JP2008512444A - 神経変性状態の治療のための、両親媒性弱塩基様テンパミンを含むリポソーム製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】神経変性状態の治療のための、両親媒性弱塩基様テンパミンを含むリポソーム製剤
【解決手段】本発明は、神経変性状態の治療又は予防のための薬学的製剤の調製のための、定義された特徴を有する両親媒性弱塩基の使用を提供する。好ましくは、該両親媒性弱塩基はリポソーム中に封入される。また、本発明は、薬学的製剤及び神経変性状態の治療又は予防のためのそれらの使用の方法を提供する。具体的で好ましい両親媒性弱塩基はテンパミン（TMN）である。さらに、好ましくはテンパミンは、立体的に安定化されたリポソーム中に添加される（SSL-TMN）。
【選択図】 図２

Description

本発明は、一般に、神経変性状態の治療方法に関し、特に、リポソームに封入された薬物を用いての治療方法に関する。

［従来公報］
以下は本発明の分野における技術状況を説明するために妥当と考えられる従来公報である。

WO03/053442；
Nichols, J.W., et al., Biochim. Biophys. Acta 455:269-271 (1976)；
Cramer, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 75(2):295-301 (1977)。

［発明の背景］
神経変性状態、遺伝性並びに散発性の状態は、進行性の神経系機能障害によって特徴付けられる。これらの状態は、中枢神経系又は末梢神経系の構造に影響する萎縮を付随することが多い。

パーキンソン病(PD) [Ebadi, M., et al. Prog. Neurobiol. 48(1):1-19 (1996)]、多発性硬化症(MS) [Lu F, et al. 177(2):95-103 (2000)]、アルツハイマー病(AD) [Markesbery, W.R. and Carney, J.M. Brain Pathol. 9:133-146 (1999)]、フリートライヒ運動失調[Sarsero J.P et al. J Gene Med. 5(1):72-81 (2003)]、筋萎縮性側索硬化症(ALS) [Ferrante, R.J., et al. J. Neurochem. 69(5):2064-2074 (1997)]及びハンチントン病(HD) [Borlongan, C. V., et. al. J. Fla. Med. Assoc. 83(5):335-341 (1996)]を含む、神経変性疾患の原因は、活性酸素種(ROS)の発生によって起こるという重要な証言がある。それらは、天然ではラジカルではないが、細胞外環境及び細胞内環境においてラジカル形成可能である、水素亜塩素酸(hydrochlorous acid)(HOCl)、一重項酸素('O₂)及び過酸化水素(H₂O₂)のような分子である。ROSは、生化学的プロセスの制御、特異的酵素の作用の補助、及び細菌及び損傷した細胞の除去及び破壊を含む、多くの生物学的プロセスに関与する。細胞内の酸化化合物と還元化合物（酸化還元状態）の平衡を達成するために、遊離ラジカルが身体に必須である一方、その平衡が酸化化合物に傾くと、酸化ストレス（OS）が生じる。

蓄積されているデータは、主にマクロファージによるＲＯＳの発生を介して酸化ストレス（ＯＳ）がＭＳのような進行性の神経変性疾患における主要な役割を果たすことを示している。結果として、脱髄傷害及び軸索傷害は、ＭＳ及び実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE、ＭＳの容認動物モデル)のいずれにも起因する。

血液脳関門を通過可能であり、神経変性状態をもたらす酸化傷害を減少することができる抗酸化物の開発が多く試みられている。ビタミン E (トコフェロール)、カロテノイド及びフラボノイドのような天然の抗酸化物は、成人の脳に容易には入らず、ラザロイド(lazaroid)抗酸化物チリラザド(tirilazad) (U-74006F)は血液脳関門に局在するように見える。よって、改変されたスピントラップ（spin traps）及びO2*^-の低分子量スカベンジャーの使用が提案されている [Halliwell B. Drugs Aging. 18(9):685-716 (2001)]。

血液脳関門を克服することに加えて、遊離形態で投与されたときの抗酸化物の速いクリアランス、及び、血漿中でのそれらの化学的崩壊が、それらのインビボでの有効性を制限する。よって、それら及び他の治療薬剤の血液循環時間を延長する種々のアプローチが開発されている。一つのそのようなアプローチは、リポソーム中に該薬剤を取込むことを含む。

受動的な取込み及び能動的な遠隔性添加を含む、取込まれた薬剤を有するリポソームを調製するために利用可能な種々の薬物添加方法がある。受動的な取込み方法は、リポソームの膜が属する親油性の薬物の取込み、及び、高い水溶解度及び／又は高分子量を有する薬物の取込みに最も適している。しかしながら、この添加方法は、水和媒体における該薬物の溶解度によって制限される。イオン性両親媒性薬物の場合、該薬物を膜貫通イオン勾配に抗してリポソーム中に添加することによって、より大きい薬物添加効率が達成される[Nichols, J.W., et al., Biochim. Biophys. Acta 455:269-271 (1976); Cramer, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 75(2):295-301 (1977)]。この添加方法は、一般に遠隔性添加（remote loading）と呼ばれ、典型的には両親媒性でイオン性アミノ基を有し、高い内側／低い外側Ｈ⁺、又はイオン性カチオン勾配（例えばアンモニウムイオン、両親媒性弱塩基について）、又は低い内側／高い外側Ｈ⁺、又はイオン性アニオン勾配（両親媒性弱酸について）を有するリポソームの懸濁液に、それを加えることによって添加される薬物に関係する。

WO03/053442には、酸化ストレス又は細胞の酸化傷害によって引き起こされる状態の治療のための、テンパミン(TMN)を含む治療的製剤が開示されている。TMNは、薬物の血液循環寿命を延長する、リポソーム中に封入される。リポソームからのTMNの放出、生物分配及びTMNを封入したリポソームの薬物動態が開示されている。

発明の概要

本発明は、幾つかの新規の発見に基づくものである。第一に、テンパミン（両親媒性弱塩基抗酸化物、略語TMNで称する)が、1-メチル、4-フェニル、ピリジニウムイオン(MPP⁺が誘導した酸化傷害に抗してPC12神経細胞を保護する効果を示すこと、及び、その保護効果が投与量依存的様式であることが発見された。

さらに、活性成分として、ＴＭＮを封入する二つの異なるリポソーム製剤が、容認された動物モデルにおいて、多発性硬化症(MS)及びパーキンソン病の臨床的徴候（疾患の発生率、疾病の期間及び罹患率を含む）を減少するのに著しく有効であることが分かった。実験の実行において、TMN (SSL-TMN)を封入する立体的に安定なリポソーム(SSL)がＴＭＮ輸送系として用いられた。

さらにまた、約80 nmの直径を有するSSL-TMN製剤が、実験的な自己免疫脳脊髄炎（EAE、MSの容認された動物モデル）における血液脳関門（ＢＢＢ）の通過が、健康な動物のＢＢＢを通るそれらの通過と比較して、より効果的であることが分かった。

従って、SSL-TMNは、神経変性疾患、特に、血液脳関門を通過する薬物の透過性が要求されるものに対して有利な効果を有することが示唆されている。

このように、第一の側面に従って、本発明は、神経変性状態の治療又は予防のための薬学的組成物の調製のための、両親媒性弱塩基の使用であって、該両親媒性弱塩基が次の特徴の一以上を有することを特徴とする使用を提供する：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、約0.001〜約5.0の範囲の分配係数を有し、好ましくは約0.005〜約0.5の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。

本発明の他の側面に従って、活性成分として次の特徴の一以上を有する両親媒性弱塩基を含む、神経変性状態の治療又は予防のための薬学的製剤を提供する：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、約0.001〜約5.0の範囲の分配係数を有し、好ましくは約0.005〜約0.5の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。

本発明のさらに他の側面において、神経変性状態を有するか、又は、発達する素因にある被検者を治療する方法が提供され、該方法は、次の特徴の一以上を有する両親媒性弱塩基の一定量を活性成分として含む薬学的製剤の一定量を、前記被検者に投与することを含む：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、約0.001〜約5.0の範囲の分配係数を有し、好ましくは約0.005〜約0.5の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。

好ましくは、該両親媒性弱塩基は、少なくとも上記のpKa及び分配係数値により特徴付けられる。

該薬学的組成物は、生理学的に及び薬学的に許容される適切な担体を含むであろう。典型的には、該担体は、血液脳関門（ＢＢＢ）にも関わらず活性成分の透過を可能にするものである。そのような透過は、特にＢＢＢが傷害なく残存する神経変性疾患において重要である。

該担体は、ＢＢＢを通る流入を促進又は亢進することが知られている、トランスフェリン（transferin）受容体-結合薬剤、抗体、又はそれ自体がＢＢＢを通って移行する他の薬剤のような分子であり得る。そのような場合、該分子は、ＢＢＢにおいて切断可能な結合によって本発明の両親媒性弱酸と接合される。

他の選択は、ＢＢＢを透過するのに有効な、脂質小胞、ナノ粒子（コーティングあり又はなし）又はナノカプセルのような適切な小胞に活性成分を取込ませることである。

以下により詳細に説明するように、該活性成分は好ましい態様によって脂質担体中、好ましくはリポソーム中に封入される。

本発明を理解するために、また、どのように実際に実行するかを示すために、添付の図を参照して単に非限定的な例として好ましい態様を記載する。

本発明は、神経変性状態の治療のための薬学的製剤を形成するための、薬学的に許容される薬物送達媒体中に封入された両親媒性弱塩基の使用に関する。

用語「両親媒性弱塩基」は、以下のパラメーターによって特徴付けられる分子を意味するようにここでは用いられる：
(i) 11.0未満；好ましくは約11.0〜7.5のpKaを有する
(ii) 7.0のpHを有するn-オクタノール/バッファー（水相）系において、約0.001〜約5.0の範囲、好ましくは約0.005〜約0.5の範囲の分配係数を有する。

それら上記の特徴が、WO 03/053442（表２）に長さで記載されており、その全内容は参照によって本明細書に援用される。

該両親媒性弱塩基はさらに、抗酸化薬剤及び／又は前アポトーシス薬剤としての、その生物学的活性によって特徴付けられる。

用語「抗酸化活性」又は「抗酸化薬剤」は、両親媒性弱塩基が、遊離ラジカル、ＲＯＳと相互作用することができ、それが遊離ラジカルによって起こされる傷害を予防することができるという事実を指している。

用語「前アポトーシス活性」又は「前アポトーシス薬剤」は、両親媒性弱塩基が、アポトーシスの誘発を介して細胞死を誘導することができるという事実を指している [WO03/053442に開示されたように]。

一つの態様に従って、両親媒性弱塩基は窒素酸化物化合物である。用語「窒素酸化物」は、安定な環式窒素酸化物遊離ラジカル、それらの前駆体及びプロトン可能（protonable）アミン、即ち、少なくとも一つの水素プロトンを需要可能なアミンを有するそれらの誘導体を示すようにここでは用いられる。環式窒素酸化物の非限定的な例には、5-カルボキシ-1,1,3,3-テトラメチルイソインドリン-2-イルオキシル(CTMIO)、4-カルボキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イルオキシル(CTEMPO)、及び3-カルボキシ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-イルオキシル(CPROXYL)のようなカルボキシ窒素酸化物、2,2,6,6-テトラメチル-ピペリジン-1-オキシル(TEMPO)、4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-オキシル(TEMPOL)、及び-アミノ-2,2,2,6,6-テトラメチル-ピペリジン-N-オキシル(テンパミン、TMN)が含まれる。環式窒素酸化物の好ましいグループは、ピペリジン窒素酸化物である。ピペリジン窒素酸化物である本発明に従った好ましい両親媒性弱塩基は、TMNである。

一般に、TEMPOL、TEMPO、及びTMNのようなピペリジン窒素酸化物は、細胞透過性、無毒性及び非免疫原性の安定な環式ラジカルである[Afzal V. et al. Invest Radiol 19:549-552 (1984)]。窒素酸化物は、それらの抗酸化活性を幾つかのメカニズムを通して発揮する：SOD-擬態、還元型金属イオンの酸化、超原子価金属の還元及びラジカル連鎖反応の中断[Samuni A. et al. Free Radic. Res. Commun. 12-13 Pt 1 187-197 (1991)]。近年、ピペリジン窒素酸化物（テンポル(Tempol)及びテンポ(Tempo)）が、抗腫瘍活性を有し、化学療法誘導アポトーシスを増強することが示された[Gariboldi et al. Free Radic. Biol. Med. 24:913-923 (1998); Shacter JA et al. Blood 96:307-313 (2000)]。

用語「神経変性状態」は、神経系の機能障害の結果として起こる神経系の任意の異常な変質を意味するように、用語「神経変疾患」及び「神経変性障害」と交換可能にここでは用いられる。さらに、これは、例えば、可動性の減少、発生の現象、認知機能の減少（特に学習及び記憶）、異常な肢-抱擁反射、吊下げ試験で成功するための網膜萎縮無能(retinal atrophy inability)、MMP-2のレベルの上昇、神経原線維変化のレベルの増加、タウリン酸化の増大、タウ微細線維形成、異常な神経細胞の形態、リソソーム異常、神経細胞変性、神経膠症及び脱髄などの、神経機能における疾患に関連する任意のパラメータによって示される、神経系の構成要素の漸進的で通常は容赦のない進行性の萎縮の状態にあるグループを意味するように用いられる。

それらに限定されないが、神経変性状態は、以下のグループに従って分類することができる：
−脱髄性疾患及び神経自己免疫性疾患、これらに限定されないが急性、慢性、進行性、及び再発寛解性の多発性硬化症(MS)、ドヴィック病、視覚神経炎、急性播種性脳脊髄炎、ギヤン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性疾患、多発神経根筋障害、血管炎、全身性紅斑性狼瘡の神経性の影響、神経サルコイドーシスを含む。
−感染症、これらに限定されないが、大脳性マラリア、ウイルス感染後脳炎及びベル麻痺を含む。
−神経変性障害、これらに限定されないがアルツハイマー病、パーキンソン病、老年痴呆、プリオン病、海綿状脳症、クロイツフェルトヤコブ病、AIDS痴呆、タウオパシー(tauopathies)及び筋萎縮性側索硬化症を含む。
−脳外傷、これらに限定されないが、脳卒中、非開放性脳損傷、放射線障害及び脊髄外傷を含む。

本発明の好ましい態様は、多発性硬化症(MS)の治療のための薬学的製剤の調製のための、上記で特徴付けられた（好ましくはリポソーム中に封入されたような）両親媒性弱塩基の使用に関する。

本発明の他の好ましい態様は、パーキンソン病の治療のための薬学的製剤の調製のための、上記で特徴付けられた（好ましくはリポソーム中に封入されたような）両親媒性弱塩基の使用に関する。

用語「治療する」又は「治療」は、神経系の異常な変質を予防、阻害又は遅らせるため、
神経変性状態に付随する症状を寛解させるため、そのような症状の徴候が起こる前に防ぐため、慢性期の神経変性状態によって起こる不可逆性の損傷を遅らせるため、神経変性状態の重症度又は治療を少なくするため、そのような状態からの生存率又はより速い回復を改善するために有効な量の、薬学的に許容される媒体中に封入された両親媒性弱塩基を投与することを意味するようにここでは用いられる。本発明の内容において、用語「治療」はまた、予防的な治療、即ち、神経変性状態の発達の素因の高い被検者（医学に精通した者に知られる検討によって決定される）における神経系の変質及びそれによる神経変性状態の発達を予防すること、又は、慢性的に病気の被検者における急性期の神経変性状態の再発を予防するための治療を含む。最後に、両親媒性弱塩基を添加された媒体は、神経変性状態を示していないが、そのような状態が発達する高いリスクを有する被検者、例えば、活性酸素種の異常な発生を引き起こし得る薬剤への曝露の結果或いは疾患の家族歴を有する被検者（即ち、遺伝的素因）のような被検者に投与され得る。この場合、両親媒性弱塩基を添加された溶媒は、典型的には、一日一回の投与量（例えば、累積的な有効量を生じさせるために）、一日数回の投与量、数日に一回の投与量などで、神経系の障害を予防するために長期間にわたって投与される。

用語「有効量」は、神経細胞の崩壊、及びそれによる神経系の変質を阻害又は減少するのに十分である、与えられた治療的措置における媒体中に添加されたときの両親媒性弱塩基の量を意味するようにここでは用いられる。その量は、当該分野で既知であるような考慮によって決定され、治療される神経変性状態のタイプ及び重篤度並びに治療措置に依存する。有効量は典型的には、適切に設計された臨床試験（投与量範囲調査）において決定され、当該分野に精通した人間には、有効量を決定するためのそのような試験を如何にして適切に行うかは既知である。一般に知られているように、有効量は、投与の様式、両親媒性弱塩基を保有する媒体のタイプ、両親媒性弱塩基の反応性、その体内での分布プロフィール、媒体から放出された後の体内での半減期のような種々の薬理学的パラメーターを含む種々の要因、望ましくない副作用、任意の場合に治療される被検者の年齢及び性別などのような要因に依存する。

ヒトは、ここで例証されたような実験動物よりも一般に長期間治療され、その治療は疾病過程の長さ及び活性薬剤の有効性に比例した長さを有することが留意される。投与量は、
数日間にわたって与えられる、単回投与量又は複数回投与量である。

以下の開示は、動物モデルによる実験データを与えるが、動物モデルからヒトへ投与量を変換するための種々の許容されるアプローチがある。例えば、近似の体表面（ＢＳＡ）アプローチの算出は、体重（Ｗ）に基づく単純な非比例的な関係をＢＳＡが体重（Ｗ）の0.67羃乗と等しいように使用する[Freireich E.J. et.al. Cancer Chemother. Reports 1966, 50(4) 219-244; and as analyzed in Dosage Regimen Design for Pharmaceutical Studies Conducted in Animals, by Mordenti, J, in J. Pharm. Sci., 75:852-57, 1986]。さらに、相対成長（allometry）及びBSAの錠剤データが確立されている[Extrapolation of Toxicological and Pharmacological Data from Animals to Humans, by Chappell W & Mordenti J, Advances in Drug Research, Vol. 20, 1- 116, 1991 (published by Academic Press Ltd)]。

投与量を変換するための他のアプローチは、濃度時間曲線下のエリア（ＡＵＣ）を用いる薬物動態学に基づくアプローチ又は[Voisin E.M. et al. Regul Toxicol Pharmacol. 12(2):107-116. (1990)]に開示されている生理学に基づく薬物動態学的（ＰＢＰＫ）方法である。

用語「薬学的に/生理学的に許容される担体」は、活性薬剤の送達に適した許容される任意の媒体を意味するようにここでは用いられる。ＢＢＢを透過して送達するのに適した媒体が好ましい。該媒体は、脂質に基づく小胞（例えば、リポソーム）又はポリマーに基づくナノ粒子（例えば、ポリマーが両親媒性弱塩基が包埋されるマトリクスを形成する場合又は両親媒性弱塩基がコア内に封入される場合の殻構造）であってよい。好ましくは、該媒体はリポソームである。さらに好ましくは、該担体は、両親媒性弱塩基の非経口的な送達に適し、特に、注射による投与に適する。投与の他の方法は、これらに限定されないが、経口、鼻腔内（例えば、以下に開示されたCCSのようなポリカチオンの脂質に基づくリポソームを用いて）、卵内及び局所的投与並びに注入技術によって）を含む。

用語「リポソーム」は、脂質に基づく二重層の小胞を意味するようにここでは用いられる。リポソームは、薬物、ペプチド、タンパク質、原形質DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムの生体適合性担体として、医薬品、化粧品、及び生化学的目的のために広く用いられている。脂質の粒子サイズ及び脂質の物理的パラメーターにおける莫大な融通性は、広い範囲の適用のための目的にかなった（tailor-made）媒体を構成する魅力的な可能性を与える。異なる適用（例えば、非経口投与、経皮投与、肺投与、鼻腔内投与及び経口投与）のための、性質の異なる（サイズ、コロイドの挙動、相転移、電荷及び多形性（polymorphism））多様な脂質製剤（リポソーム、リポプレクス（lipoplexes）、立方相（cubic phases）、乳濁液、ミセル及び固体脂質ナノ粒子）が、当該分野に精通した者に既知で利用可能である。これらの性質は、貯蔵の間及び血清中でのリポソームの安定性、体内分布及び受動的又は能動的な（特異的な）カーゴのターゲティング（targeting of cargo）、及び、如何にして薬物放出及び膜分解及び／又は融合の引き金を引くかのような、リポソームの関連する性質に影響を与える。

リポソームは、パッキングパラメーター0.74〜1.0によって、又は、0.74〜1の範囲にある相加的なパッキングパラメーター（リポソームの各成分のパッキングパラメーター掛ける各成分のモル分率の合計）を有する脂質混合物によって基本的に特徴付けられる、両親媒性分子であるリポソーム形成脂質で主に構成されるものである。リン脂質によってここに例証されるリポソーム形成脂質は、水中で二重層小胞に形成される。リポソームはまた、内部と接触する疎水性分子、二重層膜の疎水性領域、及び、二重層膜の外部、極性表面に方向付けられた頭部部分と共に、脂質二重層中へ取込まれる他の脂質を含むことができる。

リポソーム形成脂質は好ましくは、グリセロール主鎖を有するものであり、ここにおいて、少なくとも一つ、好ましくは二つの、頭部における水酸基は、好ましくはアシル鎖で置換され（アシル又はジアシル誘導体を形成する）、しかしながら、アルキル又はアルケニル鎖、リン酸基又は同様の組み合わせ又は誘導体で置換されることもでき、頭部において化学的に反応性の基を含むことができ（アミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールのような）、それによって、極性頭部を提供する。スフィンゴミエリン（sphyngomyelins）のような、スフィンゴ脂質（Sphyngolipids）は、グリセロホスホ脂質（glycerophopholipids）に代わる良好なものである。

典型的には、置換する鎖、例えばアシル鎖、アルキル鎖又はアルケニル鎖などは、１４〜約２４炭素の長さであり、完全に、部分的に水素化されたか又は水素化されていない脂質である変化する飽和度を有する。さらに、該脂質は、天然の源、半合成又は完全に合成の脂質であってよく、中性、負又は正に帯電してよい。ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)；卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)；ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルセリン(PS) 1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC) のようなリン脂質及び12〜24の炭素原子を有するアシル鎖又はアルキル鎖を有するスフィンゴミエリン(SM)のようなスフィンゴリン脂質を含む、多様な合成小胞形成脂質及び天然の小胞形成脂質がある。その炭化水素鎖（アシル鎖／アルキル鎖／アルケニル鎖）が変化する飽和度を有する、上記に開示した脂質及びリン脂質は、商業的に得ることができ、又は、公開されている方法にしたがって調製することができる。リポソーム中に含まれる他の適切な脂質は、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質及びステロール（コレステロール又は植物ステロールのような)である。

好ましくは、該リン脂質は、卵ホスファチジルコリン(EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)又は水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)である。

カチオン性脂質（モノ及びポリカチオン性）も本発明のリポソーム中で使用するのに適し、該カチオン性脂質は、脂質組成物の微量成分として、又は主要成分として、又は単独成分として含まれることができる。そのようなカチオン性脂質は、典型的には、ステロール、アシル鎖又はジアシル鎖のような、親油性部分を有し、該脂質は全体的に純正電荷を有する。好ましくは、該脂質の頭部基は正電荷を保有する。モノカチオン性脂質には、例えば、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP) 1,2-ジオレイルオキシ-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP)；N-[1-(2,3,-ジテトラデシロキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)；N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル-アンモニウムブロミド(DORIE)；N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)；3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol);及びジメチル-ジオクタデシルアンモニウム(DDAB)が含まれる。

ポリカチオン性脂質の例には、ポリカチオン部分が結合するモノカチオン脂質を有する同様の親油性部分が含まれる。代表的なポリカチオン性部分には、スペルミン又はスペルミジン（DOSPA及びDOSPERによって代表されるような）、又はポリリシン又は他のポリアミン脂質のようなペプチドが含まれる。例えば、中性脂質(DOPE)は、ポリリシンにより誘導体化されてカチオン性脂質を形成することができる。ポリカチオン性脂質は、これらに限定されないが、N-[2-[[2,5-ビス[3-アミノプロピル)アミノ]-1-オキソペンチル]アミノ]エチル]-N,N-ジメチル-2,3-ビス[(1-オキソ-9-オクタデセニル)オキシ]-1-プロパンアミニウム(DOSPA)、及びセラミドカルバモイルスペルミン(CCS)を含む。

リポソームを形成する脂質混合物は、特定の程度の流動性又は剛性を達成するため、血清中のリポソームの安定性を制御するため、及び、リポソーム中に閉じ込められた薬剤の放出率を制御するために選択することができる。

さらに、リポソームは、リポポリマーという用語で知られる新しい実体を形成するため、親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含むこともできる。リポポリマーは好ましくは、それらの頭部において750 Da以上の分子量を有するポリマーで改変された脂質を含む。該頭部は、極性又は無極性であり、しかしながら、大きな（＞750 Da）高い水和された（１頭部当り少なくとも水60分子）可動性のポリマーが結合した、極性頭部であることが好ましい。親水性ポリマー頭部の脂質部分への結合は、共有結合又は非供給結合であってよいが、しかしながら、共有結合（任意にリンカーを介して）の形成を介することが好ましい。親水性ポリマー鎖の最外側表面コーティングは、インビボでの長い血液循環時間をリポソームに与えるのに効果的である。リポポリマーは、二つの異なる方法によってリポソーム中に導入され得る：(a) リポポリマーを、リポソームを形成する脂質混合物中に添加すること。該リポポリマーは取込まれ、リポソーム二重層の内側及び外側リーフレットで曝露される [Uster P.S. et al. FEBBS Letters 386:243 (1996)]；(b) 又は、最初にリポソームが調製され、次いで、リポポリマー及びリポソーム形成脂質のＴｍ値以上の温度でインキュベーションするか、或いは、マイクロ波照射に短時間曝露するかの何れかによって、予め形成されたリポソームの外側リーフレットにリポポリマーが取込まれる。

リポソーム形成脂質から構成される小胞の調製及び親水性ポリマーによるそのような脂質の誘導体化（それによるリポポリマーの形成）は、例えば、Tiroshら[Tirosh et al., Biopys. J., 74(3):1371-1379, (1998)] によって、また、米国特許第5,013,556号；同第5,395,619号；同第5,817,856号；同第6,043,094号、同第6,165,501号において（参照によって本明細書に援用される）、及びWO 98/07409において開示されている。リポポリマーは、非イオン性リポポリマー（同時に、中性リポポリマー又は非帯電リポポリマーとも称される）又は純負電荷又は純正電荷を有するリポポリマーであってよい。

脂質に結合可能なポリマーは多数ある。脂質部分として典型的に用いられるポリマーは、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸、ポリ乳酸（ポリラクチドとも称される）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも称される)、ポリ乳酸-ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチロキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、ポリヒドロキシプロピル メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシエチル アクリレート、ヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースのような誘導体化セルロースを含む。該ポリマーは、ホモポリマー又はブロックコポリマー又はランダムコポリマーとして用いられ得る。

前記リポポリマーに誘導体化された脂質が中性であり、負の電荷を持ち、並びに正の電荷を持つ、即ち、特定の電荷（又は電荷なし）に制限されない一方、最も一般に用いられ、商業的に入手可能な、リポポリマーに誘導体化された脂質は、ホスファチジルエタノールアミン(PE)に基づくものであり、通常、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)である。

本発明で用いられるリポポリマーの具体的なファミリーは、DSPEに結合したモノメチル化PEG（異なる長さのPEG鎖を有する、該メチル化PEGは略されたPEGとしてもここでは称される）であって、該PEGポリマーが該脂質に、カルバメート結合を介して結合されて負に帯電したリポポリマーを産する、DSPEに結合したモノメチル化PEGを含む。他のリポポリマーは、中性メチルポリエチレングリコールジステアロイルグリセロール(mPEG-DSG)及び中性メチルポリエチレングリコールオキシカルボニル-3-アミノ-1,2-プロパンジオールジステアロイルエステル(mPEG-DS) [Garbuzenko O. et al., Langmuir. 21:2560-2568 (2005)]である。PEG部分は好ましくは、約750Da〜約20,000 Daの頭部基の分子量を有する。より好ましくは、該分子量は約750 Da〜約12,000 Daであり、最も好ましくは、約1,000 Da〜約5,000 Daである。ここで用いられる一つの具体的なPEG-DSPEは、2000 Daの分子量を有するPEGであり、ここでは、²⁰⁰⁰PEG-DSPE又は^2kPEG-DSPEと命名される。

そのような誘導体化脂質を含むリポソームの調製も開示されており、典型的には、１〜２０モルパーセントのそのような誘導体化脂質がリポソーム製剤中に含まれる。

上記で論じたように、両親媒性弱塩基は好ましくは媒体と組み合されて用いられる。好ましい態様に従って、該媒体は、脂質小胞であり、両親媒性弱塩基は該小胞中に封入される。より好ましくは、該小胞はリポソームである。

用語「封入(encapsulating)」は、脂質小胞、例えばリポソームの水相中への両親媒性弱塩基の添加を意味するようにここでは用いられる。添加（Loading）は、好ましくは、遠隔性の添加技術の使用によって行われ、該抗酸化物は、米国5,192,549に開示されているように、アンモニウムイオン濃度勾配に抗して添加することによって予め形成されたリポソーム中に添加される。この方法に従えば、該両親媒性弱塩基は、他の添加方法によって達成することができるよりはるかに高いレベルの濃度でリポソーム内部の水性コンパートメント内に蓄積される。

ここで用いられる「投与(administering)」は、好ましくは媒体に保有された両親媒性弱塩基を、それらを被検者の所望の部位に送達するのに適した任意の経路で、好ましくは、皮下、筋肉内及び静脈内、動脈内、腹腔内、並びに、鼻腔内投与、くも膜下腔内及び注入技術を含む非経口ルートによって、被検者に接触又は分配し、送達又は適用することを意味するように用いられる。

一つの好ましい態様に従って、本発明に従って用いられる製剤は、注射に適した形態である。注射可能な製剤のために有効な薬学的小胞についての要求は、当該分野の技術者には周知である。「Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)」、及び「ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)」を参照されたい。

本発明の好ましい態様は、1〜20モルパーセントのリポポリマーを含むリポソームに関する。該リポポリマーの好ましい親水性部分は、PEGであり、好ましい誘導体化リポポリマーは²⁰⁰⁰PEG-DSPE、²⁰⁰⁰PEG-DS又は²⁰⁰⁰PEG-DSGである。

それらのリポソーム成分の間の比率の変化は、リポソームの安定性を含むリポソームの薬理学的性質を規定し、これは種々のタイプの小胞の適用に大いに関係する。リポソームの安定性が、従来の医薬品と同じ標準を満たすべきであることは明らかであろう。化学的安定性は、リン脂質二重層中のエステル結合の加水分解及び脂質鎖中の不飽和サイトの酸化のいずれの予防にも関する。化学的不安定性は、物理的不安定性又は二重層からの封入された薬物の漏出並びに小胞の融合及び凝集をもたらす。化学的不安定性は、リポソームの短い血液循環時間ももたらし、これはターゲットに接近し相互作用する有効性に影響する。

本発明に従った具体的なリポソーム組成物は、コレステロール(Chol)及び前記リポポリマーと組合せて、水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)又は卵ホスファチジルコリン(EPC)のようなリポソーム形成脂質を含むものである。具体的な態様は、以下のリポソーム組成物を含む：EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE及びHSPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPEいずれもモル比が54:41:5である。異なる構成のリポソームの最終添加パッキングパラメーターが約0.74〜1.0の範囲であるという条件で、他のリポソーム形成脂質が同じ又は類似のモル比で利用され得ることは明らかである。

本発明の好ましい態様に従って、予め形成されたリポソームが、両親媒性弱塩基のリポソームへのイオン濃度勾配に抗する遠隔添加のために用いられる。遠隔添加に用いるための、H⁺ を有するリポソーム及び／又はリポソーム二重層を横切るイオン勾配は、種々の技術によって調製できる。典型的な方法は、脂質の混合物を、安定なリポソームが形成する割合で適切な有機溶媒中に溶解し、容器中で蒸発させて薄い脂質フィルムを形成することを含む。次いで、該フィルムを、溶質種を含む水性媒体で水和し、リポソーム内部水相を形成し、また、イオン膜貫通勾配（リポソーム内側 高／膜外側 低）のための基礎を供給する。

リポソーム形成の後、該リポソームは、既知の方法に従って、選択された範囲内のリポソームのサイズ分布を達成するために大きさに従って分けられる。リポソームは70〜100 nmの範囲の選択されたサイズ、好ましくは約80 nmに、均一にサイズ分けされることが好ましい。

サイズ分けした後、リポソームの外部媒体は、リポソーム膜を横切るイオン勾配を生成するように処置され、これは典型的には高い内側／低い外側イオン濃度勾配である。これは、種々の方法で行われ、例えば、(i)外部媒体を希釈する、(ii) 所望の最終媒体に抗して透析する、(iii)例えば、溶出のために用いられる所望の媒体中で平衡化されたSephadex G-50を用いた、ゲル排除クロマトグラフィー、又は(iv) 高速遠心分離及びペレット化したリポソームの所望の最終媒体中での再懸濁を繰り返す；で行われる。外部媒体の選択は、ここで考察するように、勾配形成の機構、外部溶質及び所望のｐＨに依存する。

イオン及び／又はH⁺ 勾配を発生させるための最も簡単なアプローチにおいて、脂質は水素化され、選択された内部媒体ｐＨを有する媒体中でサイズ分けされる。リポソームの懸濁液は、外部リポソーム混合物が所望の最終ｐＨに達するまで滴定されるか、又は、所望の外部ｐＨを有するもので外部相バッファーを交換するために上記のように処置される。例えば、元の水素化媒体は、選択されたバッファー、例えばグルタメート、クエン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩バッファー中において、5.5のｐＨを有し、その最終外部媒体は、同じ又は異なるバッファー中で8.5のpHを有する。それらのバッファーの共通の特徴は、基本的にリポソーム不透過性である酸からそれらが形成されているということである。内部及び外部媒体は、例えば、バッファー、塩、又はデキストロース又はスクロースのような低分子量非電解質溶質の濃度を適切に調整することによって、好ましくはほぼ同じモル浸透圧濃度を含むように選択される。

他の一般的なアプローチにおいて、該勾配は、リポソーム中にイオン選択的イオノフォアを含むことによって調製される。説明すると、リポソーム二重層中にバリノマイシンを含有するよう調製されたリポソームは、カリウムバッファー中で調製され、サイズ分けされ、次いで、外部媒体がナトリウムバッファーと交換され、カリウム内側／ナトリウム外側勾配が創造される。K⁺ 選択的イオノフォアバリノマイシンは、恐らくはリポソーム膜を横切る純電気陰性電化に応答したプロトンのリポソーム内部への移動のために、内側から外側への方向でのカリウムイオンの移動を可能にし、その結果として、低内側／高外側ｐＨ勾配を生成する[Deamer, D. W., et al., Biochim. et Biophys. Acta 274:323 (1972)]。

簡単なアプローチは、脂質を水和し、形成した多重膜のリポソームを高濃度の硫酸マグネシウム中でサイズ分けすることである。該硫酸マグネシウム勾配は、スクロース中、20mM HEPPES バッファー、pH 7.4に抗して透析されて創造される。次いで、A23187 イオノフォアが加えられ、各マグネシウムイオンからの二つのプロトンの交換においてマグネシウムイオンの外向きの移動が得られるとともに、内部リポソーム 高／外部リポソーム 低プロトン勾配が確立される [Senske DB et al. (Biochim. Biophys. Acta 1414: 188-204 (1998)]。

他のより好ましいアプローチにおいて、薬物添加に用いられる該プロトン勾配は、例えば、米国特許第5,192,549号及び同第5,316,771号（参照によって本明細書に援用される）に開示されているように、リポソーム膜を横切るアンモニウムイオン勾配を創造することによって調製される。該リポソームは、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどのようなアンモニウム塩、典型的には0.1〜0.3 M アンモニウム塩を、適切なpH、例えば5.5〜7.5で含む水性バッファー中で調製される。勾配は、デキストロース硫酸アンモニウム塩、ヘパリン硫酸アンモニウム塩又はスクラルフェートのような硫酸化ポリマーを水和媒体中に含むことによって調製することもできる。リポソーム形成及びサイズ分けした後、外部媒体をアンモニウムイオンを含まないものに交換する。このアプローチにおいて、添加の間、両親媒性弱塩基がアンモニウムイオンと交換される。

さらに、他のアプローチが米国5,939,096に開示されており、参照によって本明細書に援用される。簡単には、該方法は、酢酸のような弱酸の塩が関与するプロトンシャトル機構を利用し、そのプトロン化形態がリポソーム膜を横切って位置して、高内側／低外側ｐＨ勾配を生じさせる。次いで、両親媒性弱酸化合物が該媒体に加えられ、リポソームを予め形成する。この両親媒性弱酸は、この勾配に応じてリポソーム中に蓄積され、カチオン（即ちカルシウムイオン）が促進する沈殿によって、又はリポソーム膜を横切る低い透過性によってリポソーム中に保持される、即ち、両親媒性弱酸は酢酸と交換される。

遠隔性の添加、及び特に、後者のアンモニウムイオン勾配方法の使用によって、リポソーム中への両親媒性弱塩基の高い添加が可能になる。脂質に対する両親媒性弱塩基の好ましい割合は、約0.01〜約2の範囲であり、好ましくは、約0.001〜約4の範囲であり、好ましくは0.01〜約2の範囲である。両親媒性弱塩基の高い添加のために、リポソーム中の同じ濃度が共に閉じ込められた硫酸のような対イオンの存在下において、それを沈殿させるようであることがときに好ましい。

他の好ましい態様に従って、両親媒性弱塩基の添加は、ゲルの液体結晶相遷移の温度範囲で行われるべきである。

本発明は好ましくは、両親媒性弱塩基として、環式窒素酸化物を含むリポソームの製剤の使用に関する。好ましい両親媒性弱塩基は、環式窒素酸化物でありTMNである。

従って、本発明に従う好ましいリポソーム製剤は、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）に封入されたTMNである。血液脳関門を十分なレベルで透過するために、ＳＳＬが約80 nm又はより小さい直径を有することが必須である。

以下の例は、ここで開示した発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するように意図するものでは全くない。

代表的な態様の詳細な説明

実施例１−神経におけるTMNの影響
細胞培養
PC12細胞を、7％ウシ胎児血清、7％ウマ血清、100 μg/mlストレプトマイシン、及び100 U/mlペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖した。その培養物を加湿した6% CO₂雰囲気下、37℃のインキュベーター中で維持した。増殖培地を週に２回交換し、培養物を週に１回１：６の割合で分割した[Abu-Raya et al. J. Neurosci. Methods 50:197-203 (1993)]。

分化のために、同数のPC12細胞(3.75×10⁵ 細胞)を、細胞接着を促進するためにラット尾部タイプＩコラーゲン (0.1 mg/ml) でコーティングした６穴プレートに蒔いた[Abu-Raya et al Rasagiline, a monoamine oxidase-B inhibitor, protects NGF-differentiated PC12 cells against oxygen-glucose deprivation. J. Neurosci. Res. 58:456-463 (1999)]。培養物の分化を、NGF (50 ng/ml)を７〜８日間の間に４８時間毎に添加して処理することによって誘導した。

細胞死の測定−乳酸脱水素酵素（LDH）漏出アッセイ
細胞死を、先に述べられているように [Abu-Raya et al. J. Neurosci. Res. 58:456-463, (1999)]、増殖培地中に漏出するＬＤＨを測定することによって評価した。増殖培地のサンプル50 μlを各ウェルから集め、3,500 rpmで５分間、25℃で遠心分離した；上清を集め、LDH放出をTRACE LD-L試薬を使って測定した。ELISA リーダー（TECAN, SPECTRAFluor PLUS, Grodig, Salzburg, Austria）を340 nmで用い、続いて、酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD⁺)の還元形態(NADH)への転換率を用いて、LDH活性を定量した。MPP⁺-誘導LDH放出は、対照の非処理培養物と比較して100％の毒性を表した。各実験は、重複して３回行った(n=6)。

MPP⁺毒性実験
実験の日、NGF含有培地を新鮮なものと交換した。培養物を３つのグループに分割した：１）対照―非処理細胞；２）MPP⁺ 傷害に曝露した培養物；３）MPP+ 傷害に曝露したTMN処理培養物。

MPP⁺ をNGF含有増殖培地に溶解し、各ウェルに最終濃度1500 μMで添加した。実験の終わりに、ＬＤＨ放出を評価するために培地を採取した。実験中、全ての培養物は加湿した6% CO₂雰囲気下、３７℃で維持した。実験は、培地へのＬＤＨ放出によって測定された細胞死の割合が30〜60％の範囲で達成された。

NGF含有増殖培地に溶解したTMNを、MPP⁺に曝露する１時間前に該培養物に添加した。投与量応答アッセイのために、TMNを各ウェルに最終濃度0.1、1、10、100、500又は1000 μMで投与した。50 μlのサンプル培地を、ＬＤＨ放出評価のために４８時間後に採取した。

結果
MPP⁺による傷害に曝露されたPC12神経細胞におけるテンパミン保護効果
図１は、TMNが、1500 μMのMPP⁺によって加えられた酸化的な傷害から、(0.1〜100 μM)の範囲で投与量依存的にPC12神経細胞を保護すること、100μMが最も有効であることを示している。高濃度500μM〜1000μM（治療的適用に不適切な濃度）での釣鐘形状は、高濃度のTMNが細胞に毒性であることを暗示している。

実施例２−TMNを含むリポソーム製剤
材料及び方法
2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-4-アミノ-1-オキシル(4-アミノ-テンポ、TMN、TMNと呼ばれる)遊離ラジカル97％を、Aldrich (Milwaukee, Wis., USA)から購入した。
卵ホスファチジルコリン (EPC I)及び水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)を、Lipoid KG (Ludwigshafen, Germany)から得た。
N-カルバミル-ポリ-(エチレングリコールメチルエーテル)-1,2-ジステアロイル-s-n-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン トリエチル アンモニウム塩（²⁰⁰⁰PEG-DSPE）をGenzyme（Lista, Switzerland）から得た。
コレステロールをSigma（St. Louis, Mo., USA）から得た。
セファデックスG-50をPharmacia（Uppsala, Sweden）から得た。
t-エタノールをBDH, Poole, UKから購入した。
フルオロセイン(Fluoroscein) ホスファチジル レタノールアミン(lethanolamine)（F-PE）をAvanti Polar Lipids (Alabaster, Ala., USA)から得た。

他の薬品はバッファーを含めて、Sigmaから得た。透析膜（ダイアリシスチュービング-ビスキング（サイズ6-｛分率（27/32）｝”）をMedicell International (London, UK)から得た。

可能な最小レベルの総有機炭素及び無機イオンのレベルを提供する精製水(WaterPro PS HPLC/Ultrafilter Hybrid model, Labconco, Kansas City, Mo., USA)を、全ての水を基本にした配合物中で用いた(抵抗 18.2メガオーム)。

電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）測定
ＴＭＮ濃度を検出するために、JES-RE3X EPRスペクトロメーター(JEOL Co., Japan) （Fuchs, J., et al., Free Radic. Biol. Med. 22:967-976, (1997)）を用いたＥＰＲ分光測定を利用した。サンプルを、0.81 mm i.d.及び0.05 mm 壁厚のガス-透過性のテフロン（登録商標）キャピラリーチューブ(Zeus Industrial Products, Raritan, N.J., USA)にシリンジで吸引した。キャピラリーチューブを両端が開口した2.5-mm-i.d.石英チューブに挿入し、EPR穴に置いた。EPRスペクトルを329 mT、100 kHz変調周波数、0.1 mT 変調振幅、及び非含浸（nonsaturating）マイクロ波力で設定された中心野で記録した。EPR測定の直前に、添加されたリポソームを、0.15 M NaClで適切なTMN濃度範囲(0.02〜0.1 mM)に希釈した。実験は、空気の下、室温で行った。これは、ＴＭＮの活性を定量する機能アッセイである。

サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定
全てのサイクリックボルモグラムを、--200 mV〜1.3 Vの間で行った。測定は、リン酸-緩衝生理食塩水、pH 7.4で行った。調査を通して３電極系を用いた。作用電極には直径3.3 mmのガラス状カーボンディスク(BAS MF-2012, Bioanalytical Systems, W. Lafayette, Ind., USA)を用いた。補助電極は白金ワイヤーであり、参照電極はAg/AgCl (BAS)であった。作用電極は、各測定の前に研磨キット(BAS PK-1) (Kohen, R., et al., Arch. Gerontol. Geriatr., 24:103-123, (1996))を使用して研磨した。CV測定の直前に、サンプルをバッファーで至適TMN濃度範囲(0.05-0.2 mM)に希釈した。実験は、空気下、室温で行った。CVアッセイは、電子を受容又は供与する検体の能力を定量する機能アッセイである。

リポソームの調製
リポソーム形成
EPC、コレステロール及び²⁰⁰⁰PEG-DSPEのモル比が54:41:5であるストック溶液を、最終脂質濃度が62.5% (w/v)に達するように７０℃のエタノール中で混合し、次いで、全ての脂質が溶解して清澄溶液が得られるまで、７０℃で１５分間インキュベートした。次いで、この脂質を含有するエタノールストック溶液を、最終脂質濃度が6.25% (w/v)に達し、最終エタノール濃度が10% (w/v)に達するように、70℃の250mMの硫酸アンモニウム溶液に加えた。この混合物を、乳白色の分散系が得られるまで、70℃で一定に撹拌し、この段階で、脂質は水和されてサイズ分けされていない不均一な多層状の(multillamellar)リポソーム(MLVs)を形成した。

また、三級ブタノールからの凍結乾燥（冷凍温度２２℃）に続く機械的な水和（ボルテックスで撹拌）及び押出しのアプローチも使用した[G. Haran et al. Biochim Biophys. Acta 1151:201-215 (1993)]。全ての脂質を三級ブタノールに溶解し、一晩凍結乾燥した。乾燥脂質粉末を硫酸アンモニウム溶液(150 mM)で水分補給した。水分補給は、マトリクス脂質のT_m 以上で行った：HSPCは60℃(Tm＝52.2℃)及びEPCは室温(Tm＝-5℃)。水和は、連続的な振盪下で行い、多層小胞(MLV)を形成させた。水和媒体の容量は、10% (w/v)の脂質濃度を得るように調節した。大きい単層の小胞(LUV 100nm)を、最終工程で100-nmの細孔サイズのポリカーボネートフィルターを用いて段階的に押出しすることによって調製した。

リポソームサイズ分布は、Coulter (Model N4 SD) サブミクロン粒子アナライザー又はALV-5000/EPP マルチプルデジタル相関器(ALV-Laser Vertriebsgesellschaft GmbH, Langen, Germany [Barenholz Y and Amselem S. liposome Technology 2nd Edition, Vol I, liposome Preparation and Related Techniques 527-616 (1993)]を備えたALV-NIBS/HPPSの何れかを用いた動的光散乱法(DLS)によって定量した。MLV及びLUVのそれぞれについて、1200±200 nm (多重モード)及び100±10 nm (単峰)が得られた。

高圧押出し装置 (Lipex Biomembranes, Vancouver,BC,Canada)を用いて、次第に孔サイズが減少する（0.4、0.1、0.08及び0.05 um）二枚積み重ねたポリカーボネート膜を通して、段階的な押出しによって小さい単層の小胞(SUVs)を得た。TMNを以下に記載するような硫酸アンモニウム勾配を使用して、予め形成されたSUV中に能動的に遠隔添加した。

硫酸アンモニウム勾配の形成
硫酸アンモニウム勾配の形成のために、Amselem et al. [Amselem et al. J. Liposome Res., 2:93-123 (1992)]の透析方法を利用した。簡単に言うと、該方法は、0.13M NaCl 0.01M クエン酸Na (pH=7.4)の100容量に対して、メディカルインターナショナルからの二つ又は三つの連続した透析交換を用いる（透析チュービング-ビスキング（サイズ 9 36/32”）。

テンパミンのリポソーム添加
ＴＭＮのリポソーム添加は、WO03/053442に開示されているように行った。簡単に述べると、濃縮したTMNアルコール溶液（70% エタノール中、0.8 ml の25 mM TMN）を、10 mlのリポソーム懸濁液に加えた。最終溶液は、5.6%のエタノール及び2 mM TMNを含む。添加は、マトリクス脂質のT_m 以上で行った。添加は、４℃での透析を用いて、非封入ＴＭＮの除去により指定された時間で終了した。

添加効率は、以下のように決定した。

テンパミンの封入パーセント
調製されたリポソーム中に封入されたＴＭＮの量は、WO03/053442に開示されているように、EPR又はCVの何れかを用いて定量した。EPR測定は初め、添加後のリポソーム製剤(TMN_mix)中の全ＴＭＮを測定した。次いで、フェリシアン化カリウム―遊離（非-リポソーム）TMNのシグナルを除去するEPR広幅化剤（broadening agent）―の存在下、添加後のリポソーム製剤中のTMNの量を測定した。残ったシグナルはリポソーム中のＴＭＮのものである（TMN_{liposome(quenched)}）。得られたスペクトルは、リポソーム内のＴＭＮ濃度が高いために広範であり、互いに近接したＴＭＮ分子間のスピン相互作用のためにそのＥＰＲシグナルの消光をもたらす。次いで、ナイゲリシン（nigericin）(TMN_nigericin)によって、リポソームからのその放出後の全ＴＭＮを測定した。このシグナルは、添加(TMN_nigericin=TMN_total)のための用いられた全ＴＭＮと同一であり、完全に消光（dequenched）される。TMN_{liposome(not quenched)} は、硫酸アンモニア勾配が崩壊し、全てのＴＭＮが放出されたときの、リポソームＴＭＮのシグナルを表す。

封入パーセント及び消光要因は以下のように算出される：
TMN_free＝TMN_mix-TMN_{liposomes (quenched)} (1)
TMN_{liposomes(not quenched)}＝TMN_nigericin-TMN_free (2)
封入パーセント＝100xTMN_{liposome(not quenched)}/TMN_nigericin (3)
消光要因（Quenching factor）＝TMN_{liposome(not quenched)}/TMN_{liposome(quenched)} (4)
データを表１にまとめる。

総合ＴＭＮ＝ＴＭＮナイゲリシンのレベルは1% トリトン X-100によるリポソーム可溶化後に測定したＴＭＮとよく一致する。ＣＶによるTMNの測定は、最初に遊離ＴＭＮ（リポソーム中への添加後の残り）を測定した。それらから、遊離ＴＭＮのレベル、及び封入されたＴＭＮのパーセントを算出した。WO03/053442にも記載されているように、EPRとCV測定値の間は良好に一致した。

窒素酸化物定量化
組織、脳及び血漿中のTMN濃度を、上記方法の節に記載したように、リポソームを可溶化し、封入されたＴＭＮ及び遊離ＴＭＮの検出を可能にする、1.32 %のトリトン X-100の存在下で、電子常磁性共鳴(EPR)を用いて定量した。

リン脂質濃度
リポソーム組成物中のリン脂質濃度を、バートレット方法の変更を用いて定量した[Barenholz Y. et al. in LIPOSOME TECHNOLOGY, G. Gregoriadis (Ed.) 2^nd Edn, Vol I, CRC Press, Boca Raton 527-616 (1993);, Shmeeda et al, Methods in Enzymol. 367:272-292 (2003)]。

剤形
遊離TMN（濃縮されたTMNアルコール溶液（70% ETOH中500mM TMN）を、生理食塩水で希釈して、10mM 濃度を得、又は、リポソーム（EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE）に加えて最終濃度10mM TMNにした。

リポソーム体内分布：
ヘブライ大学（Jerusalem, Israel）の動物育種ハウスを通して得た６〜７週のSJLのメスのマウスを、体内分布実験の間ずっと用いた。動物をSPF学部のハダサ（Hadassah）医療センターで、随意に食物と水で飼育した。実験方法は、動物保護協会（Institutional Animal Care）及びヘブライ大学の使用委員会（Use Committee）及びハダサ（Hadassah）医療協会による標準的な要求に従った。

EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE (54:41:5)のモル比で構成されるSSLリポソーム、及び、微量の[³H] コレステリルエーテル（0.5μCi/ μmol リン脂質）を、Kedar et al [Kedar et al, J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 16(1):47-59 (1994)]に開示されているように調製した。[³H] コレステリルヘキサデシルエーテルSSL-TMN IVの注射から1、6、16、24、48及び72時間後、動物を、エーテル吸入で麻酔し、眼窩洞から抜取り、直ちに屠殺して脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、胃及び腎臓を取り出した。各時点は２匹のマウスから成った。血漿を遠心分離によって血球から分離した。

臓器はポリトロンホモジナイザー(Kinematica, Lutzern, Switzerland)で2% トリトンX-100（１：２、臓器：トリトンX-100溶液）中で均質化し、冷却し、ＴＭＮを放出するために数回温めた。血漿サンプルを、2% トリトンX-100と１：１で混合し、試験サンプル中1% トリトンX-100を与え、冷却し、数回温めた。そのような条件下で、無処置のリポソームがそのＴＭＮを全て放出するのを定量した（さらなるＴＭＮ定量のために）。

100μlのサンプル二つ組を、サンプル酸化剤（Sample Oxidizer ）(Model 307, Packard Instrument Co., Meridien, CT)中で燃やし、一晩暗く冷たい場所に置き、β計測器 (KONTRON Liquid Scintillation Counter)で測定した。リポソーム DPM/μmoleの放射スペクトル活性を算出した。

実施例２Ａ−多発性硬化症 (MS)
動物モデル
Ａ．PLP (プロテオリピドタンパク質)を用いた急性EAEの誘発
プロテオリピドタンパク質を用いたEAEの誘発を、Pollak J of Neuroimmunology 137:94-99 (2003)]に開示されているように行った。簡単に述べると、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）139-151ペプチド並びに150μgのペプチド及び200μgの結核菌を含有する完全フロイントのアジュバンド（ＣＦＡ）を含有するエマルジョンを、右側方に皮下注射して６〜７週齢のＳＪＬメスマウスを免疫化した。最初のＰＬＰ注射の日に、百日咳毒素(PT) 150ngを腹腔内に注射した（0.1ml/マウス）。

その動物を特定病原体のない(SPF)条件で維持し、随意に食物を与えた。
処置のために、動物（１グループに10匹のマウス）をグループに分け、下記表２にまとめたように処置した。

一度ＭＳの臨床的徴候が現れたら（即ち、ＰＬＰの接種後１０日）、ベタフェロン(Betaferon)(Schering AG Germany)又はコパクソン(Copaxone)(Teva pharmaceuticals, Israel)のような従来のＭＳ薬物、或いは、上記表１に記載した立体的に安定化されたＴＭＮ製剤（EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE、54:41:5、表２下方SSL-TMN)のいずれかで、マウスを処置した。

EAE誘発(PLP注射、即ち、処置の第一日)後１０日からマウスを毎日観察し、EAEの臨床的徴候を採点した。採点は下記表３に従って行った：

疾患（病気）が発達した各動物グループにおけるマウスの数を合計し、それらの割合を算出した。

加えて、平均最大スコア（ＭＭＳ）を、各グループの１０匹のマウスのそれぞれの最大スコアを合計し、以下の式に従ってグループの平均最大スコアをそれらから算出した：
Σ各マウスの最大スコア／グループ中のマウスの数
さらに、発現した疾患（ＭＤＤ）の平均日数を以下の式に従って算出した：
Σ各マウスの疾患の期間／グループ中のマウスの数
さらに、各グループの平均スコア（ＧＭＳ）(疾患の負担)を、以下の式に従って、グループ中の１０匹のマウスのそれぞれのスコアを合計し、１日あたりの平均スコアを算出して決定した：
Σ１日当りの各マウスの合計スコア／グループ中のマウスの数。

表４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ（３つの別々のアッセイから得られた）及び図１は算出された異なるスコアの概要を示している：

上記及び図２の結果は、立体的に安定化されたＴＭＮ（SSL-TMN, 直径80nm）の静脈内投与が、従来の薬物（コパクソン及びベタフェロン）により観察される徴候と比較して、或いは、空のＳＳＬリポソーム（ＥＰＣ又はＨＳＰＣ）又は遊離ＴＭＮと比較して、ＭＳの臨床的徴候を減少させるのにより有効であり、空のリポソーム又は遊離ＴＭＮは、疾患に対して何の効果も観察されないことを証明した。

Ｂ．体内分布調査
マウスは、0.1ml [³H] コレステリルヘキサデシルエーテル (0.5μCi/ μmol リン脂質)標識化TMN-SSLのi.v 注射を受けた。注射後異なる時点で（[³H] コレステリルヘキサデシルエーテルリポソーム注射から1、6、16、24、48及び72時間後)、マウスをエーテル吸入で麻酔し、眼窩洞から抜取り、直ちに屠殺して脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、胃及び腎臓を取り出した。各時点は２匹のマウスから成った。血漿を遠心分離によって血球から分離した。

臓器はポリトロンホモジナイザー(Kinematica, Lutzern, Switzerland)で2% トリトンX-100（１：２、臓器：トリトンX-100溶液）中で均質化し、冷却し、脂質膜を破壊するために数回温めた。血漿サンプルを、2% トリトンX-100と１：１で混合し、試験サンプル中1% トリトンX-100を与え、冷却し、数回温めた。そのような条件下で、無処置のリポソームがそれらのＴＭＮを全て放出するのを定量した。

100μlのサンプル二つ組を、サンプル酸化剤（Sample Oxidizer）(Model 307, Packard Instrument Co., Meridien, CT)中で燃やし、一晩暗く冷たい場所に置き、β計測器 (KONTRON Liquid Scintillation Counter)で測定し、各臓器中のリポソームＴＭＮの量を反映させた。図３は、リポソームTMN (EPC:Chol²⁰⁰⁰PEG-DSPE)で処置した後の、健康なマウス及びＥＡＥ誘発マウスにおける、組織１ｍｌ当りの吸光度の割合を提示する。[³H]コレステリルヘキサデシルエーテル SSL-TMNリポソーム透過が、健康なマウスのものより病気(EAE)にかかったマウスの脳内においてより高く、特に、[³H] コレステリルヘキサデシルエーテルSSL-TMNリポソームの注射から最初の６時間の間で高いということが明確に示されている。これは、ＭＳ及び同様の神経変性疾患で共通である、血液脳関門（ＢＢＢ）における破壊の結果であると考えられる。

健康な動物モデルと病気にかかった動物モデルにおけるリポソームＴＭＮの組織分布における相違を図４Ａ〜４Ｂにそれぞれ示した。

Ｃ．MOG (ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質)を用いた慢性ＥＡＥの誘発
MOG 35-55 ペプチドを用いた慢性 EAEの誘発を、[Offen D et al J Mol Neurosci. 15(3):167-76 (2000)]に開示されているように行った。一般に、メスのC57B1/6マウスに脳炎惹起性のエマルジョン(MOGプラスＭＴに富むCFA(結核菌)を接種(右側方にs.c.注射)した。接種の日及び48時間後に百日咳毒素を注射したi.p (250 ng/mouse)。MOGエマルジョンの追加免疫を、最初の注射から１週間後に右側方に注射したs.c.。１０日目に、各マウスにSSL-TMN製剤又は対照溶液を注射した(i.v.)。動物を、SPF条件で維持し、食物及び水を随意に与えた。処置を３０日に終了した。

処置のために、動物（各グループ１０匹のマウス）をグループに分割し、下記表５にまとめたように処置した。

マウスは、EAE誘発（MOGの最初の注射)の後１０日目から毎日観察し、EAE臨床的徴候を上記に示した表３に従って採点した。結果を表６及び図５に示す。

表６及び図５は、SSL-TMNが、慢性疾患のMOG誘発動物モデルにおいても、対照（生理食塩水）と比較して、MSの臨床的徴候を減少するのに有効であることを示している。

実施例２Ｂ−パーキンソン病
パーキンソン病の治療におけるリポソームＴＭＮ製剤の効果を判定するために、従来の6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)パーキンソン動物モデルを用いた[Hastings TG et al; Proc. Natl.Acad. Sci USA 93:195619-195661 (1996)]。このモデルは、ドーパミン作動性神経細胞への先々の毒素(6-OHDA)の蓄積が、恐らく酸化ストレスに媒介されるそれらの死をもたらす、黒質への6-OHDAの一側性の注射によって特徴付けられる。簡単に言うと、6-OHDA (8 μg/rat)が4 μlでオスのSprague-Dawleyラット(体重250〜280 g；注射の座標: 十字縫合からP＝4.8、L＝1.7、H＝-8.6)の右の黒質に定位的に注射される。6-ヒドロキシドーパミン注射から１８日後、アポモルヒネ(25 mg/100 g体重)のs.c. 注射後１時間当り＞350の回転を有するかどうか、及び、２日後、それらが、D-アンフェタミン(4 mg/kg)のi.p. 注射後の１時間当り＞360（平均520±38）の回転を有するかどうか、移植のためにラットを選択した。

黒質における病変の効果は、足踏み試験(stepping test)で評価した[Olsson M et al; J. neurosci 15(5):3863-3875 (1995)]。この試験は、ラットの前肢における運動の開始の欠乏を判定し、肢アキネジア及びパーキンソン患者における歩行運動問題に類似している。6-OHDA病変は深く足踏みの調整に影響し、これは、左肢性能(反対側の肢)における重大な機能障害があることを意味し、これはラットが実験者によって横に動かされたとき、足の引きずりをもたらす。対照的に、右足は影響されない。SSL-TMN (EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE)を受けた動物は、対照6OHDA動物とは対照的に、足踏みの調節における著しい上昇を示す。足踏み調節の数は、標準的な平面での前方へのゆっくりとした横向きの動きの間にそれぞれの前足についてカウントした。足踏み調節試験は、SSL-TMN注射の後に各前肢について２回行い、SSL-TMN処置動物は無処置の対照動物（6-OHDAを受けていない動物）において見られるようなものと類似のレベルに足踏みの調節の数が回復した。足踏み試験は、全てのラットにおいて、病変後１５〜２０日の間、少なくとも３回繰り返した。6-OHDAで処置され、各試験の間に、病変に対して反対側の前肢について２回未満の足踏みの調節を示したラットのみを治療のために選択した。

具体的には、ラットは、二つのグループに分割された：
グループＩ−6-OHDAによる疾病の誘発の前、２及び４日間、1ml SSL-TMN (i.v.又はs.c. 注射の何れか)で処置されたラット
グループＩＩ−6-OHDAによる疾病の誘発後、２、４及び７日間、1ml SSL-TMNによる処置を受けたラット。

ラットは、誘発の日（０日）から毎日観察され、臨床的徴候が採点された。結果を図６に示す。

ラットの挙動も上記の足踏み試験を通して検査した。具体的には、足踏み調節試験(左肢割る右肢×100)における改善の割合が採点され、その結果は図７に示した。

図１は、MPP⁺によって引き起こされた傷害に抗する、ＰＣ１２におけるＴＭＮ保護を示す棒グラフである。細胞死は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の培地への漏出を測定することによって評価した。 図２は、多発性硬化症の臨床的徴候（臨床的スコア）における、TMN (SSL-TMN)を添加された立体的に安定化されたリポソームの影響を、商業的に入手可能な薬物（Copaxone, Betaferon）のものと比較して示す、該疾患のEAEモデルを用いたときのグラフである。生理食塩水は対照処置として用いた。 図３は、[³H] コレステリルヘキサデシルエーテル標識化SSL-TMN製剤を注射(i.v.)した、健康なマウス及びEAE誘導マウスの脳における、薬物動態を示す棒グラフである。 図４Ａ、４Ｂは、異なる組織及び血漿における、健康なマウス（図４Ａ）及びEAE誘導マウス（図４Ｂ）におけるSSL-TMN リポソームの分布の変化を示す棒グラフである（図４Ａの血漿レベルは二つに分割された）。 図４Ａ、４Ｂは、異なる組織及び血漿における、健康なマウス（図４Ａ）及びEAE誘導マウス（図４Ｂ）におけるSSL-TMN リポソームの分布の変化を示す棒グラフである。 図５は、該疾患の他のEAEモデルを用いた場合の多発性硬化症の臨床的徴候（平均臨床的スコア）におけるSSL-TMNの効果を、対照処置（生理食塩水）と比較して示すグラフである。 図６は、6-OHDAパーキンソン誘導動物モデルにおける、SSL-TMNによる治療の効果を示すグラフである。 図７は、SSL-TMN（i.v.又はs.c.注射の何れか）又は対照（生理食塩水）で処置した後の、6-OHDAパーキンソンを誘導された動物の振る舞いの変化を示す棒グラフである。

Claims (51)

1. 神経変性状態の治療又は予防のための薬学的製剤の調製のための、両親媒性弱塩基の使用であって、該両親媒性弱塩基が次の特徴の一以上を有することを特徴とする使用：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、0.001〜5.0の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。
2. 前記両親媒性弱塩基が、11.0未満のpKa及び0.001〜5.0の範囲の分配係数によって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
3. 前記分配係数が、0.005〜0.5の範囲である、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記両親媒性弱塩基が、薬学的に許容される担体によって保有される、請求項１〜３の何れか一項に記載の使用。
5. 前記薬学的に許容される担体が、前記両親媒性弱塩基を封入するリポソームである、請求項４に記載の使用。
6. 前記リポソームがリン脂質、コレステロール及びリポポリマーの組み合せを含む、請求項５に記載の使用。
7. 前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン(EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)又は水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)である、請求項６に記載の使用。
8. 前記リポソーム前記組合せが、EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE又はHSPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPEを54:41:5のモル比で含む、請求項６及び７に記載の使用。
9. 前記両親媒性弱塩基が、環式窒素酸化物である、請求項１〜８の何れか一項に記載の使用。
10. 前記環式窒素酸化物がテンパミン（tempamine）(TMN)である、請求項９に記載の使用。
11. 前記神経変性疾患が、神経系の機能障害の結果として起こる神経系の異常な変質（deterioration）に付随するものである、請求項１〜１０の何れか一項に記載の使用。
12. 前記神経変性状態が、脱髄性疾患及び神経自己免疫性疾患から選択される、請求項１〜１１の何れか一項に記載の使用。
13. 前記神経変性状態が、急性、慢性、進行性、及び再発寛解性の多発性硬化症である、請求項１２に記載の使用。
14. 前記神経変性状態が、神経変性疾患から選択される、請求項１〜１１の何れか一項に記載の使用。
15. 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項１４に記載の使用。
16. 前記薬学的製剤が、非経口投与に適した剤形である、請求項１〜１５の何れか一項に記載の使用。
17. 前記製剤が、注射に適した剤形である、請求項１６に記載の使用。
18. 活性成分として次の特徴の一以上を有する両親媒性弱塩基を含む、神経変性状態の治療又は予防のための薬学的製剤：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、0.001〜5.0の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。
19. 前記両親媒性弱塩基が、11.0未満のpKa及び0.001〜5.0の範囲にある分配係数によって特徴付けられる、請求項１８に記載の薬学的製剤。
20. 前記分配係数が0.005〜0.5の範囲である、請求項１８又は１９に記載の薬学的製剤。
21. 前記両親媒性弱塩基を保有する薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１８〜２０の何れか一項に記載の薬学的製剤。
22. 前記薬学的に許容される担体が、前記両親媒性弱塩基を封入するリポソームである、請求項２１に記載の薬学的製剤。
23. 前記リポソームが、リン脂質、コレステロール及びリポポリマーの組み合せを含む、請求項２２に記載の薬学的製剤。
24. 前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン(EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)又は水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)である、請求項２３に記載の薬学的製剤。
25. 前記リポソーム前記組合せが、EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE又はHSPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPEを54:41:5のモル比で含む、請求項２３及び２４に記載の薬学的製剤。
26. 前記両親媒性弱塩基が環式窒素酸化物である、請求項１８〜２５の何れか一項に記載の薬学的製剤。
27. 前記環式窒素酸化物がTMNである、請求項２６に記載の薬学的製剤。
28. 前記神経変性状態が、神経系の機能障害の結果として起こる神経系の異常な変質に付随するものである、請求項１８〜２７の何れか一項に記載の薬学的製剤。
29. 前記神経変性状態が、脱髄性疾患及び神経自己免疫性疾患から選択される、請求項１８〜２８の何れか一項に記載の薬学的製剤。
30. 前記神経変性状態が、急性、慢性、進行性、及び再発寛解性の多発性硬化症である、請求項２９に記載の薬学的製剤。
31. 前記神経変性状態が、神経変性疾患から選択される、請求項１８〜２８の何れか一項に記載の薬学的製剤。
32. 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項３１に記載の薬学的製剤。
33. 非経口投与に適した剤形にある、請求項１８〜３２の何れか一項に記載の薬学的製剤。
34. 注射に適した剤形にある、請求項３３に記載の薬学的製剤。
35. 神経変性状態を有するか、又は、発達する素因にある被検者を治療する方法であって、該方法は、神経変性状態の発達を治療又は予防するのに有効な量の両親媒性弱塩基を含む薬学的製剤を前記被検者に投与することを含み、前記両親媒性弱塩基が次の特徴の一以上を有することを特徴とする方法：(i) 11.0未満のpKaを有する；(ii) pH 7.0のn-オクタノール/バッファー（水相）系中において、0.001〜5.0の範囲の分配係数を有する；(iii) 抗酸化活性を示す；(iv) 前アポトーシス活性を示す。
36. 前記両親媒性弱塩基が11.0未満のpKa及び0.001〜5.0の範囲にある分配係数によって特徴付けられる、請求項３５に記載の方法。
37. 前記分配係数が、0.005〜0.5の範囲である、請求項３５又は３６に記載の薬学的製剤。
38. 前記製剤が、前記両親媒性弱塩基を保有する薬学的に許容される担体を含む、請求項３５〜３７の何れか一項に記載の方法。
39. 前記薬学的に許容される担体が、前記両親媒性弱塩基を封入するリポソームである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記リポソームが、リン脂質、コレステロール及びリポポリマーの組み合せを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン(EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)又は水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC)である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記リポソーム前記組合せが、EPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPE又はHSPC:Chol:²⁰⁰⁰PEG-DSPEを54:41:5のモル比で含む、請求項３９及び４０に記載の方法。
43. 前記両親媒性弱塩基が環式窒素酸化物である、請求項３４〜４２の何れか一項に記載の方法。
44. 前記両親媒性弱塩基がTMNである、請求項４３に記載の方法。
45. 神経系の機能障害の結果として起こる神経系の異常な変質に付随する神経変性状態の治療のための、請求項３４〜４４の何れか一項に記載の方法。
46. 前記神経変性状態が、脱髄性疾患及び神経自己免疫性疾患から選択される、請求項３４〜４５の何れか一項に記載の方法。
47. 前記神経変性状態が、急性、慢性、進行性、及び再発寛解性の多発性硬化症である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記神経変性状態が、神経変性疾患から選択される、請求項３４〜４５の何れか一項に記載の方法。
49. 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項４８に記載の方法。
50. 前記薬学的製剤の非経口投与を含む、請求項３４〜４９の何れか一項に記載の方法。
51. 前記非経口投与が、注射による投与を含む、請求項５０に記載の方法。

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