TWI362931B - Irinotecan formulation - Google Patents
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Description
1362931 九、發明說明 月所屬之技術領域】 本發明係有關將伊立替康(Irinotecan)及/或其鹽高 載持於封閉小泡載體之伊立替康製劑及含其醫藥組成物。 【先前技術】 使用於癌治療之醫藥品範疇之其一的異構酶阻斷劑, 鲁β有例如喜樹驗(camptothecin)者。喜樹驗係於1996年經 由美國之Wall等,自中國原產之植物:喜樹( Camptotheca acuminate)萃取、單離之五環狀生物鹼,被 發現具有高抗腫瘤活性與廣泛之抗腫瘤光譜(參照非專利 文獻1 )。以往之癌化學療法劑係通常藉阻斷II型異構酶以 表現抗腫瘤活性,與之相比,喜樹鹼係藉由阻斷I型異構 酶,阻斷以複製 '修復DNA、重組基因及轉錄來扮演其角 色之異構酶酵素的作用。
做爲藥劑使用時,喜樹鹼係具有一些問題者,其中有 關不溶水性曾有幾個報告提出改良該問題之水溶性喜樹鹼 類似化合物(例如參照專利文獻1 )。其中,於1 994年曾 經達到,在日本國內市販之喜樹鹼水溶性衍生物之伊立替 康鹽酸鹽(CPT-11)雖然爲藥物前體,但因具有高度之抗 腫瘤活性,在醫療領域受到極大之期待》做爲藥物前體之 伊立替康鹽酸鹽係投予後被代謝爲活性體之SN-38 ’具有 抗腫瘤活性。 另一方面,伊立替康及其鹽,因投予後會顯現出抑制 -5- 1362931 骨髓機能、腸胃障礙等重大副作因,對其使用被施予嚴格 之限制。另外,藉由對喜樹鹼及其類似化合物特有之水性 環境中的感受性,該羥基內酯環會被水解,而有減弱 抗腫瘤活性之問題。 爲解決此等問題,欲使用細胞周期特異性代謝拮抗物 質,以喜樹鹼類似化合物進行最適當之抗癌治療時,必須 長期間維持藥劑之局部濃度》惟這類藥劑事實上在靜脈內 Φ鲁或皮下投予後之半衰期只爲較短之數小時而已。此等藥劑. 係以可將治療性濃度之醫藥送達的控制釋出製劑較爲有用 。可以穩定地且有.效率地送達目的病巢部位,爲使其在目 的病巢部位示有抗腫瘤活性,做爲其一途徑,被考慮的是 載持於封閉泡囊形態之載體。已有幾篇有關喜樹鹼類之脂 質體製劑化被提案,例如有報告提出使喜樹鹼含於脂質體 膜中,以抑制α -羥基內酯環之水解(參照例如專利文獻2 、非專利文獻2等)。又,有人揭示將伊立替康鹽酸鹽活 性本體的SN-38含於脂質體之方法(參照非專利文獻3、非 專利文獻4等)。惟SN-38在脂質體中很難安定化,在血液 中會很快地消失,所以很難長期間維持SN-38之血漿中濃 度。 藉被動地封入方法將水溶性衍生物之伊立替康鹽酸鹽 封閉於脂質體中,靜電性地固化其脂質雙重膜使其安定化 之一般方法(被動負荷製料Passive loading法)製造之例 亦曾被提出報告(參照非專利文獻5 )。 [專利文獻1]特公平3-4077號公報 1362931 [專利文獻2]特公平9-504517號公報 [非專利文獻 l]Am. Chem. Sec., 94(1966),388 [非專利文獻 2]Tomas G. Burke 等、Biochemistry, 32(1993),5352-5364 [非專利文獻 3]W. Gao 等、J. of Chromatography B, 791(2003),85-92 [非專利文獻 4]Joshua Williams 等、J. of Controlled ·· Release,9 1 (2003),167-172 [非專利文獻 5]Yasuyuki Sazuka 等、Cancer Letter 127(1998), 99-106 [發明之揭示] [發明欲解'決之課題] 藉由如上述以往被報告之伊立替康鹽酸鹽封入方法( 被動負荷製料法)可使伊立替康鹽酸鹽包含入脂質體的量 係約0.05 (藥劑(莫耳)/總脂質(莫耳)),以此載持量 很難長時間維持伊立替康鹽酸鹽之血漿中濃度,甚至於長 期間維持其活性代謝物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(SN-38) 之血漿中濃度,就臨床效果言並不是充分之濃度。雖可以 脂質體化而見到改善伊立替康鹽酸鹽之血中滯留性,但因 自血中消失之速度仍然極快,就這點而言,仍然很難長時 間維持活性代謝物之S Ν - 3 8的血漿中濃度。 以長時間維持伊立替康鹽酸鹽之活性代謝物的SN-3 8 在血漿中濃度爲目的,將藥物前體之伊立替康及/或其鹽 -7- 1362931 ,以臨床上適當、充分之封入量內封於封閉泡囊中,且在 抑制α -羥基內酯環水解之狀態下長時間存在於血液中, 可以長時間維持活性代謝物之SN-3 8的血漿中濃度之製劑 至今仍未出現。 有鑑於此情況,本發明係以提供做爲達成封入對臨床 效果而言具有充分之藥劑量的製劑,在封閉泡囊中內封至 少0.07 (藥劑(莫耳)/總脂質(莫耳))之高載持量的伊 φ嫌立替康及/或其鹽,可以長時間維持伊立替康鹽酸鹽之活 性代謝物之SN-3 8的血漿中濃度之伊立替康製劑爲目的者 【發明內容】 本發明人係爲達成上述目的進行檢討之結果,發現做 爲對封閉泡囊藥劑封入伊立替康及/或其鹽之方法,尤其 選擇於封閉泡囊之內側/外側形成離子梯度。藉由透過封 閉泡囊之膜導入藥劑之離子梯度的Remote loading (遠隔 負荷製料)法時’不但可達成以往之被動負荷製料法很難 達成之高濃度封入’還可以比以往方法調製之脂質體更顯 著地提高血中滞留性’結果可以長時間維持伊立替康鹽酸 鹽之活性代謝物SN-38在血中濃度。另外,因選擇遠隔負 荷製料法而發現可以顯著地提高37. °C下之製劑安定性,4 °C下之長期製劑安定性。藉此確認可獲得對臨床效果而言 爲充分之藥劑封入量的0· 07 (藥劑(莫耳)/總脂質(莫耳 ))之商載持量內封於封閉泡囊的伊立替康製劑。以這種 -8- 1362931 濃度內封伊立替康及/或其鹽於封閉泡囊內,可長時間維 持伊立替康之活性代謝物SN-38之血漿中濃度的製劑迄今 仍未有人揭示報告,所以做爲解決上述課題,本發明提供 以下者。 (1) 一種伊立替康製劑,其特徵爲在脂質膜所形成 之封閉泡囊中,以至少0.07莫耳/莫耳(藥劑莫耳/膜總脂 質莫耳)之濃度內封伊立替康及/或其鹽所成者。
較佳之實施形態例爲伊立替康製劑係至少載持較〇. 1 莫耳藥劑/莫耳脂質更高濃度之藥劑。 本發明之伊立替康製劑的平均粒徑係較佳爲0.02〜2 50 μηι。 本發明中高濃度地封入伊立替康及/或其鹽於封閉泡 囊係可藉由利用下述離子梯度之遠隔負荷製料(Remote loading)予以達成。 (2 )如上述(1 )所記載之伊立替康製劑,其中該伊 立替康製劑爲在該封閉泡囊之內水相與外水相之間具有離 子梯度者。藉由該離子梯度可使伊立替康及/或其鹽在離 子化狀態下以上述濃度保持於封閉泡囊內。 (3)如上述(2)所記載之伊立替康製劑,其中該內 水相邊pH値爲具有較外水相邊PH値低之pH値梯度。 (4 )如上述(3 )所記載之伊立替康製劑,其中該PH 値梯度爲藉由銨離子濃度梯度及/或具有可被質子化之胺 基的有機化合物濃度梯度所形成者。 (5 )如上述(1 )〜(4 )之任一所記載之伊立替康製 -9 - 1362931 劑,其中該封閉泡囊爲以含有磷質體做爲主膜材料之脂質 雙重膜所形成的脂質體者。 上述(5)中,主膜材料較佳爲相轉移點50 °C以上之 磷質。 磷脂質係較佳爲例如被氫化之磷脂質及/或神經鞘磷 脂質爲宜。
(6) 如上述(5)所記載之伊立替康製劑,其中該脂 質體可以再含有該磷脂質以外脂質及/或表面改性劑。 其他之脂質以膽固醇較佳。 表面改性劑以例如親水性高分子衍生物較佳。親水性 高分子係具體言可爲分子量50 0〜10,0 00達爾頓之聚乙二醇 ,可以做爲其磷脂質或膽固醇衍生物被導入。 (7) 如上述(6)所記載之伊立替康製劑,其中做爲 表面改性劑含有親水性高分子衍生物之實施形態中,較佳 係只有該脂質體之外表面被親水性高分子所改性者。 (8 )如上述(6 )或(7 )所記載之伊立替康製劑, 其中該表面改性劑亦可包含具有鹼性官能基之化合物。 具有鹼性官能基之化合物以3,5 -兩個十五烷氧基苯甲 脒鹽酸鹽爲宜。 (9) 一種醫藥組成物,其特徵爲含有如上述1〜8所記 載之伊立替康製劑者。 (10)—種疾病之預防及/或治療方法,其特徵爲將 預防及/或治療有效量之上述(1 )〜(8 )所記載任一之伊 立替康製劑投予宿主者。 -10- 1362931 (11) 投予(1) ~(8)之任一伊立替康製劑予宿主 所成,在宿主內釋出有效量之伊立替康及/或其鹽者。 (12) 投予(1)〜(8)之任一伊立替康製劑予宿主 所成,在標的部位曝露有效量之伊立替康及/或其鹽者。 [發明之效果] 本發明提供之伊立替康製劑係以至少0.07 (藥劑(莫 φ鲁耳)/總脂質(莫耳))之載持量內封伊立替康及/或其鹽 ’含有就臨床效果而言充分高濃度之藥劑。又,如後述之 實施例所示,本發明之伊立替康製劑係與以往公知之伊立 替康脂質體製劑相比,可以更顯著地提高血中滞留性,可 以長時間存在於血中。又,更顯著地提高3 7 r下之製劑 安定性,4 °C下之長期製劑安定性者。 [實施發明時之最佳形態]
以下詳細說明本發明。 伊立替康(irinotecan)係以化學名(+) -(4S)·-4,11-一乙基-4-趨基-9-[(4-六氫13比陡基-六氫卩比11定基)鑛 氧基]-111-吡喃[3’,4’:6,7]吲畊基[1,2-1)]喹啉-3,14( 4H,12H )-二酮所表示具有喜樹鹼架構之化合物。伊立替 康及/或其鹽係一種抗惡性腫瘤劑,做爲下述之鹽酸鹽( irinotecan· HCl(hydrochloride))使用之水溶性物質。此 說明書中「伊立替康及/或其鹽」有時僅稱其爲「伊立替 康」或「藥劑」。又,有時將伊立替康鹽酸鹽稱爲「伊立 -11 - 1362931 替康鹽酸鹽」或「CPT-11」。
本發明可提供以0 · 0 7莫耳/莫耳(藥劑莫耳/膜總脂質 ® 莫耳)以上之高載持量內封上述伊立替康及/或其鹽於脂 質膜所形成之封閉泡囊的伊立替康製劑。 封閉泡囊係只要具有可內封藥劑之構造即不必特別限 定’可爲各種形態者,惟可以利用具有其內部可用高濃度 封入之潛在性功能之脂質體、類脂中心體及奈米顆粒等。 此等中以脂質體爲最佳形態。
以下主要以本發明之伊立替康製劑的載體爲最佳之脂 質體的實施態樣爲例如以說明》 脂質體係由磷脂質雙重膜所成,藉由依據脂質之疏水 性基與親水性基之極性生成之膜,具有可形成與外界隔離 之構造的封閉泡囊,其泡囊空間內含有水相(內水相)。 脂質體製劑係以此脂質體爲載體,將藥劑載持於此者。 「磷脂質」係一種活體膜之主要構成成份,在分子內 具有由長鏈烷基所構成之疏水性基與由磷酸基所構成之親 水基群之兩親媒性物質。磷脂質可爲磷脂醯膽鹼(二卵磷 脂)、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺 酸、磷脂醯肌醇,更可爲神經鞘磷脂等神經鞘磷脂質、或 -12- 1362931 心磷脂等天然或合成之磷脂質或此等之衍生物,及此等依 常法氫化者等。以下,有時指包含此等在內之「磷脂質」 稱爲磷脂質類。 此等中,尤以氫化大豆磷脂醯膽鹼(HS PC )等被氫 化之磷脂質、神經鞘磷脂(Sphingomyelin,SM )等爲宜。 主膜材料可以只含單一種之磷脂質者,亦可含複數種 磷脂質者。
磷脂質係爲使保存時或在血液等活體中,所封入之藥 劑不致於極易漏出,做爲主膜材料以使用相轉移點爲較活 體內溫度(35〜37 °C)高之磷脂質較爲適宜。另外,製造 這種脂質體時,有時會被曝露於較活體溫度更高溫度。即 ,有時會在5G t〜70 °C左右,例如60 t左右之溫度條 件下被製.造。對於藉由熱形成脂質體的影響較大,所以最 好係使用具有較此等溫度更高之相轉移點的主膜材料。具 體言,以主膜材料之相轉移點係5 0 °C以上之磷脂質爲宜 脂質體可以與上述主膜材料一起含有其他之膜成份。 以含有磷脂質以外之脂質或其衍生物(以下有時稱爲其他 脂質),與上述磷脂質一起,藉由混合脂質形成膜爲宜。 「磷脂質以外之脂質」係分子內具有藉由長鏈烷基等 所構成之疏水性基,於分子內不含磷酸基之脂質,雖不予 特別限制,但可爲甘油糖脂質、神經鞘糖脂質及做爲安定 劑之後述的膽固醇等膽固醇類等及此等之氫化物等衍生物 。膽固醇衍生物係具有環戊烷氫菲環之酯醇類,雖不特別 -13- 1362931 限定,但可爲膽固醇。 混合脂質可含其他脂類各單一種,亦可含複數種。 伊立替康製劑在血漿中的釋出率可由膽固醇之量來調 • 節,欲壓低釋出率時以含有〇~20莫耳%之量爲宜,相反地 ,欲提高釋出率時係以含30~50莫耳%,較佳含40~50莫耳 %。 本發明中之脂質體係可與上述膜構成脂質一起保持上 φ鲁述膜構造者,可以在不影響本發明之目的範圍內含有可以 含在脂質體之其他的膜成份。做爲其他之膜成份可爲使脂 質物性變化,可對載體之膜成份賦予所希望之特性的表面 改性劑。表面改性劑雖不特別限定,但可爲帶電物質、親 水性高分子之衍生物、水溶性多糖類之衍生物等。 帶電物質雖不特別限制,但可爲具有胺基、脒基、脈 基等鹼性官能基之化合物,具有酸性官能基之化合物等。 鹼性化合物有特開昭61-161246號所揭示之DOTMA、 特表平5-508 626號所揭示之DOTAP、特開平2-292246號所 揭示之Transfectam、特開平4-108391號所揭示之TMAC、 國際公開第97M2166號所揭示之3,5-兩個十五烷氧基苯甲 脒鹽酸鹽、DOSPA、TfxTM-50、DDAB 、 DC-CHOL、 DMRIE 等。 具有酸性官能基之化合物有油酸、磷脂酸等脂肪酸、 神經節苷酯GM1、神經節苷酯GM3等具有唾液酸之神經節 苷酯等、N -醯基-L -麩胺酸等酸性胺基酸系界面活性劑等 -14- 1362931 上述帶電物質爲脂質中結合具有鹼性官能基之化合物 的物質時,被稱爲陽離子化脂質。陽離子化脂質之脂質部 份係被安定化於脂質體之脂質雙重膜中,鹼性官能基部份 則可存在於載體之脂質雙重層的膜表面上(外膜表面上及 /或內膜表面上)。藉由陽離子化脂質改性膜,而可以提 高脂質體膜與細胞間之黏著性。 水溶性糖類雖不特別限制,但可爲例如尿甘酸、唾液 _籲酸、糊精、黏多醣、直鏈澱粉、支鏈澱粉、脫乙醯殼多糖 、甘露聚糖、環糊精、果膠、角鹿菜等水溶性多醋類等。 親水性高分子雖不予特別限定,但可爲聚乙二醇、 Ficoll(商品名)、聚乙烯醇、苯乙烯-順丁烯二酸酐交互 共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐交互共聚物、聚乙烯吡 咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚乙烯甲基哼唑啉、聚乙基Of唑啉 、聚羥丙基腭唑琳、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯 醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥丙酯、聚丙烯 酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚天冬胺醯胺 、合成聚胺基酸等。 親水性高分子係以具有改性脂質的構造爲宜。尤其在 親水性高分子鏈之一端具有該構造爲宜。即,改性所用之 親水性高分子係由親水性高分子之本體部份,與改性脂質 用之構造部份所成爲宜。該構造爲脂質等疏水部份時,該 疏水性部份係以插入脂質體膜之形態,親水性高分子之本 體部份會被固定爲自脂質體外表面突出,該構造爲若具有 可以與脂質體膜構成成份共價鍵之反應性官能基時,可以 -15- 1362931 與露出於脂質體外表面之磷脂質等脂質體膜構成份共價鍵 ,藉此親水性高分子之本體部份會被固定化爲自脂質體外 表面上突出。 其次’對於與親水性高分子本體結合以形成親水性高 分子-疏水性高分子化合物所用之疏水性化合物說明如下 〇 該疏水性化合物並不特別被限定,惟例如可爲具有疏 Φ鲁水性領域之化合物(疏水性化合物)。疏水性化合物可爲 例如後述之構成混合脂質的磷脂質,或脂醇等其他之脂質 類’或長鏈脂肪族醇、甘油脂肪酸酯等。其中以磷脂質爲 較佳態樣之一。又,此等疏水性化合物亦可具有反應性官 能基。藉由反應性官能基所形成之結合係以共價鍵爲宜,具 體言可爲醯胺、酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫醚鍵等,惟並不 特別限定。 上述磷脂質所含醯鍵係以飽和脂肪酸爲宜。醯鍵之鏈長 係C14〜C2Q爲宜,更以C16〜C18爲最佳。醯鍵可爲二軟脂醯基 、二硬脂醯基、軟脂醯基硬脂醯基。 磷脂質並不特別限制。做爲磷脂質可例如使用具有與 上述親水性高分子可以反應之官能基者。這種具有與親水 性高分子可以反應之官能基的磷脂質,具體言可爲具有胺 基之磷脂醯乙醇胺,具有羥基之磷脂醯甘油,具有羧基之磷 脂醯絲胺酸。以使用上述之磷脂醯乙醇胺爲較佳態樣之一 〇 親水性高分子之脂質衍生物係由上述親水性高分子與 -16- 1362931 上述脂質所成。上述親水性高分子與上述脂質之組合係並 不特別限定者。可以配合目的使用適當組合者。例如可爲 至少一個選自磷脂質、脂醇等其他脂質類、長鏈脂肪質醇、 甘油脂肪酸酯,與至少一個選自PCG、PG、PPG結合之親水 性高分子衍生物。具體言可爲聚氧化丙烯烷基等,尤其親 水性高分子爲聚乙二醇(PEG )時,選擇磷脂質、膽固醇 做爲脂質係較佳態樣之一。這種組合所成之PEG的脂質衍生 φ鲁物係有PEG之磷脂質衍生物或PEG之膽固醇衍生物。 親水性高分子之脂質衍生物可藉由脂質之選擇,可選 擇帶正電、帶負電、中性。例如選擇DSPE爲脂質時,因磷 酸基之影響會成爲帶負電之脂質衍生物,又,做爲脂質選擇 膽固醇時會成爲中性之脂質衍生物。可以視其目的選擇脂 質。 PEG之分子量並不被特別限制。PEG之分子量係通常爲 500〜10,000達爾頓,較佳係1000~7000達爾頓,更佳係 2000-5000達爾頓》 PG之分子量並不特別限制PG之分子量通常係100~1〇〇〇〇 達爾頓,較佳係200〜7000達爾頓,更佳係400〜5000達爾頓。 PPG之分子量並不特別限制。PPG之分子量係通常爲 1 00-1 0000達爾頓,較佳係200〜7000達爾頓,更佳係 1 000~5000達爾頓。 此等中’ PEG之磷脂質衍生物係較佳態樣之一。PEG之 磷脂質衍生物有例如聚乙二醇·二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺( PEG-DSPE) 。PEG-DSPE係廣泛被用之化合物極易取得, -17- 1362931 所極佳® 上述親水性高分子係可以各自單獨或組合二種以上使 用。 這類親水性高分子之脂質衍生物係可依以往公知之方 法製造。親水性高分子之脂質衍生物其中一例之PEG的磷 脂質衍生物之合成方法有例如使用觸媒,使具有對PEG可 反應之官能基的磷脂質,與PEG反應之方法。該觸媒可爲 __例如氰尿醯氯、碳化二亞胺 '酸酐、戊二醛。藉由此種反 應,使上述官能基與PEG爲共價鍵,得PEG之磷脂質衍生 物。 使用此等親水性高分子之脂質衍生物被表面改性之脂 質係可以防止血漿中之調理素蛋白質等吸附至該脂質體之 表面,提高該脂質體在血中之安定性可避免在RES截留, 可提高送達藥物爲目的之對組織或細胞之送達性。 上述藉由親水性高分子脂質衍生物之膜脂質(總脂質 )的改性率係對膜脂質的比率爲通常0.1〜20莫耳%,較佳 係〇」~5莫耳%,更佳係0.5~5莫耳%。 另外,本發明中之「總脂質」係指構成膜之脂質中除 去親水性高分子脂質衍生物之總脂質,具體而言,包含磷 脂質類及其他脂質類(包含膽固醇),另含有親水性高分 子脂質衍生物以外之表面改性劑時亦含此表面改性劑,惟 並不包含親水性高分子脂質衍生物中所含磷脂醯乙醇胺( PE)等磷脂質 '膽固醇等。 本發明中藉由如上述之脂質體的親水性高分子脂質衍 -18- 1362931 生物(PEG-PE)之膜改性係可爲將親水性高分子(PEG) 分佈於脂質雙重膜之內/外雙方,亦可爲選擇性地分佈於 外膜側。具體言,在調製後述之脂質體製劑時,預先均勻 地混合脂質體形成脂質與PEG-PE,使之形成脂質體(先導 入),亦可使用混合不含PEG-PE之脂質體形成脂質所得混 合脂質,依常法形成爲脂質體後,再導入PEG-PE (後導入 )’尤其以形成脂質雙重膜之未改性脂質體後,自外部以 φ鲁親水性高分子改性膜表面(後導入),選擇性地僅表面改 性劑脂質雙重膜之外膜的脂質體爲宜。這時導入親水性高 分子用之改性劑若使用親水性高分子脂質衍生物時,親水 性高分子部份會以向外方突出之狀態,疏水性部份之脂質 部份會進入脂質體之脂質雙重膜中被安定地保持,在脂質 體之脂質雙重膜之外膜表面上存在並分佈結合於脂質之親 水性高分子。 脂質體形成步驟後之脂質體受到溫度、時間之影響會 引起凝聚等不安定化現象。此不安定化係視脂質體之脂質 組成之不同而有所不同,所以已知係每一種脂質組成會有 不同之溫度、時間。爲規避因脂質組成之不同而有所不同 之不安定化,於脂質體形成步驟後設定親水性高分子改性 步驟爲宜。 添加親水性高分子步驟中添加親水性高分子之時期係 以脂質體形成步驟之後愈快愈好。具體言,只要爲1 80分 鐘以內,對膜成份或內封物之熱影響較少爲宜,更佳係 1 20分鐘以內,最佳係4 5分鐘以內,脂質體形成步驟後即 -19- 1362931 爲最理想。更具體言之,亦可將脂質體形成步驟後之脂質 體分散液直接投入親水性高分子溶液中,又可相反地,將 親水性高分子溶液加入脂質體形成步驟後之脂質體分散液 之方法。又,可以將脂質體分散液與親水性高分子溶液同 時移至另一容器再予混合的方法。這時就濃度均一性及溫 度均一化之觀點,採用攪拌器等攪拌之步驟較理想。 親水性高分子改性步驟中添加親水性高分子後,最好 Φ籲以相轉移溫度以上,以所定時間,加溫攪拌爲宜。加熱攪 拌之時間係以0〜120分鐘,較佳係〇〜60分鐘,更佳係0〜45 分鐘爲宜。 又,上述之外,亦可以依常法製造含具有反應活性之 官能基的磷脂質等膜構成脂質之脂質體後,添加一邊末端 活化之PEG於脂質體外液,使之與具有官能基之磷脂質等 膜構成脂質結合,藉此製造脂質體》 又,上述方法以外,脂質體還可以混合上述各構成成 份,藉由高壓排出型乳化機使其高壓排出亦可製得。此方 法係被具體記載於「Life Science中之脂質體」(寺田、吉 村等:Springer-Verlag Tokyo (1992))中者,引用此記載 做爲本說明書中所記載。 上述中,爲使脂質體定尺寸爲所希望之大小,可以利 用幾個技術(G. Gregoriadis 編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques 」 2nd edition, Vol. I-III > CRC Press )。可引用此記載做爲本說 明書之記載。 -20- 1362931 脂質體之脂質雙重膜構造係習知者有單層泡囊( Small Unilamellar Vesicle, SUV, Large Unilamellar Vesicle, LUV )及複數枚所成多層泡囊(Multilamellar Vesicle, MLV)等。 本發明有關脂質體係其任一膜構造均可以單層泡囊之 脂質體爲宜,具體言以LUV脂質體爲最佳。 脂質體分散液係使用擠製機,強制通過濾器複數次, φ鲁使其成單層化。通常濾器係具有較所要粒徑大之孔徑者, 使用二種以上不同於最後希望得之粒徑的孔徑者。使用這 樣之擠製機,通過不同孔徑之濾器次數愈多單層泡囊化率 會愈高,可以成爲實質上爲單層泡囊之脂質體。實質上爲 單層泡囊之脂質體係具體言指構成脂質體製劑之全體載體 (泡囊)中,單層泡囊所佔比率以整體而言爲50%以上之 存在比率即可,以80%以上更佳。 如上述之脂質體中係其外膜表面的親水性高分子鍵爲 向著脂質體外側分佈,另一方面,脂質雙重膜之內水相側 內膜係未被表面改性者,所以內水相內係實質上沒有分佈 親水性商分子鍵。只要爲這種分佈構造,即使內水相之pH 値低,亦比雙重膜之內外膜兩側上分佈有親水性高分子者 更能確保膜之安定性。又,與雙重膜之內外膜兩側上所分 佈者相比,只要以整體量較少之親水性高分子即可得血中 安定性之效果。 又’本發明中’ 「血中滯留性」係指投予載體於宿主 時’被內封於載體之狀態下的藥劑存在於血液中的性質。 -21 - 1362931 自載體釋出藥劑後,自血中快速地消失,對於藥劑曝露之 部位發生作用。血中滯留性較佳時可以只投予少量之藥劑 本發明之載體可採用球狀或近乎其形態者,其粒徑( 粒子外徑之直徑)雖不特別限定,但以0.02-25 0 μιη,較 佳以0.03〜0.4 μπι’更佳以0.05〜0.2 μιη爲宜。粒子外徑之 直徑係藉由動態光散射法所測定之脂質體製劑全粒子直徑 I鲁之平均値,具體言可以使用粒徑分析儀(Zetasizer (Malvern Instruments 300 OHS 或 SZEM 5002)測定。 本發明之伊立替康製劑還可以配合其投服形態再含有 醫藥上可被容許之安定化劑及/或防氧化劑者。安定化劑 雖不予特別限制,但可爲甘油或蔗糖等糖類。防氧化劑雖 不予特別限制,但可爲抗壞血酸、尿酸、或生育酚同族體 之例如維生素E等。生育酚中有α、0、r、δ之4種異構物 ,本發明中均可使用。
視其投予形態可再含有醫藥上可被容許之添加物。這 種添加物可爲例如水、生理食鹽、醫藥上可被容許之有機 溶媒 '膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚 合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻朊酸鈉、水溶性 糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、 漢生膠、阿拉伯橡膠、酪蛋白、明膠、瓊脂 '甘油去水縮 合體、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂 酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、 PBS、活體內分解性聚合物、無血清培養基、做爲醫藥添 -22- 1362931 加物可被容許之界面活性劑或活體內可被容許之生理上pH 値緩衝液等。所用添加物可以視其劑型自上述中適當地選 擇或組合,惟並不限定於此》 本發明中可將含有此等添加物之態樣的伊立替康提供 做爲醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可用一般之方法, 例如可在0~8 °C之冷藏或1〜30 t室溫保存。
本發明中之脂質體可採用內封CPT-1 1之形態。習知者 ’ CPT-11係在較中性條件高之pH値領域中會發生α-羥基 內酯環之水解。爲此本發明之脂質體即使脂質雙重膜中倂 入有CPT-11,即使內水相中倂入有CPT-1 1,爲抑制α -羥 基內酯環之水解,脂質體之內水相必須保持爲酸性。 習知者,脂質通常會因溫度,pH値而引起水解。尤其 Sn-1與Sn-2位之脂肪酸的羧酸酯係極易受到水解,而分解 爲溶血脂質及脂肪酸亦爲人所知(Grit等,Chem. Phys. Lipids,64,3- 1 8, 1 993 ),這種分解物會擾亂原來之脂質 膜組成,提高脂質膜之透過性,因而損害脂質體之安定性 。針對此欲保持內水相爲酸性時,就脂質之安定性觀點, 外水相之P Η係以中性附近較適宜。 此等相反之兩個條件會被最嚴厲地限制之狀況係在藥 物導入步驟。藥物導入步驟必須加溫爲脂質膜之相轉移溫 度以上者,會顯著地促進脂質之水解。爲抑制脂質之水解 ,雖將外水相之pH値設定爲中性附近較適宜,惟將外水相 之pH値設定爲中性附近時會促進CPT-1 1之α -羥基內酯環 的水解。有鑑於此等相反之兩個條件,藥物導入步驟中之 -23- 1362931 外水相的pH値係以4.0〜8.0爲宜,更佳係4.0~7.0,最佳係 5.0 〜7.0 〇 本發明之高載持量伊立替康製劑係在形成載體脂質體 後可利用其膜內外之離子梯度,藉由導入藥劑之被稱爲遠 隔負荷製料(Remote loading)的方法予以達成。遠距離 塡裝法係可用在被溶解爲適當之水性媒體時,可以存在於 帶電狀態下之慣用藥劑者。藉由在脂質體之內側/外側形成 φ鲁離子梯度,藥劑係依所形成之梯度透過脂質體膜而可以將 藥劑封入。 隔著脂質體膜被形成之離子梯度有Na + /K+濃度梯度。 對Na + /K +濃度梯度之藉由遠隔負荷製料,預先形成之脂質 體中添加藥劑之技術係記載於美國專利5077056號者,可 參照其施行。又,引用其記載可做爲本說明書之記載。 本發明中係做爲離子梯度以質子濃度梯度可謂較佳, 可爲具有脂質體膜內側(內水相)pH値較外側(外水相) pH値低之pH値梯度的態樣。具體言,pH値梯度係可藉由 銨離子濃度梯度及/或可質子化之具有胺基之有機化合物的 濃度梯度等形成。 藉由銨離子濃度梯度,將藥劑(伊立替康及/或其鹽 )封入脂質體內之方法,其具體例可爲首先在含有 0_1〜0.3 Μ銨鹽的水性緩衝液中預先形成脂質體,與外部媒 體之不含銨離子之媒質,例如蔗糖溶液交換,在脂質體膜 之內/外形成銨離子梯度。內部銨離子係藉由氨及質子予以 平衡化、氨會透過脂質膜擴散,而自脂質體內部消失。隨 -24- 1362931 著氨之消失,脂質體內之平衡會連續地移動向質子生成之 方向》結果脂質體內會蓄積質子,脂質體之內側/外側會形 成pH値梯度。添加藥劑予具有此梯度之脂質體分散液時, 藥劑可藉此被內封於脂質體中。 可形成上述銨離子濃度梯度之銨鹽並不特別限制,可 爲硫酸銨、氫氧化銨、乙酸銨、氯化銨、磷酸銨、檸檬酸 銨、琥珀酸銨、乳糖酸銨、碳酸銨、酒石酸銨及草酸銨等
另外,對銨離子濃度梯度之藉由遠隔負荷裝料法預先 所形成之脂質體中導入藥劑之技術,其本身係記載於美國專 利5 1 92549號中,可參照其進行,又,可引用此記載做爲本 說明之記載。 可質子化之具有胺基的有機化合物係以低分子者爲宜, 具體言可爲甲基胺、乙基胺、丙基胺、二乙基胺、乙二胺等 ’惟並不限定於此。
本發明中,藉由使用銨離子濃度梯度的遠隔負荷製料 法’內封伊立替康或其鹽之態樣係較佳者。 本發明之伊立替康製劑係在如上述之載體中,以較 0.07莫耳/莫耳(藥劑莫耳/膜總脂質莫耳),較佳較0.1莫 耳/莫耳高之濃度內封伊立替康或其鹽所成者。 本發明中所稱「內封」係指載體內部中藥劑被封入之狀 態而言。還可爲載體之構成成份的脂質層內含有一部份或全 部之狀態。本發明之載體可藉由凝膠過濾、透析、膜分離及 離心分離等一般所用方法予以精製,以除去未被內封於載體 -25- 1362931 內之藥劑。 藥劑係經過除去未被內封之藥劑之階段而被提供者。所 以載體之內部與載體之外部介著脂質雙重層而產生濃度梯 度。本發明之載體係較佳爲在調製後脂質雙重層之外部不 具有未內封之藥劑。然後自內部將被內封於載體之藥劑釋 出至外部環境。本發明之載體係在內封藥劑之狀態下到達 標的部位,結果可將內封之藥劑送達至標的部位。送達藥 Φ·劑至標的部位可爲將被載持於載體之藥劑倂入標的部位, 亦可爲即使不被倂入標的部位只要可使藥劑影響及於標的 部位或其近鄰。 又,本發明中所稱「釋出」係指載體中所內封之藥劑 可藉由通過構成載體之脂質膜,或藉由脂質膜之一部份構 造改變而出來至封閉泡囊之外部而言。在血漿中伊立替康 鹽酸鹽係被代謝爲活性代謝物之SN-38,長時間高濃度下 曝露於標的部位,示有極強之抗腫瘤活性,所以控制釋出 係極重要者。伊立替康製劑在血漿中之釋出率可用膽固醇 之量予以調節,調節膽固醇之量可期待得較佳效果。「釋 出率」係指載體之構成成份與自載持伊立替康鹽酸鹽之載 體向封閉泡囊外部出來之藥劑,與被載體所載持藥劑之比 率(重量比或莫耳比)。「釋出率低」係指每單位時間向 • 封閉泡囊外部出來之藥劑量少而言。 本發明中所稱「標的部位」係指內封於載體之藥劑被 釋出予以作用之特定部位,每一部位被特定之細胞、組織 、器官或內臓、器官及此等內部而言者。細胞、組織、器 -26- 1362931 官或內臟、器官及此等內部等的標的部位係可成爲藉由藥 劑治療之對象的部位,藉由曝露所釋出之藥劑,而發揮其 效果。標的部位並不特別限定,惟可爲腫瘤。 做爲治療對象的腫瘤雖不特別限制,但爲固體腫瘤, 具體言可爲食道癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、胰 臟癌、肝臟癌、喉癌、肺癌、攝護腺癌、膀胱癌、乳癌、 子宮癌或卵巢癌。標的部位係腫癌之細胞、組織、器官或 Φ·內臟、器官及此等內部等。所以本發明中所稱病症係指上 述腫瘤、藥劑係對此等可期待具有抗腫瘤效果。 本發明中所稱「曝露」係指被釋出至載體外部的藥劑 可影響及於外部環境之作用而言。具體而言,被釋出之藥 劑係接近於標的部位,經由接觸,而發揮其作用之抗腫瘤 效果。經由藥劑作用於標的部位、局部性地作用於進行標 的部份之DNA合成之細胞周期的細胞,顯示被期待之效果 。爲顯示此等效果,自載體之藥劑釋出率與載體之血中滯 留性必須保持均衡。 本發明之載體係以較佳之釋出速度釋出伊立替康及/或 其鹽而被釋出之伊立替康及/或其鹽係被代謝物成爲活性 代謝物之SN-38。本發明係使用其而使SN-38可長時間曝露 於所希望之標的部位。因此本發明中可以爲預防及/或治療 宿主之疾病,投予內封有效量之伊立替康及/或其鹽之載體 予宿主,在宿主內釋出有效量之伊立替康及/或其鹽,或使 有效量之SN-38長時間高濃度曝露於標的部位,所以可以 對宿主非口服性地投予全身或局部。投予對象之宿主可爲 -27- 1362931 哺乳動物,較佳係人、猴、鼠、家畜等。 非口服性投予的途徑可選擇例如點滴等靜脈內注射( 靜脈注射)、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等,可 依病人之年齡、症狀適當地選擇投予方法。本發明之載體可 以對於已被疾病困擾之病人治療病人之症狀,或至少爲阻擋 其一部份而投予十足之量。例如被封閉於載體之藥劑的有效 投予量係選擇每天每kg體重爲O.Olmg至lOOmg範圍。惟本 發明之載體並不是限定此等投予量者。投予時期可在病症發 生後投予,或被預測病人之病症會發病時爲緩和發病時之症 狀而預防性地投予。又,投予期間可視病人之年齡、症狀而 適當地選擇。 具體的投予方法可爲以注入器或點滴投予醫藥組成物。 又,將導管插入病人或宿主體內,例如管腔內,例如血管內 ,將其先端引導至標的部位附近,通過該導管投予所希望之 標的部位或其鄰近或標的部位之可期待血流之部位。
如實施例所示,針對本發明之載體測定被內封之藥劑 的釋出率時,確認爲低釋出率。釋出率可以使本發明之載體 離心地沈澱,測定上澄液存在之藥劑量與載體即可計算出。 【實施方式】 其次舉實施例更詳細地說明本發明’惟本發明並不被 此等實施例、試驗例所限定者。 各例中所調製之封入藥劑脂質體的各濃度及粒徑係依 以下求得者。 -28- 1362931 •磷脂質濃度(mg/ml ):使用磷脂質定量套組(磷 脂質C試和光’和光純藥工業公司)所定量之脂質體分散液 中之磷脂質(HSPC)濃度。 •總脂質濃度(莫耳/ <):自上述磷脂質濃度所算出 之膜構成成份的混合脂質合計莫耳濃度(mM)。此總脂質 中係含有做爲混合脂質被調製之表面改性中的脂質成份, 惟不含爲導入PEG而用之PEG衍生物中之脂質(實施例中 0·係PEG-ΡΕ中之PE (碟脂酿乙醇)或Chol-PEG中的Choi ( 膽固醇)。 •藥劑濃度(mg/ml ):將上述所得製劑稀釋爲生理 食鹽水40倍後,取其50 L,加入2ml甲醇,針對此溶液以 分光螢光光度計測定求得激勵波長:3 60nm,螢光波長: 43 5ηιη下之螢光強度。以藥劑量(mg) /製劑全量(ml )表 示所內封之伊立替康鹽酸鹽濃度。 •藥劑載持量(藥劑/總脂質莫耳比):自上述總脂 質濃度的上述藥劑濃度之比,以藥劑/總脂質之莫耳比表 示被內封於載體之伊立替康鹽酸鹽濃度。 •粒徑(nm):以3ml生理食鹽水稀釋20 μΐ脂質體 分散液,以 Zetasizer3000HS ( Malvern Instruments )測定 之平均粒徑。 以下示使用之各成份略稱及分子量。 HSPC:氫化大豆磷脂醯膽鹼(分子量790、Lipoid公司 製 SPC3)
Choi :膽固醇(分子量3 86.65、Solvay公司) -29- 1362931 ?£05()()()-?£:聚乙二醇(分子量5 00 0)磷脂醯乙醇胺( 分子量5938、Genzyme公司) PEG2Q()()-PE:聚乙二醇(分子量2000 )磷脂醯乙醇胺( 分子量2725、日本油脂公司) PEGi6〇〇-Chol :聚乙二醇(分子量1600 )膽固醇(分子 量1 982、日本油脂公司) 0?丁-11:伊立替康鹽酸鹽(分子量677.1 9 )
R-DHPE :若丹明二個十六烷醯基磷脂乙醇胺(分子 量:1 3 3 3.8 1、Molecular Probes公司) 丁艮又-20:3,5-二個十五烷氧基苯甲脒鹽酸鹽(分子量 6 0 9.4 1、常興藥品) 實施例1 爲確認可達成伊立替康鹽酸鹽高載持脂質體製劑之方 法,藉由遠隔負荷製料法(Remote Loading法)(調劑例1 )或被動負荷製料法(比較調劑例1)試著導入高濃度藥 劑。除導入方法不同以外,各伊立替康鹽酸鹽載持脂質製 劑(以下,稱CPT-11製劑)均以PE-PE (後導入)脂質做 爲載體。 (調劑例1 ) <遠隔負荷製料法) (1 )調製混合脂質.:將〇.422g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC )及〇_176g膽固醇(Choi),溶解於加熱爲60 t之25ml正丁醇(關東化學公司)後予以冰冷、凍結乾燥 -30- 1362931 ,調製爲HSPC: Chol = 54: 46 (莫耳比)之混合脂質》 (2 )調製脂質體:在0.5 98g上述調製之混合脂質中 ,加入10ml 250mM硫酸銨溶液,充分膨潤後,旋渦攪拌器 攪拌,依序通過於68 °C裝備擠製機(The Extruder T. 10, Lipex Biomembranes Inc·)濾器(孔徑 0.2 μιηχ5 次,0.1 μηιχΙΟ次,Whatman公司),調製脂質體分散液。 (3 )導入PEG-PE :在上述脂質體分散液中加入 φ·1·21πι1聚乙二醇500-磷脂醯乙醇胺(PEG5QQQ-PE)之蒸餾 水溶液(36_74mg/ml )(相當於0.7 5莫耳%混合脂質之總 脂質量),於60 °C加溫30分鐘,導入PEG5〇〇〇-PE。 以10mM組織胺/10%蔗糖溶液(PH6.0)予以溶媒取代 之凝膠管柱進行外水相取代。 使用磷脂質定量套組HSPC濃度。自HSPC濃度求得 總脂質量mM。 (4)封入藥劑:調製l〇mg/ml濃度之伊立替康鹽酸 鹽(CPT-1 1 ) /RO水(逆滲透膜淨水)溶液。 對上述 HSPC 濃度(mg/ml)可使 CPT-ll/HSPC = 〇.2( w/w )之量加入此伊立替康鹽酸鹽溶液於脂質體分散液, 於60 °C攪拌60分鐘,導入伊立替康鹽酸鹽。導入後冰冷 試樣品。以l〇mM組織胺/10%蔗糖溶液(ΡΗ6·5 )取代之凝 膠管柱,自封入伊立替康鹽酸鹽後之脂質體分散液除去未 封入之藥劑。 將上述所得CPT-11製劑之組成及粒徑示於表1。 得到本發明之高載持CPT-1 1製劑。 -31 - (比較調劑例1) <被動負荷製料(Passive loading)法> 在0.2992g以調製例1—樣之方法調製之混合脂質( HSPC : Chol = 54 : 46 (莫耳比)中,加入5ml伊立替康鹽 酸鹽溶液(l〇mg/ml濃度之CPT-11 10%蔗糖溶液),使 其充分地膨潤。以旋渦攪拌機攪拌,與調劑例1 一樣依序通 過於68 °C裝在擠製機之濾器(〇·2μιηχ5次,Ο.ΙμιηχΙΟ次) ,調劑封入伊立替康鹽酸鹽之脂質體。 與調劑例1之(3 ) —樣,在此脂質體中加入相當於混 合脂質之總脂質量0.75莫耳%的0.61ml PEG5Q(){)-PE,於60 °C加溫30分鐘,導入PEG5()()()-PE,繼而以10mM組織胺/10% 蔗糖溶液(PH6.5)取代之凝膠管柱除去未封入之藥劑。 將上述所得CPT-1 1製劑之組成及粒徑示於表1。 雖以調劑例1一樣之之藥劑量導入藥劑,但以被動負 荷製料法時無法達成獲得高載持CPT-1 1製劑。 實施例2 在遠隔負荷製料法中,調查爲得本發明之高載持CPT-U製劑所需之塡充量。 (調劑例2 ) 除將調劑例1之(4 )封入藥劑中,與(1 )〜(3 ) — 樣調製之PEG_PE後’加入導入脂質體分散液中之l〇mg/ml CPT-11/RO水溶液之量改爲 〇·1、0.2' 0.4、0.8 之 CPT- -32- 1362931 1 l/HSPC ( w/w )比之量以外,其他則與調製例1 一樣得 CPT-11製劑。將所得CPT-11製劑之組成及粒徑示於表1。 如表1所示,以遠隔負荷製料法時可以提高藥劑塡裝 量(藥劑/HSPC之比),而可達成獲得臨床效果上十足濃 度之高載持CPT-1 1製劑。
-33- 1362931
粒徑 n m 120.9 120.8 125.2 124.8 123.1 126.5 藥劑 載持量 藥劑m ο 1 / 總脂質 m ό 1 (N 卜 t—H o m o o 0.073 0.132 0.266 寸 o 藥劑濃度 m g /m L 寸 (N CN o 1 1.32 1.88 〇\ Os (N VO ON CN 藥劑 塡裝量 CPT-1 1 /HSPC w/ w (N 〇 (N 〇 ο CN 〇 寸 〇 OO o 脂質濃度 總脂質 mo 1 /L 〇 o 0.032 0.027 0.02 1 1_ 卜 T—H o o 1-H o o 磷脂質 (HSPC) mg/mL VO (N m r- m 卜 r-H oo Ch OO oo o 卜 寸 in 寸 塡裝膜組成 (mol 比) PEG-PE 卜 o 脂質 HSPC /Choi 54/46 調製例 調製例1 比較調製例1 調製例2-(1) -(2) /-*—*N 1 -(4) -34- 1362931 (試驗例1)37 t下之製劑加速安定性 於3 7 °C加溫實施例1調製之各C P T · 1 1製劑經所定時間 。加溫完後在CPT-1 1製劑中加入生理食鹽水稀釋20倍後予 以超離心(1 xlO5,2小時,10 °C ),使CPT-1 1製劑(封 入有伊立替康鹽酸鹽之脂質體)沈澱,測定上澄液中存在 之伊立替康鹽酸鹽量的螢光強度,算出自CPT-11製劑之伊 立替康鹽酸鹽之釋出率(%)。結果示於圖1。
比較調製例1調製之C P T -1 1製劑係在3 7 °c下加溫7天 時示有約60%之伊立替康鹽酸鹽釋出率,與之相比,以調 製例1之遠隔負荷製料法調製之C P T -1 1製劑係於3 7 °C下加 溫7天後亦幾乎未釋出伊立替康鹽酸鹽。由此可知,藉由 遠隔負荷製料法封入脂質體時可調製爲高載持且製劑安定 性極優之CPT-1 1製劑。 (試驗例2)37 °C下之製劑安定性
於37 °C加溫實施例2調製之各CPT-1 1製劑經所定時間 。加溫完後,與試驗例1 —樣,針對加溫後之C P T -1 1製劑 測定伊立替康鹽酸鹽之釋出率。結果,各CPT-11製劑係於 3 7 °C加溫1 4天後釋出率仍爲1 %以下。 由此可知’以遠隔負荷製料法所調製之CPT-11製劑的 釋出率係不會受到藥劑載持量(藥劑/總脂質比)極大影 響,既使爲高載持之CPT-11製劑亦具極優之製劑安定性。 實施例3 -35- 1362931 做爲載體用膜構成與調製例1不同之脂質體,調製 CPT-1 1製劑。即,膜成份爲使用由以下所示混合脂質所成 PEG-PE後導入脂質體(調製例3),或PEG-ΡΕ先導入脂質 體(參考調製例1) ’與調製例1 一樣依遠隔負荷製料法進 行伊立替康鹽酸鹽之封入操作。 (調製例3 )
(1)調製混合脂質:將1.5317g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC ) ,0.6419g 膽固醇(Choi),及 0.005g 若丹明兩 個十六烷醯基磷脂醯乙醇胺(R-DHPE )溶解於加溫爲60 °C之5 0ml第三丁醇後,冰冷、凍結乾燥,調製爲H S PC : Choi : R-DHPE = 54 : 4 6 : 0.1 (莫耳比)之混合脂質。 (2)調製脂質體:除使〇.37g上述調製之混合脂質 以外,與調製例1—樣,添加10ml 250mM硫酸銨溶液,以 旋渦攪拌機攪拌,使其通過裝有擠製機之濾器(0.2 μιη><5 次,0.1 μηιχΙΟ次),得脂質體分散液。 繼而以10mM組織胺/10%蔗糖溶液(ρΗ6.0)進行外水 相取代。 (3 )導入PEG」PE :在上述脂質體分散液中,加入相 當於2_8莫耳%總脂質量之聚乙二醇2000-磷脂醯乙醇胺( PEG2 0 0 0 -PE )之蒸餾水溶液(3 6.74mg/ml ),於 60 °C 加 溫30分鐘,導入PEG2Q00-PE。 (4 )與調製例1之封入藥劑一樣,在脂質體分散液中 加入對於 CPT-11/HSPC = 0.2 ( w/w )所需量之 10mg/ml -36- 1362931 CPT-l 1/R0水溶液,導入伊立替康鹽酸鹽後,冰冷,繼而 以10mM組織胺/10%蔗糖溶液(ρΗ6·5)除去未封入之藥劑 。所得之CPT-11製劑示於表2。 (參考調製例η 除將調製例3之(3)添加之PEG2()()()-PE,改爲預先在 (2)中添加膜材料之混合脂質,製作內外膜兩側分佈有 PEG-PE之脂質體以外,其他則與調製例3—樣調製CPT-l 1 製劑。如以下。 在與調製例3之(1 )—樣調製之0.3 7g混合脂質( HSPC : Choi : R-DHPE = 54 : 46 : 0.1 (莫耳比))及相當 於調製例3之倍量(5.6莫耳%)之〇.〇94g PEG2〇〇〇-PE中, 加入lml乙醇,於65 °C攪拌3 0分鐘,使之完全溶解。 經由攪拌確認已完全溶解後之乙醇溶液中,加入10ml
調製爲25 OmM之硫酸銨溶液,其後則與調製例3之(2 )— 樣,藉由進行旋渦狀攪拌機及擠製機操作,進行使用10% 蔗糖溶液所得脂質體分散液之外水相取代》 與調製例3之(4)—樣,加入可使CPT-11/HSPC量 = 0_2(w/w)所需量之10mg/ml CPT-11/ro水溶液於脂質體 分散液,導入伊立替康鹽酸鹽。導入後與調製例3之(4) —樣,冰冷’除去未封入之藥劑。所得C P T -1 1製劑示於表 -37- 2 ° 1362931
(N^ 粒徑 ε C 123.8 102.3 藥劑 載持量 藥劑m ο 1 / 總脂質mol 寸 〇 0.107 藥劑濃度 m g/m L CN <N 脂質濃度 總脂質 m ο 1 / L ON o o o o 磷脂質 6 ε (N oo oo 00 VO Πτ} 1 -1 PEG-PE 00 CN VO in ¢¢(— Μ £ 脂質 HSPC : Choi : R-DHPE o v〇 寸 寸 54 : 46 : 0. 1 cn 匡 m θϋ iliis 參考調製例1 -38- 1362931 (試驗例3)37 t下之製劑加速安定性
於37 °C加溫1個月,對實施例3調製之各CPT-11製劑 進行加速試驗。每一個禮拜採取一部份加溫之CPT-11製劑 ,加入生理食鹽水稀釋爲20倍後,以超離心(1 xl 05g,2 小時,10 t )使CPT-1 1製劑沈澱。定量上液中存在之伊 立替康鹽酸鹽量之螢光強度,算出自脂質體之釋出率(% )。結果示於圖2。又,每一週測定加溫後之脂質體分散 液之粒徑,結果示於圖3。 由上述圖2及圖3可知,調製例3調製之脂質體係於37 °C經1個月後亦未釋出藥劑(圖2 ),粒徑亦大約固定(圖 3),是爲製劑安定性極優之脂質體。又,於參考調製例1 調製之PEG-PE先導入脂質體係於37 °C下第3週即開始釋 出,第4週所示極高之釋出率(圖2)。又,由於粒徑係第 3週以後即增大(圖3 ),所以顯示第3週以後,已引膜之 破壞。 由此等結果可知,本發明之高載持CPT-11製劑中,形 成脂質體後添加PEG-PE的PEG-PG後導入脂質體係爲較佳 之形態。 [實施例4] 爲試驗本發明之高載持CPT-1 1製劑之長期保存安定性 及血中安定性,藉由以下調製例4〜5調製CPT-1 1製劑。 (調製例4 ) -39- 1362931 調製例1.之(3 )中,除以l〇mM MES/10%蔗糖溶液( PH6.0 )取代peg-PE後導入脂質體之分散液的外水相予以 Μ代以外’其他則均與調製例i一樣,藉由遠隔負荷製料 法藥劑導入,調製高載持CPT-1 1製劑。組成示於表3。 (調製例5 ) 以下述(1)調製之混合脂質做爲膜成份以外,其他 則與調製例4一樣,調製含有帶電物質之3,5-兩個十五烷氧 基苯甲脒鹽酸鹽之高載持CPT-11製劑。示於以下》 (1)調製混合脂質:將〇.4561g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC) ,0.1876g 膽固醇(Choi),及 0.0563g3,5-兩 個十六烷氧基苯甲脒鹽酸鹽(TRX-20 )溶解於加溫爲60 °C之25ml第三丁醇後,冰冷、凍結乾燥,調製爲HSPC : Choi : TRX-20 = 5 0 : 42: 8(莫耳比)之混合脂質。 使用〇.7〇〇g上述調製之混合脂質,與調製例1之(2 )—樣調製脂質體分散液。 除在上述脂質體分散液中添加相當於0.75莫耳%混合 脂質之總脂質量之1.42ml PEGsoqo-PE的蒸餾水溶液( 36.74mg/ml )導入 PEG5〇〇〇-PE後,以 10mM MES/10%蔗糖 溶液(pH6.0 )進行脂質體分散液之外水相取代以外,其 他則與調製例1之(3) —樣,藉由遠隔負荷製料法導入藥 劑,調製高載持CPT-11製劑。組成示於表3。 (試驗例4) 4 °C下之長期保存安定性試驗 -40- 1362931 於4 °C,保存上述所得各C Ρ Τ -1 1製劑經所定時間。經 所定時間後測定CPT-1 1製劑之粒徑,及與調製例1樣測定 佳CPT-1 1製之伊立替康鹽酸鹽的釋出率(% )。結果如表 3所示。 表3
調製例4 -— 1 調製例5 塡裝之膜組成 m ο 1比 脂質 HSPC/Chol HSPC/Chol/ TRX-20 54/46 50/42/8 PEG-PE 0.75 0.75 脂質濃度 磷脂質(HSPC) mg/mL 12.02 11.77 總脂質m ο 1 / L 0.028 0.03 藥劑濃度 mg/mL 2.67 2.4 1 _劑載持量 m ο 1藥劑/ mol總脂質 0.136 0.119 粒徑 _ nm 初期 126.3 123.3 保存6個月後 122.2 125.4 釋出率 -% 初期 0.63 0.12 保存6個月後 0.38 0.17 上述實施例4調製之各CPT-1 1製劑係保存於4 °C下6個 月後’粒徑及釋出率均未見有所變化。由此可知,藉由遠 -41 - 1362931 隔負荷製料法調製之CP T-l 1製劑係長期間之保存安定性極 佳。 (試驗例5)血中滯留性 對於小鼠(BALB/c,雌,5週齡,日本Clea公司)尾 靜脈注射做爲伊立替康鹽酸鹽量爲l〇mg/kg (做爲伊立替 康量爲8.77g/kg)之實施例4(調製例4及5)調製之各CPT_ 11製劑或伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液(做爲伊立替康 鹽酸鹽爲1 mg/ml )。 注射後於1、6、24小時後抽血,經離心分離( 3000rpm,10分鐘,4 °C )採取血漿,藉由測定螢光強度 予以測定各血漿中之伊立替康鹽酸鹽濃度》血漿係測定前 保管於冷凍庫者。結果示於表4及圖4。 實施例4之各CPT-1 1製劑係血漿中之伊立替康鹽酸鹽 濃度在尾靜脈注射後2 4小時爲止均被檢測出,但伊立替康 鹽酸鹽生理食鹽水溶液時則僅在尾靜脈注射後1小時檢測 出而己。 由此可知,藉由遠隔負荷製料法所調製之CPT-11製劑 可以長期間以高濃度維持伊立替康鹽酸鹽之血漿中濃度。 -42- 1362931 表4
血中濃度(Pg/mL ) 經過時間(小時) 1 6 24 C P T -1 1製劑(調製例4) 189.41 128.03 13.18 含TRX-20之CPT-1 1製劑(調製例5) 185.29 84.67 3.38 伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液 0.39 ND ND
[實施例5] 爲試驗本發明之高載持CPT-1 1製劑之藥效,依以下調 製例6〜9調製CPT-1 1製劑。 (調製例6 ) 除以下述(1)調製之混合脂質做爲膜成份以外,其 他則與調製例4一樣,調製含帶電物質之3,5 -兩個十五烷氧 基苯甲脒鹽酸鹽之高載持CPT-1 1製劑。示如以下。
(1 )調製混合脂質:將4.562g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (118?(3)’1.876§膽固醇(〇!11〇1),〇.564§3,5-兩個十 五烷氧基苯甲脒鹽酸鹽(TRX-20 )溶解於加溫爲60 〇c之 5 Oml第三丁醇後’冰冷、凍結乾燥,調製爲HSPC : Choi : TRX-20 = 5 0 : 42 : 8 (莫耳比)之混合脂質。 除使用7.002g上述調製之混合脂質以外,其他則與 調製例1 一樣調製脂質體分散液。 在上述脂質體分散液中,加入相當於〇 . 7 5莫耳%總脂 質量之聚乙二醇5000·磷脂醯乙醇胺(peGmqo-PE)之蒸餾 -43- 1362931 水溶液(36.74mg/ml ),於60 °C加溫3 0分鐘導入PEG5〇00-PE後,與調製例1之(4) 一樣,藉由遠隔負荷製料法導入 藥劑,調製高載持CPT-11製劑,組成示於表5。
-44- 1362931
粒徑 ε C 134.3 藥劑載持量 藥劑mol/ 總脂質m ο 1 Ο 藥劑濃度 S ', bO B ν〇 m 脂質濃度 總脂質 mol/L 0.047 磷脂質 s ', 00 ε ν〇 cn 00 r—Η 塡裝之膜組成 (m ο 1 比) PEG-PE 卜 ο 脂質 Ο <Ν >< ^ Η 〇Η Ο Λ υ 00 CN 寸 調製例6 -45 - 1362931 調製例7 除以下述(1)調製之混合脂質做爲膜成份以外’其 他則與調製例4 —樣,調製含有帶電物質之3,5之兩個十五 烷氧基苯甲脒之高載持CPT-1 1製劑。示如以下。 (1 )調製混合脂質:將4.5 62g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC ) ,1.518g 膽固醇(Choi ) ,1 . 1 2 6 g 3,5 -兩個十 五烷氧基苯甲脒鹽酸鹽(TRX-20)溶解於加溫爲60 °C之 50ml第三丁醇後,冰冷、凍結乾燥,調製爲HSPC: Choi: TRX_20 = 5 0 : 34 : 1 6 (莫耳比)之混合脂質。 除使用7.2 07g上述混合脂質以外,其他則與調製例1 一樣調製脂質體分散液。 除在上述脂質體分散液中,加入相於2.0莫耳%總脂質 量之聚乙二醇1 600-膽固醇(PEG16G()-Chol)之蒸餾水溶液 (36.74mg/ml) ’於 60 °C 加溫 3 0分鐘,導入 PEGi 6〇〇-Chol 後,以1 OmM MES/10%蔗糖溶液(pH6.0 )以外,其他則與 調製例1之(4 ) 一樣,遠隔負荷製料法導入藥劑,調製高 載持CPT-11製劑。組成示於表6 ^ -46 - 1362931
粒徑 n m 133.7 藥劑載持量 藥劑m ο 1 / 總脂質m ο 1 ON o 藥劑濃度 mg/mL VO (N m 脂質濃度 總脂質 mol/L 1_ 1 0.041 磷脂質 mg/mL oo 卜 塡裝之膜組成 (mol 比) Chol- PEG CN 1 I 脂質 HSPC : Choi : TRX-20 v〇 寸 〇 卜 眠 11ΪΓ3 -47- 1362931 (調製例8 ) 除以下述(1)調製之混合脂質做爲膜成份以外,其 他則與調製例4一樣,調製含帶電物質之3,5-兩個十五烷氧 基苯甲脒鹽酸鹽之高載持CPT-11製劑。示如以下。 (1 )調製混合脂質:將4.5 62g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC ) ,1.876g 膽固醇(Choi) ,〇.564g3,5-兩個十 五烷氧基苯甲脒鹽酸鹽(TRX-20 )溶解於加溫爲60 °C之 50 ml第三丁醇後,冰冷、凍結乾燥,調製爲HSPC: Choi: TRX-20 = 5 0 : 42 : 8 (莫耳比)之混合脂質。 除使用7.002g上述調製之混合脂質以外,其他則與 調製例1一樣調製脂質體分散液。 在上述脂質體分散液中,加入相當於0.75莫耳%總脂 質量之聚乙二醇5000-磷脂醯乙醇胺(PEGsooo-PE)之蒸餾 水溶液(3 6.74mg/ml ),於60 °C加溫3 0分鐘導入P E G 5 〇 〇 〇-PE後,與調製例1之(4)—樣,藉由遠隔負荷製料法導入 藥劑,調製高載持CPT-11製劑,組成示於表6。 (調製例9 ) 除以下述(1 )調製之混合脂質做爲膜成份以外,其 他則與調製例4一樣,調製含帶電物質之3,5-兩個十五烷氧 基苯甲脒鹽酸鹽之高載持CPT-1 1製劑。示如以下。
(1 )調製混合脂質:將4.940g氫化大豆磷脂醯膽鹼 (HSPC ) ’ 2.〇60g膽固醇(Choi )溶解於加溫爲60 °C 之50ml第三丁醇後,冰冷、凍結乾燥,調製爲HSPC : -48 - 1362931
Chol = 5 4 : 46 (莫耳比)之混合脂質。 除使用7.002g上述調製之混合脂質以外,其他則與 調製例1 一樣調製脂質體分散液。 在上述脂質體分散液中,加入相當於0.75莫耳%總脂 質量之聚乙二醇5 000-磷脂醯乙醇胺(PEGsooo-PE)之蒸餾 水溶液(3 6.74mg/ml ),於60 °C加溫3 0分鐘導入P E G 5 〇 〇 〇-PE後,與調製例1之(4) 一樣,藉由遠隔負荷製料法導入 藥劑,調製高載持CPT-11製劑,組成示於表7。
-49- 1362931
L % 粒徑 nm Ό (Ν Os σ\ 藥劑載持量 藥劑mol/ 總脂質ϊπ ο 1 0.098 0.107 藥劑濃度 m g/mL CN CN m 00 CN C^J 脂質濃度 總脂質 mol/L 0.049 0.045 磷脂質 mg/mL 寸 ο ο v〇 v〇. ON t-H 塡裝之膜組成 (mol 比) PEG-PE 卜 ο 卜 O 脂質 ° 〇 ^ CN U . .. X pi ^ Η 00 οο (Ν 寸 Ο ιη o 寸 寸 調製例8 ON 卿 ΙΪ1Ϊ3 -50- 1362931 [實施例6] 檢測證明對外水相pH之藥劑封入率的影響。 (調製例1 〇 ) (1)調製混合脂質:秤量7.01g HSPC及2.93g Cho卜 於此等中加入l〇ml無水乙醇,於68 °C加溫溶解。確認已 完全溶解後加入90ml硫酸銨溶液(250mM ),於68 。(:加 溫攪拌。 (2 )製作脂質體:加溫攪拌後,使用加溫爲68 °C之 擠製機,5次通過孔徑0.2 μιη之濾器,其後改換爲孔徑0.1 μηι之濾器,通過5次。導入PEG 5 0 0 0 -DSPE :力□入20.4ml PEG5Q()()-DSPE溶液( 3 6.74mg/ml)於擠製後之樣品使其成 爲具有所定含率(莫耳% )之PEGsoqo-DSPE,於60 °C加 溫攪拌30分鐘,導入PEGsooo-DSPE。冰冷導入後之樣品。 (3 )外水相取代:分別取8ml冰冷之樣品,使用以不 同 pH (pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)外水相溶液,具 體言爲卩1^.0'5.0(1〇111]\/1乙酸/10%蔗糖溶液)' pH6.〇 ( 1〇1111^組織胺/10%蔗糖溶液)、pH7.0、8.0、9.0 ( 10»ιΜ Tris/10%蔗糖溶液)充分取代之凝膠管柱,進行外水相取 代。外水相取代後之脂質體分散液磷脂質定量套組’ $量 HSPC濃度。自HSPC濃度求得總脂質量mM。 (4 )封入藥劑:調製10mg/ml濃度之伊立替康鹽酸 鹽(CPT-1 1 ) /RO水(逆滲透膜淨水)溶液。以對上述總 脂質量(mM)可成爲CPT-11/總脂質量=0.16(莫耳/莫耳 -51 - 1362931 )之量,將此伊立替康鹽酸鹽溶液加入脂質體分散液中, 於60 °C攪拌60分鐘,導入伊立替康鹽酸鹽。冰冷導入後 之樣品。以1 QmM組織胺/1 〇%蔗糖溶液(ρΗ6·5 )取代之凝 膠管柱除去封入伊立替康鹽酸鹽後之脂質體分散液中的未 封入藥劑。 上述所得各CPT-11製劑之脂質(HSPC)濃度、藥劑 (CPT-11製劑)濃度及粒徑示於表8。
(藥劑封入率) 依以下式,針對上述各CPT-11製劑,自對於0.16(莫 耳/莫耳)藥劑塡裝濃度之最後藥劑濃度CPT-11之比’算 出藥劑封入效率(%)。 CPT-1 1之封入效率(%) = 最後C/T _ 11 /總脂質(莫耳/莫耳)叫nn 最先C/T _ 11 /總脂質(莫耳/莫耳)
結果示於表8及圖5。如表及圖所示’外水相之PH爲 8.0以下時,CPT-11之封入效率(%)係可以極高達90 %以 上,惟比8.0高時則CP T-1 1之封入效率(% )會降低。 -52- 1362931
8撇 粒徑 (nm) <N 123.8 122.6 124.0 123.5 122.9 124.7 122.4 124.1 123.8 寸 (N 124.1 封入效率 (%) ON o 寸 ON a\ 102.5 98.1 cn Ό On 寸 寸 Os 00 oo On m CN σ\ ON CN CTn 〇 卜 On 卜 Η Μ- 5 ^ Ϊ rrri 、 •N _时 ^ " Μ m ^ 0.163 as in o 0.164 卜 ^T) r— H o 0.154 f—^ o OO V) o 0.148 0.147 0.148 0.120 〇 ^ /—\ H W 5 ^ μ tii! •N ^ W-® C Μ m w \〇 r ·Η o C P T -1 1 製齊!J (mg/mL) On <N (N m m m cn CN m 寸 cn cn <N cn r—Η m <N m 寸 CN rn CN HSPC濃度 (mg/mL) 寸 m (N 卜 CN f H i〇 CN o m CO 寸 <N 卜 cn cn cn 〇 m 寸 <N 00 CN 外水相 pH 寸 v〇 卜 oo ON -53- 1362931 [實施例7 ] 檢測證實外水相pH對藥劑安定性之影響。 在調製例10之(3)使用之各pH的外水相溶液(ρΗ4·0 5 0 ' 60 ' 7.0 ' 8.0 > 9.0 ),具體言 ρΗ4·0、5.0 ( lOmM 乙酸/10%蔗糖溶液),pH6.0 ( 10mM組織胺/10%蔗糖溶液 )’ PH7_0、8.0、9.0 ( lOmM Tris/ΙΟ%蔗糖溶液)之各 lml 中’加入0.7 ml 10mg/ml濃度之伊立替康鹽酸鹽(CPT-11 ) /RO水(逆滲透膜淨水)溶液,於60 °C攪拌60分鐘。 以各外相溶液稀釋上述所得CPT-11溶液爲20倍後,對 5 μΐ試料溶液測定高速液體層析,由以下式算出CPT-1 1之 羥基內酯環之水解率(開環體存在率)(%)。 CPT-1 1 開環體存在率. l〇2xAel()se)}xl〇〇 Aope^CPT-ll開環體巔峰面積 Acl()se = CPT-ll閉環體巔峰面積
結果於圖5。 獲知外水相之pH爲8.0以上時’ CPT-1 1開環體存在率 (%)會增加爲95%以上極爲高。爲維持〇?7'-11之活性, 欲抑制α -羥基內酯環之水解,必須將PH保持爲4.0以下’ 惟由一種安定性(脂質之水解)之觀點,PH係以6·0~7·〇附 近爲宜。有鑑於實施例6之結果可知’導入藥物時之外水 相的pH係以4·0〜7.0爲宜。 -54- 1362931 [實施例8] (調製例1 1 ) (1 )形成脂質體: 秤量70.87g HSPC及29.13g Cho卜於此等中加入100ml 無水乙醇,於68艺加溫溶解。確認已完全溶解後加入 900ml硫酸銨溶液( 25 0mM),於68 °C加溫攪拌。
(2 )製作脂質體 控制脂質體之粒徑:加溫攪拌完後,使用加溫爲68 °C之擠製機,通過5次孔徑l〇〇nm之濾器。
PEG5〇c)()-DSPE 之導入:加入 200ml PEG5〇〇q-DSPE 溶液 (3 6.74mg/ml),使擠製後之樣品成所定之PEG5GG()-DSPE 含有率(莫耳% ),加溫爲6 0 °C攪拌3 0分鐘,導入 PEG5〇〇〇-DSPE。 ( 3 )外液取代 使用錯流過濾系統,對於外水相溶液(l〇mM組織胺 溶液/10%蔗糖溶液(莫耳6.5 ))進行外液取代。外液取 代後之脂質體分散液使用高速液體層析,定量HSPC濃度 及膽固醇濃度以HPSC濃度及膽固醇濃度之總和爲總脂質 濃度’求得封入之伊立替康鹽酸鹽量。 (4 )封入藥劑 調製例10mg/ml濃度之伊立替康鹽酸鹽(cPT_n) -55- 1362931 /R0水(逆透膜淨水)溶液。以對於上述總脂質j 可成爲CPT-11/總脂質量=0.16(莫耳/莫耳)之量 立替康鹽酸鹽溶液加入脂質體分散液,於50 °c 鐘,導入伊立替康鹽酸鹽。導入後之樣品立即冰: I ( mM ) ,將此伊 攪拌20分 (5)除去未封入之藥物 在封入伊立替康鹽酸鹽後之脂質體分散液中 相液’使用錯流過濾系統,除去未封入藥物。 ,加入外 (6)調整濃度 使用高速液體層析定量除去未封入藥物後之 散液中之伊立替康鹽酸鹽,調整爲5.Omg/ml之伊 酸鹽濃度。 脂質體分 立替康鹽
(7)過濾殺菌 使用0.2 μιη之殺菌濾器,對調整濃度後之脂 液進行過據殺菌,塡充於小藥瓶中。 將上述所得CPT-1 1製劑之組成及粒徑示於表 質體分散 9 〇 -56- 1362931
粒徑 B C (N 卜 OS 藥劑載持量 藥劑m 〇 1 / 總脂質mol 1—^ o 藥劑濃度 mg/mL cs ON 寸 脂質濃度 總脂質 e 卜 寸 磷脂質 (HSPC) mg/mL Ο <Ν 塡裝之膜組成 (mol 比) PEG- DSPE 卜 Ο 脂質 t HSPC : Choi 寸 調製例11 -57- 1362931 (調製例6)抗腫瘤效果 將2.5 χΙΟ6細胞/小鼠之人攝護腺癌細胞(PC-3)移植 至小鼠(BALB/c nude、雄、6週齡、日本 Charluse liver公 司)之左鼠蹊部皮下。腫瘤移植後,等到以1/2 · ab2 ( a係 腫瘤之長度,b係短度)所求得之推定腫瘤體積達到4 0mm3 左右(〇天)之翌日開始,每4天計3次(第1、5、9天), 尾靜脈注射調製例1 1調製之CPT-1 1或伊立替康鹽酸鹽生理 食鹽水溶液。以未注射藥劑之小鼠做爲對照群。 求得第1、5、9、12、16、22天之推定腫瘤體積及小 鼠體重。 又,於第22天切出腫瘤測定重量後’依以下算出腫瘤 增殖阻斷率I. R ( % )。 I.R%= ( 1-投予群之平均腫瘤重量/對照群之平均腫瘤 重量)X 1 00
將結果示於表10及圖6與圖7。 對於人攝護腺癌,CPT-n製劑及伊立替康鹽酸鹽生理 食鹽水溶液係與對照群比均示有顯著之腫瘤抑制效果(表 10,圖6)。又,CPT-11製劑係與伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水相比較,具有高抗腫瘤效果。又’兩藥劑均對於小鼠 之體重未予以影響(圖7) ° -58- 1362931
褂一 σ\ cn Ο ο 〇 m Μ ^ 1 卜 00 〇\ 0\ 00 (Ν s w CN ^ 〇s 寸寸 ν〇 N Q oo — ο ο Vi〇 CO Ο zn ώτη] ~t! Pi) G 1 < o 丄| ο ο ο ο ο ο +丨 +1 +1 CS 一 CM o o 〇 +1 +1 +1 锲 S 十1 \〇 γ〇 CN — 寸 v〇 oo l Λ V Ormi S s (N QJ? Ο Ο Ο so so o o 〇 CO rnlmll ^ r-> ¢-¾ 啊 ^ 蘅 ω 1 mo (NO mo 〜 π = B 擦 琺 -½ m 鹌 mi) 脚 05* ϋΐίΒ 胡 V—✓ m 蒙 in 饵 陛 Η f>\ m Pm u m -59- 1362931 (試驗例7 )藥物動態 對於食蟹猿(雄,4~5 齡,Guangxi Research Center of Primate Laboratory Animal)之頭皮靜脈持續投予4分鐘調製 例1 1調製之CPT-1 1製劑或伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液 ,使其做爲伊立替康鹽酸鹽可爲l〇mg/kg。 投予完畢後立即及投予開始後10、30分鐘,及1、6、 24、48、72、168、3 3 6、504小時後抽血,以離心分離得 血漿。在50ml血漿中加入550 μΐ內標溶液B (內標物質之 甲醇溶液)予以離心,以甲醇稀釋1 0 0倍上澄液者做爲總 CPT-11濃度測定用試料。另一方面,在50ml各血漿中加入 200ml內標溶液A (內標物質之0.147莫耳"Η3Ρ04溶液) ,離心分離(l〇〇,〇〇〇xg,30分鐘,1〇 °C )其中之200ml ,自上層部分離100ml予以固相萃取,以萃取液做爲游離 CPT-11 濃度 SN-38 濃度及 SN-38C ( SN-38 10-0 -葡糖苷酸) 濃度測定用試料。所得試料以LC/MS/MS分別測其各濃度 。結果示於圖8 -1 1。 結果’總CPT-1 1濃度係在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水 溶液時係投予後急速地減少,至1小時即減少爲未達定量 下限値(< 1 m g / m 1 ) 。C P T -1 1製劑係投予後1小時至4 8小時 爲止時大約以指數函數地減少,與伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水溶液相比,可以看出顯著地延長了滞留時間(圖8) 〇 游離CPT-11濃度係在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液 時係投予完立即爲最高濃度,其後過6小時爲止時係比較 -60- 1362931 快,其後才緩慢地減少。另一方面CPT-11製劑係開始投予 後1小時達最高濃度,其後再緩慢地減少(圖9)。 SN-38濃度係在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液中係 投予後立即爲最高濃度,其後快速地減少,至24小時即成 爲未達定量下限(<〇.〇〇〇5mg/ml )。另一方面CPT-1 1製劑 係投予完後立即達最高濃度,其後維持1小時後才減少,6 小時至48小時之間大約維持爲一定(圖1 0 )。
SN-38G濃度係投予CPT-11製劑,伊立替康鹽酸鹽生 理食鹽水溶液時均在投1小時後爲止急速增加,其後一邊 維持濃度僅稍爲減少而已(圖1 1 )。 (試驗例8 )血液毒性 使調製例11調製成爲伊立替康鹽酸鹽量3、10及 30mg/kg,使伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液成爲30mg/kg ,對大鼠(CD ( SD ) IGS鼠,雄,7週齡,日本Charlus Hver)尾靜脈投予。 在藥物投予前,及投予後第2、4、6、13、20、27天(4 週),自頸靜脈抽取〇.4ml之血,以血液自動分析裝置( Sysmex XT-2000i,Sismex)測定嗜中性白血球數及淋巴細胞 數。結果示於圖12及圖13。 嗜中性白血球係投予藥劑後均在投予後立即見到暫時性 之減少,但其後就很快地恢復。減少之程度係10及3 Omg/kg 者較3mg/kg爲大,而恢復期則30mg/kg可見到急速之增加。 兩個投予劑之30mg/kg中,在嗜中性白血球之變化上並沒有 -61 - 1362931 見到顯著之差異(圖12)。淋巴細胞數係投予後_LL即見到有 減少傾向,但其程度不大,未.見到各投予量之間之差異(圖 13)。 由以上結果可知,在CPT-1 1製劑雖可見到對嗜中性白 血球有暫時性之極弱的血液毒性,但只與同用量之伊立替康 鹽酸鹽生理食鹽水溶液之血液毒性大約同程度而已。 [實施例9] (調製例1 2 ) (1 )形成脂質體 秤量 65.250g HSPC 及 26.800g Choi 及 8.000g TRX-20 . 於此等中加入100ml無水乙醇,於68 °C加溫溶解。確認已 完全溶解後加入900ml硫酸銨溶液( 250mM),於68 °C加 溫攪拌。 ( 2 )製作脂質體 加溫攪拌後,使用加溫爲68 °C之擠製機,5次通過孔 徑 100nm之濾器。導入 PEG5〇()()_DSPE :加入 200ml PEG 5 000 -DSPE溶液( 3 6.74mg/ml)於擠製後之樣品使其成爲具有所 定含率(莫耳% )之PEG5QQQ_DSpE,於6〇 。(:加溫攪拌30 分鐘。 (3 )外液取代 使用錯流過濾系統,對冰冷之樣品進行外水相溶液( -62- 1362931 10mM組織胺/10%蔗糖溶液(ρΗ6·5))之外液取代。使用 高速液體層析定量外液取代後之脂質體分散液的膽固醇濃 度及TRX-20濃度。以HPSC濃度,膽固醇濃度,及trx-20濃度之總和做爲總脂質濃度,求得欲封入之伊立替康 鹽酸鹽量。 (4 )封入藥劑
調製10mg/ml濃度之伊立替康鹽酸鹽(CPT-11) /R0 水(逆滲透膜淨水)溶液。以對上述總脂質量(mM )可 成爲CPT-11/總脂質量=0.16 (莫耳/莫耳)之量,將此伊立 替康鹽酸鹽溶液加入脂質體分散液中,於50 。(:攪拌20分 鐘,導入伊立替康鹽酸鹽。立即冰冷導入後之樣品。 (5)除去未封入之藥物 在封入伊立替康鹽酸鹽後之脂質體分散液中加入外水 •I®相,使用錯流過濾系統除去未封入之藥物。 (6 )調整濃度 使用高速液體層析定量除去未封入藥物後之脂質體分 散液中之伊立替康鹽酸鹽,調整爲5.Omg/ml之伊立替康鹽 酸鹽濃度。 (7 )過濾殺菌 使用0.2 μιη之殺菌濾器,對調整濃度後之脂質體分散 -63- 1362931 液進行過濾殺菌,塡充於小藥瓶中。 將上述所得CPT-11製劑之組成及粒徑示於表11。
-64 - 1362931
粒徑 nm o <N ON 藥劑載持量 1藥劑mol/ 總脂質mol 〇 藥劑濃度 ε to B v〇 寸 脂質濃度 總脂質 2 a 寸 寸 磷脂質 (HSPC) mg/mL oo 塡裝之膜組成 (m ο 1 比) I PEG- DSPE 卜 ο 脂質 HSPC : Choi : TRX-20 oo (N 寸 ο 調製例1 2 -65 - 1362931 (試驗例9)抗腫瘤效果 將2xl06細胞/小鼠之人大腸癌細胞(HCT 116)移植 至小鼠(BALB/c nude、雄、6週齡、日本 charluse liver公 司)之左鼠蹊部皮下。腫瘤移植後,等到以1/2 · ab2 ( a係 腫瘤之長度,b係短度)所求得之推定腫瘤體積達到90mm3 左右(〇天)之翌日開始,每4天計3次(第1、5、9天), 尾靜脈注射調製例12調製之CPT-11或伊立替康鹽酸鹽生理 食鹽水溶液。以未注射藥劑之小鼠做爲對照群。 注射後’於第5、8、1 2、1 6、2 1天後求得推定腫瘤體 積及小鼠之體重。又,注射第2 1天後切割腫瘤測出重量後 ,依試驗例6中所示式,算出腫瘤增殖阻斷率I.R. ( % )。 結果示於表12及圖14與圖15。 對於人大腸癌,CPT-11製劑及伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水溶液係與對照群比較均示有顯著之腫瘤抑制效果(表 12,圖Η )。又,CPT-1 1製劑係與伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水相比較,具有高抗腫瘤效果。又,兩藥劑均對於小鼠 之體重未予以影響(圖15)。 -66- 1362931
褂一 ^ 〇〇 o o 寸寸 V J 1 — 〇 00 os m 卜 l〇 t—^ oo ro 寸 w"> Q Γπτπΐί V〇 — 卜 CO Ό 〇〇 寸 _i GO \|τττΐ| 調 C r H o +1 — o o o o o +1 +1 +1 CZ5 CZ5 *—< o o o +1 +1 +1 锲 S ^s.1 — VO 寸 v〇 f—« rn unnJ S 画 C N Cm o o 〇 1、 1、 v j o o 〇 cc V_✓ /-N mind] in iT) 啊 y | 卜 · IT) 觀 w 1 00^0 — m -^ ^ s 柴 狭 /*—s (N m 鸲 鏘 mil 勘 Fffg ιϋι3 傷 蘅 跏 仁i 雜 r-Η m H 氍 Ph u 顬 -67- 1362931 (試驗例1 ο)單次投予時之藥物動態 對於麻醉下,大腿靜脈及大腿靜脈施予套管後,裝在 Bollmancage之大鼠(CD ( SD) IGS大鼠,雄,7週齡,日 本Charluse liver),以調製例12調製的CPT-11製劑或伊立 替康鹽酸鹽生理食鹽水稀釋溶液做爲伊立替康鹽酸鹽可成 爲3、10及30mg/kg,自大脈靜脈套管投予靜脈內。 投予後經2、10、30分鐘,1、3、6、9、24及30小時, 自大腿動脈套管抽血,離心分離採取50mi血漿,以內標液 200ml予以稀釋。在50ml此內標液稀釋血漿中加入500ml甲 醇,經攪拌後,以0.146M H2P〇4稀釋爲10倍者做爲總CPT-11濃度測定用試料。另一方面,超離心分離(100, OOOxg, 30分鐘,10 °C ) 20 0ml內標液稀釋血漿,自上層部分離 50ml並以0.146M H3P〇4稀釋爲10倍者做爲測定游離CPT-11 濃度,SN-38濃度及SN-38G濃度測定用試料。所得試料 依 Kurita 等之方法(J. Chromatogr B 724,p3 3 5 -3 44,1999 ),於PROSPEKT-HPLC分別測定其各濃度,結果示於圖 16~ 1 9。 總CPT-11濃度在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液中係 在各投予量(3、10及30mg/kg)下,投予後均急速地減少 ,自0.5 ~9小時爲止係指數函數地減少。另一方面,CPT-11製劑則投予10分鐘後至30小時爲止大約以指數函數地減 少,與伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液相比,確認可顯著 地延長滯留時間(圖1 6 ) ^ CPT-1 1製劑投予後之游離CPT-11濃度係投予後均爲自 -68- 1362931 10分鐘後至30小時爲止,大約以指數函數地減少,確認與 伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液相比顯著地延長了滯留時 間(圖1 7 )。 SN-3 8濃度在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液中係各 投予量下均爲投予後立即急速減少,惟1小時以後之消失 變成緩慢,30mg/kg時係3小時後爲止大約維持一定之濃度 。另一方面,CPT-11製劑係3及10mg/kg時投予後3〜6小時 可達最高濃度,然後緩慢地減少。30mg/kg時係投予後立 即達最高濃度’其後1小時爲止爲急速減少,惟其後9小時 爲止,大約可維持一定之濃度(圖18)。 SN-3 8G濃度在伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液時, 各投予量均可在投予10分鐘後達最高濃度,其後至1小時 爲止較爲快速,其後則緩慢地滅少。另一方面,CPT-1 1製 劑則投予後1小時爲止’濃度係增加,其後維持該濃度僅 稍爲減少(圖19)。
[實施例10] 針對做爲本發明高載持CPT-1 1製劑之調製例9調製的 CPT-1 1製劑試驗。 (試驗例11)抗腫瘤效果 以移植針移植2~3mm四方形之人大腸癌細胞(HT-29 )於小鼠(BALB/c nude ’雄,6週齡,日本Clea公司)之 鼠蹊部皮下。移植腫瘤後,以1/2 . ab2 ( a係腫瘤之長度, -69- 1362931 b係短距)求得之推_定腫瘤體積達到100mm3左右時(第1天 )與4日後(第5天)及8日後(第99天)之計3次,尾靜脈 注射調製例9調製之CPT-1 1製劑或伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水溶液。以未注射藥劑之小鼠做爲對照群。 首次注射後,於4、8、12、17、21天後求得推定腫瘤 體積及小鼠之體重。首次注射後第21天取出腫瘤測定重量 後,藉由試驗例6所示式,算出腫瘤增殖阻斷率I.R. (%)
結果不於表13,圖20及圖21。 對人大腸癌,CPT-1 1製劑及伊立替康鹽酸鹽生理食鹽 水溶液均較對照群示有更強之腫瘤增殖抑制效果。又, CPT-1 1製劑係與伊立替康鹽酸鹽比較,示有高抗腫瘤效果 (表13,圖20)。又,兩種藥劑均對小鼠之體重沒有影響 (圖 21 )。 -70- 1362931
ει撇 抑制率 1 69.4 84.1 92.0 CN ON Ο 〇〇 寸寸 r〇 CN 寸 /—N Q 剩 〇〇 ι|τττ]| 調 ΰ 徵 α> tirmi S bO 0.58±0.29 0.1 8±0.15 0.09±0.06 0.05±0.03 0.36±0.41 0.44±0.36 0.3 3±0.32 劑量 (mg/kg ) 1 25 50 100 25 50 100 對照群 CPT-1 1製齊!((調製例9) 鹽酸伊立替康生理食鹽水溶液 -71 1362931 (試驗例1 2 )由單次投予時之藥物動態 將2.5 X105細胞/小鼠之小鼠纖維肉瘤(Meth A )移至 小鼠(BALB/c,雄,7週齡,日本S.L.C)之鼠蹊部皮 下。腫瘤移植後放置20天,使腫瘤增殖後,使調製例9調 製之CPT-11製劑或伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液做爲 l〇mg/kg之伊立替康鹽酸鹽濃度,投予鼠靜脈。 投予後經10、30分鐘及1、3、6、12、24、48、96小時 後心臟抽位,經離心分離(1 5,000pm,1分鐘,0 °C )得 到血漿。測定投予CPT-11製劑之動物的血漿中CPT-11濃度 係以0.146M 1^?04稀釋所得血漿爲50倍後,以加入等量之 內標液者做爲測定用試枓。投予CPT-11製劑之動物的血漿 中SN-38及SN-38G濃度,及投予伊立替康鹽酸鹽生理食 鹽水溶液之動物的血漿中藥物濃度係以0.146M H3P04稀釋 所得血漿爲4倍後,以加入等量內標液者爲測定用試料。 心臟抽血後,自鼠蹊部割出腫瘤,以生理食鹽水洗淨 後,測定腫瘤重量。加入5倍量之冰冷內0.146M 113?04後 ,以特弗龍勻漿器使之成均質物。在20 0ml均質物中加入 50ml內標液及0.75ml甲醇予以懸濁後,以-20°C放置一夜, 遠心分離(1 5,000rpm、3分鐘、0°C )後,在0.1ml上澄液中 加入0.4ml 0.146M H3P04,做爲測定HPLC用試料。所得測 定用試料係依Kurita等之方法(J. Chromatogr B 724, P3 3 5 -3 44, 1 999 ) > 以 P R Ο S P E K T - Η P L C 測定各濃度。結果 示於圖22~27。 CPT-1 1之血漿中濃度係因藉由脂質體製劑化之關係, -72- 1362931 CPT-l 1製劑係與與伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液相比較 ,血漿中濃度-時間曲線下面積爲增302倍,平均滯留時間 爲增加4.4倍(圖22)。另一方面,SN-3 8之血漿中濃度係 藉由脂質體製劑化之關係,血漿中濃度-時間曲線下面積 增加至2.5倍,亦延長了平均滯留時間(圖23 )。又SN-3 8 G之濃度係因藉由脂質體化之關係而血漿中濃度-時間曲 線下面積增加至1.8倍,平均滯留時亦被延長(圖24)。
伊立替康鹽酸鹽之腫瘤組織內藥物濃度係在伊立替康 鹽酸鹽生理食鹽水溶液中係投予後0.5小時達到最高腫瘤 組織中濃度後,以2、3小時之半衰期即減少。另一方面, CPT-1 1製劑係投予後濃度會慢慢增加,1 2小時後達最高腫 瘤組織中濃度,其後較伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液緩 慢地減少,腫瘤組織中濃度-時間曲線下面積係增加爲9.0 倍(圖2 5 )。 SN-3 8之腫瘤組織內藥物濃度係伊立替康鹽酸鹽生理 食鹽水溶液時爲投予後經10鐘達最高腫瘤組織中濃度後慢 慢減少。CPT-l 1製劑係投予後約6小時爲止係慢慢上昇, 其後至48小時爲止係大約維持爲一定。其後大約與伊立替 康鹽酸鹽生理食鹽水溶液一樣以消失半衰期減少,腫瘤組 織中濃度-時間曲線下面積係增加3.9倍(圖26)。 SN-3 8 G之腫瘤組織內藥物濃度係在伊立替康鹽酸鹽生 理食鹽水溶液時爲投予後經10分鐘達最高腫瘤組織中濃度 後慢慢減少。CPT-1 1製劑時則投予後慢慢上昇,投予後1 2 小時達最高腫瘤組織濃度,其後慢慢減少(圖27 )。 -73- 1362931 由此可知’ CPT-11製劑係較伊立替康鹽酸鹽生理食鹽 水溶液具更高之血中滯留性及腫瘤移行性》 [實施例11] 做爲本發明之高載持CPT-11製劑,測試調製例7調製 之CPT-1 1製劑。 (試驗例13)藉由投予藥劑3次所得抗腫瘤效果 將2.5 xl05cell/小鼠之小鼠纖維肉瘤(Meth A)移植 於小鼠(BALB/c,雌,7週齡,日本Clea公司)之鼠溪部 皮下。移植腫瘤後第7、9、11天,或第7、11、15天計3次 ,尾靜脈注射調製例7調製之CPT.1 1製劑或伊立替康鹽酸 鹽生理食鹽水溶液。以未注射藥劑之小鼠爲對照群。 注射後第2 1天切割出腫瘤予以測定後,依試驗例6所 示式’算出腫瘤增殖阻斷率I.R ( %)。結果示於表14。
針對小鼠纖維肉瘤’ CPT-11製劑及伊立替康鹽酸鹽生 理食鹽水溶液係均與對照群相比具有顯著之腫瘤增殖抑制 效果。又’ CPT-1 1製劑係比伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶 液具有更高之抗腫瘤效果。又,兩種藥劑均對小鼠之體重 沒有任何影響。 -74- 1362931
掛 一 〇\ cs 〇\ ο v〇 m Q 寸 1 ON VO VO ν〇 ON <N Γ- 00 ON (Ν 〇〇 Os m /<—N Q _ GO 〇 m r*·** < — o OO CN — 寸 Γ-- CN 寸一 Γ— ON 寸寸 獅 C o +1 o o +1 +1 Ο Ο +1 +1 o o +l +l Ο ο +ι +ι 擊 ω 〇 oo ΛΪ /—s 卜 οο ΛΟ — Ό ΟΝ Ό /Tv. rvl tlmil S s (N V N o o ν Ν — <ζ> o o \J\ C N y—^ bO ΠΙ r-H in ^ u-i in • H mil 勸 1 ON On Os 0's n 卜卜 卜卜 Λ Λ 卜卜 r\ r> 卜卜 /—N mlml] 如 /-¾ ¢-¾ 啊 ^ .—, ^ 1 ^ 〇 ° ο ° ο ° ° T~H B 's—✓ 燦 璨 链 独 * ,*—\ m /*—Ν m 鸲 鉍 mt1 棚 mil st1 0Η» mia ffig πη3 舷 Ν—✓ 舷 蘅 龅 蘅 撕 m 仁1 r—Η w Η 陛 Η 氍 Η A 氍 Ρη U 劚 Ρη U m -75- 1362931 (試驗例14)投予1次或2次藥劑之抗腫瘤效果 將2.5 xl05cell/小鼠之小鼠纖維肉瘤(Meth A)移植 於小鼠(BALB/c,雌,7週齡,日本Clea公司)之鼠蹊部 皮下。移植腫瘤後第7、11天,計1次或2次,尾靜脈注射 調製例7調製之CPT-1 1製劑或伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水 溶液。以未注射藥劑之小鼠爲對照群。 注射後第2 1天切割出腫瘤予以測定後,依試驗例6所 示式,算出腫瘤增殖阻斷率I.R(%)。結果示於表15。 針對小鼠纖維肉瘤,CPT-1 1製劑及伊立替康鹽酸鹽生 理食鹽水溶液係除去一部份伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶 液以外,其他均與對照群相比具有顯著之腫瘤增殖抑制效 果。又,CPT-11製劑係比伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液 具有更高之抗腫瘤效果。又,兩種藥劑均對小鼠之體重沒 有任何影響。
-76- 1362931
>01 撇 (0/{>) (·Crs+IIGSUI ”3) (se/MUI)褂蕋臣 s_锲麵 0刮蜮 _蘅 卜 oo — CN O 卜 00 CN ' <0 OO Ο Ό 寸 — CN 1 寸 σ\ ο 寸寸卜 ο Ό m <N <N m —〇 in v〇 (N 寸 m 寸 寸寸 — 寸》η 〇〇 ON 寸 — (N m 寸 CS Ον 一 〇〇 〇3 v〇 cn '—1 CD Γ^~ ί〇 寸 H '—· CN oo 寸 寸 1〇 卜 寸 ON ON CO CO < ON CN CO CM VO 寸 〇 +1 m o o o +1+1+1 m 卜 v〇 σ\ t> a> 〇 〇 〇 +1 +1 +1 (N — 寸 〇〇 v〇 m ο ο +丨 +1 ο — 卜寸 Ο 〇 +1 +1 〇 00 寸 ON 〇 〇 〇 +1 +1 +1 ^ m m 0Λ V〇 V〇 〇 〇 〇 +1 +1 +1 on m oo 寸 m o cn t-H CN (N (N τ-Η CN '―< > ^ ^ c^b (N (N (N 1 卜 卜卜 卜卜卜 τ—H t—Η 1—^ T-H T < 4 卜卜卜 ι-H i—H r—H y-^ 卜卜卜 1 • o (N cn »n r*H • in o <N 〇j i〇 们 〇 cn 〇 cn .l〇 o CN 〇sj vn 〇 (N OJ … 對照群 /—s 卜 E \\m s—✓ W 鏘 1 H Plh ϋ 鹽酸伊立替康生理食鹽水溶液 CPT-1 1製劑(調製例7) 鹽酸伊立替康生理食鹽水溶液 CPT-1 1製劑(調製例7) 鹽酸伊立替康生理食鹽水溶液 -77- 1362931 [實施例12] 做爲本發明之高載持CPT-11製劑,測試調製例8調製 之CPT-I 1製劑。 (試驗例15)抗腫瘤效果 將2~3mm方形之人肺癌細胞(QG56)以移植針移植於 小鼠(BALB/c nude,雄,6週齡,日本Clea公司)之鼠暖 部皮下。移植腫瘤後,藉由1/2· ab2 (a係腫瘤之長度,b 係寬度)所求得之推定腫瘤體積達到1mm3左右之時間(第 1天)與其4天後(第5天)及8天後(第9天)計3次,尾靜 脈注射調製例8調製之CPT-1 1製劑或伊立替康鹽酸鹽生理 食鹽水溶液。未注射藥劑之小鼠做爲對照群。 第一次注射後,於4、8、12、16、21天後求得推定腫 瘤體積及小鼠之體重。又,第一次注射後第21天取出腫瘤 ,測定重量後,依試驗例6所示式算出腫瘤增殖阻斷率I.R. φβ ( % )。結果示於表16,圖28及圖29。 CPT-11製劑及伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液係對於 人肺癌均比對照群更具有顯著之腫瘤增殖抑制效果。又, CPT-1 1製劑係比伊立替康鹽酸鹽生理食鹽水溶液具有更高 之抗腫瘤效果(表16,圖28)。又,兩種藥劑均對小鼠之 體重沒有影響(圖29)。 78- 1362931
褂一 〇 m (N Ό 卜 (N 嘉 ^ 1 Os 〇\ 0\ to 00 卜 S Cs ON Cn m 寸 v〇 /<—*s Q ¢3 cn 1 < Cvl CN O 〇 〇 〇 CO y—i OO 寸 l〇 — ιίτττ]| nllm G 〇 〇 〇 〇 o o o crt +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 锲 S 1—H Λν m (N cn i«*s j^k /«—*. oo m tlmil S S VN CN o o o oo on r-Ή DO v_/ mljn]] 如 r-s —» 、 1 π O (N ^ ° 〇 <N 敕 ω ε T—H 燦 -½ m 冕 舭 m m" 脚 @F iii® S—✓ m m 龅 m t H 陛 H 氍 u m -79- 1362931 【圖式簡單說明】 圖1示實施例1調製之CPT-11製劑在37 °C的製劑加速 安定性試驗之結果(釋出率)圖。 圖2示實施例3調製之CPT-11製劑在37 °C的製劑加速 安定性試驗之結果(釋出率)圖。 圖3示實施例3調製之CPT-11製劑在37 °C的製劑加速 安定性試驗之結果(粒徑)圖。
圖4示血中滯留性試驗中於注射後採血時間之血漿( Plasma)中伊立替康鹽酸鹽濃度圖。 圖5示對CPT-11封入效率(%)與開環體存在率(%) 下之外水相pH値之關係圖。 圖6係本發明之實施例8調製之CPT-1 1製劑的抗腫瘤效 果,以推定之腫瘤體積的經久變化予以表示之圖。 圖7係本發明之實施例8調製之CPT-11製劑的抗腫瘤效 果,以體重之變化予以表示之圖。
圖8示實施例8中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血漿 中總CPT-1 1濃度變化圖。 圖9示實施例8中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血漿 中游離CPT-1 1濃度變化圖。 圖10示實施例8中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血 漿中SN-38濃度變化圖。 圖1 1示實施例8中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血 漿中SN-38G濃度變化圖。 圖12示實施例8調製之CPT-1 1製劑的血液毒性(淋巴 -80- 1362931 細胞)圖。 圖13示實施例8調製之CPT-11製劑的血液毒性(嗜中 性白血球)圖。 圖14係本發明之實施例9調製之CPT-1 1製劑的抗腫瘤 效果,以推定之腫瘤體積之經久變化予以表示之圖。 圖15係本發明之實施例9調製之CPT-11製劑的抗腫瘤 效果,以體重變化予以表示之圖。
圖16示實施例9中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之血 漿中總CPT-1 1濃度變化圖。 圖17示實施例9中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血 漿中游離CPT-1 1濃度變化圖。 圖18示實施例9中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血 漿中SN-38濃度變化圖。 圖19示實施例9中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之血 漿中SN-38G濃度變化圖。 圖2 0係本發明之實施例10調製之cpt-1 1製劑的抗腫瘤 效果’以推定之腫瘤體積之經久變化予以表示之圖。 圖21係本發明之實施例10調製之CPT-11製劑的抗腫瘤 效果,以體重變化予以表示之圖。 圖22示實施例1〇中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之血 漿中CPT-11濃度變化圖。 圖23示實施例10中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之血 漿中SN-38濃度變化圖。 圖24示實施例10中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之血 -81 - 1362931 漿中SN-38G濃度變化圖。 圖25示實施例10中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之腫 瘤中CPT-1 1濃度變化圖。 圖26示實施例1〇中CPT-1 1製劑的藥物動態試驗中之腫 瘤中SN-38濃度變化圖。 圖27示實施例1〇中CPT-11製劑的藥物動態試驗中之腫 瘤中SN-38G濃度變化圖。
圖28係本發明之實施例12調製之CPT-11製劑的抗腫瘤 效果,以推定腫瘤體積之經久變化予以表示之圖。 圖29係本發明之實施例12調製之CPT-1 1製劑的抗腫瘤 效果,以體重變化予以表示之圖。 -82-
Claims (1)
1362931 杏禾·: 丨〇ύ年'月(1日修(更)正本 第094118012號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國101年1月19日修正 十、申請專利範園 1· 一種伊立替康製劑,其特徵爲,以含有磷脂質做爲 主膜材料之脂質雙重膜所形成,僅外表面以含有親水性高 分子之表面改性劑所改性而成之脂質體上,於該脂質體之內 水相與外水相之間使用離子梯度,將伊立替康及/或其鹽, φ 以至少0.1莫耳/莫耳(藥劑莫耳/總脂質量莫耳)之濃度內 封者。 2.如申請專利範圍第1項之伊立替康製劑,其中該離子 梯度爲質子濃度梯度,具有該內水相側之pH値爲較外水相 側之pH爲低之pH梯度者。 3.如申請專利範圍第2項之伊立替康製劑,其中該pH 梯度係藉由銨離子濃度梯度及/或具有可被質子化之胺基的 有機化合物濃度梯度所形成者。
4 ·如申請專利範圍第1〜3項中任一項之伊立替康製劑, 其中該脂質體爲進而含有該磷脂質以外脂質及/或表面改性 劑者。 5. 如申請專利範圍第4項之伊立替康製劑,其中該表面 改性劑係含有具鹼性官能基之化合物者。 6. —種醫藥組成物’其特徵爲含有如申請專利範圍第1 〜3項中任一項之伊立替康製劑者。 7 .如申請專利範圍第1項之伊立替康製劑,其中於3 7 °C 1362931 下1個月 8. 項中任 9. 項中任 以上,4°C下6個月以上爲穩定。 -種醫藥組成物,其特徵爲含有如申請專利範圍第4 -項之伊立替康製劑者。 -種醫藥組成物,其特徵爲含有如申請專利範圍第5 -項之伊立替康製劑者。
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