MXPA06013874A - Formulacion de irinotecan. - Google Patents

Abstract

Una preparacion de irinotecan que tiene irinotecan y/o una sal del mismo altamente portado por un portador vesicular cerrado, que muestra una retencion notablemente prolongada en la sangre, como se comparo con aquella de las preparaciones de liposoma de irinotecan convencionales y es capaz de estar presente en la sangre durante un periodo de tiempo prolongado. Se proporciona una preparacion de irinotecan que comprende vesiculas cerradas formadas de una membrana de lipido en donde el irinotecan y/o una sal del mismo se sellan en una concentracion de al menos 0.07 mol/mol (mol de medicina/mci de lipidos totales de la membrana) . La preparacion de irinotecan preferiblemente tiene un gradiente ionico entre una fase acuosa interna y una fase acuosa externa dentro de las vesiculas cerradas. Las vesiculas cerradas son preferiblemente liposomas, y los liposomas preferiblemente tienen solo la superficie externa del mismo modificado con un modificador de superficie que contiene un polimero hidrofilico.

Description

FORMULACIÓN DE IRINOTECAN Campo Técnico La presente invención se refiere a una formulación de irinotecan que incluye un portador vesicular cerrado que incorpora irinotecan y/o una sal del mismo en una concentración elevada, y a una composición farmacéutica que lo contiene.

Antecedentes de la Técnica Una categoría de productos farmacéuticos para ser empleados para el tratamiento del cáncer es un inhibidor de topoisomerasa, y ejemplos del mismo incluyen campototecina . La camptotecina es un penta alcaloide cíclico, que ha sido extraído y aislado de Camptotheca acuminata (una planta de China) por Wall et . Al. (USA) in 1966 (adm. Chem. Soc., 94 (1966), 388), y del cual se descubrió que tenia una elevada actividad antineoplásica y una amplio espectro antineoplásico. Un agente de quimioterapia de cáncer convencional ejercen una actividad antineoplásica mediante la inhibición de topoisomerasa II, mientras que la camptotecina inhibe una función enzimática de la topoisomerasa que cumple una función entre la replicación del ADN, en la reparación, en la recombinación y en la transcripción mediante la inhibición de la topoisomerasa I.

La camptotecina plantea algunos problemas en el uso como fármaco. Entre ellos, con respecto a la insolubilidad en agua, se han propuesto algunos análogos de camptotecina solubles en agua, cada uno de ellos mejorado en términos de insolubilidad (JP 03-4077 B) . En particular, el clorhidrato de irinotecan (CPT-11) , que es un derivado de camptotecina soluble en agua y que ha sido presentado en el mercado en 1994 en Japón, es un profármaco y ejerce una elevada actividad antineoplásica, por lo cual era sumamente esperado en los campos clínicos. Después de la administración, el clorhidrato de irinotecan, que es un profármaco se metaboliza en SN-38 que es un metabolito activo, y ejerce una actividad antineoplásica . Sin embargo, cuando se administra irinotecan y una sal del mismo, se producen graves efectos secundarios tales como disfunción de la médula ósea y trastornos gastrointestinales. Por lo tanto, el uso del mismo está severamente restringido. Además, existe el problema en el sentido de que disminuye la actividad antineoplásica por hidrólisis de un anillo a-hidroxilactona debido a la sensibilidad en un ambiente acuoso, que es único para la camptotecina y un análogo del mismo. Para resolver los problemas anteriores y llevar a cabo un óptimo tratamiento del cáncer usando un análogo de camptotecina como antimetabolito específico del ciclo celular, es necesario mantener la concentración del fármaco por un largo período de tiempo. Sin embargo, existe el hecho de que dicho fármaco tiene una vida media tan corta como varias horas después de administración intravenosa o administración subcutánea. El fármaco es útil como agente de control de liberación que puede usarse para liberar un agente farmacéutico que tiene una concentración terapéutica. Una modalidad para resolver estos problemas, libertar un análogo de camptotecina estable y eficazmente a un sitio objetivo con una lesión, y ejercer una actividad antineoplásica en un sitio objetivo con una lesión, es el que incorpora el fármaco a un portador que tiene una forma de vesícula cerrada. Algunas propuestas sobre la formulación de un liposoma, incluyendo camptotecina, han sido ya formuladas. Por ejemplo, se ha informado que cuando se incluye camptotecina en una membrana de liposoma, se suprime la hidrólisis de un anillo de a-hidroxilactona (JP 9-504517 A; Tomas G. Burke et al., Biochemistry, 32 (1993) , 5352-5364) . Además, se ha descrito un método para conseguir que una membrana de liposoma contenga al SN-38 mismo, que es un cuerpo principal activo de clorhidrato de irinotecan (W.Gao et al. J. of Chromatography B, 791 (2003), 85-92; Joshua Williams et al., J. of Controlled Reléase, 91 (2003), 167-172. Sin embargo, el SN-38 es difícil de estabilizar en una membrana de liposoma y desaparece rápidamente en la sangre, de modo que es difícil mantener la concentración de S-38 en el plasma por un período de tiempo prolongado. Se ha informado también un ejemplo de manufactura basado en un método habitual en el cual el clorhidrato de irinotecan (un derivado soluble en agua) queda encerrado en un liposoma por el método de carga pasiva, y es estabilizado fijándolo en la membrana de bicapa de lípidos, electrostáticamente Documento de Patente 1: JP 3-4077 B Documento de Patente 2 JP 9-504517 A Documento de No-Patente 1: Am. Chem. Soc ., 97 (1996) , 388 Documento de No-Patente 2: Tomas G. Burke et al., Biochemestry, 32 (1993), 5352-5364 Documento de No- Patente 3: W. Gao et al., J. of Chromatography B, 791 (2003) 85-92 Documento de No-Patente 4: Joshua Williams et al., J. of Controlled Reléase, 91 (2003), 167-172 Documento de No-Patente 5: Yasuyuki Sazuka et al. Cáncer Letter 127 (1998) , 99-106 Descripción de la Invención Problemas que deben ser Resueltos por la Invención La cantidad de clorhidrato de irinotecan que se incorpore en una liposoma de acuerdo con el método descrito anteriormente de encapsulación de clorhidrato de irinotecan el método de carga pasiva que ha sido ya manifestado, es de aproximadamente 0.05 (fármaco (mol)/lípido total (mol). Con dicha cantidad incorporada, la concentración de clorhidrato de irinotecan en el plasma y la concentración de SN-38 que es un metabolito activo del mismo, son apenas mantenidos por un tiempo prolongado, y dichas cantidades no son suficientes para los efectos clínicos. Aunque la capacidad de retención del clorhidrato de irinotecan en la sangre mejora mediante la formación de liposomas, la concentración de SN-38 que es un metabolito activo en el plasma se mantiene apenas por un tiempo prolongado, debido a que la velocidad de desaparición desde la sangre es todavía rápida. No se ha informado todavía sobre una formulación que contenga una cantidad para encapsulación clínicamente apropiado/suficiente de irinotecan (un profármaco) y/o una sal del mismo en una vesícula cerrada, y que existe en la sangre en un estado de hidrólisis suprimida de una anillo de a-hidroxilactona por un período de tiempo prolongado, para mantener la concentración de SN-38 que es un metabolito activo en el plasma, con el fin de mantener la concentración de SN-38 que es un metabolito activo de clorhidrato de irinotecan en el plasma por un tiempo prolongado. En vista de tales circunstancias, un objeto de la presente invención es el de proveer, como formulación que tiene una cantidad de encapsulación de fármacos suficientes para efectos clínicos, una formulación de irinotecan capaz de contener irinotecan y/o una sal del mismo en una vesícula cerrada en una elevada eficiencia de encapsulación de por lo menos 0.07 (fármaco (mol)/lípido total (mol)) y de mantener la concentración de SN-38 que es un metabolito activo del clorhidrato de irinotecan en el plasma por un período de tiempo prolongado.

Medios para Resolver los Problemas En la presente invención se han llevado a cabo extensos estudios para alcanzar los objetivos antes descritos. Como resultado, se han efectuado los siguientes descubrimientos: cuando el método de carga remota basado en un gradiente iónico está particularmente seleccionado como método de encapsulación de fármacos para irinotecan y/o una sal del mismo en una vesícula cerrada (se forma un gradiente iónico en el interior/exterior, de la vesícula cerrada, y el fármaco se deja penetrar a través de la membrana de la vesícula cerrada para introducir el fármaco) , el fármaco puede ser encapsulado a una concentración elevada, que rara vez se logra con el método de carga pasiva convencional, y la capacidad de retención en la sangre mejora drásticamente en comparación con un liposoma, preparado con un método convencional, con el resultado de que la concentración de 7-etil-10-hidroxi camptotecina (SN-38) (que es un metabolito activo del clorhidrato de irinotecan) en el plasma, puede mantenerse constante por un período de tiempo prolongado. Sin embargo, se hicieron los siguientes descubrimientos: cuando se selecciona el método de carga remota, la estabilidad de la formulación a 37 °C y la estabilidad de la formulación a largo término a 4°C, puede mejorar enormemente. Por lo tanto, se ha confirmado que puede obtenerse una formulación que incluya una vesícula cerrada en la cual este encerrado irinotecan con una eficiencia de encapsulación de 0.07 (fármaco (mol) /lípidos totales (mol)), que es una cantidad de encapsulación de fármacos suficientes para un efectos clínico. No se ha informado sobre una formulación que incluya una vesícula cerrada en la cual el irinotecan y/o una sal del mismo esté encerrada a dicha concentración y que pueda mantener la concentración de SN-38 (que es un metabolito activo del clorhidrato de irinotecan) en el plasma, por un período de tiempo prolongado. Por consiguiente, para lograr los objetivos antes descritos, la presente invención provee lo siguiente. (1) Una formulación de irinotecan que incluye una vesícula cerrada formada por una membrana lípida, en la cual el irinotecan y/o un sal del mismo está encerrada en una concentración de por lo menos 0.07 mol/mol (mol de fármaco/mol de lípido total de la membrana) . En un aspecto preferible, una formulación de irinotecan incorpora el fármaco en una concentración más elevada que por lo menos 0.1 mol de fármaco/mol de lípido. El tamaño de partícula promedio de una formulación de irinotecan de la presente invención es preferiblemente de 0.02 a 250 µm. En la presente invención, el irinotecan y/o una sal del mismo, pueden encapsularse en una vesícula cerrada en una concentración elevada mediante por ejemplo el siguiente método de carga remota usando un gradiente iónico. (2) La formulación de irinotecan de acuerdo con el artículo (1) , donde la formulación de irinotecan tiene un gradiente iónico entre la fase acuosa interna y la fase acuosa externa de la vesícula cerrada. Mediante el uso del gradiente iónico descrito, el irinotecan y/o una sal del mismo puede incorporarse a la vesícula cerrada en un estado de ionización en la concentración (3) La formulación de irinotecan de acuerdo con el ítem (2) , donde el gradiente iónico es un gradiente de concentración protónica que tiene un gradiente de pH donde el valor de pH de la fase acuosa interna es inferior a un valor de pH de la fase acuosa externa. (4) La formulación de irinotecan de acuerdo con el ítem (3) , donde el gradiente de pH se forma mediante un gradiente de concentración de un ion amonio y/o un gradiente de concentración de un compuesto orgánico que tiene un grupo amino capaz de ser protonado. Por ejemplo, en el caso en el cual la concentración de ion amonio en la fase acuosa interna es más elevada que la de la fase acuosa externa, puede formarse un gradiente de pH en el cual el valor de pH de la fase acuosa interna es inferior al valor de pH de la fase acuosa externa. (5) La formulación de irinotecan de acuerdo con cualquiera de los ítems (1) a (4) , donde la vesícula cerrada es un liposoma formado por una membrana de una capa de lípidos que contiene un fosfolípido como componente de membrana principal . En el ítem (5) anterior, preferiblemente es un aspecto en el que el componente de membrana principal es un fosfolípido que tiene una temperatura de transición de fase de 50°C o mas. Ejemplos específicos preferibles del fosfolípido incluyen un fosfolípido hidrogenado y/o un esfingofosfolípido . (6) El liposoma puede contener adicionalmente un lípido distinto del fosfolípido y/o un agente modificador de superficie. Como el otro lípido, es preferible colesterol. Los ejemplos preferibles del agente modificador de superficie incluyen un derivado polimérico hidrofílico. Ejemplos específicos del polímero hidrofílico incluyen un polietilenglicol que tiene un peso molecular de 500 a 10,000 daltons, que puede ser introducido como fosfolípido o derivado colesterol. (7) La formulación de irinotecan de acuerdo con el ítem (6) , donde únicamente la superficie extrema del liposoma está preferiblemente modificada con un polímero hidrofílico en un aspecto en el cual el derivado polimérico hidrofílico está contenido como agente modificador de superficie. (8) Un aspecto en el cual la formulación de irinotecan de acuerdo con el ítem (6) o (7) contiene un compuesto que tiene un grupo funcional básico como agente modificador de superficie, también es preferible. Ejemplos particularmente preferibles del compuesto que tienen un grupo funcional básico incluyen sal de clorhidrato de 3 , 5-dipentadeciloxibenzamidina . (9) Una composición farmacéutica que incluye la formulación de irinotecan de acuerdo con cualquiera de los ítems (1) a (8) . (10) Un método profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad, que incluye administrar una cantidad profiláctica y/o terapéuticamente eficaz de la formulación de irinotecan de acuerdo con cualquiera de los ítems (1) a (8) a un huésped. (11) Un método para liberar una cantidad eficaz de irinotecan y/o una sal del mismo en un huésped, que incluye administrar la formulación de irinotecan de acuerdo con uno cualquiera de los ítems (1) a (8) al huésped. (12) Un método para exponer una cantidad eficaz de irinotecan y/o una sal del mismo a un sitio objetivo, que incluye administrar la formulación de irinotecan de acuerdo con cualquiera de los ítems (1) a (8) al huésped.

Efectos de la Invención Una formulación de irinotecan para ser provista en la presente invención comprende irinotecan y/o una sal del mismo en una cantidad encapsulada de por lo menos 0.07 (fármaco (mol) /lípidos totales (mol)) e incluye el fármaco en una concentración elevada suficiente para un efecto clínico.

Tal como se describió en los ejemplos siguientes, una formulación de irinotecan de la presente invención mejora drásticamente a la capacidad de retención en la sangre, en comparación con una formulación de liposoma de irinotecan convencionalmente conocida, de manera que puede existir en la sangre por un período de tiempo prolongado. Además, la formulación tiene una estabilidad de formulación drásticamente mejorada a 37°C y una estabilidad de formulación a largo término a 4°C.

Breve Descripción de los Dibujos [Figura 1] Esta es una gráfica que muestra los resultados (régimen de liberación) de un ensayo de estabilidad acelerada de la formulación a 37°C para la formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 1. [Figura 2] Esta es una gráfica que muestra los resultados (régimen de liberación) de un ensayo de estabilidad acelerada de la formulación a 37°C para la formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 3. [Figura 3] Esta es una gráfica que muestra los resultados (tamaño de partícula) de un ensayo de estabilidad acelerada de la formulación a 37°C para la formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 3. [Figura 4] Esta es una gráfica que muestra las concentraciones de clorhidrato de irinotecan en el plasma en cada tiempo de extracción de sangre después de inyección en un ensayo sobre la capacidad de retención en la sangre. [Figura 5] Esta es una gráfica que muestra la relación entre el valor de pH de una fase acuosa externa y la eficiencia de encapsulación de CPT-11 (%) o la relación existente en la forma circular abierta (%) . [Figura 6] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 8 de la presente invención mediante el cambio del volumen presunto del tumor a lo largo del tiempo. [Figura 7] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 8 de la presente invención mediante el cambio de peso corporal del ratón. [Figura 8] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración total de CPT- 11 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético en el Ejemplo 8. [Figura 9] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de CPT-11 liberado por liposomas en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 8. [Figura 10] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 8. [Figura 11] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38G en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 8. [Figura 12] Esta es una gráfica que muestra la hemotoxicidad (linfocitos) de la preparación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 8. [Figura 13] Esta es una gráfica que muestra la hemotoxicidad (neutrófilos) de la preparación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 8. [Figura 14] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 9 mediante el cambio del volumen presunto del tumor a lo largo del tiempo. [Figura 15] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 9 mediante el cambio de peso corporal del ratón. [Figura 16] Esta es una gráfica que muestra a la transición de la concentración total de CPT-11 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 9. [Figura 17] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de CPT- 11 liberado por liposomas en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 9. [Figura 18] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 9. [Figura 19] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38G en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 9. [Figura 20] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT-11 mediante el cambio del volumen presunto del tumor a lo largo del tiempo en el Ejemplo 10. [Figura 21] - Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT- 11 mediante el cambio de peso corporal del ratón en el Ejemplo 10. [Figura 22] - Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de CPT- 11 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 10. [Figura 23 - Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38 en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 10. [Figura 24] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38G en el plasma de la sangre en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 10. [Figura 25] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de CPT- 11 en tumores en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 10. [Figura 26] Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38 en tumores en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT- 11 en el Ejemplo 10. [Figura 27] - Esta es una gráfica que muestra la transición de la concentración de SN-38G en tumores en un experimento farmacocinético de la preparación de CPT-11 en el Ejemplo 10. [Figura 28] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT-11 mediante el cambio del volumen presunto del tumor a lo largo del tiempo en el Ejemplo 12. [Figura 29] Esta es una gráfica que muestra el efecto antitumoral de la preparación de CPT-11 mediante el cambio de peso corporal del ratón en el Ejemplo 12.

Mejor Modo de Llevar a Cabo la Invención A continuación, la presente invención se describirá en forma más detallada. El irinotecan es un compuesto que tiene un esqueleto de camptotecina y está representado por el nombre químico de (+) - (4S) -4, ll-dietil-4-hidroxi-9- [ (4-piperidino-piperidino) carboniloxi] -lH-pirano [3 ' , 4 ' : 6 , 7] indolizino [1,2-b] quinolin-3 , 14 (4H, 12H) -diona. El irinotecan y/o una sal del mismo es un agente antineoplásico y es una sustancia soluble en agua usada como sal de clorhidrato (irinotecan'HCl clorhidrato) tal como se muestra a continuación. En la presente memoria, el término "irinotecan y/o una sal del mismo" se menciona algunas veces como "irinotecan" o "fármaco" . Aunque, el término "sal de clorhidrato de La presente invención provee una formulación de irinotecan que incluye una vesícula (portador) cerrada, formada por una membrana de lípido, donde el irinotecan y/o una sal del mismo antes descritos están encerrados con una elevada eficiencia de encapsulación de 0.07 mol/mol (de fármaco mol/de lípido total de la membrana) o más. La vesícula cerrada no está particularmente limitada y puede tener varias formas con la condición de que tenga una estructura capaz de contener un fármaco. Puede emplearse un liposoma, una microesfera lípida, una monopartícula o similares, que tengan una función potencial capaz de encapsular el fármaco en la misma en una concentración elevada. Entre éstos, un ejemplo de una forma particularmente preferida es el liposoma. A continuación, se efectuará una descripción tomando como ejemplo un aspecto en el cual un portador de una formulación de irinotecan de la presente invención es un liposoma particularmente preferido. Un liposoma está compuesto por una membrana de una bicapa de fosfolípidos y es una vesícula cerrada que tiene una estructura que forma un espacio separado del área externa a través de la membrana que se forma en base a caracteres polares de grupos hidrofóbicos y grupo hidrofílicos del lípido, y una fase acuosa (fase acuosa interna) incluida en el espacio de la vesícula. Se forma una formulación de liposoma usando el liposoma que incorpora una droga como un portador. El "fosfolípido" es un componente principal de una biomembrana y es una sustancia antipática, y la molécula tiene un grupo hidrofóbico compuesto por un grupo alquilo de cadena larga y un grupo hidrofílico compuesto por un grupo fosfato. Ejemplos del fosfolípido incluyen fosfatidilcolina (=lecitina) , fosfatidilglicerol ácido fosfatídico, fosfatidil etanolamina, fosfatidilcerina, fosfatidilinositol, y un esfingofosfolípido tal como esfingomielina, un fosfolípido natural o sintético tal como una cardiolipina o un derivado de los mismos y un compuesto que ha sido hidrogenado de acuerdo con un método convencional . A continuación el término "fosfolípido" se denominará algunas veces fosfolípidos para abarcar los mismos. Entre aquellos se prefiere un fosfolípido hidrogenado tal como fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) , esfingomielina (SM) , y similares. Como componente de membrana principal, puede contener una especie única de fosfolípido o varias especies de fosfolípidos.

En un liposoma, se usa preferiblemente como componente principal de membrana un fosfolípido que tenga una temperatura de transición de fase más elevada que la temperatura del cuerpo (35 a 37°C) , para que no pierda fácilmente un fármaco encapsulado durante un período de almacenamiento, o en un cuerpo tal como sangre. Además, en el caso de manufacturar dicho liposoma, este es algunas veces expuesto a una temperatura más elevada que la temperatura del cuerpo. Es decir, el liposoma se manufactura algunas veces bajo una condición de temperatura de aproximadamente 50 a 70°C, por ejemplo aproximadamente 60°C, y el efecto del calor sobre la formación del liposoma aumenta, de manera que preferiblemente se usará un componente principal de membrana que tenga una temperatura de transición de fase más elevada que aquellas temperaturas. Específicamente, el material de membrana principal es preferiblemente un fosfolípido que tiene un punto de transición de fase de 50°C o más. El liposoma puede contener otro componente de la membrana conjuntamente con el componente principal de membrana antes descrito. Por ejemplo, se prefiere que un liposoma contenga un lípido distinto de un fosfolípido o un derivado del mismo (a continuación, denominado algunas veces otros lípidos) , y que la membrana se forme de un lípido mixto conjuntamente con el fosfolípido antes descrito.

El término "lípido distinto de un fosfolípido" significa un lípido que tiene un grupo hidrofóbico compuesto por un grupo alquilo de cadena larga o similares en su molécula y que no contenga ningún grupo fosfato en su molécula. Ejemplos del mismo incluyen, pero no están particularmente limitados a, gliceroglicolípidos, esfingoglicolípidos, y esteróles tales como colesterol (descrito a continuación como un agente estabilizador) , y un derivado del mismo tal como un producto hidrogenado. Ejemplos del derivado de colesterol incluyen esteróles donde cada uno tiene un anillo ciclopentanhidrofenantreno, y entre los ejemplos específicos del mismo se incluyen, pero no están particularmente limitados a, colesterol. El lípido mixto puede contener una especie sola o varias especies de los otros lípidos. La velocidad de liberación de la formulación de irinotecan en el plasma puede regularse mediante la cantidad de colesterol. Para disminuir la velocidad de liberación a un nivel bajo, la formulación contiene colesterol en una proporción de 0 a 20% en moles mientras que para aumentar la velocidad de liberación a un nivel alto, la formulación contiene colesterol en una proporción de 30 a 50 % en moles preferiblemente 40 a 50 % en moles. Un liposoma en la presente invención puede mantener la estructura de membrana anteriormente descrita junto con el lípido formador de membrana antes descrita y puede contener otros componentes de membrana capaces de ser contenidos en el liposoma sin apartarse de los objetos de la presente invención. Ejemplos de los otros componentes de membrana incluyen un agente modificador de superficie para proveer una característica propuesta para un componente de membrana portadora mediante el cambio de una propiedad física del lípido. Ejemplos del agente modificador de superficie incluyen, pero no están particularmente limitados a, una sustancia cargada como un derivado de un polímero hidrofílico, un derivado de un polisacárido soluble en agua y similares . Ejemplos de las sustancias cargadas incluyen, pero no están particularmente limitadas a, un compuesto que tiene un grupo funcional básico tal como un grupo amino, un grupo amidinio o un grupo guanidino; un compuesto que tiene un grupo funcional ácido; y similares. Ejemplos del compuesto básico incluyen DOTMA descrito en JP 61-161246 A, un DOTAP descrito en JP 05-508626 A, un transfectam descrito en JP 02-292246 A, TMAG descrito en JP 04-108391 A, sal de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina descrito en la WO 97/42166, y similares, DOSPA, TfxTM-50, DDAB, DC-CHOL, y DMRIE. Ejemplos del compuesto que tiene el grupo funcional ácido incluyen: un ácido graso tal como un ácido oleico; ácido esteárico; gangliosidas que tienen un ácido siálico tal como gangliosida GM1 y gangliosida GM3 ; un surfactante ácido a base de amino ácido tal como N-acil-L glutamina, y similares . En el caso de que la sustancia cargada antes descrita sea una sustancia que incluye un compuesto que tiene un grupo funcional básico unido a un lípido, se denominará un lípido cationizado. La porción lípida del lípido cationizado es estabilizada en una bicapa de lípidos de un liposoma, y la porción del grupo funcional básico puede existir sobre la superficie de la membrana de la bicapa del lípido del portador (en la superficie externa de la membrana y/o en la superficie interna de la membrana) . La modificación de la membrana con un lípido cationizado permite mejorar la capacidad de adhesión o similares entre la membrana de liposomas y las células. Ejemplos de polisacáridos solubles en agua incluyen pero están particularmente limitados a polisacáridos solubles en agua tales como ácido glucorónido, ácido siálico, dextrano, pululan, amilosa, amilpectina, quitosan, manan, ciclodextrina, pectina, y carragenina. Un ejemplo de un derivado polisacárido soluble en agua incluye un glicolípido o similares. Ejemplos de polímeros hidrofílicos incluyen pero no están particularmente limitados a polietilenglicol, Ficoll, alcohol polivinílico, un copolímero alternado de estirena-anhídrido maleico, un copolímero alternado de éter-anhídrido maleico, polivinil pirrolidona, éter polivinil metílico, polivinil metil oxazolina, polietil oxazolina, polihidroxipropil oxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polidimetil acrilamida, metacrilato de polihidroxipropilo, acrilato de polihidroxietilo, hidroximetil celulosa, hidroxietil celulosa, poliasparto amida, y poliamino ácido sintético. El polímero hidrofílico preferiblemente tiene una estructura para modificar un liposoma. En particular, un extremo de la cadena polimérica tiene preferiblemente la estructura. Es decir, se prefiere que el polímero hidrofílico que se usa para la modificación, incluya una porción de cuerpo principal del polímero hidrofílico y una porción estructural para modificar un liposoma. En caso de que la estructura sea una porción hidrofóbica tal como un lípido, la porción de cuerpo principal del polímero hidrofílico se fija de manera de proyectarse desde la superficie externa del liposoma de modo que la porción hidrofóbica quede insertada en la membrana del liposoma, mientras que en el caso en el que la estructura sea un grupo funcional reactivo capaz de unirse covalentemente a un componente de membrana del liposoma, la porción del cuerpo principal del polímero hidrofílico se fija de manera que se proyecte desde la superficie externa del liposoma mediante un enlace covalente a un componente de la membrana de liposomas tal como un fosfolípido expuesto en la superficie externa del liposoma. A continuación, se describirá un compuesto hidrofóbico para usarlo en la formación de un compuesto polimérico hidrofóbico de polímero hidrofílico, mediante un enlace a una porción de cuerpo principal de un polímero hidrofílico. El compuesto hidrofóbico no está particularmente limitado. Ejemplos del mismo incluyen un compuesto que tiene una región hidrofóbica (compuesto hidrofóbico) . Ejemplos del compuesto hidrofóbico incluyen: un fosfolípido y otro lípido tal como un esterol que forman un lípido mixto descrito a continuación; un alcohol alifático de cadena larga; un éster de ácido graso de glicerina; y similares. Entre éstos, un fosfolípido es un aspecto preferible. Además, el compuesto hidrofóbico puede tener un grupo funcional reactivo. Un enlace formado mediante el grupo funcional reactivo es convenientemente un enlace covalente, y un ejemplo específico del mismo incluye pero no está particularmente limitado a un enlace amida, un enlace éster, un enlace éter, un enlace sulfuro o un enlace disulfuro. Una cadena de acilo incluida en el fosfolípido es conveniente un ácido graso saturado. La longitud de cadena de la cadena acilo es convenientemente Ci4 a C20, más convenientemente C16 a C?8. Ejemplos de la cadena acilo incluyen dipalmitoílo, diestearoílo y palmitoilestearoílo . Un fosfolípido no está particularmente limitado. Por ejemplo, como fosfolípido, puede usarse uno que tenga un grupo funcional capaz de reaccionar con el polímero hidrofílico. Ejemplos específicos de dichos fosfolípidos que tienen un grupo funcional capaz de reaccionar con un polímero hidrofílico incluyen fosfatidil etanolamina que tiene grupos amino, fosfatidilglicerol que tiene grupos hidroxi y fosfatidilserina que tiene grupos carboxi. Es un aspecto preferible usar la fosfatidil etanolamina antes descrita. Un derivado polímero hidrofílico-lípido está compuesto por el polímero hidrofílico y el lípido antes descritos. La combinación del polímero hidrofílico y el lípido antes descritos no están particularmente limitada. Dependiendo del propósito, puede emplearse una combinación apropiada. Ejemplos de la misma incluyen un derivado polimérico hidrofílico formado por la unión de por lo menos un miembro seleccionado de un fosfolípido, otros lípidos tales como esterol, alcohol alifático de cadena larga, y éster de ácido graso de glicerina, con por lo menos un miembro seleccionado de PEG, PG y PPG. Ejemplos específicos del mismo incluyen un polioxipropileno alquilo, en particular, es un aspecto preferible que en el caso en el que el polímero hidrofílico es polietilenglicol (PEG) , se seleccione un fosfolípido o un colesterol como lípido. Ejemplos de un derivado PEG-lípido formado por dicha combinación incluyen un derivado PEG-fosfolípido o un derivado PEG-colesterol. Para el derivado polímero hidrofílico-lípido, puede seleccionarse un derivado cargado positivamente, negativamente o neutralmente, mediante la selección del lípido. Por ejemplo, en el caso en el cual DSPE es seleccionado como lípido, el derivado lípido exhibe una carga negativa mediante el efecto de los grupos fosfato, mientras que en el caso en el que el colesterol es seleccionado como lípido, el derivado lípido exhibe una carga neutra. El lípido puede seleccionarse dependiendo del propósito. El peso molecular de PEG no está particularmente limitado. En general el peso molecular de PEG es de 500 a 10,000 daltons preferiblemente 1,000 a 7,000 daltons, y más preferiblemente 2,000 a 5,000 daltons. El peso molecular de PG no está particularmente limitado. En general el peso molecular de PG es 100 a 10.000 daltons, preferiblemente 200 a 7,000 daltons, y más preferiblemente 400 a 5,000 daltons. El peso molecular de PPG no está particularmente limitado. En general el peso molecular de PPG es 100 a 10,000 daltons preferiblemente 200 a 7,000 daltons y más preferiblemente 1,000 a 5,000 daltons.

Entre éstos, un aspecto preferible es un derivado PEG-fosfolípido. Ejemplos del derivado PEG-fosfolípido incluyen polietilenglicol-deasteroil-fosftidil etanolamina (PEG-DSPE) . El PEG-DSPE es preferible debido a que es un compuesto para propósitos generales y es fácilmente obtenible . El polímero hidrofílico antes descrito puede usarse solo o pueden usarse dos o más de los polímeros en combinación. Dicho derivado polímero hidrofílico-lípido puede manufacturarse mediante un método convencionalmente conocido. Ejemplos de un método para sintetizar un derivado PEG-fosfolípido que es un ejemplo del derivado polímero hidrofílico-lípido incluyen un método para la reacción de PEG con un fosfolípido que tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con PEG, usando un catalizador. Ejemplos del catalizador incluyen cloruro cianúrico, carbodiimida, anhídrido ácido y glutaraldehído . El grupo funcional antes descrito está unido covalentemente a PEG mediante dicha reacción, para proporcionar de esta manera un derivado PEG-fosfolípido . En un liposoma que ha sido sometido a una modificación de superficie mediante el uso de un derivado de polímero hidrofílico-lípido cuando se previene la absorción de una proteína oxonina o similares en el plasma en la superficie del liposoma, se mejora la estabilidad del liposoma en la sangre, puede evitarse la captura mediante RES, y puede mejorar la capacidad de liberación del fármaco a un tejido o célula que constituyen el objetivo de la liberación del fármaco. La relación modificada de un lípido de membrana (lípido total) mediante el derivado polímero hidrofílico-lípido antes descrito, se efectúa de manera que el régimen al lípido de la membrana será de generalmente 0.1 a 20 % en moles, preferiblemente 0.1 a 5% en moles, más preferiblemente 0.5 a 5 % en moles. Cabe observar que en la presente invención, el término "lípidos totales" significa los lípidos totales que forman una membrana, distintos del derivado polímero hidrofílico-lípido. Específicamente, se incluyen fosfolípidos y otros lípidos (incluyendo colesterol) , se incluye adicionalmente un agente modificador de superficie en el caso en el que se incluye un agente modificador de superficie distinto del derivado polímero hidrofílico-lípido, pero no se incluye un fosfolípido tal como una fosfatidil etanolamina (PE) o colesterol, que están incluidos en el derivado polímero hidrofílico-lípido. En la presente invención, la modificación de la membrana del liposoma mediante el derivado polímero hidrofílico-lípido (PEG-PE) antes descrito puede efectuarse mediante la distribución de un polímero hidrofílico (PEG) tanto en el interior como en el exterior de la bicapa de membrana del lípido, o mediante distribución selectiva en la membrana exterior. Específicamente, en la preparación de una formulación de liposoma descrita a continuación, el liposoma puede formarse después de mezclar un lípido formador de liposoma y PEG-PE uniformemente (pre-introducción) . El PEG-PE puede introducirse después de formar el liposoma mediante un método convencional usando un lípido mixto obtenido por mezcla de los lípidos formadores de liposomas que no contienen PEG-PE (post-introducción) , pero es particularmente preferible un liposoma formado mediante la modificación selectiva de superficie de únicamente la capa externa de la membrana de bicapa de lípidos, por modificación de la superficie de la membrana con un polímero hidrofílico desde la parte exterior después de formar un liposoma no modificado compuesto por la bicapa de lípidos (post-introducción) . En este caso, cuando se usa un derivado polímero hidrofílico-lípido como agente modificador para introducir un polímero hidrofílico, la porción polimérica hidrofílica se mantiene en un estado que se proyecta hacia la parte exterior, y la porción lípida, que es una porción hidrofóbica, se mantiene en un estado estable mediante la entrada de la membrana de bicapa de lípidos del liposoma, de manera que puede formarse un liposoma que tiene la superficie externa de la capa de la bicapa de lípidos sobre la cual hay una unión de polímero hidrofílico al lípido y se distribuye. Después de la etapa de formación de liposoma, ocurre una desestabilización tal como una agregación en el liposoma que depende de la temperatura o del tiempo. Dicha desestabilización es diferente según la composición del lípido del liposoma, de modo que se sabe que la temperatura o el tiempo son diferentes de acuerdo a la composición del lípido. Para evitar la desestabilización que es diferente de acuerdo con la composición del lípido, es conveniente establecer una etapa de modificación del polímero hidrofílico después de la etapa de formación del liposoma. El momento de agregar un polímero hidrofílico en una etapa de adición de polímero hidrofílico, es convenientemente cerca de inmediatamente después de la etapa de formación del liposoma. Específicamente, el tiempo está comprendido preferiblemente dentro de 180 minutos porque el efecto del calor sobre los componentes de la membrana o las sustancias encerradas es pequeño. El tiempo está preferiblemente comprendido dentro los 120 minutos, más preferiblemente dentro de los 45 minutos, más convenientemente inmediatamente después de la etapa de formación del liposoma. Más específicamente, después de la etapa de formación del liposoma, el dispersante de liposoma puede verterse directamente a una solución polimérica hidrofílica. Mientras tanto, puede adoptarse un método de adición de una solución polimérica hidrofílica al dispersante liposoma después de la etapa de formación del liposoma. Además puede adoptarse también un método para decantar el dispersante liposoma y la solución polimérica hidrofílica simultáneamente en otro contenedor para la mezcla. En este caso, desde el punto de vista de la uniformidad de concentración y uniformidad de temperatura, es conveniente agregar una etapa de agitación mediante un dispositivo agitador o similar. Después de la adición de un polímero hidrofílico en una etapa de modificación del polímero hidrofílico, la mezcla se agita convenientemente con calentamiento por un período de tiempo predeterminado a una temperatura de transición de fase o superior. El tiempo de la agitación con calentamiento es de 0 a 120 minutos, preferiblemente de 0 a 60 minutos, y más preferiblemente de 0 a 45 minutos. Contrariamente a los métodos antes descritos, un liposoma que contiene un lípido formador de membrana tal como un fosfolípido que tiene un grupo funcional reactivo es manufacturado por un método convencional, y luego se agrega un PEG de extremo activado al líquido externo del liposoma para unirlo a un lípido formador de membrana tal como un fosfolípido que tiene el grupo funcional para manufacturar de esta manera un liposoma.

A diferencia de los métodos antes descritos, los componentes antes descritos se mezclan, y la mezcla se descarga a una presión elevada mediante un emulsionador de tipo de descarga de alta presión, para proporcionar un liposoma. Este método ha sido específicamente descrito en "Liposome in Life Science" (Terada, Yoshimura, et al.; Springer-Verlag Tokio (1992)), que se incorpora aquí como referencia. En el caso anteriormente descrito, para dimensionar el liposoma hasta un tamaño predeterminado, se encuentran disponibles ciertas técnicas (editado por G. Gregoriadis "Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques" 2nd edición, Vol. I-III, CRC Press), que se incorpora aquí como referencia. Como estructura de membrana de lípidos de un liposoma, se conocen estructuras de membrana tales como vesículas unilaminares (pequeña vesícula unilaminar (SUV) o vesículas unilaminares grandes (LUV) ) , capa de lípidos y una vesícula multilaminar (MLV) que incluye una pluralidad de capas de lípidos. Aunque un liposoma de acuerdo con la presente invención puede estar compuesto por cualquier estructura de membrana, preferiblemente es un liposoma compuesto por una vesícula unilaminar, y específicamente es preferible un liposoma LUV.

Un dispersante liposoma puede formarse en una forma unilaminar haciéndolo pasar forzosamente a través de un filtro varias veces usando un extrusor. En general, se usan dos o más especies de filtros que tienen diferentes tamaños de poros (un filtro que tiene un tamaño de poro más grande que un tamaño de poro predeterminado y un filtro para obtener finalmente un tamaño de poro predeterminado) . Cuantas más veces pasan por filtros que tienen diferentes tamaños de poros usando un extrusor, más alto será el régimen de formación unilaminar, de modo que el producto resultante se considerará como un liposoma prácticamente compuesto por una vesícula unilaminar. El liposoma prácticamente compuesto por una vesícula unilaminar específicamente significa un liposoma que tiene una vesícula unilaminar en la que el régimen de vesícula unilaminar para todos los portadores (vesículas) que forman la formulación de liposoma puede ser de 50% o más, preferiblemente 80% o más. En el liposoma anteriormente descrito, las cadenas del polímero hidrofílico en su superficie externa están distribuidas hacia la parte exterior del liposoma, mientras que la superficie lateral a la fase acuosa interna de la capa interna de la bicapa de lípidos no está modificada, de modo que las cadenas del polímero hidrofílico no están sustancialmente distribuidas en la fase acuosa interna. En el caso de un liposoma que tiene la estructura de distribución, la estabilidad de la membrana puede mantenerse en comparación con un liposoma que tiene los polímeros hidrofílicos distribuidos en ambos lados de las capas interna y externa de la membrana de bicapa incluso si el valor de pH de la fase acuosa interna es bajo. Además, puede obtenerse un efecto de estabilidad en la sangre incluso si la cantidad total de polímeros hidrofílicos es pequeña en comparación con un liposoma que tiene los polímeros distribuidos en ambos lados de las capas interna y externa de la membrana de bicapa. Cabe observar que el término "capacidad de retención en la sangre" se refiere a una propiedad que significa que un fármaco encerrado en un portador está presente en la sangre. Cuando el fármaco es liberado del portador, desaparece rápidamente el fármaco de la sangre y afecta un sitio expuesto al fármaco. Puede administrarse un fármaco que tiene excelente capacidad de retención en la sangre, a una dosis más pequeña. Un portador de la presente invención puede estar en forma de una esfera o en una forma similar. El tamaño de partícula del mismo no está particularmente limitado pero es de 0.02 a 250 µm, preferiblemente de 0.03 a 0.4 µm, más preferiblemente de 0.05 a 0.2 µm. El diámetro exterior de la partícula es un valor promedio del diámetro de todas las partículas de una formulación de liposoma, que se determina por el método dinámico de dispersión de luz. Específicamente, la determinación puede llevarse a cabo usando Zetasizer (Malven Instruments 3000HS o S ZEM 5002) . Una formulación de irinotecan de la presente invención puede contener adicionalmente un estabilizador y/o antioxidante farmacéuticamente aceptables dependiendo de su vía de administración. Ejemplos del estabilizador incluyen, pero no están particularmente limitados a, sacáridos tales como glicerol y sucrosa. Ejemplos del antioxidante incluyen, pero no están particularmente limitados a, ácido ascórbico, ácido úrico, homólogos de tocoferol (por ejemplo, vitamina E) y similares. Existen cuatro isómeros de tocoferol (a, ß, ? y d) , todos los cuales pueden usarse en la presente invención. La formulación de irinotecan puede contener adicionalmente un aditivo farmacéuticamente aceptable dependiendo de su vía de administración. Ejemplos del aditivo incluyen agua, solución salina fisiológica, solvente orgánico farmacéuticamente aceptable, colágeno, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, polímero carboxivinílico, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, almidón de sodio carboximetilo, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantano, goma acacia, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, petrolato, parafina, alcohol esteárico, ácido esteárico, albúmina de suero humano (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, PBS, un polímero biodegradable, un medio libre de suero, un surfactante aceptable como aditivo farmacéutico, un buffer de pH fisiológico aceptable en un cuerpo vivo, o similares. El aditivo que se usa no está limitado, pero puede seleccionarse entre los aditivos anteriormente descritos dependiendo de su forma de dosificación en forma apropiada o en combinación con otro aditivo. En la presente invención, puede proveerse como composición farmacéutica una formulación de irinotecan que contiene dichos aditivos. Una composición farmacéutica de la presente invención puede almacenarse mediante un método general, por ejemplo, en un refrigerador a una temperatura de 0 a 8°C o a temperatura ambiente de 1 a 30°C. En la presente invención, un liposoma tiene una forma que encierra CPT-11. Se sabe que un anillo de a-hidroxi lactona en el CPT-11 se hidrolizará a un rango de pH superior a la condición neutra. Por lo tanto, en el liposoma de la presente invención, la fase acuosa interna del liposoma es necesaria para mantener un pH ácido para suprimir la hidrólisis del anillo a-hidroxi lactona independientemente de si se toma el CPT-11 en la bicapa de lípidos o en la fase acuosa interna . Se sabe que generalmente un lípido se hidroliza dependiendo de la temperatura o el valor del pH. En particular, se sabe que los carboxilatoésteres de ácido graso en las posiciones sn-1 y sn-2 son fácilmente hidrolizadas y descompuestas hasta un lisolípido y un ácido graso (Grit et al., Chem. Phys. Lipids 64, 3-18, 1993). Dichos productos descompuestos alteran la composición convencional de la membrana del lípido, y aumenta la permeabilidad de la membrana del lípido, lo cual da como resultado un deterioro de la estabilidad del liposoma. Por lo tanto, cuando la fase acuosa interna se mantiene acida, el pH en la fase acuosa externa es convenientemente aproximadamente neutral desde el punto de vista de la estabilidad del lípido. Una situación en la que estas dos condiciones contrarias están más severamente restringidas es la etapa de introducción de un fármaco. En la etapa de introducción del fármaco, es necesario calentar la mezcla hasta por lo menos una temperatura de transición de fase de la membrana del lípido, que promueve significativamente la hidrólisis del lípido. Con el fin de suprimir la hidrólisis del lípido, es conveniente establecer el pH en la fase acuosa externa hasta aproximadamente neutralidad. Sin embargo, cuando el pH de la fase acuosa externa se fija hasta aproximadamente neutralidad, se promueve la hidrólisis de un anillo de a-hidroxi lactona en CPT-11. En vista de estas dos condiciones contrarias, el valor del pH en la fase acuosa externa en la etapa de introducción del fármaco, es preferiblemente de 4.0 a 8.0, más preferiblemente de 4.0 a 7.0, y más preferiblemente de 5.0 a 7.0. Para completar una formulación de irinotecan altamente incorporada de acuerdo con la presente invención, se forma un liposoma portador, y luego se lleva a cabo un método denominado método de carga remota para introducir el fármaco usando un gradiente iónico interior/exterior de la membrana del liposoma. El método de carga remota puede usarse para un fármaco común capaz de existir en un estado de carga en el caso en el cual el fármaco se disuelve en un medio acuoso apropiado. Cuando se forma un gradiente iónico interno/externo del liposoma, el fármaco puede encapsularse para penetrar la membrana del liposoma dependiendo del gradiente formado. Ejemplos de un gradiente iónico formado a través de la membrana del liposoma incluyen un gradiente de concentración de Na+/K+. Una técnica para agregar un fármaco a un liposoma previamente formado mediante el método de carga remota para un gradiente de concentración de Na+/K+ se describe en la patente norteamericana 5.077.056 (que se incorpora aquí como referencia) , lo cual puede llevarse a cabo con referencia a la descripción. En la presente invención, preferiblemente los ejemplos del gradiente iónico incluyen un gradiente de concentración de protones, y se ejemplifica un modo de un gradiente de pH formado mediante el establecimiento del valor de pH del interior de la membrana (fase acuosa interna) más bajo que el valor de pH de la parte externa de la membrana (fase acuosa externa) . Específicamente, el gradiente de pH puede formarse en base a un gradiente de concentración de ion amonio y/o un gradiente de concentración de un compuesto orgánico que tiene un grupo amino capaz de ser protonado. Un ejemplo específico de un método de encapsulación de un fármaco (irinotecan o una sal del mismo) en un liposoma usando el gradiente de concentración de ion amonio, se describirá a continuación. En primer lugar, se forma previamente un liposoma en un buffer acuoso que contiene 0.1 a 0.3 M de una sal de amonio, y se intercambia el medio externo por un medio que no contiene iones amonio (por ejemplo, una solución de sucrosa) , para formar de este modo un gradiente de ion amonio en el interior/exterior de la membrana del liposoma. Los iones amonio interiores están equilibrados con amoníaco y protones, y el amoníaco penetra la membrana del lípido y se dispersa para eliminar el amoníaco del interior del liposoma. Con la eliminación de amoníaco, la porción equilibrada en el liposoma pasa a la formación de protones. Como resultado, se acumulan protones en el liposoma, y se forma un gradiente de pH en el interior/exterior del liposoma. Cuando se agrega un fármaco a un dispersante liposoma que tiene dicho gradiente de pH, el fármaco está encerrado en el liposoma.

Una sal de amonio capaz de formar un gradiente de concentración de ion amonio incluye, pero no está particularmente limitada a, sulfato de amonio, hidróxido de amonio, acetato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, citrato de amonio, succinato de amonio, lactobionato de amonio, carbonato de amonio, tartrato de amonio y oxalato de amonio . Cabe observar que una técnica para introducir un fármaco en un liposoma previamente formado mediante el método de carga remota para un gradiente de concentración de ion amonio ha sido descripta en la patente norteamericana 5.192.549 (que se incorpora aquí como referencia), lo cual puede llevarse a cabo con referencia a la descripción. Convenientemente, el compuesto orgánico que tiene un grupo amino capaz de ser protonado tiene bajo peso molecular. Ejemplos específicos del mismo incluyen, pero no están limitados a, metilamina, etilamina, propilamina, dietilamina, etilendiamina y similares. En la presente invención, un modo apropiado es incorporar el irinotecan o una sal del mismo mediante un método de carga remota usando el gradiente de concentración de ion amonio. Una formulación de irinotecan de la presente invención se forma incorporando el irinotecan o una sal del mismo en el portador anteriormente descrito a una concentración superior a 0.07 mol/mol (mol de fármaco/mol de lípido total de membrana), preferiblemente superior a 0.1 mol/mol . En la presente invención, el término "encerrar" significa un estado en el cual un fármaco está encapsulado en un portador. El término significa también un estado en el cual parte o la totalidad de las moléculas del fármaco están incluidas en una capa de un lípido que es un componente del portador. Un portador de acuerdo con la presente invención es purificado por un método comúnmente usado (tal como filtración de gel, diálisis, separación de membrana o centrifugación) , para remover de esta manera los fármacos que no han quedado descargados en el portador. Se provee un portador después de la etapa de remoción de los fármacos no descargados. Por lo tanto, puede ocurrir un gradiente de concentración de fármaco entre la parte interior y exterior del portador a través de una bicapa de lípidos. Preferiblemente, el portador de la presente invención no contiene ningún fármaco libre fuera de la bicapa de lípidos después de la preparación del portador. Entonces, los fármacos no encerrados en el portador son liberados al área exterior. El portador de la presente invención que tiene fármacos llega hasta el sitio que es el objetivo, con el resultado de que libera los fármacos encerrados al sitio que es el objetivo. La liberación de los fármacos al sitio objetivo puede lograrse tomando fármacos incorporados en el portador, hasta el sitio que es el objetivo, o ejerciendo el efecto de los fármacos en el sitio que es el objetivo o en la vecindad del mismo incluso si los fármacos no han sido tomados en el sitio objetivo. En la presente invención, el término "liberar" significa que un fármaco encerrado en un portador se difunde a la parte exterior de una vesícula cerrada pasando a través de una membrana de lípidos que forman el portador o cambiando parte de la estructura de la membrana del lípido. Cuando se metaboliza el clorhidrato de irinotecan en el plasma dentro de SN-38 que es un metabolito activo y se expone a un sitio objetivo en una elevada concentración por un largo período de tiempo, se exhibe una fuerte actividad antineoplásica, de modo que es importante controlar la liberación. El régimen de liberación de una formulación de irinotecan en el plasma puede controlarse ajustando la cantidad de colesterol, y se espera obtener un efecto preferible mediante el ajuste de la cantidad de colesterol. El término "régimen de liberación" significa un régimen de un fármaco que pasa por exudación a la parte exterior de una vesícula cerrada desde un portador que encapsula los componentes del portador y clorhidrato de irinotecan, a un fármaco incorporado en el portador (relación en peso o relación molar) . La frase "el régimen de liberación es bajo" significa que la cantidad de un fármaco exudado al exterior de una vesícula cerrada por tiempo unitario es pequeña . En la presente invención, el término "sitio objetivo" significa un sitio específico en el cual se libera un fármaco encapsulado en un portador y actúa, y significa una célula, tejido, órgano u órgano interno que está especificado en cada sitio, y un interior del mismo. El sitio objetivo tal como una célula, un tejido, un órgano o el órgano interno, y una parte interior del mismo pueden ser un sitio que es necesario tratar con un fármaco. Cuando el fármaco liberado es expuesto al sitio, ejerce un efecto. Ejemplos del sitio objetivo incluyen, pero no están particularmente limitados a un tumor. Ejemplos de un tumor que es necesario tratar incluyen, pero no está particularmente limitado a un tumor sólido. Ejemplos específicos del mismo incluyen cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de intestino grueso, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de laringe, cáncer de pulmón, cáncer prostático, cáncer de vesícula, cáncer de mama, cáncer uterino y cáncer ovario. El sitio objetivo es una célula tumoral, un tejido, un órgano o el órgano interno, una parte interior del mismo y similares. Por lo tanto, en la presente invención, una enfermedad significa el tumor antes descrito, y se espera que un fármaco ejerciera un efecto antineoplásico en el mismo. En la presente invención, el término "exposición" significa que un fármaco liberado en la parte exterior de un portador actúa sobre el área exterior. Específicamente, cuando un fármaco liberado llega cerca y entra en contacto con el sitio objetivo, el fármaco ejerce su efecto antineoplásico como acción del mismo. Cuando el fármaco actúa sobre el sitio objetivo actúa tópicamente sobre una célula en un ciclo celular en el cual se lleva a cabo una síntesis de ADN, de modo de ejercer un efecto esperado. Para ejercer dicho efecto, debería mantenerse un equilibrio entre el régimen de liberación de un fármaco desde un portador y la capacidad de retención del portador en la sangre. Un portador de la presente invención libera irinotecan y/o una sal del mismo a un régimen de liberación preferido, y el irinotecan liberado y/o la sal del mismo son adicionalmente metabolizados en SN-38 que es un metabolito activo. La presente invención se usa para exponer SN-38 a un sitio objetivo predeterminado por un largo período de tiempo. Por lo tanto, en la presente invención, para evitar y/o tratar una enfermedad sufrida por un huésped, puede efectuarse la administración sistémica o tópica al huésped (paciente) parenteralmente mediante la administración de un portador en el cual una cantidad eficaz de irinotecan y/o una sal del mismo está encerrada para liberar la cantidad eficaz de irinotecan y/o una sal del mismo en el huésped o para exponer una cantidad eficaz de SN-38 a un sitio objetivo en una elevada concentración por un período de tiempo prolongado. Ejemplos del huésped como objetivo de administración incluyen mamíferos, preferiblemente seres humanos, monos, ratones, ganado y similares. Entre los ejemplos de la vía de administración parenteral que deben seleccionarse se incluye inyección intravenosa (i.v.) tal como goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea, y el método de administración puede seleccionarse apropiadamente dependiendo de la edad o síntoma de un paciente. Un portador de la presente invención se administra a un paciente que sufre de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar el síntoma de la enfermedad o para aliviar por lo menos parte del síntoma. Por ejemplo, una dosis eficaz de un fármaco para ser encapsulado en un portador se selecciona dentro de un rango de 0.01 mg hasta 100 mg por kg de peso corporal por día. Sin embargo, la dosis del portador de la presente invención no se limita a la misma. Para el período de administración, la administración puede llevarse a cabo después del inicio de la enfermedad, o puede llevarse a cabo profilácticamente para aliviar el síntoma en el momento de inicio de la enfermedad en el caso de haber sido pronosticado el comienzo de la enfermedad. Además, un período de administración puede seleccionarse apropiadamente dependiendo de la edad o síntoma de un paciente. Ejemplos específicos del método de administración incluyen la administración de una composición farmacéutica usando una jeringa o goteo. Mientras, se inserta un catéter dentro de un cuerpo (por ejemplo, lumen o vaso) de un paciente o un huésped para guiar su borde alrededor del sitio objetivo, y la composición puede administrarse a través del catéter desde un sitio objetivo predeterminado o desde la vecindad del sitio o un sitio en el cual se espera que fluya la sangre hacia el sitio objetivo. Tal como se describió en los Ejemplos, cuando el régimen de liberación de un fármaco encerrado en un portador de la presente invención ha sido determinado, se descubre que el régimen de liberación es bajo. Para calcular el régimen de liberación, el portador de la presente invención es precipitado por centrifugación, y se determina la cantidad de fármaco presente en el sobrenadante y portador.

Ejemplos A continuación, la presente invención se describirá en forma más detallada a modo de ejemplos, pero la presente invención no se limitará a aquellos ejemplos y ejemplos de ensayo . Cada concentración y tamaño de partícula de un liposoma encapsulado en un fármaco preparado en cada ejemplo se determina de la manera siguiente. Concentración de fosfolípidos (mg/ml) : una concentración de fosfolípido (HSPC) en una dispersión de liposoma, que fue determinada usando un equipo para la determinación de fosfolípidos (Phospholipid C-Test Wako, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.). Concentración de lípidos totales (mol/1) : una concentración molar total (mM) de un lípido mixto que es un componente de una membrana, que se calcula a partir de la concentración de fosfolípido anterior. Los lípidos torales contienen componentes de lípido en un agente modificador de superficie preparado en forma de un lípido mixto pero no contienen un lípido (en los ejemplos, PE (fosfatidil etanolamina) en PEG-PE o Chol (colesterol) en Chol-PEG) en un derivado PEG para introducir PEG. Concentración de fármaco (mg/ml) : la concentración se determinó de la manera siguiente: la formulación obtenida anteriormente se diluyó 40 veces con solución salina fisiológica, y se agregaron 2 ml de metanol a 50 µl de la mezcla, seguido de medición de una intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 360 nm, longitud de onda de fluorescencia: 435 nm) de la mezcla usando un espectrofluorímetro . La concentración de clorhidrato de irinotecan encerrado se representa como "cantidad de fármaco (mg/cantidad de formulación total (ml)". " Cantidad de fármaco incorporado (relación molar del fármaco/lípidos totales) : la concentración de clorhidrato de irinotecan encerrado en un portador se representa como una relación molar de fármaco/lípidos totales, que se calcula a partir de una relación de la concentración de fármaco a la concentración de lípidos. ' Tamaño de partícula (nm) : se diluyeron 20 µl de una dispersión de liposoma en 3 ml con solución salina fisiológica, y se determinó un tamaño de partícula promedio mediante Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments) . Los siguientes son nombres abreviados y pesos moleculares de los componentes usados. HSPC: fosfatidilcolina de soja hidrogenada (peso molecular: 790, manufacturado por Lipoid, SPC3) Chol: colesterol (peso molecular: 386.65, Solvay) PEG5000-PE: polietilenglicol (peso molecular: 5,000) fosfatidil etanolamina (peso molecular: 5,938, Genzyme Corporation) PEG2000--PE: polietilenglicol (peso molecular: 2,000) fosfatidil etanolamina (peso molecular: 2,725, NOF Corporation) PEGi6oo~Chol : polietilenglicol (peso molecular: 1,600) - colesterol (peso molecular: 1,982, NOF Corporation) CPT-11: clorhidrato de irinotecan (peso molecular: 677.19) R-DHPE: rodamina dihexadecanoil fosfatidil etanolamina (peso molecular: 1333.81, Molecular Probes, Inc.) TRX-20: clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (peso molecular: 609.41, Joko Pharmaceutical Co., Ltd.) [Ejemplo 1] Para confirmar un método capaz de lograr una formulación de liposoma con cantidad elevada de clorhidrato de irinotecan encapsulado se intentó la introducción del fármaco en una concentración elevada mediante el método de carga remota (Ejemplo de Preparación 1) o mediante el método de carga pasiva (Ejemplo de Preparación Comparativo 1) . Para todas las formulaciones del liposoma incorporadas con clorhidrato de irinotecan (abreviadas a continuación como formulación de CPT-11) , se usó un liposoma PGE-PE (post-introducido) como portador aunque los métodos se introducción son diferentes.

[Ejemplo de Preparación 1] <Método de carga remota> (1) Preparación de un lípido mixto: 0.422 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y 0.176 g de colesterol (Chol) se disolvieron en 25 ml de t-butanol (Kanto Kagaku) calentado a 60°C y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación, para preparar de este modo un lípido mixto de HSPC:Chol = 54:46 (relación molar). (2) Preparación de liposoma: a 0.598 g del lípido mixto preparado anteriormente se agregaron 10 ml de una solución de sulfato de amonio 250 mM y se dejó dilatar completamente el lípido. Luego, se agitó la mezcla con una mezcladora de remolino y la mezcla resultante se hizo pasar secuencialmente a través de un filtro (tamaño del poro: 0.2 µm x 5 veces, 0.1 µm x 10 veces, Whatman) unido a un extrusor (The Extruder T. 10, Lipex biomembranes Inc.) a 68 °C para preparar de este modo una dispersión de liposoma. (3) Introducción de PEG-PE: se agregó a la dispersión de liposoma resultante 1.21 ml (correspondiente a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos del lípido mixto) de una solución de polietilenglicol 5000-fosfatidil etanolamina (PEG50oo-PE) en agua destilada (36.74 mg/ml) y la mezcla se calentó a 60 °C durante 30 minutos, para introducir de esta manera PEG50oo-PE. Se efectuó una sustitución de fase acuosa externa usando una columna de gel que había sido sometida a sustitución de solvente con una solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa (pH 6.0). Se determinó una concentración de HSPC usando un equipo para la determinación de fosfolípidos. Se calculó una cantidad total de lípidos (mM) a partir de la concentración de HSPC. (4) Encapsulación del fármaco: se preparó una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-11) /agua RO (agua purificada de membrana de osmosis inversa) que tenía una concentración de 10 mg/ml. Se agregó la solución de clorhidrato de irinotecan a la dispersión de liposoma en una cantidad de CPT-ll/HSPC = 0.2 (p/p) para la concentración de HSPC (mg/ml) anterior, y la mezcla se agitó a 60°C durante 60 minutos, para introducir de este modo el clorhidrato de irinotecan. Después de la introducción, la muestra se enfrió en hielo. Después de la encapsulación del clorhidrato de irinotecan, la dispersión de liposoma se hizo pasar a través de una columna de gel que había sido sometida a sustitución con solvente con una solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa (pH 6.5) para remover los fármacos no encapsulados . Las composiciones y los tamaños de partícula de las formulaciones de CPT-11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 1. Se obtuvieron formulaciones de CPT-11 altamente incorporadas de la presente invención.

[Ejemplo de Preparación Comparativo 1] <Método de carga pasiva> A 0.2992 g de un lípido mixto (HSPC: Chol = 54:46 (relación molar) ) preparado mediante el mismo método que el del Ejemplo de Preparación 1, se le agregaron 5 ml de una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-ll/10% de solución de sucrosa que tiene una concentración de 10 mg/ml) y se permitió que el lípido se dilatara completamente. La mezcla se agitó con una mezcladora de remolino, y la mezcla resultante se hizo pasar consecutivamente a través de un filtro (0.2 µm x 5 veces, 0.1 µm x 10 veces) unido a un extrusor a 68 °C de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1, para preparar de esta manera un liposoma encapsulado de clorhidrato de irinotecan. Se agregó al liposoma 0.61 ml (correspondiente a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos del lípido mixto) de PEG5ooo_PE del mismo modo que en el Ejemplo de Preparación 1 (3) , y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir de este modo PEG50oo-PE. Subsiguientemente, se extrajeron los fármacos no encapsulados usando una columna de gel que había sido sometida a sustitución de solvente con una solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa (pH 6.5). Las composiciones y tamaños de partícula de las formulaciones CPT- 11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 1. El fármaco se introdujo con la misma cantidad de fármaco que en el Ejemplo de Preparación 1, pero no se obtuvieron formulaciones altamente encapsuladas de CPT-11 mediante el método de carga pasiva.

[Ejemplo 2] Se investigó la cantidad inicial necesaria para obtener una formulación de CPT- 11 altamente encapsulada de la presente invención en el método de carga remota. (Ejemplo de Preparación 2) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 excepto que, en la encapsulación del fármaco descripta en el Ejemplo de Preparación 1 (4) , la relación de CPT-11/HSPC (p/p) de una solución acuosa de CPT-ll/RO (10 mg/ml) para ser agregada a la dispersión de liposoma con PGE-PE post-introducido preparado de la misma manera que (1) hasta (3) se cambió a 0.1, 0.2, 0.4 y 0.8 para obtener de esta manera formulaciones de CPT- 11. Las composiciones y tamaños de partícula de las formulaciones de CPT-11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 1. Tal como se muestra en la Tabla 1, las formulaciones altamente incorporadas de CPT-11 que tienen el fármaco en una concentración completamente eficaz para uso clínico pueden obtenerse mediante el método de carga remota incrementando la cantidad inicial de fármaco (relación de fármaco/HSPC) .

[Tabla 1] 10 15 (Ejemplo de Ensayo 1) Estabilidad de formulación acelerada a 37°C Cada formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 1 se calentó a 37°C por un período predeterminado. Después del calentamiento se diluyó la formulación de CPT-11 20 veces mediante el agregado de solución fisiológica salina y se llevó a cabo una ultracentrifugación (1 x 105 g, 2 horas, 10°C) para precipitar una formulación de CPT-11 (liposoma de clorhidrato de irinotecan encapsulado) . La cantidad de clorhidrato de irinotecan presente en el sobrenadante se determinó para calcular el régimen de liberación (%) del clorhidrato de irinotecan desde la formulación de CPT-11. Los resultados se muestran en la figura 1. La formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación Comparativo 1 demostró tener un régimen de liberación de clorhidrato de irinotecan de aproximadamente 60% después de calentamiento a 37°C durante 7 días, mientras que la formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 1 mediante el método de carga remota demostró que liberaba poco clorhidrato de irinotecan incluso después de calentar a 37°C durante 7 días. Por lo tanto, se aclaró que la encapsulación del clorhidrato de irinotecan dentro de un liposoma mediante el método de carga remota permite la preparación de una formulación altamente incorporada de CPT-11 que tiene excelente estabilidad de formulación.

(Ejemplo de Ensayo 2) Estabilidad de formulación a 37°C Cada formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 2 se calentó a 37°C por un período predeterminado. Después del calentamiento, de la formulación de CPT- 11, se determinó el régimen de liberación del clorhidrato de irinotecan de la misma manera que en el Ejemplo de Ensayo 1. El régimen de liberación de cada formulación de CPT-11 demostró ser 1% o menos incluso después de calentar a 37°C durante 14 días. Por lo tanto, quedó claro que el régimen de liberación de la formulación de CPT-11 preparada mediante el método de carga remota no es afectado en gran medida por la cantidad de fármaco incorporado (relación de fármaco/lípidos totales) e incluso la formulación de CPT-11 extremadamente altamente encapsulada tiene el excelente estabilidad de formulación.

[Ejemplo 3] Se usó un liposoma que tiene una composición de membrana diferente de la del Ejemplo de Preparación 1 como portador para preparar una formulación de CPT- 11. Específicamente, el procedimiento para la encapsulación de clorhidrato de irinotecan se llevó a cabo mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 usando un liposoma de PEG-PE post-introducido (Ejemplo de Preparación 3) o un liposoma de PEG-PE pre-introducido (Ejemplo de Preparación de Referencia 1) que incluye el lípido mixto que se muestra a continuación como componente de la membrana. (Ejemplo de Preparación 3) (1) Preparación del lípido mixto: 1.5317 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 0.6419 g de colesterol (Chol) y 0.005 g de rodamina dihexadecanoil fosfatidil etanolamina (R-DHPE) se disolvieron en 50 ml de t-butanol calentada a 60°C y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación, para preparar de este modo un lípido mixto que tiene una relación molar de HSPC : Chol: R-DHPE = 54:46:0.1. (2) Preparación del liposoma: la adición de 10 ml de una solución de sulfato de amonio 250 mM, la agitación con una mezcladora de remolino, y la filtración con un filtro unido a un extrusor (0.2 µm x 5 veces, 0.1 µm x 10 veces) se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 excepto que se usaron 0.37 g del lípido mixto preparado anteriormente, para obtener de este modo una dispersión de liposoma. Subsiguientemente, se llevó a cabo una sustitución de fase acuosa externa con una solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa (pH 6.0). (3) Introducción de PEG-PE: se agregó a la dispersión del liposoma resultante una solución de polietilenglicol 2000-fosfatidil etanolamina (PEG20oo-PE) en agua destilada (36.74 mg/ml) (correspondiente a 2.8 % en moles de la cantidad total de lípidos) y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir de esta manera PEG20oo-PE. (4) De la misma manera que en la encapsulación del fármaco del Ejemplo de Preparación 1, se agregaron 10 mg/ml de una solución de CPT-ll/agua RO a la dispersión de liposoma en una cantidad requerida para CPT-ll/HSPC = 0.2 (p/p) con el fin de introducir clorhidrato de irinotecan. Subsiguientemente, la mezcla se enfrió en hielo y se extrajeron los fármacos no encapsulados con una solución de 10 mM de histidina/10% se sucrosa (pH 6.5). La formulación de CPT-11 resultante se muestra en la Tabla 2. (Ejemplo de Preparación de Referencia 1) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 3 excepto que el PEG20oo-PE que debía agregarse en el Ejemplo de Preparación 3 (3) había sido agregado previamente al lípido mixto en forma de un material de membrana para preparar un liposoma que tiene PEG-PE dispersado en ambos lados de las membranas internas y externas, para preparar de este modo una formulación de CPT-11. El procedimiento se muestra a continuación. A 0.37 g del lípido mixto (HSPC : Chol :R-DHPE = 54:46=0.1 (relación molar)) preparado de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 3 (1) y 0.094 g (que corresponde a la cantidad de (5.6 moles%) el doble de la cantidad del Ejemplo de Preparación 3) de PEG20oo-PE se le agregó 1 ml de etanol y la mezcla se disolvió completamente mediante agitación a 65°C durante 30 minutos. Después de confirmar que la mezcla había sido disuelta completamente por agitación, se agregaron a la solución de etanol 10 ml de una solución de sulfato de amonio preparada para que fuera de 250 mM. A continuación, se llevaron cabo los mismos procedimientos que para el Ejemplo de Preparación 3 (2) con una mezcladora de remolino y un extrusor, y se efectuó la sustitución de fase acuosa externa para la dispersión de liposoma obtenido mediante el uso de 10% de solución de sucrosa. De la misma manera que para el Ejemplo de Preparación 3 (4) , 10 mg/ml de una solución de CPT-ll/agua RO se agregó a la dispersión de liposoma en una cantidad requerida para CPT-ll/HSPC valor = 0.2 (p/p) para introducir clorhidrato de irinotecan. Después de la introducción, la mezcla se enfrió en hielo y se extrajeron los fármacos no encapsulados de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 3 (4) . La formulación de CPT- 11 resultante se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2 10 15 (Ejemplo de Ensayo 3) Estabilidad acelerada de la formulación a 37°C Para cada formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo 3, se llevó a cabo un ensayo acelerado mediante calentamiento del mismo a 37°C durante 1 mes. Se recogió cada semana una alícuota de la formulación de CPT-11 caliente, y se diluyó 20 veces mediante agregado de solución salina fisiológica, seguido de ultracentrifugación (1 x 105 g, 2 horas, 10°C) para precipitar una formulación de CPT-11. La intensidad de fluorescencia correspondiente a la cantidad de clorhidrato de irinotecan presente en el sobrenadante se determinó para calcular el régimen de liberación del liposoma (%) . Los resultados se muestran en la figura 2. Mientras tanto el tamaño de partícula del liposoma en la dispersión caliente se midió cada semana. Los resultados se muestran en la figura 3. Las figuras 2 y 3 revelan que el liposoma preparado en el Ejemplo de Preparación 3 no liberó droga a 37°C incluso al cabo de 1 mes (figura 2) y tuvo un tamaño de partícula sustancialmente constante (figura 3), de modo que mostró excelente estabilidad de la formulación. Por otra parte, para el liposoma de PEG-PE pre-introducido preparado en el Ejemplo de Preparación de Referencia 1, la liberación del fármaco a 37 °C se inició a la tercera semana, el régimen de liberación a la cuarta semana fue extremadamente alto (figura 2) , y el tamaño de partícula aumentó desde la tercera semana (figura 3) , de modo que se sugirió que la ruptura de la membrana ocurrió desde la tercera semana. A partir de estos resultados, para una formulación de CPT-11 altamente incorporada de acuerdo con la presente invención, el liposoma PEG-PE post-introducido preparado por agregado de PEG-PE después de la formación del liposoma, mostró que tenía una forma preferible.

[Ejemplo 4] Para ensayar la estabilidad de preservación a largo término y la estabilidad en la sangre de una formulación de CPT-11 de la presente invención, se prepararon formulaciones de CPT-11 mediante los métodos en los Ejemplos de Preparación 4 y 5 siguientes.

(Ejemplo de Preparación 4) Se introdujo un fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 excepto que se llevó a cabo una sustitución de fase acuosa externa para la dispersión del liposoma PEG-PE post-introducido usando una columna de gel que había sido sometida a sustitución de solvente con una solución de 10 mM de MES/10% de sucrosa (pH 6.0) en el Ejemplo de Preparación 1 (3), para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente incorporada. Las composiciones se muestran en la Tabla 3. n (Ejemplo de preparación 5) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 4 excepto que el lípido mixto preparado en (1) siguiente se usó como componente de la membrana, para preparar de esta manera una formulación de CPT- 11 altamente incorporada que contenía clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación. (1) Preparación de lípidos mixtos: 0.4561 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 0.1876 g de colesterol (Chol) y 0.0563 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) se disolvieron en 25 ml de t-butanol calentado a 60°C, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación para preparar de esta manera un lípido mixto de HSPC : Chol : TRX-20 = 50:42:8 (relación molar) . Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 (2) excepto que 0.700 g del lípido mixto preparado anteriormente se usaron para preparar de esta manera una dispersión de liposoma. A la dispersión de liposoma se agregó 1.42 ml (correspondiente a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos del lípido mixto) de una solución de PEG5000-PE en agua destilada (36.74 mg/ml) para introducir PEG5000-PE. Subsiguientemente se introdujo el fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 (3) excepto la sustitución de fase acuosa externa para la dispersión de liposoma se llevó a cabo con una solución de 10 mM de MES/10% de sucrosa (pH 6.0), para preparar de esta manera una formulación de CPT- 11 altamente incorporada. La composición se muestra en la Tabla 3.

(Ejemplo de Ensayo 4) Ensayo de preservación a largo término a 4°C Cada una de las formulaciones de CPT- 11 obtenidas anteriormente se almacenó a 4°C por un período predeterminado. Después de transcurrido el período predeterminado, se midió el tamaño de partícula de la formulación de CPT-11 y el régimen de liberación (%) del clorhidrato de irinotecan a partir de la formulación de CPT-11 de la misma manera que en el Ejemplo de Ensayo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 10 15 Para cada una de las formulaciones de CPT-11 preparadas en el Ejemplo 4 anterior, no se cambió el tamaño de partícula y el régimen de liberación incluso después de 6 meses de almacenamiento a 4CC. Por lo tanto, se aclaró que cada formulación de CPT-11 preparada por el método de carga remota tiene excelente estabilidad de preservación a largo término .

(Ejemplo de Ensayo 5) Capacidad de retención en la sangre Cada formulación de CPT-11 preparado en el Ejemplo 4 (Ejemplos de Preparación 4 y 5) o una solución de clorhidrato de irinotecan en solución salina fisiológica (que contenía 1 mg/ml de clorhidrato de irinotecan) se inyectó intravenosamente en la cola de un ratón (BALB/c, macho, de 5 semanas de vida, CLEA Japan, Inc.) en una cantidad de clorhidrato de irinotecan de 10 mg/kg (que corresponden a 8.77 g/kg en términos de cantidad de irinotecan). Se extrajo sangre 1.6 y 24 horas después de la inyección y se centrifugó (3,000 rpm, 10 minutos, 4°C) para recoger plasma. La concentración de clorhidrato de irinotecan en cada plasma se midió con una medición de la intensidad de la fluorescencia. El plasma se almacenó en un refrigerador hasta el momento de la medición. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y en la Figura 4.

En el caso de cada formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 4, la concentración de clorhidrato de irinotecan en el plasma pudo medirse hasta 24 horas después de la inyección en la vena de la cola, mientras que en el caso de la solución de clorhidrato de irinotecan en solución salina fisiológica, la concentración pudo medirse solamente 1 hora después de la inyección en la vena de la cola.

Por lo tanto, la formulación de CPT-11 preparada mediante el método de carga remota permitió el mantenimiento de la concentración de clorhidrato de irinotecan en el plasma en una concentración elevada por un período de tiempo prolongado.

Tabla 4 [Ejemplo 5] Para probar la eficacia del fármaco en una formulación de CPT-11 altamente encapsulada de acuerdo con la presente invención, se prepararon formulaciones de CPT- 11 en los Ejemplos de Preparación 6 a 9 siguientes.

(Ejemplo de Preparación 6) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 4 excepto que el lípido mixto preparado en (1) siguiente se usó como componente de la membrana, para preparar de esta manera una formulación de CPT-11 altamente incorporada que contenía clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación. (1) Preparación del lípido mixto: se disolvieron 4,562 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1,876 g de colesterol (Chol) y 0,564 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) en 50 ml de t-butanol calentado a 60°C, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación para preparar de esta manera un lípido mixto de HSPC : Chol :TRX-20 = 50:42:8 (relación molar). Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 excepto que se usaron 7,002 g del lípido mixto preparado anteriormente, para preparar de esta manera una dispersión de liposoma. A la dispersión de liposoma se le agregó una solución de polietilenglicol 5000-fosfatidil etanolamina (PEG5ooo_PE) en agua destilada (36.74 mg/ml) que correspondía a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos, y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir PEG5000-PE. Subsiguientemente, se introdujo el fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 (4), para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente encapsulada. La composición se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5 10 15 (Ejemplo de Preparación 7) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 4 excepto que el lípido mixto preparado en (1) siguiente se usó como componente de la membrana, para preparar de esta manera una formulación de CPT- 11 altamente incorporada que contenía clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación. (1) Preparación de un lípido mixto: se disolvieron 4,562 g fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1,518 g de colesterol (Chol), y 1,126 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) en 50 ml de t-butanol calentado a 60°C y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación, para preparar de esta manera un lípido mixto de HSPC : Chol :TRX-20 = 50:34:16 (relación molar). Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 excepto que se usaron 7,207 g del lípido mixto preparado anteriormente, para preparar de este modo un dispersante de liposoma. A la dispersión de liposoma se le agregó una solución de polietilenglicol 1600-colesterol (PEG50oo-Chol) en agua destilada (36.74 mg/ml) que corresponden a 2.0 % en moles de cantidad total de lípidos y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir PEG?6oo_Chol . Subsiguientemente, se introdujo el fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 (4) excepto que la sustitución de la fase acuosa externa por la dispersión de liposoma se llevó a cabo con una solución de sucrosa 10 mM de MES/10% (pH 6.0), para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente encapsulada. La composición se muestra en la Tabla 6. [Tabla 6] Tabla 6 10 15 (Ejemplo de Preparación 8) Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 4 excepto que el lípido mixto preparado en (1) siguiente se usó como componente de la membrana, para preparar de esta manera una formulación de CPT-11 altamente incorporada que contenía clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación. (1) Preparación del lípido mixto: se disolvieron 4.562 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1.876 g de colesterol (Chol) y 0.564 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) en 50 ml de t-butanol calentado a 60°C, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación para preparar de esta manera un lípido mixto de HSPC:Chol :TRX-20 = 50:42:8 (relación molar). El procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 se repitió excepto que se usaron 7.002 g del lípido mixto preparado anteriormente, para preparar de este modo una dispersión de liposoma. A la dispersión de liposoma se le agregó una solución de polietilenglicol 5000-fosfatidil etanolamina (PEG5000-PE) en agua destilada (36.74 mg/ml) correspondiente a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir PEG50oo- PE.

Subsiguientemente, se introdujo el fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 (4) para preparar de esta manera una formulación de CPT-11 altamente encapsulada. La composición se muestra en la Tabla 6.

(Ejemplo de Preparación 9) El procedimiento del Ejemplo de Preparación 4 se repitió excepto que el lípido mixto preparado en (1) más abajo se usó en forma de un componente de membrana, para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente incorporada. El procedimiento se muestra a continuación. (1) Preparación de lípido mixto: 4.940 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y 2.060 g de colesterol (Chol) se disolvieron en 50 ml de t-butanol calentado a 60°C y la mezcla se enfrió en hielo, seguido de secado por congelación para preparar de este modo un lípido mixto de HSPC:Chol = 54:46 (relación molar). Se repitió el procedimiento del Ejemplo de Preparación 1 excepto que se usaron 7.002 g del lípido mixto preparado anteriormente, para preparar de este modo una dispersión de liposoma. A la dispersión de liposoma se agregó una solución de polietilenglicol 5000-fosfatidil etanolamina (PEG50oo-PE) en agua destilada (36.74 mg/ml) que correspondía a 0.75 % en moles de la cantidad total de lípidos, y la mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos para introducir PEG50oo"PE. Subsiguientemente, se introdujo el fármaco mediante el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1 (4), para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente encapsulada. La composición se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7 10 15 [Ejemplo 6] Se examinó el efecto del valor de pH de una fase acuosa externa sobre el régimen de encapsulación del fármaco.

(Ejemplo de Preparación 10) (1) Preparación de lípidos mixtos: se pesaron 7.01 g de HSPC y 2.93 g de Chol y se agregaron al mismo 10 ml de etanol absoluto. Luego, se disolvieron con calentamiento a 68 °C. Después de confirmar que se habían disueltos completamente, se agregaron a los mismos 90 ml de solución de sulfato de amonio (250 mM) y la mezcla se agitó con calentamiento a 68°C. (2) Preparación de liposomas: después de completar la agitación con calentamiento, la mezcla resultante se pasó a través de un filtro que tenía un tamaño de poro de 0.2 µm, cinco veces usando un extrusor calentado a 68 °C. Subsiguientemente, se intercambió el filtro por un filtro que tenía un tamaño de poro de 0.1 µm y el filtrado se pasó a través del filtro cinco veces. A continuación, se intercambió el filtro por un filtro que tenía un tamaño de poro de 0.1 µm nuevamente, y se pasó el filtrado a través del filtro cinco veces. La introducción de PEG50oo-DSPE: después de la extrusión, se agregaron a la muestra 20.4 ml de una solución de PEGsooo-DSPE (36.74 mg/ml) para que tuviera un contenido de PEG5000-DSPE predeterminado (% en moles) y la mezcla se agitó a 60°C durante 30 minutos, para introducir luego PEG50oo-DSPE. Después de la introducción, la muestra se enfrió en hielo. (3) Sustitución de fase acuosa externa: para cada muestra (8 ml) enfriada con hielo, se llevó a cabo una sustitución de fase acuosa externa usando una columna de gel que había sido sometida a sustitución adecuada, donde cada una de dichas soluciones de fase acuosa externa tenían diferentes valores de pH (pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 ó 9.0), concretamente, soluciones acuosas de fase externa que tenían un pH de 4.0, 5.0 (soluciones de 10 mM de ácido acético/10% de sucrosa) , una solución de fase acuosa externa que tenía un pH de 6.0 (solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa), soluciones de fase acuosa externas que tenían un pH de 7.0, 8.0, 9.0 (soluciones de 10 mM de Tris/10% de sucrosa). Después de la sustitución de la fase acuosa externa, se determinó cada concentración de HSPC usando un equipo para la determinación de fosfolípidos, para la dispersión de liposoma. La cantidad total de fosfolípido (mM) se calculó a partir de la concentración de HSPC. (4) Encapsulación del fármaco: se preparó una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-11) /agua RO (agua purificada por membrana de osmosis inversa) , que tenía una concentración de 10 mg/ml. Se agregó la solución de clorhidrato de irinotecan a la dispersión de liposoma en una cantidad de CPT-ll/cantidad total de lípidos = 0.16 (mol/ml) con respecto a la cantidad de lípidos total (mM) anterior, y la mezcla se agitó a 60°C durante 60 minutos, para introducir de esta manera clorhidrato de irinotecan. Después de la introducción, la muestra se enfrió en hielo. Después de la encapsulación del clorhidrato de irinotecan, la dispersión de liposoma se pasó a través de una columna de gel que había sido sometida a sustitución con una solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa (pH 6.5) para eliminar los fármacos no encapsulados. La concentración de lípido (HSPC) , concentración de fármaco (CPT-11) y el tamaño de partícula de cada formulación de CPT- 11 obtenida anteriormente se muestra en la Tabla 8.

(Eficiencia de encapsulación del fármaco) Para cada formulación de CPT- 11 obtenida anteriormente, se calculó la eficiencia de encapsulación del fármaco (%) a partir de la relación de la concentración final de fármaco CPT- 11 con respecto a la concentración inicial de fármaco 0.16 (mol/mol) de acuerdo con la expresión siguiente. [Formula Matemática 1] Eficiencia de encapsulación de CPT-11 (%) = {CPT-11 Final/Lípidos totales (mol/mol) }/{CPT-ll Inicial/Lípidos totales (mol/mol) } x 100 Los resultados se muestran en la Tabla 8 y en la figura 5. La tabla y la figura muestran lo siguiente: en el caso en el que el valor de pH de la fase acuosa externa es 8.0 o menos, la eficiencia de encapsulación de CPT-11 (%) es un valor extremadamente alto de 90% o más, mientras que en el caso en el que el valor es de más de 8.0, la eficiencia de encapsulación del CPT-11 (%) disminuye.

Tabla 8 10 15 [Ejemplo 7] Se examinó el efecto del valor pH de la fase acuosa externa sobre la estabilidad del fármaco. A 1 mL de cada una de las fases acuosas externas que tienen diferentes valores de pH, concretamente las soluciones de fase acuosa externa que tienen un pH de 4.0, 5.0 (soluciones de 10 mM de ácido acético/10% de sucrosa), soluciones de fase acuosa externa que tienen pH 6.0 (solución de 10 mM de histidina/10% de solución de sucrosa) , soluciones de fases acuosas externas que tienen 7.0, 8.0, 9.0 (soluciones de 10 mM Tris/10% de sucrosa), (pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, o 9.0) que se usaron en (3) del Ejemplo de Preparación 10, se les agregó 0.7 mL de una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-11) agua RO (agua purificada de membrana de osmosis inversa) que tenía una concentración de 10 mg/mL, y la mezcla se agitó a 60°C durante 60 minutos. La solución de CPT-11 obtenida anteriormente se diluyó 20 veces con cada una de las soluciones de fase acuosa externa, y 5 µl de la muestra se sometieron a medición con cromatografía líquida de alto rendimiento. A continuación, la relación de hidrólisis (relación existente de forma circular abierta) , (%) de un anillo de a-hidroxilactona se calculó de acuerdo con la expresión siguiente. Relación existente de forma circular abierta de CPT-11 (%) = {Aabierto/ (Aabierto + 1.102 X Acerrado ) } X 100 abiero: un área pico de forma circular abierta de CPT-11 Acerrado: un área pico de forma circular cerrada de CPT- 11 Los resultados se muestran en la Figura 5. Se aclaró que, en el caso de que el valor de pH de la fase acuosa externa es de 8.0 o más, la relación existente de la forma circular abierta CPT-11 (%) aumentó y fue un valor extremadamente alto de 95% o más. Para mantener la actividad del CPT-11, es necesario que el valor de pH sea de 4.0 o menos para suprimir la hidrólisis del anillo de a-hidroxilactona. Sin embargo, a partir del aspecto de la estabilidad del lípidos (hidrólisis de lípidos) , el valor de pH es convenientemente de aproximadamente 6.0 a 7.0. Considerando los resultados del Ejemplo 6, se halló que el valor de pH de la fase acuosa externa en el momento de introducción del fármaco, era convenientemente de 4.0 a 7.0.

[Ejemplo 8] (Ejemplo de preparación 11) (1) Preparación de liposomas Se pesaron 70.87 g de HSPC y 29.13 g de Chol, y luego se les agregaron 100 mL de etanol absoluto. Luego, se disolvieron éstos con calentamiento a 68°C. Después de confirmar que se habían disuelto completamente, se agregó a los mismos una solución de 900 mL de sulfato de amonio (250 mM) , y la mezcla se agitó con calentamiento a 68°C. (2) Regulación del tamaño de partículas del liposoma Regulación del tamaño de partículas del liposoma: después de completar la agitación con calentamiento, se pasó la mezcla resultante a través de un filtro que tenía un tamaño de poros de 100 nm cinco veces usando un extrusor calentado a 68°C. Introducción de PEG50oo-DSPE: después de la extrusión, se agregaron a la mezcla 200 mL de una solución de PEG5000-DSPE (36.74 mg/mL) para tener un contenido de PEG5000-DSPE predeterminado (%molar) , y la mezcla se agitó a 6°C durante 30 minutos, para introducir de esta manera PEG50oo-DSPE. Después de la introducción la mezcla se enfrió en hielo. (3) Sustitución de fase acuosa externa Para la muestra enfriada con hielo, se efectuó una sustitución de fase acuosa externa usando un sistema de filtración de flujo cruzado con una solución de fase acuosa externa (solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa) (pH 6.5) . Después de la sustitución de fase acuosa externa, se determinó la concentración de HSPC y la concentración de colesterol, usando cromatografía líquida de alto rendimiento.

La cantidad de clorhidrato de irinotecan que debería ser encapsulada se calculó a partir de la suma de la concentración de HSPC y la concentración de colesterol como concentración total de lípidos. (4) Encapsulación del fármaco Se preparó una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-11) /agua RO (agua purificada de membrana por osmosis inversa) , que tenía una concentración de 10 mg/mL. La solución de clorhidrato de irinotecan se agregó a la dispersión de liposomas en una cantidad de CPT-11/lípidos totales = 0.16 (mol/mol) con respecto a la cantidad total de lípidos (mM) anterior, y la mezcla se agitó a 50°C durante 20 minutos, para introducir luego clorhidrato de irinotecan. Después de la introducción se enfrió la muestra en hielo. (5) Remoción del fármaco no encapsulado Después de la encapsulación de clorhidrato de irinotecan a la dispersión de liposomas se agregó la solución de fase acuosa externa, y se llevó a cabo la remoción del fármaco encapsulado usando un sistema de filtración de flujo cruzado. (6) Regulación de la concentración Para la dispersión de liposomas después de la remoción de los fármacos no encapsulados, se determinó una cantidad de clorhidrato de irinotecan usando una cromatografía líquida de alto rendimiento, y se reguló la concentración de clorhidrato de irinotecan a 5.0 mg/mL. (7) Esterilización del filtro Después de la regulación de la concentración, la dispersión de liposoma se introdujo dentro de un frasco tubular a través de esterilización con filtro usando un filtro esterilizador que tenía un tamaño de poro de 0.2 µm. Las composiciones y los tamaños de partículas de las formulaciones de CPT-11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 10 15 (Ejemplo de ensayo 6) Efecto antitumoral. 2.5 x 106 células/ratón de células de cáncer prostático humano (PC-3) se implantaron subcutáneamente en la región inguinal izquierda del ratón (BALB/c desnudos, machos, de 6 semanas de vida, Charles River Japan, Inc.) Después de implantar los tumores, se calculó el volumen presunto del tumor mediante 1/2 ab2 (a representa un diámetro longitudinal de un tumor y b representa un diámetro de eje corto del mismo) . Desde el día siguiente hasta un día (día 0) en el cual el volumen presunto del tumor fue de aproximadamente 40 mm3, tres veces cada cuatro días (días 1, 5, y 9) , se inyectó en la vena de la cola del ratón una preparación de CPT- 11 preparado en el Ejemplo de Preparación 11 o una solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan. Se dejó un ratón sin inyección de cada agente como grupo de control. Se midieron el volumen presunto del tumor y el peso corporal de un ratón en los días 1, 5, 9, 12, 16 y 22. Después de extraer los tumores y medir el peso de los mismos en el día 22, adicionalmente se calculó el régimen de inhibición del crecimiento del tumor IR (%) , mediante la fórmula siguiente. I.R. % = (1 - peso promedio del tumor en un grupo de tratamiento/peso promedio del tumor en un grupo de control) x 100 La Tabla 10 y la Figuras 6 y 7 muestran los resultados . La preparación de CPT-11 y la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan, demostraron, cada uno, un efecto supresor significativo del crecimiento del tumor para cáncer prostático humano comparando el grupo de tratamiento con el grupo de control. La preparación de CPT-11 mostró un efecto antitumoral mayor que el de la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan (Tabla 10, Figura 6) . Además, ambos agentes no influenciaron el peso corporal del ratón (Figura 7). Tabla 10 Dosis Peso del Régimen de (mg/kg) Tumor Inhibición (g, (%) promedio ± S.D) Grupo de control 1.26±0.18 Preparación de CPT-11 25 0.03±0.01 97.9 (Ejemplo de Preparación 50 0.0210.00 98.3 11) 100 O.Ol±O.OO 99.0 Solución Fisiológica 25 0.064±0.25 49.0 Salina de Clorhidrato de 50 0.66±0.13 48.0 Irinotecan 100 0.48±0.20 62.3 (Ejemplo de ensayo 7) Farmacocinética La preparación de CPT-11 preparado en el Ejemplo de Preparación 11 o la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan, se inyectó continuamente a una vena cefálica de un mono macaco (macho, de 4 a 5 años, guangxi Research Center of primate Laboratory animal) durante 4 minutos hasta lograr un contenido de clorhidrato de irinotecan con 10 mg/kg. Se recogió sangre del macaco inmediatamente después de la inyección y antes de comenzar la aplicación de la inyección; después de 10 y 30 minutos; y después de 1, 6, 24, 48, 72, 168, 336, y 504 horas; se obtuvo plasma de la sangre por separación centrífuga. Se proveyeron 50 µL de plasma de sangre con 550 µL de una solución B convencional interna (una solución de metanol de sustancias convencionales internas), y se empleó fuerza centrífuga, se diluyó el sobrenadante con metanol 100 veces como muestra para la medición de la concentración total de CPT-11. Mientras tanto, se proveyeron 50 µL de cada plasma de sangre con 200 µL de una solución A convencional interna (0.147 mol/L de solución H3P04 de sustancias convencionales internas), se sometieron 200 µL de las mismas a una separación centrífuga (100,000 x g, durante 30 minutos, a 10°C) . Se separaron 100 µL en la capa superior y se empleó extracción de fase sólida para obtener la solución de agotamiento como muestra para la medición de la concentración de CPT-11 libre, (es decir, el CPT-11 liberado del liposoma, denominado a continuación "CPT-11 liberador de liposomas") , la medición de la concentración de SN-38 y la medición de la concentración de SN-38G (SN-38 10-0-glucónido) . Las muestras obtenidas se midieron en cada concentración de las mismas con LC/MS/MS. Las figuras 8 a 11 muestran los resultados. En la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan, la concentración total de CPT-11 se redujo rápidamente después de la inyección y se redujo a menos del límite más bajo de cuantificación (<1µg/mL) hasta 1 hora. Mientras tanto, para la preparación de CPT-11, la concentración total de CPT-11 se redujo exponencialmente desde 1 a 48 horas después de la inyección, y se reconoció una extensión suficiente del tiempo de retención en comparación con el de la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan. (Figura 8) En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración de CPT-11 libre, CPT-11 liberado por liposomas se redujo en forma relativamente rápida hasta 6 horas después de obtener la concentración más elevada inmediatamente después de la inyección, después de lo cual se redujo moderadamente la concentración. Mientras tanto, en la preparación de CPT-11, la concentración de CPT-11 libre logró la concentración más elevada en 1 hora después de la inyección, y luego se redujo moderadamente (Figura 9) . En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración de SN-38 se redujo rápidamente después de obtener la concentración más alta inmediatamente después de la inyección, y se dedujo menos del límite más bajo de cuantificación (<0.0005 µg/mL) hasta 24 horas. Mientras tanto, para la preparación de CPT-11, la concentración de SN-38 se mantuvo durante 1 hora después de lograr la concentración más alta inmediatamente después de la inyección. A la concentración se redujo después de mantenerse desde 6 hasta 48 horas (Figura 10). Tanto para preparación de CPT-11 como para la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración de SN-38G se incrementó en 1 hora después de la inyección, para reducirse ligeramente con mantenimiento de la concentración (Figura 11) . (Ejemplo de ensayo 8) Hemotoxicidad La preparación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 11 se inyectó en la vena de la cola de una rata (CD(SD) ratón IGS, macho, de 7 semanas de vida, Charles River Japan, Inc.) hasta satisfacer un contenido de clorhidrato de irinotecan de 3, 10 y 30 mg/kg, o satisfacer la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan con 30 mg/kg.

Se recogió sangre de 0.4 mL, de una vena cervical de rata antes y después de la inyección; y después de 2, 4, 6, 13, 20 y 27 días (durante 4 semanas); se midió la cantidad de neutrófilos y linfocitos con un analizador hematológico automático (Sysmex XT-2000Í, Sysmex) . Las Figuras 12 y 13 muestran los resultados. La cantidad de neutrófilos se redujo transitoriamente, para recuperarse rápidamente después de esto con cualquier cantidad de inyección. A una dosis de 10 y 30 mg/kg como contenido de clorhidrato de irinotecan en comparación con 3 mg/kg de contenido, el grado de reducción de cantidad fue amplio. A una dosis de 30 mg/kg la cantidad aumentó rápidamente en el período de recuperación. En 30 mg/kg en cada uno de ambos agentes de inyección, no se reconocieron diferencias significativas entre transiciones en la cantidad de neutrófilos (Figura 12) . La cantidad de linfocitos declinó inmediatamente después de la inyección a pesar de que fue solo ligeramente. Sin embargo, no hubo diferencias entre las inyecciones (Figura 13) . Los resultados anteriores descritos, reconocen una débil hematoxicidad transitoria para los neutrófilos en la preparación de CPT-11. Sin embargo, la intensidad de hematoxicidad fue aproximadamente igual a la de la misma cantidad de solución salina fisiológica de clorhidirato de irinotecan.

[Ejemplo 9] (Ejemplo de Preparación 12) (1) Preparación del liposoma Se pesaron 65.250 g de HSPC, 26.800 de Chol y 8.000 g de TRX-20 y se agregaron a los mismos 100 mL de etanol absoluto. Luego se disolvieron con calentamiento a 68°C. Después de confirmar que se habían disuelto completamente, se agregaron 900 mL de una solución de sulfato de amonio (250 mM) , la mezcla se agitó con calentamiento a 68°C. (2) regulación del tamaño de partícula del liposoma Regulación del tamaño de partícula del liposoma: después de completar la agitación con calentamiento, se pasó la mezcla resultante a través de un filtro que tenía el tamaño de poro de 100 nm cinco veces usando un extrusor calentado a 68°C. Introducción de PEG50oo-DSPE: después de la extrusión, se agregaron a la muestra 200 mL de una solución de PEG5000-DSPE (36.74 mg/mL) para tener un contenido de PEG5000-DSPE predeterminado (% molar) , y la mezcla se agitó a 60°C durante 30 minutos para introducir PEG50oo-DSPE . Después de la introducción se enfrió la muestra en hielo (3) Sustitución de fase acuosa externa Para la muestra enfriada con hielo, se efectuó una sustitución de fase acuosa externa usando un sistema de filtración de flujo cruzado con una solución de fase acuosa externa (solución de 10 mM de histidina/10% de sucrosa) (pH 6.5) . Después de la sustitución de la fase acuosa externa, se determinó la concentración de HSPC y la concentración de colesterol, usando una cromatografía líquida de alto rendimiento. La cantidad de clorhidrato de irinotecan que debería estar encapsulada se calculó a partir de la suma de la concentración de HSPC, la concentración de colesterol y la concentración TRX-20 como concentración total de lípidos. (4) Encapsulación del fármaco Se preparó una solución de clorhidrato de irinotecan (CPT-11) /agua RO (agua purificada por membrana de osmosis inversa) que tenía una concentración de 10 mg/mL. La solución de clorhidrato de irinotecan se agregó a la dispersión de liposoma en una cantidad de CPT-ll/cantidad de lípidos totales = 0.16 (mol/mol) con respecto a la cantidad total de lípidos (mM) anterior, y la mezcla se agitó a 50°C durante 20 minutos, para introducir de esta manera clorhidrato de irinotecan. Después de la introducción la muestra se enfrió en hielo. (5) Remoción del fármaco no encapsulado Después de la encapsulación del clorhidrato de irinotecan a la dispersión de liposoma, se le agregó la solución de fase acuosa externa, y se efectuó la remoción del fármaco no encapsulado usando un sistema de filtración de flujo cruzado. (6) Regulación de la concentración Para la dispersión de liposoma después de la remoción de fármacos no encapsulados, se determinó una cantidad de clorhidrato de irinotecan usando cromatografía líquida de alto rendimiento y se reguló a 5.0 mg/mL de concentración de clorhidrato de irinotecan. (7) Esterilización del filtro Después de la regulación de la concentración, la dispersión de liposoma se introdujo dentro de un frasco tubular a través de una esterilización con filtros usando un filtro esterilizado que tenía un tamaño de poro de 0.2 µm. Las composiciones y los tamaños de partículas de las formulaciones de CPT-11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11 10 15 (Ejemplo de ensayo 9) Efecto antitumoral 2 x 106 células/ratón de células de cáncer de colon humano (HCT116) se implantaron subcutáneamente en la región inglinal izquierda del local (BALB/c desnudo, d, de 6 semanas de vida, Charles River Japan, Inc.). Después de implantar los tumores, se calculó el volumen tumoral presunto mediante 1/2 -ab2 (a representa un diámetro longitudinal de un tumor y b representa un diámetro corto del eje del mismo) se obtuvieron hasta aproximadamente 90 mm3 en un día (día 0) . Desde el día siguiente, en 3 veces cada cuatro días (días 1, 5 y 9) , una preparación de CPT- 11 preparado en el Ejemplo de Preparación 12 o una solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan se inyectó a una vena de la cola del ratón. En cada agente hubo un ratón sin inyección como grupo de control. Se midió el volumen presunto del tumor y el peso corporal del ratón después de 5, 8, 12, 16 y 21 días desde la inyección. Extrayendo tumores 21 días después de la inyección y midiendo el peso de los mismos, adicionalmente, se calculó el régimen de inhibición del crecimiento del tumor I.R. (%) mediante la fórmula que se muestra en el Ejemplo de Ensayo 6. La Tabla 12 y las Figuras 14 y 15 muestran los resultados . La preparación de CPT-11 y la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, demostraron, cada uno, un efecto supresor significativo del crecimiento del tumor para cáncer de colon humano, comparando el grupo de tratamiento con el grupo de control. La preparación de CPT-11 demostró un efecto antitumoral mayor que el de la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan (Tabla 12, Figura 14). Además, ninguno de los dos agentes influenció el peso corporal del ratón (Figura 15) .

Tabla 12 Dosis Peso del Régimen de (mg/kg) Tumor Inhibición (g, promedio (%) ± S.D) Grupo de control 1.25±0.15 Preparación de CPT-11 18.75 0.6110.11 51.1 (Ejemplo de Preparación 12) 37.5 0.36±0.07 70.8 75 0.14±0.03 88.7 Solución Fisiológica 18.75 0.7610.06 39.0 Salina de Clorhidrato de 37.5 0.7110.08 43.4 Irinotecan 75 0.5310.14 57.4 (Ejemplo de ensayo 10) Farmacocinéticas debida a una única administración Después de aplicar cánulas a la vena femoral y la vena femoral de la rata (CD(SD) ratón IGS, macho, de 7 semanas de vida, Charles River Japan, Inc.) bajo anestesia, y dejar la rata en la jaula bollman, la preparación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 12 o la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan se inyectó intravenosamente a través de la cánula de la vena femoral, a la rata hasta satisfacer un contenido de clorhidrato de irinotecan de 3, 10 y 30 mg/kg. Se recogió sangre de la rata después de la inyección; después de 2, 10 y 30 minutos; y después de 1, 3, 6, 9 24 y 30 horas; se obtuvieron 50 µL de plasma de la sangre por separación centrífuga, para diluirla con 200 µL de una solución convencional interna. Después de proveer 50 µL del plasma de sangre diluido con la solución convencional interna con 500 µL de metanol y agitación, se diluyó el plasma de la sangre diluido con 0.146 M de H3P04 10 veces como muestra para la medición de la concentración total de CPT-11. Mientras tanto, se sometieron 200 µiL del plasma de sangre diluido para separación centrífuga (100,000 x g, durante 30 minutos, 10°C), y los 50 µL obtenidos en la capa superior se diluyeron con 0.146 M de H3P04 10 veces como muestra para la medición de la concentración de CPT- 11 libre, medición de la concentración de SN-38 y medición de la concentración de SN-38G. Cada concentración de las muestras obtenidas se midió con PROPEKT-HPLC de acuerdo con métodos tales como el método de Kurita (J. Chromatogr. B 724, p335 to 344, 1999) . Las figuras 16 a 19 muestran los resultados. En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración total de CPT-11 se redujo rápidamente después de la inyección y se redujo exponencialmente desde 0.5 a 9 horas con cualquiera cantidad de inyección (3, 10 y 30 mg/kg). Mientras tanto, para la preparación de CPT-11, la concentración de CPT- 11 total se redujo casi exponencialmente desde 10 minutos a 30 horas después de la inyección, y se reconoció una extensión suficiente de tiempo de retención en comparación con la de la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan (Figura 16) . La concentración de CPT-11 liberado por liposomas se redujo casi exponencialmente desde 10 minutos a 30 horas después de la inyección de la preparación de CPT-11, y se reconoció una extensión suficiente de tiempo de retención en comparación con la de la solución salina fisiológica del clorhidrato de irinotecan (Figura 17) . En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración de SN-38 se redujo rápidamente, justo después de la inyección, y se redujo moderadamente después de una hora con cualquier cantidad de inyección, para conservarse aproximadamente a las 3 horas con 30 mg/kg. Mientras tanto para la preparación de CPT- 11, la concentración de SN-38 se redujo moderadamente después de lograr la concentración más elevada desde 3 a 6 horas después de la inyección en dosis de 3 y 10 mg/kg, respectivamente (Figura 18) . La concentración se redujo rápidamente durante 1 hora después de obtener la concentración más alta inmediatamente después de la inyección, para conservarse aproximadamente a las 9 horas con las cantidades de inyección de 30 mg/kg (Figura 18) . En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, la concentración de SN-38G se redujo rápidamente a l hora después de lograr la concentración más alta a los 10 minutos después de inyección con una cantidad de inyección para reducirse moderadamente después de esto. Mientras tanto para la preparación de CPT-11, la concentración de SN-38G se incrementó hasta 1 hora después de la inyección para reducirse ligeramente manteniendo la concentración (Figura 19) .

[Ejemplo 10] La formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo de Preparación 9 se ensayó como formulación de CPT-11 con un portador elevado, en la presente invención. (Ejemplo de Ensayo 11) Efecto antitumoral Se transplantaron células de cáncer de colon humano (HT-29) con 2 a 3 mm cuadrados, en la parte subcutánea inguinal de un ratón (BALB/c desnudo, macho, de 6 semanas de vida, CLEA Japan, Inc.) con una aguja para transplante. La formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo de Preparación 9 o una solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan se inyectaron a la vena caudal tres veces en total, lo cual fue en un punto (día 1) en el que el volumen estimado de tumores calculado por 1/2 ' ab2 (a se refiere a un eje principal de cada tumor, b se refiere a un eje menor) se acercó a alrededor de los 100 mm3, 4 días adicionales (día 5) y 8 días adicionales (día 9) , después del transplante de tumores. Se empleó un ratón sin inyección del fármaco como grupo de control . El volumen estimado de tumores y el peso corporal del ratón se calcularon a los 4, 8, 12, 17, 21 días después de la primera inyección. También se extrajeron los tumores 21 días después de la inyección, y se midió el peso de los tumores, para calcular de este modo el régimen de inhibición de proliferación del tumor, I.R. (%) mediante la fórmula que se muestra en el Ejemplo de Ensayo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 13, figura 20 y figura 21.

En el cáncer de colon humano, la formulación de CPT-11 y la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, mostraron un fuerte efecto inhibidor de la proliferación del tumor en comparación con el del grupo de control. Además, la formulación de CPT-11 reveló un alto efecto antitumoral en comparación con el de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan (Tabla 13, Figura 20) . Además, ninguno de los dos fármacos afectó el peso corporal del ratón (Figura 21) . Tabla 13 Dosis Peso del Régimen de (mg/kg) tumor (g, inhibición promedio + (%) S.D. ) Grupo de Control 0.58 + 0.29 Formulación de CPT- 25 0.18 + 0.15 69.4 11 (Ejemplo de Preparación 9) 50 0.09 + 0.06 84. .1 100 0.05 + 0.03 92. .0 Solución salina 25 0.36 + 0.41 38. .2 acuosa de clorhidrato de 50 0.44 + 0.36 24. .9 irinotecan 100 0.33 + 0.32 44. .0 (Ejemplo de Ensayo 12) Farmacocinética debida a una administración única Se transplantaron fibrosarcoma de ratón (Meth A) , 2.5 x 105 células/ratón en la parte subcutánea inguinal de un ratón (BALB/c, macho, 7 semanas de vida, Japan SLC, Inc.). Los tumores se dejaron para maduración en 20 días después del transplante de los tumores y luego se preparó la formulación de CPT-11 en el Ejemplo de Preparación 9 o se administró una solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan a la vena caudal con 10 mg/kg como concentración de clorhidrato de irinotecan . Después de la administración, se recogió sangre del corazón después de 10, y 30 minutos, y 1, 3, 5, 12, 24, 48 y 96 horas, y se trató en una centrifugadora (15,000 rpm, 1 minuto, 0CC) , para obtener de esta manera plasma. El plasma obtenido se diluyó 50 veces con 0.146 M de H3P04 y se agregó a una cantidad igual de solución convencional interna, como muestra para la medición de la concentración de CPT-11 en el plasma de un animal, al que se le administró la formulación de CPT-11. El plasma obtenido se diluyó 4 veces con 0.146 M de H3P04, y se agregó a una cantidad igual de solución convencional interna, como muestra para la medición de una concentración de SN-38 y una concentración de SN-38G cada una en el plasma del animal al que se le administró la formulación de CPT- 11, y se administró una concentración en el plasma del animal con la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan. Después de recoger la sangre del corazón, se extrajeron tumores del área inguinal y se lavaron con solución fisiológica, y luego se midió el peso del tumor. El tumor resultante se agregó a una cantidad de 5 veces de H3P04 de 0.146 M enfriado, y se homogeneizó con un homogeneizador de teflón. Se agregaron 200 µl del tumor homogeneizado resultante a 50 µl de una solución convencional interna y 0.75 ml de metanol, se suspendieron y luego se dejaron en reposo durante la noche a -20°C. Se trató la solución resultante en una centrifugadora (15.000 rpm, 3 minutos, 0°C) antes de agregar 0.4 ml de H3P04 0.146 M a 0.1 ml de sobrenadante, para obtener de esta manera una muestra para la medición de HPLC. Cada concentración de la muestra resultante para la medición se medió con un PROSPEKT-HPLC de acuerdo con el método de Kurita (J Chromoatogr B 724, pp . 335-344, 1999), o similares. Los resultados se muestran en las figuras 22 a 27. La formulación de CPT- 11 aumentó un área bajo la concentración en la curva de plasma-tiempo hasta 302 veces, y un tiempo de residencia promedio de hasta 4.4 veces en comparación con las de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, debido respectivamente a la formulación de liposoma, en la concentración de CPT-11 en el plasma (Figura 22) . Mientras tanto, la formulación de liposoma de la formulación de SN-38 aumentó en un área bajo la concentración de la curva de plasma-tiempo hasta 2.5 veces tal como para la concentración de SN-38 en el plasma, y extendió un tiempo de residencia promedio debido a la administración de una formulación de liposoma (Figura 23) . Además, la formulación de liposoma de la formulación SN-38 aumentó un área para la concentración en la curva de plásmatiempo hasta 1.8 veces en lo que se refiere a la concentración de SN-38G en el plasma y se extendió en un tiempo de residencia promedio (Figura 24) . En la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, una concentración de clorhidrato de irinotecan en los tejidos tumorales llegó a un nivel de concentración máxima en el tejido tumoral a las 0.5 horas después de la administración, y luego disminuyó con 2.3 horas de vida media. Mientras tanto, en la formulación de CPT-11, la concentración aumentó gradualmente y alcanzó un nivel de concentración máximo en el tejido tumoral después de 12 horas, y luego disminuyó más suavemente que la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan para aumentar un área bajo la concentración en la curva de tejido tumoral -tiempo de 9.0 veces (Figura 25) . En la solución salina fisiológica de clorhidrato de irinotecan, una concentración de SN-38 en los tejidos tumorales alcanzó una concentración máxima en el tejido tumoral a los 10 minutos después de la administración, y luego disminuyó gradualmente. En la formulación de CPT-111, la concentración aumentó gradualmente a las 6 horas después de la administración y luego se mantuvo una concentración constante aproximadamente a las 48 horas. A continuación la concentración disminuyó hasta extinguirse en una vida media cercana a la misma vía que la de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan para aumentar en un área bajo la concentración en la curva de tejido tumoral -tiempo de 3.9 veces (Figura 26) . En la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, una concentración de SN-38G en los tejidos tumorales alcanzó una concentración máxima en el tejido tumoral a los 10 minutos después de la administración, y luego disminuyó gradualmente. En la formulación de CPT-11, la concentración aumentó gradualmente, y alcanzó una concentración máxima en el tejido corporal a las 12 horas después de la administración y luego disminuyó gradualmente (Figura 27) . Por lo tanto, se confirmó que las propiedades acumulables en la sangre y las propiedades transicionales del tumor en la formulación de CPT-11 fueron mayores que las de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan .

[Ejemplo 11] Una formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 7 se ensayó como formulación de CPT-11 que tiene un portador alto en la presente invención. (Ejemplo de Ensayo 13) Efecto antitumoral debido a la administración de un fármaco tres veces Un fibrosarcoma de ratón (Meth A), 2.5 x 105 células/ratón se transplantó a la parte subcutánea inguinal de un ratón (BALB/c, hembra, 7 semanas de vida, CLEA Japan, Inc.). La formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 7 o una solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan se inyectaron a una vena caudal tres veces en total, es decir, a los 7, 9 y 11 días o a los 7, 11 y 15 días después de transplante de los tumores. Se empleó como grupo de control un ratón sin inyección de fármaco. También se extrajeron los tumores después de 21 días del transplante y se pesaron los tumores, para calcular de este modo el régimen de inhibición de proliferación de cada tumor, I.R. (%) mediante la fórmula que se muestra en el Ejemplo de Ensayo 6. El resultado se muestra en la Tabla 14. En el fibrosarcoma de ratón, la formulación de CPT- 11 y la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan mostraron cada una, un efecto inhibidor de proliferación de tumor significativo en relación al del grupo de control.

Además, la formulación de CPT-11 exhibió un efecto antitumoral más alto que el de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan. Además, ninguno de los fármacos afectó el peso corporal del ratón.

Tabla 14 Peso del Dosis Tratamiento Régimen de tumor (g, (mg/kg) en los días promedio + inhibición S.D. ) (%) Grupo de 2.01 + 0.30 Control Formulación de CPT-11 50 7,9,11 0.20 + 0.17 89.9 (Ejemplo de Preparación 7) 100 7,9,11 0.08 + 0.01 96.2 Solución acuosa 50 7,9,11 1.47 + 0.18 26.9 salina de clorhidrato de 100 7,9,11 0.28 + 0.42 86.0 irinotecan Solución 50 7,9,11 1.47 + 0.1Í 26.9 acuosa salina de clorhidrato de irinotecan 100 7,9,11 0.28 + 0.42 86.0 Formulación de CPT-11 50 7,11,15 0.81 + 0.47 59.6 (Ejemplo de Preparación 7) 100 7,11,15 0.16 + 0.12 92.3 Solución acuosa 50 7, 11, 15 1.99 + 0.47 1.0 salina de clorhidrato de irinotecan 100 7,11, 15 1.26 + 0.49 37.4 (Ejemplo de Ensayo 14) Efecto antitumoral debido a la administración de un fármaco una o dos veces Se transplantó un fibrosarcoma de ratón (Meth A) , 2.5 x 105 células/ratón a la parte subcutánea inguinal de un ratón (BALB/c, hembra, 7 semanas de vida, CLEA Japan, Inc.) . La formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo de Preparación 7 o una solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan se inyectaron a la vena caudal a los 7 y/u 11 días una o dos veces en total después de transplante de tumores . Se empleó como grupo de control un ratón sin inyección de fármaco . Los tumores fueron también extraídos al cabo de 21 días desde el transplante y se pesaron los tumores, para calcular de este modo el régimen de inhibición de proliferación del tumor, I.R. (%) mediante la fórmula que se muestra en el Ejemplo de Ensayo 6. El resultado se muestra en la Tabla 15. En el fibrosarcoma de ratón, la formulación de CPT-11 y la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan mostraron cada una, un efecto inhibidor significativo de proliferación del tumor en relación al del grupo de control, por lo menos una parte de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan. Además, algunas de las formulaciones de CPT- 11 exhibieron un efecto antitumoral más alto que el de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan. Además, ninguna de ambos fármacos afectó el peso corporal del ratón. Tabla 15 Dosis Tratamiento Peso del Régimen de (mg/kg) en los días tumor (g, inhibición promedio + (%) S D ) Grupo de Control - - 3.53 + 0.25 - Formulación de 12.5 7 1.95 + 0.29 44.7 CPT-11 (Ejemplo de Preparación 7) 25 7 1.77 + 0.61 49.8 50 7 1.06 + 0.38 70.1 Solución acuosa 12.5 7 2.82 + 0.51 26.9 salina de clorhidrato de irinotecan 25 7 2.61 + 0.40 26.0 50 7 2.34 + 0.17 33.7 Formulación de 25 11 1.70 + 0.81 51.8 CPT-11 (Ejemplo de Preparación 7) 50 11 1.41 + 0.42 60.2 Solución acuosa 25 11 2.40 + 0.74 32.1 salina de clorhidrato de irinotecan 50 11 1.98 + 0.45 44.0 Formulación de 12.5 7,11 1.95 + 0.19 44.8 CPT-11 (Ejemplo de Preparación 7) 25 7,11 1.63 + 0.39 54.0 50 7,11 0.65 + 0.13 81.6 Solución acuosa 12.5 7,11 2.49 + 0.29 29.4 salina de clorhidrato de irinotecan 25 7,11 2.33 + 0.62 34.1 50 7,11 2.08 + 0.43 41.2 Ejemplo 12 La formulación de CPT- 11 preparada en el Ejemplo de Preparación 8, se ensayó como formulación de CPT- 11 que tiene un portador de la presente invención. (Ejemplo de Ensayo 15) Efecto antitumoral Células de cáncer de pulmón humano (QG56) con 2 a 3 mm cuadrados fueron transplantados a una parte subcutánea inguinal de un ratón (BALB/c desnudo, macho, de 6 semanas de vida, CLEA Japan, Inc.) con una aguja para transplante. La formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de Preparación 8 o una solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, se inyectó a una vena caudal tres veces en total, en un punto en el que (día 1) el volumen estimado del tumor se calculó en 1/2 " ab2 (a se refiere al eje principal de un tumor, b se refiere a un eje menor) cercano a alrededor de 1 mm3, 4 días adicionales (día 5) y 8 días adicionales (día 9) , después del transplante de tumores. Se empleó como grupo de control un ratón sin inyección de fármaco. El volumen estimado de cada tumor y el peso corporal del ratón se calcularon a los 4, 8, 12, 16 y 21 días después de la primera inyección. También se extrajeron tumores a los 21 días después de la primera inyección, y se pesaron los tumores, para calcular de esta manera el régimen mediante la fórmula que se muestra en el Ejemplo de Ensayo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 16, figura 28 y en la Figura 29. En las células de carcinoma pulmonar humano, la formulación de CPT-11 y la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecan, mostraron un significativo efecto inhibidor de la proliferación del tumor en relación al del grupo de control. Además, la formulación de CPT-11 exhibió un efecto antitumoral más elevado que el de la solución acuosa salina de clorhidrato de irinotecann (Tabla 16, Figura 28). Además, ninguno de los fármacos afectó el peso corporal del ratón (Figura 29) .

Tabla 16 Dosis Peso del Régimen de (mg/kg) tumor (g, inhibición promedio + (%) S.D. ) Grupo de Control 2.91 + 0.21 Formulación de 25 0.03 + 0.02 99.0 CPT-11 (Ejemplo de Preparación 8) 50 0.02 + 0.00 99.3 100 0.03 + 0.02 99.1 Solución salina 25 1.88 + 0.43 35.5 acuosa de clorhidrato de 50 1.49 + 0.51 48.7 irinotecan 100 0.95 + 0.18 67.2

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. Formulación de irinotecan caracterizado porque incluye una vesícula cerrada formada por una membrana de lípidos, en la que el irinotecan y/o una sal del mismo están encapsulados en una concentración de por lo menos 0.07 mol/mol (mol de fármaco/mol de lípido total de la membrana) .
2. 2. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación de irinotecan tiene un gradiente iónico comprendido entre la fase acuosa interna y la fase acuosa externa de la vesícula cerrada .
3. 3. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el gradiente iónico es un gradiente de concentración de protones, que tiene un gradiente de pH en el que el valor de pH de la fase acuosa interna es inferior al valor de pH de la fase acuosa externa.
4. 4. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el gradiente de pH se forma mediante un gradiente de concentración de ion amonio y/o un gradiente de concentración de un compuesto orgánico que tiene un grupo amino capaz de ser protonado.
5. 5. Formulación de irinotecan de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la vesícula cerrada es un liposoma formado por una membrana de una bicapa de lípidos que contiene un fosfolípido co o componente principal de la membrana.
6. 6. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el liposoma contiene además un lípido distinto del fosfolípido y/o un agente modificador de superficie.
7. 7. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque únicamente la superficie externa del liposoma está modificada con un agente modificador de superficie que contiene un polímero hidrofílico. 8. Formulación de irinotecan de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada además porque comprende un compuesto que tiene un grupo funcional básico como agente modificador de superficie. 9. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende la formulación de irinotecan de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8. 8.