤＮＡとの付加物を形成することができる白金錯体を設計し且つ製造することであった。これはリガンドとしてピペラジンを有するいくつかの追加のトランス−Ｐｔ誘導体の設計及び合成に導いた。このリガンドは、それが錯体に正の電荷を与え、かくして十分な水溶解度及び迅速なポリアニオン性ＤＮＡとの相互作用を保証するであろう故に選ばれた；それは、柔軟性であり且つＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる水素結合ドナーを有する非−平面状複素環式アミンリガンドであり；且つそれは速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高い。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）
シス−ジアミン−ジクロロ白金（ＩＩ）、（３００ｍｇ，１ミリモル）を３０ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、２当量（３７２．５２ｍｇ，２ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル及び２当量（３３９．７６ｍｇ，２ミリモル）のＡｇＮＯ３を攪拌しながら同時に加えた。暗所で室温において２４時間攪拌を続けた。セライト焼結ガラスを介して沈殿を濾過し、濾液を減圧下で蒸発乾固した。得られるゴムを３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、２ｍＬの濃ＨＣｌを加え、反応混合物を室温で２４時間攪拌した。着色沈殿を除去し、溶液を８５〜９０℃に６０分間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、濾液を０℃に７２時間冷却した。黄色の沈殿を濾過し、１０ｍＬの氷−冷ＤＤＷ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。乾燥後、黄色の生成物（３００ｍｇ）を所望のトランス−アミン−ピペラジン−ジクロロ白金（ＩＩ）（８）の塩酸塩として分析した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）収率：７４％．分析 Ｃ４Ｈ１４Ｃｌ３Ｎ３ＰｔＨ２Ｏに関する計算値：Ｃ，１１．３４％；Ｈ，３．８１％；Ｎ，９．９２％．測定値：Ｃ，１１．２７％；Ｈ，３．５６％；Ｎ，９．８６％．１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （Ａｍ １ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌの製造のための一般的方法
以下の記述においてＡｍ１は下記のアミンのいずれか１つを指す：ｎ−ブチルアミン、イソプロピルアミン、４−ピコリン、ピペリジン、ピペラジン。
【００５２】
中間体シス−［ＰｔＩ２（１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）２］の合成：テトラクロロ白金酸カリウム（１ｇ，２．４ミリモル）を４０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、８当量（３．２ｇ，１９．２７ミリモル）のＫＩを加えた。混合物を室温で１５分間攪拌した。２当量（０．９ｇ，４．８ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加え、混合物を室温で１時間激しく攪拌した。この時間中ずっと、所望のジヨードジアミン白金（ＩＩ）が沈殿していた。黄色の沈殿を濾過により集め、５０ｍＬのＤＤＷで洗浄し、吸引により乾燥した。
シス−［ＰｔＩ ２ （１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル） ２ ：収率：８９％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−３２６４ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＩ２（１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）２（４１１ｍｇ，０．５ミリモル）を暗所で１５ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、２当量（１６９．８８ｍｇ，１ミリモル）のＡｇＮＯ３を２当量の対応するアミン（９８．８３μＬのｎ−ブチルアミン、８５．１７μＬのイソプロピルアミン、９７．４μＬの４−ピコリン、９９μＬのピペリジン又は１８６ｍｇの１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）と同時に加えた。暗所で室温において２４時間攪拌を続けた。セライト焼結ガラスを介して沈殿を濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固した。得られるゴムを３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、２ｍＬの濃塩酸を加え、反応混合物を室温で２４時間攪拌した。着色沈殿を除去し、溶液を８５〜９０℃に６０分間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、濾液を０℃に２４時間冷却した。黄色の沈殿を濾過し、２０ｍＬの氷−冷ＤＤＷ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。乾燥後、黄色の生成物を所望のトランス−ジアミン−ジクロロ白金（ＩＩ）錯体の塩酸塩として分析した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（９）：収率 ７１％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２２６ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１０）：収率 ６７％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２２１ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１１）：収率 ７７％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３６ｐｐｍ．
２５．０６％，Ｈ：３．８２％，Ｎ：８．５５％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２０８６ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１２）：収率 ５６％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３０ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）：収率 ６１．２％，分析 Ｃ１０Ｈ１８Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔに関する計算値：Ｃ：２４．９９％，Ｈ：３．５６％，Ｎ：８．７４％，測定値：Ｃ：２５．０６％，Ｈ：３．８２％，Ｎ：８．５５％，
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１４）：収率 ８３％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３８ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ（１５）：収率 ８３％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３８ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌの製造のための方法（１６）
テトラフェニルホスホニウムトリクロロ−モノアミン−白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，０．４５ミリモル）を１０ｍＬの１：１アセトン／ＤＤＷ混合物中に溶解した。オレンジ−色の溶液に１当量（７７．５３ｍｇ，０．４５ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加えた。密閉容器中で室温において７日間混合物を攪拌した。減圧下で溶液を蒸発乾固した後、黄色の固体を１０ｍＬの無水エタノール中に取り上げ、０．５ｍＬの濃塩酸を加え、混合物を終夜放置した。黄色の沈殿を濾過により集め、１０ｍＬのエタノールで洗浄した。
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ：収率５８％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１８７ｐｐｍ．
【実施例２】
【００５３】
−生物学的アッセイ
細胞培養
Ｈａｄａｓｓａｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ病院で樹立されたヒト卵巣ガン細胞系（ＯＶ−１０６３）及びヒト結腸ガン細胞系（Ｃ−２６）を、１０％ＦＣＳ、抗生物質及びグルタミンが補足されたＲＰＭＩ−１６４０培地中に保持した。すべての培養培地成分はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入された。両細胞系は３７℃において水−ジャケット付きＣＯ２インキュベーター中で保持された。
【００５４】
さらに３対のシスプラチン感受性及び耐性のガン細胞系（Ａ２７８０／Ａ２７８０ｃｉｓＲ、４１Ｍ，／４１ＭｃｉｓＲ及びＣＨ１／ＣＨ１ｃｉｓＲ）を用いた（１５）。これらの細胞系の対はシスプラチンに対する耐性の既知の主要な機構のすべてを包含することに基づいて選ばれた：４１ＭｃｉｓＲは主に薬剤輸送の低下を介して耐性であり（１６）、ＣＨ１ｃｉｓＲは強化されたＤＮＡ修復／寛容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を介して耐性であり（１７）、Ａ２７７８０ｃｉｓＲは吸収の減少、強化されたＤＮＡ修復／寛容性及びＧＳＨ量の増加の組み合わせを介して耐性である（１８）。
薬剤
シスプラチン及びトランスプラチンは（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により供給された。すべての薬剤は実験の直前に正常食塩水中に溶解された。
細胞生存のメチレンブルーアッセイ
合成された錯体の細胞毒性をメチレンブルー（ＭＢ）染色アッセイにより調べた（１９）。２００μｌの培地中の指数関数的に成長する細胞の決められた（ｆｉｘｅｄ）数を９６穴平底プレート中にプレーティングした。調べられる錯体のそれぞれに関し、４個のウェルを用いた。培養中で２４時間の後、未処理の細胞を含有する各ウェルに２０μｌの種々の濃度の錯体を加えた。標準に正常食塩水を加えた。細胞を錯体に４、２４又は７２時間暴露した。決められた時間の間の暴露の最後に、処理された細胞ならびに平行標準細胞を洗浄し、実験の終止まで新しい培地中でインキュベーションを続けた。７２時間の成長の後、５０μｌの２．５％グルタルアルデヒドを各ウェルに１５分間加えることにより細胞を固定した。固定された細胞を新しい脱イオン水で１０回及びホウ酸塩緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝８．５）で１回濯ぎ、乾燥し、ＭＢ（０．１Ｍホウ酸塩緩衝液中の１％溶液の１００μｌ，ｐＨ＝８．５）を用い、室温で１時間染色した。染色された細胞を脱イオン水を用いて十分に濯ぎ、非−細胞−結合色素を除去し、次いで乾燥した。固定された細胞に結合したＭＢを、３７℃において２００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌと一緒に１時間インキュベーションすることにより抽出し、各ウェルにおける色素の正味の光学濃度（ＯＤ）を平板分光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｙｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により６２０ｎｍにおいて決定した。
【００５５】
９６穴プレートを用いるＭＢ法の利点は、細胞増殖の速度及び生存についての広範囲の実験を多数のデータ点を用いて行なう可能性であり、その方法では種々の実験的錯体に関して細胞が同じプレートにおいて生育され、正確に同じ条件で検定される。細胞生存の評価に関するＭＢアッセイの妥当性は、ＭＢ比色アッセイとコロニー−形成単位アッセイの結果の間の高い関連性により支持される（２０）。
ミクロ培養テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ及び細胞生存
合成された錯体の細胞毒性をＭＴＳ法（２１）によっても調べた。従って化合物を対応する細胞系と一緒に２４時間インキュベーションし、化合物処理した培養における細胞生存を評価した。
白金錯体細胞内蓄積測定
細胞を播種してから４８時間後に錯体の１つを培養培地に加えた。２４時間の暴露の後、錯体を除去し、細胞を氷−冷ＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化した。細胞（１＊１０６個）を乾燥し、６５％ＨＮＯ３（ＢＤＨ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中で１０分間加熱することにより鉱物化した（２２）。試料を脱イオン水中に溶解し、各試料を２種の希釈において無炎Ｚｅｅｍａｎ原子吸光分析計（ＦＡＡＳ）により測定した。キャリブレーションカーブは、ｍｌ当たりに５０〜２５０ｎｇの白金の範囲の濃度を有する５つの標準のＫ２ＰｔＣｌ４貯蔵溶液を含んだ。１＊１０６個の細胞当たりのピコモルの白金として白金含有量を表した。
ＦＡＡＳによるＰｔ−ＤＮＡ付加物の決定
細胞を播種してから４８時間後に薬剤の１つを培養培地に加えた。２４時間の暴露の後、錯体を除去し、細胞を氷−冷ＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化した。白金−含有材料（２＊１０６個の細胞）からのＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、製造者の指示に従って細胞ペレットから抽出した。２６０ｎｍにおける吸光度により溶離物中のＤＮＡの濃度を測定することによって、ＤＮＡ収量を決定した。各試料から単離されたＤＮＡは平均で５０±１０μｇ／ｍｌであった。純度は２６０ｎｍにおける吸光度対２８０ｎｍにおける吸光度の比を計算することにより決定される；ＤＮＡの精製の程度は平均して９５％であった。
ＥｔＢｒ蛍光によるＰｔ−ＤＮＡ付加物の決定
ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含有するプラスミド（４．８ｋｂｐ）であるプラスミドｐＳ１６−ｈＧＨを以前に記載されている通りに調製した（２３）。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）での後−染色（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いるアガロースゲル（１％）電気泳動により、新しく調製されたＤＮＡを分析した。スーパーコイルプラスミドの定量的分析（２４）を行い、プラスミドＤＮＡが８５〜９０％スーパーコイル形態にあることを示した。ＵＶ−分光分析は、いずれのＤＮＡバッチ中にもタンパク質又はＲＮＡ汚染が存在しないことを示した。２６０ｎｍにおける吸光度対２８０ｎｍにおける吸光度の比は常に１．８〜１．９であった。
【００５６】
３７℃において暗所で２４時間、１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４（ｐＨ ７．０）中でＤＮＡを白金錯体により改変した。ＥｔＢｒ蛍光の測定をＬＳ５０Ｂルミネセンス分光分析器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で行なった。ＥｔＢｒの存在下において白金により改変されたＤＮＡの蛍光測定を、５４６ｎｍ（スリット１０ｎｍ）の励起波長及び５９０ｎｍ（スリット１０ｎｍ）の発光波長を用い、２５℃において行なった。濃度はＤＮＡに関して０．０１ｍｇ／ｍｌ及びＥｔＢｒに関して０．０４ｍｇ／ｍｌであり、それらはＤＮＡにおけるＥｔＢｒのすべての挿入部位の飽和に相当する。
アポトーシスの評価
２つの方法によりアポトーシスを評価した：
（１）メロシアニン ５４０（ＭＣ ５４０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）及び４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドンジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を用いるＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞の染色により。このアッセイは、アポトーシスの開始からすぐ後にホスファチジルセリン（ＰＳ）が原形質膜の内面から細胞表面に転位するという観察に基づく。この時点に、ＰＳに強い親和性を有するＭＣ ５４０を用いて染色することにより、ＰＳを容易に検出することができる（２５）。二重鎖ＤＮＡを優先的に染色するＤＡＰＩを用いる染色により、クロマチン凝縮（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を評価した。以下の実験において、５＊１０５個の細胞を含有する試料を、ガラスのカバースリップで覆われた６穴プレート上で培養した。ＩＣ５０の錯体で細胞を処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５μｌのＭＣ ５４０（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する５００μｌのＰＢＳ中で、暗所において２分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、３００μｌのＤＡＰＩ（３μＭ）で染色した。その後ガラスのカバースリップをガラススライド上に置き、蛍光共焦点顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて写真撮影した。
【００５７】
（２）ＥｎｚＣｈｅｋｔｍ Ｃａｓｐａｓｅ−３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により。このキットは、キャスパーゼ−３及び他のＤＥＶＤ−特異的プロテアーゼ活性（例えばキャスパーゼ−７）における向上に関して検定することにより、アポトーシスの検出を可能にする。アッセイのための基礎はローダミン １１０ ビス−（Ｎ−ＣＢＺ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−アスパラギン酸アミド）（Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）である。この基質はＲ１１０のアミノ基のそれぞれに共有結合したＤＥＶＤペプチドを含有するローダミン １１０（Ｒ１１０）のビスアミド誘導体である。酵素的に切断されると、非−蛍光性ビスアミド基質が蛍光性Ｒ１１０に転換され、それを４８５±１０ｎｍにおける励起及び５３５±１０ｎｍにおける発光検出を用いて蛍光マイクロプレートリーダーにより定量することができる。
【００５８】
簡単に記載すると、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞をＩＣ５０のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）（それぞれ４．５μＭ及び６．５μＭ）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）・ＨＣｌ］（１２）（それぞれ５μＭ及び７．５μＭ）を用いて５又は１６時間処理した。次いで「誘導された」細胞及び「標準」細胞の両方を回収し、溶解した。９６穴プレートにおいて５０μｇの細胞質ゾルタンパク質を用いて（５５分間のインキュベーション）及び２５μＭの最終的濃度のＺ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０基質を用いて、キットの案に記載されている通り、酵素反応を行なった。
生体内毒性及び抗−腫瘍効果
トランス−白金（ＩＩ）誘導体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］（３）を、シス−ＤＤＰに比較されるその毒性及び抗腫瘍有効性に関して評価した。
毒性
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］の毒性を８週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスについて評価し、シス−ＤＤＰと比較した。種々の濃度におけるこの新規な錯体及びシス−ＤＤＰを静脈内に、週間隔で３回注入し、動物の体重及び生存を評価した。
抗腫瘍有効性
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（１７〜２０ｇの体重範囲内）に１＊１０６個のＣ−２６結腸ガンを腹腔内に注入した。トリパンブルー排除によると、これらの細胞の生存率は＞９０％であった。
【００５９】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）の治療的有効性を研究し、シス−ＤＤＰと比較した。腫瘍の接種から後の３日に処置を開始し、週間隔で合計３回の注入のために２回繰り返した。
結果
Ｐｔ錯体の溶解度
劣ったバイオアベイラビリティーを生ずる中性のジアミンジクロロ白金（ＩＩ）化合物の低い溶解度は、一般式［ＰｔＣｌ２（Ａｍ）（Ｐｚ）］・ＨＣｌの正に帯電した錯体の設計及び合成に関する理由の１つであった。本明細書で示される化合物は、シスプラチンの場合の６．３ｍＭ及びトランスプラチンの場合の０．８ｍＭと比較して２０ｍＭの範囲内の溶解度を有し、それらの中性の相手より可溶性であることが示された。例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）はＤＤＷ（３７℃において）中で７．５ｍｇ／ｍｌ（１８．０ｍＭ）の溶解度を示した。
生物学的活性
試験管内成長阻害
合成されたトランス及びシス錯体の抗−腫瘍活性を評価するために、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞をこれらの錯体と一緒に４、２４又は７２時間インキュベーションした。ＭＢ細胞毒性アッセイは、トランスプラチンの１個の（ＮＨ３）又は両方の置き換えがＣ−２６及びＯＶ−１０６３ガン細胞系の両方において、新規なトランス−ＰｔＣｌ２化合物の細胞毒性を有意に（４倍より高く）増強することを明らかにした（表１）。
【００６０】
【表１】
【００６１】
１個のＮＨ３基を芳香族−平面状アミン（４−ピコリン）で置き換えてトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］を得るか、又は脂肪族非−平面状アミン（ピペリジン）で置き換えてトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］（１）を得ることは、トランスプラチンと比較して細胞毒性活性を増強した（表１）。錯体（１）が［トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］誘導体より細胞毒性であることに注目するべきであり、それは立体的に妨げられたアミンリガンドによりトランス位の活性化が達成され得ることを示唆している。４−ピコリンの芳香環の平面状水素と対照的に、反対の方向に向いている水素原子のために、ピペリジンは４−ピコリンより立体的に妨げられており、それは細胞毒性活性と関連し得る。
【００６２】
さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］中の第２のＮＨ３をピペリジンで置き換えて混合トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）を得ることは、化合物の細胞毒性を２〜３倍（ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ２−３）増強した（表１）。この観察は、錯体（５）のより高く立体的に妨げられた構造により説明され得る。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］はシスプラチンより３倍活性が低く、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］のより高いＩＣ５０値は、図１Ａ及び１Ｂにおいて示されるより少量のＰｔ−ＤＮＡ付加物と一致している。
【００６３】
トランス形の立体的に妨げられた化合物の細胞毒性をそれらのシスの相手、シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］及びシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］（７）の細胞毒性と比較した。新しいトランス−Ｐｔ錯体中の１個のＮＨ３の置き換えの効果と対照的に、シスプラチンの１個のＮＨ３の芳香族−平面状アミンリガンド（４−ピコリン）又は脂肪族非−平面状アミン（ピペリジン）による類似の置き換えは、シスプラチン自身に比較してより低い細胞毒性活性を生じた。錯体シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］は、白金薬剤耐性を妨げるために設計され、現在臨床試験下にある新規な立体的に妨げられた抗−腫瘍化合物である新しい活性なシス−［Ｐｔ（ＮＨ３）（２−ピコリン）］（ＡＭＤ４７３）への類似体である（２６）。
【００６４】
いくつかのピペラジン−含有Ｐｔ錯体の、シスプラチン感受性及び耐性ガン細胞系への細胞毒性も決定された。特定的には３対のシスプラチン感受性及び耐性ガン細胞系（Ａ２７８０／Ａ２７８０ｃｉｓＲ、４１Ｍ／４１ＭｃｉｓＲ及びＣＨ１／ＣＨ１ｃｉｓＲ）を用いた。
【００６５】
錯体を上記の細胞系と一緒に２４時間インキュベーションし、化合物処理した培養中の細胞生存を、前に報告した（ミクロ培養テトラゾリウム）ＭＴＳ法により評価した。ＩＣ５０研究の結果を表２Ａ〜２Ｂに示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
ＮＢＡ＝ｎ−ブチルアミン、ＩＰＡ＝イソプロピルアミン、４−ｐｉｃ＝４−メチルピリジン、ｐｉｐ＝ピペリジン、ｐｉｐ−ピペラジン。括弧内の数字は耐性因子（ＩＣ５０耐性／ＩＣ５０感受性）である。
【００６９】
ＳＡＲに関して言うと、トランスプラチンの１個もしくは両方のアミンリガンドをピペラジンで置き換えることは、トランスプラチンに対して抗腫瘍活性を顕著に向上させ、正に帯電した非−平面状アミンリガンド（ピペラジン）がトランス形を活性化できることを示している。これらの細胞毒性研究の最も衝撃的な特徴は、強化されたＤＮＡ修復／寛容性及び増加したＧＳＨ量を介して耐性であるＡ２７８０ｃｉｓＲ細胞系に対し、錯体が少なくともシスプラチンと同様に活性であることである。特に注目できることは、すべての３つの細胞系に対するトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＢＡ）（ｐｚ）］・ＨＣｌ（１０）の非常に低い耐性因子（ＲＦ）であり（ＲＦ＜２）、シスプラチン耐性の有効な妨害を示している。
【００７０】
これらのトランスプラチン錯体の抗−腫瘍活性の向上に関する可能な説明は、立体的に妨げられたリガンドがチオールによる解毒を低下させ得ることである。生物学的（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）なチオール及びチオエーテル（タンパク質及びペプチド）に対する反応性の低下は有益であると考えられ、それは生物学的硫黄含有リガンドとのシスプラチンの反応が後天的な耐性及び薬剤の毒性の副作用の源にあると思われるからである。
細胞の薬剤吸収及びＤＮＡ白金化
腫瘍細胞における薬剤蓄積を決定するために、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞を細胞毒性化合物、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）・ＨＣｌ］（１３）に２４時間暴露し、同じ条件下におけるシスプラチン及びトランスプラチンの薬剤吸収と比較した。原子吸光分析法（ＡＡＳ）により、細胞と関連するＰｔ含有量を測定した。図１Ａにおいて示される通り、両細胞系においてトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）は非常に有効に細胞に浸透することが見出された（シスプラチンより６−倍高い）。
【００７１】
また図１Ｂにおいて示される通り、トランスプラチンと比較して、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）の浸透はＯＶ−１０６３細胞において７−倍高く、Ｃ−２６細胞において３０−倍高い。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）の蓄積の時間−依存性増加は、薬剤暴露の４（データは示されていない）〜２４時間の間、観察された。細胞におけるＰｔの時間−依存性蓄積はＩＣ５０値における低下と一致する（表１）。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）は両細胞系において最も高い浸透値を示した（シスプラチンと比較して２２−倍高い）（図１Ａ及び１Ｂ）。
【００７２】
細胞ＤＮＡの白金化を決定するために、Ｃ−２６細胞及びＯＶ−１０６３細胞をこれらのトランスプラチン錯体に４時間又は２４時間暴露し、シスプラチンと比較し、ＡＡ分光計により白金ＤＮＡ含有量を測定した。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］のＤＮＡ白金化はＣ−２６細胞及びＯＶ−１０６３細胞においてＣｉｓ−Ｐｔのそれと同じであり、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ錯体からＤＮＡに挿入された（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ）Ｐｔ分子の値は両細胞系においてＣｉｓ−Ｐｔのそれより７−倍高かった（図２Ａ及び２Ｂ）。
【００７３】
コウシ胸腺ＤＮＡの白金化の形成も調べた。この目的のために、コウシ胸腺ＤＮＡを種々の化合物（表３）と一緒にインキュベーションし、そこにおいて以下のパラメーターを決定した：
ｔ１／２−１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４中で３７℃、ｒｉ＝０．０８における、ディファレンシャルパルスポーラログラフィー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｕｌｓｅ ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｙ）により決定されるコウシ胸腺ＤＮＡへの化合物の結合の半時間（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）（分における）；
ΔΔεｍａｘ−約２７５ｎｍにおける正のＣＤバンドの極大、標準及び白金化コウシ胸腺ＤＮＡの間の差； ΔＴｍ−非白金化及び白金化コウシ胸腺ＤＮＡの融解温度における差； 巻き戻し−付加物当たりの巻き戻し角； ％ＩＥＣ／付加物−鎖間架橋の頻度。
【００７４】
【表４】
【００７５】
わかる通り、両ピペラジン−及びピペリジン含有錯体はシスプラチンより有意に高い速度でＤＮＡに結合する。
ＥｔＢｒ蛍光によるＤＮＡ付加物の分析
蛍光性プローブとしてＥｔＢｒを用い、白金（ＩＩ）化合物の付加物によりＤＮＡにおいて誘導される撹乱を区別した（１４）。挿入によるＥｔＢｒの結合は、Ｃｉｓ−Ｐｔの結合と同様に二官能基性付加物の形成により化学量論的に遮断され、それは蛍光強度を失わせる。他方、一官能基性付加物の形成はＥｔＢｒ蛍光をわずかに低下させるのみである。
【００７６】
トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌにより改変されたＤＮＡのＤＮＡ白金化測定は、二官能基性付加物の形成と一致する蛍光における有意な低下を示した。他方、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］の付加物による蛍光強度の低下はシスプラチンのそれより小さく、しかしながらトランスプラチンのそれより大きかった。最良の付加物はトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを用いて形成された（表４及び又図３）。
【００７７】
【表５】
【００７８】
かくして引き出される結論は、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）が一官能基性付加物及び又、ＤＮＡ中へのＥｔＢｒの挿入を阻害し、従ってＥｔＢｒ蛍光強度を低下させることができる二官能基性付加物を形成するということであった。
【００７９】
さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）と一緒に２４時間インキュベーションされたＤＮＡはＥｔＢｒ蛍光における有意な低下を示した（シスプラチンのそれよりわずかに大きい）（図４）。錯体（３）とシス−ＤＤＰの間の差は低濃度においてより大きく、それは錯体（３）がＤＮＡへのより高い親和性を有することを示唆している。シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）の付加物による蛍光強度の低下はシスプラチンのそれに類似していた（図４）。
アポトーシスの評価
プログラミングされた細胞死としても知られるアポトーシスは、多細胞生物における細胞数の調節ならびに腫瘍進行、神経変性障害及びウィルス感染を含む種々の疾患の病因に含まれる。通常は正常な細胞の原形質膜の内側のリーフレットに閉じ込められている脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）がほとんどの細胞型において示された。アポトーシスを経る細胞においては、ＰＳがアポトーシスの初期の段階に外側の原形質膜リーフレットに輸送される（ｅｘｐｏｒｔｅｄ）。処理されたＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞におけるＰＳ露出を、ＰＳへの強い親和性を有するＭＣ ５４０を用いる染色により検出し、二本鎖ＤＮＡを優先的に染色するＤＡＰＩを用いる染色によりクロマチン凝縮を評価した。
【００８０】
赤く着色されない未処理細胞（結果は示されていない）と対照的な細胞膜における赤い蛍光の出現及び核の緑の蛍光の増加により証明される通り、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］処理されたＯＶ １０６３細胞においてはアポトーシスの顕著な特徴が観察された。この染色の結果は、ＯＶ−１０６３細胞の大部分が６．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されてから５時間後にアポトーシス的であるように見えることを示した。Ｃ−２６細胞の細胞表面は、未処理細胞において赤い蛍光がないこと（結果は示されていない）と対照的に、４．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されてから５時間後にわずかに赤く蛍光性となる（結果は示されていない）。
【００８１】
近年、プロテアーゼのキャスパーゼ（ＣＥＤ−３／ＩＣＥ）ファミリーのメンバーがアポトーシスと関連する複雑な生化学的現象の決定的な媒介物質であることが見出された（２７）。特に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、タンパク質キナーゼＣδ及びアクチンを含む複数の異なるタンパク質を切断するキャスパーゼ−３の活性化は、アポトーシスの開始に重要であることが示された（２８）。かくしてトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］処理されたＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞においてキャスパーゼ−３の活性化を測定した。６．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］又は７．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌで５時間処理されたＯＶ−１０６３細胞がキャスパーゼ−３を活性化することが見出された（未処理の細胞と比較して処理された細胞における蛍光の約２倍の増加）。さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］又はトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌを用いるＯＶ−１０６３細胞の１６時間の処理の後、未処理の細胞と比較して処理された細胞において蛍光が３倍増加した（示されていない）。
【００８２】
観察された蛍光シグナルがキャスパーゼ−３の活性化の故であることを確かめるために、キャスパーゼ−３様プロテアーゼの可逆的Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ阻害剤を標準及び処理試料に加えた。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ阻害剤で処理された試料において蛍光シグナルにおけるものすごい低下が見出され（示されていない）、それはキャスパーゼ−３の特異的活性化を証明している。４．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されたＣ−２６細胞において蛍光シグナルは見出されなかった。
【００８３】
シスプラチンで処理されたＯＶ−１０６３又はＣ−２６細胞がアポトーシスを経るか否かを決定するために、これらの細胞系をそれぞれ２μＭ又は１．５μＭで５又は１６時間処理した。シスプラチン処理されたＯＶ−１０６３細胞又はＣ−２６細胞において蛍光シグナルは見出されなかった。これらの発見は、シスプラチンで処理されたＬ１２１０細胞においてアガロースゲル電気泳動により検出される分解ＤＮＡがないことを示したＬ．Ｓｚｍｉｇｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．のデータと一致している（２９）。それは結腸ガン細胞が、アポトーシスを阻害する単数もしくは複数の可溶性因子を分泌することによって（３０）及び結腸ガン細胞をアポトーシスから防御するｃ−キットの異常な活性化によって自己防衛することを示したいくつかの発見とも一致した。
タンパク質結合
静脈内に投与されるほとんどの白金（ＩＩ）誘導体は２４時間以内にタンパク質結合となるので、２種のモデルタンパク質、ユビキチン（ＭＷ ８５６５）及び心臓ミオグロビン（ＭＷ １６９５１）のＰｔ錯体への結合速度を決定した。この目的のために、白金錯体とタンパク質の間の１：１反応を１０ｍＭリン酸塩緩衝液，ｐＨ６．４中で１〜２ｍＭ濃度において、３７℃で行なった。タンパク質結合速度を反応混合物について直接、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により測定した。図５は、中性のトランス−ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）がタンパク質に迅速に結合し、結合速度に関してシスプラチン及びトランスプラチンが続くが、帯電したピペラジン錯体はタンパク質に有意に結合しないことを示している。ＤＮＡへの非常に迅速な結合とタンパク質への遅く且つ無効な結合の組み合わせは、白金に基づく抗−腫瘍薬剤の非常に望ましい性質である。
毒性
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ及びシス−ＤＤＰが５ｍｇ／ｋｇの濃度において無毒性であり、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌが２０ｍｇ／ｋｇの濃度において無毒性であることが見出された。
生体内抗腫瘍効果
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（１７〜２０グラムの体重範囲内）に１＊１０６個のＣ−２６結腸ガンを腹腔内注入した。トリパンブルー排除によると、これらの細胞の生存率は＞９０％であった。
【００８４】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの治療的有効性を研究し、シスプラチンと比較した。処置は上記のスケジュールに従って行なわれた。結果を表５及び図６に示す。
【００８５】
【表６】
【実施例３】
【００８６】
−リポソーム調剤
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有する立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）の調製及び分析
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬの調製
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．９％ ＮａＣｌ中に６５℃で溶解し、この温度で１時間放置した。脂質（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ ５１：４４：５）をエタノール中に溶解した。このエタノール性溶液を薬剤混合物に加えることにより、脂質を水和させた。最終的な脂質濃度は、６５℃において２５％エタノール中で１５０ｍｇ／ｍｌ（１５％）であった。混合物を６５℃で１時間攪拌し続け、次いで２００ｎｍの孔径を有する２５ｍｍのポリカーボネートフィルターを介し、Ｌｉｐｅｘ押出し機（Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて６５℃で５回押出し、続いて１００ｎｍの孔径のポリカーボネートフィルターを介して１１回押出した。寸法をそろえられた（ｓｉｚｅｄ）リポソーム（〜１００ｎｍ）を室温に冷ました。冷ます間、重質の沈殿が生成し、上澄み液を集めた。次いで上澄み液を４℃に終夜冷却し、再び上澄み液を集めた。上澄み液を集め、１０％スクロース及び１ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ＝６．５）に対して、１００体積の緩衝液に対して合計で５回及び２００体積に対して１回、４℃で透析した。これらの条件下で、緩衝液との完全な平衡が起こるはずである。最終的なリポソーム分散液は半透明白色であった。
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬの分析
ＣｏｕｌｔｅｒモデルＮ４ ＳＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用い、動的光−散乱（ＤＬＳ）により、リポソームをそれらの寸法分布に関して２５℃で分析した。
【００８７】
リン脂質（ＰＬｓ）の濃度を脂質リン含有量により調べた（修正Ｂａｒｔｌｅｔｔ法）
（３１）。
【００８８】
無炎Ｚｅｅｍａｎ原子吸光分析計（ＦＡＡＳ）により、リポソーム中の白金濃度を測定した。白金濃度は、ｍＬ当たりに５０〜２５０ｎｇの白金の範囲の濃度を有するＫ２ＰｔＣｌ４貯蔵溶液の５つの標準を含むキャリブレーションカーブに従って計算された。
【００８９】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬを以下のパラメーターにより分析した：寸法−１０２ｎｍ；調製物中のトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの濃度：１ｍＭ；調製物中の脂質の濃度：９４ｍＭ；及びカプセル封入のパーセンテージ（リポソーム中のＰｔ／Ｐｌ比／初期Ｐｔ／Ｐｌ比ｘ１００）８％。
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ ＳＳＬからのＰｔ放出の分析
硫黄含有グルタチオン（ＧＳＨ）は白金との反応性が高いことが知られている。従ってリポソームからの白金の放出実験のためにそれを選択した。その白金との迅速な反応及び１９５Ｐｔ−ＮＭＲ上で誘導されるその硫黄の結合による強い化学シフトは、問題の範囲において我々がジアミンジクロロ白金のみを検出することを可能にするであろう。正に帯電した活性誘導体はトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）であった。
【００９０】
すべてのＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ５００ ＭＨｚ分光計上で５ｍｍのスィッチ可能なプローブを用いて記録された。１９５Ｐｔ ＮＭＲスペクトルは外部標準としてＨＣｌ中のＫ２ＰｔＣｌ４（−１６２４ｐｐｍ）に関連付けられた。
１９５ＮＭＲ実験
ＮＭＲ管中の０．５ｍＬのリポソーム懸濁液（０．５ｍｇ／ｍＬ）に２当量のグルタチオン（ＧＳＨ）を加え、懸濁液を２分間激しく振盪させた。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ試験は、リポソーム内の錯体が無損傷であることを示した（δ＝−２１３４．５９７ｐｐｍ）。試料を３７℃で放置した。続行１９５Ｐｔ ＮＭＲを１、２及び７日後に行なった。最初の２日間ずっと、白金部分は無損傷であった。第７日に行なわれた１９５Ｐｔ−ＮＭＲは、ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）部分に特徴的な化学シフトの全体的消失を明らかにした。
【００９１】
白金薬剤の放出への（ＧＳＨ）の効果を評価するために、ＧＳＨなしで上記の実験を繰り返した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲは、３７℃において１０日後でさえ錯体が内部で無損傷であり（δ＝−２１３２．５８５ｐｐｍ）、δ＝−２６６１．４２８ｐｐｍにおける少量の生成物があることを明らかにした。
【００９２】
要するに結果は、帯電した錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌが、シスプラチンと対照的に放出されることを明白に示した。ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の特徴的な化学シフトの全体的消失は、配位球中のリガンドが変化したことを意味する。それにもかかわらず、ＧＳＨを含まない実験において変化が現れないことは、放出がないことを示す糸口ではない（ｎｏｔ ａ ｃｌｕｅ ｆｏｒ）。そのためには、リポソームの外部における白金部分の存在を証明するために、外部の溶液を濾過し、原子吸光（ＡＡ）及び（可能なら）１９５Ｐｔ−ＮＭＲを行わなければならない。
【実施例４】
【００９３】
−四官能基性の正に帯電したピペラジンに基づくビス−白金錯体
非−古典的な白金錯体の合成の努力を続け、四官能基性の正に帯電したビス−白金錯体を以下のスキームに従って合成した：
【００９４】
【化１】
【００９５】
シス−ＰｔＣｌ２（ＢＯＣ−Ｐｚ）２（１ｇ，２．４１ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ中に溶解した。攪拌されている混合物に２当量（０．９ｇ，４．８４ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加え、混合物を７０℃に加温した。攪拌及び加温を５０分間続け、次いで黄色の沈殿を集め、４０ｍＬのＤＤＷで２回洗浄した。乾燥後、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）を用いて且つさらなる精製を用いずに黄色の生成物を分析した。
１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）：δ＝−２２３９．４ｐｐｍ，−２２６７．８ｐｐｍ
ビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２−Ｐｚ）２｝（リンカー）］・２ＨＣｌの合成
暗所でシス−ＰｔＣｌ２（Ｂｏｃ−Ｐｚ）２（５３８ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＭＦ中に溶解した。攪拌されている黄色の溶液に１当量（１６９．８８ｍｇ，１ミリモル）の硝酸銀を加え、混合物を室温で４８時間攪拌した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）は、（δ＝−２２４０．４７７ｐｐｍ）における微量の出発材料とともにモノ−ニトラト／ＤＭＦモノ−クロロジアミノ白金（ＩＩ）（δ＝−２００２．９８７ｐｐｍ，−２１２３．９９５）の生成を示した。この段階にＡｇＣｌ沈殿を濾過し、０．５当量（１１０ｍｇ，０．５ミリモル）の４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンを加えた。混合物を暗所で終夜攪拌した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）はモノ−クロロ−トリアミン白金の生成を示した（δ＝−２５４２．９７４ｐｐｍ，−２５７０．９１１ｐｐｍ）。黄色がかった濾液を取り上げ、溶媒を減圧下で蒸発乾固した。ゴムを２０ｍｌのエタノール中に溶解し、１ｍＬの濃塩酸を加えた。全体が可溶化するまで混合物を室温で攪拌し、次いで５０分間温度を上げて還流させた。この時間中ずっと、黄色がかった沈殿が生成していた。反応混合物を室温に冷まし、沈殿を集め、２０ｍｌのエタノールで洗浄し、乾燥した。
１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（Ｈ２Ｏ）：δ＝−２２２４．３９６ｐｐｍ，２２３８．１４２ｐｐｍ，２２４８．１９４ｐｐｍ。
【００９６】
【表７】
【００９７】
【表８】
【００９８】
【表９】
【００９９】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】Ｃ−２６ガン細胞によるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの吸収を示す図。
【図１Ｂ】ＯＶ−１０６３ガン細胞によるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの吸収を示す図。
【図２Ａ】Ｃ−２６ガン細胞におけるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌのＤＮＡ白金化レベルを示す図。
【図２Ｂ】ＯＶ−１０６３ガン細胞におけるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌのＤＮＡ白金化レベルを示す図。
【図３】シスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌにより改変された種々の濃度のＤＮＡへのＥｔＢｒ蛍光の依存性を示す図。
【図４】ＩＣ５０値のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ又はシスプラチンで処理されたＯＶ−１０６３細胞における、未処理の（標準細胞）と比較されるキャスパーゼ−３−活性を示す図。
【図５】シスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペリジン）］；及びトランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌへのユビキチンの結合曲線を示す図。
【図６】Ｃ−２６結腸ガンが接種され、本明細書上記に記載されるスケジュールに従って処置された雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、シス−ＤＤＰと比較されるトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの抗腫瘍活性を示す図。
【０００１】
本発明は新規な白金錯体及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチン、シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）２］は多様な充実性腫瘍の処置において最も広く用いられる３つの臨床的薬剤の１つである（非特許文献１）。それはＤＮＡに、主に同じ鎖上の２つの隣接するグアニンに不可逆的に結合し、ＤＮＡにおける屈曲を誘導し、それがシスプラチン−改変ＤＮＡに結合する細胞タンパク質により認識されることにより腫瘍細胞を殺すと思われる（非特許文献２）。アポトーシス及び結果としての細胞死の誘導を担うのはＰｔ−ＤＮＡ付加物である（非特許文献３）。精巣及び卵巣腫瘍を含む種々の腫瘍性疾患の処置におけるその有効性にかかわらず、その臨床的有用性はその低い溶解度、毒性及び特に腫瘍の耐性により制限される（非特許文献４）。カルボプラチン（Ｐｔ（ＣＢＤＣＡ）（ＮＨ３）２，ＣＢＤＣＡ＝１，１−シクロブタンジカルボキシレート）のような第二世代薬剤は腎毒性の低下を示すが、おそらくそれらがシスプラチンが生成すると同じ範囲のＤＮＡ付加物を生成するという事のために、腫瘍の耐性を克服できない（非特許文献５）。
【０００３】
耐性の克服は新規な白金薬剤の開発における主な目標の１つであり、従って古典的な構造−活性関連性（ＳＡＲ）から離れる新規な化合物が設計され、合成され、スクリーニングされてきた（非特許文献６）。Ｃｌｅａｒｅ及びＨｏｅｓｃｈｅｌｅにより最初に公式化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＳＡＲは医化学者に、シス立体配置における２個の不活性リガンド及び２個の半−不安定離脱基を有する中性白金（ＩＩ）錯体の製造に彼らの努力を向けるように影響を与えた（非特許文献７）。
【０００４】
２個の離脱基のシス立体配置がシス−ジアミンジクロロ白金（シス−ＤＤＰ）の抗−腫瘍活性に必須であることは一般的に受け入れられた。これは、Ａｍ１、Ａｍ２＝ＮＨ３又は平面状アミンリガンド、例えばキノリン、チアゾール、ピリジン又はベンゾチアゾールであるトランス−ＰｔＣｌ２（Ａｍ１）（Ａｍ２）、（例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（チアゾール）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（キノリン）］及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ベンゾチアゾール）］）における１個もしくは両方のＮＨ３リガンドの置き換えがトランス形の細胞毒性を実質的に強化することをｆａｒｒｅｌｌ等が報告するまで２０年以上もの間の状況であった（非特許文献８）。
【０００５】
さらにＮａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｇｅｒ及び共同研究者等は、トランス−ＰｔＣｌ２［ＮＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］［ＮＨ（ＣＨ３）２］が興味深い薬理学的性質を有することを示し（非特許文献９）、Ｎａｔｉｌｅ等はトランス−ＰｔＣｌ２（イミノエーテル）２もいくつかのヒトガン系に対して活性であることを報告した（非特許文献１０）。臨床試験の２期にある非−古典的錯体の他の例は、四重に帯電したカチオンである３核Ｐｔ錯体ＢＢＲ３４６４である（非特許文献１１）。
【０００６】
非−古典的白金化合物の重要性は、シスプラチン及びカルボプラチンにより形成される付加物と別個の範囲のＤＮＡ付加物を形成するようにそれらが設計され、従ってそれらが後天的Ｐｔ耐性を妨げることができるという事実に由来する（非特許文献１２）。
【０００７】
一般にトランス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）類似体は、それらのシスの相手より低い水溶液中における溶解度を有し、限られたバイオアベイラビリティーを生ずる。水溶解度を向上させる１つの方法は錯体に電荷を加えることによる方法である。Ｆａｒｒｅｌｌ等は、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）の型の化合物の劣った水溶解度の克服においていくらかの努力をしたが、ＮＨ３及び平面状リガンドのトランス配向及び四角形−平面状物（ｓｑｕａｒｅ−ｐｌａｎａｒ ｅｎｔｉｔｙ）の電気的中性性を保持した。トランス−白金錯体、トランス−［ＰｔＣｌ（ＰｙＡｃ−Ｎ，Ｏ）（ＮＨ３）］（ＰｙＡｃ＝ピリジン−２−イルアセテート、Ｎ−ドナーはトランス）及びそのシス異性体が合成され、トランス異性体は類似錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）と比較して水中における溶解度の向上を示した（約４〜５ミリモルＬ−１）（非特許文献１３）。他方、Ｆａｒｒｅｌｌ等により、及びまたＨｏｌｌｉｓ等により製造される白金錯体のカチオン性電荷は金属中心上にあり、アニオン性クロリドリガンドの１つの中性リガンドによる置換から生ずる（非特許文献１４）。
【非特許文献１】
Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｅ．Ｒ． ＆ Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ＤＮＡ Ａｄｄｕｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４６７−２４９８
【非特許文献２】
Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．＆ Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，１−２１
【非特許文献３】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｖ．Ｍ．；Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ａｌｏｎｓｏ Ｃ．；Ｐｅｒｅｚ Ｊ．Ｍ．著，Ｉｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｌｗａｙｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ？ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，５９，４，６５７−６３
【非特許文献４】
Ｋａｒｔａｌｏｕ Ｍ，Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ ＪＭ．著，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，２３−４３
【非特許文献５】
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｏｎ，Ｔ．Ｌ．＆ Ｒｅｅｄ，Ｅ．著，Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃ．１９９３，５０，２，１４７−１５８
【非特許文献６】
Ｗｏｎｇ，Ｅ．＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ｃ．Ｍ．著，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｄｒｕｇｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４５１−２４６６
【非特許文献７】
Ｃｌｅａｒｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｏｅｓｃｈｅｌｅ，Ｊ．Ｄ．著，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｒｏｕｐ ＶＩＩＩ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｎｉｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，２，１８７−２１０
【非特許文献８】
Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．；Ｑｕ，Ｙ．；Ｈａｍｂｌｅｙ，Ｔ．Ｗ．；Ｐｅｒｏｕｔｋａ，Ｊ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｌ．；Ｄｏｅｄｅｅ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）Ｌ］（Ｌ＝Ｐｌａｎａｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ ａｎｄ Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ Ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌｌｙ Ｐｌａｔｉｎａｔｅｄ ＤＮＡ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；３８，１５，３５３５−３５４２
【非特許文献９】
Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｅ．Ｉ．；Ｄｉａｚ，Ｓ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖａｄｉｌｌｏ，Ａ．Ｍ．；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．＆ Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．著，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｖｅｌ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ（２）（ａｍｉｎｅ）（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）］ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，２０，４２６４−４２６８
【非特許文献１０】
Ｃｏｌｕｃｃｉａ，Ｍ．；Ｎａｓｓｉ，Ａ．；Ｂｏｃｃａｒｅｌｌｉ，Ａ．；Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｄ．；Ｃａｒｄｅｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｎ．；Ｌｏｃｋｅｒ，Ｄ．；Ｌｅｎｇ，Ｍ．；Ｓｉｖｏ，Ｍ．；Ｉｎｔｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．；＆ Ｎａｔｉｌｅ，Ｇ．著，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｌｉｇａｎｄｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，３１−３５
【非特許文献１１】
Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｒｏｕｔｋａ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｆａｒｒｅｌｌ著，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，５１−５７
【非特許文献１２】
Ｋｅｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｒ；Ｓｈａｒｐ，Ｓ．Ｙ．；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｃ．Ｆ．；Ｒａｙｎａｕｄ，Ｆ．Ｉ．；Ｂｅａｌｅ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｓｏｎ，Ｉ．著，Ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，Ｉ １−２，１１１−１１５
【非特許文献１３】
Ｂｉｅｒｖａｃｈ，Ｕ．；Ｓａｂａｔ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．著，Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｎｅｖｅｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｎ，Ｏ−Ｄｏｎｏｒ Ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００；３９（９）；１８８２−１８９０
【非特許文献１４】
Ｈｏｌｌｉｓ，Ｌ Ｓ；Ａｍｕｎｄｓｅｎ，Ａ Ｒ；Ｓｔｅｒｎ，Ｅ Ｗ．著，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒｓ：ｃｉｓ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（Ｎ−ｄｏｎｏｒ）Ｃｌ］＋，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８９，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １２８−１３６
【発明の開示】
【０００８】
発明の概略
本発明は、その側面の第１に従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
を有する新規な白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金錯体に関する。
【０００９】
本発明のＰｔ−錯体はダイマーの形態にあることができ、そこにおいて各モノマー単位は、独立してＡｍ１リガンドを介して又はＡｍ２リガンドを介して又は該Ａｍ１もしくはＡｍ２に連結したリンカーを介して他のＰｔ−錯体に結合した定義されている通りのＰｔ−錯体である。
【００１０】
他の側面に従い本発明は、製薬学的に許容され得る担体ならびに活性成分として一般式：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
のＰｔ錯体であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできないＰｔ錯体の治療的に有効な量を含む製薬学的組成物に関する。
【００１１】
製薬学的組成物はモノマーの形態における、又は上記で定義したダイマーの形態における本発明のＰｔ−錯体を含むことができる。
本発明は、必要のある患者に治療的効果を達成するのに十分な量の白金錯体（モノマー又はダイマーの形態における）を投与することを含み、Ｐｔ錯体が一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示し、
但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない］
を含む治療的効果を達成するための方法にも関する。
【００１２】
図の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｂは、Ｃ−２６ガン細胞（図１Ａ）又はＯＶ−１０６３ガン細胞（図１Ｂ）によるシスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−ｏ−）の吸収を示す。Ｐｔ含有量は原子吸光分析法（ＡＡＳ）により決定された。
【００１３】
図２Ａ〜２Ｂは、Ｃ−２６ガン細胞（図２Ａ）又はＯＶ−１０６３ガン細胞（図２Ｂ）におけるシスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−ｏ−）のＤＮＡ白金化レベルを示す。Ｐｔ含有量は原子吸光分析法（ＡＡＳ）により決定された。
【００１４】
図３は、シスプラチン（−：−）；トランスプラチン（−＾−）；トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−ｘ−）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−？−）により改変された種々の濃度のＤＮＡへのＥｔＢｒ蛍光の依存性を示す。データ点は三重に測定され、それは平均で±３％変動した。
【００１５】
図４は、ＩＣ５０値のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（６．５μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（４−ｐｉｃ）（ｐｉｐ）］）、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（それぞれ７．５μＭ又は６．５μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（４−ｐｉｃ）（ｐｚ）］・ＨＣｌ）、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（それぞれ４μＭ又は６μＭ，ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ｐｉｐｏ−ｐｉｐ）］・ＨＣｌ）又はシスプラチン（それぞれ２μＭ又は１μＭ）で処理されたＯＶ−１０６３細胞における、未処理の（標準細胞）と比較されるキャスパーゼ−３−活性を示す。薬剤−処理された細胞及び標準の細胞の両方を次いで回収し、溶解し、キットの案に記載されている通り、指示される長さの時間の後に検定した。
【００１６】
図５は、シスプラチン（−？−）；トランスプラチン（−：−）；トランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペリジン）］（−＾−）；及びトランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（−：−）へのユビキチンの結合曲線を示す。
【００１７】
図６は、Ｃ−２６結腸ガンが接種され、本明細書下記に記載されるスケジュールに従って処置された雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、シス−ＤＤＰ（−：−）と比較されるトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（−：−）の抗腫瘍活性を示す。
発明の詳細な記述
本発明は、Ｐｔ−錯体中に非−平面状複素環式脂肪族アミンリガンドが含まれることが、例えばガン処置の分野において治療的利点を有するという驚くべき発見に基づく。本発明に従うＰｔ−錯体は少なくとも１個の非−平面状複素環式アミンリガンドを含み、それは柔軟性であり且つ水素結合ドナーを有し、それは他の物質と、例えばＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる。リガンドは、得られる錯体の速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高いこともできる。
【００１８】
かくして本発明はその側面の１つに従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金錯体を提供する。
【００１９】
本明細書で用いられる「Ｐｔ−錯体」という用語は、その最も広い意味において、２個のアミン−含有リガンドを含み、少なくとも１個のリガンドが非−平面状複素環式脂肪族アミンであるいずれのＰｔ−錯体をも指す。これらの錯体はシス及びトランス位置異性体の両方を含む（但し、錯体がシス立体配置にある場合、２個のアミンリガンドは同時にはピペリジンを示さない）。Ｐｔ−錯体は、金属中心として配位されたＰｔ（ＩＩ）又は配位されたＰｔ（ＩＶ）を含むことができる。さらにＰｔ−錯体はダイマーの形態にあることができ、そこにおいて各モノマー単位は、独立してそのアミンリガンドの１つを介して直接、あるいは該Ａｍ１又はＡｍ２に連結したリンカーを介して他のＰｔ−錯体に結合している上記で定義されたＰｔ−錯体であり、２個のアミンリガンドは一緒になって、窒素結合を介してそれぞれのＰｔ金属と配位するピペリジン環のような環式環を形成することもできる。
【００２０】
好ましい態様に従うと、Ｘ及びＹは同一もしくは異なり、クロリド又はヨーダイドを示し、より好ましくはＸ及びＹは両方ともクロリドを示す。
【００２１】
本発明に従うと、Ａｍ１はアンモニア；これらに限られるわけではないがメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、ｎ−ヘプチルアミン又はｎ−ノニルアミンのような第一級アミン；これらに限られるわけではないがジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミンのような第二級アミン；これらに限られるわけではないがピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンのような非−平面状複素環式脂肪族アミン；あるいはこれらに限られるわけではないがピリジン、２−、３−もしくは４−アミノピリジン、２−、３−もしくは４−ピコリン、キノリン、３−もしくは４−アミノキノリン、チアゾール、イミダゾール、３−ピロリン、ピラジン、２−メチルピラジン、４−アミノキナルジンのような複素環式芳香族アミンを示すことができる。
【００２２】
本発明に従うＡｍ２は非−平面状複素環式アミン、例えばこれらに限られるわけではないがピペラジン（本明細書で時々「ｐｚ｝の略字により言及される）、２−メチルピペラジン、ピペリジン（本明細書で時々「ｐｉｐ」の略字で言及される）、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン（本明細書で時々「ｐｉｐ−ｐｉｐ」の略字により言及される）、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンである。
【００２３】
上記で示した通り、本発明のＰｔ−錯体は上記で定義した一般式（Ｉ）を有する錯体のすべての位置異性体を指す。１つの側面に従うと、Ｐｔ−錯体はトランス立体配置にある。特定の例には：
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ヒドロキシピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４，４’−ビピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）２］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ；
が含まれる。
【００２４】
さらに別の側面に従うと、錯体はシス立体配置にある。特定のシス異性体にはシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］又はシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌが含まれるがこれらに限られない。
【００２５】
上記で示した通り、非−平面状複素環式アミンリガンドは柔軟性であり且つＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる水素結合ドナーを有し、得られる錯体の速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高い。さらに、ピペラジンのようなアミンリガンドのいくつかは錯体に正の電荷を与え、かくして十分な水溶解度及びＤＮＡのようなポリアニオン性分子との錯体の迅速な相互作用を保証する。
【００２６】
錯体はダイマーの形態にあることもできる。従って、２個のＰｔ−錯体が原子価結合、各Ｐｔ−錯体のアミン置換基の間で形成される環式環（例えば一緒になってピペラジン環を形成する）を介して、あるいは各錯体のＡｍ１又はＡｍ２リガンドに連結するリンカーにより会合する。リンカーの制限ではない例には短いポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）、短いジアミノアルカン類（例えば１，６−ジアミノヘキサン、１，８−ジアミノオクタン）が含まれる。リンカーに関する特定の例は４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン鎖であり、２個のＰｔ−錯体がこのリンカーにより会合している１つの特定のダイマーはビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２ピペラジン）２｝（４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン）］・２ＨＣｌである。
【００２７】
本発明は、製薬学的に許容され得る担体ならびに活性成分として上記で定義した本発明のＰｔ−錯体の治療的に有効な量を含む製薬学的組成物にも関する。
【００２８】
本発明のＰｔ−錯体は優れた医学的慣習に従い、個々の患者の臨床的状態、投与の部位及び方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重及び医療実施者に既知の他の因子を考慮して、投与され、投薬される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａｎｄ ｄｏｓｅｄ）。本明細書の目的のための治療的に「有効な量」は、かくして当該技術分野において既知の考察により決定される。その量は、本発明の活性成分を用いて処置される疾患状態からの生存率の向上又はより迅速な回復あるいは疾患状態と関連する症状の改善もしくは除去ならびに当該技術分野における熟練者により適した尺度として選ばれる他の指標を含むがこれらに限られない改善を達成するのに有効でなければならない。
【００２９】
有効量は典型的には適切に設計される臨床試験（投薬量範囲研究）において決定され、当該技術分野における熟練者は有効量を決定するためにそのような試験をいかにして適切に行なうかを知っているであろう。一般的に既知の通り、有効量はＰｔ−錯体の、例えばＰｔ−ＤＮＡ付加物を形成するためのＤＮＡへの親和性、体内におけるＰｔ−錯体の分布プロファイル、多様な薬理学的パラメーター、例えば体内における半減期を含む多様な因子、もしあるとしたら望ましくない副作用、年齢及び性別などのような因子に依存する。
【００３０】
Ｐｔ−錯体の送達のために多くの投与様式を用いることができ、これらは当該技術分野において既知の通り、種々の担体、添加剤、エリキサーなどの使用を必要とするであろう。
【００３１】
明らかに、本発明に従って用いられる製薬学的に許容され得る担体は一般に、それらがＰｔ−錯体の所望の治療効果を邪魔しないかもしくは妨げず且つ本発明のＰｔ−錯体と反応しない程度までの不活性無毒性固体もしくは液体充填剤、希釈剤又はカプセル封入材料を指す。
【００３２】
Ｐｔ−錯体を経口的に、皮下的に又は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内及び鼻内投与ならびに包膜内投与及び輸液法による投与を含む非経口的に投与することができる。さらに、肺への吸入器を介する送達のためにＰｔ−錯体をクロロフルオロカーボンもしくはヒドロフルオロカーボンプロペラント中に懸濁させることができる。あるいはまた、Ｐｔ−錯体をマトリックス（ラクトースなど）又は担体（例えばリポソームなど）中で調製することができ、それは経口的、舌下的又は座薬による送達を可能にするであろう。
【００３３】
投薬は１回の投薬又は数日間に及ぶ複数回の投薬であることができる。処置は一般に疾患経過の長さ及び活性成分の有効性及び処置されている患者の種に比例する長さを有する。さらに、本発明のＰｔ−錯体の投与は断続的であるか、あるいは漸次的又は連続的、一定の又は制御された割合における患者への投与であることができる。本明細書に記載される白金化合物を用いる治療的処置のための宿主又は患者は一般に哺乳類、例えば人間、犬及びネズミ類などである。
【００３４】
本発明のＰｔ−錯体を非経口的に投与する場合、それは一般に注入可能な単位投薬量の形態で調製されるであろう（溶液、懸濁剤、乳剤）。注入に適した製薬学的調剤には無菌の水溶液もしくは分散液及び無菌の注入可能な溶液もしくは分散液への再構築のための無菌の粉剤が含まれる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、脂質ポリエチレングリコールなど）、それらの適した混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。綿実油、ごま油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ひまわり油又はピーナッツ油ならびにエステル、例えばミリスチン酸イソプロピルのような非水性ビヒクルを本発明のＰｔ−錯体のための溶媒系として用いることもできる。
【００３５】
さらに、抗微生物性防腐剤、酸化防止剤及び緩衝剤を含む本発明のＰｔ−錯体含有組成物の安定性、無菌性及び等張性を増強する種々の添加剤を加えることができる。種々の抗バクテリア剤及び抗菌・カビ剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより微生物の作用の防止を確実にすることができる。
【００３６】
本発明の製薬学的組成物を必要のある患者に経口的に投与することもできる。錠剤、懸濁剤、溶液、乳剤、カプセル、粉剤、シロップなどにおいて活性化合物を投与するような通常の方法が有用である。それを経口的又は静脈内に送達し且つその生物学的活性を保持する既知の方法が好ましい。
【００３７】
１つの好ましい態様に従うと、本発明のＰｔ−錯体はリポソームにより閉じ込められるか又はその上に充填される。本明細書で用いられる「リポソーム」という用語は、自然に又は自然にではなく小胞を生ずることができるリポソーム−形成性脂質、例えば少なくとも１個のアシル基が複雑なリン酸エステルにより置き換えられているグリセリドであるリン脂質のすべての球又は小胞を含む。
【００３８】
「充填される」又は「閉じ込められる」という用語は、リポソームの内部に閉じ込められるか、リポソームの表面に露出されるかもしくは存在するか、リポソームの膜内に埋め込まれることを意味する。
【００３９】
本発明に従うリポソームはいずれの既知のリポソーム形成性脂質からも形成され得る。本明細書で用いられる場合、「リポソーム−形成性脂質」という用語は、特徴的に異なる性質、例えば親水性と疎水性の両方を有する基又はそのような分子の混合物を含有し、その水性媒体中の分散液においてリポソーム性小胞を形成する生理学的に許容され得る両親媒性物質を示す。リポソームは１種の両親媒性物質から、又はそのような物質の混合物から成ることができる。
【００４０】
両親媒性物質には中でもリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、例えばセレブロシド及びガングリオシド、ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｉｄｓ）及びステロール類、例えばコレステロール及び他が含まれる。本発明の方法による使用のために、通常既知のいずれのリポソーム−形成性脂質も適している。脂質の源又はその合成法は重要ではない：改変されたもしくは改変されない自然に存在するいずれかの脂質又は合成ホスファチドを用いることができる。
【００４１】
好ましいリポソーム−形成性両親媒性物質は天然、半−合成又は完全に合成の分子；負に又は正に帯電した脂質、場合によりコレステロールのようなステロールと；及び／又はＰＥＧ化脂質のようなリポポリマーと組み合わされていることができるリン脂質又はスフィンゴ脂質である。
【００４２】
本発明により用いられるリポソームを、種々の生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ）を含むいずれかの特定の貯蔵体（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の必要条件に適合させて作ることができ、それは凝集又はクロマトグラフィー分離なくそれらの安定性を保持し、それにより注入される流体中に十分に分散され且つ懸濁されたままである。その場の流動性は組成、温度、塩分、二価カチオン及びタンパク質の存在の理由で変化する。他の溶媒又は界面活性剤と一緒に又はそれらなしでリポソームを用いることができる。
【００４３】
本発明に従う好ましいリン脂質の組み合わせには（ＨＳＰＣ）：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの混合物（ＨＳＰＣは水素化大豆ホスファチジルコリンを指し、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはＰＥＧ２０００が頭基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）に結合したジ−ステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミンを指す）、あるいはまたジアシルグリコールＰＥＧ（２個のステアロイルアシル鎖を有する）又はコレステロール−ＰＥＧが含まれる。
【００４４】
本発明の組成物は治療的効果を達成することを目的とし、治療的効果は本発明のＰｔ錯体とＤＮＡのような核酸分子の間の付加物の形成を含む。治療的効果は望ましくない細胞増殖の阻害又は望ましくない細胞のアポトーシスの誘導を含むことができる。
【００４５】
かくして本発明の組成物を、望ましくない細胞増殖と関連する疾患状態の処置又は予防のために用いることができる。本明細書で用いられる「処置又は予防」という用語は、疾患状態と関連する望ましくない症状の改善に、そのような症状が起こる前にそれらの発現を妨げるのに、疾患の進行を遅らせるのに（病気の組織の増殖の速度から明らかになり得る）、症状の悪化を遅らせるのに、軽快期の開始を増進させるのに、疾患の進行性慢性期において引き起こされる不可逆的な損傷を遅らせるのに（例えば自己免疫疾患において）、該進行性期の開始を遅らせるのに、重度を低くするか又は疾患を治癒させるのに、生存率を向上させるか又はより急速な回復を達成するのに、あるいは疾患が起こるのを妨げるのに、あるいは上記の２つもしくはそれより多くの組み合わせのために有効である本発明の組成物の治療的量の投与を指す。
【００４６】
かくして本発明は治療的効果を達成するための方法にも関し、その方法は必要のある患者に該治療的効果の達成に十分な量の本発明に従う白金錯体を投与することを含む。１つの態様に従うと、本発明のＰｔ−錯体は抗−ガン剤として用いられる。
【００４７】
ここで以下の制限ではない実施例により本発明をさらに説明する。前記の記述は本発明のいくつかの特定の態様のみを詳細に記載しているが、本発明はそれらに制限されないことならびに特許請求の範囲により定義される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、形式及び詳細において他の変動が可能であり、それらは明細書の開示内に含まれるとして読まれるべきであることが当該技術分野における熟練者により理解されるであろう。
特定の態様の詳細な記述
【実施例１】
【００４８】
−化学合成
（１）ピペリジン−含有Ｐｔ錯体の合成
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（Ｒ）］の製造のための一般的方法
以下の記述において、Ｒは下記のピペリジン誘導体のいずれか１つを指す：ピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、１，４’−ビスピペリジン。さらなる参照のために、得られる誘導体を括弧内の参照番号により同定する。
【００４９】
シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，１ミリモル）を３０ｍＬの二回蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）、ＤＤＷ中に懸濁させた。２当量（ｅｑ．）のピペリジン誘導体を加え、懸濁液を８５℃に３時間加熱した。この時間の間に黄色の懸濁液は無色透明の溶液に変わった（いくつかの場合には黒色沈殿が生成した）。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、１ｍＬの濃ＨＣｌを滴下した。温度を９０℃に６時間上げ、その間に黄色の生成物、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン誘導体）］が沈殿した。反応混合物を室温で４時間放置し、その後黄色の生成物を濾過により集め、４０ｍＬのＤＤＷ、１０ｍＬのＥｔＯＨ及び４０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］（１）：収率８６．９％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１６７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４−ヒドロキシピペリジン）］（２）：収率８０．０％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２ＯＰｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１７２ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］（３）：収率７８．５％．分析（Ｃ１０Ｈ２４Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７０ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（４，４’−ビピペリジン）］（４）：収率８５．９％．分析（Ｃ１０Ｈ２４Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７５ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （４−ピコリン）（ピペリジン）］の製造のための方法（５）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（２００ｍｇ，０．４８２ミリモル）を３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解した。４−ピコリン（２．５当量，１１７．３μＬ；１．２ミリモル）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。黄色の沈殿、シス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）２］［１９５Ｐｔ ＮＭＲ（ＤＭＦ）＝−１９６４ｐｐｍ］を濾過により集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。シス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）２］（２２６ｍｇ，０．５ミリモル）を４０ｍＬのＤＤＷ中に２当量のピペリジン（９９μＬ，１ミリモル）と一緒に懸濁させ、懸濁液を８０℃に３時間加熱した。溶液は透明且つ無色に変わり、黒色の沈殿がいくらか生成した。反応混合物を室温に冷まし、沈殿した材料を濾過した。無色の濾液に１ｍＬの濃ＨＣｌを加え、混合物を９０℃に加熱した。加熱を６時間保持し、その間に黄色の沈殿が生成した。反応混合物を室温に冷まし、沈殿（１８０ｍｇ）を集め、５０ｍＬのＤＤＷ、１０ｍＬのＥｔＯＨ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。
【００５０】
収率：８１％．分析（Ｃ１１Ｈ１８Ｃ１２Ｎ２Ｐｔ）：Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２０８７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン） ２ ］の製造のための方法（６）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、それに（１．３３０グラム，８ミリモル）のＫＩを加え、赤色の溶液を室温で２０分間攪拌した。攪拌されている溶液に（２０２μｌ，２ミリモル）のピペリジンをゆっくり加えた。室温で１時間攪拌した後、黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び次いで５０ｍＬのエーテルで洗浄した。シス−［ＰｔＩ２（Ｐｉｐ）２］（３００ミリグラム，０．４８４ミリモル）を２０ｍＬのＤＭＦ中に取り上げ、１６４．５ミリグラム（０．９７ミリモル）のＡｇＮＯ３及び（９８μｌ，１．９４ミリモル）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。沈殿を濾過した後、溶液を蒸発乾固した。ゴムに２０ｍＬのＤＤＷを加え、３０分間攪拌した。不溶性の材料を濾過し、２ｍＬの濃ＨＣｌを加えた。酸性化された溶液を９０℃に５時間温めた。室温に冷却した後、黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのエーテルで洗浄した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン） ２ ］（６）：収率：９１％．分析（Ｃ１０Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）：Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２０８０ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］の製造のための方法（７）
Ｋ２ＰｔＣｌ４（４１５ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、８当量のＫＩ（１．３２８ｇ，８ミリモル）を加えた。混合物を室温で１５分間攪拌し、次いで２当量のピペリジン（１９８μＬ，２ミリモル）をゆっくり加えた。混合物を室温で１時間攪拌し、その間に黄色の沈殿が生成した。沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び２０ｍＬの（１：１）アセトン：ジエチルエーテル混合物で十分に洗浄した。乾燥後、黄色の沈殿（５００ｍｇ，０．８ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ及び４０ｍＬのエタノールの混合物中に懸濁させ、それに１ｍＬの過塩素酸（７０％）を加えた。懸濁液を室温で８日間攪拌した。この期間の間に、黄色の沈殿は褐色に変わった。褐色の沈殿を濾過により集め、４０ｍＬのＤＤＷ及び２０ｍＬのアセトン：ジエチルエーテル（１：１）で洗浄した。乾燥後、沈殿を２０ｍＬのＤＤＷ中に再−懸濁させ、０．５ｍＬの２５％ＮＨ４ＯＨを滴下し、混合物を２４時間激しく攪拌し、その間に褐色の沈殿は黄色に変わった。黄色の沈殿を集め、５０ｍＬのＤＤＷ及び１０ｍＬのアセトン−ジエチルエーテルで十分に洗浄し、連続的吸引により乾燥した。生成物は混合シス−アミン−ピペリジン−ジヨード白金（ＩＩ）として分析された［１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）＝−３２６０ｐｐｍ］。
【００５１】
シス−アミン−ピペリジン−ジヨード白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，０．５４ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ中に懸濁させ、２当量のＡｇＮＯ３（１８４．９ｍｇ，１．０８ミリモル）を加えた。懸濁液を暗所で２４時間激しく攪拌した。ＡｇＩ沈殿を濾過し、水性濾液を５０−ｍＬの容器に移し、それに０．５ｇのＫＣｌを加えた。無色の溶液は黄色がかり、ジクロロ−ジアミン白金（ＩＩ）生成物が沈殿し始めた。室温で４時間の後、黄色がかった沈殿（２６０ｍｇ）を集め、５０ｍＬのＤＤＷで十分に洗浄し、１００ｍＬのジエチルエーテルで洗浄することにより乾燥した。
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペリジン）］（７）の全体的収率：６９％．分析（Ｃ５Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．１９５Ｐｔ ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−２１５９ｐｐｍ．
（２）ピペラジン錯体の合成
本明細書で示す研究の１つの目的は、水溶性であり、ＤＮＡと迅速に反応し且つシスプラチン及びトランスプラチンにより形成されるものと異なるＤＮＡとの付加物を形成することができる白金錯体を設計し且つ製造することであった。これはリガンドとしてピペラジンを有するいくつかの追加のトランス−Ｐｔ誘導体の設計及び合成に導いた。このリガンドは、それが錯体に正の電荷を与え、かくして十分な水溶解度及び迅速なポリアニオン性ＤＮＡとの相互作用を保証するであろう故に選ばれた；それは、柔軟性であり且つＤＮＡと相互作用して損傷を形成することができる水素結合ドナーを有する非−平面状複素環式アミンリガンドであり；且つそれは速度論及び細胞毒性に影響するのに十分に嵩高い。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）
シス−ジアミン−ジクロロ白金（ＩＩ）、（３００ｍｇ，１ミリモル）を３０ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、２当量（３７２．５２ｍｇ，２ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル及び２当量（３３９．７６ｍｇ，２ミリモル）のＡｇＮＯ３を攪拌しながら同時に加えた。暗所で室温において２４時間攪拌を続けた。セライト焼結ガラスを介して沈殿を濾過し、濾液を減圧下で蒸発乾固した。得られるゴムを３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、２ｍＬの濃ＨＣｌを加え、反応混合物を室温で２４時間攪拌した。着色沈殿を除去し、溶液を８５〜９０℃に６０分間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、濾液を０℃に７２時間冷却した。黄色の沈殿を濾過し、１０ｍＬの氷−冷ＤＤＷ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。乾燥後、黄色の生成物（３００ｍｇ）を所望のトランス−アミン−ピペラジン−ジクロロ白金（ＩＩ）（８）の塩酸塩として分析した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）収率：７４％．分析 Ｃ４Ｈ１４Ｃｌ３Ｎ３ＰｔＨ２Ｏに関する計算値：Ｃ，１１．３４％；Ｈ，３．８１％；Ｎ，９．９２％．測定値：Ｃ，１１．２７％；Ｈ，３．５６％；Ｎ，９．８６％．１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１７７ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （Ａｍ １ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌの製造のための一般的方法
以下の記述においてＡｍ１は下記のアミンのいずれか１つを指す：ｎ−ブチルアミン、イソプロピルアミン、４−ピコリン、ピペリジン、ピペラジン。
【００５２】
中間体シス−［ＰｔＩ２（１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）２］の合成：テトラクロロ白金酸カリウム（１ｇ，２．４ミリモル）を４０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、８当量（３．２ｇ，１９．２７ミリモル）のＫＩを加えた。混合物を室温で１５分間攪拌した。２当量（０．９ｇ，４．８ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加え、混合物を室温で１時間激しく攪拌した。この時間中ずっと、所望のジヨードジアミン白金（ＩＩ）が沈殿していた。黄色の沈殿を濾過により集め、５０ｍＬのＤＤＷで洗浄し、吸引により乾燥した。
シス−［ＰｔＩ ２ （１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル） ２ ：収率：８９％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，ＤＭＦ）：−３２６４ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＩ２（１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）２（４１１ｍｇ，０．５ミリモル）を暗所で１５ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、２当量（１６９．８８ｍｇ，１ミリモル）のＡｇＮＯ３を２当量の対応するアミン（９８．８３μＬのｎ−ブチルアミン、８５．１７μＬのイソプロピルアミン、９７．４μＬの４−ピコリン、９９μＬのピペリジン又は１８６ｍｇの１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル）と同時に加えた。暗所で室温において２４時間攪拌を続けた。セライト焼結ガラスを介して沈殿を濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固した。得られるゴムを３０ｍＬのＤＤＷ中に溶解し、２ｍＬの濃塩酸を加え、反応混合物を室温で２４時間攪拌した。着色沈殿を除去し、溶液を８５〜９０℃に６０分間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、濾液を０℃に２４時間冷却した。黄色の沈殿を濾過し、２０ｍＬの氷−冷ＤＤＷ及び３０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。乾燥後、黄色の生成物を所望のトランス−ジアミン−ジクロロ白金（ＩＩ）錯体の塩酸塩として分析した。
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（９）：収率 ７１％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２２６ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１０）：収率 ６７％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２２１ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１１）：収率 ７７％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３６ｐｐｍ．
２５．０６％，Ｈ：３．８２％，Ｎ：８．５５％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２０８６ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１２）：収率 ５６％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３０ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）：収率 ６１．２％，分析 Ｃ１０Ｈ１８Ｃｌ３Ｎ３Ｐｔに関する計算値：Ｃ：２４．９９％，Ｈ：３．５６％，Ｎ：８．７４％，測定値：Ｃ：２５．０６％，Ｈ：３．８２％，Ｎ：８．５５％，
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１４）：収率 ８３％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３８ｐｐｍ．
トランス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ（１５）：収率 ８３％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２２３８ｐｐｍ．
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌの製造のための方法（１６）
テトラフェニルホスホニウムトリクロロ−モノアミン−白金（ＩＩ）（３００ｍｇ，０．４５ミリモル）を１０ｍＬの１：１アセトン／ＤＤＷ混合物中に溶解した。オレンジ−色の溶液に１当量（７７．５３ｍｇ，０．４５ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加えた。密閉容器中で室温において７日間混合物を攪拌した。減圧下で溶液を蒸発乾固した後、黄色の固体を１０ｍＬの無水エタノール中に取り上げ、０．５ｍＬの濃塩酸を加え、混合物を終夜放置した。黄色の沈殿を濾過により集め、１０ｍＬのエタノールで洗浄した。
シス−［ＰｔＣｌ ２ （ＮＨ ３ ）（ピペラジン）］・ＨＣｌ：収率５８％，１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（δ，Ｈ２Ｏ）：−２１８７ｐｐｍ．
【実施例２】
【００５３】
−生物学的アッセイ
細胞培養
Ｈａｄａｓｓａｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ病院で樹立されたヒト卵巣ガン細胞系（ＯＶ−１０６３）及びヒト結腸ガン細胞系（Ｃ−２６）を、１０％ＦＣＳ、抗生物質及びグルタミンが補足されたＲＰＭＩ−１６４０培地中に保持した。すべての培養培地成分はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入された。両細胞系は３７℃において水−ジャケット付きＣＯ２インキュベーター中で保持された。
【００５４】
さらに３対のシスプラチン感受性及び耐性のガン細胞系（Ａ２７８０／Ａ２７８０ｃｉｓＲ、４１Ｍ，／４１ＭｃｉｓＲ及びＣＨ１／ＣＨ１ｃｉｓＲ）を用いた（１５）。これらの細胞系の対はシスプラチンに対する耐性の既知の主要な機構のすべてを包含することに基づいて選ばれた：４１ＭｃｉｓＲは主に薬剤輸送の低下を介して耐性であり（１６）、ＣＨ１ｃｉｓＲは強化されたＤＮＡ修復／寛容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を介して耐性であり（１７）、Ａ２７７８０ｃｉｓＲは吸収の減少、強化されたＤＮＡ修復／寛容性及びＧＳＨ量の増加の組み合わせを介して耐性である（１８）。
薬剤
シスプラチン及びトランスプラチンは（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により供給された。すべての薬剤は実験の直前に正常食塩水中に溶解された。
細胞生存のメチレンブルーアッセイ
合成された錯体の細胞毒性をメチレンブルー（ＭＢ）染色アッセイにより調べた（１９）。２００μｌの培地中の指数関数的に成長する細胞の決められた（ｆｉｘｅｄ）数を９６穴平底プレート中にプレーティングした。調べられる錯体のそれぞれに関し、４個のウェルを用いた。培養中で２４時間の後、未処理の細胞を含有する各ウェルに２０μｌの種々の濃度の錯体を加えた。標準に正常食塩水を加えた。細胞を錯体に４、２４又は７２時間暴露した。決められた時間の間の暴露の最後に、処理された細胞ならびに平行標準細胞を洗浄し、実験の終止まで新しい培地中でインキュベーションを続けた。７２時間の成長の後、５０μｌの２．５％グルタルアルデヒドを各ウェルに１５分間加えることにより細胞を固定した。固定された細胞を新しい脱イオン水で１０回及びホウ酸塩緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝８．５）で１回濯ぎ、乾燥し、ＭＢ（０．１Ｍホウ酸塩緩衝液中の１％溶液の１００μｌ，ｐＨ＝８．５）を用い、室温で１時間染色した。染色された細胞を脱イオン水を用いて十分に濯ぎ、非−細胞−結合色素を除去し、次いで乾燥した。固定された細胞に結合したＭＢを、３７℃において２００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌと一緒に１時間インキュベーションすることにより抽出し、各ウェルにおける色素の正味の光学濃度（ＯＤ）を平板分光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｙｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により６２０ｎｍにおいて決定した。
【００５５】
９６穴プレートを用いるＭＢ法の利点は、細胞増殖の速度及び生存についての広範囲の実験を多数のデータ点を用いて行なう可能性であり、その方法では種々の実験的錯体に関して細胞が同じプレートにおいて生育され、正確に同じ条件で検定される。細胞生存の評価に関するＭＢアッセイの妥当性は、ＭＢ比色アッセイとコロニー−形成単位アッセイの結果の間の高い関連性により支持される（２０）。
ミクロ培養テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ及び細胞生存
合成された錯体の細胞毒性をＭＴＳ法（２１）によっても調べた。従って化合物を対応する細胞系と一緒に２４時間インキュベーションし、化合物処理した培養における細胞生存を評価した。
白金錯体細胞内蓄積測定
細胞を播種してから４８時間後に錯体の１つを培養培地に加えた。２４時間の暴露の後、錯体を除去し、細胞を氷−冷ＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化した。細胞（１＊１０６個）を乾燥し、６５％ＨＮＯ３（ＢＤＨ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中で１０分間加熱することにより鉱物化した（２２）。試料を脱イオン水中に溶解し、各試料を２種の希釈において無炎Ｚｅｅｍａｎ原子吸光分析計（ＦＡＡＳ）により測定した。キャリブレーションカーブは、ｍｌ当たりに５０〜２５０ｎｇの白金の範囲の濃度を有する５つの標準のＫ２ＰｔＣｌ４貯蔵溶液を含んだ。１＊１０６個の細胞当たりのピコモルの白金として白金含有量を表した。
ＦＡＡＳによるＰｔ−ＤＮＡ付加物の決定
細胞を播種してから４８時間後に薬剤の１つを培養培地に加えた。２４時間の暴露の後、錯体を除去し、細胞を氷−冷ＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化した。白金−含有材料（２＊１０６個の細胞）からのＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、製造者の指示に従って細胞ペレットから抽出した。２６０ｎｍにおける吸光度により溶離物中のＤＮＡの濃度を測定することによって、ＤＮＡ収量を決定した。各試料から単離されたＤＮＡは平均で５０±１０μｇ／ｍｌであった。純度は２６０ｎｍにおける吸光度対２８０ｎｍにおける吸光度の比を計算することにより決定される；ＤＮＡの精製の程度は平均して９５％であった。
ＥｔＢｒ蛍光によるＰｔ−ＤＮＡ付加物の決定
ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含有するプラスミド（４．８ｋｂｐ）であるプラスミドｐＳ１６−ｈＧＨを以前に記載されている通りに調製した（２３）。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）での後−染色（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いるアガロースゲル（１％）電気泳動により、新しく調製されたＤＮＡを分析した。スーパーコイルプラスミドの定量的分析（２４）を行い、プラスミドＤＮＡが８５〜９０％スーパーコイル形態にあることを示した。ＵＶ−分光分析は、いずれのＤＮＡバッチ中にもタンパク質又はＲＮＡ汚染が存在しないことを示した。２６０ｎｍにおける吸光度対２８０ｎｍにおける吸光度の比は常に１．８〜１．９であった。
【００５６】
３７℃において暗所で２４時間、１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４（ｐＨ ７．０）中でＤＮＡを白金錯体により改変した。ＥｔＢｒ蛍光の測定をＬＳ５０Ｂルミネセンス分光分析器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で行なった。ＥｔＢｒの存在下において白金により改変されたＤＮＡの蛍光測定を、５４６ｎｍ（スリット１０ｎｍ）の励起波長及び５９０ｎｍ（スリット１０ｎｍ）の発光波長を用い、２５℃において行なった。濃度はＤＮＡに関して０．０１ｍｇ／ｍｌ及びＥｔＢｒに関して０．０４ｍｇ／ｍｌであり、それらはＤＮＡにおけるＥｔＢｒのすべての挿入部位の飽和に相当する。
アポトーシスの評価
２つの方法によりアポトーシスを評価した：
（１）メロシアニン ５４０（ＭＣ ５４０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）及び４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドンジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を用いるＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞の染色により。このアッセイは、アポトーシスの開始からすぐ後にホスファチジルセリン（ＰＳ）が原形質膜の内面から細胞表面に転位するという観察に基づく。この時点に、ＰＳに強い親和性を有するＭＣ ５４０を用いて染色することにより、ＰＳを容易に検出することができる（２５）。二重鎖ＤＮＡを優先的に染色するＤＡＰＩを用いる染色により、クロマチン凝縮（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を評価した。以下の実験において、５＊１０５個の細胞を含有する試料を、ガラスのカバースリップで覆われた６穴プレート上で培養した。ＩＣ５０の錯体で細胞を処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５μｌのＭＣ ５４０（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する５００μｌのＰＢＳ中で、暗所において２分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、３００μｌのＤＡＰＩ（３μＭ）で染色した。その後ガラスのカバースリップをガラススライド上に置き、蛍光共焦点顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて写真撮影した。
【００５７】
（２）ＥｎｚＣｈｅｋｔｍ Ｃａｓｐａｓｅ−３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により。このキットは、キャスパーゼ−３及び他のＤＥＶＤ−特異的プロテアーゼ活性（例えばキャスパーゼ−７）における向上に関して検定することにより、アポトーシスの検出を可能にする。アッセイのための基礎はローダミン １１０ ビス−（Ｎ−ＣＢＺ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−アスパラギン酸アミド）（Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）である。この基質はＲ１１０のアミノ基のそれぞれに共有結合したＤＥＶＤペプチドを含有するローダミン １１０（Ｒ１１０）のビスアミド誘導体である。酵素的に切断されると、非−蛍光性ビスアミド基質が蛍光性Ｒ１１０に転換され、それを４８５±１０ｎｍにおける励起及び５３５±１０ｎｍにおける発光検出を用いて蛍光マイクロプレートリーダーにより定量することができる。
【００５８】
簡単に記載すると、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞をＩＣ５０のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）（それぞれ４．５μＭ及び６．５μＭ）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）・ＨＣｌ］（１２）（それぞれ５μＭ及び７．５μＭ）を用いて５又は１６時間処理した。次いで「誘導された」細胞及び「標準」細胞の両方を回収し、溶解した。９６穴プレートにおいて５０μｇの細胞質ゾルタンパク質を用いて（５５分間のインキュベーション）及び２５μＭの最終的濃度のＺ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０基質を用いて、キットの案に記載されている通り、酵素反応を行なった。
生体内毒性及び抗−腫瘍効果
トランス−白金（ＩＩ）誘導体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］（３）を、シス−ＤＤＰに比較されるその毒性及び抗腫瘍有効性に関して評価した。
毒性
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］の毒性を８週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスについて評価し、シス−ＤＤＰと比較した。種々の濃度におけるこの新規な錯体及びシス−ＤＤＰを静脈内に、週間隔で３回注入し、動物の体重及び生存を評価した。
抗腫瘍有効性
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（１７〜２０ｇの体重範囲内）に１＊１０６個のＣ−２６結腸ガンを腹腔内に注入した。トリパンブルー排除によると、これらの細胞の生存率は＞９０％であった。
【００５９】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）の治療的有効性を研究し、シス−ＤＤＰと比較した。腫瘍の接種から後の３日に処置を開始し、週間隔で合計３回の注入のために２回繰り返した。
結果
Ｐｔ錯体の溶解度
劣ったバイオアベイラビリティーを生ずる中性のジアミンジクロロ白金（ＩＩ）化合物の低い溶解度は、一般式［ＰｔＣｌ２（Ａｍ）（Ｐｚ）］・ＨＣｌの正に帯電した錯体の設計及び合成に関する理由の１つであった。本明細書で示される化合物は、シスプラチンの場合の６．３ｍＭ及びトランスプラチンの場合の０．８ｍＭと比較して２０ｍＭの範囲内の溶解度を有し、それらの中性の相手より可溶性であることが示された。例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）はＤＤＷ（３７℃において）中で７．５ｍｇ／ｍｌ（１８．０ｍＭ）の溶解度を示した。
生物学的活性
試験管内成長阻害
合成されたトランス及びシス錯体の抗−腫瘍活性を評価するために、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞をこれらの錯体と一緒に４、２４又は７２時間インキュベーションした。ＭＢ細胞毒性アッセイは、トランスプラチンの１個の（ＮＨ３）又は両方の置き換えがＣ−２６及びＯＶ−１０６３ガン細胞系の両方において、新規なトランス−ＰｔＣｌ２化合物の細胞毒性を有意に（４倍より高く）増強することを明らかにした（表１）。
【００６０】
【表１】
１個のＮＨ３基を芳香族−平面状アミン（４−ピコリン）で置き換えてトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］を得るか、又は脂肪族非−平面状アミン（ピペリジン）で置き換えてトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］（１）を得ることは、トランスプラチンと比較して細胞毒性活性を増強した（表１）。錯体（１）が［トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］誘導体より細胞毒性であることに注目するべきであり、それは立体的に妨げられたアミンリガンドによりトランス位の活性化が達成され得ることを示唆している。４−ピコリンの芳香環の平面状水素と対照的に、反対の方向に向いている水素原子のために、ピペリジンは４−ピコリンより立体的に妨げられており、それは細胞毒性活性と関連し得る。
【００６２】
さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］中の第２のＮＨ３をピペリジンで置き換えて混合トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）を得ることは、化合物の細胞毒性を２〜３倍（ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ２−３）増強した（表１）。この観察は、錯体（５）のより高く立体的に妨げられた構造により説明され得る。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］はシスプラチンより３倍活性が低く、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］のより高いＩＣ５０値は、図１Ａ及び１Ｂにおいて示されるより少量のＰｔ−ＤＮＡ付加物と一致している。
【００６３】
トランス形の立体的に妨げられた化合物の細胞毒性をそれらのシスの相手、シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピコリン）］及びシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］（７）の細胞毒性と比較した。新しいトランス−Ｐｔ錯体中の１個のＮＨ３の置き換えの効果と対照的に、シスプラチンの１個のＮＨ３の芳香族−平面状アミンリガンド（４−ピコリン）又は脂肪族非−平面状アミン（ピペリジン）による類似の置き換えは、シスプラチン自身に比較してより低い細胞毒性活性を生じた。錯体シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］は、白金薬剤耐性を妨げるために設計され、現在臨床試験下にある新規な立体的に妨げられた抗−腫瘍化合物である新しい活性なシス−［Ｐｔ（ＮＨ３）（２−ピコリン）］（ＡＭＤ４７３）への類似体である（２６）。
【００６４】
いくつかのピペラジン−含有Ｐｔ錯体の、シスプラチン感受性及び耐性ガン細胞系への細胞毒性も決定された。特定的には３対のシスプラチン感受性及び耐性ガン細胞系（Ａ２７８０／Ａ２７８０ｃｉｓＲ、４１Ｍ／４１ＭｃｉｓＲ及びＣＨ１／ＣＨ１ｃｉｓＲ）を用いた。
【００６５】
錯体を上記の細胞系と一緒に２４時間インキュベーションし、化合物処理した培養中の細胞生存を、前に報告した（ミクロ培養テトラゾリウム）ＭＴＳ法により評価した。ＩＣ５０研究の結果を表２Ａ〜２Ｂに示す。
【００６６】
【表２】
【表３】
ＮＢＡ＝ｎ−ブチルアミン、ＩＰＡ＝イソプロピルアミン、４−ｐｉｃ＝４−メチルピリジン、ｐｉｐ＝ピペリジン、ｐｉｐ−ピペラジン。括弧内の数字は耐性因子（ＩＣ５０耐性／ＩＣ５０感受性）である。
【００６９】
ＳＡＲに関して言うと、トランスプラチンの１個もしくは両方のアミンリガンドをピペラジンで置き換えることは、トランスプラチンに対して抗腫瘍活性を顕著に向上させ、正に帯電した非−平面状アミンリガンド（ピペラジン）がトランス形を活性化できることを示している。これらの細胞毒性研究の最も衝撃的な特徴は、強化されたＤＮＡ修復／寛容性及び増加したＧＳＨ量を介して耐性であるＡ２７８０ｃｉｓＲ細胞系に対し、錯体が少なくともシスプラチンと同様に活性であることである。特に注目できることは、すべての３つの細胞系に対するトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＢＡ）（ｐｚ）］・ＨＣｌ（１０）の非常に低い耐性因子（ＲＦ）であり（ＲＦ＜２）、シスプラチン耐性の有効な妨害を示している。
【００７０】
これらのトランスプラチン錯体の抗−腫瘍活性の向上に関する可能な説明は、立体的に妨げられたリガンドがチオールによる解毒を低下させ得ることである。生物学的（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）なチオール及びチオエーテル（タンパク質及びペプチド）に対する反応性の低下は有益であると考えられ、それは生物学的硫黄含有リガンドとのシスプラチンの反応が後天的な耐性及び薬剤の毒性の副作用の源にあると思われるからである。
細胞の薬剤吸収及びＤＮＡ白金化
腫瘍細胞における薬剤蓄積を決定するために、Ｃ−２６及びＯＶ−１０６３細胞を細胞毒性化合物、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）及びトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）・ＨＣｌ］（１３）に２４時間暴露し、同じ条件下におけるシスプラチン及びトランスプラチンの薬剤吸収と比較した。原子吸光分析法（ＡＡＳ）により、細胞と関連するＰｔ含有量を測定した。図１Ａにおいて示される通り、両細胞系においてトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）は非常に有効に細胞に浸透することが見出された（シスプラチンより６−倍高い）。
【００７１】
また図１Ｂにおいて示される通り、トランスプラチンと比較して、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）の浸透はＯＶ−１０６３細胞において７−倍高く、Ｃ−２６細胞において３０−倍高い。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］（５）の蓄積の時間−依存性増加は、薬剤暴露の４（データは示されていない）〜２４時間の間、観察された。細胞におけるＰｔの時間−依存性蓄積はＩＣ５０値における低下と一致する（表１）。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（１３）は両細胞系において最も高い浸透値を示した（シスプラチンと比較して２２−倍高い）（図１Ａ及び１Ｂ）。
【００７２】
細胞ＤＮＡの白金化を決定するために、Ｃ−２６細胞及びＯＶ−１０６３細胞をこれらのトランスプラチン錯体に４時間又は２４時間暴露し、シスプラチンと比較し、ＡＡ分光計により白金ＤＮＡ含有量を測定した。トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］のＤＮＡ白金化はＣ−２６細胞及びＯＶ−１０６３細胞においてＣｉｓ−Ｐｔのそれと同じであり、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ錯体からＤＮＡに挿入された（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ）Ｐｔ分子の値は両細胞系においてＣｉｓ−Ｐｔのそれより７−倍高かった（図２Ａ及び２Ｂ）。
【００７３】
コウシ胸腺ＤＮＡの白金化の形成も調べた。この目的のために、コウシ胸腺ＤＮＡを種々の化合物（表３）と一緒にインキュベーションし、そこにおいて以下のパラメーターを決定した：
ｔ１／２−１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４中で３７℃、ｒｉ＝０．０８における、ディファレンシャルパルスポーラログラフィー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｕｌｓｅ ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｙ）により決定されるコウシ胸腺ＤＮＡへの化合物の結合の半時間（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）（分における）；
ΔΔεｍａｘ−約２７５ｎｍにおける正のＣＤバンドの極大、標準及び白金化コウシ胸腺ＤＮＡの間の差； ΔＴｍ−非白金化及び白金化コウシ胸腺ＤＮＡの融解温度における差； 巻き戻し−付加物当たりの巻き戻し角； ％ＩＥＣ／付加物−鎖間架橋の頻度。
【００７４】
【表４】
わかる通り、両ピペラジン−及びピペリジン含有錯体はシスプラチンより有意に高い速度でＤＮＡに結合する。
ＥｔＢｒ蛍光によるＤＮＡ付加物の分析
蛍光性プローブとしてＥｔＢｒを用い、白金（ＩＩ）化合物の付加物によりＤＮＡにおいて誘導される撹乱を区別した（１４）。挿入によるＥｔＢｒの結合は、Ｃｉｓ−Ｐｔの結合と同様に二官能基性付加物の形成により化学量論的に遮断され、それは蛍光強度を失わせる。他方、一官能基性付加物の形成はＥｔＢｒ蛍光をわずかに低下させるのみである。
【００７６】
トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌにより改変されたＤＮＡのＤＮＡ白金化測定は、二官能基性付加物の形成と一致する蛍光における有意な低下を示した。他方、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］の付加物による蛍光強度の低下はシスプラチンのそれより小さく、しかしながらトランスプラチンのそれより大きかった。最良の付加物はトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを用いて形成された（表４及び又図３）。
【００７７】
【表５】
かくして引き出される結論は、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）が一官能基性付加物及び又、ＤＮＡ中へのＥｔＢｒの挿入を阻害し、従ってＥｔＢｒ蛍光強度を低下させることができる二官能基性付加物を形成するということであった。
【００７９】
さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）と一緒に２４時間インキュベーションされたＤＮＡはＥｔＢｒ蛍光における有意な低下を示した（シスプラチンのそれよりわずかに大きい）（図４）。錯体（３）とシス−ＤＤＰの間の差は低濃度においてより大きく、それは錯体（３）がＤＮＡへのより高い親和性を有することを示唆している。シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ（８）の付加物による蛍光強度の低下はシスプラチンのそれに類似していた（図４）。
アポトーシスの評価
プログラミングされた細胞死としても知られるアポトーシスは、多細胞生物における細胞数の調節ならびに腫瘍進行、神経変性障害及びウィルス感染を含む種々の疾患の病因に含まれる。通常は正常な細胞の原形質膜の内側のリーフレットに閉じ込められている脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）がほとんどの細胞型において示された。アポトーシスを経る細胞においては、ＰＳがアポトーシスの初期の段階に外側の原形質膜リーフレットに輸送される（ｅｘｐｏｒｔｅｄ）。処理されたＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞におけるＰＳ露出を、ＰＳへの強い親和性を有するＭＣ ５４０を用いる染色により検出し、二本鎖ＤＮＡを優先的に染色するＤＡＰＩを用いる染色によりクロマチン凝縮を評価した。
【００８０】
赤く着色されない未処理細胞（結果は示されていない）と対照的な細胞膜における赤い蛍光の出現及び核の緑の蛍光の増加により証明される通り、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］処理されたＯＶ １０６３細胞においてはアポトーシスの顕著な特徴が観察された。この染色の結果は、ＯＶ−１０６３細胞の大部分が６．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されてから５時間後にアポトーシス的であるように見えることを示した。Ｃ−２６細胞の細胞表面は、未処理細胞において赤い蛍光がないこと（結果は示されていない）と対照的に、４．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されてから５時間後にわずかに赤く蛍光性となる（結果は示されていない）。
【００８１】
近年、プロテアーゼのキャスパーゼ（ＣＥＤ−３／ＩＣＥ）ファミリーのメンバーがアポトーシスと関連する複雑な生化学的現象の決定的な媒介物質であることが見出された（２７）。特に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、タンパク質キナーゼＣδ及びアクチンを含む複数の異なるタンパク質を切断するキャスパーゼ−３の活性化は、アポトーシスの開始に重要であることが示された（２８）。かくしてトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］処理されたＣ−２６及びＯＶ−１０６３細胞においてキャスパーゼ−３の活性化を測定した。６．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］又は７．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌで５時間処理されたＯＶ−１０６３細胞がキャスパーゼ−３を活性化することが見出された（未処理の細胞と比較して処理された細胞における蛍光の約２倍の増加）。さらに、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］又はトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌを用いるＯＶ−１０６３細胞の１６時間の処理の後、未処理の細胞と比較して処理された細胞において蛍光が３倍増加した（示されていない）。
【００８２】
観察された蛍光シグナルがキャスパーゼ−３の活性化の故であることを確かめるために、キャスパーゼ−３様プロテアーゼの可逆的Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ阻害剤を標準及び処理試料に加えた。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ阻害剤で処理された試料において蛍光シグナルにおけるものすごい低下が見出され（示されていない）、それはキャスパーゼ−３の特異的活性化を証明している。４．５μＭのトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］で処理されたＣ−２６細胞において蛍光シグナルは見出されなかった。
【００８３】
シスプラチンで処理されたＯＶ−１０６３又はＣ−２６細胞がアポトーシスを経るか否かを決定するために、これらの細胞系をそれぞれ２μＭ又は１．５μＭで５又は１６時間処理した。シスプラチン処理されたＯＶ−１０６３細胞又はＣ−２６細胞において蛍光シグナルは見出されなかった。これらの発見は、シスプラチンで処理されたＬ１２１０細胞においてアガロースゲル電気泳動により検出される分解ＤＮＡがないことを示したＬ．Ｓｚｍｉｇｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．のデータと一致している（２９）。それは結腸ガン細胞が、アポトーシスを阻害する単数もしくは複数の可溶性因子を分泌することによって（３０）及び結腸ガン細胞をアポトーシスから防御するｃ−キットの異常な活性化によって自己防衛することを示したいくつかの発見とも一致した。
タンパク質結合
静脈内に投与されるほとんどの白金（ＩＩ）誘導体は２４時間以内にタンパク質結合となるので、２種のモデルタンパク質、ユビキチン（ＭＷ ８５６５）及び心臓ミオグロビン（ＭＷ １６９５１）のＰｔ錯体への結合速度を決定した。この目的のために、白金錯体とタンパク質の間の１：１反応を１０ｍＭリン酸塩緩衝液，ｐＨ６．４中で１〜２ｍＭ濃度において、３７℃で行なった。タンパク質結合速度を反応混合物について直接、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により測定した。図５は、中性のトランス−ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）がタンパク質に迅速に結合し、結合速度に関してシスプラチン及びトランスプラチンが続くが、帯電したピペラジン錯体はタンパク質に有意に結合しないことを示している。ＤＮＡへの非常に迅速な結合とタンパク質への遅く且つ無効な結合の組み合わせは、白金に基づく抗−腫瘍薬剤の非常に望ましい性質である。
毒性
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ及びシス−ＤＤＰが５ｍｇ／ｋｇの濃度において無毒性であり、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌが２０ｍｇ／ｋｇの濃度において無毒性であることが見出された。
生体内抗腫瘍効果
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（１７〜２０グラムの体重範囲内）に１＊１０６個のＣ−２６結腸ガンを腹腔内注入した。トリパンブルー排除によると、これらの細胞の生存率は＞９０％であった。
【００８４】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの治療的有効性を研究し、シスプラチンと比較した。処置は上記のスケジュールに従って行なわれた。結果を表５及び図６に示す。
【００８５】
【表６】
【００８６】
−リポソーム調剤
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有する立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）の調製及び分析
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬの調製
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．９％ ＮａＣｌ中に６５℃で溶解し、この温度で１時間放置した。脂質（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ ５１：４４：５）をエタノール中に溶解した。このエタノール性溶液を薬剤混合物に加えることにより、脂質を水和させた。最終的な脂質濃度は、６５℃において２５％エタノール中で１５０ｍｇ／ｍｌ（１５％）であった。混合物を６５℃で１時間攪拌し続け、次いで２００ｎｍの孔径を有する２５ｍｍのポリカーボネートフィルターを介し、Ｌｉｐｅｘ押出し機（Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて６５℃で５回押出し、続いて１００ｎｍの孔径のポリカーボネートフィルターを介して１１回押出した。寸法をそろえられた（ｓｉｚｅｄ）リポソーム（〜１００ｎｍ）を室温に冷ました。冷ます間、重質の沈殿が生成し、上澄み液を集めた。次いで上澄み液を４℃に終夜冷却し、再び上澄み液を集めた。上澄み液を集め、１０％スクロース及び１ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ＝６．５）に対して、１００体積の緩衝液に対して合計で５回及び２００体積に対して１回、４℃で透析した。これらの条件下で、緩衝液との完全な平衡が起こるはずである。最終的なリポソーム分散液は半透明白色であった。
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬの分析
ＣｏｕｌｔｅｒモデルＮ４ ＳＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用い、動的光−散乱（ＤＬＳ）により、リポソームをそれらの寸法分布に関して２５℃で分析した。
【００８７】
リン脂質（ＰＬｓ）の濃度を脂質リン含有量により調べた（修正Ｂａｒｔｌｅｔｔ法）
（３１）。
【００８８】
無炎Ｚｅｅｍａｎ原子吸光分析計（ＦＡＡＳ）により、リポソーム中の白金濃度を測定した。白金濃度は、ｍＬ当たりに５０〜２５０ｎｇの白金の範囲の濃度を有するＫ２ＰｔＣｌ４貯蔵溶液の５つの標準を含むキャリブレーションカーブに従って計算された。
【００８９】
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌを含有するＳＳＬを以下のパラメーターにより分析した：寸法−１０２ｎｍ；調製物中のトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの濃度：１ｍＭ；調製物中の脂質の濃度：９４ｍＭ；及びカプセル封入のパーセンテージ（リポソーム中のＰｔ／Ｐｌ比／初期Ｐｔ／Ｐｌ比ｘ１００）８％。
トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ ＳＳＬからのＰｔ放出の分析
硫黄含有グルタチオン（ＧＳＨ）は白金との反応性が高いことが知られている。従ってリポソームからの白金の放出実験のためにそれを選択した。その白金との迅速な反応及び１９５Ｐｔ−ＮＭＲ上で誘導されるその硫黄の結合による強い化学シフトは、問題の範囲において我々がジアミンジクロロ白金のみを検出することを可能にするであろう。正に帯電した活性誘導体はトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ（３）であった。
【００９０】
すべてのＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ５００ ＭＨｚ分光計上で５ｍｍのスィッチ可能なプローブを用いて記録された。１９５Ｐｔ ＮＭＲスペクトルは外部標準としてＨＣｌ中のＫ２ＰｔＣｌ４（−１６２４ｐｐｍ）に関連付けられた。
１９５ＮＭＲ実験
ＮＭＲ管中の０．５ｍＬのリポソーム懸濁液（０．５ｍｇ／ｍＬ）に２当量のグルタチオン（ＧＳＨ）を加え、懸濁液を２分間激しく振盪させた。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ試験は、リポソーム内の錯体が無損傷であることを示した（δ＝−２１３４．５９７ｐｐｍ）。試料を３７℃で放置した。続行１９５Ｐｔ ＮＭＲを１、２及び７日後に行なった。最初の２日間ずっと、白金部分は無損傷であった。第７日に行なわれた１９５Ｐｔ−ＮＭＲは、ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）部分に特徴的な化学シフトの全体的消失を明らかにした。
【００９１】
白金薬剤の放出への（ＧＳＨ）の効果を評価するために、ＧＳＨなしで上記の実験を繰り返した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲは、３７℃において１０日後でさえ錯体が内部で無損傷であり（δ＝−２１３２．５８５ｐｐｍ）、δ＝−２６６１．４２８ｐｐｍにおける少量の生成物があることを明らかにした。
【００９２】
要するに結果は、帯電した錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌが、シスプラチンと対照的に放出されることを明白に示した。ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の特徴的な化学シフトの全体的消失は、配位球中のリガンドが変化したことを意味する。それにもかかわらず、ＧＳＨを含まない実験において変化が現れないことは、放出がないことを示す糸口ではない（ｎｏｔ ａ ｃｌｕｅ ｆｏｒ）。そのためには、リポソームの外部における白金部分の存在を証明するために、外部の溶液を濾過し、原子吸光（ＡＡ）及び（可能なら）１９５Ｐｔ−ＮＭＲを行わなければならない。
【実施例４】
【００９３】
−四官能基性の正に帯電したピペラジンに基づくビス−白金錯体
非−古典的な白金錯体の合成の努力を続け、四官能基性の正に帯電したビス−白金錯体を以下のスキームに従って合成した：
【００９４】
【化１】
シス−ＰｔＣｌ２（ＢＯＣ−Ｐｚ）２（１ｇ，２．４１ミリモル）を２０ｍＬのＤＤＷ中に溶解した。攪拌されている混合物に２当量（０．９ｇ，４．８４ミリモル）の１−ピペラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを加え、混合物を７０℃に加温した。攪拌及び加温を５０分間続け、次いで黄色の沈殿を集め、４０ｍＬのＤＤＷで２回洗浄した。乾燥後、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）を用いて且つさらなる精製を用いずに黄色の生成物を分析した。
１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）：δ＝−２２３９．４ｐｐｍ，−２２６７．８ｐｐｍ
ビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２−Ｐｚ）２｝（リンカー）］・２ＨＣｌの合成
暗所でシス−ＰｔＣｌ２（Ｂｏｃ−Ｐｚ）２（５３８ｍｇ，１ミリモル）を５０ｍＬのＤＭＦ中に溶解した。攪拌されている黄色の溶液に１当量（１６９．８８ｍｇ，１ミリモル）の硝酸銀を加え、混合物を室温で４８時間攪拌した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）は、（δ＝−２２４０．４７７ｐｐｍ）における微量の出発材料とともにモノ−ニトラト／ＤＭＦモノ−クロロジアミノ白金（ＩＩ）（δ＝−２００２．９８７ｐｐｍ，−２１２３．９９５）の生成を示した。この段階にＡｇＣｌ沈殿を濾過し、０．５当量（１１０ｍｇ，０．５ミリモル）の４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンを加えた。混合物を暗所で終夜攪拌した。１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ）はモノ−クロロ−トリアミン白金の生成を示した（δ＝−２５４２．９７４ｐｐｍ，−２５７０．９１１ｐｐｍ）。黄色がかった濾液を取り上げ、溶媒を減圧下で蒸発乾固した。ゴムを２０ｍｌのエタノール中に溶解し、１ｍＬの濃塩酸を加えた。全体が可溶化するまで混合物を室温で攪拌し、次いで５０分間温度を上げて還流させた。この時間中ずっと、黄色がかった沈殿が生成していた。反応混合物を室温に冷まし、沈殿を集め、２０ｍｌのエタノールで洗浄し、乾燥した。
１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（Ｈ２Ｏ）：δ＝−２２２４．３９６ｐｐｍ，２２３８．１４２ｐｐｍ，２２４８．１９４ｐｐｍ。
【００９６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】Ｃ−２６ガン細胞によるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの吸収を示す図。
【図１Ｂ】ＯＶ−１０６３ガン細胞によるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［（ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの吸収を示す図。
【図２Ａ】Ｃ−２６ガン細胞におけるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌのＤＮＡ白金化レベルを示す図。
【図２Ｂ】ＯＶ−１０６３ガン細胞におけるシスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペリジン）］；トランス−［ＰｔＣｌ２）（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌのＤＮＡ白金化レベルを示す図。
【図３】シスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌにより改変された種々の濃度のＤＮＡへのＥｔＢｒ蛍光の依存性を示す図。
【図４】ＩＣ５０値のトランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌ又はシスプラチンで処理されたＯＶ−１０６３細胞における、未処理の（標準細胞）と比較されるキャスパーゼ−３−活性を示す図。
【図５】シスプラチン；トランスプラチン；トランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペリジン）］；及びトランス−［ＰｔＣｌ２）（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌへのユビキチンの結合曲線を示す図。
【図６】Ｃ−２６結腸ガンが接種され、本明細書上記に記載されるスケジュールに従って処置された雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、シス−ＤＤＰと比較されるトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジノ−ピペリジン）］・ＨＣｌの抗腫瘍活性を示す図。
【０００４】
２個の離脱基のシス立体配置がシス−ジアミンジクロロ白金（シス−ＤＤＰ）の抗−腫瘍活性に必須であることは一般的に受け入れられた。これは、Ａｍ１、Ａｍ２＝ＮＨ３又は平面状アミンリガンド、例えばキノリン、チアゾール、ピリジン又はベンゾチアゾールであるトランス−ＰｔＣｌ２（Ａｍ１）（Ａｍ２）、（例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（チアゾール）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（キノリン）］及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ベンゾチアゾール）］）における１個もしくは両方のＮＨ３リガンドの置き換えがトランス形の細胞毒性を実質的に強化することをｆａｒｒｅｌｌ等が報告するまで２０年以上のものより長い間の状況であった（非特許文献８）。（非特許文献１５）は、キノリンならびに第一級及び第二級アミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成を記載しており、それらの １ Ｈ−ＮＭＲスペクトルを議論している。（非特許文献１６）は、２個のアミン−含有リガンドを含有し、１個は芳香族ピリジン又はベンジルアミンであり、他は脂肪族環状アミン（モルホリン又はピペリジン）であるシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体を記載しており、錯体のＩＲ及びラマンスペクトルを議論している。（非特許文献１７）は、ピペリジン及び芳香族アミン又は芳香族アミンで置換されたアミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成、それらのＩＲ、ラマン及びＵＶスペクトルを記載している。さらに、ヒト肝臓ガン細胞への細胞毒性に関して錯体を調べた。（非特許文献１８）は、キノリンならびにモルホリン、シクロヘキシルアミン、ピペリジン又はベンジルアミンから選ばれるアミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成、それらのＵＶ及びＩＲスペクトルならびに仁の発芽の減少のためのそれらの生物学的活性を記載している。（特許文献１）は、式Ｐｔ（Ｘ）（Ｚ）（Ａ） ２ のシス−Ｐｔ錯体及びガン細胞へのそれらの活性を記載している。Ａは離脱基（例えばハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシレート又は一緒になって二座配位カルボキシレート又はサルフェートを形成する）であり、ＸはＮＨ ３ 又はモノ−もしくはジアルキル置換ＮＨ ３ であり、Ｚは置換アミン、好ましくは５−もしくは６−員単環式又は８〜１０員多環式アミン、特に置換ピリジン又は二環式アミンであり、ここでアミンは窒素原子を介して配位している。（非特許文献１９）は、ピペラジンとのＰｔＸ ２ 錯体の合成を記載しており、ここでＸはＣｌ又はＢｒであることができる。合成された錯体は、ピペラジンのコンフォーメーションを明らかにするために振動分光学を用いて分析された。（非特許文献２０）は、ピリジン、置換ピリジン、モルホリン、ピペリジン及びジメチルアミンから選ばれる２個のアミンリガンドを含有するシス及びトランスＰｔＣｌ ２ 錯体を記載している。（特許文献２）は、シス−ＰｔＸ ２ （ＮＨ ３ ）（Ａｍ）錯体及びそれらの抗腫瘍活性を開示している。ＸはＣｌ、Ｉ、ニトロ又は環状部分であることができ、Ａｍは置換Ｃ ２−７ Ｎである。（非特許文献２１）は、白金に基づく抗腫瘍薬剤を総説しており、シス−Ｐｔ錯体に言及している。
２個の離脱基のシス立体配置がシス−ジアミンジクロロ白金（シス−ＤＤＰ）の抗−腫瘍活性に必須であることは一般的に受け入れられた。これは、Ａｍ１、Ａｍ２＝ＮＨ３又は平面状アミンリガンド、例えばキノリン、チアゾール、ピリジン又はベンゾチアゾールであるトランス−ＰｔＣｌ２（Ａｍ１）（Ａｍ２）、（例えばトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピリジン）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（チアゾール）］、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（キノリン）］及びトランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ベンゾチアゾール）］）における１個もしくは両方のＮＨ３リガンドの置き換えがトランス形の細胞毒性を実質的に強化することをｆａｒｒｅｌｌ等が報告するまで２０年以上のものより長い間の状況であった（非特許文献８）。（非特許文献１５）は、キノリンならびに第一級及び第二級アミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成を記載しており、それらの １ Ｈ−ＮＭＲスペクトルを議論している。（非特許文献１６）は、２個のアミン−含有リガンドを含有し、１個は芳香族ピリジン又はベンジルアミンであり、他は脂肪族環状アミン（モルホリン又はピペリジン）であるシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体を記載しており、錯体のＩＲ及びラマンスペクトルを議論している。（非特許文献１７）は、ピペリジン及び芳香族アミン又は芳香族アミンで置換されたアミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成、それらのＩＲ、ラマン及びＵＶスペクトルを記載している。さらに、ヒト肝臓ガン細胞への細胞毒性に関して錯体を調べた。（非特許文献１８）は、キノリンならびにモルホリン、シクロヘキシルアミン、ピペリジン又はベンジルアミンから選ばれるアミンを含有するシス−ＰｔＣｌ ２ 錯体の合成、それらのＵＶ及びＩＲスペクトルならびに仁の発芽の減少のためのそれらの生物学的活性を記載している。（特許文献１）は、式Ｐｔ（Ｘ）（Ｚ）（Ａ） ２ のシス−Ｐｔ錯体及びガン細胞へのそれらの活性を記載している。Ａは離脱基（例えばハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシレート又は一緒になって二座配位カルボキシレート又はサルフェートを形成する）であり、ＸはＮＨ ３ 又はモノ−もしくはジアルキル置換ＮＨ ３ であり、Ｚは置換アミン、好ましくは５−もしくは６−員単環式又は８〜１０員多環式アミン、特に置換ピリジン又は二環式アミンであり、ここでアミンは窒素原子を介して配位している。（非特許文献１９）は、ピペラジンとのＰｔＸ ２ 錯体の合成を記載しており、ここでＸはＣｌ又はＢｒであることができる。合成された錯体は、ピペラジンのコンフォーメーションを明らかにするために振動分光学を用いて分析された。（非特許文献２０）は、ピリジン、置換ピリジン、モルホリン、ピペリジン及びジメチルアミンから選ばれる２個のアミンリガンドを含有するシス及びトランスＰｔＣｌ ２ 錯体を記載している。（特許文献２）は、シス−ＰｔＸ ２ （ＮＨ ３ ）（Ａｍ）錯体及びそれらの抗腫瘍活性を開示している。ＸはＣｌ、Ｉ、ニトロ又は環状部分であることができ、Ａｍは置換Ｃ ２−７ Ｎである。（非特許文献２１）は、白金に基づく抗腫瘍薬剤を総説しており、シス−Ｐｔ錯体に言及している。
【０００７】
一般にトランス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）類似体は、それらのシスの相手より低い水溶液中における溶解度を有し、限られたバイオアベイラビリティーを生ずる。水溶解度を向上させる１つの方法は錯体に電荷を加えることによる方法である。Ｆａｒｒｅｌｌ等は、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）の型の化合物の劣った水溶解度の克服においていくらかの努力をしたが、ＮＨ３及び平面状リガンドのトランス配向及び四角形−平面状物（ｓｑｕａｒｅ−ｐｌａｎａｒ ｅｎｔｉｔｙ）の電気的中性性を保持した。トランス−白金錯体、トランス−［ＰｔＣｌ（ＰｙＡｃ−Ｎ，Ｏ）（ＮＨ３）］（ＰｙＡｃ＝ピリジン−２−イルアセテート、Ｎ−ドナーはトランス）及びそのシス異性体が合成され、トランス異性体は類似錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）と比較して水中における溶解度の向上を示した（約４〜５ミリモルＬ−１）（非特許文献１３）。他方、Ｆａｒｒｅｌｌ等により、及びまたＨｏｌｌｉｓ等により製造される白金錯体のカチオン性電荷は金属中心上にあり、アニオン性クロリドリガンドの１つの中性リガンドによる置換から生ずる（非特許文献１４）。
【非特許文献１】
Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｅ．Ｒ． ＆ Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ＤＮＡ Ａｄｄｕｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４６７−２４９８
【非特許文献２】
Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．＆ Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，１−２１
【非特許文献３】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｖ．Ｍ．；Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ａｌｏｎｓｏ Ｃ．；Ｐｅｒｅｚ Ｊ．Ｍ．著，Ｉｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｌｗａｙｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ？ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，５９，４，６５７−６３
【非特許文献４】
Ｋａｒｔａｌｏｕ Ｍ，Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ ＪＭ．著，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，２３−４３
【非特許文献５】
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｏｎ，Ｔ．Ｌ．＆ Ｒｅｅｄ，Ｅ．著，Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃ．１９９３，５０，２，１４７−１５８
【非特許文献６】
Ｗｏｎｇ，Ｅ．＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ｃ．Ｍ．著，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｄｒｕｇｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４５１−２４６６
【非特許文献７】
Ｃｌｅａｒｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｏｅｓｃｈｅｌｅ，Ｊ．Ｄ．著，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｒｏｕｐ ＶＩＩＩ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｎｉｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，２，１８７−２１０
【非特許文献８】
Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．；Ｑｕ，Ｙ．；Ｈａｍｂｌｅｙ，Ｔ．Ｗ．；Ｐｅｒｏｕｔｋａ，Ｊ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｌ．；Ｄｏｅｄｅｅ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）Ｌ］（Ｌ＝Ｐｌａｎａｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ ａｎｄ Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ Ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌｌｙ Ｐｌａｔｉｎａｔｅｄ ＤＮＡ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；３８，１５，３５３５−３５４２
【非特許文献９】
Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｅ．Ｉ．；Ｄｉａｚ，Ｓ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖａｄｉｌｌｏ，Ａ．Ｍ．；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．＆ Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．著，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｖｅｌ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ（２）（ａｍｉｎｅ）（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）］ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，２０，４２６４−４２６８
【非特許文献１０】
Ｃｏｌｕｃｃｉａ，Ｍ．；Ｎａｓｓｉ，Ａ．；Ｂｏｃｃａｒｅｌｌｉ，Ａ．；Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｄ．；Ｃａｒｄｅｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｎ．；Ｌｏｃｋｅｒ，Ｄ．；Ｌｅｎｇ，Ｍ．；Ｓｉｖｏ，Ｍ．；Ｉｎｔｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．；＆ Ｎａｔｉｌｅ，Ｇ．著，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｌｉｇａｎｄｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，３１−３５
【非特許文献１１】
Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｒｏｕｔｋａ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｆａｒｒｅｌｌ著，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，５１−５７
【非特許文献１２】
Ｋｅｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｒ；Ｓｈａｒｐ，Ｓ．Ｙ．；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｃ．Ｆ．；Ｒａｙｎａｕｄ，Ｆ．Ｉ．；Ｂｅａｌｅ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｓｏｎ，Ｉ．著，Ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，Ｉ １−２，１１１−１１５
【非特許文献１３】
Ｂｉｅｒｖａｃｈ，Ｕ．；Ｓａｂａｔ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．著，Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｎｅｖｅｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｎ，Ｏ−Ｄｏｎｏｒ Ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００；３９（９）；１８８２−１８９０
【非特許文献１４】
Ｈｏｌｌｉｓ，Ｌ Ｓ；Ａｍｕｎｄｓｅｎ，Ａ Ｒ；Ｓｔｅｒｎ，Ｅ Ｗ．著，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒｓ：ｃｉｓ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（Ｎ−ｄｏｎｏｒ）Ｃｌ］＋，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８９，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １２８−１３６
【非特許文献１５】
Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ． ｏｆ Ｃｈｅｍ．，２００１年，３９（４），１１１−１１４
【非特許文献１６】
Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｔａｐ Ｃｈｉ Ｄｕｏｃ Ｈｏｃ，２００１年，６，６−８
【非特許文献１７】
Ｔｒａｎ Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．，２００１年，３９（３），９９−１０２
【非特許文献１８】
Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｔａｐ Ｃｈｉ Ｄｕｏｃ Ｈｏｃ（Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．），１９９７年，３５（２），２１−２３
【特許文献１】
欧州特許出願公開第０７２７４３０号明細書，Ｊｏｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ．Ｃｏ．，１９９６年
【非特許文献１９】
Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，１９（１２），８５６−８６３
【非特許文献２０】
Ｃａｔｔａｌｉｎｉ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１９９３年，２３３−２３６
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０２７３３１５号明細書，Ｓｈｉｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，１９８８年
【非特許文献２１】
Ｗｏｎｇ ｅｔ ａ．著，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９９年，９９（９），２４５１−２４６６
【発明の開示】
一般にトランス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）類似体は、それらのシスの相手より低い水溶液中における溶解度を有し、限られたバイオアベイラビリティーを生ずる。水溶解度を向上させる１つの方法は錯体に電荷を加えることによる方法である。Ｆａｒｒｅｌｌ等は、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）の型の化合物の劣った水溶解度の克服においていくらかの努力をしたが、ＮＨ３及び平面状リガンドのトランス配向及び四角形−平面状物（ｓｑｕａｒｅ−ｐｌａｎａｒ ｅｎｔｉｔｙ）の電気的中性性を保持した。トランス−白金錯体、トランス−［ＰｔＣｌ（ＰｙＡｃ−Ｎ，Ｏ）（ＮＨ３）］（ＰｙＡｃ＝ピリジン−２−イルアセテート、Ｎ−ドナーはトランス）及びそのシス異性体が合成され、トランス異性体は類似錯体、トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（Ａｍ１）］（Ａｍ１＝平面状リガンド）と比較して水中における溶解度の向上を示した（約４〜５ミリモルＬ−１）（非特許文献１３）。他方、Ｆａｒｒｅｌｌ等により、及びまたＨｏｌｌｉｓ等により製造される白金錯体のカチオン性電荷は金属中心上にあり、アニオン性クロリドリガンドの１つの中性リガンドによる置換から生ずる（非特許文献１４）。
【非特許文献１】
Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｅ．Ｒ． ＆ Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ＤＮＡ Ａｄｄｕｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４６７−２４９８
【非特許文献２】
Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．＆ Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．著，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，１−２１
【非特許文献３】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｖ．Ｍ．；Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ａｌｏｎｓｏ Ｃ．；Ｐｅｒｅｚ Ｊ．Ｍ．著，Ｉｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｌｗａｙｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ？ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，５９，４，６５７−６３
【非特許文献４】
Ｋａｒｔａｌｏｕ Ｍ，Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ ＪＭ．著，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００１，４７８，１−２，２３−４３
【非特許文献５】
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｏｎ，Ｔ．Ｌ．＆ Ｒｅｅｄ，Ｅ．著，Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ａｎｄ Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃ．１９９３，５０，２，１４７−１５８
【非特許文献６】
Ｗｏｎｇ，Ｅ．＆ Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ｃ．Ｍ．著，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｄｒｕｇｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９；９９（９）；２４５１−２４６６
【非特許文献７】
Ｃｌｅａｒｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｏｅｓｃｈｅｌｅ，Ｊ．Ｄ．著，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｒｏｕｐ ＶＩＩＩ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｎｉｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，２，１８７−２１０
【非特許文献８】
Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．；Ｑｕ，Ｙ．；Ｈａｍｂｌｅｙ，Ｔ．Ｗ．；Ｐｅｒｏｕｔｋａ，Ｊ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｌ．；Ｄｏｅｄｅｅ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）Ｌ］（Ｌ＝Ｐｌａｎａｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ ａｎｄ Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ Ｉｓｏｍｅｒｉｓｍ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌｌｙ Ｐｌａｔｉｎａｔｅｄ ＤＮＡ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；３８，１５，３５３５−３５４２
【非特許文献９】
Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｅ．Ｉ．；Ｄｉａｚ，Ｓ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖａｄｉｌｌｏ，Ａ．Ｍ．；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．＆ Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．著，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｖｅｌ ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ（２）（ａｍｉｎｅ）（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）］ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，２０，４２６４−４２６８
【非特許文献１０】
Ｃｏｌｕｃｃｉａ，Ｍ．；Ｎａｓｓｉ，Ａ．；Ｂｏｃｃａｒｅｌｌｉ，Ａ．；Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｄ．；Ｃａｒｄｅｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｎ．；Ｌｏｃｋｅｒ，Ｄ．；Ｌｅｎｇ，Ｍ．；Ｓｉｖｏ，Ｍ．；Ｉｎｔｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．；＆ Ｎａｔｉｌｅ，Ｇ．著，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｉｎｏｅｔｈｅｒ ｌｉｇａｎｄｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，３１−３５
【非特許文献１１】
Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｒｏｕｔｋａ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｆａｒｒｅｌｌ著，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，１−２，５１−５７
【非特許文献１２】
Ｋｅｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｒ；Ｓｈａｒｐ，Ｓ．Ｙ．；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｃ．Ｆ．；Ｒａｙｎａｕｄ，Ｆ．Ｉ．；Ｂｅａｌｅ，Ｐ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｓｏｎ，Ｉ．著，Ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，７７，Ｉ １−２，１１１−１１５
【非特許文献１３】
Ｂｉｅｒｖａｃｈ，Ｕ．；Ｓａｂａｔ，Ｍ．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｎ．著，Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｎｅｖｅｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ） Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｎ，Ｏ−Ｄｏｎｏｒ Ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００；３９（９）；１８８２−１８９０
【非特許文献１４】
Ｈｏｌｌｉｓ，Ｌ Ｓ；Ａｍｕｎｄｓｅｎ，Ａ Ｒ；Ｓｔｅｒｎ，Ｅ Ｗ．著，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒｓ：ｃｉｓ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（Ｎ−ｄｏｎｏｒ）Ｃｌ］＋，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８９，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １２８−１３６
【非特許文献１５】
Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ． ｏｆ Ｃｈｅｍ．，２００１年，３９（４），１１１−１１４
【非特許文献１６】
Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｔａｐ Ｃｈｉ Ｄｕｏｃ Ｈｏｃ，２００１年，６，６−８
【非特許文献１７】
Ｔｒａｎ Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．，２００１年，３９（３），９９−１０２
【非特許文献１８】
Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｔａｐ Ｃｈｉ Ｄｕｏｃ Ｈｏｃ（Ｖｉｅｔｎａｍ Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．），１９９７年，３５（２），２１−２３
【特許文献１】
欧州特許出願公開第０７２７４３０号明細書，Ｊｏｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ．Ｃｏ．，１９９６年
【非特許文献１９】
Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，１９（１２），８５６−８６３
【非特許文献２０】
Ｃａｔｔａｌｉｎｉ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１９９３年，２３３−２３６
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０２７３３１５号明細書，Ｓｈｉｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，１９８８年
【非特許文献２１】
Ｗｏｎｇ ｅｔ ａ．著，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９９年，９９（９），２４５１−２４６６
【発明の開示】
【０００８】
発明の概略
本発明は、その側面の第１に従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
を有するトランス配置にある新規な白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、以下の化合物：
トランス−［Ｐｔ（ピペリジン） ２ Ｃｌ ２ ］及びトランス−［Ｐｔ（モルホリン） ２ Ｃｌ ２ ］を除く白金錯体に関する。
発明の概略
本発明は、その側面の第１に従い、一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
を有するトランス配置にある新規な白金錯体（Ｐｔ−錯体）であって、以下の化合物：
トランス−［Ｐｔ（ピペリジン） ２ Ｃｌ ２ ］及びトランス−［Ｐｔ（モルホリン） ２ Ｃｌ ２ ］を除く白金錯体に関する。
【００１１】
本発明は、必要のある患者に治療的効果を達成するのに十分な量の白金錯体を投与することを含み、Ｐｔ錯体が一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示し、
但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない］
を含む治療的効果を達成するための方法にも関する。
さらに別の側面に従うと、本発明は一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ １ ）（Ａｍ ２ ）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ １ はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ ２ は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体であって、以下の化合物：
シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ −（ピペリジン）（ｏ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｐ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ピリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ｏ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ｐ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（アニリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｏ−ＣＨ ３ Ｏ−Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｐ−Ｃ ２ Ｈ ５ ＯＣ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（シクロヘキシルアミン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（モルホリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＢｒ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（モルホリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩＣｌ（ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピペリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩＣｌ（ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌＩ（３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ），トランス−［Ｐｔ（ピペリジン） ２ Ｃｌ ２ ］及びトランス−［Ｐｔ（モルホリン） ２ Ｃｌ ２ ］を除く白金錯体に関する。
本発明は、必要のある患者に治療的効果を達成するのに十分な量の白金錯体を投与することを含み、Ｐｔ錯体が一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示し、
但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない］
を含む治療的効果を達成するための方法にも関する。
さらに別の側面に従うと、本発明は一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ １ ）（Ａｍ ２ ）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ １ はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ ２ は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体であって、以下の化合物：
シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ −（ピペリジン）（ｏ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｐ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ピリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ｏ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（ｐ−ＣＨ ３ −Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（アニリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｏ−ＣＨ ３ Ｏ−Ｃ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ｐ−Ｃ ２ Ｈ ５ ＯＣ ６ Ｈ ４ −ＮＨ ２ ）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（シクロヘキシルアミン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（モルホリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （キノリン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＢｒ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペラジン）（ピペラジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （モルホリン）（モルホリン）］；シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩＣｌ（ピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピペリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩＣｌ（ピペリドン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌ ２ （３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＩ ２ （３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ）］，シス−［ＰｔＣｌＩ（３−ヒドロキシピロリジン）（ＮＨ ３ ），トランス−［Ｐｔ（ピペリジン） ２ Ｃｌ ２ ］及びトランス−［Ｐｔ（モルホリン） ２ Ｃｌ ２ ］を除く白金錯体に関する。
Claims (58)
- 一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金錯体。 - 各モノマー単位が、独立してＡｍ１を介して、Ａｍ２を介して、該Ａｍ１又はＡｍ２に連結したリンカーを介してあるいは該Ａｍ１とＡｍ２から生成する環式環を介して他のＰｔ−錯体に結合している請求項１で定義されているＰｔ−錯体であるダイマー形態の請求項１の錯体。
- 該Ｘ及びＹが同一もしくは異なり、クロリド又はヨーダイドを示す請求項１又は２の錯体。
- 該Ｘ及びＹが両方ともクロリドを示す請求項３の錯体。
- 該Ａｍ１がアンモニアを示す請求項１〜４のいずれか１つの錯体。
- 該Ａｍ１がメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、ｎ−ヘプチルアミン又はｎ−ノニルアミンから選ばれる第一級アミンを示す請求項１〜４のいずれか１つの錯体。
- 該Ａｍ１がジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミンから選ばれる第二級アミンを示す請求項１〜４のいずれか１つの錯体。
- 該Ａｍ１がピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す請求項１〜４のいずれか１つの錯体。
- 該Ａｍ１がピリジン、２−、３−もしくは４−アミノピリジン、２−、３−もしくは４−ピコリン、キノリン、３−もしくは４−アミノキノリン、チアゾール、イミダゾール、３−ピロリン、ピラジン、２−メチルピラジン、４−アミノキナルジンから選ばれる複素環式芳香族アミンを示す請求項１〜４のいずれか１つの錯体。
- 該Ａｍ２がピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式アミンを示す請求項１〜９のいずれか１つの錯体。
- トランス立体配置にある請求項１０の錯体。
- −トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ヒドロキシピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４，４’−ビピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）２］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ；
から選ばれる請求項１１の錯体。 - シス立体配置にある請求項１０の錯体。
- シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］又はシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌから選ばれる請求項１３の錯体。
- 正に帯電している請求項１〜１０のいずれか１つの錯体。
- 該リンカーが４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン鎖を含んでなる請求項２の錯体。
- ビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２ピペラジン）２｝（４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン）］・２ＨＣｌである請求項１６の錯体。
- 製薬学的に許容され得る担体ならびに活性成分として一般式：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中、
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す］
の白金錯体であって、但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない白金（Ｐｔ）錯体の治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物。 - 活性成分がダイマー形態の該Ｐｔ錯体であり、そこにおいて各モノマー単位は、独立してＡｍ１を介して、Ａｍ２を介して、該Ａｍ１又はＡｍ２に連結したリンカーを介してあるいは該Ａｍ１とＡｍ２から生成する環式環を介して他のＰｔ−錯体に結合している請求項１８で定義されているＰｔ−錯体である請求項１８の組成物。
- 活性成分が、Ｘ及びＹが同一もしくは異なり、クロリド又はヨーダイドを示す該Ｐｔ錯体である請求項１８又は１９の組成物。
- 活性成分が、Ｘ及びＹが両方ともクロリドを示す該Ｐｔ錯体である請求項２０の組成物。
- 活性成分が、該Ａｍ１がアンモニアを示す該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２１のいずれか１つの組成物。
- 活性成分が、Ａｍ１がメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、ｎ−ヘプチルアミン又はｎ−ノニルアミンから選ばれる第一級アミンを示す該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２１のいずれか１つの組成物。
- 活性成分が、Ａｍ１がジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミンから選ばれる第二級アミンを示す該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２１のいずれか１つの組成物。
- 活性成分が、Ａｍ１がピリジン、２−、３−もしくは４−アミノピリジン、２−、３−もしくは４−ピコリン、キノリン、３−もしくは４−アミノキノリン、チアゾール、イミダゾール、３−ピロリン、ピラジン、２−メチルピラジン、４−アミノキナルジンから選ばれる複素環式芳香族アミンを示す該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２１のいずれか１つの組成物。
- 活性成分が、Ａｍ１がピペラジン、２−メチルピペラジン、２−ピラゾリン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン又は３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式脂肪族アミンを示す該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２１のいずれか１つの組成物。
- 活性成分が、Ａｍ２がピペラジン、２−メチルピペラジン、２−ピラゾリン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン又は３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式脂肪族アミンである該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２６のいずれか１つの組成物。
- 活性成分がトランス立体配置にある該Ｐｔ錯体を含んでなる請求項１８〜２６のいずれか１つの組成物。
- 該活性成分が、
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ヒドロキシピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４，４’−ビピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）２］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ；
から選ばれる請求項２８の組成物。 - 該活性成分がシス立体配置にある請求項１８〜２６のいずれか１つの組成物。
- シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］から選ばれる請求項３０の組成物。
- 該リンカーが４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン鎖を含んでなる請求項１９の組成物。
- ビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２ピペラジン）２｝（４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン）］・２ＨＣｌである請求項３２の組成物。
- 該Ｐｔ錯体とＤＮＡの間の付加物の形成を含んでなる治療的効果を達成するための請求項１８〜３３のいずれか１つの組成物。
- 望ましくない細胞増殖の阻害を含んでなる治療的効果を達成するための請求項１８〜３３のいずれか１つの組成物。
- 望ましくない細胞のアポトーシスを誘導するための請求項３５の組成物。
- リポソーム内に充填される請求項１８〜３６のいずれか１つの組成物。
- 必要のある患者に治療的効果を達成するのに十分な量のＰｔ−錯体を投与することを含んでなり、Ｐｔ錯体が一般式（Ｉ）：
［Ｐｔ（Ｘ）（Ｙ）（Ａｍ１）（Ａｍ２）］ （Ｉ）
［式中：
−Ｘ及びＹは、同一もしくは異なることができ、ハロゲン、カルボキシレート、ホスフェート又はサルェート基を示し；
−Ａｍ１はアンモニア、第一級アミン、第二級アミン、非−平面状複素環式脂肪族アミン又は複素環式芳香族アミンから選ばれるアミンを示し；
−Ａｍ２は非−平面状複素環式脂肪族アミンを示し、
但し、該錯体がシス立体配置にある場合、Ａｍ１及びＡｍ２は同時にピペリジンを示すことはできない］
から成る、治療的効果を達成するための方法。 - 該Ｐｔ−錯体がダイマーの形態にあり、そこにおいて各モノマー単位は、独立してＡｍ１を介して、Ａｍ２を介して、該Ａｍ１又はＡｍ２に連結したリンカーを介してあるいは該Ａｍ１とＡｍ２から生成する環式環を介して他の錯体に結合しているＰｔ−錯体である請求項３８の方法。
- Ｘ及びＹが同一もしくは異なり、クロリド又はヨーダイドを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８又は３９の方法。
- Ｘ及びＹが両方ともクロリドを示す請求項４０の方法。
- Ａｍ１がアンモニアを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８〜４１のいずれか１つの方法。
- Ａｍ１がメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、ｎ−ヘプチルアミン又はｎ−ノニルアミンから選ばれる第一級アミンを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８〜４１のいずれか１つの方法。
- Ａｍ１がジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミンから選ばれる第二級アミンを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８〜４１のいずれか１つの方法。
- Ａｍ１がピリジン、２−、３−もしくは４−ピコリン、キノリン、３−もしくは４−アミノキノリン、チアゾール、２−、３−もしくは４−アミノピリジン、イミダゾール、３−ピロリン、ピラジン、２−メチルピラジン又は４−アミノキナルジンから選ばれる複素環式芳香族アミンを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８〜４１のいずれか１つの方法。
- Ａｍ１がピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン及び３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式アミンを示すＰｔ錯体を該患者に投与する請求項３８〜４１のいずれか１つの方法。
- Ａｍ２がピペラジン、２−メチルピペラジン、ピペリジン、２−、３−もしくは４−ヒドロキシピペリジン、４−ピペリジノ−ピペリジン、ピロリジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン又は３−アミノピロリジンから選ばれる非−平面状複素環式アミンを示す請求項４６の方法。
- 該錯体がトランス立体配置にある請求項３８〜４７のいずれか１つの方法。
- −トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ヒドロキシピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（４−ピペリジノ−ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（１，４’−ビピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペリジン）］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）２］；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（イソプロピルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ブチルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ｎ−ノニルアミン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペリジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（４−ピコリン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ピペラジン）（ピペラジン）］・ＨＣｌ；
−トランス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）］・ＨＣｌ；
から選ばれる白金錯体を該患者に投与することを含んでなる請求項４８の方法。 - 該錯体がシス立体配置にある請求項３８〜４７のいずれか１つの方法。
- 該錯体がシス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペリジン）］；シス−［ＰｔＣｌ２（ＮＨ３）（ピペラジン）］から選ばれる請求項５０の方法。
- 該リンカーが４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン鎖を含んでなる請求項３９の方法。
- 治療的に有効な量のビス−［｛トランス，トランス−（ＰｔＣｌ２ピペラジン）２｝（４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン）］・２ＨＣｌを患者に投与する請求項５２の方法。
- 該Ｐｔ錯体とＤＮＡの間の付加物の形成を含んでなる治療的効果を達成するための請求項３８〜５３のいずれか１つの方法。
- 望ましくない細胞増殖の阻害を含んでなる治療的効果を達成するための請求項３８〜５３のいずれか１つの方法。
- 望ましくない細胞のアポトーシスを誘導するための請求項５５の方法。
- 該Ｐｔ錯体をリポソーム内に充填する請求項３８〜５６のいずれか１つの方法。
- 抗ガン剤として用いるための請求項１〜１７のいずれか１つで定義されている白金錯体。
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