KR101646181B1 - 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물 - Google Patents

이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물 Download PDF

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우드 딘 파카르
김동욱
김동식
용철순
김종오
오유경
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한양대학교 에리카산학협력단
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Abstract

본 발명은 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제에 관한 것으로서, 이리노테칸 및 지질을 포함하는 나노입자; 하이드로 겔; 및 안정화제를 포함하는 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물이다.

Description

이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물 {Composition of irinotecan-loaded dual-reverse thermosensitive hydrogel}
본 발명은 유효 성분으로서 이리노테칸을 포함하는 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 이리노테칸을 함유한 온도감응성 고형지질 나노입자를 온도감응성 수용성 겔에 분산시킨 근육주사용 또는 직장투여용 제제이다. 즉, 온도감응성 수용성 겔은 폴록사머 2종 이상 및 안정화제인 트윈 80을 혼합하여 겔화온도가 30 내지 36 가 되도록 제조하고, 여기에 유효성분으로서 이리노테칸, 그리고 트리카프린 및 트리에탄올아민 등의 혼합 지질을 혼합하여 제조한 융점이 30 내지 36 가 되는 온도감응성 고형지질 나노입자를 분산시킨 제제이며, 실온에서는 고형지질 나노입자 및 수용성 겔은 고형 및 액상으로 각각 존재하다가 체내에서는 각각 액상 및 겔로 상반된 상으로 변함으로서 이리노테칸의 방출을 이중으로 조절하여 약물의 초기 다량 방출효과(burst effect)을 해결하고 독성 약물인 이리노테칸의 근육 조직과의 직접적인 접촉을 방지함으로써 직장 및 근육 조직의 손상을 주지 않음으로써 점막의 손상을 개선함과 동시에 직장투여에서는 약효를 증가시키고 근육투여에서는 서서히 약물을 방출시켜 약효를 오랫동안 유지시켜줄 수 있는 근육주사용 또는 직장투여용 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물에 관한 것이다.
이리노테칸은 수용성인 캡토테신 유도체로서 토포아이소메라제-1 효소를 억제함으로써 탁월한 항암효과를 나타낸다. 이리노테칸은 현재 대장암이나 직장암에 많이 사용되는 항암제로서 (Marschner et al., 2015) 정맥으로 점적용 주사제로서 시판되고 있다 (Iyer et al., 2002). 그러나 이 제품은 일반적인 항암제가 가지고 있는 항암 부작용을 많이 내포하고 있다. 또한 현재 이리노테칸 등 독성약물을 수용성 겔에 봉입하여 근육 주사를 하여 약물을 서서히 방출하여 약효를 증가시키는 연구를 하고 있으나(Xuan 등, 2010) 이러한 수용성 겔 제제는 약물을 서서히 방출시키면서 생체이용률을 크게 증가시키는 제제이나 초기에 약물이 높은 농도로 방출되는 초기 다량 방출효과(burst effect)에 의해 매우 높은 혈중 약물농도를 나타내는 약물의 부작용이 나타날 우려가 있고 또한 독성 약물이 근육 조직에 직접 접촉을 하기 때문에 장기간 사용할 경우 근육 조직을 크게 손상시킬 수 있다는 문제점을 가지고 있다.
따라서, 독성 약물인 이리노테칸의 약효를 지속시킴과 동시에 약물의 초기 다량 방출효과 및 생체 조직에 대한 안전성을 개선할 수 있는 새로운 제제의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 유효성분으로서 이리노테칸 및 융점이 30 내지 36℃인 트리카프린, 트리에탄올아민 또는 이들의 혼합 지질을 포함하는 나노입자; 폴록사머 188, 폴록사머 407 또는 이들의 혼합물; 및 안정화제를 포함하고 겔화 온도가 30 내지 36℃인 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물 및 제제를 제공하여 약물의 초기 방출 조절 및 생체 조직에 대한 안전성을 개선하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 유효성분으로서 이리노테칸과 트리카프린, 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되며, 융점이 30 내지 36℃인 지질을 포함하는 나노입자; 폴록사머 188, 폴록사머 407, 또는 이들의 혼합물; 및 트윈 80을 포함하는 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물로서 상기 조성물의 겔화 온도가 30 내지 36℃인, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물의 전체 중량을 기준으로 상기 이리노테칸을 0.1 내지 5중량%; 상기 트리카프린, 상기 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합 지질을 5 내지 9.9중량%; 상기 폴록사머 188, 상기 폴록사머 407, 또는 이들의 혼합물을 30 내지 34중량%; 및 상기 트윈80을 2 내지 6 중량%으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합 지질은 트리카프린 및 트리에탄올아민이 99.9:0.1 내지 10:90으로 비율로 혼합된 지질일 수 있다. 또한 바람직하게는, 상기 폴록사머 188 및 폴록사머 407를 모두 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 근육 또는 직장에 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 유효성분으로서 이리노테칸 및 융점이 30 내지 36℃인 트리카프린, 트리에탄올아민 또는 이들의 혼합 지질을 포함하는 나노입자; 폴록사머 188, 폴록사머 407 또는 이들의 혼합물; 및 안정화제를 포함하고 겔화 온도가 30 내지 36℃인 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제를 제공한다.
바람직하게는, 상기 안정화제는 트윈 80이다.
바람직하게는 상기 제제는 유효성분으로서 이리노테칸 0.1 내지 5중량% 및 융점이 30 내지 36℃인 트리카프린, 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합 지질을 5 내지 9.9중량% 포함하는 나노입자; 폴록사머 188, 폴록사머 407, 또는 이들의 혼합물을 30 내지 36중량%; 및 트윈 80을 2 내지 6중량%로 포함하고 겔화 온도가 30 내지 36℃인 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제이다.
더욱 바람직하게는 상기 혼합 지질은 트리카프린 및 트리에탄올아민이 99.9:0.1 내지 10:90으로 비율로 혼합된 지질일 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 폴록사머 188 및 폴록사머 407를 모두 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 상기 제제는 근육 또는 직장에 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자는 약물 및 지질을 함유하며, 상기 나노입자의 크기는 계면활성제에 따라 달라질 수 있고, 바람직하게는 130 내지 170nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 135 내지 140nm일 수 있다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제에는 유효성분으로서 이리노테칸을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 상기 제제의 전체 중량을 기준으로, 상기 이리노테칸을 0.1 내지 5중량%로 포함될 수 있다. 만일, 유효성분의 함량이 0.1 중량% 미만이면 약물이 효과적으로 약효를 나타나기 위하여 매우 많은 용량을 투여하여야 한다. 이중역상 온도감응성 제제의 나노입자의 침전 문제 등의 물리적 안정성을 고려하여, 상기 약물의 함량범위를 적절히 선택한다. 예를 들면, 5 중량%를 초과하면 지질 나노입자의 함유량도 10% 이상으로 증가함으로써 지질 나노입자가 침전을 발생하는 등 물리적 안정성에 문제점을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제에는 지질을 포함하며, 바람직하게는 트리카프린, 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 지질은 약물의 함유량의 2배 이상이 되어야 하며 이리노테칸의 함유량을 고려하여 본 발명의 이중역상 온도 감응성 제제의 전체 중량을 기준으로 5 내지 9.9 중량%으로 함유될 수 있다. 혼합 지질은 약물의 함유량의 2배 미만일 경우에는 약물의 봉입효율이 크게 떨어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 이중역상 온도감응성 제제의 전체 중량을 기준으로, 상기 지질을 5 내지 9.9 중량%으로 함유할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 상기 지질은 트리카프린 및 트리에탄올아민으로 이루어진 군에서 1 이상 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 트리카프린 및 트리에탄올아민 혼합물을 99.9:0.1 내지 10:90의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제에는 고분자 하이드로겔을 포함한다. 바람직하게는 상기 고분자 하이드로겔은 폴록사머일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 고분자 하이드로겔은 폴록사머 188 및 폴록사머 407로 이루어진 군에서 1 이상 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 상기 이중역상 온도감응성 제제의 전체 중량을 기준으로, 상기 고분자 하이드로겔을 30 내지 34중량%로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 수용성 겔 제형 중에서 기제로서는 독성을 일으키지 않는 폴록사머 188 및 폴록사머 407 중 1 종 이상을 사용하며 본 발명의 이중역상 온도감응성 제제 중에 30 내지 34 중량%를 함유하여 겔화 온도가 30 내지 36 ℃이다. 만일 상기 폴록사머 혼합기제가 34중량% 초과일 경우 겔화 온도가 30 ℃ 미만이 되어 이중역상 온도감응성 제제가 실온에서 겔화 상태이기 때문에 투여가 매우 힘들며, 30 중량% 미만으로 포함될 경우 겔화 온도가 36 ℃를 초과하여 체내에서도 액체상으로 유지하여 약물의 용출을 효과적으로 조절하지 못하여 초기 과량 약물 방출 현상을 개선하지 못하고 약물의 직접적인 생체 조직 접촉을 막지 못한다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제는 이리노테칸 약물 및 지질을 함유하는 나노입자가 상기 고분자 하이드로 겔에 포함되며 겔화 온도가 30 내지 36℃인 특성을 가질 수 있다. 상기 고분자 하이드로 겔에 포함된 나노입자는 혼합, 분산, 혼탁되어 존재할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는 상기 나노입자에 포함된 지질은 융점이 30 내지 36℃일 수 있다. 혼합 지질의 융점이 30 ℃ 미만일 경우 지질 나노입자가 실온 및 체온에서 액체 상태로 있기 때문에 폴록사머 기제와 실온에서 서로 혼합이 되어 이중역상 온도 감응성 수용성 겔 제제가 파괴된다. 또한, 혼합 지질의 융점이 36 ℃를 초과할 경우에는 체내에서도 고형상태를 유지하고 용융이 되지 않아 약물을 방출하지 않아서 약효를 발휘할 수 없다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제는 안정화제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 안정화제는 폴리소르베이트(polysorbate)계 안정화제일 수 있으며, 예를 들면 트윈 20(폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우르산), 트윈 40(폴리소르베이트 40, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미트산), 트윈 60(폴리소르베이트 60, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아르산) 및 트윈80(폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레산)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 안정화제는 트윈 80일 수 있다. 바람직하게는 상기 트윈 80을 2 내지 6중량%로 포함할 수 있다. 트윈 80을 6중량% 초과하여 포함하는 경우 겔화 온도가 30 ℃ 미만이 되어 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물이 실온에서 겔화 상태이기 때문에 직장 투여가 매우 힘들다. 또한 2중량% 미만으로 포함하는 경우 겔화 온도가 36 ℃를 초과하여 체내에서도 액체상으로 유지하여 약물의 방출을 효과적으로 조절하지 못하여 초기 과량 약물 방출 현상을 개선하지 못하고 약물의 직접적인 근육 조직 접촉을 막지 못할 수 있으며, 온도감응성 지질 나노입자가 서로 달라붙어 응집체 (aggregate)를 형성함으로써 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물의 물리적 안정성 등에 문제점을 일으킨다.
본 발명에 따른 이중역상 온도감응성 제제는 경구, 경피, 피하, 정맥 직장 또는 근육을 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육 또는 직장에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제는 통상의 당업자들에게 잘 알려진 통상의 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이리노테칸을 함유한 지질 나노입자를 온도감응성 수용성 겔을 포함하는 제제는 이중역상 온도 감응성 특성으로 약물을 방출함으로써 이리노테칸의 약효성을 증가시키고 종래의 수용성 겔에 비해 약물의 초기 다량 방출효과 및 생체 조직에 대한 안전성을 개선한 매우 우수한 제제를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제 및 체내 투여시 이중역상 현상을 간략히 도시화한 도면이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제의 용출시험을 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 제제의 쥐에 직장 투여(1) 및 근육 투여(2)한 후 혈중농도 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물의 종양 유발 마우스에 반복적인 직장 투여 후의 종양 크기(1) 및 체중 감소 곡선(2)을 나타낸 것이다.
도 5는 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물의 종양 유발 마우스에 반복적인 근육 투여 후의 종양 크기(1) 및 체중 감소 곡선(2) 을 나타낸 것이다.
도 6은 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물의 쥐에 직장 투여 후 직장 조직 (1) 및 근육 투여 후 근육 조직 (2) 의 사진을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 지질 물질의 단독 또는 혼합물의 융점 측정
지질물질을 단독 또는 혼합하여 열분석기(differential scanning calorimetry, DSC Q20; TA Instruments, New Castle, DE, USA)로 융점을 측정하였고, 사용한 지질물질을 표 1에 나타내었다. 그 결과 실험된 지질들 중에서 트리카프린 및 트리에탄올아민을 중량 %로서 10:90 내지 100:0로 혼합할 경우 융점이 하나로 나타나 서로 분리되지 않으며 융점이 32-34 ℃이었다. 따라서, 실온에서는 고형 상태이고 체온에서는 액상으로 유지되는 트리카프린 및 트리에탄올아민 지질을 온도감응성 지질로 선정하였다.
　지질물질 비율(중량%) 융점(°C)
캠프리톨
(Compritol)		 폴리에틸렌글리콜
(PEG 400)		 5:5 72.5　
트윈 80
(Tween 80)		 5:5 68 및 79(두 피크로 분리)
프로필렌글리콜
(Propylene glycol)		 5:5 69
3:7 68
4:6 68
6:4 69
7:3 68
트리미리스틴
(Trimyristin)		 프로필렌글리콜 5:5 58
2:8 58.5
3:7 59
트리카프린
(Tricaprylin)		 트리라우린 5:5 11.5 및 44.5(두 피크로 분리)
트리미리스틴 5:5 11.5 및 56(두 피크로 분리)
트리에탄올아민
(Triethanolamin)		 트리라우린 5:5 48
트리카프린 5:5 11
트리미리스틴 5:5 59
트리라우린 5:5 21 및 49(두 피크로 분리)
트리카프린 10:0 22.6
9:1 32.5
8:2 32.3
7:3 33.6
5:5 33.3
3:7 33.0
1:9 32.5
0:10 32.3
Trilaurin　
(트리라우린)		 트리카프린 5:5 11.5 및 44.5(두 피크로 분리)
6:4 31.5 및 46(두 피크로 분리)
프로필렌글리콜 3:7 46.5
실시예 1 내지 8: 이중역상 온도 감응성 수용성 겔 제형 제조
트리카프린 및 트리에탄올아민을 온도조절용 용기에 넣고 약 45 ℃에서 녹이고 여기에 이리노테칸을 완전히 혼합시켜 지질 나노입자를 제조하였다. 이 때, 트리카프린 및 트리에탄올아민의 함량은 하기 표 2에 나타낸 함량으로 제조하였다. 상기 지질 나노입자를 폴록사머 188, 폴록사머 407 및 트윈 80을 물에 녹인 폴록사머 용액 일부에 첨가하고 고압유화기(Ultra-Turrax, IKA, Guangzhou, China)에서 유화한 후 나머지 폴록사머 용액을 첨가하고 잘 혼합하여, 실시예 1 내지 8의 이중역상 온도감응성 수용성 겔 제형을 제조하였다.
항목 실시예
1 2 3 4 5 6 7 8
이리노테칸(g) 1.0 0.1 5.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
지질(g) 트리카프린 7.2 9.9 1.0 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2
트리에탄올아민 1.8 0 4.0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
폴록사머(g) P188 15 15 15 15 16 15 15 16
P407 17 17 17 15 18 17 17 18
트윈 80(g) 4 4 4 4 4 2 6 6
물(g) 54 54 54 56 52 56 52 50
합계(g) 100 100 100 100 100 100 100 100
비교예 1 내지 5: 이중역상 온도감응성 수용성 겔 제형 제조
트리에탄올아민, 트리카프린 및 트리에탄올아민 혼합물을 온도조절용 용기에 넣고 약 45 ℃에서 녹이고 여기에 이리노테칸을 완전히 혼합시켜 지질 나노입자를 제조하였다. 이 때, 트리카프린 및 트리에탄올아민의 함량은 하기 표 3에 나타낸 함량으로 제조하였다.
상기 지질 나노입자를 폴록사머 188, 폴록사머 407, 트윈 80을 물에 녹인 폴록사머 용액 일부에 첨가하고 고압유화기(Ultra-Turrax, IKA, Guangzhou, China)에서 유화한 후 나머지 폴록사머 용액을 첨가하고 잘 혼합하여 비교예 1 내지 5의 제형을 제조하였다.
항목 비교예
1 2 3 4 5
이리노테칸(g) 5.5 1.0 1.0 1.0 1.0
지질(g) 트리카프린 4.8 0 7.2 7.2 7.2
트리에탄올아민 1.2 9.0 1.8 1.8 1.8
폴록사머(g) P188 15 15 17 15 15
P407 14 14 18 17 17
트윈 80(g) 4 4 4 1.5 6.5
물(g) 55.5 57.0 51.0 56.5 51.5
합계(g) 100 100 100 100 100
시험예 1: 지질 나노입자의 융점
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 5의 지질 나노입자를 가지고 열분석기(differential scanning calorimetry, DSC Q20; TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 가지고 융점을 측정하였다(표 4).
그 결과 실시예 1 내지 8 및 비교예 1, 3 내지 5에서 지질 나노입자는 이리노테칸의 양에 상관없이 트리카프린 및 트리에탄올아민이 중량 %로서 10:90 내지 100:0일 경우 융점이 32-34 ℃로서 실온에서는 고형 상태이고 체온에서는 액상으로 온도감응성 지질 나노입자를 형성하였다. 그러나 비교예 2에서는 트리에탄올아민을 단독으로 사용할 경우에는 융점이 22.6도로서 실온 및 체온에서 모두 액체로 존재하여 온도감응성 지질 나노입자를 형성하지 않았다.
구분 융점
(℃)		 봉입효율(×102mPa.s) 겔화 온도
(℃)		 실린지능
(mPa.s)		 겔강도
(×102mPa.s)
실시예 1 32.4 97.9 ±7.7 32.5±0.4 261.1±4.1 100.4±1.7
실시예 2 32.4 97.9 ±7.7 32.4±0.4 264.3±3.8 147.2±3.2
실시예 3 32.1 95.8 ±3.2 33.1±0.4 252.5±5.3 83.4±6.3
실시예 4 32.3 99.3 ±9.6 34.2±0.4 248.4±2.6 90.7±4.3
실시예 5 32.3 97.2 ±4.1 30.9±0.4 289.3±6.3 89.3±4.4
실시예 6 32.4 97.9 ±7.2 34.5±0.4 242.1±1.9 130.2±10.2
실시예 7 32.4 97.9 ±7.4 31.8±0.4 278.4±3.7 141.5±11.1
실시예 8 32.3 96.5 ±4.1 30.4±0.4 293.1±2.6
비교예 1 32.3 65.2 ±9.0 36.7±0.4 221.7±4.9 94.4±3.5
비교예 2 22.6 98.1 ±4.3 36.5±0.4 227.8±3.1 152.6±8.2
비교예 3 32.2 97.6 ±7.8 28.5±0.4 331.9±6.5 48.3±6.3
비교예 4 32.4 97.9 ±7.7 36.9±0.4 321.2±4.2 43.2±5.2
비교예 5 32.3 96.7 ±3.8 29.1±0.4 318.6±2.3
시험예 2: 지질 나노입자의 봉입효율
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 5의 지질 나노입자 1 g을 생리식염수 4 ml에 첨가하고 교반한 다음 10 분 동안 20,000 g에서 원심분리하여 상등액을 취했다. 이 상등액(20 μl)를 HPLC(Agilent 1260 Infinity; Santa Clara, CA, USA)로 봉입되지 않은 이리노테칸을 정량하였다. 이 때 컬럼은 inertsil ODS-4 C18(GL Science, 5 μm, 4.6 x 250 mm)을 사용하였으며 이동상은 인산이수소나트륨(pH 3.1) 및 아세토니트릴(50:50, 중량%)의 혼액을 사용하였고, 컬럼 온도를 40℃로, 유속은 1.0 ml/min, UV 파장은 254 nm이었다. 봉입효율(%)은 총 이리노테칸의 양에 대한 봉입된 양의 비율로 계산하였다(표 4). 그 결과 실시예 1 내지 8 및 비교예 2 내지 5와 같이 지질 나노입자는 이리노테칸의 양이 지질보다 적을 경우, 즉, 지질 나노입자 총 중량의 50% 이하일 경우 봉입효율이 90% 이상 나타났다. 그러나 비교예 1과 같이 이리노테칸의 양이 지질 나노입자 총 중량의 50%를 초과할 경우에는 봉입효율이 70%로 크게 낮아졌다.
시험예 3: 온도감응성 수용성 겔 함량에 따른 겔화 온도
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 5의 이중역상 온도감응성 수용성 겔 2 g을 가지고 10 ml 용기에 마그네틱바와 함께 넣고 4 ℃의 항온조에 장치한 다음 마그네틱바와 접촉하지 않도록 디지탈 온도계를 시료에 꽂고 일정속도로 교반하면서 온도를 1 ℃/분의 속도로 상승시키면서 마그네틱바가 완전히 멈추는 온도를 겔화 온도로 하였다(표 4). 그 결과 실시예 1 내지 8과 같이 폴록사머 188 및 폴록사머 407의 양이 총 중량의 30 내지 34중량%이고 트윈 80이 2 내지 6중량%일 경우 겔화 온도가 30-36℃이었으며 실온에서는 액상이고 체온에서는 겔로 변화는 온도감응성 수용성 겔을 형성하였다. 그러나 비교예 3 내지 5와 같이 폴록사머 188 및 폴록사머 407의 양이 총 중량의 34%가 초과하거나 트윈 80이 6중량%를 초과할 경우 겔화 온도가 30 ℃ 이하로 실온 및 체온에서 모두 겔상으로 존재하여 온도감응성 수용성 겔을 형성하지 않았다. 그러나 비교예 1, 2, 및 4와 같이 폴록사머 188 및 폴록사머 407의 양이 총 중량의 30% 미만이거나 트윈 80이 2중량% 미만일 경우 겔화 온도가 36 ℃ 이상이어서 실온 및 체온에서 모두 액상으로 존재하여 마찬가지로 온도감응성 수용성 겔을 형성하지 않았다.
시험예 4: 실린지능 측정
상기 실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 5의 이중역상 온도감응성 수용성 겔을 근육 투여가 용이한 점도를 측정하기 위하여 실온에서 점도를 측정한 후, 쥐의 뒷다리 근육에 주사기로 투여 시 주사기와 바늘의 분리 여부를 조사한 결과 점도가 300 mPa 이하일 경우에는 주사기와 바늘이 분리되지 않고 투여가 용이하여 근육 주입이 가능하다고 판단하였다(표 4). 그 결과 실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 2와 같이 폴록사머 188 및 폴록사머 407의 양이 총 중량의 34% 이하이고 트윈 80이 2중량% 이하일 경우에는 근육 주입능이 300 mPa.s 이하로 투여가 용이하였다. 그러나, 비교예 3 내지 5와 같이 폴록사머 188 및 폴록사머 407의 양이 총 중량의 34%를 초과하거나 트윈80이 6중량%를 초과할 경우 근육 주입능이 300 mPa.s 이상으로 투여시 경구용 존데와 주사기가 분리하여 투여가 용이하지 않았다.
시험예 5: 물리적 안정성 확인을 위한 입자크기 측정
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 5의 이중역상 온도감응성 수용성 겔을 25℃ 및 30℃에서 4개월 동안 보관하면서 입자크기 (Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK))를 측정한 결과 트윈 80 2 중량% 미만일 경우 입자크기가 2개월에 약 1,000 nm, 4개월에 약 3,000 nm로 시간이 경과함에 따라 점점 증가하여 유의적인 차이를 보인 반면 트윈 80이 2 중량% 이상일 경우 4개월에도 입자크기가 150-200 nm에서 유의적인 변화를 나타나지 않아 물리적으로 안정한 것을 확인하였다. 상기 결과를 표 5에 나타내었다.
입자크기 (nm)(30℃) 0개월　 4개월
실시예 1 168 ±7 172 ±9
실시예 2 180±16 192±7
실시예 3 179±9 180±11
실시예 4 175±9 193±9
실시예 5 182±5 187±6
실시예 6 178±22 182±9
실시예 7 183±7 169±5
실시예 8 162±3 171±9
비교예 1 159±9 181±12
비교예 2 188±7 192±3
비교예 3 177±10 188±4
비교예 4 174 ±6 2946±369
비교예 5 165± 189±7
시험예 6: 용출 시험
실시예 1(약물 20 mg 해당량)을 이리노테칸 현탁액(1% 약물 함유) 및 이리노테칸 수용성 겔과 함께 각각 반투막에 넣은 다음 패들에 묶어 놓고 물 500ml을 가지고 용출시험기(VISION-6 Classic, Chatsworth, CA, USA)에서 대한약전 일반시험법 중 용출시험법 제 2 법(패들법)에 따라 방출 시험을 수행하였고 주어진 시간에 샘플을 채취하여 상기의 같은 HPLC 방법으로 이리노테칸의 농도를 측정하여 방출율을 계산하였다. 이리노테칸 수용성 겔은 이리노테칸 1%, 폴록사머 407 15%, 폴록사머 188 17%, 트윈 80 4 및 물 54%로 구성하였다. 그 때의 조건은 방출온도는 36.5 ℃, 방출속도는 100 rpm, 방출시간은 8 시간이었다. 방출 그래프는 도 2에 나타내었으며 실시예 1은 약물용액 및 이리노테칸 수용성 겔보다 방출율이 유의적으로 감소되었으며 특히, 방출율이 초기 농도가 매우 유의적으로 감소됨을 볼 수 있다. 또한 약물은 8시간 동안 서서히 방출되었다. 따라서, 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 일반적인 수용성 겔과는 다르게 온도감응성 고형지질 및 온도감응성 수용성 겔에 의해 이중으로 이리노테칸과 같은 약물의 방출을 조절함으로써 초기의 약물 과량 방출을 해결하였다.
시험예 7: 체내동태
Sprague-Dawley 수컷 쥐(체중, 250 ± 20 g) 36마리를 실험 전 24-36 시간 동안 절식 시킨 다음 실시예 1을 쥐 6 마리의 직장 안쪽 4cm 부근에 2 ml/kg(이리노테칸 25 mg/kg) 만큼 삽입하였다. 또한, 대조군(control)로서 이리노테칸 용액 (1% 약물 함유)을 정맥투여하고 이리노테칸 수용성 겔은 실시예 1과 같은 방법으로 각각 쥐 6 마리에 동일한 방법으로 직장 투여하였다. 아울러, 실시예 1을 쥐 6 마리의 다리 근육에 2 ml/kg(이리노테칸 25 mg/kg) 만큼 삽입하였다. 그리고, 대조군(control)로서 이리노테칸 용액 (1% 약물 함유) 및 이리노테칸 수용성 겔은 각각 쥐 6 마리에 동일한 방법으로 근육 투여하였다. 이리노테칸 수용성 겔은 이리노테칸 1%, 폴록사머 407 15%, 폴록사머 188 17%, 트윈 80 4 및 물 54%로 구성되어있다. 주어진 시간에 오른쪽 대퇴부 동맥을 통하여 0.2 ml의 피를 채취한 다음 원심분리하여 얻은 혈장(150 ㎕)에 내부표준액인 캠포테신(100 ㎍/㎖, 아세토니트릴) 150 ㎕을 첨가하고 13,000 g에서 10분 동안 원심분리하고 단백질을 침전시키고 상등액을 취하였다. 이 상등액(10 μl)을 고속액체크로마토그라프 (HPLC, Agilent 1260 Infinity, Agilent Technologies; Santa Clara, CA, USA; ODS-4 C18(GL Science, 5 μm, 4.6 x 150 mm)로, 컬럼온도를 40℃로 이동상은 인산이수소나트륨 (pH 3.1) 및 아세토니트릴(50:50, 중량%) 혼합용액을, 유속은 1 ml/min, UV 흡광치는 254 nm로 혈중 이리노테칸의 농도를 정량하였다.
실시예 1의 직장투여 후의 혈중 농도 그래프는 도 2에 나타내었으며 체내동태 파라미터는 표 6과 같았다. 실시예는 수용성 겔보다는 유의적인 차이는 없었으나 초기 혈중농도가 낮았으며 AUC 값도 유의적인 차이는 없었으나 약간 증가하였다. 아울러 약물용액의 정맥투여와 비교할 경우 절대생체이용율이 약 45%로 수용성 겔의 40%보다 약간 증가하였다. 실시예 1과 같은 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물을 직장 투여할 경우 일반적인 수용성 겔과는 다르게 온도감응성 고형지질 및 온도감응성 수용성 겔에 의해 이중으로 이리노테칸의 용출을 조절함으로써 초기 혈중농도가 낮은 반면 생체이용율은 약간 증가한 것으로 보아 생체이용율의 증가를 하면서 이리노테칸의 부작용이 수용성 겔보다 조금밖에 나타나지 않을 것으로 판단된다.
파라메타 약물용액
(정맥투여)		 수용성 겔
(직장투여)		 실시예 1
(직장투여)
AUC (μg·h/ml) 104.29 ± 29.58 39.38 ± 7.90 45.18 ± 12.67
Tmax(h) - 1.41 ± 0.20 1.91 ± 0.20*
Cmax (μg/ml) 83.68 ± 8.86 11.15 ± 1.03 11.42 ± 0.88
t1/2 (h) 0.92 ± 0.28 4.16± 2.41 4. 61± 2.06
Kel (h-1) 0.79 ± 0.20 0.19± 0.09 0.18± 0.09
각 값은 평균±표준편차로 표시함(n=6).
약물용액 (정맥투여)및 수용성 겔(직장투여)과 비교시 유의성 *P<0.05.
실시예 1의 근육내 투여 후의 혈중 농도 그래프는 도 4에 나타내었으며 체내동태 파라미터는 표 7과 같았다. 실시예 1는 약물용액 및 수용성 겔보다는 혈중농도, AUC 및 Cmax 값이 유의적으로 낮았으며 특히 초기 혈중농도가 유의적으로 매우 감소함을 보였다. 또한, 실시예 1의 혈중농도는 2시간부터 48시간까지 약 10 μg/ml이 계속적으로 유지되었다. 일반적으로 높은 Cmax는 약효를 증가시키지마는 약물의 고유 부작용도 증가시키기 때문에 실시예 1의 낮은 Cmax 값은 이리노테칸의 고유 부작용을 감소시킨다. 즉, 수용성 겔 안의 약물은 용출이 매우 빨라서 흡수가 빨라 높은 Cmax 값을 나타내어 항암 독성약물인 이리노테칸의 많은 부작용을 나타낸다. 그러나, 실시예 1은 일반적인 수용성 겔과는 다르게 체내에서 액상으로 변한 고형지질과 겔로 변한 수용성 겔에 의해 이중으로 이리노테칸의 방출을 조절함으로서 초기 약물과량 방출없이 약물이 서서히 방출됨에 따라 흡수됨으로서 낮은 농도로 약물이 48시간 계속 지속된다. 따라서, 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 투여후 이리노테칸의 항암 부작용을 나타내지 않으면서 48시간 동안 지속적으로 약효를 발현시킬 수 있다.
파라미터 약물용액
(근육투여)		 수용성 겔
(근육투여)		 실시예 1
(근육투여)
AUC (μg·h/ml) 1034.91 ± 71.70 758.98 ±115.57* 724.02 ± 117.21*
Tmax (h) 2.16 ± 0.40 1.83 ± 0.75 2.83 ± 0.40*
Cmax (μg/ml) 17.70 ± 1.80 11.86 ± 1.96* 10.05 ± 1.49*
t1/2 (h) 11.93 ± 1.95 11.88 ± 1.50 10.50 ± 1.66
Kel (h-1) 0.06 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01
각 값은 평균±표준편차로 표시함(n=6).
약물용액 (근육 투여)및 수용성 겔(근육 투여)과 비교시 유의성 *P<0.05.
시험예 8: 항암 및 부작용 실험
인간 상피성암종 KB 세포(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)를 24-웰 플레이트에 8×104 cells/well 밀도로 도포하여 항암 효율을 관찰하였고 다음날, 60-70% 컨플루언스를 이루는 시점에서 DMEM 세포 배양 배지를 신선한 배양 배지(500 μl/well)로 교체하였다. 5주령의 늙은 마우스 48마리에 0.1 ml 완충용액 중 1 x 106 KB cells을 피하로 오른쪽 뒤측면에 주입하였고 이 날을 0일(0 day)로 지정하였다. 종양의 차원을 측정하여서 종양 크기가 100-150 mm3 (day 7)에 도달하였을 때, 종양 이식 마우스들을 임의로 8 그룹으로 나누고 실험하였다. 4 그룹의 마우스들에게 각각 직장으로 실시예 1, 대조군(control), 이리노테칸 용액 (1% 약물 함유) 및 이리노테칸 수용성 겔을 이리노테칸 5 mg/kg 용량으로 3회 즉, 7일, 10일 및 13일에 각각 투여하였다. 아울러, 다른 4 그룹의 마우스들에게 근육주사로 실시예 1, 대조군(control). 이리노테칸 용액 (1% 약물 함유) 및 이리노테칸 수용성 겔을 이리노테칸 5 mg/kg 용량으로 3회 즉, 7일, 10일 및 13일에 각각 투여하였다. 이 때 대조군(control)은 완충용액 (pH 7.4)이고 이리노테칸 수용성 겔은 이리노테칸 수용성 겔은 이리노테칸 1%, 폴록사머 407 15%, 폴록사머 188 17%, 트윈 80 4 및 물 54%로 구성되어있다. 각 일시마다 종양 이식 마우스의 직장 또는 근육 투여한 실시예 1의 항암효율 및 부작용을 종양 크기 및 체중 감소를 측정함으로써 각각 비교하였다.
실시예 1의 직장투여 후의 종양 크기 및 체중 감소 그래프는 도 4의 (1) 및 (2)에 나타내었다. 실시예 1은 대조군(control) 및 이리노테칸 용액보다 종양크기가 유의적으로 감소하였으며 수용성 겔과 비교시에도 종양크기가 유의적인 차이는 없었으나 약간 감소하였다(도 4의 (1)). 실시예 1은 이리노테칸 용액보다 체중이 유의적으로 감소하지 않았으며 수용성 겔과 비교시에도 종양크기가 유의적인 차이는 없었다 (도 4의 (2)). 또한, 대조군(control) 은 항암제를 투여하지 않았으므로 체중은 감소하기보다는 증가하여 체중 감소 등 부작용을 나타내지 않았다. 실시예 1과 같은 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물을 직장투여할 경우 일반적인 수용성 겔에 비하여 향상된 항암효과를 가지고 있으며 체중감소에 대한 부작용은 유사한 것으로 판단된다.
실시예 1의 근육투여 후의 종양 크기 및 체중 감소 그래프는 도 5의 (1) 및 (2)에 나타내었다. 마찬가지로 근육투여시 실시예 1은 대조군(control) 및 이리노테칸 용액 (1% 약물 함유)보다 종양크기가 유의적으로 감소하였으며 수용성 겔과 비교시에도 종양크기가 유의적인 차이는 없었으나 약간 감소하였다 (도 5의(1)). 또한 실시예 1은 이리노테칸 용액 및 수용성 겔보다 체중이 유의적으로 감소하지 않았다 (도 5의(2)). 일반적으로 높은 Cmax는 약효를 증가시키지마는 약물의 고유 부작용도 증가시키기 때문에 실시예 1의 낮은 Cmax 값은 이리노테칸의 고유 부작용을 감소시킨다. 즉, 수용성 겔 안의 약물은 용출이 매우 빨라서 흡수가 빨라 높은 Cmax 값을 나타내어 항암 독성약물의 부작용인 체중감소가 나타낸다. 그러나, 실시예 1은 일반적인 수용성 겔과는 다르게 체내에서 액상으로 변한 고형지질과 겔로 변한 수용성 겔에 의해 이중으로 이리노테칸의 방출을 조절함으로서 초기 약물과량 방출없이 약물이 서서히 방출됨에 따라 흡수됨으로서 낮은 농도로 약물이 48시간 계속 지속된다. 따라서, 실시예 1과 같은 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물을 근육투여할 경우 일반적인 수용성 겔과 유사한 항암효과를 가지고 있으며 체중감소에 대한 부작용도 크게 향상되는 것으로 판단된다.
시험예 9: 근육의 조직학적 소견
시험예 8의 직장 및 근육 투여후의 체내동태 실험을 종료한 후 실시예 1 및 이리노테칸 수용성 겔을 각각 투여한 쥐의 직장 및 근육 조직을 분리하였고, 식염수 용액으로 세척한 다음 10% 중탄산 완충 포름알데히드액(neutral carbonate-buffered formaldehyde)으로 고정시키고, 엠베딩 기기(embedding centre)를 이용하여 파라핀에 넣고 슬라이스로 잘라서 헤모시아닌-에오신 시약(haematoxylin & eosin)으로 염색하였다. 이 근육 점막을 광학현미경(light microscope, E400, Nikkon, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였으며 조직 상피의 분비선 변화를 관찰하였고, 대조군으로 약물 처리를 하지 않은 직장 또는 근육 조직 상피의 것과 비교하였다.
도 6의 A 내지 C는 쥐에게 실시예 1 및 수용성 겔을 직장 내 투여 후 직장의 조직 사진이며 결과적으로 정상세포와 유의할만한 차이를 나타내지 않았다. 아울러, 표 8는 직장투여 후의 직장의 조직학적 분석을 나타낸 값으로서 실시예 1은 점막두께, 상피두께, 콜라겐 함량 및 단핵셀 수 등에서 정상세포와 유의할만한 변화를 나타내지 않은 것으로 보아 직장투여용 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 직장에 자극이나 손상을 일으키지 않는다고 판단하였다. 따라서 실시예 1과 같은 직장투여용 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 독성약물인 이리노테칸이 온도감응성 고형지질에 봉입되어 있어서 직장과 직접적인 접촉을 시키지 않으므로 직장 점막에 손상을 일으키지 않는다고 사료된다.
조직학 소견 대조군 수용성 겔
(직장 투여)		 실시예 1
(직장 투여)
근육상피 두께 (μm) 287.76±30.40 281.13±25.98 289.70±25.15
근육상피 수 (fibers mm-2) 37.71±6.60 38.19±3.88 38.01±3.64
단핵셀수 (cells mm-2) 38.06±5.18 37.17±5.38 37.69±5.22
콜라겐 함량(% mm-2) 139.33±64.82 151.67±82.63 135.00±64.33
각 값은 평균±표준편차로 표시함(n=9)
도 6의 D 내지 E는 쥐에게 실시예 1 및 수용성 겔의 근육 투여 후 근육의 상피 조직 사진이다. 결과적으로 수용성 겔은 정상세포와 유의적으로 다르며 근육 조직에 손상을 주는 반면 실시예 1은 대조군인 정상세포와 유의할만한 차이를 나타내지 않으면서 근육 조직에 손상을 주지 않았다. 또한, 표 9은 근육 투여 후의 근육의 조직학적 분석을 나타낸 값이다. 수용성 겔은 대조군인 정상세포와 근육섬유 두께가 얇아지는 등 유의적인 차이를 나타내어 근육에 손상을 일으킨다. 그러나 실시예 1은 근육섬유 두께, 근육섬유 수, 단핵셀 수 및 콜라겐 함량 등에서 정상세포와 유의할만한 변화를 나타내지 않은 것으로 보아 근육에 손상을 일으키지 않았다. 따라서, 수용성 겔은 독성 약물인 이리노테칸이 근육 조직과 직접 접촉을 일으키어 근육 조직에 손상을 주나, 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물은 약물이 고형 나노입자에 봉입되어 근육 조직과 직접 접촉을 방지함으로써 근육 조직에 손상을 일으키지 않는다고 판단하였다.
조직학 소견 대조군 수용성 겔
(직장 투여)		 실시예 1
(근육 투여)
근육상피 두께 (μm) 50.11 ± 3.09 18.81 ± 3.38* 48.18 ± 5.67
근육상피 수 (fibers mm-2) 139.56± 9.02 146.44 ± 16.88 143.44 ± 9.00
단핵셀수 (cells mm-2) 12.11 ± 4.14 11.89 ± 4.43 13.44 ± 6.04
콜라겐 함량(% mm-2) 5.94 ± 1.25 5.77 ± 1.13 6.13 ± 3.34
각 값은 평균±표준편차로 표시함(n=9).
대조군과 비교시 유의성 *p <0.01.

Claims (6)

  1. (a) 융점이 30 내지 36℃이며, 트리카프린, 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 지질과, 유효성분으로서 이리노테칸을 함유하는 온도감응성 나노입자; 및
    (b) 폴록사머 188, 폴록사머 407, 또는 이들의 혼합물, 및 트윈 80을 포함하고, 겔화 온도가 30 내지 36℃인 온도감응성 수용성 겔을 포함하는,
    이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물로서,
    상기 조성물의 전체 중량을 기준으로,
    상기 이리노테칸을 0.1 내지 5중량%;
    상기 트리카프린, 상기 트리에탄올아민, 또는 이들의 혼합 지질을 5 내지 9.9중량%;
    상기 폴록사머 188, 상기 폴록사머 407, 또는 이들의 혼합물을 30 내지 34중량%; 및
    상기 트윈80을 2 내지 6 중량%으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 지질은 트리카프린 및 트리에탄올아민이 99.9:0.1 내지 10:90으로 중량비율로 혼합된 지질인, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴록사머 188 및 폴록사머 407를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 근육 또는 직장에 투여되는 것을 특징으로 하는, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 온도감응성 나노입자가 상기 온도감응성 수용성 겔에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는, 이리노테칸 함유 이중역상 온도감응성 수용성 겔 조성물.
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