ES2967961T3 - Liposomas útiles en la administración de fármacos - Google Patents

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Daryl Drummond
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Abstract

La presente invención proporciona composiciones de liposomas que contienen amonio y/o polianión sustituidos y, opcionalmente, con una entidad terapéutica o de formación de imágenes deseada. La presente invención también proporciona métodos para preparar las composiciones de liposomas proporcionadas por la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Liposomas útiles en la administración de fármacos
DECLARACIÓN DE PRIORIDAD
Esta Solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 60/567,921 presentada el 3 de mayo de 2004.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere de manera a una composición farmacéutica que comprende una composición que comprende un liposoma.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los liposomas, o vesículas de bicapa lipídica, se han usado o propuesto para su uso en una variedad de aplicaciones en la investigación, la industria y la medicina, en particular para el uso como portadores de compuestos de diagnóstico o terapéuticosin vivo.Consultar, por ejemplo Lasic, D. Liposomes: from physics to applications. Elsevier, Amsterdam, 1993. Lasic, D., y Papahadjopoulos, D., eds. Medical Applications of Liposomes. Elsevier, Ámsterdam, 1998. Los liposomas habitualmente se caracterizan por tener un espacio interior aislado de un medio exterior por una membrana de una o más bicapas que forman un saco microscópico o vesícula. Las membranas bicapa de los liposomas típicamente están formadas por lípidos, es decir, moléculas anfifílicas de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente. Consultar Lasic D., 1993,supra.Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfifílicos y surfactantes (polimerosomas, niosomas). Un liposoma típicamente sirve como portador de una entidad tal como, sin limitación, un compuesto químico, una combinación de compuestos, un complejo supramolecular de origen sintético o natural, un material genético, un organismo vivo, una porción del mismo, o un derivado del mismo, que es capaz de tener una propiedad útil o ejercer una actividad útil. Con este propósito, los liposomas se preparan para contener la entidad deseada en una forma incorporada al liposoma. El proceso de incorporación de una entidad deseada en un liposoma a menudo se denomina "carga". La entidad incorporada al liposoma puede estar total o parcialmente localizada en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociada a la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporación de entidades en liposomas también se denomina encapsulación o atrapamiento, y estos tres términos se usan en la presente indistintamente con el mismo significado. La intención de la encapsulación liposomal de una entidad es a menudo proteger a la entidad del entorno destructivo a la vez que se proporciona la oportunidad de que la entidad encapsulada ejerza su actividad principalmente en el sitio o en el entorno donde dicha actividad es ventajosa pero no tanto en otros sitios donde dicha actividad puede ser inútil o indeseable. Este fenómeno se denomina liberación. Por ejemplo, una sustancia farmacológica dentro del liposoma puede estar protegida de la destrucción por las enzimas en el cuerpo, pero liberarse del liposoma y proporcionar tratamiento en el sitio de la enfermedad.
Idealmente, tales liposomas pueden prepararse para que incluyan el compuesto deseado (i) con alta eficiencia de carga, es decir, alto porcentaje de entidad encapsulada con respecto a la cantidad tomada en el proceso de encapsulación; (ii) alta cantidad de entidad encapsulada por unidad de material de bicapa liposomal; (iii) a una alta concentración de entidad encapsulada, y (iv) en una forma estable, es decir, con escasa liberación (filtración) de una entidad encapsulada durante el almacenamiento o, en general, antes de que el liposoma aparezca en el sitio o en el entorno donde se espera que la entidad encapsulada en el liposoma ejerza su actividad prevista.
Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de proporcionar varias composiciones de liposomas que sean útiles para la administración de una variedad de compuestos, especialmente entidades terapéuticas, de diagnóstico o de formación de imagenología. La WO 2005/002546 A1 describe una "composición liposomal de Topotecán que puede reconstituirse a partir de una forma liofilizada a una suspensión liposomal inyectable que tiene tamaños liposomales seleccionados en el intervalo de tamaño entre 0,05 y 0,25 micras, y entre aproximadamente el 85-100% de Topotecán atrapado en liposomas". La WO 98/17256 A1 describe una "composición liposomal que contiene un compuesto encapsulado en "forma precipitada estable, y un método para producir la composición". La US 4321 259 A describe "eritrocitos con propiedades mejoradas de liberación de O<2>que tienen fusionados a los mismos pequeños efectores alostéricos, es decir, vesículas lipídicas que contienen hexafosfato de inositol". La US 5 316 771 A describe un "procedimiento mejorado de carga transmembrana simple, eficaz, seguro, económico y rápido para la carga activa eficaz de fármacos anfifáticos débiles en liposomas usando el gradiente transmembrana".
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a una composición farmacéutica que comprende una composición que comprende un liposoma en un medio, en donde el liposoma comprende 1,2-distearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol)oxicarbonil)-1,2distearoilfosfatidiletanolamina en la relación molar 3:2:0,015, y atrapados dentro del liposoma hay irinotecán y octasulfato de sacarosa; y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención se basa en el descubrimiento de que el amonio sustituido y el polianión son útiles para cargar y retener entidades dentro de liposomas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una composición que comprende un liposoma.
En la presente de divulga una composición que comprende un liposoma en un medio, en donde el interior del liposoma contiene un amonio sustituido.
en donde cada uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>es independientemente un hidrógeno o un grupo orgánico que tiene, inclusive, en su totalidad hasta 18 átomos de carbono, en donde por lo menos uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>es un grupo orgánico, en donde el grupo orgánico es independientemente un grupo hidrocarbonado que tiene hasta 8 átomos de carbono, y es un grupo alquilo, alquilideno, alquilo heterocíclico, cicloalquilo, arilo, alquenilo o cicloalquenilo o un derivado sustituido con hidroxi de los mismos, incluyendo opcionalmente dentro de su cadena hidrocarbonada un átomo de S, O o N, formando un enlace éter, éster, tioéter, amina o amida, en donde por lo menos tres de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>son grupos orgánicos, o el amonio sustituido es un amonio estéricamente impedido como, por ejemplo, cuando por lo menos uno de los grupos orgánicos tiene un átomo de carbono secundario o terciario directamente enlazado al átomo de nitrógeno del amonio. Preferiblemente, el compuesto de amonio sustituido encapsulado en liposomas tiene un logaritmo negativo de la constante de disociación ácida (desprotonación) (pKa) de por lo menos aproximadamente 8,0, por lo menos aproximadamente 8,5, por lo menos aproximadamente 9,0, por lo menos 9,5, o por lo menos 10,0, determinado en una solución acuosa a temperatura ambiente.
En la presente se divulga una composición que comprende un liposoma en un medio, en donde el espacio interior del liposoma contiene un polianión y en donde el polianión es un poliol polianionizado o un azúcar polianionizado. El liposoma contiene preferiblemente un gradiente transmembrana capaz de efectuar la carga de una entidad en el liposoma. En una realización, el gradiente transmembrana es un gradiente de un amonio, un amonio cuadernario, o un compuesto de amonio sustituido primario, secundario o terciario que tiene en una solución acuosa diluida a temperatura ambiente un logaritmo negativo de la constante de disociación ácida (desprotonación) (pKa) de por lo menos aproximadamente 8,0, por lo menos aproximadamente 8,5, por lo menos aproximadamente 9,0, por lo menos 9,5, o por lo menos 10,0. El liposoma contiene opcionalmente una entidad atrapada, por ejemplo, un agente terapéutico, un marcador detectable o una molécula orgánica globalmente catiónica.
La composición divulgada en la presente puede comprender además opcionalmente una entidad encapsulada en los liposomas de la presente invención. Preferiblemente, la entidad está encapsulada dentro del espacio interior del liposoma. Por ejemplo, el espacio interior del liposoma comprende además un agente terapéutico antineoplásico y en donde el nivel de toxicidad de la composición para un sujeto es por lo menos igual o menor que el nivel de toxicidad del agente terapéutico antineoplásico administrado al sujeto sin la composición.
La composición divulgada en la presente puede ser opcionalmente una composición liposomal que comprende un compuesto de camptotecina. La composición tiene una actividad anticancerígena por lo menos dos veces, cuatro veces o diez veces mayor que el compuesto de camptotecina administrado de forma similar en ausencia de la composición, mientras que la toxicidad de la composición no excede, es por lo menos dos veces o por lo menos cuatro veces menor que la toxicidad del compuesto de camptotecina administrado de forma similar en ausencia de la composición. En una realización, el compuesto de camptotecina es un profármaco, y está contenido en el liposoma de por lo menos 0,1 mg, por lo menos 0,2 mg, por lo menos 0,3 mg, por lo menos 0,5 mg, o por lo menos 1 mg por 1 mg de los materiales de membrana del liposoma, por ejemplo, lípidos. El compuesto de camptotecina se encapsula preferiblemente en el liposoma sustancialmente dentro del espacio interior del liposoma. En la invención, el compuesto de camptotecina irinotecán (CPT-11) está encapsulado dentro del liposoma.
La composición divulgada en la presente puede ser opcionalmente una composición liposomal de un alcaloide de vinca o un derivado del mismo. La composición tiene una retención del fármaco dentro del liposoma después de 24 horas de exposición en la sangre de un mamíferoin vivode por lo menos el 50%, por lo menos el 60% o por lo menos el 70% de la carga original del fármaco. El alcaloide de la vinca o un derivado del mismo se encapsula preferiblemente en el liposoma sustancialmente dentro del espacio interior del liposoma. Un ejemplo de mamífero es la rata. Los alcaloides de la vinca y sus derivados ejemplares son la vincristina, la vinblastina y la vinorelbina.
En la presente se divulga un método para encapsular una entidad en un liposoma. El método comprende poner en contacto los liposomas con una entidad, por ejemplo, entidad terapéutica o detectable. Preferiblemente, el contacto se realiza en condiciones en las que la concentración de amonio sustituido o un polianión en el medio es menor que la del espacio interior de los liposomas. En una realización, la composición liposomal se pone en contacto con una entidad en un medio acuoso.
En la presente se divulga un método para encapsular una entidad en un liposoma. El método comprende poner en contacto la composición que contiene liposomas con una preentidad, en donde la preentidad es capaz de convertirse en una entidad bajo una condición, y proporcionar la condición dentro del liposoma mediante la cual se convierte la preentidad en la entidad dentro del liposoma. En un caso, la entidad es un compuesto orgánico, y la preentidad es un derivado básico del mismo.
En la presente se divulga un kit para elaborar entidades encapsuladas en liposomas. El kit comprende un recipiente con un liposoma y, opcionalmente, un recipiente que contiene una entidad, y/o instrucciones para un usuario, por ejemplo, para encapsular una entidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal (círculos) y del fármaco (triángulos) después de la administración i.v. en bolo de liposomas cargados con CPT-11 a una rata. Los liposomas se cargan usando el método TEA-Pn (consultar el Ejemplo 9).
La Figura 2 muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal en la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo de liposoma cargado con CPT-11 usando el método TEA-Pn (Consultar el Ejemplo 9).
La Figura 3 muestra la eficacia antitumoral de CPT-11 libre y CPT-11 liposomal contra xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el ejemplo 10).
La Figura 4 muestra la dinámica del peso corporal de los animales durante el tratamiento de ratones desnudos portadores del tumor BT-474 con CPT-11 libre o CPT-11 liposomal. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con el vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 10).
La Figura 5 muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal en la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo del liposoma cargado con CPT-11 usando el método TEA-SOS. (Consultar el Ejemplo 14).
La Figura 6 muestra la eficacia antitumoral de CPT-11 libre y liposomal contra xenoinjertos de cáncer de colon humano HT-29 en ratones desnudos. La leyenda del panel indica el método de carga del fármaco y la dosis administrada por inyección. El "control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con el vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 15).
La Figura 7 muestra la dinámica de los pesos corporales de los animales durante el tratamiento de ratones desnudos portadores de tumores HT-29 con formulaciones libres o liposomales de CPT-11. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo libre de fármaco y liposomas. (Consultar el ejemplo 15).
La Figura 8A muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal después de la administración i.v. en bolo de liposomas cargados con Topotecán a una rata. La leyenda en el panel indica el método de carga del fármaco y el contenido de fármaco de los liposomas. (Consultar el ejemplo 24).
La Figura 8B muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomalen la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo de los liposomas cargados con Topotecán La leyenda del panel indica el método de carga del fármaco y el contenido de fármaco de los liposomas. (Consultar el ejemplo 24).
La Figura 9 muestra la citotoxicidadin vitrode Topotecán libre, liposomal o inmunoliposomal dirigido a HER2 (método TEA-Pn) frente a células de carcinoma de mama SKBr-3. (Consultar el Ejemplo 27).
La Figura 10 muestra la citotoxicidadin vitrode Topotecán libre, liposomal o inmunoliposomal dirigido a HER2 (método TEA-SOS) frente a células de carcinoma de mama SKBr-3. (Consultar el ejemplo 32).
La Figura 11 muestra la eficacia antitumoral de varias formulaciones de Topotecán (TPT) frente a xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. "Control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el Ejemplo 29).
La Figura 12 muestra la dinámica del peso corporal de los animales durante el tratamiento de ratones desnudos portadores del tumor BT-474 con Topotecán libre (TPT), Topotecán liposomal (Ls-TPT) o Topotecán inmunoliposomal anti-HER2 (F5 ILs-TPT). "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 29).
La Figura 13A muestra la eficacia antitumoral de las formulaciones de Topotecán contra xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. Se administraron Topotecán libre (TPT libre) o Topotecán liposomal (Ls-TPT) a un octavo de sus dosis máximas toleradas. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el Ejemplo 31).
La Figura 13B muestra la eficacia antitumoral de las formulaciones de Topotecán contra xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. Se administraron Topotecán libre (TPT libre) o Topotecán liposomal (Ls-TPT) a una cuarta parte de sus dosis máximas toleradas. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo libre de fármaco y liposoma. (Consultar el ejemplo 31).
La Figura 13C muestra la eficacia antitumoral de las formulaciones de Topotecán contra xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. Se administraron Topotecán libre (TPT libre) o Topotecán liposomal (Ls-TPT) a la mitad de sus dosis máximas toleradas. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el Ejemplo 31).
La Figura 13D muestra la eficacia antitumoral de las formulaciones de Topotecán contra xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones desnudos. Se administraron Topotecán libre (TPT libre) o Topotecán liposomal (Ls-TPT) a sus dosis máximas toleradas. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 31).
La Figura 14 muestra la dinámica de los pesos corporales medios durante el tratamiento de ratones desnudos portadores del tumor BT-474 con Topotecán libre (TPT libre) o Topotecán liposomal (Ls-TPT) administrados a sus dosis máximas toleradas. "Control" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 31).
La Figura 15 muestra la citotoxicidad de 6-(3-aminopropil)-elipticina libre (AE libre), 6-(3-aminopropil)-elipticina liposomal (Ls-AE), o 6-(3-aminopropil)-elipticina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5 ILs-AE)) contra células de carcinoma de mama BT-474in vitro.(Consultar el Ejemplo 35).
La Figura 16 muestra la citotoxicidadin vitrode 6-(3-aminopropil)-elipticina libre (APE libre), 6-(3-aminopropil)-elipticina liposomal (Ls-APE), o 6-(3-aminopropil)-elipticina inmunoliposomal dirigida a EGFR (C225-ILs-APE) contra células de carcinoma de mama con expresión baja (MCF-7) o alta (MDA-MB468) del receptor EGF. (Consultar el Ejemplo 36).
La Figura 17 muestra los atributos farmacocinéticos sanguíneos de la 6-(3-aminopropil)ellipticina (APE) formulada liposomalmente: farmacocinética sanguínea del lípido liposomal (Panel A, círculos abiertos), el fármaco (Panel A, círculos rellenos) y la dinámica de la relación fármaco a lípido liposomal (Panel B) después de la administración i.v. en bolo de liposomas de APE a una rata. (Consultar el ejemplo 37).
La Figura 18 muestra atributos farmacocinéticos sanguíneos de vinorelbina formulada en liposomas (Ls-VRB), e inmunoliposomas anti-HER2 (F5-ILs-VRB): farmacocinética sanguínea del lípido liposomal (Panel A), el fármaco (Panel B), y la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal (Panel C) después de la administración i.v. en bolo de liposomas de vinorelbina a una rata. (Consultar el ejemplo 43).
La Figura 19 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal después de la administración i.v. en bolo de liposomas cargados con vinorelbina a una rata. Los liposomas se cargan usando dextransulfato de trietilamonio (DS-TEA), dextransulfato de amonio (DS-A) o sulfato de amonio (S-A) preenvasados. (Consultar el ejemplo 44).
La Figura 20 muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal en la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo de los liposomas cargados con vinorelbina usando dextransulfato de trietilamonio (DS-TEA), dextransulfato de amonio (DS-A) o sulfato de amonio (S-A) previamente envueltos. (Consultar el ejemplo 44).
La Figura 21 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal después de la administración i.v. en bolo de liposomas cargados con vinorelbina a una rata. Los liposomas se cargan usando sucroseoctasulfato de trietilamonio (TEA-SOS) preenvasado y tienen el tamaño medio indicado en el pie de foto del panel. (Consultar el ejemplo 45).
La Figura 22 muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal en la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo de liposomas cargados con vinorelbina. Los liposomas se cargan usando sucrooctasulfato de trietilamonio (TEA-SOS) preatrapado y tienen el tamaño medio indicado en la leyenda del panel. (Consultar el ejemplo 45).
La Figura 23 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal en una rata después de la administración i.v. en bolo de vinorelbina formulada en liposomas (Ls-VRB) o inmunoliposomas anti-HER2 (F5-ILs-VRB) usando el método TEA-SOS. (Consultar el Ejemplo 46).
La Figura 24 muestra la dinámica de la relación de fármaco a lípido liposomal en la sangre de una ratain vivodespués de la administración i.v. en bolo de vinorelbina formulada en liposomas (Ls-VRB) o inmunoliposomas anti-HER<2>(F5-ILs-VRB) utilizando el método TEA-SOS. (Consultar el Ejemplo 46).
La Figura 25 muestra la citotoxicidadin vitrode vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls-VRB), o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-Ils-VRB) contra células de cáncer de mama humano MDA-MB-453 que sobreexpresan HER2. (Consultar el Ejemplo 48).
La Figura 26 muestra la citotoxicidadin vitrode vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls-VRB) o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-Ils-VRB) contra células humanas de cáncer de pulmón no microcítico CaLu-3 que sobreexpresan HER2. (Consultar el Ejemplo 49).
La Figura 27 muestra la citotoxicidadin vitrode vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB/SOS-TEA), o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-ILs VRB/SOS-TEA) contra células de cáncer de mama humano SKBr-3 que sobreexpresan HER2. (Consultar el Ejemplo 50).
La Figura 28 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (VRB libre) o de la vinorelbina liposomal (Ls VRB) contra xenoinjertos de cáncer de colon humano HT-29 en ratones desnudos. "Solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con el vehículo libre de fármaco y liposoma. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. (Consultar el ejemplo 51).
La Figura 29 muestra la dinámica de los pesos corporales medios durante el tratamiento de ratones desnudos portadores de tumores HT-29 con vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB) o vehículo solo (solución salina). Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. (Consultar el ejemplo 51).
La Figura 30 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (VRB libre) o de la vinorelbina liposomal (VRB Ls) en un modelo de carcinoma de colon murino C-26 singénico. La dosis del fármaco por inyección fue la indicada en la leyenda del panel. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. "Solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 52).
La Figura 31 muestra la dinámica de los pesos corporales medios durante el tratamiento de ratones portadores de tumores de carcinoma de colon murino C-26 singénico con varias dosis de vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB), o sólo con vehículo (solución salina). La dosis del fármaco por inyección fue la indicada en la leyenda del panel. (Consultar el ejemplo 52).
La Figura 32 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (fármaco libre) o de la vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 conjugada con scFv F5 preparada mediante un método TEA-SOS (F5-ILs-VRB TEA-SOS), vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 preparada mediante un método TEA-Pn (F5-ILs-VRB TEA-Pn) contra xenoinjertos de carcinoma de mama humano que sobreexpresa HER2 (BT-474) en ratones desnudos. "Control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el ejemplo 53).
La Figura 33 muestra la dinámica del peso corporal medio durante el tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos de carcinoma de mama humano con sobreexpresión de HER2 (BT-474) con vinorelbina libre, vinorelbina inmunoliposomal conjugada con scFv F5, vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 preparada mediante un método TEA-SOS, vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 preparada mediante un método TEA-Pn, o sólo con vehículo. Para la explicación de los símbolos, consultar la leyenda de la Figura 32. (Consultar también el Ejemplo 53).
La Figura 34 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (fármaco libre) o de la vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 conjugada con scFv F5 preparada usando varias cantidades de PEG-lípido contra xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con sobreexpresión de HER2 en ratones desnudos. Las barras de error son la desviación estándar de los datos. "Control con vehículo" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el ejemplo 54).
La Figura 35 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (NAV libre), la vinorelbina liposomal (NAV Lip) o la vinorelbina inmunoliposomal antiEGFR conjugada con FC225Fab' (C225-NAV Lip) contra xenoinjertos de glioblastoma humano (U87) con sobreexpresión de EGFR en ratones desnudos. "Solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el ejemplo 55).
La Figura 36 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal y la dinámica de la relación fármaco/lípido liposomal en la sangre de una rata después de la administración i.v. en bolo de doxorrubicina formulada en liposomas usando el método del sulfato de trietilamonio. (Consultar el Ejemplo 56).
La Figura 37 muestra la eficacia antitumoral de la doxorrubicina liposomal (Ls-Dox), o de la doxorrubicina inmunoliposomal anti-HER2 conjugada con scFv F5 (F5 ILs-Dox) preparada usando varias cantidades de PEG-lípido contra xenoinjertos de carcinoma de mama humano con sobreexpresión de HER2 (BT-474) en ratones desnudos. La leyenda en el panel muestra la cantidad de PEG-lípido expresada en % en moles de fosfolípidos del liposoma. "Control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposomas. (Consultar el ejemplo 57).
La Figura 38 muestra la farmacocinética sanguínea de la vinblastina liposomal en una rata. (Consultar el ejemplo 58).
La Figura 39 muestra la dinámica de la relación fármaco/lípido liposomal en la sangre de una rata después de la administración i.v. en bolo de vinblastina liposomal. (Consultar el Ejemplo 58).
La Figura 40 muestra la citotoxicidadin vitrode la vincristina libre (VCR libre), la vincristina liposomal (Ls-VCR) o la vincristina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-ILs-VCR) contra las células de cáncer de mama humano SKBr-3 con sobreexpresión de HER2. (Consultar el Ejemplo 61).
La Figura 41 muestra la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal en una rata después de la administración i.v. en bolo de vincristina formulada en liposomas de diferente tamaño medio (indicado en la leyenda del panel). (Consultar el Ejemplo 62).
La Figura 42 muestra la dinámica de la relación fármaco/liposoma lipídico en la sangre de una rata después de la administración i.v. en bolo de vincristina formulada en liposomas de diferente tamaño medio (indicado en la leyenda del panel). (Consultar el Ejemplo 62).
La Figura 43 muestra la eficacia antitumoral de la vincristina libre (VCR libre), la vincristina liposomal preparada mediante el método del citrato de trietilamonio (Ls-VCR Citrato), la vincristina liposomal preparada mediante el método del sucrooctasulfato de trietilamonio (Ls-VCR SOS), o vincristina inmunoliposomal anti-HER2 conjugada con scFv F5 y preparada mediante el método del sucrooctasulfato de trietilamonio (F5 ILs-VCR SOS) contra xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con sobreexpresión de HER2 en ratones desnudos. "Control de solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el Ejemplo 64).
La Figura 44 muestra la dinámica de los pesos corporales medios durante el tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos de carcinoma de mama humano con sobreexpresión de HER2 (BT-474) con vincristina libre (VCR libre), vincristina liposomal preparada por el método del citrato de trietilamonio (Ls-VCR Citrato), vincristina liposomal preparada por el método del sucrooctasulfato de trietilamonio (Ls-VCR SOS), vincristina inmunoliposomal anti-HER2 conjugada con scFv F5 preparada por el método del sucrooctasulfato de trietilamonio (F5 ILs-VCR SOS), o sólo con vehículo (control de solución salina). (Consultar el Ejemplo 64).
La Figura 45 muestra la eficacia antitumoral de la vincristina libre (vincristina), la vincristina liposomal (nt-vcr) o la vincristina inmunoliposomal antiEGFR conjugada con Fab'C225 (C225-vcr) contra xenoinjertos de cáncer cerebral humano (U87) con sobreexpresión de EGFRvIII en ratones desnudos. "Solución salina" designa a los ratones tratados únicamente con vehículo sin fármaco ni liposoma. (Consultar el ejemplo 65).
La Figura 46 muestra la farmacocinética sanguínea de CPT-11 y la dinámica del porcentaje de CPT-11 presente en la forma activa (lactona) en la sangre de una rata después de la administración i.v. en bolo de CPT-11 liposomal. (Consultar el Ejemplo 69).
La Figura 47 muestra la farmacocinética sanguínea de CPT-11 y la dinámica del porcentaje de CPT-11 presente en la forma activa (lactona) en la sangre de una rata después de la administración i.v. en bolo de solución de CPT-11 (CPT-11 libre). (Consultar el Ejemplo 69).
DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. El descubrimiento de la presente invención es que el amonio sustituido y el polianión son útiles para cargar y retener las entidades, por ejemplo, compuesto, dentro de liposomas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En la presente de divulga una composición de liposomas que contiene dentro de su espacio interior uno o más compuestos de amonio sustituido de una fórmula
en donde cada uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>es independientemente un hidrógeno o un grupo orgánico, y en donde por lo menos uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>es un grupo orgánico como un grupo alquilo, alquilideno, alquilo heterocíclico, cicloalquilo, arilo, alquenilo o cicloalquenilo, o un derivado sustituido con hidroxi del mismo, que incluye opcionalmente en su cadena hidrocarbonada un átomo de S, O o N, por ejemplo formando un enlace éter (incluyendo un acetal o cetal), éster, sulfuro (tioéter), amina o amida en el mismo. Si menos de tres de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>son grupos orgánicos, entonces, por lo menos uno, y preferiblemente dos, de los grupos orgánicos tiene un átomo de carbono secundario o terciario (es decir, átomos de carbono que tienen 2 o 3 enlaces carbono-carbono, respectivamente) directamente enlazado al nitrógeno amónico, es decir, el amonio sustituido es un amonio estéricamente impedido. En general, se sabe que la presencia de amonio titulable, como el ion amonio no sustituido (NH<4>+), así como de iones de alquilamonio de cadena lineal primaria y secundaria en el espacio interior del liposoma proporciona una encapsulación mejorada de bases anfifílicas débiles, por ejemplo, a través de un mecanismo de carga "activa", "remota" o "impulsada por gradiente transmembrana" (Haran, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1152, p. 253-258; Maurer-Spurej, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1416, p. 1-10). Sin embargo, estos compuestos de amoníaco poseen átomos de hidrógeno que se introducen fácilmente en reacciones de sustitución nucleófila, y reaccionan químicamente de otro modo con las entidades atrapadas en liposomas, y por lo tanto son capaces de deteriorar la integridad química de las entidades durante o después del proceso de carga (atrapamiento) en liposomas. Por tanto, es deseable que un compuesto de amonio sustituido atrapado sea químicamente más inerte, careciendo de funciones químicas que sean inestables o fácilmente reactivas con los componentes del liposoma, que pueden incluir una entidad encapsulada. Inesperadamente, descubrimos que las composiciones liposómicas que comprenden dentro de su espacio interior un amonio terciario y cuaternario sustituido que no tiene un hidrógeno sustituible, o un amonio primario o secundario estéricamente impedido, en el que el acceso a un átomo de hidrógeno de amonio está estéricamente impedido por un grupo orgánico voluminoso colindante, como el que tiene uno o dos átomos de carbono secundarios o terciarios enlazados al nitrógeno de amonio, muestran no sólo una capacidad de carga de entidad sobresaliente, sino también una estabilidad mejorada de la entidad atrapada en el liposoma, por ejemplo, un fármaco, frente a la liberación prematura del liposoma en el cuerpo vivo.
En una realización, el compuesto de amonio sustituido atrapado en liposomas es farmacéuticamente inerte, es decir, no provoca una respuesta fisiológica adversa cuando se administra a un sujeto vivo, por ejemplo, un humano o un animal, dentro de una cantidad de material de membrana liposomal que es suficiente para administrar una dosis eficaz de la entidad atrapada en liposomas. En otra realización, el amonio sustituido tiene un nivel aceptable de toxicidad para un sujeto. Habitualmente, un nivel aceptable de toxicidad significa que la dosis tóxica, por ejemplo, una dosis máxima tolerada (DMT), o una dosis que provoca un 50% de letalidad (DL50) del amonio sustituido es por lo menos dos veces, por lo menos cuatro veces, por lo menos ocho veces, o por lo menos diez veces mayor que la dosis tóxica de una entidad atrapada en liposomas, por ejemplo, fármaco, cargada dentro de los liposomas de la presente invención. Por ejemplo, el sulfato de trietilamonio tiene un nivel aceptable de toxicidad ya que su DL50 es aproximadamente 40 veces más alta que la DL50 de la doxorrubicina, un fármaco anticancerígeno. Los niveles de toxicidad o las respuestas fisiológicas de los amonios sustituidos, así como de las entidades de interés, si no se conocen ya, pueden establecerse fácilmente mediante técnicas rutinarias bien conocidas por los expertos en la técnica biomédica. Consultar, por ejemplo, S.C. Gad. Drug Safety Evaluation, Wiley, Nueva York, 2002. En el Ejemplo 16 de la presente se describe un método para cuantificar la toxicidad del fármaco libre y/o formulado liposomalmente.
En una realización preferida, los grupos orgánicos sustituyentes entre R<1>, R<2>, R<3>, o R<4>tienen el tamaño y las propiedades fisicoquímicas suficientes para asegurar que el amonio sustituido forme en medio acuoso sustancialmente una solución verdadera (molecular), pero no micelas, bicapas o estructuras autoensambladas similares. Por lo tanto, el amonio sustituido preferiblemente tiene poca o ninguna distribución en la parte de bicapa de los liposomas, minimizando de este modo el riesgo de desestabilización, solubilización o permeabilización de los liposomas que atrapan el amonio sustituido.
El grupo orgánico del amonio sustituido es típicamente un hidrocarburo que contiene, inclusive, hasta 8, hasta 6, o hasta 4 átomos de carbono, y en total, los grupos sustituyentes contienen, inclusive, hasta 18, hasta 16, hasta 12, o hasta 9 átomos de carbono. Estos grupos hidrocarbonados sustituyentes incluyen cualquier combinación de átomos de carbono primarios, secundarios o terciarios entrelazados, así como grupos cicloalquilo enlazados en sus extremos terminales directamente al nitrógeno amónico para formar un heterociclo, o a un átomo de carbono de un grupo sustituyente del hidrógeno amónico. Estos grupos alquilo sustituidos también pueden incluir heteroátomos, por ejemplo, oxígeno, nitrógeno o azufre en sus cadenas de carbono formando un grupo funcional, por ejemplo, grupo éter, acetal, amina o sulfuro, así como formando un grupo funcional, por ejemplo, grupo hidroxilo, enlazado a la cadena de carbono alquilo. Los ejemplos del grupo orgánico incluyen, sin ninguna limitación, alquilos, alquilidenos, alquilos heterocíclicos, cicloalquilos, arilos, alquenilos, cicloalquenilos o derivados hidroxisustituidos de los mismos, por ejemplo, un alquilideno sustituido con hidroxi que forma un anillo que incluye N en el amonio sustituido.
En otra realización, el amonio sustituido es: un amonio heterocíclico, es decir, un amonio en donde por lo menos dos de R<1>, R<2>, R<3>, o R<4>forman un anillo; un amonio primario estéricamente impedido; o un amonio secundario estéricamente impedido. En general, un amonio primario o secundario estéricamente impedido incluye cualquier amonio sustituido con uno o dos de los R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>sustituidos con grupos alquilo que aglomeran estéricamente la molécula, por ejemplo, cualquier amonio sustituido con uno o dos de los R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>sustituidos con uno o dos grupos cicloalquilo o grupos alquilo que tienen por lo menos un átomo de carbono alquilo secundario o terciario enlazado al nitrógeno del amonio sustituido. Los ejemplos de tales amonios primarios estéricamente impedidos y amonios secundarios estéricamente impedidos, heterocíclicos incluyen, sin limitación, isopropiletilamonio, isopropilmetilamonio, diisopropilamonio, terc-butilamonio, dicohexilamonio, formas protonizadas de morfolina, piridina, piperidina, pirrolidina, piperazina, terc-bulilamina, 2-amino-2-metilpropanol-1, 2-amino-2-metil-propandiol-1,3 ytris-(hidroxietil)-aminometano. Estos compuestos de amonio sustituido están disponibles comercialmente generalmente en forma de varias sales, o se preparan fácilmente a partir de sus aminas correspondientes mediante neutralización con ácidos.
En otra realización más, el amonio sustituido es un amonio terciario o cuaternario incluyendo, sin limitación, trimetilamonio, trietilamonio, tributilamonio, dietilmetilamonio, diisopropiletilamonio, triisopropilamonio, N-metilmorfolinio, N-hidroxietilpiperidinio, N-metilpirrolidinio y N, N'-dimetilpiperazinio, tetrametilamonio, tetraetilamonio y tetrabutilamonio. Estos compuestos de amonio sustituido están generalmente disponibles comercialmente en forma de varias sales, o se preparan fácilmente a partir de sus aminas correspondientes por neutralización con ácidos.
En otra realización más, el compuesto de amonio sustituido es un compuesto globalmente catiónico, es decir, que en las condiciones de la encapsulación de la entidad, típicamente, en solución acuosa a un pH entre aproximadamente pH 2 y aproximadamente pH 8, tiene carga neta positiva, por ejemplo, como resultado de la ionización (protonación) del átomo de nitrógeno.
En otra realización más, el compuesto de amonio primario, secundario o terciario sustituido encapsulado en liposomas tiene un logaritmo negativo de la constante de disociación ácida (desprotonación) (pKa) de por lo menos aproximadamente 8,0, por lo menos aproximadamente 8,5, por lo menos aproximadamente 9,0, por lo menos 9,5 o por lo menos aproximadamente 10,0, determinado en una solución acuosa diluida a temperatura ambiente (típicamente 25° C). El parámetro pKa es una característica bien conocida de los compuestos de amonio que generalmente caracteriza la fuerza de sus propiedades básicas, y los métodos para la determinación del pKa son convencionales y rutinarios en la técnica. Los valores de pKa para muchas aminas y sus formas protonadas (amonios) están tabulados en libros de referencia de química y farmacología. Consultar, por ejemplo, IUPAC Handbook of Pharmaceutical Salts, ed. por P.H. Stahl y C.G Wermuth, Wiley-VCH, 2002; CRC Handbook of Chemistry and Physics, 82a Edición, ed. por D.R.Lide, CRC Press, Florida, 2001, p. 8-44 a 8-56. Generalmente, un pKa más alta caracteriza a las bases más fuertes. Ejemplos de compuestos de amonio sustituido, así como de amonio no sustituido (enumerados como sus bases aminas conjugadas) tienen los siguientes valores de pKa: pirrolidina, 11.31; piperidina, 11.12; diisopropilamina, 11.05; dietilamina, 10.93; trietilamima, 10.75; dimetilamina, 10.73; terc-butilamina, 10.68; ciclohexilamina, 10.66; metilamina, 10.66; etilamina, 10.65; propilamina,10.54; isopropilamina, 10.53; N-etilpiperidina, 10.45; diciclohexilamina, 10.4; N-metilpiperidina,10.38; dietilmetilamina, 10.35; dimetilpropilamina, 10.15; trimetilamina, 9.8; piperazina, 9.73 (I), 5.33 (II); 2-amino-2-metilpropanol, 9.69; N,N'-dimetilpiperazina, 9.66 (I), 5.2 (II); dietil-(2-hidroxietil)amina, 9.58; etanolamina, 9.5; N-hirdoxietilpirrolidina, 9.44; dietanolamina, 9.28; amoniaco, 9.27; dimetil-(2-hidroxietil)amina, 8.83; 2-amino-2-metilpropanodiol-1,3, 8.8; morfolina, 8.5; tris-(hidroximetil)-aminometano, 8.3; N-metilglucamina, 8.03; trietanolamina, 7.76; N-etilmorfolina, 7.67; N-hidroxietilmorfolina, 7.39; imidazol, 7.03; piridina, 5.23. Por regla general, la sustitución de un grupo alquilo o cicloalquilo por un hidrógeno en un compuesto de amonio aumenta el valor pKa. Particularmente, múltiples funciones hidroxilo o éter en los grupos alquilo sustituyentes, o la presencia de aromaticidad en un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno reducen el valor pKa con respecto al amonio sustituido similar sin funciones hidroxilo o éter. Los compuestos con más de un grupo amonio tienen habitualmente la pKa del segundo grupo amonio y siguientes mucho más bajas que las del primero. Inesperadamente descubrimos que los amonios sustituidos con valores de pKa más altos, es decir, formados por aminas más fuertemente básicas, eran más eficaces que los formados por aminas más débiles para estabilizar el fármaco dentro de los liposomas. Por ejemplo, tanto las sales IHP como SOS de trietilamonio (pKa = 10.75) fueron notablemente más eficaces que las sales correspondientes de trietanolamonio (pKa = 7.76) para estabilizar el irinotecán dentro de los liposomas in vivo (Ejemplo 73).
El amonio sustituido contenido en la composición liposomal puede estar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, sal. Las sales adecuadas incluyen sales farmacéuticamente aceptables. Consultar, por ejemplo, P.H. Stahl, C.G. Wermuth (eds), Handbook of Pharmaceutical Salts, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. En una realización, el amonio sustituido es una sal que contiene uno o más polianiones . De manera óptima, el contraión (anión) en la sal de amonio sustituido hace que la sal sea soluble en agua, sea farmacéuticamente inerte, capaz de formar precipitados o geles cuando entra en contacto con una entidad terapéutica o detectable, y/o es menos permeable a través de la membrana del liposoma que el amonio sustituido o su forma de amina no disociada. En general, la sal de amonio sustituido forma una verdadera solución en el espacio intraliposomal, por ejemplo acuoso, y no forma una cantidad significativa de una fase condensada como micela, bicapa, gel o fase cristalina. La cantidad relativa de un amonio sustituido y un anión formador de sales, por ejemplo, polianión, está en o cerca del punto de equivalencia estequiométrica, y típicamente tiene el pH en el intervalo de 3-9, más a menudo, pH 4-8, dependiente, por ejemplo, de la constante de disociación de la base conjugada del ion amonio sustituido.
En general, el amonio sustituido está contenido dentro, es decir, en el espacio interno (interior) de los liposomas. En una realización, el amonio sustituido se elimina parcial o sustancialmente por completo del medio exterior que rodea a los liposomas. Dicha eliminación puede lograrse mediante cualquier medio adecuado conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, dilución, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis, ultrafiltración, precipitación, etc.
En la presente se divulga una composición de liposomas que contiene un polianión. El polianión puede ser cualquier entidad química adecuada con más de un grupo cargado negativamente que dé como resultado una carga iónica negativa neta de más de dos unidades dentro del espacio interior, por ejemplo acuoso, del liposoma. El polianión puede ser un anión divalente, un anión trivalente, un anión polivalente, un anión polivalente polimérico, un poliol polianionizado o un azúcar polianionizado. El sulfato, fosfato, pirofosfato, tartrato, succinato, maleato, borato y citrato son, sin limitación, ejemplos de tales aniones di- y trivalentes. En una realización preferida, el polianión es un polímero polianiónico, que tiene una estructura principal orgánica (carbono) o inorgánica, y una pluralidad de grupos funcionales aniónicos, es decir, grupos funcionales ionizables a una carga negativa en una solución acuosa neutra, e integrados o añadidos a la estructura principal. Un polímero es un compuesto natural o sintético, habitualmente de alto peso molecular, que consiste en unidades enlazadas repetidas, cada una de ellas una molécula relativamente ligera y simple. Los polímeros polianiónicos ejemplares son el polifosfato, el polisulfato de vinilo, el polivinilsulfonato, los polímeros poliacrílicos anionizados, anionizados, por ejemplo, poliaminas polisulfonadas, como la poli(etileno imina) polisulfonada; polisacáridos polisulfatados, policarboxilados o polifosforilados; poliaminoácidos ácidos; polinucleótidos; otros polímeros polifosforilados, polisulfatados, polisulfonados, poliborados o policarboxilados. Tales aniones polivalentes y polímeros son bien conocidos en la técnica y muchos están disponibles comercialmente. Un anión polimérico es preferiblemente uno biodegradable, es decir, capaz de descomponerse en unidades no tóxicas dentro del organismo vivo. Un anión polimérico biodegradable ejemplar es el polifosfato.
En otra realización preferida, el polianión es un poliol polianionizado o un azúcar polianionizado. Un poliol es una molécula orgánica que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo enlazados a, por ejemplo, una estructura principal de carbono lineal, ramificada o cíclica. Por tanto, un poliol puede caracterizarse en otros términos como un compuesto polihidroxilado. Preferiblemente, la mayoría de los átomos de carbono de un poliol están hidroxilados. Los polioles (alcoholes poliatómicos) son moléculas bien conocidas en la técnica. Pueden usarse tanto polioles de cadena recta (lineal o ramificada) como cíclicos. Los polioles ejemplares son, sin limitación: etilenglicol; glicerol, treitol, eritritol, pentaeritritol, manitol, glucitol, sorbitol, sorbitán, xilitol, lactitol, maltitol, fructitol e inositol. Un azúcar comprende habitualmente un acetal cíclico, un cetal cíclico, una cetona o un grupo aldehído, o un aducto de los mismos, dentro de un grupo de átomos de carbono entrelazados predominantemente hidroxilados. Los azúcares suelen ser compuestos de origen natural. La hidrólisis de los azúcares en medio acuoso lleva a unidades denominadas monosacáridos. Típicamente, en una solución acuosa una molécula de azúcar monosacárido de cinco o seis átomos de carbono forma un hemiacetal cíclico, una estructura de anillo. Preferiblemente, los azúcares son monosacáridos o disacáridos, es decir, consisten en una o dos unidades de monosacárido, cada una de las cuales tiene de tres a siete, preferiblemente de tres a seis átomos de carbono. Los azúcares ejemplares son, sin limitación, hexosas monosacáridas, como glucosa (dextrosa), galactosa, manosa, fructosa; pentosas monosacáridas, como xilosa, ribosa, arabinosa, y disacáridos, como lactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. También pueden usarse compuestos formados por varias unidades de azúcar entrelazadas que forman un anillo (ciclodextrinas) y sus derivados. La reducción de los azúcares es uno de los métodos para obtener polioles. Se prefieren los disacáridos "no reductores" y no metabolizables más estables, como la sacarosa o la trehalosa. En el mercado hay varios polioles, monosacáridos y disacáridos.
Un poliol o azúcar polianionizado es un poliol o un azúcar cuyos grupos hidroxilo han sido modificados o sustituidos total o parcialmente por grupos aniónicos (anionizados). Por tanto, un poliol polianionizado o un azúcar polianionizado comprende una fracción de poliol o una fracción de azúcar junto con grupos aniónicos enlazados a las mismas. Los grupos aniónicos ejemplares incluyen, sin ninguna limitación, carboxilato, carbonato, tiocarbonato, ditiocarbonato, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, nitrato y borato. Se prefiere que por lo menos un grupo aniónico de un azúcar o poliol polianionizado sea un grupo fuertemente aniónico, es decir, que esté ionizado en más de un 50% en el amplio intervalo de pH, por ejemplo, pH 3-12, preferiblemente, pH 2-12, cuando está en medio acuoso, o, alternativamente, que tenga una constante de disociación logarítmica (pKa) de 3 o menos, preferiblemente de 2 o menos. La polianionización de un poliol o un azúcar puede lograrse mediante una variedad de procesos químicos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la reacción de polioles y/o azúcares con trióxido de azufre o ácido clorosulfónico en piridina o 2-picolina da como resultado algunos o todos los grupos hidroxilo esterificados con residuos de ácido sulfúrico (sulfatados), proporcionando un azúcar o poliol polisulfatado. Un azúcar sulfatado ejemplar es la sacarosa sulfatada incluyendo, sin limitación, hexasulfato de sacarosa, heptasulfato de sacarosa y octasulfato de sacarosa (Consultar Ochi. K., et al., 1980, Chem. Pharm. Bull., v. 28, p. 638-641). En la invención, el octasulfato de sacarosa está atrapado dentro del liposoma. De manera similar, la reacción con oxicloruro de fósforo o dietilclorofosfato en presencia de un catalizador de base da lugar a polioles o azúcares polifosforilados. Los polioles polifosforilados también se aíslan a partir de fuentes naturales. Por ejemplo, los polifosfatos de inositol, como el hexafosfato de inositol (ácido fítico), se aíslan del maíz. Una variedad de azúcares y polioles sulfatados, sulfonados y fosforilados adecuados se divulgan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 5,783,568 y la Patente de Estados Unidos 5,281,237. Se descubrió inesperadamente que los compuestos polihidroxilados polianionizados con solo pasos de disociación de ácidos fuertes, por ejemplo, los grupos que tienen pKa de menos de aproximadamente 3,0, preferiblemente menos de aproximadamente 2,0 como, por ejemplo, los monoésteres de sulfato (pKa 1.0 o menos), proporcionan una encapsulación liposomal con mejor retención de fármacos que los compuestos polihidroxilados polianionizados que tienen también pasos de disociación débilmente ácidos, como los monoésteres de fosfato (paso 1, pKa de aproximadamente 1,5; paso 2, pKa de aproximadamente 6,7; consultar Stahl y Wermuth,Op. cit,2002). El Ejemplo 73 a continuación ilustra este descubrimiento. La formación de complejos de polioles y/o azúcares con más de una molécula de ácido bórico también da como resultado un producto polianionizado (poliborado). La reacción de polioles y/o azúcares con disulfuro de carbono en presencia de álcali da como resultado derivados polianionizados (poliditiocarbonados, polixantogenados). Un derivado polianionizado de poliol o azúcar puede aislarse en forma de un ácido libre y neutralizarse con una base adecuada, por ejemplo, con un hidróxido de metal alcalino, hidróxido de amonio, o preferiblemente con una amina sustituida, por ejemplo, la amina correspondiente a un amonio sustituido, en forma pura o en forma de un hidróxido de amonio sustituido que proporcione una sal polianiónica de un amonio sustituido. Alternativamente, puede aislarse una sal de sodio, potasio, calcio, bario o magnesio de un poliol/azúcar polianionizado y convertirse en una forma adecuada, por ejemplo, una forma de sal de amonio sustituido, por cualquier método conocido, por ejemplo, por intercambio iónico.
El polianión tiene habitualmente una densidad de carga de por lo menos dos, tres o cuatro grupos cargados negativamente por unidad, por ejemplo, por átomo o anillo de carbono en una cadena de carbono o por unidad de monosacárido en un azúcar. El azúcar o poliol polianionizado cíclico de la presente invención tiene preferiblemente por lo menos el 75% de los grupos hidroxilo disponibles polianionizados, y más preferiblemente el 100% de los grupos hidroxilo disponibles polianionizados. Además, la polianionización dentro de los liposomas está habitualmente a un nivel que es compatible con o facilita la administración y liberación de la entidad atrapada dentro de los liposomas en el sitio de su acción prevista, pero disminuye la liberación de la entidad atrapada prematuramente, es decir, antes de que el liposoma alcance su sitio de acción prevista.
El grado de polianionización en el interior de los liposomas puede usarse para regular las características de liberación, por ejemplo, la velocidad de liberación y la cinética de una entidad atrapada en el interior de los liposomas. En general, el grado de polianionización puede evaluarse basándose en la cantidad de azúcar o poliol polianionizado con respecto a la cantidad total de anión o aniones o en el caso de que el polianión sea el único tipo de anión, el porcentaje de polianionización con respecto a la capacidad total de polianionización del polianión, por ejemplo, azúcar o poliol polianionizado o una mezcla de los mismos dentro de los liposomas de la presente invención. En una realización, el azúcar o poliol polianionizado se mezcla con uno o más de otros aniones y cuanto menor sea la cantidad de azúcar o poliol polianionizado sobre la cantidad de otro anión o aniones, más rápidamente se libera la entidad de los liposomas.
Por lo general, si una entidad atrapada se libera de los liposomas en el sitio de su actividad prevista con demasiada lentitud, la velocidad de liberación de la entidad deseada puede lograrse usando de una mezcla de azúcar o poliol polianionizado con uno o más de otros aniones monovalentes o polivalentes, por ejemplo, cloruro, sulfato, fosfato, etc. Alternativamente, pueden usarse mezclas de azúcar o poliol polianionizadoes con varios grados de polianionización. En una realización, el grado de polianionización dentro de los liposomas está comprendido entre el 0,1% y el 99%, el 10% y el 90%, o el 20% y el 80% del anión o aniones totales dentro de los liposomas, por ejemplo, con una entidad atrapada.
En general, la composición liposomal puede contener uno o más polianiones en cualquier forma adecuada, por ejemplo, en forma de un ácido o una sal que comprende un polianión y un catión. La cantidad de polianión, por ejemplo, azúcar o poliol polianionizado, puede ser estequiométricamente equivalente o diferente de la cantidad de catión. En una realización, la composición liposomal contiene una o más sales de polianión de un catión, en donde hay un gradiente de concentración de catión o un gradiente de pH presente a través de la membrana liposomal. En otra realización, la composición liposomal contiene una o más sales de polianión de amonio sustituido. En otra realización más, la composición liposomal contiene el polianión dentro de los liposomas mientras que el polianión en el medio que contiene los liposomas se elimina parcial o sustancialmente mediante cualquier medio adecuado conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, dilución, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis, ultrafiltración, absorción, precipitación, etc. En otra realización más, el liposoma con polianión atrapado, por ejemplo, poliol polianionizado o azúcar polianionizado, tiene también un gradiente transmembrana eficaz para retener sustancias dentro del liposoma. Ejemplos de tales gradientes transmembrana son el gradiente de pH, el gradiente de potencial electroquímico, el gradiente de iones de amonio, el gradiente de iones de amonio sustituido o el gradiente de solubilidad. Un gradiente de amonio sustituido típicamente incluye una forma sustituida de ion de amonio que comprende por lo menos un enlace C-N como, amonio primario, cuaternario, terciario o cuaternario. Los métodos para crear gradientes transmembrana son rutinarios en la técnica de los liposomas.
La composición liposomal divulga en la presente contiene uno o más amonios y/o polianiones sustituidos y una entidad química o biológica, por ejemplo, una entidad terapéutica o detectable. Por ejemplo, la entidad contenida en la composición liposomal puede ser un agente terapéutico, tinta, colorante, compuesto magnético, fertilizante, señuelo, biocatalizador, sustancia modificadora del sabor u olor, blanqueador, o cualquier entidad que sea detectable mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, técnicas de imagenología por resonancia magnética (MRI), imagenología óptica, imagenología fluorescente/luminiscente, o imagenología nuclear. Convenientemente, una entidad contenida o cargable en la composición liposomal es una entidad débilmente básica y permeable a la membrana (lipófila), por ejemplo, una entidad que contiene amina o una base nitrogenada.
En una realización, la entidad contenida en la composición liposomal es un agente terapéutico.
En otra realización, la entidad contenida en la composición liposomal es una entidad anticancerígena. Un listado parcial de algunos de los agentes antineoplásicos comúnmente conocidos y aprobados comercialmente (o en desarrollo activo) por clasificación es la siguiente.
Clases basadas en la estructura: Fluoropirimidinas--5-FU, Fluorodesoxiuridina, Ftorafur, 5'-desoxifluoruridina, UFT, S-1 Capecitabina; Nucleósidos de pirimidina-Deoxicitidina, Arabinósido de citosina, 5-Azacitosina, Gemcitabina, 5-Azacitosina-Arabinósido;. Purinas--6-Mercaptopurina, Tioguanina, Azatioprina, Alopurinol, Cladribina, Fludarabina, Pentostatina, 2-Cloro Adenosina; Análogos del Platino-Cisplatino, Carboplatino, Oxaliplatino, Tetraplatino, Platino-DACH, Ormaplatino, CI-973, JM-216; Antraciclinas/Antracenedionas--Doxorrubicina, Daunorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Mitoxantrona; Epipodofilotoxinas--Etopósido, Tenipósido; Camptotequinasirinotecán, Topotecán, Lurtotecán, Silatecán, 9-amino-camptotequina, 10,11-metilendioxi-camptotequina, 9-nitro-camptotequina, TAS 103, 7-(4-metil-piperazino-metileno)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotequina, 7-(2-N-isopropilamino)etil)-20(S)-camptotequina; Hormonas y análogos hormonales: dietilestilbestrol, tamoxifeno, toremefina, tolmudex, timitaq, flutamida, bicalutamida, finasterida, estradiol, trioxifeno, droloxifeno, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megesterol, aminoglutetimida, testolactona y otros; Enzimas, Proteínas y Anticuerpos-Asparaginasa, Interleucinas, Interferones, Leuprolida, Pegaspargasa y otros; Alcaloides de Vinca--Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Vindesina; Taxanos--Paclitaxel, Docetaxel.
Clases basadas en el mecanismo: Antihormonales--Ver clasificación de Hormonas y Análogos Hormonales, Anastrozol; Antifolatos--Metotrexato, Aminopterina, Trimetrexato, Trimetoprim, Piritrexim, Pirimetamina, Edatrexato, MDAM; Agentes Antimicrotubulares--Taxanos y Alcaloides de Vinca; Agentes alquilantes (clásicos y no clásicos): mostazas nitrogenadas (mecloretamina, clorambucil, melfalán, mostaza uracilo), oxazafosforinas (ifosfamida, ciclofosfamida, perfosfamida, trofosfamida), alquilsulfonatos (busulfán), nitrosoureas (carmustina, lomustina, estreptozocina), tiotepa, dacarbazina y otros; Antimetabolitos--Purinas, pirimidinas y nucleósidos, enumerados anteriormente; Antibióticos--Antraciclinas/Antracenedionas, Bleomicina, Dactinomicina, Mitomicina, Plicamicina, Pentostatina, Estreptozocina; Inhibidores de la topoisomerasa--Camptotequinas (Topo I), Epipodofilotoxinas, m-AMSA, Ellipticinas (Topo II); Antivirales--AZT, Zalcitabina, Gemcitabina, Didanosina, y otros; Agentes Citotóxicos Misceláneos--Hidroxiurea, Mitotano, Toxinas de Fusión, PZA, Briostatina, Retinoides, Ácido Butírico y derivados, Pentosan, Fumagillina, y otros.
Además de lo anterior, una entidad anticancerígena incluye, sin ninguna limitación, cualquier inhibidor de la topoisomerasa, alcaloide de la vinca, por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vinflunina y vinpocetina, agente despolimerizador o desestabilizador de microtúbulos, agente estabilizador de microtúbulos, por ejemplo, taxano, análogo aminoalquilo o aminoacilo de paclitaxel o docetaxel, por ejemplo, 2'-[3-(N,N-Dietilamino)propionil]paclitaxel, 7-(N,N-Dimetilgilil)paclitaxel, y 7-L-alanilpaclitaxel, agente alquilante, agente de unión a receptores, inhibidor de tirosina quinasa, inhibidor de la fosfatasa, inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, inhibidor enzimático, inhibidor de la aurora quinasa, nucleótido, polinicleótido e inhibidor de la farnesiltransferasa.
En otra realización, la entidad contenida en la composición liposomal es un agente terapéutico de compuestos o derivados de antraciclina, compuestos o derivados de camptotecina, compuestos o derivados de elipticina, alcaloindros o derivados de vinca, wortmannina, sus análogos y derivados, o compuestos de pirazolopirimidina con propiedades inhibidoras de la aurora quinasa.
En otra realización más, la entidad contenida en la composición liposomal es un fármaco de antraciclina, doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, epirrubicina, pirarrubicina, rubidomicina, carcinomicina, N-acetiladriamicina, rubidazona, 5-imidodaunomicina, N-acetilldaunomicina, daunorilina, mitoxantrona; un compuesto de camptotecina, camptotecina, 9-aminocamptotecina, 7-etilcamptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, 10,11 -metilendioxicamptotecina, 9-amino-10,11 -metilendioxicamptotecina, 9-cloro-10,11 -metilendioxicamptotecina, irinotecán, Topotecán, lurtotecán, silatecán, (7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotequina, 7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11 -metilendioxi-20(S)-camptotequina, 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)camptotequina; un compuesto de elipticina, elipticina, 6-3-aminopropil-elipticina, 2-dietilaminoetil-elipticinio y sales de los mismos, dateliptio, reteliptina. En la invención, el irinotecán está atrapado dentro del liposoma.
En otra realización más , la entidad contenida en el liposoma es una entidad farmacéutica que incluye, sin limitación, cualquiera de las siguientes: derivados etilendiaminas antihistamínicos (bromfenifamina, difenhidramina); antiprotozoarios: quinolonas (iodoquinol); amidinas (pentamidina); antihelmínticos (pirantel); fármacos antiesquistosomales (oxaminiquina); derivados de triazol antifúngicos (fliconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol); cefalosporinas antimicrobianas (cefazolina, cefonicid, cefotaxima, ceftazimida, cefuoxime); derivados de betalacta antimicrobianos (aztreopam, cefmetazol, cefoxitina); antimicrobianos del grupo de la eritromicina (eritromicina, azitromicina, claritromicina, oleandomicina); penicilinas (bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina, cloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, carbenicilina) tetraciclinas; otros antibióticos antimicrobianos, novobiocina, espectinomicina, vancomicina; fármacos antimicobacterianos: ácido aminosalicílico, capreomicina, etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampicina, clofazima; adamantanos antivirales: amantadina, rimantadina; derivados de la quinidina: cloroquina, hidroxicloroquina, promaquina, qionona; qionolonas antimicrobianas: ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina; sulfonamidas; antimicrobianos de las vías urinarias: metenamina, nitrofurantoína, trimetoprim; nitroimidazoles: metronidazol; compuestos colinérgicos de amonio cuaternario (ambetinio, neostigmina, fisostigmina); aminoacridinas anti-Alzheimer (tacrina); fármacos antiparkinsonianos (benztropina, biperiden, prociclidina, trihexilhenidilo); agentes antimuscarínicos (atropina, hiosciamina, escopolamina, propantelina); dopaminas adrenérgicas (albuterol, dobutamina, efedrina, epinefrina, norepinefrina, isoproterenol, metaproperenol, salmetrol, terbutalina); derivados de ergotamina; miorrelajantes o serie curane; miorrelajantes de acción central; baclofeno, ciclobenzepina, dentroleno; nicotina; beta-adrenobloqueantes (acebutil, amiodarona); benzodiacepinas (ditiazem); fármacos antiarrítmicos (diisopiramida, encaidina, serie de anestésicos locales--procaína, procainamida, lidocaína, flecaimida), quinidina; inhibidores de ACE: captopril, enelaprilat, fosinoprol, quinapril, ramipril; antilipidémicos: fluvastatina, gemfibrosil, inhibidores de HMG-coA (pravastatina); fármacos hipotensores: clonidina, guanabenz, prazocina, guanetidina, granadril, hidralazina; y vasodilatadores no coronarios: dipiridamol.
La entidad contenida en la composición liposomal también puede ser una preentidad, por ejemplo, un profármaco o un agente que es capaz de convertirse en una entidad deseada tras uno o más pasos de conversión bajo una condición como un cambio en el pH o una escisión enzimática de un enlace lábil. Dicha conversión puede producirse tras la liberación del profármaco del interior del liposoma en el sitio previsto para la acción del fármaco/liposoma. Sin embargo, la preentidad puede convertirse en la entidad activa deseada dentro de los liposomas antes del uso de los liposomas como vehículo de administración, por ejemplo, la administración a un paciente. Por ejemplo, una entidad puede modificarse en una preentidad para que sea más fácil de cargar en los liposomas y luego puede convertirse de nuevo en la entidad deseada una vez que está dentro de los liposomas. De esta manera, las entidades que generalmente no son susceptibles de carga "activa", "remota" u otros métodos de carga basados en gradientes, pueden cargarse eficazmente en liposomas, por ejemplo, en el espacio interior del liposoma, en su forma nativa, no modificada.
Se sabe que los compuestos globalmente catiónicos, es decir, los compuestos capaces de alcanzar una carga iónica positiva neta en las condiciones de carga del liposoma, especialmente los compuestos que contienen una amina titulable, se cargan eficazmente en liposomas que presentan gradientes iónicos transmembrana. Si una entidad de interés es un compuesto orgánico y no es un compuesto globalmente catiónico que tenga una amina titulable, puede prepararse un derivado del mismo que tenga las propiedades iónicas requeridas mediante una modificación adecuada, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en Woodle et al., en la WO 96/25147. Por ejemplo, puede introducirse un grupo amino mediante esterificación de un grupo hidroxilo de la entidad con un aminoácido. Alternativamente, puede introducirse un grupo hidrófobo en un compuesto hidrosoluble para facilitar su partición en la membrana liposomal y el posterior paso de la membrana al compartimento intraliposomal, es decir, al interior de los liposomas. Otra modificación útil para crear una preentidad cargable en liposomas es la formación de un aducto de grupo carbonilo, por ejemplo, una hidrazona, una oxima, un acetal o un cetal. Un grupo que contiene amino modificado puede hidrolizarse o separarse químicamente de otro modo del compuesto modificado tras la carga del compuesto modificado en los liposomas. Los procesos típicos para regenerar intraliposómicamente la entidad a partir de una preentidad son hidrólisis, fotólisis, radiólisis, tiólisis, amonólisis, reducción, sustitución, oxidación o eliminación. Estos procesos pueden efectuarse, sin limitación, por el cambio de pH o por una acción enzimática. Por ejemplo, el paclitaxel o el docetaxel, entidades no iónicas, se convierten en sus ésteres 2'-(dietilaminopropionil)- o 7'-(dietilaminopropionil), que son bases débiles (preentidades). Después de la carga en los liposomas mediante cualquier método conocido, incluyendo, sin limitación, los métodos "activo", "remoto", "basado en gradiente transmembrana" o "basado en gradiente de solubilidad", y/o los métodos de la presente invención, el 2'-(dietilaminopropionil)-paclitaxel intraliposomal se convierte en paclitaxel original estimulando su hidrólisis mediante el aumento del pH por encima de pH 7,0. Por tanto, se obtiene un liposoma que encapsula una molécula neutra de taxano en su espacio interior con una relación fármaco/lípido superior a 0,05 mol por mol de lípido liposomal, sin la ayuda de modificaciones covalentes hidrófilas de la molécula de taxano (por ejemplo, mediante la unión de PEG), complejos de ciclodextrina de taxano o surfactantes solubilizantes de taxano formadores de micelas.
Los liposomas contenidos en la composición liposomal pueden ser cualquier liposoma conocido o descubierto posteriormente en la técnica. En general, los liposomas de la presente invención pueden tener cualquier estructura liposomal, por ejemplo, estructuras que tengan un espacio interior secuestrado del medio exterior por una o más bicapas lipídicas, o cualquier microcápsula que tenga una membrana semipermeable con una parte central lipófila donde la membrana secuestra un interior. Una bicapa lipídica puede ser cualquier disposición de moléculas anfifílicas caracterizadas por una parte hidrófila (fracción hidrófila) y una parte hidrófoba (fracción hidrófoba). Habitualmente, las moléculas anfifílicas de una bicapa se disponen en láminas bidimensionales en las que las fracciones hidrófobas se orientan hacia el interior de la lámina, mientras que las fracciones hidrófilas se orientan hacia el exterior. Las moléculas anfifílicas que forman los liposomas pueden ser cualquier molécula anfifílica conocida o descubierta posteriormente, por ejemplo, lípidos de origen sintético o natural o lípidos biocompatibles. Los liposomas también pueden estar formados por polímeros anfifílicos y surfactantes, por ejemplo, polimerosomas y niosomas. A efectos de la presente divulgación, sin limitación, estos materiales formadores de liposomas también se denominan "lípidos".
Los liposomas contenidos en la composición liposomal también pueden ser liposomas de direccionamiento, por ejemplo, liposomas que contienen una o más fracciones de direccionamiento o modificadores de la biodistribución en la superficie de los liposomas. Una fracción de direccionamiento puede ser cualquier agente que sea capaz de unirse o interactuar específicamente con una diana deseada. En una realización, la fracción de direccionamiento es un ligando. El ligando se une preferiblemente y/o se internaliza en una célula en la que la entidad atrapada en el liposoma ejerce su efecto deseado (una célula diana). Un ligando es habitualmente un miembro de un par de unión en donde el segundo miembro está presente sobre o dentro de una célula diana o en un tejido que comprende la célula diana. Ejemplos de ligandos adecuados son: el ácido fólico, proteína, por ejemplo, transferrina, factor de crecimiento, enzima, péptido, receptor, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como Fab', Fv, Fv de cadena sencilla, anticuerpo de dominio simple, o cualquier otro polipéptido que comprenda secuencias de unión a antígeno (CDR) de una molécula de anticuerpo. Se denomina inmunoliposoma a un liposoma dirigido por un ligando en donde una fracción dirigida es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno diana del mismo. En una realización preferida, el liposoma que porta una fracción de direccionamiento, por ejemplo un ligando, es internalizado por una célula diana. En otra realización más, la fracción de direccionamiento es un ligando que interactúa específicamente con un receptor de tirosina quinasa como, por ejemplo, los receptores EGFR, HER2, HER3, HER4, PD-GFR, VEGFR, bFGFR o IGFR. En otra realización más, la fracción de direccionamiento interactúa específicamente con un receptor de factor de crecimiento, un receptor de factor angiogénico, un receptor de transferrina, una molécula de adhesión celular o un receptor de vitamina.
Los liposomas contenidos en la composición liposomal divulgada en la presente muestran un gradiente de concentración transmembrana de un amonio y/o polianión sustituido. Preferiblemente, la concentración más alta se encuentra en el espacio interior (interno) de los liposomas. Además, la composición liposomal puede incluir uno o más gradientes transmembrana además del gradiente creado por el amonio y/o polianión sustituido. Por ejemplo, los liposomas contenidos en la composición liposomal pueden incluir adicionalmente un gradiente transmembrana de pH, gradiente iónico, gradiente de potencial electroquímico, y/o gradiente de solubilidad.
La composición liposomal de la presente invención puede proporcionarse en un kit que comprende un recipiente con los liposomas y, opcionalmente, un recipiente con la entidad y una instrucción, por ejemplo, procedimientos o información relacionados con el uso de la composición liposomal en una o más aplicaciones. Dicha instrucción puede proporcionarse a través de cualquier medio, por ejemplo, copia impresa en papel, medio electrónico o acceso a una base de datos o sitio web que contenga la instrucción.
La composición de membrana liposomal puede elaborarse mediante cualquier método adecuado conocido o descubierto posteriormente por un experto en la técnica. En general, pueden usarse una variedad de componentes lipídicos para elaborar los liposomas. Los componentes lipídicos habitualmente incluyen, pero no se limitan a (1) componentes lipídicos no cargados, por ejemplo, colesterol, ceramida, diacilglicerol, acil(poliéteres) o alquilpol(éteres); (2) fosfolípidos neutros, por ejemplo, diacilfosfatidilcolinas, esfingomielinas y diacilfosfatidiletanolaminas, (3) lípidos aniónicos, por ejemplo, diacilfosfatidilserina, diacilfosfatidilglicerol, diacilfosfatidato, cardiolipina, diacilfosfatidilinositol, diacilglicerolhemisuccinato, diacilglicerolhemigluratato, colesterilhemisuccinato, colesterilhemiglutarato y similares; (4) lípidos conjugados con polímeros, por ejemplo, N-[metoxi-(poli(etilenglicol)diacilfosfatidiletanolamina, poli(etilenglicol)-diacilglicerol, poli(etilenglicol)-ceramida; y (5) lípidos catiónicos, por ejemplo, 1,2,-diacil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y 1,2-diacil-sn-glicero-3-etilfosfocolina. También pueden emplearse derivados sustituidos con monoacilo de estos lípidos, así como análogos di- y monoalquilos.
Pueden seleccionarse varios componentes lipídicos para cumplir, modificar o impartir una o más funciones deseadas. Por ejemplo, el fosfolípido puede usarse como lípido principal formador de vesículas. La inclusión de colesterol es útil para mantener la rigidez de la membrana y reducir la filtración de fármacos. Los lípidos conjugados con polímeros pueden usarse en la formulación liposomal para aumentar la vida útil de la circulación mediante la reducción de la depuración del liposoma por el hígado y el bazo, o para mejorar la estabilidad de los liposomas frente a la agregación durante el almacenamiento, en ausencia del efecto de extensión de la circulación. Aunque se afirma que la inclusión de lípidos PEG en una cantidad igual o mayor al 1% en moles del lípido liposomal prolonga varias veces el tiempo de circulación sanguínea del liposoma (consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5,013,556), hemos descubierto sorprendentemente que los liposomas de la presente invención tienen una circulación bastante larga, y la adición de lípidos PEG a la composición liposomal sólo prolonga la longevidad de circulación menos de dos veces, si lo hace. Además, los lípidos modificadores de la carga (titulables) pueden usarse para ayudar a la administración de entidades encapsuladas en liposomas a dianas citosólicas o nucleares facilitando que algunas clases de entidades escapen de los confines de la vía endosomal.
En una realización, los liposomas incluyen lecitina, colesterol y un polímero anfipático. La lecitina incluida en los liposomas de la presente invención puede ser una lecitina natural, una lecitina natural hidrogenada, una lecitina sintética, 1,2-distearoil-lecitina, dipalmitoil-lecitina, dimiristoil lecitina, dioleolil lecitina, 1-estearoil-2-oleoil lecitina o 1-palmitoil-2-oleoil lecitina, mientras que el polímero anfipático puede ser un derivado lipídico de polietilenglicol, por ejemplo, un derivado lipídico de polietilenglicol, por ejemplo, derivado de polietilenglicol fosfatidiletanolamina, polietilenglicol-diacilglicerol, o polietilenglicol-ceramida, donde la porción de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 250 a aproximadamente 20.000, más comúnmente de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000. En otra realización, la proporción de lecitina y colesterol en los liposomas de la presente invención es de aproximadamente 3:2 en moles. En otra realización más, el polímero anfipático es de por lo menos 0,1% en moles del lípido formador de liposomas en los liposomas de la presente invención. En otra realización más, la cantidad de un polímero anfipático está entre 0,1% en moles y 1% en moles del lípido formador de liposomas en los liposomas de la presente invención. Preferiblemente, el polímero anfipático es un polímero neutro, es decir, posee en las condiciones de carga del fármaco la carga iónica neta de cero, por ejemplo, PEG-diacilglicerol, PEG-dialquilglicerol o PEG-ceramida. Se descubrió inesperadamente que la inclusión de lípidos anfipáticos iónicamente neutros hasta un contenido de PEG-lípido de aproximadamente 5,7% en moles del lípido total proporcionaba una carga liposomal de alta eficacia de, por ejemplo, alcaloides de la vinca, como la vinorelbina, mientras que en el caso del PEG-DSPE cargado aniónicamente la eficacia de carga disminuía notablemente con un contenido de PEG-lípido del 1,6% en moles o más (Ejemplo 72). En la invención, el liposoma comprende 1,2-distearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol)oxicarbonil)-1,2-distearoil-fosfatidil etanolamina en la proporción molar 3:2:0,015.
Los liposomas de la invención contienen irinotecán y están compuestos de lecitina y colesterol y un polímero anfipático, como se define en las reivindicaciones.
Los liposomas de la presente invención pueden elaborarse mediante cualquier método conocido o que se conocerá en la técnica. Consultar, por ejemplo, G. Gregoriadis (editor), Liposome Technology, vol. 1-3, 1a edición, 1983; 2a edición, 1993, CRC Press, Boca Ratón, FL. Ejemplos de métodos adecuados para elaborar la composición liposomal de la presente invención incluyen extrusión, evaporación en fase inversa, sonicación, inyección de solvente (por ejemplo, etanol), microfluidización, diálisis con detergente, inyección de éter y deshidratación/rehidratación. El tamaño de los liposomas puede controlarse controlando el tamaño de los poros de las membranas usadas para extrusiones a baja presión o la presión y el número de pases usados en microfluidización o cualquier otro método adecuado. En una realización, los lípidos deseados se hidratan primero por hidratación en película fina o por inyección de etanol y posteriormente se dimensionan por extrusión a través de membranas de un tamaño de poro definido; más comúnmente 0,05 gm, 0,08 gm o 0,1 gm.
Las composiciones de liposomas que contienen el amonio y/o polianión sustituido en el interior de los liposomas pueden hacerse por cualquier método adecuado, por ejemplo, formación de liposomas en presencia del amonio y/o polianión sustituido, por ejemplo, en forma de sal. El amonio y/o polianión sustituido fuera de los liposomas puede eliminarse o diluirse tras la formación del liposoma o antes de cargar o atrapar una entidad deseada. Alternativamente, la composición liposomal que contiene el amonio y/o polianión sustituido puede elaborarse mediante el método de intercambio iónico directamente o mediante un paso intermedio de ácido libre que tenga un gradiente de amonio sustituido, por ejemplo, sal de amonio sustituido de azúcar o poliol polianionizado. Tales liposomas pueden neutralizarse usando la amina o su sal con un ácido volátil, por ejemplo, carbonato. La solución de liposomas resultante puede usarse directamente o, alternativamente, la sal contenida en la misma puede eliminarse si se desea, por ejemplo, mediante evaporación y cristalización seguida de disolución en un medio acuoso.
Preferiblemente, la composición liposomal tiene un gradiente de concentración transmembrana del amonio y/o polianión sustituido, por ejemplo, la concentración de la sal de amonio y/o polianión sustituido en el interior del liposoma es mayor, habitualmente por lo menos 100 veces mayor, que la concentración del amonio y/o polianión sustituido en el medio fuera del liposoma.
En una realización, la concentración de la sal de amonio y/o polianión sustituido dentro del liposoma es por lo menos 100 veces mayor que la concentración de la sal de amonio y/o polianión sustituido en el medio fuera del liposoma y es por lo menos a una concentración de aproximadamente 10mM, 50mM, 0,1 M, 0,2M, 0,5M, 0,6M, 0,7M, o 1,0M, en donde la molaridad se calcula sobre la base del amonio sustituido. En otra realización, la concentración de la sal de amonio y/o polianión sustituido dentro del liposoma es por lo menos 100 veces mayor que la concentración de la sal de amonio y/o polianión sustituido en el medio fuera del liposoma y está en una concentración de aproximadamente 0,65M o aproximadamente 1,0M.
Además, la composición liposomal tiene habitualmente un pH exterior que es compatible o útil para mantener la estabilidad de una entidad deseada durante el proceso de carga, junto con la alta eficacia de carga, por ejemplo, por encima del 90% de atrapamiento. Por ejemplo, se prefiere un pH en el intervalo de 4-7, o pH 4,5-6,5. En particular, de acuerdo con la presente invención, la carga de un compuesto de camptotecina, por ejemplo, irinotecán, se realiza mejor a un pH del medio exterior en el intervalo entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 7,0, más preferiblemente entre aproximadamente pH 5,0 y pH 6,5.
De acuerdo con la presente invención, puede cargarse o atraparse irinotecán en los liposomas incubando el irinotecán con los liposomas en un medio acuoso a una temperatura adecuada, por ejemplo, una temperatura por encima de la temperatura de transición de fase de los lípidos componentes durante la carga mientras se reduce por debajo de la temperatura de transición de fase después de cargar la entidad. El tiempo de incubación se basa habitualmente en la naturaleza de los lípidos componentes, la entidad que se va a cargar en los liposomas y la temperatura de incubación. Típicamente, son suficientes tiempos de incubación de pocos minutos a varias horas. Como se consiguen eficacias de atrapamiento elevadas, de más del 85%, típicamente más del 90%, no suele ser necesario retirar la entidad no atrapada. Sin embargo, si hay tal necesidad, la entidad no atrapada puede eliminarse de la composición mediante varios medios como, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis, ultrafiltración, adsorción o precipitación. Se descubrió inesperadamente que el mantenimiento de la fuerza iónica baja durante la incubación de una entidad como, en particular, un derivado de camptotecina o un derivado de alcaloide de vinca, con los liposomas de la presente invención, seguido del aumento de la fuerza iónica al final de la incubación, da como resultado una mayor eficacia de carga, una mejor eliminación del fármaco no atrapado y una mejor estabilidad del liposoma frente a la agregación. Típicamente, la incubación se lleva a cabo, por ejemplo, en una solución acuosa, a una fuerza iónica inferior a la equivalente a 50 mM de NaCl, o más preferiblemente, inferior a la equivalente a 30 mM de NaCl. Después de la incubación, puede añadirse una solución salina concentrada, por ejemplo, NaCl, para elevar la fuerza iónica por encima de 50 mM de NaCl, o más preferiblemente, por encima de 100 mM de NaCl. Sin estar limitados por una teoría, planteamos la hipótesis de que el aumento de la fuerza iónica ayuda a la disociación de la entidad de la membrana liposomal, dejando sustancialmente toda la entidad encapsulada dentro del espacio interior liposomal.
En general, la proporción entidad-lípido, por ejemplo, proporción de carga de fármaco obtenida tras cargar una entidad depende de la cantidad de entidad atrapada dentro de los liposomas, la concentración de amonio y/o polianión sustituido atrapado, por ejemplo, sal, las propiedades fisicoquímicas de la entidad atrapada y el tipo de contraión (anión), por ejemplo, polianión usado. Debido a las altas eficiencias de carga logradas en las composiciones y/o por los métodos de la presente invención, la proporción entidad-lípido para la entidad atrapada en los liposomas es superior al 80%, superior al 90%, y típicamente mayor del 95% de la proporción entidad-lípido calculada sobre la base de la cantidad de la entidad y el lípido liposomal tomados en el proceso de carga (la proporción de "entrada"). De hecho, es común una encapsulación prácticamente del 100% (cuantitativa). La proporción entidad-lípido en los liposomas puede caracterizarse en términos de proporción en peso (cantidad en peso de la entidad por peso o unidad molar del lípido liposomal) o relación molar (moles de la entidad por peso o unidad molar del lípido liposomal). Una unidad de la proporción entidad-lípido puede convertirse a otras unidades mediante un cálculo rutinario, como se ejemplifica a continuación. La proporción en peso de una entidad en los liposomas de la presente invención es típicamente de por lo menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,35, 0,5, o por lo menos 0,65 mg de la entidad por mg de lípido. En términos de relación molar, la proporción entidad-lípido de acuerdo con la presente invención es por lo menos de aproximadamente 0,02, a aproximadamente 5, preferiblemente de por lo menos de 0,1 a aproximadamente 2, y más preferiblemente, de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 1,5 moles del fármaco por mol del lípido liposomal. En una realización, la proporción entidad-lípido, por ejemplo, proporción de carga de fármaco de derivados de la camptotecina es de por lo menos 0,1, por ejemplo, 0,1 moles de derivado de la camptotecina por un mol de lípido liposomal, y preferiblemente de por lo menos 0,2. En otra realización, la proporción entidad-lípido, por ejemplo, carga de fármaco es de por lo menos de aproximadamente 300 mg de entidad (por ejemplo, alcaloide de vinca o un derivado del mismo) por mg de lípido formador de liposomas. En otra realización más, la proporción de entidad-lípido, por ejemplo, carga de fármaco es de por lo menos 500 mg de entidad (por ejemplo, derivado de camptotecina o profármaco de camprotecina) por mg de lípido formador de liposomas. Sorprendentemente, la invención proporcionó la encapsulación liposomal estable y casi cuantitativa de un fármaco derivado de la camptotecina, por ejemplo, irinotecán, con una proporción de fármaco-lípido de más de 0,8 mmol de la entidad por 1 g de lípido liposomal, más de 1,3 mmol de entidad por 1 g de lípido liposomal, e incluso tan alta como 1,7 mmol de entidad por 1 g de lípido liposomal (consultar el Ejemplo 74).
Si el liposoma comprende un fosfolípido, es conveniente expresar el contenido de la entidad en unidades de cantidad en peso (masa) del fármaco por unidad molar del fosfolípido del liposoma, por ejemplo, mg de fármaco/mmol de fosfolípido. Sin embargo, un experto en la técnica apreciaría que el contenido de fármaco puede expresarse equivalentemente de manera independiente de la presencia de fosfolípidos en un liposoma, y además, puede expresarse equivalentemente en términos de una cantidad molar del fármaco por unidad (de masa o molar) del contenido de lípidos del liposoma. Por ejemplo, un liposoma que contiene 3 partes molares de distearoylphosphatidylcholine (DSPC, peso molecular 790), 2 partes molares de colesterol (peso molecular 387), y 0.015 partes molares de distearoilfosfatidiletanolamina derivatizado de poli(etilenglicol) (PEG-DSPE, peso molecular 2750), y que contiene un fármaco doxorrubicina (peso molecular 543,5) en la proporción de fármaco/lípido de 150 mg/mmol de fosfolípido, el mismo contenido de fármaco puede expresarse equivalentemente en términos de mg de fármaco/mg de lípido total de la siguiente manera:
(a) Calcular las cantidades molares de los componentes lipídicos del liposoma normalizadas a la unidad molar de los fosfolípidos del liposoma (DSPC y PEG-DSPE en este ejemplo) dividiendo la cantidad molar de un componente por el total de las cantidades molares de los fosfolípidos del liposoma:
DSPC3/(3+0,015) = 0,99502
Colesterol 2/(3 0,015) = 0,66335
PG-DSPE 0,015/(3+0,015) = 0,00498
(b) Calcular la cantidad másica de lípido total del liposoma correspondiente a una cantidad molar unitaria de fosfolípido liposomal y los pesos moleculares de los componentes:
Lípido total, mg/mmol de fosfolípido = 0,99502x790+0,66335x387+0,00498x2750=1056,48
(c) Calcular la cantidad másica de fármaco por unidad de masa de lípido total dividiendo el contenido de fármaco expresado en unidades másicas por unidad molar de fosfolípido por el número obtenido en el paso (b):
Doxorrubicina, mg/mg de lípido total = 150/1056,48 = 0,14198.
(d) Calcular la cantidad molar del fármaco por unidad de masa de lípido total dividiendo el número obtenido en el paso (c) por el peso molecular del fármaco (en este caso, 543,5):
Doxorrubicina, mmol/g de lípido total = 0,14198/543,5x1000=0,261.
(e) Calcular la parte molar de fosfolípidos en la matriz lipídica del liposoma:
Parte molar de fosfolípido = (moles totales de fosfolípidos)/(cantidad de moles total de lípidos) =
(3+0,015/(3+2+0,015) = 0,6012.
(f) Calcular la proporción molar de doxorrubicina con respecto al lípido total.
Doxorrubicina, mol/mol de lípido total = (parte molar de fosfolípido)x(doxorrubicina, g/moles de fosfolípido)/(peso molecular de doxorrubicina) = 0,6012x150/543,5 = 0,166
Por tanto, la relación entre la proporción fármaco-lípido y fármaco-fosfolípido expresada en varias unidades se establece fácilmente. Como se usa en la presente, un "lípido" incluye, sin limitación, cualquier componente formador de membrana de la membrana del liposoma, como, por ejemplo, polímeros y/o detergentes.
La solución salina de amonio y/o polianión sustituido atrapada en liposomas de la presente invención tiene habitualmente una fuerza osmótica (osmolalidad) que ayuda a mantener los liposomas estables frente al daño osmótico (hinchazón y/o estallido) sin sacrificar la capacidad de carga de los liposomas. En una realización, la osmolalidad de la composición liposomal está en el intervalo de 0,1 a 1,5 mol/kg o, preferiblemente, de 0,2 a 1,0 mol/kg. Sorprendentemente, descubrimos que los liposomas de la presente invención son estables frente al efecto adverso de una alta fuerza osmótica intraliposomal sobre la carga de fármaco. Las osmolaridades intraliposomales de hasta 0,727 mol/kg fueron bien toleradas.727 mol/kg, dando como resultado una carga prácticamente cuantitativa de un fármaco hasta el máximo teórico de intercambio estequiométrico de iones de amonio sustituidos intraliposomales por moléculas del fármaco (en el caso del irinotecán, una molécula de fármaco por un ion de amonio sustituido), aunque la osmolaridad del medio acuoso extraliposomal durante la coincubación del fármaco y los liposomas era cercana al valor fisiológico de aproximadamente 0,3 mol/kg (Ejemplo 74).
En general, la composición liposomal de la presente invención es bastante estable durante el almacenamiento, por ejemplo, según lo medido por el porcentaje de entidad atrapada liberada fuera de los liposomas o todavía mantenida dentro de los liposomas después de un cierto periodo de tiempo desde la carga inicial de la entidad dentro de los liposomas de la presente invención. Por ejemplo, la composición liposomal es estable a 4° C durante por lo menos 6 meses, por ejemplo, menos del 10% de la entidad atrapada se libera 6 meses después de la carga inicial de la entidad. En una realización, la composición liposomal es estable a 4° C durante por lo menos 2 años, por ejemplo, se libera menos del 20% de la entidad atrapada 2 años después de la carga inicial de la entidad.
Es ventajoso que una entidad atrapada en liposomas permanezca encapsulada en el liposoma hasta que el liposoma alcance el sitio de su acción prevista, por ejemplo, en el caso de un fármaco antitumoral liposomal administrado en un paciente, un tumor. Los liposomas de la presente invención mostraron una estabilidad sorprendente frente a la liberación (filtración) de la entidad atrapada en condiciones in vivo, por ejemplo, en la sangre de un mamífero. El tiempo de exposición necesario para la liberación del 50% de la entidad atrapada, por ejemplo el fármaco, de los liposomas (tiempo de semiliberación) en la sangre de una ratain vivofue de más de 24 horas. En particular, los liposomas cargados con fármacos alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina, vincristina y vinorelbina, mostraron una notable estabilidad frente a la filtración del fármaco in vivo, con un tiempo de semiliberación de por lo menos 24 horas, o la cantidad de entidad que permaneció encapsulada tras 24 horas en la sangre in vivo de por lo menos aproximadamente el 50% del valor previo a la administración. Típicamente se observó un tiempo de semiliberación de más de 33 horas, o la cantidad de entidad encapsulada que permanece encapsulada después de 24 horas en la sangre in vivo de por lo menos aproximadamente el 60%; e incluso fue común un tiempo de semiliberación de más de 46 horas, o la cantidad de entidad encapsulada después de 24 horas en la sangre in vivo por lo menos de aproximadamente el 70% del valor previo a la administración. A veces, el tiempo de semiliberación de un fármaco encapsulado en la sangre in vivo era superior a 93 horas, e incluso superior a 120 horas. Los liposomas cargados con derivados de la camptotecina, como el Topotecán y el irinotecán, también mostraron una excepcional estabilidad in vivo en la sangre, con un 79-85% de la carga original del fármaco permaneciendo encapsulada después de 24 horas. Sorprendentemente, los liposomas, a pesar de tener una tasa de liberación in vivo del fármaco tan baja en la circulación sanguínea, mostraron una actividad antitumoral in vivo sustancial que superaba a la del fármaco libre (es decir, administrado como solución).
Los liposomas de la presente invención proporcionoron una combinación inesperada de alta eficacia del agente terapéutico atrapado y baja toxicidad. En general, la actividad de una entidad terapéutica encapsulada liposomalmente de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, la actividad antineoplásica del irinotecán en un mamífero, es por lo menos igual, por lo menos dos veces mayor o por lo menos cuatro veces mayoor a la actividad de la entidad terapéutica si se administra en la misma cantidad mediante su formulación rutinaria no liposomal, por ejemplo, sin usar la composición liposomal, mientras que la toxicidad de la entidad encapsulada liposomalmente no excede, es por lo menos dos veces, por lo menos tres veces o por lo menos cuatro veces menor que la de la misma entidad terapéutica administrada en la misma dosis y programa pero en forma libre, no encapsulada. Por ejemplo, en general se sabe que la encapsulación liposomal de derivados de la camptotecina anticancerígenos mediante los métodos publicados de otros da como resultado un aumento de la toxicidad (menor dosis máxima tolerada, menor dosis letal del 50%) en comparación con el fármaco no encapsulado. Consultar Patente de Estados Unidos 6,355,268; Patente de Estados Unidos 6.465.008; Colbern, et al. Clinical Cancer Res. 1998, v.4, p. 3077-3082; Tardi, et al. Cancer Res., 2000, v. 60, p.3389-3393; Emerson, et al. Clinical Cancer Res. 2000, v. 6, p.2903-2912. Los profármacos de camptotecina encapsulados liposomalmente, como el irinotecán (CPT-11), que es un derivado de profármaco catiónico de camptotecina soluble en agua, tienen una actividad antitumoral sustancialmente mayor, por ejemplo, por lo menos 4 veces, e incluso 10 veces mayor, evaluada en un modelo tumoral in vivo que el fármaco en ausencia de una formulación liposomal, por ejemplo, en forma libre (solución). Esto es aún más notable dado que un compuesto terapéutico, irinotecán, requiere activación enzimática, por ejemplo, por la acción de la carboxilesterasa endógena no específica, pero de acuerdo con la presente invención está encapsulado sustancialmente en el espacio interior del liposoma. Por otro lado, sorprendentemente, la toxicidad del profármaco de camptotecina como el CPT-11 en forma liposomal (relación de masa fármaco/lípido por encima de 0,1, por ejemplo, 0,2-0,6 o más) de acuerdo con la presente invención fue más de 2 veces, más de 3 veces e incluso más de 4 veces menor que la del profármaco CPT-11 libre (no encapsulado). Además, se logró una liberación prolongada del fármaco de los liposomas de CPT-11 in vivo, con más del 50%, e incluso más del 70% (79-86%) del contenido original del fármaco que aún permanecía en los liposomas 24 horas después de la administración en el torrente sanguíneo, y con tiempos de semiliberación superiores a 24 horas, típicamente superiores a 48 horas. La remanencia prolongada del fármaco en el liposoma in vivo se asoció a un mayor efecto antitumoral. Sorprendentemente, la liberación in vivo más lenta de CPT-11 y la mayor actividad antitumoral se observaron en los liposomas que contenían un derivado polianionizado de azúcar de bajo peso molecular (octasulfato de sacarosa) en lugar de un anión polimérico (polifosfato) (Ejemplo 15).
De acuerdo con otra realización de la presente invención, la composición liposomal de la presente invención puede proporcionarse como una composición farmacéutica que contiene la composición liposomal de la presente invención y un portador, por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son solución salina normal, dextrosa isotónica, sacarosa isotónica, solución de Ringer y solución de Hanks. Puede añadirse una sustancia tampón para proporcionar un pH óptimo para la estabilidad de almacenamiento. Por ejemplo, un pH entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5, más preferiblemente un pH de aproximadamente 6,5, es óptimo para la estabilidad de los lípidos de membrana del liposoma, y proporciona una excelente retención de las entidades atrapadas. La histidina, el hidroxietilpiperazina-etilsulfonato (HEPES), el morfolipoetilsulfonato (MES), el succinato, el tartrato y el citrato, típicamente a una concentración de 2-20 mM, son sustancias tampón ejemplares. Otros portadores adecuados son, por ejemplo, agua, solución acuosa tamponada, NaCl al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Pueden añadirse estabilizadores de proteínas, carbohidratos o polímeros y ajustadores de tonicidad, por ejemplo, gelatina, albúmina, dextrano o polivinilpirrolidona. La tonicidad de la composición puede ajustarse al nivel fisiológico de 0,25-0,35 mol/kg con glucosa o un compuesto más inerte como lactosa, sacarosa, manitol o dextrina. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, por ejemplo, por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse, la preparación liofilizada combinándose con un medio acuoso estéril antes de la administración.
Las composiciones farmacéuticas de liposomas también pueden contener otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, etc. Además, la suspensión liposomal puede incluir agentes protectores de lípidos que protegen a los lípidos contra los radicales libres y los daños lipidoperoxidativos durante el almacenamiento. Son adecuados los inactivadores lipófilos de radicales libres, como el alfa-tocoferol, y los quelantes hidrosolubles específicos del hierro, como la ferrioxamina.
La concentración de los liposomas de la presente invención en las formulaciones farmacéuticas fluidas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,05% habitualmente o por lo menos aproximadamente el 2-10% hasta tanto como del 30 al 50% en peso y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Por ejemplo, la concentración puede aumentarse para reducir la carga de fluidos asociada al tratamiento. Esto puede ser especialmente deseable en pacientes que tienen insuficiencia cardíaca congestiva asociada a aterosclerosis o hipertensión grave. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas liposomales compuestas de lípidos irritantes pueden diluirse a bajas concentraciones para disminuir la inflamación en el sitio de administración.
La cantidad de composición farmacéutica liposomal administrada dependerá de la entidad terapéutica concreta atrapada dentro de los liposomas, del estado de la enfermedad que se esté tratando, del tipo de liposomas que se estén usando y del criterio del practicante clínico. Por lo general, la cantidad de composición farmacéutica liposomal administrada será suficiente para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la entidad terapéutica particular.
La cantidad de composición farmacéutica liposomal necesaria para administrar una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse mediante métodos rutinarios in vitro e in vivo, habituales en la técnica de pruebas de fármacos. Consultar, por ejemplo, D.B.Budman, A.H.Calvert, E.K.Rowinsky (editores). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003. Las dosificaciones terapéuticamente eficaces para varias entidades terapéuticas son bien conocidas por los expertos en la técnica; y de acuerdo con la presente invención, una entidad terapéutica administrada a través de la composición farmacéutica liposomal de la presente invención proporciona por lo menos la misma actividad, o 2 veces, 4 veces o 10 veces mayor que la actividad obtenida administrando la misma cantidad de la entidad terapéutica en su formulación no liposomal habitual. Típicamente, las dosificaciones para la composición farmacéutica liposomal de la presente invención varían entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 500 mg de la entidad terapéutica por kilogramo de peso corporal, más a menudo, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 mg de entidad terapéutica/kg de peso corporal.
Típicamente, la composición farmacéutica liposomal de la presente invención se prepara como tópica o inyectable, ya sea como solución líquida o suspensión. Sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición también puede formularse en un comprimido con recubrimiento entérico o en una cápsula de gel de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
La composición liposomal de la presente invención puede administrarse de cualquier manera que sea médicamente aceptable, lo que puede depender de la afección o lesión que se esté tratando. Las posibles vías de administración incluyen inyecciones, por vías parenterales como intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraepidural, intratecal u otras, así como oral, nasal, oftálmica, rectal, vaginal, tópica o pulmonar, por ejemplo, por inhalación. Para la administración de fármacos liposomales formulados de acuerdo con la invención a tumores del sistema nervioso central, resulta especialmente ventajosa una infusión intracraneal lenta y sostenida de los liposomas directamente en el tumor (una administración mejorada por convección o CED). Consultar Saito, et al., Cancer Research, vol.64, p. 2572-2579, 2004; Mamot, et al., J. Neuro-Oncology, vol. 68, p. 1 -9, 2004. Las composiciones también pueden aplicarse directamente a las superficies de los tejidos. También se incluye específicamente en la invención la liberación sostenida, la liberación dependiente del pH u otra administración de liberación mediada por condiciones químicas o ambientales específicas, por ejemplo, por medios como inyecciones de depósito o implantes erosionables.
EJEMPLOS
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren pero no limiten la invención (que se define en las reivindicaciones adjuntas) de ninguna manera, conformación o forma, ni explícita ni implícitamente. Aunque son típicos de los que podrían usarse, también pueden emplearse otros procedimientos, metodologías o técnicas conocidos por los expertos en la técnica.
EJEMPLO 1. Preparación de las soluciones de sales de amonio sustituidas.
Las soluciones de sulfato de trialquilamonio y dialquilamonio útiles para cargar fármacos (por ejemplo, doxorrubicina) en liposomas se prepararon diluyendo ácido sulfúrico con agua hasta una concentración de 0,25 M y titulando después la solución de ácido sulfúrico con una de una variedad de aminas. Las aminas sustituidas usadas en este ejemplo fueron trietilamina, trimetilamina, dimetilamina, dietilamina o dietanolamina. Tras la adición de las aminas, la solución resultante se diluyó hasta una concentración final de 0,2 M de la sal de amonio sustituida. La osmolalidad se determinó usando un osmómetro de punto de rocío. Las propiedades de las soluciones de sal de sulfato de alquilamonio sustituido resultantes se muestran en la Tabla 1.
T l 1. Pr i v ri l i n lf i l il m ni ri l il m ni
EJEMPLO 2. Preparación de liposomas con sales de dialquilamonio y trialquilamonio atrapadas, y carga de una sustancia en estos liposomas.
La distearoilfosfatidilcolina (DSPC), el colesterol (Chol) y la N-(metoxi-poli(etilenglicol)-oxicarbonil)-distearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) (preparada a partir de poli(etilenglicol) con un peso molar de 2.000) se disolvieron conjuntamente en cloroformo en una relación molar de 3:2:0,015, y el cloroformo se eliminó a 55-60° C por evaporación rotatoria. Luego, la película lipídica seca se hidrató en una solución de uno de cada uno de los sulfatos de dialquil- o trialquilamonio enumerados en el Ejemplo 1 a 60° C durante 30 min. La suspensión lipídica se extruyó bajo presión a través de dos filtros de membrana de policarbonato apilados con el tamaño de poro de 0,1 pm (Corning Nuclepore). El tamaño del liposoma determinado por el método de dispersión de luz cuasi elástica fue de aproximadamente 110-120 nm. Las sales de trialquilamonio o dialquilamonio no encapsuladas se eliminaron del medio externo de los liposomas mediante filtración en gel usando una columna de gel de dextrano reticulado (Sephadex G-75, Amersham Pharmacia Biotechnology) eluida con solución salina tamponada con HEPES, pH 7,2-7,4, y los liposomas se recogieron en una fracción de volumen vacío de la columna. Se añadió clorhidrato de doxorrubicina USP (polvo liofilizado que contiene 5 partes en peso de lactosa por 1 parte de doxorrubicina) a los liposomas a una concentración de 150 pg de fármaco/pmol de fosfolípido liposomal. La mezcla se incubó a 55° C durante 45 minutos, se enfrió en hielo durante 10 minutos y el fármaco no encapsulado se eliminó por cromatografía de filtración en gel usando una columna Sephadex G-75 eluida con solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4. La presencia de doxorrubicina libre (caracterizada por la aparición de una banda de color rojo de movimiento más lento) era visualmente indetectable. Los liposomas purificados cargados con doxorrubicina se analizaron para fosfolípidos y doxorrubicina de acuerdo con los Ejemplos 70 y 71 (método espectrofotométrico), respectivamente. Las eficiencias de carga de fármaco resultantes se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Carga de doxorrubicina en liposomas con soluciones atrapadas de sales de dialquil- y trialquilamonio.
EJEMPLO 3. Preparación de liposomas que contienen varias sales de sulfato de amonio sustituidas por dialquilos, trialquilos y heterocíclicos, y carga de doxorrubicina en estos liposomas.
Las soluciones de sales de sulfato de amonio sustituido se prepararon como en el Ejemplo 1 usando aminas sustituidas con alquilo, sustituidas con hidroxialquilo y heterocíclicas disponibles comercialmente. Los liposomas se formaron como en el Ejemplo 1, salvo que en lugar del paso de hidratación de la película lipídica, los lípidos puros se disolvieron en etanol (aproximadamente 100 pl de etanol por cada 50 pmol de fosfolípido) y se mezclaron con la solución de sal de amonio sustituido a 60-65° C de tal manera que la dispersión lipídica resultante contuviera aproximadamente un 10% en volulmende etanol.
La carga de doxorrubicina se logró añadiendo solución de doxorrubicina (2 mg/ml en solución salina tamponada con HEPES pH 6,5) a los liposomas en una proporción de 155 pg de fármaco/pmol de fosfolípido liposomal (PL) y calentando a 58° C durante 45 min en un baño de agua caliente. Los liposomas resultantes se separaron de cualquier doxorrubicina residual no encapsulada y se analizó el contenido de fármaco y lípidos como en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Carga de doxorrubicina en liposomas con soluciones de sales de amonio sustituidas con alquilo, dialquilo, ri l il h r í li ri m n im i .
EJEMPLO 4. Preparación de una solución de polifosfato de trietilamonio (TEA-Pn).
Se disolvió en agua poli(fosfato) lineal de sodio con 13-18 unidades de fosfato por molécula (vidrio de fosfato; CALGON®, obtenido de Sigma Chemical Company) hasta una concentración de aproximadamente 1,3 M de fosfato. La solución se hizo pasar por una columna rellena con 120 ml de perlas de resina de intercambio catiónico de copolímero de poliestireno-divinilbenceno sulfonado (Dowex 50Wx8-200, Dow Chemical Co.) en forma de hidrógeno. La columna se preequilibró con HCl acuoso 3 - 3,6 M para llevar la resina a la forma de hidrógeno, y se lavó con agua desionizada hasta pH neutro. Se aplicaron 15 ml de la solución de polifosfato sódico a la columna y se eluyeron con H<2>O desionizada. El eluyente de la columna se controló mediante un detector de conductividad. El flujo de salida de la columna correspondiente al pico de conductividad se valoró con trietilamina pura a pH 5,5-6,0. La solución se analizó para determinar el sodio residual. Se analizó el contenido de sodio residual de la solución por potenciometría usando un electrodo de vidrio sensible al sodio y el contenido de fosfato usando un ensayo de fosfato inorgánico como en el Ejemplo 1. La solución que tenía un contenido de sodio residual de menos del 1% se diluyó hasta una concentración final de fosfato de 0,55 M. La solución tiene típicamente una concentración de TEA de 0,52-0,55 M, un pH de 5,5-6,0 y una osmolalidad de 430-480 mmol/kg.
EJEMPLO 5. Eliminación de sales de polifosfato no atrapadas en preparaciones liposomales.
Los liposomas (de 120 nm de tamaño) con el marcador fluorescente 8-hidroxipireno trisulfonato atrapado se prepararon de acuerdo con Kirpotin, et al., Biochemistry 36:66-75, 1997, y se mezclaron con la solución de polifosfato sódico. La mezcla se cargó en columnas de exclusión por tamaño que contenían perlas de dextrano reticulado (Sephadex G-75), perlas de agarosa al 6% (Sepharose 6B-CL) o perlas de agarosa al 4% (Sepharose 4B-CL), todas ellas de Amersham Pharmacia, y se eluyó con tampón MES-Dextrosa (pH 5,5). Se analizó el contenido de fosfato de los efluentes mediante el ensayo de fosfato de Bartlett (1959), y el contenido de liposomas mediante espectrofluorometría. De los portadores de cromatografía en gel estudiados, la sefarosa CL-6B proporcionó una separación completa del polifosfato de los liposomas a la proporción de volumen de muestra/lecho de la columna de 13.
EJEMPLO 6. Preparación de una solución de octasulfato de sacarosa de trietilamonio (TEA-SOS).
El octasulfato sódico de sacarosa (peso equivalente 144,8) es la sal sódica del derivado de la sacarosa en donde todos los grupos hidroxilo han formado ésteres de ácido sulfúrico. La sal sódica de octasulfato de sacarosa (SOS) se adquirió en Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá, pin S699020. Se disolvieron seis gramos de octasulfato sódico de sacarosa en 16,57 ml de agua desionizada para obtener una concentración final de aproximadamente 2,5 N de los grupos sulfato. La solución se trató por intercambio iónico como en el Ejemplo 4. La solución de ácido sacarosaoctasulfúrico obtenida como efluente de la columna de intercambio iónico se tituló luego con trietilamina pura hasta pH 5,7 (punto de neutralización), y se determinaron el pH y la osmolalidad de la solución. La solución resultante tenía una concentración calculada de trietilamonio de 0,643 M, un pH de 5,7 y una osmolalidad de 530 mmol/kg. La presencia de sodio residual era indetectable por potenciometría (menos del 0,1%).
EJEMPLO 7. Liposomas cargados con Irinotecán (CPT-11) usando sales de amonio sustituidas: preparación y liberación in vitro del fármaco en presencia de plasma sanguíneo.
En este ejemplo, se estudiaron el sulfato, el citrato, el pirofosfato, el trifosfato y el polifosfato lineal (13-18 mer) como aniones en las soluciones de sales de amonio sustituidas atrapadas en liposomas. Se eligieron los polímeros de fosfato por su biodegradabilidad y porque los polifosfatos se encuentran de forma natural en las células, a diferencia de otros aniones poliméricos sintéticos (poliacrilato, sulfato de dextrano y similares). Además, la viscosidad de las soluciones de polifosfatos de bajo peso molecular era menor que la de otros polímeros, haciendo que los polifosfatos fuesen más fáciles de procesar.
Para la preparación de las soluciones salinas se usaron los siguientes materiales.
1. Polifosfato sódico, NaO-[PO3Na]n-Na, n=13-18, adquirido a Sigma (N° de producto P-8510, "Fosfato de vidrio, grado práctico", también conocido como hexametafosfato sódico o por la marca CALGON);
2. Tripolifosfato pentasódico, Na5P3O10, adquirido a Sigma (producto N° T-5883); 3. Pirofosfato tetrasódico decahidrato, Na4p2Oy10H2O, adquirido a Sigma (producto N° P-9146).
4. Se usaron indistintamente resinas de intercambio iónico Dowex 50Wx4 (resina de poliestireno sulfonado reticulado al 4%, 100-200 mesh) adquirida a Sigma (Producto N° 50X4-200) o Dowex HCR-W2 (resina de poliestireno sulfonado reticulado al 8%, 50-100 mesh) adquirida a Sigma (Producto N° I-8880). Las resinas se lavaron por decantación en el siguiente orden: tres veces con agua desionizada, dos veces con HCl 1N (3 veces en exceso sobre la resina en volumen), tres veces con agua, dos veces con NaOH 1N, tres veces con agua, tres veces con HCl 1N y tres veces con agua. T ras la decantación, las resinas estaban en forma de H+.
5. Trimetilamina (TMA), solución acuosa al 40%, de Aldrich Chemical Co. (producto N° 43, 326-8). La concentración se estableció por titulación con ácido en torno a 5,9 N.
6. Trietilamina (TEA), 99%, grado HPLC, de Fisher (producto N° 04884). La concentración por titulación de ácido fue de 6,9-7,1 N.
El agua se purificó mediante ósmosis inversa, intercambio iónico y eliminación orgánica para conseguir una calidad "16-18 MOhm" libre de materia orgánica.
Se prepararon soluciones acuosas de pirofosfato, trifosfato y sales de polifosfato por el método de intercambio iónico. Se cargaron soluciones de polifosfato sódico (3 g en 25 ml de agua), pirofosfato (4 g en 27 ml de agua) o polifosfato (6,7 g en 30 ml de agua) en la columna que contenía 100 ml (volumen del lecho) de la resina de intercambio iónico preparada como se ha indicado anteriormente. La columna se eluyó con agua y se recogieron las fracciones. Se juntaron las fracciones que mostraban pH ácido (pH<3). Se diluyeron triplicados de alícuotas de 0,5 ml de la fracción agrupada que contenía el ácido fosfórico con 20 ml de agua y se valoraron con NaOH 0,100 N hasta el punto final de pH 4,5-5,0 (solución analítica de Fisher) para determinar la normalidad. Las fracciones agrupadas después del intercambio iónico se valoraron con trimetilamina (para obtener sales de trimetilamonio) hasta pH 5,4-5,5. Después de la titulación, las soluciones se diluyeron, en caso necesario, para obtener una concentración final de trimetilamonio próxima a 0,5 N.
Los sulfatos de trimetilamonio y trietilamonio se prepararon diluyendo 1,39 ml de ácido sulfúrico concentrado (17,9 M) con 80 ml de agua, y titulando la solución diluida con trietilamina pura o trimetilamina acuosa bajo el control de un pH-metro hasta el punto de equivalencia (pH 5,1 -5,5). El volumen se ajustó a 100 ml con agua.
La solución de citrato de trimetilamonio se preparó disolviendo 1,572 g de ácido cítrico monohidratado ACS de Sigma (N° de producto C-1909) en 20 ml de agua, y titulando la solución con trimetilamina acuosa hasta el punto de equivalencia. El volumen se ajustó a 25 ml con agua.
Las soluciones se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 gm usando presión positiva. La osmolalidad y el pH de las soluciones se midieron con un osmómetro de presión de vapor y un medidor de pH de electrodo de vidrio-calomelano, respectivamente. La normalidad del anión en las soluciones de fosfato se determinó mediante ensayo espectrofotométrico de fosfomolibdato azul (consultar el Ejemplo 70) después de la hidrólisis con ácido (5 min. 100° C, 3N H<2>SO<4>). La normalidad aniónica tuvo en cuenta únicamente los grupos funcionales ácidos que están sustancialmente ionizados a pH 5,5. La normalidad catiónica se determinó sobre la base de la base de trialquilamonio añadida. Las soluciones obtenidas presentaban las siguientes propiedades (Tabla 4):
Tabl 4. Pr i l l i n l m ni i i r l r PT-11 n li mas.
El colesterol y el DSPC se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA. El PEG-DSPE (PEG peso mol. 2.000) era de Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA. El DSPC, el colesterol y el PEG-DSPE en la proporción de peso de 3:1:0.1 (proporción molar de aproximadamente 3:2:0.03) se disolvieron en cloroformo (Fisher; grado Optima, estabilizado con amileno) a 60 mg/ml de DSPC. La solución se dispensó en tubos Pyrex a 30 mg de DSPC (0,5 ml) por tubo y se evaporó lentamente a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 60° C. Las películas lipídicas se secaron al vacío (100 micras de mercurio, bomba de aceite) durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
Las películas lipídicas secas se hidrataron mediante agitación suave en las soluciones salinas acuosas mencionadas a 60° C durante 15-20 minutos. Los lípidos formaron una suspensión lechosa (vesículas multilamelares). Esta suspensión lechosa se sometió a cinco ciclos de congelación en la mezcla de hielo seco e isopropanol (-80° C, 3 minutos) y descongelación en un baño de agua a 60° C durante 3 minutos. Luego, la suspensión lipídica se extruyó 10 veces (series dobles) a través de dos filtros de membrana de policarbonato apilados (Nucleopore, Whatman, tamaño de poro 0,1 pm) usando un extrusor alternativo de accionamiento manual (Avanti Polar Lipids) calentado a 60° C.
Los liposomas extruidos se mantuvieron a 60° C durante cinco minutos y se enfriaron en agua helada (0-4° C) durante cinco minutos. Luego, los liposomas se separaron de la solución salina formadora de gradiente en el tampón de carga MES-Dextrosa (50 g/l de dextrosa ACS, 0,975 g/l de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), y cantidad suficiente de NaOH 5M para llevar el pH a 6,4) mediante cromatografía en gel sobre Sephadex G-75. Los liposomas aparecen en la fracción de volumen vacío (aproximadamente el 30% del volumen del lecho de la columna).
La preparación de CPT-11 (clorhidrato de irinotecán) que contenía 0,860 mg de la base de CPT-11 por 1 mg del sólido se disolvió en HCl 0,001 N para obtener una solución madre de 16,5 mg/ml de base de CPT-11. Esta solución se mezcló con los liposomas en tampón MES-Dextrosa para alcanzar la proporción de 150 pg de CPT-11 por 1 pmol de fosfolípidos de liposomas. La mezcla se incubó a 55° C en un baño de agua, con agitación suave ocasional (aproximadamente cada cinco minutos) durante 30 minutos, y después se enfrió rápidamente en agua con hielo (0-4° C). Los liposomas se separaron del fármaco no encapsulado mediante cromatografía en gel sobre Sephadex G-75, usando MES-Dextrosa como eluyente. El fármaco encapsulado se determinó mediante un ensayo espectrofotométrico (Ejemplo 71), y los fosfolípidos se determinaron usando un ensayo de extracción (Ejemplo 70).
La liberaciónin vitrodel fármaco a partir de liposomas cargados con CPT-11 obtenidos de este modo en presencia de plasma humano al 50% se estudió de la siguiente manera. El plasma humano congelado de donante se descongeló a 37° C, se centrifugó a 14.500 g durante 10 minutos y se filtró a través de un filtro de jeringuilla de acetato de celulosa de 0,45 pm. Las preparaciones de liposomas con CPT-11 cargado se esterilizaron pasándolas por un filtro de jeringuilla estéril de acetato de celulosa sin surfactantes (SFCA) de 0,2 pm. Se mezclaron 0,5 ml de los liposomas con 0,5 ml de plasma en tubos Eppendorf estériles de copolímero de 1,5 ml, se sellaron y se incubaron en una plataforma oscilante a 37° C durante 24 horas. La muestra en blanco contenía 0,5 ml de MES-Dextrosa estéril en lugar de liposomas. Los liposomas se aislaron mediante cromatografía en gel en un gel de agarosa reticulada en perlas al 2% (Sepharose CL-2b , Pharmacia; 10 ml de volumen de lecho) usando 144 mM de NaCl, 5 mM de HEPES-Na, tampón de pH 7,4 (HBS-5). Los liposomas aparecieron en la fracción de volumen vacío, mientras que las proteínas plasmáticas y el fármaco liberado (si lo había) fueron retardados por el gel. Las fracciones de liposomas se analizaron para CPT-11 y fosfolípidos, y se determinó la proporción de fármaco/fosfolípidos (relación de salida). Las lecturas de las muestras en blanco (sólo plasma) se restaron de las lecturas de las muestras que contenían liposomas. El porcentaje de fármaco restante en los liposomas tras la incubación se determinó dividiendo la proporción de fármaco/lípido de salida por la proporción de fármaco/lípido de entrada (proporción de fármaco/lípido antes de la incubación con plasma). Los datos de carga y liberación se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5. Carga de CPT-11 en liposomas con sales terciarias de alquilamonio y liberaciónin vitrodel fármaco en r n i l m h m n .
EJEMPLO 8. Estabilidad in vivo de los liposomas cargados con CPT-11 usando sales de trialquilamonio de pirofosfato, trifosfato, polifosfato, citrato y sulfato.
Mientras que los liposomas de camptotecina pueden mostrar una filtración aceptable del fármaco en el plasma sanguíneo invitro,el fármaco puede filtrarse más rápidamente en la circulación sanguínea in vivo. Por lo tanto, se estudió la estabilidad del fármaco en la circulación sanguínea invivode un panel de formulaciones liposomales de CPT-11 usando un ensayo de punto temporal único en ratones.
Los liposomas se prepararon y cargaron con CPT-11 como se describe en el Ejemplo 6, con las siguientes modificaciones. En lugar de usar PEG-DSPE de Shearwater Polymers, se usó PEG-DSPE similar de Avanti Polar Lipids. Para proporcionar la cuantificación de la matriz lipídica liposomal en las muestras de sangre/tejido, se añadió un marcador radiactivo no intercambiable, [3H]-colesteril hexadecil éter ([3H]-CHE; (Amersham, USA) a la solución de cloroformo de los lípidos en una cantidad de 0,25 mCi/mmol de fosfolípidos. Las soluciones lipídicas se dispensaron en tubos Pyrex a razón de 12 mg de DSPC/tubo, y las películas lipídicas se formaron por evaporación rotatoria/secado al vacío. Las películas lipídicas se hidrataron en 0,7 ml de las soluciones de sales de amonio sustituidas formadoras de gradiente. La concentración de lípidos en los liposomas con sales de fosfato atrapadas se determinó mediante recuento por centelleo de radiactividad. Las preparaciones sin sales de fosfato atrapadas también se ensayaron para fosfolípidos sin extracción como se describe en el Ejemplo 70, y se usaron como estándares de radiactividad de lípidos. Se guardaron partes de las mezclas de liposoma-fármaco preparadas para la carga y se ensayaron para confirmar la proporción de precarga del CPT-11 añadido al lípido liposomal antes de la carga ("proporción de entrada"). La media promediada por volumen y la desviación estándar de la distribución del tamaño de los liposomas se determinaron mediante dispersión cuasi elástica de la luz (QELS) usando el modelo de Gauss. Las propiedades de estos liposomas se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6. Caracterización de la carga de CPT-11 en liposomas marcados con [3H]-CHE para el estudio de estabilidadin vivo
Ratones CD-1 hembra de seis semanas de edad (Charles River) recibieron inyecciones en la vena de la cola de estas formulaciones liposomales de CPT-11 a la dosis de 10 mg/kg (0,2 mg CPT-11/ratón) por duplicado. Ocho horas después, los ratones se anestesiaron y se desangraron mediante punción a corazón abierto. La sangre se recogió en jeringuillas heparinizadas (10-20 pl de 1000 U/ml de heparina USP) y se transfirió a tubos pesados que contenían 0,4 ml de solución salina fisiológica tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,04% de EDTA (Gibco BRL), mantenidos en hielo. Los tubos se pesaron para determinar los pesos de las muestras de sangre, las células sanguíneas se separaron por centrifugación a 9.000 g durante 5 minutos, y los sobrenadantes que contenían plasma diluido en PBS, se guardaron para los ensayos de fármacos y lípidos liposomales. El CPT-11 se cuantificó mediante ensayo fluorométrico (Ejemplo 71). Los lípidos liposomales se cuantificaron mediante recuento por centelleo de radiactividad corregida por inactivación. Los estándares de radiactividad de liposomas y fosfolípidos se contaron en paralelo con las muestras de plasma. El porcentaje de fármaco que permaneció encapsulado se calculó dividiendo la proporción fármaco/radioactividad en las muestras de plasma por la proporción fármaco/radioactividad de los liposomas inyectados. Debido a la rápida eliminación de CPT-11 libre de la sangre (consultar el Ejemplo 69) y a la estabilidad conocida del [3H]-CHE frente al intercambio lipídico, las lecturas de los ensayos se consideraron indicativas del contenido sanguíneo de CPT-11 liposomal y lípido. El porcentaje de la dosis de lípidos inyectada (% I.D.) que permaneció en la circulación se calculó asumiendo que el 100% del bolo inyectado se introdujo en la circulación; el volumen sanguíneo fue del 6,3% del peso corporal del ratón, y el hematocrito del 45%. Los resultados se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7. Estabilidadin vivode la encapsulación de CPT-11 y longevidad en circulación de los liposomas cargados c n PT-11 n r n n n ni n h r r l in i n. I.D. l i in .
Todas las preparaciones mostraron el nivel de encapsulación del fármaco tras 8 horas en la sangrein vivoa un 70-80% del nivel previo a la inyección, mientras que los liposomas que contenían polifosfato fueron los más estables (la encapsulación del fármaco se mantiene en aproximadamente el 100%).
EJEMPLO 9. Farmacocinética sanguínea de liposomas de CPT-11 preparados usando polifosfato de rietilamonio.
La formulación de CPT-11 liposomal usando sal de polifosfato de trietilamonio se preparó como se indica en el Ejemplo 3. Los lípidos - DSPC, colesterol y N-(metoxi-poli(etilenglicol) (M.w. 2000)-oxicarbonil)-DSPE (PEG-DSPE) (todos de Avanti Polar Lipids, Inc.) - se combinaron como polvos secos en la proporción molar de 3:2:0,015 y se disolvieron en etanol al 100% (grado USP, aprox. 0,15 ml/100 mg de los lípidos) a 62-65° C. Para los estudios farmacocinéticos, se añadió a los lípidos 3H-colesteril hexadecil éter (3H-CHE, obtenido de Amersham Pharmacia) en una cantidad de 0,5 mCi/mmol de fosfolípidos como marcador lipídico radiactivo no intercambiable. La solución acuosa de TEA-Pn (0,5 M de trietilamonio, pH 5,7-6,2) se preparó como en el Ejemplo 4. La solución de TEA-Pn (10 veces el volumen de etanol añadido) se mezcló con la solución lipídica a 60-65° C y se agitó a esta temperatura hasta que se formó una suspensión lechosa homogénea de vesículas multilamelares. Esta suspensión se extruyó 15 veces a través de 2 filtros grabados con pistas de policarbonato apilados (Coming Nuclepore) con un tamaño de poro de 100 nm usando un extrusor de presión de argón (Lipex Biomembranes) a 60-65° C, y los liposomas unilamelares resultantes se enfriaron rápidamente en hielo y luego se dejó que alcanzasen la temperatura ambiente. El etanol y la sal de polifosfato no incorporada se eliminaron mediante cromatografía en gel en una columna Sepharose CL-4B eluida con tampón MES-Dextrosa (5 mM MES, 50 g/l de dextrosa, pH ajustado a 6,5 con NaOH).
Se añadió a los liposomas una solución madre de CPT-11 (clorhidrato de Irinotecán) que contenía 20 mg/ml de Irinotecán base en agua, a una proporción fármaco/lípido de 150-200 mg/mmol de fosfolípidos, y la mezcla se incubó con agitación ocasional durante 45-60 minutos a 60-62° C. La mezcla de incubación se enfrió rápidamente y se incubó durante 10 minutos a 0° C, después se dejó que alcanzase la temperatura ambiente. Se añadió 1/20 del volumen de NaCl 2,88 M para ajustarlo a la fuerza iónica fisiológica y mejorar la eliminación del CPT-11 unido a la membrana (a diferencia del fármaco encapsulado dentro del interior del liposoma). El fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en gel en una columna Sephadex G-25 o G-75 (Amersham Pharmacia) eluida con tampón HBS-6,5 (5 mM de ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-piperazino)-etilsulfónico (HEp Es ), 144 mM de NaCl, pH 6,5). Las fracciones de liposomas eluidas en el volumen vacío se combinaron, se esterilizaron mediante filtración de 0,2 micras y se almacenaron a 4-6° C antes de su uso. Los liposomas se caracterizaron por concentración de lípidos, concentración de fármaco y tamaño de partícula como en el Ejemplo 7. Los liposomas tenían un tamaño medio de 108 nm y un contenido de CPT-11 de 139 ± 18 mg de base de CPT-11 por mmol de fosfolípidos.
La longevidad del lípido liposomal y del fármaco liposomal en la sangre y las características de la liberación del fármaco de los liposomasin vivose estudiaron en ratas hembra Sprague-Dawley (190-210 g) con catéteres venosos centrales permanentes. Se inyectó a las ratas un bolo de 0,2-0,3 ml de liposomas de irinotecán marcados con 3H-CHE (0,05 mmol de fosfolípidos, o 7-8 mg de CPT-11 por kg de peso corporal). Se extrajeron muestras de sangre (0,2-0,3 ml) en distintos momentos tras la inyección usando una jeringuilla tratada con heparina. El volumen de sangre extraído se rellenó usando solución salina fisiológica tamponada con fosfato. Las muestras de sangre se diluyeron con 0,3 ml de PBS frío con 0,04% de EDTA, se pesaron y las células sanguíneas se separaron por centrifugación. Los fluidos sobrenadantes se recogieron y analizaron para CPT-11 usando el procedimiento fluorométrico del Ejemplo 71, y para el marcador lipídico del liposoma mediante recuento de radiactividad por centelleo usando métodos convencionales. Se usaron como patrones las preparaciones de liposomas con concentración conocida de fármaco y 3H-CHE-lípido. Los patrones de radiactividad contienen la misma cantidad de plasma de rata diluido para tener en cuenta la ianctivación. La cantidad de CPT-11 y del lípido liposomal en la sangre se calculó asumiendo que el volumen sanguíneo en ml era el 6,5% del peso corporal en gramos, y el hematocrito del 40%. La cantidad total del lípido y del fármaco en la sangre se expresó como % de la dosis inyectada (% I.D., %ID) y se representó gráficamente frente al tiempo posterior a la inyección. El porcentaje de fármaco restante en los liposomas se calculó dividiendo la proporción fármaco/lípido en las muestras de sangre por la proporción fármaco/lípido de los liposomas inyectados (tomada como 100%). Como los gráficos mostraron en general una buena concordancia con la cinética monoexponencial (linealidad en escala semilogarítmica), las semividas en sangre del fármaco, del lípido y de la liberación del fármaco de los liposomas se calcularon a partir del mejor ajuste de los datos a la ecuación de decaimiento monoexponencial usando la opción TREND del programa informático Microsoft EXCEL (Microsoft Corp., USA). Los resultados se muestran en la Figura 1. A partir de los parámetros de mejor ajuste, las semividas en sangre del lípido y del fármaco fueron de 16,4 horas y 6,61 horas, respectivamente. En estas condiciones, el CPT-11 libre se depura muy rápidamente de la circulación (consultar el Ejemplo 69).
La proporción fármaco/lípido en sangre reveló el carácter bifásico de la liberación de CPT-11 a partir de los liposomas (Figura 2). En las primeras 24 horas, la liberación del fármaco seguida fue lineal en el tiempo (R=0,992), lo que evidencia una cinética de liberación de orden cero. Sólo después de que se liberara aproximadamente el 75% del fármaco en el punto temporal de 24 horas, la liberación posterior se volvió no lineal. Durante 24 horas, los liposomas liberaron el fármaco a un ritmo constante de aproximadamente el 3,6% de la carga inicial/hora. Por tanto, el 50% del fármaco se liberó en un periodo de aproximadamente 14 horas. La liberación de orden cero del fármaco es una cualidad atractiva en las formulaciones de liberación sostenida, ya que la tasa de liberación del fármaco permanece constante a lo largo del tiempo.
EJEMPLO 10. Eficacia antitumoral de liposomas CPT-11 preparados usando polifosfato de trietilamonio contra xenoinjertos de cáncer de mama en ratones desnudos.
Se estudió la eficacia antitumoral de los liposomas CPT-11 en el modelo de carcinoma de mama humano BT-474, un adenocarcinoma ductal dependiente de estrógeno que sobreexpresa el receptor C-ErbB2 (HER2). Las células BT-474 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se estableció una sublínea BT-474 con mayor tasa de crecimiento tumoral a partir de un nódulo tumoral xenoinjertado de crecimiento rápido cultivado como se describe a continuación. Las células se propagaron in vitro en medio RPMI-1460 con 10% de suero fetal de ternera, 0,1 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G en matraces T-150, y se dividieron 1:3 cada semana. A ratones hembra NCRnu/nu(de 4-6 semanas de edad; Taconic Farms) se les implantaron por vía subcutánea (en la base de la cola) gránulos de 17p-estradiol de liberación sostenida de 0,72 mg durante 60 días (Innovative Research of America, Inc.), y en dos días se les inoculó por vía subcutánea en la zona superior de la espalda una suspensión de 0,1 ml que contenía 2x107 células BT-474 en medio de crecimiento celular. La progresión tumoral se monitorizó mediante palpación y mediciones con calibrador de los tumores a lo largo de los ejes mayor (longitud) y menor (anchura) dos veces por semana. El tamaño de los tumores se determinó dos veces por semana a partir de las mediciones con calibrador usando la fórmula (Geran, R.I., et al., 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
Volumen tumoral = [(longitud) x (anchura)12]/2
El día 13 después de la inoculación, el tumor alcanzó un tamaño medio de 200 mm3 y los animales fueron asignados aleatoriamente a tres grupos de 13-15 animales.
El CPT-11 liposomal se preparó como en el Ejemplo 8 (proporción fármaco/fosfolípido 192 mg/mmol; tamaño medio del liposoma 86,8 nm). El CPT-11 libre y liposomal se diluyeron con vehículo de MES-dextrosa hasta 5 mg/ml de base de CPT-11. Los animales se inyectaron a través de la vena de la cola con CPT-11 libre, CPT-11 liposomal o sólo vehículo los días 14, 18, 21 y 25 después de la inoculación del tumor. Las formulaciones que contenían el fármaco se administraron a la dosis de 50 mg de CPT-11/kg por inyección, que es la media de las dosis comunicadas en la bibliografía para los estudios de CPT-11 en modelos tumorales de roedores.
Para evaluar la toxicidad relacionada con el tratamiento, también se pesó a los animales dos veces por semana. Las observaciones se realizaron hasta el día 60 después de la inoculación, momento en el que se agotó el sedimento de suplementación con estrógenos. Se trazaron los volúmenes tumorales medios de todos los grupos y se compararon a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 3, mientras que el CPT-11 libre redujo la tasa de crecimiento tumoral, en el grupo que recibió tratamiento liposomal los tumores retrocedieron drásticamente. Mientras que en el día 36 en el grupo de control los tumores alcanzaron el tamaño máximo permitido con una media de 3.500 mm3, y en el día 46 en el grupo tratado con el fármaco libre los tumores eran de aproximadamente 1.000 mm3 de media, en el mismo punto temporal ninguno de los animales del grupo tratado con liposomas tenía un tumor palpable.
La toxicidad relacionada con el tratamiento se evaluó mediante la dinámica del peso corporal de los animales (Figura 4). Ninguno de los grupos reveló ninguna toxicidad significativa. El peso de los animales del grupo de control aumentó consistentemente. Hubo una ligera disminución del peso corporal medio de los animales que recibieron CPT-11 liposomal, de aproximadamente un 3,3%, el día del último tratamiento. Sin embargo, se revertió esta pérdida de peso y los animales alcanzaron su peso esperado. Esta disminución del peso corporal medio no fue estadísticamente significativa mediante la prueba t de Student en comparación con el peso previo al tratamiento (p=0,274). Por tanto, todos los tratamientos se toleraron sin toxicidad significativa.
Por tanto, la formulación liposomal de CPT-11 obtenida mediante la carga del fármaco a través de una sal de amonio sustituido (trietilamonio) con impedimentos estéricos atrapada previamente de un polímero polianiónico biodegradable (polifosfato) mostró una vida sanguínea prolongada, características de liberación sostenida y una mayor actividad antitumoral en el modelo tumoral estudiado sin un aumento apreciable de la toxicidad.
EJEMPLO 11. Evaluación comparativa de liposomas cargados con CPT-11 preparados usando sales de trietilamonio atrapadas previamente: efecto del tamaño del liposoma, la proporción fármaco/lípido y la naturaleza del anión atrapado previamente.
Se prepararon dos formulaciones prototipo de liposomas cargados con CPT-11-, una usando los liposomas con TEA-Pn atrapado previamente, y la otra con TEA-SOS atrapado previamente. La preparación de estos liposomas incluyó los siguientes pasos de fabricación.
1)Combinación de los lípidos mediante codisolución en etanol.La composición de la matriz lipídica consistía en 1,2-distearoil-SN-fosfatidilcolina (DSPC) (peso mol. 790) 3 partes molares (59,8% en moles); Colesterol (Chol) (peso mol. 387) 2 partes molares (39,9% en moles); y N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol)-oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidiletanolamina (peso mol. 2787) (PEG-DSPE) 0,015 partes molares (aprox. 0,3% en moles). El DSPC y el PEG-DSPE se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama. El colesterol (de máxima pureza) se adquirió de Calbiochem. Los lípidos secos se pesaron con una precisión de ±0,1 mg en un recipiente de vidrio de borosilicato y se combinaron con etanol absoluto en la proporción adecuada para el paso de dispersión lipídica que se indica a continuación. Debido a la elevada temperatura de transición del DSPC (55° C), la disolución se realizó típicamente a 55-60° C hasta obtener una solución trasparente.
2)Preparación de las soluciones de TEA-Pn y TEA-SOS.El polifosfato sódico (n=13-18) era de Sigma Chemical Co, p/n P 8510. El octasulfato sódico de sacarosa se adquirió de Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá, pin S699020. Las sales se pesaron y disolvieron en agua para obtener soluciones de 1,2-2,5 N. Se usaron intercambiadores de aniones Dowex 50Wx8-200 o Dowex HCR-W2 en forma de H+ (disponibles de Sigma) para convertir las sales de sodio en ácidos libres. Antes del primer uso, las resinas se lavaron agitándolas con 3 volúmenes de las siguientes soluciones, seguido de decantación: (1) HCl acuoso 1,0-1,2 M 2 veces; (2) Agua 2 veces; (3) NaOH acuoso 1,0-1,2 M 2 veces; (4) Agua 2 veces; (5) HCL acuoso 1,0-1,2 M, 2 veces. La suspensión de resina lavada en agua se empaquetó por gravedad en una columna cromatográfica de tamaño adecuado para tener por lo menos 8 ml de resina empaquetada por cada ml de solución de sal sódica. La resina se equilibró adicionalmente mediante el paso de 2 volúmenes de columna de HCL acuoso 3,0-3,6 M, seguido de 5 volúmenes de columna de agua o hasta que la conductividad del eluido cayera por debajo de 1 micro-S. Después de su uso, las columnas se regeneraron mediante el paso secuencial de: HCl 1 ,-1,2 M - 3 volúmenes de columna; HCl 3,0 3,6 M - 2 volúmenes de columna; agua - por lo menos 5 volúmenes de columna, o hasta que la conductividad del eluido caía por debajo de 1 pS, y se almacenaban bajo agua filtrada 0,2-um a temperatura ambiente. Las soluciones de sal sódica de Pn y SOS se aplicaron sobre la superficie drenada de la columna (aproximadamente 1 ml por cada 4 ml del volumen de resina empaquetada) y se dejaron fluir por gravedad a una velocidad de aproximadamente 1 -2 ml/min para el tamaño del lecho de resina de 75-150 ml. La columna se eluyó con agua. Se probó la conductividad del eluido. Se recogieron las fracciones con una conductividad de 10 mS o más alta. Si se requieren soluciones más concentradas de poliácidos, la recogida puede comenzar a 20-50 mS, pero a expensas de una pérdida algo mayor de la sal formadora del gradiente. En el caso del ácido polifosfórico, la solución recogida se mantiene refrigerada (0-4° C) hasta el paso de titulación con aminas debido a la inestabilidad hidrolítica del enlace fosfodiéster a pH bajo. Los eluidos recogidos tendrían un pH de menos de 0,7 (típicamente de aproximadamente 0,4) y una conductividad de aproximadamente 120-200 mS. Opcionalmente, el paso de titulación con amina se realiza sin demora debido a la estabilidad del polifosfato a pH bajo. Para valorar las soluciones ácidas obtenidas del intercambio iónico se usó trietilamina de grado HPLC (pureza 99,5+%) de Fisher, pin 04884. La normalidad de la TEA pura se determinó mediante titulación potenciométrica. Se tomaron alícuotas de 0,100 ml de TEA en 20 ml de agua por triplicado. Las alícuotas se titularon con solución estándar de HCl 0,1 N hasta el punto final de pH (electrodo de vidrio) de 5,5-6,0. La normalidad calculada (7,07 N) se aproximó al valor teórico de 7,17 N. Un volumen medido de la solución de ácido polifosfórico (Pn) o de ácido octasulfúrico de sacarosa (SOS) se valoró con TEA pura bajo el control del electrodo de pH (vidrio). Fue necesario agitar a fondo para dispersar la amina. El criterio de valoración fue pH 5,6-6,2. Se registró con precisión el volumen de TEA añadida. Se midió el volumen de la solución titulada y se calculó la concentración de TEA a partir del volumen de TEA añadida y la normalidad. Se añadió el agua necesaria para ajustar la concentración de TEA a 0,55±0,05 N o 0,65±0,03 N, según se indica a continuación. La cantidad de sodio residual en las soluciones de TEA-Pn o TEA-SOS obtenidas se determinó por potenciometría usando un electrodo de vidrio selectivo de sodio (Coming). Se diluyó un ml de la solución con 19 ml de agua y se determinó la concentración de sodio usando el método de incremento de acuerdo con el manual del fabricante del electrodo. La cantidad de sodio residual era menor de 1 mM, típicamente menor de 0,5 mM. Las soluciones de TEA-Pn o TEA-SOS obtenidas se pasaron a través de un filtro estéril de acetato de celulosa de 0,2 pm usando alimentación a presión positiva. Se midieron y registraron el pH y la osmolalidad finales de las soluciones. Para las mediciones de pH usamos un microelectrodo de calomelano de pH y para las de osmolalidad, un osmómetro de presión de vapor/punto de rocío. Las soluciones se almacenaron refrigeradas hasta su uso.
3) . Preparación de la dispersión lipídica en el tampón formador de gradiente mezclando la solución etanólica de los lípidos con el tampón formador de gradiente. Los lípidos se dispersaron en la solución salina formadora de gradiente usando el método de mezcla con etanol. Todos los pasos se realizaron a 60-65° C. Los lípidos se disolvieron en etanol USP al 100% a una concentración de aproximadamente 0,5-0,6 M de DSPC en un matraz o tubo de vidrio con forma de pera resistente a los productos químicos. La solución salina formadora de gradiente (TEA-Pn o TEA-SOS) se precalentó a 60-65° C y se añadió a la solución etanólica de lípidos a la vez, y los componentes se mezclaron a fondo mediante remoción y/o agitación en vórtice. La cantidad final de etanol fue de aproximadamente 10% en vol. Para las preparaciones de la escala superior a 0,1 mmol de fosfolípido, la suspensión resultante se colocó en un evaporador rotatorio a 60-65° C y se envasó al vacío con rotación hasta que cesó la evolución del etanol, lo que se manifestó por el fin de la formación de espuma. Para la escala de 0,1 mmol de fosfolípido o menos, el etanol no se eliminó de la dispersión lipídica en este paso. Las suspensiones lipídicas resultantes se mantuvieron a 60-65° C y se usaron rápidamente para el paso de extrusión.
4) .Extrusión secuencial de la dispersión lipídica a través de membranas de poros definidas.Para los volúmenes de suspensión lipídica de hasta 1 ml usamos un extrusor alternativo de accionamiento manual suministrado por Avanti Polar Lipids. El extrusor se carga con membranas filtrantes de 19 mm grabadas con puestas y se termostatiza mediante un bloque calefactor metálico. Para los volúmenes de 1 a 10 ml, usamos un extrusor de flujo unidireccional, accionado por presión de gas y con termostato, de Lipex Biomembranes. El extrusor se cargó con membranas filtrantes de 25 mm. Las suspensiones lipídicas se extruían repetidamente a 60-65° C usando alimentación manual o presión de gas argón, según fuese apropiado, a través de una serie de 2 filtros de membrana de policarbonato apilados (los filtros de Corning-Nuclepore y Osmonics Corp. eran igualmente adecuados) con tamaños de poro nominales de 100 nm, 80 nm o 50 nm. Cuando el efecto del tamaño del liposoma era de interés, la extrusión se detuvo en el paso de 100 nm, 80 nm o 50 nm. A continuación se indican el tipo exacto de filtros usados y el número de extrusiones para cada experimento. Los liposomas extruidos se mantuvieron a 60-65° C durante aproximadamente 15 min. y se enfriaron rápidamente a 2-4° C en un baño de hielo. Después de aproximadamente 15 min. en el baño de hielo, se dejó que los liposomas alcanzaran la temperatura ambiente.
5) .Eliminación del tampón formador de gradiente extraliposomal y transferencia de los liposomas a un tampón de carga de fármaco.Se eliminó la sal formadora de gradiente no encapsulada y se transfirieron los liposomas al tampón de carga de fármaco mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Puede usarse la filtración de flujo tangencial, la diálisis de fibra hueca u otro paso escalable en la fabricación a escala. Resulta ventajoso garantizar la eliminación completa del polianión extraliposomal mediante el tratamiento de los liposomas con una resina de intercambio aniónico (por ejemplo, las perlas de poliestireno reticulado con amonio cuaternario Dowex-1 o Dowex-2). El tampón de carga del fármaco contenía 50 g/l de Dextrosa USP anhidra, y 5 mM de HEPES certificado para cultivo de tejidos en agua, ajustado a pH 6,5 con NaOH. El tampón se filtró al vacío a través de un filtro de nailon de 0,2 micras (Whatman). Los liposomas extruidos se cromatografiaron en una columna con Sepharose CL-4B (Pharmacia) y se eluyeron con el tampón de carga del fármaco. Los liposomas aparecieron en la fracción de volumen vacío y se recogieron, basándose en la turbidez del eluido, en un volumen aproximadamente igual a 2x el aplicado. Los liposomas eluidos se analizaron para determinar la concentración de fosfolípidos de acuerdo con el Ejemplo 70, el tamaño de partícula por QELS, y se almacenaron a 4-6° C.
6)Incubación de los liposomas con el fármaco.La solución madre de CPT-11 (clorhidrato de irinotecán) se preparó inmediatamente antes de mezclarla con los liposomas disolviendo clorhidrato de irinotecán en agua hasta alcanzar una concentración de 20 mg/ml de fármaco base. El pH de la solución estaba entre 4,0 y 5,0. La solución del fármaco se filtró a través de un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 0,2 micras usando presión positiva. Se mezclaron alícuotas de los liposomas en el tampón de carga de fármaco producido en el paso 5 anterior a temperatura ambiente con la solución madre de Irinotecán para lograr la proporción de entrada fármaco/lípido en el intervalo de 0,15-0,55 g de fármaco por mmol de fosfolípido liposomal. A continuación se indican las proporciones de fármaco/lípido de entrada, cuando sea apropiado. El pH de las mezclas se ajustó a 6,5 con NaOH 1 M, las mezclas en viales de vidrio se incubaron en el baño de agua termostatado a 58-62° C con agitación lenta durante 30-45 min, se enfriaron rápidamente en baño de agua con hielo (0-2° C), y se dejaron a esta temperatura durante 15 min. A continuación, se dejó que los liposomas se calentaran a temperatura ambiente para el siguiente paso (eliminación del fármaco no encapsulado y transferencia al tampón de almacenamiento). Este paso dio como resultado una eficacia de encapsulación de más del 95%, típicamente del 98-100% en todo el intervalo de proporciones fármaco/lípido estudiadas.
7) .Eliminación del CPT-11 no encapsulado, transferencia de los liposomas al tampón de almacenamiento, filtración final y almacenamiento.Se eliminó el fármaco no encapsulado y los liposomas se transfirieron al tampón de almacenamiento mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El tampón de almacenamiento contenía 20 mM de HEPES, 135 mM de NaCl, pH 6,5 (ajustado con NaOH) en agua, y se filtró al vacío a 0,2 micras antes de su uso. La cromatografía en gel sobre Sephadex G-75 (Amersham Pharmacia Biotech) se realizó esencialmente como se describe en el paso 2 anterior. Los liposomas de CPT-11 eluidos de la columna (fracción de volumen vacío) se analizaron para determinar el fosfolípido liposomal y CPT-11 (por espectrofotometría, consultar los Ejemplos 70 y 71), y el tamaño medio de partícula ponderado por volumen por QELS. La concentración del fármaco se ajustó, si era necesario, para que estuviera en el intervalo de 2,0-4,0 mg/ml. Los liposomas se filtraron a través de filtros estériles de polietersulfona de 0,2 micras y se dispensaron asépticamente en viales estériles de polipropileno (Coming Cryo-Vials) o en viales de vidrio de borosilicato de 4 ml con tapón de rosca revestido de PTFE hasta aproximadamente el 70-80% del volumen del vial. Los viales se cerraron asépticamente (al aire), se marcaron y se almacenaron a 4-6° C.
EJEMPLO 12. Efecto de la proporción fármaco/lípido sobre la eficacia de carga del fármaco y la retención del fármaco in vivo de liposomas que contienen TEA-Pn.
Se prepararon liposomas con una solución acuosa 0,65N atrapada de TEA-Pn, pH 6,1, osmolalidad 531 mmol/kg, siguiendo el procedimiento del Ejemplo 11. La dispersión lipídica se extruyó diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño de poro. La dispersión lipídica de liposomas también incluía [3H]-CHE a 0,5 mCi/mmol de fosfolípido. El tamaño del liposoma antes de la carga del fármaco era de 98,5 34,3 nm. Los liposomas se cargaron en proporciones iniciales de fármaco-fosfolípido de 200, 300, 400 y 500 mg CPT-11/mmol de fosfolípido. Las cantidades de fármaco y fosfolípido en los liposomas se determinaron por espectrofotometría de acuerdo con el Ejemplo 71, y por extracción de fosfolípidos-digestión-ensayo de fosfomolibdato azul del Ejemplo 72, respectivamente.
Para evaluar la tasa de liberación del fármacoin vivo,se siguió el método del Ejemplo 8. Los liposomas se inyectaron a través de la vena de la cola en ratones Swiss Webster hembra de 6 semanas de edad (peso corporal de 18-22 g) a una dosis de 5 mg de CPT-11/kg. A las 8 y 24 horas después de la inyección, se anestesió y desangró a los ratones, en grupos de 3, por punción a corazón abierto. La sangre se mezcló con 0,4 ml de EDTA al 0,04% enfriado con hielo en PBS, las células sanguíneas se separaron por centrifugación, y la concentración plasmática de CPT-11 se midió por espectrofluorometría como se describe en el Ejemplo 71. El lípido se determinó midiendo la cantidad de [3H]-CHE mediante recuento de centelleo líquido con corrección de inactivación, y la cantidad de fármaco retenido en los liposomas se calculó dividiendo la proporción fármaco/lípido determinada por la proporción fármaco/lípido en los liposomas inyectados. Debido a la rápida depuración sanguínea del CPT-11 libre, que resulta en un bajo nivel sanguíneo, asumimos que todo el fármaco ensayado estaba en forma liposomal.
Los resultados se presentan en la Tabla 8. Las diferencias entre la retención del fármaco entre los grupos no fueron estadísticamente significativas. Como resultado de estos estudios, concluimos que el aumento de la carga de fármaco hasta 500 mg/mmol no afectará negativamente a la carga de fármaco ni a la estabilidadin vivo.Se adoptó esta proporción para estudios posteriores.
Tabla 8. Efecto de la proporción fármaco/lípido Efecto sobre la carga de fármaco y la retención de fármacoin vivo
-
EJEMPLO 13. Eficacia de carga del fármaco de carga de CPT-11 en liposomas que contienen TEA-SOS: efecto del tamaño del liposoma y retención del fármaco in vivo en ratones.
Los liposomas que contenían soluciones atrapadas se prepararon como en el Ejemplo 11 usando solución formadora de gradiente que tenía 0,643 N TEA-SOS, pH 5,7, osmolalidad 530 mmol/kg. La dispersión lipídica se extruyó diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados con un tamaño de poro de 50 nm, 80 nm o 100 nm. La matriz lipídica de liposomas también incluía [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido liposomal. El tamaño del liposoma se determinó mediante dispersión de luz dinámica. Los liposomas se cargaron con CPT-11 en proporciones iniciales de fármaco-fosfolípido de aproximadamente 550 mg de Irinotecán/mmol de fosfolípido. Los liposomas cargados con el fármaco se dimensionaron mediante QELS y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 70 y 71.
Se inyectó a ratones Swiss Webster hembra (8-10 semanas, 27-30 gramos de media) a través de la vena de la cola estas formulaciones de liposomas CPT-11 a una dosis del fármaco de 10 mg/kg. Los ratones se sacrificaron a las 24 h y se recogió la sangre y se analizó para CPT-11 y lípidos liposomales como en el Ejemplo 11. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
T l . r irin n r n i n in viv l f rm n li m TEA- .
Sorprendentemente, los liposomas con sal de trietilamonio de octasulfato de sacarosa, un compuesto orgánico hidroxilado polianiónico no polimérico (azúcar), proporcionaron una retención del fármaco en liposomasin vivoespectacularmente mejor (4-5 veces) en comparación con liposomas similares con un polímero polianiónico (polifosfato).
EJEMPLO 14. Farmacocinética sanguínea de liposomas SOS-TEA cargados con CPT-11 en ratas.
Los liposomas (100 nm de tamaño de poro de membrana de extrusión) se prepararon como se describe en el Ejemplo 12. Los liposomas se administraron por vía intravenosa a una dosis de 10 mg de CPT11 /kg a dos ratas hembra Sprague Dawley (Harlan) de nueve semanas de edad (peso corporal de aproximadamente 200 g) con catéter venoso central permanente a una dosis de 10 mg de CPT-11/kg (17,6 gmol de fosfolípidos/kg). Se tomaron muestras de sangre en los puntos temporales prescritos y se analizaron para determinar el contenido de fármaco y lípidos liposomales como en el Ejemplo 9. Los datos se expresaron como el % de dosis inyectada de lípido/ml de plasma y el % de fármaco retenido dentro del liposoma en cada punto temporal, se trazaron frente al tiempo posterior a la inyección, y las semividas para el lípido liposomal, así como las semividas para la liberación de fármaco de los liposomas, se calcularon mediante el mejor ajuste a un modelo cinético monoexponencial (Fig. 5). La semivida de liberación del fármaco de los liposomas TEA-SOS cargados con CPT-11 fue de 56,8 horas, mucho mayor que la de los liposomas TEA-Pn similares.
EJEMPLO 15. Actividad antitumoral de CPT-11 libre y CPT-11 encapsulado en liposomas que contienen TEA-Pn y TEA-SOS en ratones atímicos desnudos portadores de xenoinjertos subcutáneos de carcinoma de colon humano (HT-29).
Los liposomas se prepararon como en el Ejemplo 11 usando solución TEA-Pn con 0,65 M de TEA, pH 6. 1, y osmolalidad 531 mmol/kg, o solución TEA-SOS con 0,643 M de TEA, pH 5,7, y osmolalidad 530 mmol/kg. La extrusión incluyó 10 pases a través de dos membranas de policarbonato apiladas con un tamaño de poro de 100 nm. Los liposomas TEA-Pn y TEA-SOS resultantes tenían un tamaño de 112,3±15,5 nm y 120,5±42,5 nm, respectivamente (media ± SD de la distribución de tamaños). Los liposomas se cargaron con CPT-11 a una proporción fármaco/fosfolípidos de entrada de 500 mg/mmol. Los liposomas resultantes tenían un contenido de fármaco de 465,6 ± 26,5 (eficiencia de carga del 93%) y 499,9+22,5 mg (eficiencia de carga del 100%) de CPT-11/mmol de fosfolípido para las formulaciones TEA-Pn y TEA-SOS, respectivamente.
Las células HT-29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, y se propagaron en medio DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternera, 50 U/ml de penicilina G y 50 pg/ml de sulfato de estreptomicina a 37° C, 5% de CO<2>según las recomendaciones del proveedor. Se obtuvieron ratones desnudos macho atímicos homocigóticos NCRnu/nu(6 semanas de edad, peso de por lo menos 16 g) se obtuvieron de Charles River. Los ratones se inocularon por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de la suspensión que contenía 5 x 106 células suspendidas en el medio de crecimiento sin antibióticos. Once días después, los animales que tenían tumores con un tamaño comprendido entre 150 mm3 y 350 mm3 fueron asignados a los grupos de tratamiento de acuerdo con el método siguiente. Los animales se clasificaron según el tamaño del tumor y se dividieron en 6 categorías de tamaño tumoral decreciente. Se formaron seis grupos de tratamiento de 11 animales/grupo seleccionando aleatoriamente un animal de cada categoría de tamaño, de tal manera que en cada grupo de tratamiento todos los tamaños tumorales estuvieran representados por igual. A partir del día 13, los animales recibieron cuatro inyecciones en la vena de la cola, a intervalos de 4 días, de las siguientes preparaciones: 1) Control (solución salina tamponada con HEPES pH 6,5); 2) CPT-11 libre 50 mg/kg, administrado como solución recién preparada de 5 mg/ml en solución salina fisiológica no tamponada; 3) CPT-11 liposomal TEA-Pn a 25 mg/kg por inyección; 4) CPT-11 liposomal TEA-Pn a 50 mg/kg por inyección; 5) CPT-11 liposomal TEA-SOS a 25 mg/kg por inyección; 6) CPT-11 liposomal TEA-SOS a 50 mg/kg por inyección. El peso del animal y el tamaño del tumor se monitorizaron dos veces por semana, como se describe en el Ejemplo 10. El peso del tumor se restó de los resultados del pesaje de los animales para obtener el peso corporal de los animales. Los animales se observaron durante 60 días tras la inoculación del tumor. Cuando los tumores del grupo alcanzaron el 20% del peso corporal del ratón, se practicó la eutanasia a los animales del grupo. En algunos grupos hubo regresiones tumorales completas sin signos de rebrote tumoral al final del estudio. Los tejidos del sitio de inoculación del tumor de estos animales se recogieron y conservaron para el análisis patológico de las células tumorales residuales.
Los resultados de este estudio se muestran en las Figuras 6 y 7. El CPT-11 libre sólo tuvo un efecto menor sobre el crecimiento tumoral. Todos los liposomas tuvieron un efecto pronunciado que dio como resultado una regresión tumoral seguida posteriormente de un nuevo crecimiento en la mayoría de los animales. La dosis de 50 mg/kg fue más eficaz que la de 25 mg/kg tanto en los liposomas CPT-11 TEA-Pn como en los TEA-SOS. Los tiempos medios de duplicación tumoral calculados a partir de los datos del tamaño tumoral (Fig.7) fueron: control - 4,2 días; fármaco libre, 50 mg/kg - 4,8 días; fármaco liposomal TEA-Pn, 25 mg/mg - 43,6 días; fármaco liposomal TEA-Pn, 50 mg/kg - 47,5 días; fármaco liposomal TEA-SOS a 25 mg/kg - 48,2 días, y fármaco liposomal TEA-SOS a 50 mg/kg -más de 56 días (no se alcanzó el tiempo de duplicación). Por tanto, el CPT-11 liposomal preparado de acuerdo con la presente invención fue por lo menos unas 10 veces más activo que el fármaco libre, administrado a la misma dosis y programa. Inesperadamente, los liposomas TEA-SOS CPT-11 fueron notablemente más eficaces en la reducción del crecimiento tumoral que los liposomas TEA-Pn CPT-11 administrados a la misma dosis. Mientras que en los grupos tratados con el fármaco libre y con el fármaco liposomal TES-Pn a 50 mg/kg por inyección no hubo animales sin rebrote tumoral, en los grupos que recibieron 25 mg/kg de cada formulación liposomal, un animal (9,1%) estaba libre de tumores al final del estudio, y en el grupo que recibió 50 mg/kg de la formulación liposomal TEA-SOS CPT-11, al final del estudio 4 animales (36,4%) estaban libres de tumores sin signos de rebrote.
El fármaco manifestó cierta toxicidad. Los animales que recibieron CPT-11 libre, pero no CPT-11 liposomal, experimentaron morbilidad temporal (pérdida de alerta, postura encorvada, pelaje erizado, disminución de la movilidad) durante aproximadamente una hora después de la inyección del fármaco. Los animales que recibieron CPT-11 libre sufrieron una pérdida permanente de peso de aproximadamente el 6% durante el tratamiento, y no se recuperaron. Los animales que recibieron ambas formulaciones liposomales de CPT-11 experimentaron una pérdida transitoria de peso entre la segunda y la tercera inyección, con una media de aproximadamente el 5% (a 25 mg/kg) o de aproximadamente el 9% (a 50 mg/kg) del valor previo al tratamiento, y finalmente alcanzaron el peso normal. Por lo tanto, la toxicidad del fármaco liposomal no fue mayor que la del fármaco libre (no liposomal), mientras que la eficacia del fármaco liposomal fue sustancialmente más alta. La pérdida de peso se invirtió cuando finalizó el tratamiento farmacológico, y todos los animales recuperaron su peso sin morbilidad terminal ni muertes tóxicas. Posteriormente, los animales ganaron peso concomitantemente con las regresiones tumorales. En el grupo de control con solución salina, los animales que desarrollaron tumores de gran tamaño experimentaron una pérdida de peso evidentemente debida a la morbilidad relacionada con el tumor. En general, la formulación liposomal en la que el fármaco se cargaba en liposomas con azúcar polianionizado (octasulfato de sacarosa) atrapado previamente resultó ser la más eficaz y con menos toxicidad que la no liposomal.
EJEMPLO 16. Toxicidad de CPT-11 libre y liposomal en ratones.
Se compararon las toxicidades agudas del CPT-11 libre y del CPT-11 encapsulado en liposomas preparado de acuerdo con la presente invención determinando la dosis máxima tolerada (DMT) tras una única inyección i.v. en ratones normales (inmunocompetentes).
Se usaron los siguientes materiales:
1) Preparación de CPT-11 (clorhidrato de Irinotecán) que tenía clorhidrato de Irinotecán al 98,9% por HPLC, y 7,6% de humedad. En este estudio, las formulaciones de fármacos se prepararon "tal cual", sin corrección del contenido de humedad ni del contenido de base Irinotecán.
2) Se preparó CPT-11 liposomal (Ls-CPT-11) como en el Ejemplo 11, usando una matriz lipídica de DSPC 200 partes en moles, Colesterol 133 partes en moles, PEG-DSPE 1 parte en moles; solución atrapada TEA-SOS con 0,65 M de TEA, pH 6,4; fármaco cargado en liposomas en tampón HEPES 5 mM, 5% de dextrosa, pH 6,5, a 60° C durante 30 min a la proporción de entrada fármaco/lípido de 500 mg de fármaco/mmol de fosfolípido. La eficacia de carga fue del >99%. Tamaño del liposoma (media del volumen ± desviación estándar por QELS): 101 ± 37 nm. Los liposomas se formularon en el vehículo, 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl; pH 6,5. Las concentraciones de fármaco en las formulaciones inyectadas fueron las indicadas en las tablas siguientes.
3) Solución libre de CPT-11. La solución madre de fármaco libre se preparó disolviendo clorhidrato de irinotecán en dextrosa acuosa al 5% a 22 mg/ml, y se esterilizó por filtración de 0,2 pm. Esta solución madre se diluyó con dextrosa estéril al 5% antes de la inyección.
4) Animales. Hembras de ratón Swiss Webster, de 6-8 semanas de edad, procedían de Harlan USA.
La determinación de la MTD siguió en general el protocolo adoptado por el Programa de Terapéutica de Desarrollo del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos. El protocolo incluía los siguientes tres pasos:
Paso 1): Paso de búsqueda de intervalo con el factor de escalada de dosis de 1,8. Los grupos de dos animales se inyectaron en la vena de la cola con dosis crecientes de Irinotecán libre o liposomal, comenzando con la dosis de 60 mg/kg, y continuando con el factor de escalada de dosis de 1,8, hasta que se observa mortalidad aguda o morbilidad terminal (en el plazo de >1 día después de la inyección) en cualquiera de los animales. Se registra la dosis un escalón por debajo de la dosis de mortalidad/morbilidad terminal.
Paso 2): Paso de búsqueda de intervalo con el factor de escalada de dosis de 1,15. Los grupos de dos animales se inyectaron en la vena de la cola con dosis crecientes de Irinotecán libre o liposomal, empezando con la dosis registrada en el Paso 1, y continuando con el factor de escalada de dosis de 1,15, hasta que se observa mortalidad aguda o morbilidad terminal (en el plazo de >1 día después de la inyección) en cualquiera de los animales. Se registra la dosis un escalón por debajo de la dosis de mortalidad/morbilidad terminal como MTD provisional.
Paso 3): Paso de validación. Al grupo de 5 animales se le inyecta i.v. (vena de la cola) Irinotecán libre o liposomal a la MTD tentativa determinada en el Paso 2. Se sigue a los animales durante 7 días, se registra el peso corporal de los animales dos veces por semana y se compara con el peso antes de la inyección. Se observa la salud general de los animales (estado de alerta, acicalamiento, alimentación, excrementos, estado de la piel, pelaje y mucosas, deambulación, respiración, postura). Si durante el periodo de observación no se produce mortalidad, morbilidad progresiva o pérdida de peso superior al 15% del peso corporal previo a la inyección, se considera que la dosis ha sido validada como MTD aguda de inyección única. Si se produce alguno de estos efectos, se repite el experimento con la dosis inmediatamente inferior en un factor 1,15.
Para obtener estadísticas adicionales para el paso de validación, se siguió la dinámica del peso corporal de los animales supervivientes hasta 11 días después de la inyección. La dosis de más de 324 mg/kg de Irinotecán liposomal fue imposible de administrar debido a las limitaciones de concentración y volumen de inyección. Los resultados se presentan en la Tabla 10.
Tabla 10. Estudio de bús ueda de MTD de formulaciones de CPT-11 en ratones.
Por tanto, mientras que la MTD del CPT-11 libre era de 80 mg/kg, la MTD del CPT-11 liposomal, sorprendentemente, no se alcanzó ni siquiera a la dosis más alta administrada de 324 mg/kg. Por lo tanto, la encapsulación liposomal de CPT-11 de acuerdo con la presente invención ha reducido la toxicidad del fármaco por lo menos 4 veces.
EJEMPLO 17. Estabilidad de almacenamiento de liposomas TEA-SOS cargados con CPT-11 frente a filtraciones del fármaco.
Se prepararon cinco lotes de CPT-11 liposomal usando el método TEA-SOS (Ejemplo 11), a la proporción de entrada fármaco/lípido de 500-550 mg/mmol de fosfolípido. Los liposomas se prepararon usando extrusión de membrana a través de una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 80 nm o 100 nm, como se indica en la tabla siguiente. Los liposomas se esterilizaron por filtro de 0,2 pm y se almacenaron a 3,4-14,5 mg/ml de CPT-11 en 135 mM NaCl, 20 mM HEPES-Na, pH 6,5 (tampón de almacenamiento), a 4-8° C. Después del tiempo de almacenamiento indicado, el fármaco filtrado se eliminó mediante cromatografía en gel sobre Sephadex G-75 usando el tampón de almacenamiento como eluyente. Las concentraciones de fármaco y fosfolípido en los liposomas antes y después de la cromatografía en gel se ensayaron usando el método de espectrofotometría y el método de digestión ácida-fosfomolibdato azul, respectivamente, como se describe en los Ejemplos 70 y 71. Los liposomas de CPT-11 preparados de acuerdo con la presente invención fueron muy estables. La filtración de CPT-11 de estos liposomas durante el almacenamiento fue menor del 5% a lo largo de 6 meses (Tabla 10).
Tabla 11. Estabilidad de encapsulación de los liposomas CPT-11 durante el almacenamiento (los datos son la media±SE .
EJEMPLO 18. Liposomas cargados con Topotecán.
Los liposomas con solución TEA-Pn y solución TEA-SOS atrapadas se prepararon como en el Ejemplo 11. La solución madre de clorhidrato de Topotecán (GlaxoSmithKline, PA, USA) se preparó inmediatamente antes de mezclarla con los liposomas disolviendo clorhidrato de Topotecán en agua a 15-20 mg/ml, contando con el contenido real de HCl de Topotecán. El pH se ajustó a 3,0 con HCl 1 N. La solución del fármaco se filtró a través de un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 0,2 micras usando presión positiva. Las alícuotas de los liposomas que contenían TEA-Pn o TEA-SOS en el tampón de carga del fármaco se mezclaron a temperatura ambiente con la solución madre de Topotecán HCl para lograr la proporción de entrada fármaco/lípido en el intervalo de 0,15-0,45 g/mmol de fosfolípido liposomal. La proporción preferida fue de 0,35 g de Topotecán HCl por mmol de fosfolípido liposomal. Las mezclas en recipientes de vidrio se incubaron en el baño de agua termostatado a 55-62° C con agitación lenta durante 30-60 min, se enfriaron rápidamente en baño de agua con hielo (0-2° C) y se dejaron a esta temperatura durante 5-15 min. Este paso dio como resultado una eficacia de encapsulación del 89-90% (gradiente TEA-Pn) o del 97-100% (gradiente TEA-SOS). Se eliminó el Topotecán no encapsulado y los liposomas se transfirieron al tampón de almacenamiento usando cromatografía en columna de exclusión por tamaño. Antes de la aplicación en la columna, se aumentó la fuerza iónica de la preparación de liposomas mezclándola con 1/20 vol. de cloruro sódico acuoso 2,88 M, y la mezcla se incubó durante aproximadamente 15 min. Encontramos inesperadamente que el ajuste de la fuerza iónica del medio liposomal desde el valor bajo durante la carga (típicamente equivalente a menos de 20 mM NaCl) al valor más alto de más de 20 mM NaCl, y preferiblemente a 50 mM NaCl y más, mejoraba la eliminación del fármaco no encapsulado y aumentaba la estabilidad de los liposomas cargados con Topotecán frente a la agregación, posiblemente facilitando la eliminación del Topotecán unido a la membrana, en contraposición al fármaco encapsulado en el interior del liposoma. El resto del procedimiento siguió el paso 7 del Ejemplo 11. Para los resultados, consultar la Tabla 12 a continuación.
EJEMPLO 19. Preparación de formulaciones inmunoliposomales anti-HER2 de Topotecán.
Se prepararon inmunoliposomas de Topotecán específicamente internalizables por células cancerosas que sobreexpresan la oncoproteína tirosina quinasa receptora de superficie HER2 (C-ErbB-2) conjugando liposomas de Topotecán con un fragmento de anticuerpo Fv humano de cadena simple anti-HER2, F5, seleccionado de la biblioteca de presentación en fagos por su alta internalización en células que sobreexpresan HER2 (Poul, et al., 2000, J. Molecular Biology, v. 301, p.1149-1161). F5 es una proteína de 27-KDa que se une al dominio extracelular del receptor HER2 con una afinidad de aproximadamente 150 nM, provocando una rápida internalización (Neve, et al., 2001, Biophys. Biochim. Res. Commun. v. 280, p.274-279). Para la conjugación con liposomas, se siguieron generalmente el método de la Patente de Estados Unidos N° 6,210,707 y de Nielsen, et al. (2002), Biochim. Biophys. Acta, v. 1591, p.109-1 18. Primero se preparó un conjugado de lipopolímero hidrófilo de F5. Al extremo C-terminal de la cadena de aminoácidos del F5 se le añadió un grupo cisteína terminal (F5Cys). El constructo F5Cys se expresó en E. coli y se aisló del lisado bacteriano mediante cromatografía en columna con proteína A. Las fracciones eluidas con proteína A se adsorbieron en resina de intercambio aniónico para eliminar los pirógenos y el ADN huésped, y se trataron con un agente reductor tiol para liberar el grupo tiol de la cisteína terminal. La F5Cys reducida se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico con SP Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia). La proteína purificada se conjugó con un conector lípido-poli(etilenglicol) tiol-reactivo, N-(3-(N-maleimido)propionilamido)-poli(oxietileno)-oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidiletanolamina (Mal-PEG-DSPE), un derivado del PEG con peso mol. 2.000 (Figura 4.1), producido comercialmente por Avanti Polar Lipids, Inc., Alabama, USA. La proteína y el conector se incubaron en una solución tampón acuosa en una proporción molar de 1:4, y el conector sin reaccionar se inactivó con 1 mM de cisteína. Durante la reacción, la cisteína terminal de F5Cys se une covalentemente al grupo maleimido del conector. El conjugado F5-PEG-DSPE resultante era soluble en agua en forma de micelas con un elevado peso molecular aparente (500-850 KDa), y se separó de la proteína sin reaccionar (aproximadamente del 25%) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La cantidad de proteína en el conjugado purificado se determinó mediante espectrofotometría UV a 280 nm, y la cantidad del conector se analizó mediante un método espectrofotométrico idéntico al usado para la cuantificación de fosfolípidos (consultar el Ejemplo 70). El conjugado F5-PEG-DSPE purificado era estable en agua, totalmente inmunorreactivo, y era estable frente a la desnaturalización y la pérdida de reactividad durante por lo menos 1 hora a 65° C y por lo menos 3 meses a 37° C.
Para preparar Topotecán inmunoliposomal anti-HER2, se mezclaron liposomas cargados con Topotecán del Ejemplo 18 con F5-PEG-DSPE en tampón salino acuoso a razón de 15 microgramos de proteína por 1 micromol de fosfolípido (aproximadamente 45 copias de F5 por liposoma). La mezcla se incubó durante 40 min a 60° C, se enfrió en hielo y se cromatografió en una columna con Sepharose CL-4B (perlas de agarosa reticuladas al 4%, Amersham Pharmacia) para eliminar el conjugado micelar residual, la proteína no conjugada y cualquier traza de fármaco extraliposomal que pudiera haberse liberado durante la incubación. Los liposomas con F5-PEG-DSPE incorporado a la membrana se eluyeron con tampón 5 mM HEPES-144 mM NaCl pH 7,4, se recogieron en el volumen vacío de la columna, se filtraron estérilmente y se dispensaron para su almacenamiento (4-6° C). La cantidad de F5 incorporada al liposoma era típicamente >80% del conjugado añadido. Se determinó mediante SDS-PAGE de los liposomas con cuantificación de la banda de F5 teñida con Coomassie mediante densitometría. Las concentraciones de fármaco y lípidos en las preparaciones de inmunoliposomas se determinaron de manera similar a las de los liposomas no objetivo. Las propiedades de los liposomas de Topotecán y los inmunoliposomas de F5 (Ejemplos 18-19) se resumen en la Tabla 12.
T l 12. r rí i l li m inm n li m T n.
EJEMPLO 20. Efecto del pH del tampón de carga y de la proporción fármaco/lípido sobre la carga de Topotecán en liposomas.
Se prepararon liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE, relación molar 3:2:0,015) con TEA-Pn 0,5 N atrapado, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg, usando el método de inyección de etanol (Ejemplo 18), extruidos a través de dos filtros de policarbonato apilados con un tamaño de poro de 100 nm 5 veces y con un tamaño de poro de 50 nm 10 veces. El tampón de carga fue MES 5 mM, dextrosa 50 g/l, ajustado a varios pH en el intervalo 5,0-6,5. El tamaño del liposoma fue de 73,1 ± 21,3 nm por QELS. Los liposomas se cargaron mezclando una solución madre de Topotecán (20 mg/ml) con los liposomas en el tampón de carga a una proporción fármaco-fosfolípido de entrada de 100 mg/mmol, incubando la mezcla a 60° C durante 45 min, inactivándola en hielo durante 15 min y eliminando el fármaco no encapsulado usando una columna Sephadex G-75 eluida con 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5. El Topotecán y el fosfolípido se cuantificaron por espectrofotometría (Ejemplos 70 y 71). Los resultados (Tabla 13) indicaron que la carga de Topotecán fue casi cuantitativa en el intervalo de pH 5,5-6,5.
Tabla 13. Efecto del pH del tampón de carga en el % de encapsulación de Topotecán en los liposomas con TEA
Pn atra ado.
También se estudió el efecto de la proporción de fármaco a lípido (0,15-0,45 mg/mmol de fosfolípido) sobre la eficacia de carga. Los liposomas con TEA-Pn atrapada (TEA 0,5 M, pH 5,8, osmolalidad 480 mmol/kg) se prepararon como se ha indicado anteriormente, excepto que el paso final de extrusión fue de diez veces a través de dos filtros de policarbonato de 0,08 pm apilados. La carga fue a pH 6,5. El tamaño del liposoma fue de 93,1 ± 15,1 nm por QELS. Los resultados (Tabla 14) mostraron que la eficiencia de carga del fármaco fue superior al 85% en todo el intervalo de proporciones fármaco/lípido estudiado.
Tabla 14. Efecto de la proporción fármaco/lípido sobre la eficacia de encapsulación de Topotecán en los liposomas ue contienen TEA-Pn.
EJEMPLO 21. Estabilidad in vitro de liposomas de Topotecán en presencia de plasma.
Se prepararon liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE, relación molar 3:2:0,015) con TEA-Pn 0,5 N atrapado, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg, como se describe en el Ejemplo 18. Se produjeron liposomas con un tamaño de 96,4 ± 29,3 nm por extrusión diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño. Los liposomas con un tamaño de 96,4 ± 29,3 nm se produjeron por extrusión diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño de poro. Para la cuantificación del lípido liposomal en plasma, se incluyó [3H]-CHE en la solución lipídica a 0,5 pCi/pmol de DSPC. El Topotecán se cargó a pH 6,0, 58° C durante 45 min a una proporción fármaco/fosfolípido de 150 mg/mmol. La eficacia de la carga fue de 148,48 ± 10,26 pg de Topotecán/pmol de fosfolípido (99,0 ± 6,8 %).
Los liposomas se incubaron con plasma humano al 50% en un dispositivo de microdiálisis de múltiples pocillos (Spectra-Por MicroDialyzer de 10 pocillos, Spectrum, USA). El plasma humano del donante se diluyó con el mismo volumen de solución salina tamponada con He PES (20 mM HEPES, 135 mM NaCl), pH 6,5, que contenía un 0,02% de azida sódica y se cargó en el depósito inferior del dializador (32 ml). Los pocillos (0,4 ml) se separaron del depósito mediante una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 30 nm, para permitir el paso libre de las proteínas plasmáticas y las moléculas pequeñas, pero no de los liposomas. Los liposomas se mezclaron con cantidades calculadas de plasma y solución salina tamponada con HEPES para alcanzar la concentración de 2,5 mM de fosfolípido y 50% en volumen de plasma. El dispositivo se incubó a 37° C y el contenido del depósito se agitó lentamente. T ras 8 horas de incubación, se cambió el contenido del depósito inferior por plasma nuevo al 50%. En los puntos de tiempo dados (consultar más abajo) se extrajeron alícuotas de 50 pl de los pocillos y se cromatografiaron en las columnas que contenían 2,2-2,4 ml de Sepharose CL-2B, eluyente de solución salina tamponada con HEPES para separar los liposomas de las proteínas plasmáticas y el fármaco libre. Los liposomas se recogieron en las fracciones de volumen vacío. El Topotecán se cuantificó por fluorometría usando la excitación a 384 nm y la emisión a 524 nm tras la solubilización de las muestras de plasma en isopropanol acuoso al 90%-0,1 N HCl, y el lípido se cuantificó por recuento por centelleo de [3H]-CHE (corregido por inactivación). La proporción fármaco-lípido determinada en el tiempo se comparó con la proporción inicial antes de la incubación para obtener el % de Topotecán que permanecía encapsulado en cada punto temporal. Después de 8 horas de incubación, la cantidad de fármaco que permanecía en el liposoma era de aproximadamente el 55% de su valor inicial (Tabla 15).
Tabla 15. Liberación in vitro de Topotecán a partir de los liposomas cargados por gradiente TEA-Pn en plasma humano al 50% a 37° C.
EJEMPLO 22. Liposomas de Topotecán con gradiente de TEA-Pn atrapado en varias proporciones fármaco/lípido: retención del fármaco in vivo y longevidad en circulación en ratones.
Los liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE en proporción molar 3:2:0,015, que contenían [3H]-CHE a 0,5 mCi/mmol DSPC) con solución salina formadora de gradiente encapsulada (0,5 N TEA-Pn, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg) se prepararon como en el Ejemplo 18 usando extrusión 12 veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño de poro. El tamaño del liposoma fue de 107,7 ± 19,1 nm por QELS. Los liposomas en 5 mM HEPES, 50 g/l de dextrosa, pH 6,5 se mezclaron con la solución madre acuosa de Topotecán (20 mg/ml) en proporciones fármaco/fosfolípido en el intervalo de 130-360 pg /pmol, seguido de mi incubación de la mezcla a 58° C durante 45 min, colocación en hielo durante 15 min y eliminación del fármaco no encapsulado mediante cromatografía Sephadex G-75. A ratones FvB hembra de doce semanas de edad se les inyectaron los liposomas a través de la vena de la cola a una dosis de 5 mg de Topotecán por kg de peso corporal (aproximadamente 0,2 mg de Topotecán/animal) por triplicado. En los momentos indicados, típicamente 8 horas o 24 horas después de la inyección, se anestesió a los ratones, se desangraron y se analizaron las muestras de sangre para el fármaco y el lípido liposomal como en el Ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Tabla 16. Después de 24 horas, permanecía encapsulado aproximadamente entre el 6 y el 32% de la carga inicial del fármaco. Cargas más altas del fármaco (>200 mg/mmol de fosfolípido) dieron como resultado una retención del fármaco más prolongada.
Tabla 16. Retención del fármacoin vivoy longevidad en circulación de liposomas prototipo de Topotecán cargados
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EJEMPLO 23. Retención del fármaco in vivo y longevidad en circulación de liposomas de Topotecán cargados usando diferentes sales de amonio y trietilamonio atrapadas.
Los liposomas compuestos de DSPE, colesterol y PEG-DSPE (3:1:0,1 en peso), que también contenían [3H]-CHE a 0,22 mCi/mmol de DSPE, se prepararon como en el Ejemplo 18, excepto que el paso de extrusión incluyó 10 pases a través de 2 filtros de poros de 200 nm apilados, 10 pases a través de 2 filtros de poros de 100 nm apilados y 20 pases a través de 2 filtros de poros de 50 nm apilados. Los liposomas contenían las siguientes soluciones salinas:
Se preparó una solución 0,5 N de sulfato de dextrano amónico (A-DS) a partir de sulfato de dextrano sódico (M.w. 5000), adquirido a Sigma, y se convirtió en sal de amonio por el procedimiento de intercambio iónico similar al del Ejemplo 4. La solución de ácido sulfúrico de dextrano se tituló inmediatamente con 12,4 M de amoníaco acuoso. La solución de A-DS tiene un pH de 5,66 y una osmolalidad de 208 mmol/kg.
Se preparó octasulfato de sacarosa y amonio 0,48 N (A-SOS) de manera similar al Ejemplo 6, pero se usó hidróxido de amonio para la titulación. La solución tenía un pH de 6,27 y una osmolalidad de 258 mmol/kg.
Se preparó octasulfato de trietilamonio y sacarosa 0,47 M (TEA-SOS) como en el Ejemplo 6. La solución tiene pH 6,6 y osmolalidad de 297 mmol/kg. La solución tiene pH 6,6, osmolalidad 297 mmol/kg.
El Topotecán se cargó en los liposomas en la solución acuosa de 10 mM MES-Na, 50 g/l de dextrosa, pH 6,5, incubando los liposomas con el fármaco a 61-62° C y una proporción de entrada fármaco/fosfolípido de 346±1 mg/mmol, durante 40 min, seguido de incubación en hielo durante 10 min. Los liposomas se purificaron a partir del fármaco no encapsulado mediante cromatografía en Sephadex G-25, eluyente - acuoso 2 mM Histidina, 144 mM NaCl, pH 6,6 (HCl).
A ratones Swiss Webster hembra de siete a nueve semanas de edad se les inyectaron por la vena de la cola estas formulaciones liposomales de Topotecán a la dosis de 5 mg de Topotecán por kg de peso corporal (aprox. 0,2 mg de Topotecán/animal) por triplicado. Después de 8 horas o 24 horas después de la inyección, se recogió la sangre y se analizó el Topotecán y el lípido liposomal como en el Ejemplo 22.
Los resultados se presentan en la Tabla 17. Aunque las tres formulaciones liposomales demostraron una longevidad en la circulación de los liposomas muy similar, con aproximadamente un 23-28% de la dosis inyectada restante en la sangre 24 horas después de la inyección, inesperadamente la retención del fármaco en los liposomas TEA-SOS y en los liposomas A-SOS fue mejor que en los liposomas A-DS tanto en términos de magnitud (aproximadamente 2 veces de mejora en la retención del fármaco) como de significancia estadística (significancia estadística al 95% de nivel de confianza mediante la prueba t de Student no apareada de 2 colas p=0,0257 y p=0,00995, respectivamente; y mediante la prueba U de Mann la diferencia fue significativa con a=0.01). La retención del fármaco en los liposomas TEA-SOS que contenían Topotecán fue mejor que en los liposomas A-SOS que contenían Topotecán.
Tabla 17. Retenciónin vivodel fármaco y persistencia en circulación de los liposomas de Topotecán preparados
- - - -
EJEMPLO 24. Farmacocinética plasmática de fármaco y lípidos de Topotecán liposomal en ratas
Se evaluaron en ratas la longevidad en circulación y los parámetros de liberación de Topotecán. Los liposomas (relación molar DSPC/Colesterol/PEG-DSPE 3:2:0,015) se prepararon usando el método de mezcla/extrusión con etanol y se cargaron con Topotecán usando el gradiente TEA-Pn o el gradiente TEA-octasulfato de sacarosa (TEA-SOS) como se describe en el Ejemplo 18 y se cargaron en varias proporciones fármaco/lípido (15 450 mg/mmol de fosfolípido). Para la cuantificación de la matriz lipídica, el lípido liposomal contenía [3H]-CHE a 0,5 1,5 mCi/mmol DSPC. Se inyectó i.v. (a través del catéter) a ratas hembra Sprague Dawley (6-8 semanas de edad; peso corporal de aproximadamente 200 g) con catéteres venosos centrales permanentes los liposomas de Topotecán a la dosis de 4 - 5 mg/kg de peso corporal. El catéter se enjuagó con solución salina. En momentos seleccionados (hasta 48 horas después de la inyección) se extrajeron muestras de sangre (0,2-0,3 ml) a través del catéter en jeringuillas heparinizadas, se mezclaron con 0,4 ml de solución salina fría tamponada con fosfato con EDTA al 0,04%, se separaron las células sanguíneas por centrifugación y se analizaron los sobrenadantes (plasma diluido en PBS) para lípidos mediante recuento de radiactividad 3H-CHE (con corrección de inactivación) y para Topotecán mediante fluorometría (Ejemplo 71). Los resultados del ensayo se corrigieron en función de la dilución del plasma, calculada a partir del peso de la muestra de sangre obtenida y suponiendo un hematocrito del 40%. La dosis sanguínea total del fármaco y del lípido se estimó a partir del volumen sanguíneo calculado como el 6,5% del peso corporal. El porcentaje de Topotecán retenido en los liposomas se calculó comparando la proporción fármaco/lípido en un momento dado con la proporción fármaco/lípido de los liposomas inyectados. La Tabla 18 siguiente resume las semividas en sangre del lípido, el fármaco y las semividas de liberación del fármaco, así como otras propiedades de los liposomas. Las curvas farmacocinéticas (PK) se muestran en las Figuras 8A (lípido) y 8B (proporción fármaco/lípido). En resumen, las curvas PK en sangre tanto para el fármaco como para el lípido se ajustan bien a un modelo de exponente único (R20,984 0,999). A pesar de su tamaño de 90-100 nm y de la muy pequeña cantidad de lípido PEGilado (0,3% en moles), los liposomas mostraron inesperadamente una buena longevidad en circulación (las semividas plasmáticas del componente lipídico se situaron en el intervalo de 11-16 horas). La liberación más lenta de Topotecán (semivida de 22,9 horas) se observó con los liposomas cargados usando el método TEA-SOS.
Tabla 18. Vida media en circulación (t<1>/<2>) del lípido, el fármaco y el tiempo medio de liberación del fármaco de los li osomas rototi o de To otecán en ratas.
EJEMPLO 25. Estabilidad del fármaco frente a filtraciones durante el almacenamiento de liposomas de Topotecán
Se almacenaron a 4-6° C las muestras de varias formulaciones prototipo preparadas para los estudios descritos anteriormente durante varios periodos de tiempo para evaluar la estabilidad de almacenamiento del Topotecán encapsulado frente a la filtración del fármaco de los liposomas. Las muestras de liposomas se pasaron por columnas Sephadex G-75, se eluyeron con 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5, para eliminar el fármaco extraliposomal, y se analizó el contenido de fármaco por espectrofotometría y el contenido de lípidos por recuento de radiactividad [3H]-CHE. Los resultados (Tabla 19) indican una buena retención de Topotecán en los liposomas durante el almacenamiento.
T l 1 . R n i n l f rm n l li m r i T n r n l lm n mi n .
EJEMPLO 26. Captación in vitro de Topotecán liposomal e inmunoliposomal por células cancerosas que sobreexpresan h ER2.
Este estudio abordó la capacidad de los (inmuno)liposomas anti-HER2 cargados con Topotecán para administrar Topotecán específicamente en células que sobreexpresan HER2 en cultivo celular. Los (inmuno)liposomas se prepararon y cargaron con Topotecán usando el método TEA-Pn del Ejemplo 19. Las células de carcinoma de mama humano que sobreexpresan HER-2 (SKBr-3, ATCC) se cultivaron en medio McCoy 5A modificado (sin tricina) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 50 pg/ml de sulfato de estreptomicina y 50 U/ml de penicilina G (medio de crecimiento completo) en matraces T-75 a 37° C, 5% de CO<2>, hasta la confluencia. Las células se recogieron por tripsinización, se inocularon en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 150.000 células/pocillo en 0,5 ml del medio de crecimiento completo y se dejó que se aclimatasen durante la noche. El medio se reemplazó por 0,5 ml de medio de crecimiento completo que contenía formulaciones de Topotecán a la concentración seleccionada en el intervalo de 0,01 -0,1 mM de fosfolípido. Se usaron pocillos triplicados para cada condición. Los pocillos de control se incubaron en ausencia de fármaco y/o liposomas (para obtener lecturas de fondo para el ensayo del fármaco). Las placas se incubaron con agitación lenta a 37° C, 5% de CO<2>durante 4-8 horas. Se aspiraron los medios y las células se enjuagaron 4 veces con porciones de 1 ml de solución salina de equilibrio de Hanks fría que contenía sales de Ca y Mg. Las células se solubilizaron añadiendo 0,1 ml de Triton X-100 al 1% en agua, y la cantidad de fármaco en los lisados celulares se determinó por fluorometría (Ejemplo 71). La curva estándar se obtuvo en el intervalo de 10-2500 ng Topotecán/pocillo, y se ajustó a un polinomio de segundo orden (para tener en cuenta la autodesconexión a mayor concentración de fármaco) después de restar el fondo de autofluorescencia celular. Cuando se usó un fluorómetro de microplaca, la selección de filtros fue de 400/30 nm para la excitación y de 530/25 nm para la emisión. Tanto los fluorómetros de cubeta como los de microplaca dieron los mismos resultados.
En la Tabla 20 se resumen los resultados de dos experimentos. La captación celular del fármaco liposomal dirigido a HER2 fue muy elevada (50-300 veces superior a la del Topotecán liposomal no dirigido). Curiosamente, la captación de Topotecán libre también fue significativamente menor que la de Topotecán inmunoliposomal dirigido a HER2. Esto puede explicarse por la rápida hidrólisis del anillo de lactona de camptotecina de la molécula de Topotecán en el medio de crecimiento celular en presencia de suero, generando la forma de carboxilato del fármaco que puede tener menor permeabilidad celular y menor citotoxicidad. En resumen, se confirmó la capacidad de los inmunoliposomas conjugados con ligandos, internalizables y dirigidos a las células para administrar Topotecán intracelularmente.
Tabla 20. Captación celularin vitrode liposomas de Topotecán e inmunoliposomas anti-HER2 que contienen TEA
Pn n n rmin . P r l r rí i l li m n l r l T l 12.
EJEMPLO 27. Citotoxicidad de Topotecán liposomal e inmunoliposomal contra células cancerosas que sobreexpresan HER2 in vitro.
Una vez establecida la capacidad de los inmunoliposomas de Topotecán anti-HER2 para la liberación intracelular del fármaco en células cancerosas que sobreexpresan HER2 (Ejemplo 26), era importante garantizar que los liposomas internalizados pudieran liberar el fármaco en su forma activa. Con este fin, se estudió la citotoxicidadin vitrodel Topotecán libre (es decir, el Topotecán formulado como solución), el Topotecán liposomal y el Topotecán anti-HER2 inmunoliposomal. Se prepararon las formulaciones liposomales de Topotecán, y las células SKBr-3 se cultivaron y recogieron como se describe en el Ejemplo 26. Las células se inocularon en placas de cultivo celular de 96 pocillos a 5.000 células en 0,1 ml del medio de crecimiento completo, por triplicado, y se dejó que se aclimatasen durante la noche. Las filas y columnas más a los bordes de la placa se dejaron vacías. Se diluyeron preparaciones estériles de liposomas de Topotecán, inmunoliposomas o fármaco libre (recién preparadas diluyendo Topotecán 20 mg/ml madre, pH 3, en solución salina no tamponada hasta 2 mg/ml) con medio completo de fármaco para conseguir concentraciones a partir de 90, 30 o 10 pg/ml y se diluyeron en serie en el medio por el factor de 3. Los medios de los pocillos se sustituyeron por 0,2 ml de diluciones de fármaco/liposomas, y se incubaron a 37° C, 5% de CO<2>, durante el tiempo especificado (4-6 horas). Un pocillo de cada fila se incubó con medio sin fármaco para servir como control no tratado. Se aspiró el medio que contenía el fármaco de los pocillos, se enjuagaron las células con 0,2 ml de medio sin fármaco y se añadieron 0,2 ml de medio fresco sin fármaco a todos los pocillos. Las placas se incubaron durante 4 días a 37° C, 5% CO<2>. Sin cambio de medio, se añadieron a cada pocillo 0,03 ml de la solución de 2 mg/ml de un colorante de tetrazolio (azul de tiazolilo, MTT) (Sigma Chemical Co.) en medio libre de suero. Las placas se incubaron durante 2-3 horas adicionales a 37° C, 5% de CO<2>. Se aspiraron los medios y se llenaron los pocillos con 0,2 ml de isopropanol acuoso al 70% de vol., HCl 0,075 N, y se agitaron suavemente hasta que se disolvió el colorante formazán (15-30 min). La densidad óptica de las soluciones de formazán se determinó usando un fotómetro de microplaca a 540 nm. La viabilidad celular en % del control no tratado se calculó como la relación entre la densidad óptica en los pocillos experimentales y la densidad óptica en los pocillos que contenían células no tratadas, corregida para tener en cuenta el fondo. Los datos se trazaron frente a la concentración del fármaco, y la dosis IC50 se estimó gráficamente a partir de la intersección de la curva de viabilidad-concentración con la línea del 50% de viabilidad.
Los resultados se presentan en la Figura 9. La dosis de fármaco que produjo una inhibición del crecimiento del 50% (IC<50>) para Topotecán libre o Topotecán liposomal no dirigido fue superior a 30 pg/ml; para Topotecán F5-immunoliposomal, 0,15 pg/ml. Estos resultados son consistentes con los datos de absorción del fármaco dirigido.
EJEMPLO 28. Estabilidad comparativa y farmacocinética plasmática de Topotecán liposomal e inmunoliposomal F5 en ratones.
Los liposomas de Topotecán que contenían el marcador lipídico radiactivo [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido se prepararon de acuerdo con los Ejemplos 11 y 19 usando un procedimiento de mezclado-extrusión de solución lipídica de etanol en las siguientes condiciones: solución salina formadora de gradiente: octasulfato de sacarosa de trietilamonio 0,643 N; extrusión de membrana de policarbonato: 15 pases a través de 2 filtros PCTE apilados, 80 nm de tamaño de poro; carga de Topotecán: proporción de entrada fármaco/fosfolípido 350 mg/mmol (calculada para Topotecán base libre); la conjugación F5 scFv se realizó como se describe en el Ejemplo 19. Los liposomas tenían las siguientes características:
Tamaño por QELS: media de peso 101,2 nm; desviación estándar, 20,1 nm.
Encapsulación del fármaco: Liposomas de Topotecán (Topo-Ls) 359,3±27,4 mg/mmol de fosfolípido; Topotecán F5scFv-inmunoliposomas (Topo-F5-ILs) 326,3±15,9 mg/mmol de fosfolípido.
El estudio se realizó en general como en el Ejemplo 22. Se inyectó a grupos de nueve ratones suizos Webster macho (8-10 semanas de edad, 24-27 g) a través de la vena de la cola con Topo-Ls, Topo-F5ILs o Topotecán recién preparado 1 mg/ml en solución salina no tamponada, a la dosis de 5 mg de Topotecán base por kg de peso corporal (equivalente a la dosis de lípidos de 14-16 pmol de fosfolípido/kg de peso corporal). A la hora, a las 8 horas o a las 24 horas después de la inyección, se desangraron 3 animales por punto temporal mediante punción a corazón abierto bajo anestesia de ketamina/xilacina, se recogió la sangre en tubos que contenían PBS-EDTA y se analizó el Topotecán (fluorometría) y el lípido liposomal (mediante recuento por centelleo de radiactividad). Las cantidades de dosis de fármaco y lípido que quedaban en la sangre en puntos de tiempo dados se calcularon a partir de la dosis administrada tomada como el 100%, suponiendo que la cantidad de sangre por animal era el 6,3% del peso corporal y la fracción de células sanguíneas empaquetadas del 45%. La cantidad de fármaco restante encapsulado en los liposomas en cada punto temporal se calculó para cada animal individualmente comparando la proporción de radiactividad fármaco/lípido de las muestras de plasma con la de los liposomas inyectados. La cantidad de Topotecán libre en las muestras de plasma recogidas 1 hora después de la inyección era menor del 1% de la dosis inyectada (de hecho, estaban por debajo del límite de detección de nuestro método de ensayo); por lo tanto, no se estudiaron otros puntos temporales del grupo de Topotecán libre. Debido a la rápida eliminación en sangre y a los bajos niveles en sangre de Topotecán libre, asumimos que esencialmente todo el Topotecán encontrado en la sangre en todos los puntos temporales representa Topotecán encapsulado liposomalmente.
Los resultados se resumen en la Tabla 21. Sorprendentemente, los liposomas retuvieron el 79-85% de la carga original del fármaco incluso 24 horas después de la inyección en el torrente sanguíneo de los animales. Las diferencias entre los valores plasmáticos medios del lípido o fármaco entre los grupos de liposomas e inmunoliposomas se situaron entre el 1,8 y el 13,6% y estuvieron cerca o dentro del intervalo de los errores de ensayo. Las probabilidades de la hipótesis nula entre el grupo de liposomas y el de inmunoliposomas con respecto a los valores de fármaco o lípidos en cada punto temporal, calculadas mediante la prueba t de Student, se situaron en el intervalo de 0,543-0,938. Concluimos que las diferencias en los niveles sanguíneos residuales del fármaco o lípido entre las dos preparaciones fueron insignificantes y estadísticamente indistinguibles.
Tabla 21. Cantidades de lípido liposomal, de Topotecán y de Topotecán que permanecen encapsulados en los li m n l l m r n n v ri n m r l l in i n i.v.
EJEMPLO 29. Eficacia antitumoral del Topotecán liposomal e inmunoliposomal anti-HER2 en el modelo de xenoinjerto BT-474.
En este estudio usamos el primer prototipo de inmunoliposomas de Topotecán que usan gradiente de trietilamonio-polifosfato para el atrapamiento del fármaco. Los liposomas se prepararon en general siguiendo los métodos de los Ejemplos 11 y 19. Los componentes de la matriz lipídica - DSPC (Avanti Polar Lipids; 3 partes en moles), Colesterol (Calbiochem, 98,3%; 2 partes en moles) y metoxi-PEG(2000)-DSPE (Avanti Polar Lipids, 0,015 partes en moles) - se combinaron con etanol USP al 100% para dar la solución que contenía 0,5 mM de fosfolípido a 60° C. La solución lipídica de etanol se diluyó a 60° C con la solución acuosa de polifosfato de trietilamonio (0,608 M de trietilamina, 0,65 N de fosfato, pH 6,1, osmolalidad 531 mmol/kg), se mezcló exhaustivamente y se extruyó 10 veces a través de 2 membranas de policarbonato apiladas con un tamaño de poro de 100 nm (Nuclepore, Coming) usando una extrusora de presión de gas termostatada (Lipex Biomembranes) a 60° C. Los liposomas extruidos se enfriaron en hielo y el polifosfato de trietilamonio no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en gel sobre Sepharose CL-4B usando tampón de 5% de dextrosa-5 mM de HEPES-Na, pH 6,5, como eluyente. El tamaño de los liposomas fue de 103,8±35,1 nm por QELS. Los liposomas en este tampón se incubaron con clorhidrato de Topotecán a 60° C durante 30 min. a razón de 0,35 mg de Topotecán base por pmol de fosfolípido. Al final de la incubación, los liposomas se enfriaron en hielo y se cromatografiaron en Sephadex G-75, eluyente 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5, para eliminar cualquier fármaco no encapsulado. El contenido de fármaco se determinó por fluorometría, y el contenido de lípidos por ensayo de fosfato, como se ha informado anteriormente. El Topotecán liposomal así obtenido tiene 365,4±23,1 mg de Topotecán base por mmol de fosfolípido. Para preparar inmunoliposomas de Topotecán dirigidos a HER2, se incubó una parte de esta preparación de Topotecán liposomal con el conjugado purificado de scFv F5 anti-HER2 y conector maleimido-PEG-DSPE generalmente como se describe en el Ejemplo 19. Brevemente, el conjugado F5-PEG-DSPE en solución acuosa de 10% de sacarosa-10 mM de citrato de Na, pH 6,5, se combinó con liposomas de Topotecán a razón de 15 mg de proteína por mmol de fosfolípido liposomal, y se incubó a 60° C durante 30 min. La mezcla de incubación se enfrió en hielo y se cromatografió en Sepharose CL-4B, eluyente 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5, para eliminar cualquier conjugado scFv no incorporado. La proporción fármaco-lípido disminuyó un 14 % tras esta incubación adicional.
Las formulaciones de liposomas e inmunoliposomas de Topotecán que contenían 1-2 mg/ml de Topotecán se pasaron por un filtro de jeringuilla estéril de 0,2 micras, se dispensaron asépticamente en viales de polipropileno y se almacenaron a 4-6° C hasta 1 mes antes de su uso.
El Topotecán libre se preparó nuevo disolviendo clorhidrato de Topotecán en polvo a 2 mg/ml en dextrosa al 5% y se esterilizó pasándolo por un filtro de jeringuilla de 0,2 micras.
Se estableció un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de mama humano BT-474 con sobreexpresión de HER2 como se describe en el Ejemplo 10. En el día 13 después de la inoculación del tumor, se seleccionaron los animales que tenían tumores en el intervalo de 120-350 mm cúbicos y se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento y 1 grupo de control de 12 animales cada uno. En los días 14, 18 y 21 posteriores a la inoculación del tumor, los ratones se trataron con inyecciones i.v. (en la vena de la cola) de formulaciones de Topotecán a una dosis por inyección de 5 mg/kg de peso corporal, o con un volumen igual de solución salina fisiológica. Se monitorizó diariamente el estado general de salud de los animales. Se monitorizaron el tamaño de los tumores y el peso corporal dos veces por semana hasta el día 53 después de la inoculación del tumor. Se sacrificó a los animales cuyos tumores alcanzaron el 20% del peso corporal, o aquellos con una pérdida de peso progresiva que alcanzó el 20% o más.
Las Figuras 11 y 12 muestran los datos de crecimiento tumoral y peso corporal de los animales, respectivamente. Las formulaciones liposomales de Topotecán fueron más activas en la supresión del crecimiento tumoral que el fármaco libre, y la formulación liposomal dirigida a F5 fue más activa que la no dirigida. Los tamaños medios de los tumores al final del periodo de observación fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (los valores de p mediante la prueba t de Student no emparejada de 2 colas fueron 1,2x10-6 para el fármaco libre frente al inmunoliposomal, 0,000114 para el fármaco libre frente al liposomal y 0,00718 para el fármaco liposomal frente al inmunoliposomal). Por tanto, el Topotecán encapsulado liposomalmente fue más activo que el fármaco libre, y el Topotecán inmunoliposomal anti-HER2 fue más activo que el fármaco liposomal no dirigido. En el grupo liposomal e inmunoliposomal, tras la regresión inicial, el tumor volvió a crecer a los 10 días del último tratamiento. No hubo regresión tumoral en el grupo de fármaco libre. Se observó que las formulaciones liposomales de Topotecán a una dosis determinada eran más tóxicas que el fármaco libre. Hubo toxicidad gastrointestinal. Los animales que recibieron Topotecán liposomal desarrollaron diarrea y sufrieron una pérdida de peso corporal de un 14% de media en su punto máximo. Mientras que en el grupo de los liposomas no dirigidos los animales se recuperaron, excepto uno (12,5%) que tuvo una pérdida de peso persistente del 15% al final del estudio, en el grupo de F5 dirigido cinco animales (41,6%) desarrollaron morbilidad terminal y fallecieron; y dos más (16,7%) tuvieron una pérdida de peso persistente de aproximadamente el 15%. En el grupo de control y en el grupo libre de fármaco, no hubo pérdida de peso ni morbilidad relacionada con el tratamiento.
EJEMPLO 30. Dosis máxima tolerada (MDT) de Topotecán libre y liposomal en ratones administrado en 3 inyecciones i.v. semanales.
Este estudio usó una formulación liposomal de Topotecán preparada como en el Ejemplo 29, excepto que la solución de polifosfato de trietilamonio se sustituyó por una solución de octasulfato de trietilamonio y sacarosa que tenía 0,65 M de trietilamonio, pH 6,2; y para la extrusión se usaron filtros de membrana de policarbonato de 80 nm en lugar de 100 nm. El tamaño del liposoma ponderado por volumen, determinado por el método de dispersión cuasi elástica de la luz en aproximación gaussiana (QELS), fue de 95,1 ±19,6 nm (media±SD); la proporción fármaco/lípido fue de 369,1 ±18,3 mg/mmol de fosfolípido. Ratones Swiss-Webster hembra de cinco-seis semanas de edad (18-20 g) en grupos de dos recibieron tres inyecciones i.v. (en la vena de la cola) de Topotecán libre o liposomal en un programa de una vez a la semana, empezando con la dosis de 2 mg/kg de Topotecán base por inyección y aumentando en cada grupo posterior por el factor de 1,8 hasta la dosis de 37,8 mg/kg. En este estudio no se incluyó Topotecán inmunoliposomal. Se monitorizó diariamente el peso corporal y el estado general de salud de los animales. La pérdida progresiva de peso superior al 20% o la muerte natural en cualquier momento en cualquiera de los dos animales de un grupo durante el periodo de diez días desde el inicio del tratamiento se consideraron indicativos de la dosis tóxica. De acuerdo con los datos de mortalidad y peso de los animales, se determinó que la MTD se situaba en el intervalo de 11,7-21 mg/kg para el Topotecán libre, y de 2,0-3,6 mg/kg para el Topotecán liposomal (Prototipo 2). En el segundo estudio, los ratones recibieron inyecciones de Topotecán libre, liposomal o inmunoliposomal F5 (preparado a partir del Topotecán liposomal de este Ejemplo, como se describe en el Ejemplo 29) con las dosis de 2,0 mg/kg (Topotecán liposomal/inmunoliposomal) o 12 mg/kg (Topotecán libre), y se aumentó a cada grupo posterior en el factor 1,15 hasta que se alcanzó la dosis próxima al intervalo superior de la MTD establecida. La dosis más alta que no produjo muerte ni morbilidad terminal en ninguno de los animales se consideró una MTD y resultó ser de 18,4 mg/kg para el Topotecán libre, 3,0 mg/kg para el Topotecán liposomal y 3,0 mg/kg para el Topotecán inmunoliposomal. Por tanto, el Topotecán liposomal mostró mayor toxicidad que el fármaco libre.
EJEMPLO 31. Eficacia antitumoral de Topotecán liposomal en el modelo de xenoinjerto BT-474 en el intervalo de 0,125-1,0xMTD
En este estudio se usaron los liposomas de Topotecán y los inmunoliposomas F5 del Ejemplo 30. Se cultivaron xenoinjertos subcutáneos BT-474 en ratones desnudos como en el Ejemplo 29. En el día 18 después de la inoculación de células tumorales, los animales con tumores (105-345 mm cúbicos, media de aproximadamente 200 mm cúbicos) se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento de 6 animales/grupo, y un grupo de control de 8 animales/grupo. Los animales recibieron Topotecán libre o liposomal a 1xMTD, 0,5xMTD, 0,25xMTD o 0,125xMTD en tres inyecciones i.v. (vena de la cola) los días 19, 23 y 27 después de la inoculación del tumor. El grupo de control recibió inyecciones de solución salina fisiológica. Los tamaños de los tumores y los pesos corporales de los animales se controlaron como en el Ejemplo 29. Para obtener las mediciones del peso corporal de los animales, el peso del tumor (calculado a partir del tamaño del tumor suponiendo una densidad tumoral de 1,0) se restó de las mediciones del peso total de los animales. Todas las formulaciones del fármaco en la MTD mostraron actividad antitumoral (Figuras 13A-13D). No hubo diferencias significativas en la eficacia entre el fármaco libre y el liposomal administrados a sus MTD respectivas o a fracciones idénticas (1/2, 1/4 o 1/8) de las mismas. Por tanto, la encapsulación liposomal del fármaco usando el gradiente TEA-SOS dio lugar a un aumento de aproximadamente 6 veces en la actividad antitumoral, pero también a un aumento similar en la toxicidad del fármaco. La dinámica de los pesos corporales de los animales reveló que todos los tratamientos no eran tóxicos, excepto el tratamiento con Topotecán libre en la MTD, que mostró una disminución transitoria del peso corporal (aproximadamente el 15% del valor previo al tratamiento) que se resolvió posteriormente (Figura 14).
EJEMPLO 32. Preparación y citotoxicidad in vitro dirigida de liposomas de Topotecán preparados usando el método de atrapamiento con sucrooctasulfato de trietilamonio.
El Topotecán liposomal se preparó siguiendo en general el procedimiento del Ejemplo 18, usando la solución atrapada de TEA-SOS que tenía 643 mM de TEA, pH 5,7, osmolalidad de 530 mmol/kg, y una proporción fármaco/fosfolípido de 170 mg/mmol. Los liposomas tenían 155 mg de fármaco/mmol de fosfolípido, 90% de eficacia de carga y un tamaño de partícula de 105 nm. Estos liposomas se incubaron con la solución micelar del conjugado F5-PEG-DSPE a aproximadamente 30 scFv por liposomas (15 mg de anticuerpo/mmol de fosfolípido) a 60° C durante 1 hora, generalmente como se describe en el Ejemplo 19. Los liposomas conjugados con anticuerpos se separaron por SEC usando Sepharose CL-4B y se formularon en solución salina tamponada con HEPES HBS-6,5. No hubo cambios detectables en la proporción fármaco/lípido durante la unión de scFv anti-HER2 (F5).
La captación de las formulaciones de Topotecán por las células cancerosas se determinó de la siguiente manera. Se sembraron en placas células de adenocarcinoma de mama humano que sobreexpresan HER2 (SK-Br-3, ATCC HTB-30) en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 150.000 células/pocillo y se aclimataron durante la noche. Las células se incubaron (por triplicado) con Topotecán liposomal dirigido a F5 y no dirigido en medio de crecimiento completo a concentraciones de liposomas de 0,1 mM y 0,01 mM durante 4 horas a 37° C. Las células se enjuagaron 4 veces con solución salina equilibrada de Hanks, se solubilizaron en una mezcla de Tritón X-100 al 0,1% e isopropanol acidificado al 70% 1:10, y se determinó por fluorometría la cantidad de Topotecán asociado a células por pocillo. Los resultados (media ± error estándar) se resumen en la Tabla 22. Los liposomas dirigidos liberaron 100-300 veces más fármaco en las células dirigidas que los liposomas no dirigidos.
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La citotoxicidad de estas formulaciones de Topotecán contra células de cáncer de mama SKBr-3 se determinó como se describe en el Ejemplo 27. Las células SKBr-3 se inocularon en placas de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo, se aclimataron durante la noche y se incubaron con concentraciones crecientes (0,004-30 pg/ml) de Topotecán libre, liposomal o inmunoliposomal F5 en medio de crecimiento celular durante 4 horas a 37° C. Se retiraron los medios que contenían el fármaco y las células se dejaron crecer en medio libre de fármaco durante 72 horas. Se retiró el medio que contenía el fármaco y se dejó crecer a las células en el medio libre de fármaco durante 72 horas. La cantidad de células viables por pocillo se determinó mediante el ensayo de tetrazolio con azul de tiazolilo (MTT) y se expresó como % de la de las células de control (no tratadas). Los resultados se presentan en la Figura 10. Los inmunoliposomas de Topotecán fueron más citotóxicos (IC<50>0,15-0,5 pg/ml) que los liposomas de Topotecán no dirigidos (IC<50>s 3,1. pg/ml) y el Topotecán libre (IC<50>s 2,3 pg/ml).
EJEMPLO 33. Estabilidad in vivo de liposomas de Topotecán de diferente tamaño.
Los liposomas que contenían TEA-Pn se prepararon como en el Ejemplo 22 usando extrusión 12 veces a través de membranas de policarbonato de 100 nm de tamaño de poro o adicionalmente 12 veces a través de membranas de policarbonato de 50 nm de tamaño de poro. Se añadió Topotecán (TPT) en una proporción de 150 pg/pmol de fosfolípido. La carga se completó a 58° C durante 45 min en un baño de agua caliente, seguido de inactivación en hielo. La eficacia de carga del liposoma extruido de 50 nm y 100 nm fue de 126,80 ± 19,24 pg TPT/pmol PL (84,5 ± 12,8 %) y 148,48 ± 10,26 pg TPT/pmol PL (99,0 ± 6,8 %), respectivamente. Se inyectó por vía intravenosa a ratones Swiss Webster hembra en grupos de tres con una de las dos formulaciones de Ls-TPT a una dosis de 5 mg TPT/kg. Los ratones se sacrificaron después de 6 h y se recogió la sangre. Se analizó el plasma para TPT y lípido liposomal como se describe en el Ejemplo 22. Los resultados se presentan en la Tabla 23.
Tabla 23. Estabilidad in vivo de Ls-TPT de diferentes tamaños cargados usando el método de atrapamiento TEA-Pn.
EJEMPLO 34. Síntesis y encapsulación en liposomas de 6-(3-aminopropil) ellipticina (6-APE).
La 6-(3-aminopropil)ellipticina se preparó a partir de ellipticina mediante un método de dos pasos basado en el procedimiento de Werbel et al., J. Med. Chem. 1986, v.29, p.1321-1322. Se agitaron 501,4 mg de ellipticina base (NSC 71795) (Aldrich Chemical Co.) con aproximadamente 100 mg de hidruro sódico (Sigma; lavado con éter de petróleo anhidro) en 5 ml de dimetilformamida (DMF) seca a temperatura ambiente durante 30 min. A esta mezcla se le añadió gota a gota una solución de 678 mg de N-bromopropilftalimida (Aldrich) en 2 ml de DMF seca. La mezcla de la reacción de color púrpura se agitó bajo argón durante la noche, se trató con 1 ml de agua y se vertió en 60 ml de agua. La mezcla se extrajo dos veces con 25 ml de cloruro de metileno, el extracto se secó sobre sulfato sódico anhidro y se pasó por una capa de alúmina neutra. La capa de alúmina se lavó dos veces con 10 ml de cloruro de metileno y el filtrado y los lavados combinados se llevaron hasta la sequedad al vacío. El producto se agitó durante la noche con 20 ml de etanol absoluto y 2 ml de hidracina anhidra a temperatura ambiente. La lechada obtenida se filtró al vacío, el filtrado amarillo se diluyó con 50 ml de NaOH 0,2 N y se extrajo con dos porciones (75 ml y 50 ml) de cloroformo. El extracto de cloroformo se secó sobre Na2SO4 y se llevó hasta la sequedad al vacío. El producto bruto (rendimiento 408 mg) se cromatografió en columna de sílice 60 eluyendo isocráticamente con mezcla de cloroformo y metanol (7:3 en volumen), saturada con trimetilamina seca. Se demostró que las fracciones eluidas en una segunda banda de color amarillo, a continuación de la elipticina sin reaccionar, contenían el compuesto deseado en un rendimiento aproximado del 30%. La estructura se confirmó mediante 1H-n Mr . TLC: Rf 0,29-0,31 (sílice 60; CHCh-MeOH 7:3 en volumen, saturado con trimetilamina). Elipticina, Rf 0,81-0,83. El compuesto obtenido se convirtió en sal de diclorhidrato mediante disolución en etanol anhidro y titulación con solución de HCl 6 N en isopropanol seco. Los cristales anaranjados de diclorhidrato de 6-APE (NSC 176328) se filtraron, se enjuagaron con éter y se secaron al vacío. Rendimiento del diclorhidrato 86%.
Los liposomas se prepararon hidratando la película lipídica pura de DSPC, colesterol y PEG(M.w. 2.000)-DSPE (proporción molar 3:2:0,015) en una solución de polifosfato de trimetilamonio (TMA-Pn) a 0.5 M t Ma , pH 5,6, a 60° C, seguida de seis ciclos de congelación rápida (-78° C) y descongelación (60° C), y extrusión diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 50 nm de tamaño de poro. La TMA-Pn no encapsulada se eliminó usando una columna Sepharose CL-4B eluida con HEPES-Dextrosa (5 mM HEPES, 5% de Dextrosa, pH 5,5). El tamaño del liposoma era de 85,7 ± 32,1 nm.
Se añadió una solución concentrada de 6-APE (10 mg/ml) a los liposomas que contenían TMA-Pn a una proporción fármaco-fosfolípido de 100 pg de APE/pmol de fosfolípido, se incubó la mezcla a 58° C durante 45 min y se enfrió rápidamente en hielo durante 15 min. El fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en gel en una columna Sephadex G-75 eluida con tampón HEPES-Dextrosa (5 mM HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5). Luego, el APE atrapado en el liposoma se cuantificó por espectrofotometría como en el Ejemplo 71, y se determinó el fosfolípido del liposoma usando el ensayo de extracción del Ejemplo 70. La encapsulación del fármaco fue prácticamente cuantitativa.
EJEMPLO 35. Preparación de 6-APE inmunoliposomales dirigidos a HER2 y citotoxicidad de las formulaciones de 6-APE contra células de cáncer de mama Bt -474 que sobreexpresan HER2 in vitro.
Se prepararon liposomas con 6-APE encapsulada (Ls-APE) como en el Ejemplo 34 anterior. Se prepararon inmunoliposomas anti-HER2 con 6-APE encapsulada (F5-ILs-APE) a partir de Ls-APE mediante el método del Ejemplo 19. Se usó un ensayo de viabilidad celular basado en MTT del Ejemplo 27 para determinar la citotoxicidad de 6-APE administrado como solución, Ls-APE, o como F5-ILs-APE dirigido a HER2 contra células de carcinoma de mama humano que sobreexpresan HER2 (BT-474). Las células se expusieron a un medio que contenía fármaco durante 6 horas y se incubaron en un medio libre de fármaco durante 3 días. Los resultados se muestran en la Figura 15. La IC<50>para APE libre es de 0,26 pg APE/ml, para F5-ILs-APE fue de 0,756 pg APE/ml, y para Ls-APE no dirigido fue de 51,0 pg APE/ml. Hubo una diferencia de 67,5 veces en la actividad entre la 6-APE liposomal dirigida y la no dirigida, lo que indica un efecto de administración dirigida considerable.
EJEMPLO 36. Formulaciones inmunoliposomales dirigidas a EGFR de 6-APE y citotoxicidad contra células cancerosas in vitro,
Los liposomas cargados con 6-APE se prepararon como se describe en el Ejemplo 34. Los inmunoliposomas dirigidos a EGFR se prepararon uniendo fragmentos de anticuerpo Fab' específicos del EGFR de la siguiente manera. Una IgG MAb C225 específica de EGFR (cetuximab, ERBITUX™, Imclone Systems) se digirió con pepsina para producir fragmentos (Fab')<2>. Los fragmentos (Fab')<2>purificados se redujeron mediante tratamiento con 2-mercaptoetilamina 10-20 mM durante 15 min a 37° C, y los fragmentos Fab' se purificaron mediante filtración en gel usando Sephadex G-25. La presencia de grupos tiol reactivos fue típicamente de aproximadamente 0,9 grupos tiol por molécula de proteína (cuantificados mediante el reactivo de Ellmann). Los C225Fab' se conjugaron covalentemente con un conector anfifílico Mal-PEG-DSPE (Avanti Polar Lipids, AL) en solución acuosa a pH 6,2-6,5 y relación molar proteína-conector de 1:4 durante 2-4 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4-6° C, para producir el conjugado C225Fab'-PEG-DSPE con un rendimiento del 30-50% de la proteína. Este conjugado formador de micelas se separó de la proteína que no reaccionó mediante cromatografía en columna de exclusión por tamaño en un gel de agarosa al 3% - poliacrilamida al 4% (Ultrogel AcA34, obtenido de Sigma Chemical Co.), eluido con tampón HBS-6.5. El conjugado se recuperó en una muestra vacía de gel de poliacrilamida (Ultrogel AcA34, obtenido de Sigma Chemical Co.). El conjugado se recuperó en fracciones de volumen vacío. La 6-APE inmunoliposomal se formó incubando estos liposomas con C225 Fab'-PEG-DSPE con liposomas cargados de fármaco a razón de 30 mg de proteína C225/mmol de fosfolípido liposomal durante 30 min a 60° C, inactivando en hielo durante 15 min, y purificando los inmunoliposomas por cromatografía en gel en una columna Sepharose CL-4B también eluida con tampón HBS-6.5 (los liposomas aparecen en o cerca del volumen vacío de la columna).
Se cultivaron células de cáncer de mama humano MDA-MB-468 con sobreexpresión de EGFR y células de cáncer de mama humano MCF-7 con baja expresión de EGFR (ATCC, Rockville, MD) en sus medios de crecimiento recomendados por el proveedor, y se estudió la citotoxicidad de 6-APE libre, liposomal e inmunoliposomal anti-EGFR contra estas células de acuerdo con el método del Ejemplo 27. Las células se incubaron con medios que contenían fármaco durante 6 horas, seguido de 3 días de postincubación en el medio libre de fármaco. Los resultados se muestran en la Figura 16. En las células MDA-MB-468, la IC<50>para la 6-APE libre fue de aproximadamente 0,1 pg/ml, y para la C225-ILs-APE de aproximadamente 0,9 pg/ml. En las células MCF-7, la IC<50>fue de aproximadamente 0,1 para la 6-APE libre, de aproximadamente 0,5 pg/ml, y para la C225-ILs-APE, de aproximadamente 14 pg/ml. La IC<50>de Ls-APE en ambas líneas celulares fue >30 pg/ml. Por tanto, los inmunoliposomas cargados con 6-APE dirigidos a EGFR demostraron actividad citotóxica específica de antígeno en células de cáncer de mama MDA-MB-468 que sobreexpresan EGFR, pero no en células de cáncer de mama MCF-7 que no sobreexpresan EGFR. En las células MCF-7, los liposomas 6-APE dirigidos y no dirigidos fueron igualmente activos.
EJEMPLO 37. Farmacocinética de 6-APE liposomal en ratas.
Se prepararon liposomas con solución de TEA-Pn atrapada (grupos fosfato 557 mM, TEA 500 mM, pH 5,8, osmolalidad 480 mmol/kg) y composición lipídica de DSPC, colesterol y PEG-DSPE (relación molar 3:2:0,015) como en el Ejemplo 11 anterior. La solución etanólica de los lípidos se combinó a 60° C con 10 volúmenes de la solución acuosa de TEA-Pn, y se extruyó diez veces a través de dos membranas de policarbonato apiladas de 80 nm de tamaño de poro. La TEA-Pn no encapsulada se eliminó usando una columna Sepharose CL-4B eluida con MES-Dextrosa (5 mM MES-Na, 5% de Dextrosa, pH 5,5). El tamaño del liposoma fue de 92,3 ± 23,3 nm por QELS. En la matriz lipídica se incluyó un marcador lipídico radiactivo no intercambiable [3H]-CHE a 0,5 mCi/mmol de fosfolípido. Los liposomas se cargaron con 6-APE como se describe en el Ejemplo 34.
El estudio farmacocinético siguió el protocolo del Ejemplo 9. Se inyectó i.v. a ratas hembra Sim Albino (9 semanas, 200 g) una dosis de 10 mg de 6-APE/kg. Se extrajo sangre en los puntos temporales prescritos y se analizó el plasma para 6-APE mediante fluorometría. Se mezclaron alícuotas de plasma (0,05-0,2 ml) con 1-2 ml de 90% de isopropanol acuoso-0,1 N HCl, y la 6-APE se cuantificó por fluorescencia como en el Ejemplo 71. El lípido se cuantificó mediante recuento por centelleo de radiactividad [3H]-CHE.
Los resultados se muestran en la Figura 17. La semivida en sangre (t<1/2>) del fármaco fue de 13,7 horas y la del lípido liposomal de 16,6 horas (panel A). La semivida de liberación del fármaco a partir de los liposomas fue de 77,9 horas, lo que demuestra una notable estabilidad de la encapsulación (panel B).
EJEMPLO 38. Síntesis y encapsulación liposomal de 2-(2-(N,N-dietilamino)etil)ellipticinio (2-DAE).
El cloruro de 2-(2-(N,N-dietilamino)etil-elipticinio (NSC 359449) es un derivado anticanceroso de la elipticina que se prepara por alquilación de la elipticina con cloruro de 2-(N,N-dietilamino)etil en metanol en presencia de trietilamina (consultar Werbel, L.M., Angelo, M., Fry, D.M., y Worth, D.F. J. Med. Chem. 1986, 29:1321-1322). Los liposomas que contenían TEA-Pn atrapada se prepararon como se describe en el Ejemplo 37. Los liposomas contenían TEA-Pn atrapada. Se incubó 2-DAE.2HCl con los liposomas de TEA-Pn en 5 mM HEPES-Na, 5% de Dextrosa, pH 7,4, a una proporción 2-DAE-fosfolípido de 100 pg/pmol. La cantidad de fármaco cargado fue de 88,2 pg APE/pmol PL (eficacia 88,2 %).
EJEMPLO 39. Farmacocinética de 2-DAE liposomal en ratas.
Se estudió en ratas la farmacocinética sanguínea del 2-DAE liposomal (Ejemplo 38) como en el Ejemplo 37. La t<1/2>del 2-DAE fue de 17,8 h y la de la matriz lipídica liposomal, de 18,2 h (A). La semivida de liberación del fármaco de los liposomas en la sangre fue t<1/2>= 677 h (B). Por tanto, estos liposomas eran extraordinariamente estables frente a la filtración del fármaco en el torrente sanguíneo.
EJEMPLO 40. Carga de vinorelbina en liposomas usando el método TEA-Pn. Efecto del pH.
Los liposomas se prepararon por el método de inyección de etanol como en el Ejemplo 11 usando solución TEA-Pn de 0,608 M de TEA, 0,65 M de grupos fosfato, pH 6,1, y osmolalidad 531 mmol/kg, y extrusión de la suspensión lipídica 15 veces a través de dos membranas de policarbonato apiladas de 100 nm de tamaño de poro. El tamaño del liposoma resultante fue de 108,3 ± 17,1 nm por QELS. Se añadió vinorelbina (VRB) en forma de solución madre de bitartrato de vinorelbina 10 mg/ml USP a los liposomas en solución acuosa 5 mM HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5, a una proporción fármaco-fosfolípido de 350 pg/pmol, se ajustó el pH al valor deseado usando 1-5 N NaOH. y la mezcla se incubó a 58±2° C durante 30 min. Luego, la mezcla se enfrió en hielo durante 15 min, y el fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75, eluyendo con tampón HBS-6,5 (20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5). Luego, se solubilizaron alícuotas de liposomas purificados en isopropanol ácido y se analizaron en busca de vinorelbina usando espectrofotometría a 270 nm. El fosfolípido liposomal se cuantificó usando el ensayo de fosfato de Bartlett (1959) después de la extracción con metanol-cloroformo.
Las proporciones fármaco-lípido calculadas tras la carga fueron las que se muestran en la Tabla 24. La carga de vinorelbina fue cuantitativa(esdecir, prácticamente del 100%) e independiente del pH en el intervalo estudiado.
T l 24.^ r vin r l in n li m n TEA-Pn r v ri v l r H l m n x rno
EJEMPLO 41 Vinorelbina liposomal preparada por el método TEA-Pn en varias proporciones fármaco/lípido: eficacia de encapsulación y estabilidad in vivo en ratones.
Los liposomas con solución de TEA-Pn atrapada se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 40, excepto que se incluyó [3H]-CHE en la matriz lipídica a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido. El tamaño del liposoma fue de 98,5 ± 34,3 nm por QELS. Los liposomas se mezclaron con vinorelbina bitartrato USP en tampón acuoso de 5 mM HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5 a una proporción fármaco-fosfolípido de 150-450 mg VRB/mmol, y se incubaron a 58±2° C durante 30 min. No se realizó ningún ajuste del pH tras la adición del fármaco. Los liposomas cargados con vinorelbina (Ls-VRB) se aislaron y analizaron para el fármaco y el fosfolípido como en el Ejemplo 40.
Se inyectó por vía intravenosa Ls-VRB-Pn a ratones hembra Swiss Webster (Harlan Bioresearch) de cincoseis semanas de edad, en grupos de tres, una dosis de 5 mg VRB/kg. La dosis de lípidos varió de acuerdo con el grado de carga y puede determinarse a partir de las proporciones fármaco-lípido calculadas anteriormente. A las 8 o 24 horas después de la inyección, los animales fueron anestesiados, desangrados y la sangre se recogió en hielo en tubos pesados que contenían cantidades conocidas de PBS con EDTA al 0,04%. Las células sanguíneas se separaron por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron para lípidos liposomales por centelleo de radiactividad [3H]-CHE y para vinorelbina por HPLC de la siguiente. Las muestras se enriquecieron con vinblastina (patrón interno), se extrajeron con éter dietílico, se evaporaron y los residuos se disolvieron en la fase móvil, que consistía en acetato de trietilamonio 50 mM acuoso (pH 5,5) y acetonitrilo (58:42 en volumen). Las muestras se cargaron en una columna de sílice de fase inversa C<18>(columna Supelco C-18, 250 mm x 4 mm de diámetro interno, tamaño de partícula de 5 pm) precedida por una columna de protección C-18. La columna se eluyó isocraticamente con la fase móvil anterior a un caudal de 1,0 ml/min. El VRB se detectó usando un detector de absorbancia a 280 nm. Los tiempos de retención típicos para la VRB y la vinblastina (patrón interno) fueron de 9,1 min y 7,8 min, respectivamente.
Los resultados se muestran en la Tabla 25. La eficacia de carga disminuyó con el aumento de la proporción fármaco/lípido, desde prácticamente el 100% a 150 mg/mmol hasta aproximadamente el 66% a 450 mg/mmol. Se observó que la adición de bitartrato de vinorelbina en proporciones superiores a 250 mg de vinorelbina por mmol de fosfolípido provocaba una acidificación sustancial de la suspensión liposomal (pH <4,0) que llevó a una reducción de la eficacia de carga. Por tanto, se estableció la necesidad de controlar el pH durante el paso de carga del fármaco. Las cantidades de matriz liposomal detectadas en la sangre al de 8 horas variaban entre el 30,4 ± 6,6% de la dosis inyectada (%id) y el 38,6 ± 5,2 %id, sin relación aparente con la cantidad absoluta de lípido inyectado. Después de 24 horas, todavía había entre un 6,4%ID y un 14,8%ID de la matriz lipídica detectable en la sangre. La cantidad de fármaco que permanecía encapsulado después de 8 horas variaba del 37% al 63%. Sin embargo, a las 24 horas después de la inyección, los niveles de fármaco cayeron por debajo del límite de detección del método analítico empleado.
Tabla 25. Eficacia de la encapsulación y retención del fármacoin vivode vinorelbina liposomal preparada en diferentes proporciones fármaco/lípido usando el método TEA-Pn (sin ajuste del pH del tampón de carga). Los datos de retención del fármaco son la media ± SD N=3.
EJEMPLO 42. Carga de vinorelbina en liposomas usando el método TEA-SOS en varias proporciones fármaco/lípido.
Los liposomas TEA-SOS para la carga de fármaco se prepararon como en el Ejemplo 40, excepto que se usó la solución TEA-SOS con TEA 0,65 M, pH 5,4, osmolalidad 521 mmol/kg en lugar de la solución TEA-Pn, y los liposomas se extruyeron a través de membranas de policarbonato de 80 nm de tamaño de poro. El tamaño de los liposomas fue de 86,6 ± 12,9 nm por QELS. Se añadió VRB a los liposomas en solución acuosa de 5 mM de HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5, en varias proporciones de fármaco por fosfolípido, y la mezcla se incubó posteriormente a 60° C durante 30 min. A continuación, los liposomas cargados con VRB se aislaron y analizaron como en el Ejemplo 40.
Las proporciones fármaco-lípido calculadas en los liposomas VRB se muestran en la Tabla 26. Sorprendentemente, a diferencia de la carga asistida por aniones poliméricos, la carga de vinorelbina en los liposomas con azúcar polianionizado (octasulfato de sacarosa) fue prácticamente cuantitativa independientemente de la proporción fármaco/lípido hasta 450 mg de VRB/mmol de fosfolípido, y sólo ligeramente inferior (88%) a 550 mg de VRB/mmol de fosfolípido.
EJEMPLO 43. Preparación de inmunoliposomas dirigidos a HER2 cargados con vinorelbina por el método TEA-Pn, y farmacocinética sanguínea comparativa de liposomas de vinorelbina dirigidos a HER2 y no dirigidos en ratas.
El conjugado anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE se preparó como en el Ejemplo 19. Se prepararon inmunoliposomas de vinorelbina dirigidos a HER2 incubando liposomas de vinorelbina no dirigidos (Ejemplo 41, cargados a una proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol) con conjugado F5-PEG-DSPE (Ejemplo 19) en tampón acuoso 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5 a una proporción proteína/fosfolípido de 15 mg/mmol a 60° C durante 30 min. El conjugado F5 no incorporado se eliminó mediante cromatografía en gel en una columna de Sepharose 4B eluida con el mismo tampón. Los liposomas no dirigidos (Ls-Pn-VRB) y los dirigidos a HER2 (F5-ILs-Pn-VRB) se administraron i.v. a ratas Albino hembra (8-9 semanas de edad; 200 g) a una dosis de 5 mg VRB/kg. En varios puntos temporales, se recogió sangre como se describe en el Ejemplo 9, y se analizó para VRB y el lípido liposomal como en el Ejemplo 41. La semivida en sangre de los lípidos liposomales y el tiempo de liberación del fármaco del 50% se calcularon a partir de los gráficos de concentración-tiempo de los lípidos o mediante gráficos de tiempo de proporción fármaco/lípido, respectivamente, encontrando el mejor ajuste a la cinética monoexponencial usando la función TREND de la hoja de cálculo MICROSOFT EXCEL (Microsoft Corp.). Los resultados (Figura 18) indicaron que tanto los liposomas de vinorelbina dirigidos como los no dirigidos presentaban una farmacocinética idéntica del fármaco y del lípido, con una semivida del lípido de aproximadamente 12,1 horas y un tiempo de liberación del fármaco del 50% de aproximadamente 4,3 horas.
EJEMPLO 44. Preparación y estabilidad in vivo comparativa de liposomas de vinorelbina preparados usando sales de amonio y de amonio sustituido.
La solución de sulfato de dextrano amónico (DS-A) con pH 5,8, 0. 65 M NH<4>+, osmolalidad de 390 mmol/kg, y la solución de sulfato de dextrano trietilamónico (DS-TEA) con pH 6,0, 0. 65 M NH<4>+, osmolalidad de 465 mmol/kg, se prepararon a partir de sulfato de dextrano con peso mol. 10.000 (Sigma Chemical Co.) de acuerdo con el método del Ejemplo 4, usando titulación con amoniaco acuoso 12,4 M o trietilamina pura, respectivamente. La solución acuosa de sulfato de amonio (S-A) 325 mM, pH 5,1, osmolalidad 703 mmol/kg, se preparó a partir de sulfato de amonio de calidad analítica. Las tres soluciones contenían menos del 1 % de Na+ del contenido total de cationes. Los liposomas que atrapaban estas soluciones se prepararon usando el método de mezclado-extrusión en etanol del Ejemplo 41 (relación molar de DSPC/Colesterol/PEG-DSPE 3:2:0,015). Se incluyó el marcador lipídico radiactivo [3H]-Ch E en la matriz lipídica a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido. El paso de extrusión consistió en 10 pases a través de dos membranas de policarbonato de 0,1 gm apiladas. La VRB se añadió a los liposomas en 5 mM HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5, en una proporción fármaco-fosfolípido de 350 mg/mmol, el pH se ajustó a 6,5 usando NaOH 1 N, y la mezcla se incubó a 58-60C° C durante 30 min. Luego, la reacción se enfrió en hielo durante 15 minutos, y el fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75, eluyendo con HEPES-Na acuoso 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5. La vinorelbacida purificada se eliminó mediante cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75. Los liposomas purificados cargados con vinorelbina se analizaron espectrofotométricamente para VRB y para fosfolípidos mediante el ensayo de fosfato de Bartlett (1959) (consultar los Ejemplos 70, 71). Se estudió la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal y del fármaco en ratas como en el Ejemplo 43.
Los resultados se muestran en las Figuras 19-20, y en la Tabla 27. Los liposomas cargados con dextransulfato de trietilamonio se compararon con los cargados usando sal amónica de sulfato de dextrano. Inesperadamente, los cargados usando la sal de trietilamonio fueron considerablemente más estables que los cargados usando la sal de amonio. La farmacocinética del propio portador liposomal fue similar con las tres formulaciones diferentes y, por tanto, dependió principalmente de la composición lipídica empleada. La filtración de vinorelbina de los Ls-VRB cargados usando dextranosulfato de trietilamonio fue aproximadamente tres veces más lenta que la de los cargados con dextransulfato de amonio. Los liposomas cargados usando sulfato de amonio presentaron la tasa de filtración de fármaco más rápida.
Tabla 27. Estabilidadin vivocomparativa de la encapsulación del fármaco en liposomas usando amonio atrapado y sal de amonio sustituida.
EJEMPLO 45. Preparación y estabilidad in vivo de liposomas cargados con vinorelbina de varios tamaños.
Se prepararon liposomas marcados con [3H]-CHE (1,5 mCi/mmol de fosfolípido) con una solución atrapada de octasulfato de sacarosa de trietilamonio (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) mediante el método de mezclado-extrusión con etanol del Ejemplo 11. El paso de extrusión contenía 15 pases a través de dos membranas de policarbonato apiladas con un tamaño de 0,05, 0,08 o 0,1 pm. La carga de vinorelbina, el aislamiento de liposomas de vinorelbina y la caracterización de liposomas siguieron el método del Ejemplo 40. Se usaron ratas Albino hembra (8-9 semanas de edad; 200 g) para estudiar la estabilidadin vivode los liposomas. La farmacocinética del lípido liposomal y del fármaco se estudió en ratas como en el Ejemplo 43.
Los resultados se muestran en las Figuras 21, 22 y en la Tabla 28 a continuación. Se compararon los liposomas extruidos a través de filtros de policarbonato de 0,05, 0,08 y 0,1 pm y se demostró que presentaban una farmacocinética similar del fármaco y del portador liposomal, así como un grado similar de filtración del contenido. La liberación del fármaco de los liposomas en sangre se caracterizó por los tiempos de liberación del 50% en el intervalo de aproximadamente 40-80 horas, muy por encima de las 24 horas.
T l 2 . r riz i n l li m vin r l in .
EJEMPLO 46. Preparación de liposomas de vinorelbina dirigidos a HER2 usando el método de atrapamiento TEA-SOS, y farmacocinética de vinorelbina inmunoliposomal dirigida y no dirigida a HER2 scFv en ratas.
Se prepararon liposomas, se cargaron con vinorelbina en la proporción fármaco-fosfolípido de 350 mg/mmol y se analizaron como se describe en el Ejemplo 43, excepto que la solución TEA-SOS del Ejemplo 45 se sustituyó por la solución TEA-Pn. El paso de extrusión incluyó 15 pases a través de filtros de policarbonato de 0,08 pm de tamaño de poro. El tamaño del liposoma fue de 95,0 ± 26,0 nm por QELS. Se prepararon inmunoliposomas de vinorelbina anti-HER2 ligados a F5scFv a partir de estos liposomas de vinorelbina, y se estudió la farmacocinética sanguínea del lípido liposomal y del fármaco de vinorelbina liposomal dirigido a HER2 y no dirigido en ratas como se describe en el Ejemplo 43. La semivida de circulación del lípido liposomal fue de 11,4 horas y 10,3 horas, y el tiempo de liberación del fármaco al 50% fue de 30,9 horas y 30,3 horas para F5-ILs-VRB y Ls-VRB, respectivamente. Por tanto, la farmacocinética del lípido y del fármaco de Ls-VRB y F5-ILs-VRB fue muy similar, lo que indica que la introducción del conjugado scFv-PEG-DSPE no afectó a la depuración del propio portador ni produjo un aumento de la filtración del fármaco del portador mientras estaba en circulación (Figs. 23, 24).
EJEMPLO 47. Preparación y propiedades farmacocinéticas de liposomas de vinorelbina que comprenden derivados lipídicos no iónicos de polietilenglicol).
El derivado metoxi-PEG (peso molecular 2.000) de la ceramida C<20>sintética (PEG-ceramida) se obtuvo de Northern Lipids, Inc., Canadá. El metoxi-PEG (peso molecular 2.000)-distearoilglicerol (PEG-DSG) (SUNBRIGHT GS20) era de NOF Corp., Japón.
Se prepararon liposomas que tenían la composición lipídica de DSPC, colesterol y PEG-lípido (PEG-ceramida o PEG-DSG) en la proporción molar de 3:2:0,3 y solución TeA-SOS atrapada (0,65 M t Ea , pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) mediante el método de mezclado/extrusión con etanol del Ejemplo 11. El paso de extrusión incluyó dos pases a través de dos filtros de membrana de policarbonato apilados 2 veces usando un tamaño de membrana de 0,2 pm y 10 veces usando un tamaño de poro de 0,08 pm. Los liposomas se cargaron con vinorelbina a la proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol, se caracterizaron por tamaño, fármaco y concentración de lípidos, y su farmacocinética se estudió en ratas como en el Ejemplo 46. Ambas formulaciones mostraron un tiempo de circulación prolongado de la matriz lipídica y una liberación lenta del fármaco in vivo, con por lo menos el 50% del fármaco permaneciendo encapsulado después de 24 horas en la sangrein vivo,como se muestra en la Tabla 29 a continuación.
T l 2 r riz i n li m vin r l in n v ri PE -lí i .
Sorprendentemente, la PEGilación aumentada de estos liposomas (contenido de lípidos PEG de aproximadamente un 5,7% en moles del lípido total) no tuvo prácticamente ningún efecto sobre la longevidad del liposoma en la circulación sanguínea en comparación con los liposomas similares de tamaño coincidente que tenían una baja PEGilación de aproximadamente 0,3% en moles del lípido total (Ejemplo 45, 109,6 nm, t<1/2>=14,3 horas; 98,5 nm, t<1/2>=13,0 horas).
EJEMPLO 48. Preparación de vinorelbina liposomal dirigida a HER2 y citotoxicidad de vinorelbina liposomal libre, dirigida a h ER2 y no dirigida contra células MDA-MB-453 in vitro.
Los liposomas cargados con vinorelbina (Ls-VRB) se prepararon como en el Ejemplo 42 (sin [3H]-CHE) usando carga de fármaco a pH 6,0 y 350 pg de vinorelbina/pmol de fosfolípido. La vinorelbina inmunoliposomal anti-HER2 (F5-ILs-VRB) se formó incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE como se describe en los Ejemplos 19 y 42 anteriores, excepto que no se añadió [3H]-CHE. La vinorelbina "libre" se preparó diluyendo bitartrato de vinorelbina 10 mg/ml solución USP en el medio de cultivo celular.
Las MDA-MB-453 son células de adenocarcinoma de mama humano (American Type Culture Collection, Rockville, MD) que sobreexpresan moderadamente el receptor HER2 (aproximadamente de 3x104 a1x105 copias/célula). La citotoxicidad de VRB administrado como fármaco libre, como vinorelbina liposomal no dirigida, o como vinorelbina (F5)-inmunoliposomal dirigida a HER2 frente a células MDA-MB-453 se determinó como se describe en el Ejemplo 27, excepto que las células se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos en las condiciones de crecimiento recomendadas por el proveedor (Leibowitz L-15 con 10% de suero fetal de ternera, sin suplemento de CO<2>) a una densidad de 10.000 células/pocillo, y las formulaciones de fármaco se añadieron en una serie de diluciones escalonadas de 1:3, comenzando con 0,03-0,1 mg/ml. Los datos de viabilidad celular se representaron gráficamente frente a la concentración de fármaco (Figura 25) y a partir de los gráficos se estimaron las concentraciones de fármaco necesarias para reducir la viabilidad celular al 50% (IC<50>). La IC<50>del liposoma de vinorelbina dirigido a F5 (0,06 pg/ml) fue cercano al del fármaco libre (0,07 pg/ml) y sustancialmente menor al de los liposomas no dirigidos (2,2 pg/ml). Esto representa un aumento de la actividad de 37 veces como resultado de la administración específica del fármaco en células cancerosas.
EJEMPLO 49. Citotoxicidad de vinorelbina liposomal libre, dirigida a HER2 y no dirigida contra células CaLu-3 in vitro,
Los liposomas y métodos del ejemplo anterior (Ejemplo 48) se usaron para estudiar la citotoxicidad de vinorelbina libre, Ls-VRB y F5-ILs-VRB en células de carcinoma pulmonar humano de células no pequeñas CaLu-3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) que sobreexpresan HER2. Las células se cultivaron en medio RPMI-1460 con un 10% de suero fetal de ternera en presencia de un 5% de CO<2>. Los resultados se muestran en la Figura 26. La IC<50>para la VRB libre fue de 1,2 pg/ml, de 10 pg/ml para el F5-ILs-VRB y de 50 pg/ml para Ls-VRB no dirigido. Esto representa una mejora de 5 veces en la actividad del fármaco encapsulado en liposomas en función de la administración dirigida a las células.
EJEMPLO 50. Citotoxicidad de vinorelbina liposomal libre, dirigida a HER2 y no dirigida contra células SKBr-3 in vitro.
Se usaron los liposomas y métodos del Ejemplo 48 para estudiar la citotoxicidad de vinorelbina libre, Ls-VRB y F5-ILs-VRB en células de carcinoma de mama humano SKBr-3 que sobreexpresan HER2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD), con la excepción de que las células se cultivaron en el medio McCoy 5A modificado con un 10% de suero fetal de ternera en presencia de un 5% de CO<2>, se sembraron en placas a una densidad de 5.000 células/pocillo, y el fármaco se incubó con las células durante 6 h.
Los resultados se muestran en la Figura 27. La IC<50>para la VRB libre fue de 0,28 pg/ml, 0,17 pg/ml para el F5-ILs-VRB y 0,8 pg/ml para la Ls-VRB no dirigido. Esto representa una mejora de 4,7 veces en la actividad del fármaco en función de la administración dirigida.
EJEMPLO 51 Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal en xenoinjertos de cáncer de colon humano HT29 en ratones.
Se prepararon pequeños liposomas vesiculares unilamelares (93,2 ± 26,4 nm por QELS) a partir de distearoilfosfatidilcolina, colesterol y PEG-DSPE (relación molar 3:2:0,045) mediante hidratación a partir de una solución etanólica concentrada en una solución acuosa de sacarosaoctasulfato de trietilamonio (0,6 M de trietilamonio, pH 5,7-6.2), seguido de extrusión repetida a través de membranas de policarbonato (tamaño de poro de 100 nm), eliminación de la sal polianiónica extraliposomal, y carga con vinorelbina mediante incubación con los liposomas en tampón isoosmótico pH 6,5, proporción fármaco/lípido de 325 mg VRB/mmol fosfolípido, a 60° C como se describe en el Ejemplo 42.
A ratones hembra BALB/c homocigóticos desnudos (6-8 semanas, con un peso de 17-20 g) se les inyectaron por vía subcutánea en la zona del flanco 1x106 células de carcinoma de colon humano HT-29 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). A partir del día 16 después de la inoculación del tumor, cuando el diámetro medio del tumor alcanzó los 5-8 mm, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de seis animales cada uno y se trataron con vinorelbina libre o liposomal a una dosis de 5 mg/kg a través de la vena caudal cada tres días hasta un total de cuatro inyecciones. Para el grupo de control, los ratones fueron tratados con un volumen igual de solución salina. El tamaño del tumor de cada ratón se midió con un calibre y el volumen tumoral se calculó mediante la fórmula (longitud del tumor)x(anchura del tumor)2/2. Para evaluar la toxicidad relacionada con el tratamiento, también se pesó a los animales dos veces por semana. La vinorelbina liposomal demostró ser considerablemente más eficaz para suprimir el crecimiento de los tumores HT-29 que la vinorelbina libre, haciendo que los tumores retrocedieran, mientras que en el grupo del fármaco libre los tumores siempre siguieron creciendo (Figura 28). Apenas hubo cambio en el peso corporal de los animales durante el tratamiento, lo que indica que éste fue bien tolerado y que la liposomalización no aumentó la toxicidad del fármaco (Figura 29).
EJEMPLO 52 Eficacia antitumoral in vivo de la vinorelbina liposomal contra tumores de cáncer de colon murino singénico C-26.
La vinorelbina liposomal y la vinorelbina libre se prepararon como en el Ejemplo 48. A ratones BALB/c macho (6-8 semanas, con un peso de 17-20 g) se les inocularon por vía subcutánea 2x105 células de carcinoma de colon murino C-26. En el día 17 después de la inoculación, cuando el diámetro medio del tumor alcanzó 5-8 mm, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos de tratamiento de cinco animales/grupo. A ratones portadores de tumores se les inyectó a través de la vena caudal vinorelbina libre a 6 mg/kg, 8 mg/kg o 12 mg/kg, y vinorelbina liposomal a 4 mg/kg o 6 mg/kg cada tres días hasta un total de cuatro inyecciones. Para el grupo de control, se inyectó a los ratones el mismo volumen de solución salina normal. Los tamaños de los tumores y los pesos corporales de los animales se siguieron como en el Ejemplo 51. La vinorelbina liposomal, incluso a 4 mg/kg, fue considerablemente más eficaz en la reducción del crecimiento tumoral que el fármaco libre a 12 mg/kg (Figura 30). Los pesos corporales de los animales en el curso del tratamiento mostraron pocos cambios (<10% de disminución), lo que indica que la toxicidad de la vinorelbina liposomal no aumentó en comparación con la del fármaco libre (Figura 31).
EJEMPLO 53 Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal dirigida a HER2 contra tumores xenoinjertados de cáncer de mama humano BT-474 en ratones: efecto del contraión de carga.
Se prepararon liposomas cargados con VRB de 99,5 ± 10,2 nm de tamaño usando el método TEA-Pn del Ejemplo 41 y el método TEA-SOS del Ejemplo 42, respectivamente, excepto que no se añadió [3H]-CHE. La VRB se cargó a una proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol. La vinorelbina liposomal dirigida a HER2 se formó incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE (consultar el Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Se cultivaron xenoinjertos de carcinoma de mama humano que sobreexpresa HER2 BT-474 en ratones desnudos homocigóticos como en el Ejemplo 10. En el día 25 después de la inoculación de las células tumorales, cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 200 mm3 (intervalo 144-309 mm3), los ratones se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos de ocho animales/grupo, y se trataron i.v. con 5 mg/kg de VRB libre, F5-ILs-VRB con Pn como contraión, o F5-ILs-VRB con SOS como contraión, a una dosis de 5 mg/kg semanales durante un total de tres inyecciones. El grupo de control recibió el mismo volumen de solución salina normal. Los tumores y los pesos corporales de los animales se monitorizan como en el Ejemplo 10. La vinorelbina liposomal dirigida a HER2 cargada con octasulfato de sacarosa fue notablemente más eficaz en la reducción del crecimiento tumoral que el mismo constructo dirigido cargado con poli(fosfato), y ambas preparaciones inmunoliposomales fueron considerablemente más eficaces que la vinorelbina libre cuando se administraron a una dosis de 5 mg VRB/kg (Figura 32). Los ratones tratados con el fármaco mostraron escasos cambios de peso, lo que indica que el tratamiento fue bien tolerado (Figura 33).
EJEMPLO 54. Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal dirigida a HER2 contra tumores de xenoinjertos de cáncer de mama humano BT-474 en ratones: efecto de la PEGilación.
Los liposomas de DSPC y colesterol en la proporción molar 3:2 se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 48 por hidratación de la matriz lipídica de DSPC, colesterol y PEG-distearoil glicerol con PEG peso mol. 2.000 (GS-20, NOF Corp, Japón) en una proporción molar 3:2:0,015 ("0,5% de PEG") o 3:2:0,3 ("10% de PEG") usando el método de solución etanólica en un sucroseoctasulfato acuoso de trietilamonio, seguido de extrusión de membrana de acuerdo con el Ejemplo 48. La VRB se cargó en los liposomas en una proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol. La vinorelbina inmunoliposomal F5 se formó incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE (Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Se criaron ratones desnudos con xenoinjertos BT-474 y se trataron i.v. con VRB libre, F5-ILs-VRB-"0,5% de PEG", o F5-ILs-VRB-"10% de PEG" a 5 mg/kg como en el Ejemplo 53. Como se muestra en la Figura 34, F5-ILs-VRB con mayor PEGilación provisto de un derivado lipídico PEG no iónico PEG-DSG fue notablemente más eficaz en la reducción del crecimiento tumoral que F5-ILs-VRB con menor cantidad de PEG-DSG, mientras que ambas preparaciones fueron más activas que el fármaco libre.
EJEMPLO 55 Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal dirigida a EGFR contra tumores de xenoinjertos de cáncer cerebral humano U87 en ratones.
Los liposomas (86,6 ± 12,9 nm de tamaño por QELS) con solución encapsulada de 0,65 M TEA-SOS se prepararon y cargaron con VRB de acuerdo con el Ejemplo 42. La VRB anti-EGFR-inmunoliposomal (C225Fab'-ILs-VRB) se preparó mediante incubación de liposomas VRB con el conjugado PEG-DSPE de fragmentos Fab' de un anticuerpo anti-EGFR como se describe en el Ejemplo 36.
A ratones macho NCRnu/nu(5-6 semanas, con un peso de 17-20 g) se les inyectaron por vía subcutánea en la zona del flanco 1x107 células de glioblastoma humano U87 (ATCC) suspendidas en el medio de crecimiento en un volumen total de 150 pl. Cuando el tumor alcanzó un tamaño medio de 250 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de 10-12 animales. Los ratones fueron tratados con tres inyecciones i.v. semanales de VRB "libre", Ls-VRB no dirigida o C225Fab'-ILs-VRB a una dosis de 5 mg VRB/kg. El grupo de control recibió un volumen igual de solución salina. El tamaño de los tumores y el peso corporal de los animales se controlaron como en el Ejemplo 10. C225-Fab'-ILs-VRB fue notablemente más eficaz en la supresión del crecimiento de tumores de xenoinjerto de cáncer cerebral humano con sobreexpresión de EGFR que la vinorelbina liposomal no dirigida o la vinorelbina libre a una dosis igual (Figura 35).
EJEMPLO 56. Preparación y farmacocinética de la doxorrubicina encapsulada en los liposomas utilizando el método del sulfato de trietilamonio.
Se formaron liposomas con varias composiciones de matriz lipídica (como se indica en la tabla siguiente) como se describe en el Ejemplo 2. El N-Glutaril-DSPE (Glu-DSPE) procedía de Avanti Polar Lipids, AL, USA. Se formó una película lipídica pura a partir de la solución lipídica en cloroformo mediante evaporación rotatoria, se eliminaron trazas volátiles al vacío (90 pm Hg, 2 horas), se hidrató la película lipídica en una solución de sulfato de trietilamonio (TEA-SO<4>) (0,65 N TEA), se sometió a seis ciclos de congelación y descongelación rápidas, y se extruyó a través de dos filtros de policarbonato apilados de 0,1 pm de tamaño de poro diez veces y a través de dos filtros de policarbonato apilados de 0,05 pm de tamaño de poro diez veces. Para la cuantificación de la matriz lipídica en las muestras de sangre, se incluyó [3H]-CHE en la matriz lipídica a 0,5-1,5 mCi/mmol de fosfolípido. Los liposomas con solución de TEA-SO<4>atrapada se cargaron con doxorrubicina de acuerdo con el Ejemplo 2. Los liposomas en solución salina tamponada con HEPES (20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5) se incubaron con clorhidrato de doxorrubicina (proporciones fármaco/fosfolípido de 140-170 mg/mmol) a 60° C durante 45 min, seguido de inactivación en hielo y eliminación de la doxorrubicina no encapsulada mediante cromatografía en gel. La doxorrubicina se analizó por espectrofotometría (Ejemplo 71), y el fosfolípido se analizó por el método de Bartlett (Ejemplo 70). Las propiedades de los liposomas resultantes se resumen en la Tabla 30 a continuación.
T l . Pr i l x rr i in li m l n v ri m i i n li í i .
La farmacocinética sanguínea de estos liposomas que contienen doxorrubicina con una composición lipídica de DSPC/Chol/PEG-DSPE 2,7:2:0,3 se estudió en ratas con una única dosis i.v. de 5 mg de doxorrubicina/kg, como se describe en el Ejemplo 9. Los liposomas circularon durante largo tiempo (semivida de aproximadamente 28 horas) (Figura 36). La proporción estable de doxorrubicina por fosfolípido indicó que la formulación era notablemente estable frente a la filtración del fármaco en la circulación, perdiendo menos del 25 % del fármaco en un periodo de 48 horas.
EJEMPLO 57. Liposomas cargados con doxorrubicina e inmunoliposomas anti-HER2 preparados por el método de sulfato de TEA: preparación y eficacia antitumoral in vivo contra xenoinjertos de cáncer de mama humano que sobreexpresan HER2.
Se prepararon liposomas cargados con doxorrubicina que tenían varias composiciones y propiedades lipídicas (enumeradas en la tabla siguiente) como se describe en el Ejemplo 56. Los inmunoliposomas anti-HER2 cargados con doxorrubicina se prepararon a partir de liposomas cargados con doxorrubicina mediante coincubación con el conjugado anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE (aprox. 30 scFv/liposoma) como se describe en el Ejemplo 19. Se criaron ratones NCRnu/nuportadores del xenoinjerto de tumor de mama humano subcutáneo (BT-474), se trataron (en grupos de 10-12 animales) con doxorrubicina liposomal o inmunoliposomal anti-HER2 a una dosis de 5 mg/kg una vez a la semana durante un total de tres semanas una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 200 mm3, y se monitorizaron la progresión tumoral y el peso corporal de los animales como se describe en el Ejemplo 29. Para las formulaciones liposomales de doxorrubicina no dirigidas, se estudiaron las composiciones lipídicas que no contenían PEG-DSPE, 0,5% en moles de PEG-DSPE o 10% en moles de PEG-DSp E; para la doxorrubicina F5-inmunoliposomal, se estudiaron las formulaciones con 0,5% en moles de PEG-DSPE y 10% en moles de PEG-DSPE (aquí la cantidad de PEG-DSPE se expresa como % en moles de fosfolípido liposomal). Los resultados (Figura 37, Tabla 31) demostraron que todos los tratamientos con doxorrubicina fueron eficaces para retardar el crecimiento tumoral. Sobre la base de los tamaños de los tumores en el día 53 tras la inoculación, las diferencias en la inhibición del crecimiento tumoral entre los tres grupos de liposomas no dirigidos no alcanzaron significancia estadística (ANOVA p=0,081).081), pero la doxorrubicina inmunoliposomal fue significativamente más eficaz que la doxorrubicina liposomal no dirigida (<a>NO<v>Ap=5,5x10-10), siendo la formulación "10%PEG-DSPE" más eficaz que la "0,5%PEG-DSPE" (prueba t de Student, p=0,027). En el grupo "10%PEG-DSPE" F5-ILs, los tumores retrocedieron a 1 mm3 o menos en el 67% de los animales, mientras que en el grupo "0,5%PEG-DSPE" F5-ILs sólo en el 9%. En el grupo de control (tratamiento con solución salina) los tumores superaron el límite de tamaño aceptable del 15% del peso corporal en los días 38-43.
Tabla 31. Estudio de la eficacia antitumoralin vivo dela doxorrubicina liposomal: características de los liposomas y resultados del tratamiento.
EJEMPLO 58 Preparación de vinblastina liposomal y farmacocinética sanguínea de vinblastina liposomal en ratas.
Se prepararon liposomas con solución acuosa TEA-SOS atrapada (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) y tamaño 99,5 ± 10,2 nm (media± DE por QELS) por el método del Ejemplo 11 usando extrusión 2 veces a través de dos membranas apiladas de policarbonato de 0,2 gm y diez veces a través de dos membranas apiladas de policarbonato de 0,08 gm. Se añadió vinblastina (VBL) en forma de sulfato de vinblastina USP a una proporción fármaco-fosfolípido de 150 mg/mmol. El pH de la mezcla fármaco-liposoma se ajustó a 6,5 usando NaOH 1 N, y la mezcla se incubó posteriormente a 60° C durante 30 minutos. A continuación, la reacción se enfrió en hielo durante 15 min y el fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75, eluyendo con 5 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5. Luego los liposomas purificados se analizaron espectrofotométricamente para VBL y para fosfolípidos usando el método de Bartlett, como en los Ejemplos 70 y 71. Se incluyó [3H]-CHE en la formulación en una proporción de 1,5 mCi/mmol de fosfolípido. La vinblastina liposomal tenía 152,4 ± 12,0 mg de VBL/mmol de fosfolípido (encapsulación cuantitativa).
Se estudió la farmacocinética sanguínea de la vinblastina liposomal en ratas Albino hembra (8-9 semanas de edad; 200 g) a una dosis de 5 mg VBL/kg como se describe en el Ejemplo 9. La vinblastina se cuantificó en muestras de plasma sanguíneo como se describe en el Ejemplo 41 (usando vinorelbina como patrón interno). Los liposomas de vinblastina mostraron una buena longevidad en circulación (semivida plasmática del componente lipídico 12,8 ± 0,04 horas) (Figura 38) y muy buena estabilidad frente a la filtración del fármaco de los liposomas, con más del 70% de la carga inicial de vinblastina que permanecía encapsulada después de 24 h (Figura 39). El tiempo posterior a la inyección para lograr la liberación del 50% del fármaco encapsulado fue de 40,6 ± 1,2 horas.
EJEMPLO 59 Preparación de liposomas cargados con vincristina usando el método TEA-SOS y efecto del pH sobre la eficacia de carga.
Se prepararon liposomas con un tamaño de 86,6 ± 12,9 nm (por QELS), composición lipídica de DSPC/Chol/PEG-DSPE en la proporción molar de 3:2:0,015 y solución acuosa TEA-SOS atrapada (0,65 M TEA, pH 5,4, osmolalidad 521 mmol/kg) por el método del Ejemplo 11 usando un paso de extrusión de 15 pases a través de dos membranas de policarbonato apiladas de 0,08 gm de tamaño de poro. Se añadió vincristina (VCR) a los liposomas en tampón acuoso HEPES-Na 5 mM, 5% de dextrosa, pH 6.5, como sulfato de vincristina en una proporción de fármaco a fosfolípido de 350 gg de vincristina/gmol de fosfolípido, se ajustó el pH a la proporción indicada usando NaOH 1 N, se incubó la mezcla a 60° C durante 30 min, se enfrió en hielo durante 15 min y los liposomas se separaron del fármaco no encapsulado usando cromatografía de filtración en gel Sephadex G-75, eluyendo con HBS-6.5 (20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5). Los liposomas purificados se analizaron luego para vincristina por espectrofotometría usando absorbancia a 265 nm después de solubilización en isopropanol ácido, y para el contenido de fosfolípidos usando el ensayo de fosfato de Bartlett (1959).
Los resultados se muestran en la Tabla 32. La carga del fármaco fue superior al 90% en el intervalo de pH 4,5-7,5, y prácticamente cuantitativa a pH 5,0-7,5. A pH 3,5, que es el pH observado en la mezcla liposomal tras la adición del fármaco, pero sin ajuste de pH, la carga fue considerablemente inferior.
T l 2. D n n i l H l r vin ri in n li m n TEA- r .
EJEMPLO 60. Preparación de liposomas cargados con vincristina usando el método TEA-SOS: efecto de la proporción fármaco/lípido sobre la eficacia de carga.
Se prepararon liposomas que contenían SOS-TEA como en el Ejemplo 59 y se cargaron con sulfato de vincristina a una proporción fármaco-fosfolípido de 150-550 gg de vincristina/pmol de fosfolípido a pH 6,5 de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 59. A continuación, se analizaron los liposomas purificados del fármaco no encapsulado para determinar la VCR por espectrofotometría y el fosfolípido del liposoma mediante el ensayo de Bartlett (1959). La eficacia de carga del fármaco fue superior al 90% en todo el intervalo estudiado de proporciones fármaco/lípido, y fue prácticamente cuantitativa entre 150-450 gg de vincristina/pmol de fosfolípido (Tabla 33).
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EJEMPLO 61. Preparación de vincristina inmunoliposomal y citotoxicidad de la vincristina liposomal e inmunoliposomal contra células cancerosas in vitro.
La vincristina liposomal (Ls-VCR) se preparó como se describe en el Ejemplo 59 usando una proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol. La vincristina F5-inmunoliposomal específica de HER2 (F5-ILs-VCR) se preparó a partir de la vincristina liposomal mediante coincubación con el conjugado anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE como se describe en el Ejemplo 19. La solución de vincristina "libre" (VCR) se preparó por dilución de sulfato de vincristina USP en agua, seguido de filtración estéril. La citotoxicidad de VCR, Ls-VCR y F5-ILs-VCR contra células de carcinoma de mama humano SKBr-3 (ATCC) que sobreexpresan HER2 se determinó mediante un ensayo de viabilidad celular basado en MTT usando el procedimiento del Ejemplo 27, en donde las células se inocularon en placas de microtitulación de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo, se aclimataron durante la noche y se incubaron con el medio que contenía el fármaco durante 4 horas, seguido de una postincubación en un medio libre de fármaco durante 3 días. Los resultados se muestran en la Figura 40. La IC<50>fue de 75 ng/ml para VCR libre, 11 ng/ml para F5-ILs-VCR y 3 pg/ml para Ls-VCR. La vincristina liposomal dirigida preparada fue 6,8 veces más activa que el fármaco libre, y 273 veces más activa que el fármaco liposomal no dirigido, lo que demuestra una mejora sustancial de la actividad anticancerosa en función de la administración del fármaco específico de las células.
EJEMPLO 62 Farmacocinética sanguínea de Ls-VCR en ratas.
Los liposomas con solución SOS-TEA atrapada (0,65 M TEA, pH 5,8, osmolalidad 530 mmol/kg), y composición lipídica de DSPC/Chol/PEG-DSPE (relación molar 3:2:0,015), que también contenían [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido, se prepararon usando el método del Ejemplo 11 usando un paso de extrusión de 10 pases a través de dos membranas de policarbonato apiladas con un tamaño de poro de 80 nm o 100 nm. Los liposomas se cargaron con VCR a pH 6,5, proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol, como se describe en el Ejemplo 59. Los liposomas cargados con VCR se administraron i.v. a ratas Albino hembra (180-220 g) a una dosis de 5 mg VCR/kg, y se estudió la farmacocinética sanguínea del fármaco y del lípido liposomal como se describe en el Ejemplo 9. La cantidad de VCR en las muestras de sangre se cuantificó por HPLC como se describe en el Ejemplo 41, excepto que la relación de volumen de acetato de trietilamonio acuoso (pH 5,5) y acetonitrilo en la fase móvil fue de 65:35. El tiempo de retención típico para la VCR se determinó por HPLC. El tiempo de retención típico para VCR fue de 8,8 min. Los resultados se muestran en la Figura 41 y en la Tabla 34. Ambas preparaciones tuvieron una amplia longevidad en circulación (semividas en sangre de 12-17 horas). La vincristina liposomal fue notablemente estable frente a la filtración del fármaco en ambas preparaciones (tiempo de liberación media superior a 120 horas) (Figura 42).
Tabla 34. Características de los liposomas cargados con vincristina a 350 mg/mmol de fosfolípido usando el método TEA-SOS.
EJEMPLO 63. Farmacocinética sanguínea de Ls-VCR en ratas a varias proporcionrd fármaco/lípido.
Los liposomas con solución SOS-TEA atrapada (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalidad 485 mmol/kg), y composición lipídica de DSPC/Chol/PEG-DSPE (relación molar 3:2:0,015) que también contenían [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolípido se prepararon por el método del Ejemplo 11 usando un paso de extrusión de 10 pases a través de dos membranas de policarbonato apiladas con un tamaño de poro de 50 nm u 80 nm. Los liposomas se cargaron con VCR a pH 6,5 como se describe en el Ejemplo 59 añadiendo una solución acuosa madre de sulfato de VCR de 20 mg/ml a las proporciones calculadas de fármaco/lípido de 100, 200 o 350 mg/mmol de fosfolípido. La eficiencia de la carga del fármaco fue superior al 96% para todas las preparaciones. Los liposomas cargados con VCR se administraron i.v. a ratas albinas hembra (8-9 semanas de edad, 190-220 g) a una dosis de 5 mg VCR/kg, y se estudió la farmacocinética sanguínea del fármaco y del lípido liposomal como se describe en el Ejemplo 62. Los resultados se muestran en la Tabla 35. La vincristina liposomal tuvo una buena longevidad en circulación (semivida en sangre del fármaco de aproximadamente 20-30 horas) y fue excepcionalmente estable en todos los tamaños y proporciones fármaco-lípido estudiados (semivida de liberación del fármaco superior a 93 horas).
Tabla 35. Características de los liposomas cargados con vincristina usando el método TEA-SOS a distintas
EJEMPLO 64. Preparación de vincristina liposomal dirigida a HER2 y eficacia antitumoral de vincristina liposomal no dirigida y dirigida a HER2 contra xenoinjertos de cáncer de mama humano que sobreexpresan HER2 en ratones.
Se prepararon liposomas cargados con vincristina (Ls-VCR-SOS) usando el método TEA-SOS de acuerdo con el Ejemplo 63 (con omisión del componente [3H]-CHE) usando extrusión de membrana de 50 nm de tamaño de poro y carga de fármaco a una proporción fármaco/fosfolípido de 100 mg/mmol. Se formó vincristina inmunoliposomal F5 (F5-ILs-VCR) incubando Ls-VCR-SOS con conjugado anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE (Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Los liposomas cargados con vincristina usando TEA-citrato (Ls-VCR-Cit) se prepararon de manera similar a los liposomas Ls-VCR-SOS, excepto que la solución de citrato de trietilamonio (preparada titulando ácido cítrico acuoso con trietilamina pura a pH 5,1 y ajustando la concentración a 0,65 M de trietilamina) se sustituyó por la solución de TEA-SOS. El diseño del estudio de tratamiento siguió el método del Ejemplo 10. Se cultivaron tumores xenoinjertados subcutáneos de carcinoma de mama humano BT-474 en ratones desnudos, y cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 250 mm3 (intervalo144-309 mm3) los ratones en los grupos de ocho a nueve, se trataron con VCR libre, Ls-VCR, o F5-ILs-VCR a una dosis i.v. semanal de 2 mg VCR/kg durante un total de tres semanas, comenzando el día 19 después de la inoculación del tumor. Los tamaños de los tumores y los pesos corporales de los animales se monitorizaron como se describe en el Ejemplo 10. Para el grupo de control, se trató a los ratones con un volumen igual de solución salina. Las diferencias en el tamaño de los tumores entre los grupos de tratamiento se evaluaron estadísticamente en el día 63 después de la inoculación del tumor mediante la prueba de Mann-Whitney. En la Figura 43 se muestra la dinámica del tamaño medio de los tumores en los grupos. F5-ILs-VCR demostró la máxima eficacia en comparación con Ls-VCR o VCR libre, provocando en el día 63 regresiones tumorales completas en seis de ocho animales (75%). Ls-VCR-Cit también fue eficaz, provocando regresiones tumorales completas aún observadas en el día 63 en dos de nueve animales (22%), sin embargo, fue menos eficaz que F5-ILs-VCR (p<0,005). Ls-VCR-SOS y VCR libre fueron igualmente eficaces (p>0,2) y menos eficaces que F5-ILs-VCR o Ls-VCR-Cit. Por tanto, sorprendentemente, con la administración dirigida a células, un fármaco liposomal encapsulado usando un anión polivalente demostró ser más eficaz que el fármaco liposomal encapsulado mediante un anión no enlazante. La dinámica del peso corporal de los animales mostró que todas las preparaciones liposomales de VCR eran menos tóxicas que la VCR libre, provocando menos pérdida de peso corporal durante el tratamiento (Figura 44).
EJEMPLO 65. Preparación de vincristina liposomal dirigida a EGFR y eficacia antitumoral de vincristina liposomal no dirigida y dirigida a EGFR contra xenoinjertos de cáncer cerebral humano que sobreexpresan EGFR en ratones.
Los liposomas cargados con vincristina (Ls-VCR) se prepararon usando el método TEA-SOS como en el Ejemplo 64. La vincristina inmunoliposomal dirigida al EGFR se preparó mediante coincubación de los liposomas con el conjugado anti-HER2 Fab' C225Fab-PEG-DSPE como se describe en el Ejemplo 36.
Se inyectaron a ratones NCRnu/numachs (de 5-6 semanas de edad y 17-20 g de peso) por vía subcutánea en la zona del costado 0,15 ml del medio de crecimiento celular que contenía 1x107 células de glioblastoma humano U87 que expresaban de manera estable el receptor del factor de crecimiento epidérmico (HERI) mutante EGFRvIII. En el día 11, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó 300-400 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de 10-12 animales/grupo. Se administraron tratamientos con VCR libre (sulfato de vincristina 1 mg/ml en solución salina), Ls-VCR o C225Fab-ILs-VCR a dosis i.v. de 1,5 mg/kg los días 11, 18 y 25 después de la inoculación del tumor. A los ratones del grupo de control se les inyectó de manera similar un volumen igual de solución salina normal. Se controló el tamaño de los tumores y el peso corporal de los ratones como en el Ejemplo 10. Los resultados se muestran en la Figura 45. Los resultados se muestran en la Figura 45. Todos los animales tratados con formulaciones VCR mostraron un retraso del crecimiento tumoral en comparación con los animales de control. No hubo diferencias significativas entre los grupos tratados con VCR libre y Ls-VCR. La C225Fab-ILs-VCR dirigida al EGFR fue más eficaz que la VCR liposomal libre o no dirigida.
EJEMPLO 66. Preparación de liposomas con solución de hexafosfato de inositol trietilamonio (TEA-IHP) atrapada.
Un poliol polianionizado, la sal dodecasódica de hexafosfato de inositol (IHP), se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). Se preparó una solución acuosa que contenía 0,65 M de trietilamonio y 0,681 M de grupos fosfato, pH 6,5 y osmolalidad de 718 mmol/kg, mediante intercambio iónico en la resina de poliestireno sulfonado reticulado Dowex 50Wx8-200, seguido de titulación con TEA pura y dilución con agua de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4. El contenido de sodio residual fue menor del 1 % de la suma de cationes. Los lípidos secos (150 pmol DSPC, 100 pmol Chol, 0,75 pmol PEG-DSPE) se disolvieron en 0,5 ml de etanol 100% USP a 60° C y se mezclaron con 4,5 ml de solución de hexafosfato de inositol trietilamonio precalentada a la misma temperatura. El etanol se eliminó parcialmente por evaporación rotatoria a 30-40 mm Hg y 40-45° C hasta que la mezcla no mostró burbujeo. Luego, la suspensión lipídica se extruyó a 60-65° C 15 veces a través de dos membranas de policarbonato apiladas de 0,1 pm de tamaño de poro. Los liposomas resultantes tenían un tamaño de 104,3 ± 39,0 nm por QELS. El IHP de trietilamonio no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en gel en una columna Sepharose 4B, eluyendo con tampón HEPES-Na 5 mM, 5% de dextrosa, pH 6,5, y los liposomas se cuantificaron mediante concentración de fosfolípidos usando el método de Bartlett con extracción de acuerdo con el Ejemplo 70.
EJEMPLO 67. Carga de fármacos en liposomas con solución de TEA-IHP atrapada.
Los liposomas del Ejemplo 67 se cargaron con CPT 11 o vinorelbina La vinorelbina se cargó a una proporción fármaco-fosfolípido de 175 o 350 g/mol, y el CPT 11 a una proporción de 250 o 500 g/mol. Los fármacos se añadieron a los liposomas en el tampón HEPES-dextrosa (Ejemplo 67) en las proporciones fármaco/fosfolípido de entrada, indicadas a continuación (consultar la Tabla 36). En caso necesario, se ajustó el pH a 6,5-6,8 usando NaOH 1 N. Las mezclas se incubaron a 60° C durante 30 min, se enfriaron en hielo durante 15 min y se cromatografiaron en una columna de filtración en gel Sephadex G-25, eluida con 5 mM HEPES-Na, 145 mM NaCl, pH 6,5. Se solubilizaron alícuotas de los liposomas purificados en metanol acidificado y se analizaron por espectrofotometría (Ejemplo 71). El fosfolípido se cuantificó por el método de Bartlett (1959) con extracción (Ejemplo 70). Ambos fármacos se cargaron cuantitativamente (es decir, prácticamente al 100%) en los liposomas, como se muestra a continuación en la Tabla 36.
T l . Pr i l f rm r n li m n h x f f in i l r .
EJEMPLO 68. Estabilidad química de CPT-11 libre o liposomal en presencia de plasma de ratón in vitro.
En el organismo, el CPT-11, que es un profármaco, experimenta una transformación química para formar un metabolito activo del fármaco conocido como SN-38. Tanto el SN-38 como el CPT-11 también se transforman a partir de sus formas lactonas activas en productos inactivos conocidos como carboxilatos de SN-38 o CPT-11. En este Ejemplo se estudió el efecto de la liposomalización de CPT-11 de acuerdo con la presente invención sobre la conversión química de CPT-11 en estos productos en presencia de plasma sanguíneo. Se prepararon liposomas con sacarosaoctasulfato de trietilamonio atrapado (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 485 mmol/kg) y composición lipídica de DSPC, colesterol y PEG-DSPE en una proporción molar de 3:2:0,015 de acuerdo con el Ejemplo 11, usando extrusión diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 0,08 pm. Los liposomas tenían un tamaño de 87,4 ± 19,2 nm por QELS. El CPT-11 se cargó a aproximadamente 500 mg de CPT-11 base/mmol de fosfolípido liposomal mediante incubación en una solución acuosa de 5 mM de HEPES-Na, 5% de dextrosa, pH 6,5, a 60° C durante 30 min, seguido de inactivación en hielo durante 15 min. Luego, los liposomas cargados con CPT-11 se purificaron en una columna Sephadex G-75 eluida con solución salina tamponada con HEPES (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH 6,5). Los liposomas CPT-11 resultantes tenían 536,5 ± 20,1 mg de CPT-11/mmol de fosfolípido. La solución de CPT-11 libre se preparó disolviendo clorhidrato de irinotecán USP recién preparado a 1 mg/ml en NaCl acuoso 144 mM, acidificado a pH 3 con HCl diluido. Se mezclaron alícuotas de 10 pl de CPT-11 libre o liposomal con 90 pl de plasma de ratón estabilizado con heparina (Harlan Bioproducts, USA) y se incubaron a 37° C en un baño de agua con agitación. En un momento dado, las muestras de liposomas, por triplicado, se cromatografiaron en columnas de exclusión por tamaño Sepharose CL-4B (2 ml de volumen de lecho) eluidas con HBS-6,5, y las fracciones que contenían el fármaco se detectaron por fluorescencia. Se recogieron el primer (volumen vacío) y el segundo (arrastre) picos que contenían fármaco y se consideraron las fracciones de fármaco encapsulado liposomalmente y liberado. Las muestras se extrajeron con 400 pl de metanol enfriado con hielo mediante agitación en vórtice durante 10 s seguido de centrifugación a 14.100xg durante 5 min. Los sobrenadantes se analizaron para CPT-11 y sus productos de conversión por HPLC usando la modificación de un método de Warner y Burke, J Chromatogr., Ser. B Biomed. Sci. Appl. 1997, vol. 691, p.161-71. La fase móvil consistió en acetato de trietilamonio al 3% pH 5,5 (solución A) y acetonitrilo (solución B) suministrados a 1,0 ml/min en un gradiente lineal de 20% de vol. de B a 50% de vol. de B en 14 min. Los productos eluidos se detectaron por fluorescencia con excitación a 375 nm y emisión a 500 nm. Los tiempos de retención fueron de 5,3 min (carboxilato de CPT-11), 6,8 min (carboxilato de s N-38), 9,3 min (CPT-11) y 11,0 min (SN-38). Los resultados (Tabla 37) indicaron que mientras que el CPT-11 libre y el CPT-11 liberado de los liposomas experimentaron conversión, el CPT-11 intraliposomal fue bastante estable.
Ta l 7. nv r i n PT-11 li r li m l n N- f rm r xil n l m r nin vitro.
EJEMPLO 69. Estabilidad química in vivo de CPT-11 libre o liposomal en ratas.
El CPT-11 liposomal se preparó como en el Ejemplo 68 usando sacarosaoctasulfato de trietilamonio con 0,65 M de TEA, pH 6,4 y osmolalidad de 502 mmol/kg. El tamaño del liposoma fue de 98,5 ± 18,4 nm, y la encapsulación de CPT-11 fue de 510,1 ± 16,5 mg de CPT-11/mmol de fosfolípido. El CPT-11 liposomal y libre se administró por vía intravenosa en dosis de 25 mg/kg a ratas albinas hembra (180-220 g) con catéteres venosos centrales permanentes, y se extrajeron muestras de sangre a intervalos durante 48 horas. Las muestras de sangre se mezclaron con PBS enfriado con hielo que contenía un 0,04% de EDTA y se centrifugaron rápidamente para eliminar las células sanguíneas. Se analizaron alícuotas de los fluidos sobrenadantes para CPT-11, SN-38, y sus formas de carboxilato por HPLC como en el Ejemplo 68 anterior. Los resultados se muestran en las Figuras 46 y 47. Mientras que el CPT-11 libre se depuró muy rápidamente, siendo indetectable después de 30 min, el CPT-11 liposomal fue persistente en la circulación (t<1/2>15,2 horas) con un 37,8 % del fármaco en la sangre a las 24 h, y aproximadamente un 10% del fármaco todavía en la circulación después de 48 h. No hubo conversión detectable de la forma liposomal de CPT-11 a SN-38 ni a la forma de carboxilato de CPT-11. El CPT-11 libre, es decir, el CPT-11 liposomal, se eliminó muy rápidamente, siendo indetectable después de 30 min. El CPT-11 libre, es decir, administrado en forma de solución, se eliminó de la circulación con bastante rapidez (semivida de aproximadamente 16 minutos), y se produjo una conversión apreciable a la forma de carboxilato del fármaco.
EJEMPLO 70. Cuantificación del fosfolípido liposomal.
Digestión de ácidos modificada-método del fosfomolibdato azul I.Este método se ha modificado según Bartlett (1959). Se colocan alícuotas de 10-20 ml de liposomas en tubos de vidrio resistentes al calor, se digieren calentándolas con 0,5 ml de ácido sulfúrico 10 N durante 2 horas a 110-130° C, se mineralizan mediante la adición de 50 ml de peróxido de hidrógeno al 9% y se calientan durante 30 minutos adicionales hasta que no se detecta peróxido de hidrógeno mediante una tira de papel indicador. Las muestras digeridas a temperatura ambiente se diluyen con 1 ml de molibdato de amonio acuoso al 0,2%, se mezclan con 0,1 ml de ácido ascórbico acuoso al 5% y se incuban en un baño de agua hirviendo durante 10 min. La absorbancia del complejo fosfomolibdato reducido se mide a 800 nm y se compara con una curva patrón elaborada simultáneamente usando soluciones patrón de fosfato inorgánico.
Digestión de ácidos modificada-método del fosfomolibdato azul II.Este método es una modificación del método de Morrison (1964). Se mezclan alícuotas de 5 pl de liposomas con 1-10 mM de fosfolípido con 60 pl de ácido sulfúrico concentrado y 10 pl de peróxido de hidrógeno al 30% en tubos de vidrio resistentes al calor. Las mezclas se calientan a 200-220° C durante 10 min, se diluyen con 0,7 pl de agua desionizada, se mezclan con 10 pl de sulfito sódico acuoso al 10%, se incuban en un baño de agua hirviendo durante 5 min y se enfrían a temperatura ambiente. Se añaden 200 pl de molibdato amónico acuoso al 2% y 10 pl de ácido ascórbico acuoso al 10%, y las muestras se incuban en un baño de agua hirviendo durante 10 min. Las muestras se enfrían rápidamente a temperatura ambiente y se determina la absorbancia del complejo fosfomolibdato reducido a 825 nm frente a la muestra en blanco. La cantidad de fosfolípido se determina a partir de la curva patrón obtenida en la misma serie usando soluciones patrón con 2, 4, 6, 8 y 10 mM de dihidrógeno fosfato potásico.
Método de extracción.Se extraen 3 veces alícuotas de 25-100 pl de liposomas con porciones de 200 pl de una mezcla de metanol y cloroformo (1:2 en volumen). Las fases orgánicas se combinan en un tubo de vidrio resistente al calor y los solventes se eliminan al vacío. Los residuos se tratan con ácido sulfúrico 10N y se analizan para determinar la presencia de fósforo de acuerdo con el método I anterior.
A menos que se indique lo contrario, los datos analíticos se presentan como la media ± error estándar de series por triplicado.
EJEMPLO 71. Cuantificación de fármacos en los liposomas.
Cuantificación espectrofotométrica.Se mezclan alícuotas de liposomas (10-50 pl) con 1 ml de isopropanol acuoso al 70% en vol. que contiene HCl 0,075-0,1 N, y se mide la absorbancia frente a la muestra en blanco a las siguientes longitudes de onda: doxorrubicina, 485 nm; CPT-11 y Topotecán, 372 nm; elipticinas, 306 nm, vinorelbina, 270 nm; vincristina y vinblastina, 265 nm. La cantidad de fármaco se determina por comparación con una curva estándar realizada simultáneamente.
Cuantificación fluorométrica.Las alícuotas de las muestras que contienen liposomas (por ejemplo, plasma sanguíneo) se diluyen con isopropanol acidificado (alícuotas de 0,02-0,1 ml: 1 ml de isopropanol al 70%-0,075 N HCl; alícuotas >0,1 ml: 90% de isopropanol-0,1 N HCl a 1 ml). Si se produce precipitación de proteínas, las muestras se incuban en hielo 1-2 horas y se clarifican por centrifugación 10 min a 12.100xg. La fluorescencia de los sobrenadantes se mide en las siguientes longitudes de onda: CPT-11, excitación 370 nm, emisión 423-425 nm; Topotecán, excitación 380-385 nm, excitación 520-525 nm; ellipticinas, excitación 306 nm, emisión 520 nm. La cantidad de fármaco se calcula a partir de curvas estándar ejecutadas simultáneamente tras sustraer la fluorescencia del blanco.
EJEMPLO 72. Efecto de los lipopolímeros en la eficacia de carga de vinorelbina en liposomas.
Los liposomas compuestos de DSPC 200 partes molares, colesterol 133 partes molares y lípidos derivados de poli(etilenglicol)(peso mol. 2.000) PEG-DSPE (1-20 partes molares) o PEG-DSG (20 partes molares), y que contenían una solución encapsulada de TEA-SOS 0,65 M, se prepararon de acuerdo con el método del Ejemplo 11, usando una membrana de 80 nm de tamaño de poro para el paso de extrusión. Los liposomas se cargaron con vinorelbina en la proporción fármaco/fosfolípido de 350 mg/mmol y se purificaron a partir del fármaco no encapsulado de acuerdo con el método del Ejemplo 40. Se analizó el contenido de fármaco y lípidos de los liposomas como se describe en los Ejemplos 70, 71, y el tamaño del liposoma mediante QELS usando la aproximación gaussiana ponderada por volumen. Los resultados (Tabla 38) indicaron que mientras que el derivado de PEG aniónico, PEG-DSPE, en la cantidad de más del 1% en moles del fosfolípido del liposoma (0,3% en moles del lípido total), tuvo un efecto negativo sobre la eficacia de carga del fármaco, el derivado neutro, PEG-DSG, sorprendentemente, no afectó a la eficacia de carga incluso al 9,1% en moles del fosfolípido del liposoma (5,7% en moles del lípido total).
Tabla 38. Propiedades de los liposomas de vinorelbina preparados por el método TEA-SOS con varias cantidades de derivados de PEG-lí ido.
EJEMPLO 73. Efecto del agente de atrapamiento de fármacos intraliposomal sobre la longevidad sanguínea del CPT-11 en ratones.
Se prepararon liposomas con soluciones 0,65 N atrapadas de sales de trietilamonio (TEA) o trietanolamonio (TEOA) de hexafosfato de inositol (IHP, ácido fítico) u octasulfato de sacarosa y se cargaron con CPT-11 a 500 g/mol de fosfolípido siguiendo el procedimiento general del Ejemplo 66. Se administraron por vía intravenosa a ratones Swiss-Webster en dosis de 5 mg de CPT-11/kg de peso corporal. Los liosomas se administraron por vía intravenosa a ratones Swiss-Webster en la dosis de 5 mg de CPT-11/kg de peso corporal. Veinticuatro horas después, se anestesió a los ratones y se desangraron mediante punción a corazón abierto. Se recogió la sangre, se analizó el contenido de CPT-11 en el plasma sanguíneo mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 68, y la cantidad de fármaco se expresó como % de la dosis inyectada que quedaba en la sangre (%ID). TEOA-IHP fue menos eficaz para mejorar la longevidad del fármaco en sangre que TEA-IHP, TEOA-SOAS y TEA-SOS (Tabla 39).
Tabla 39. Remanencia de CPT-11 en la sangre 24 horas después de la administración intravenosa de liposomas CPT-11 en ratones.
EJEMPLO 74. Carga de fármaco en liposomas que contienen octasulfato de sacarosa dietilamino 1,05 N
Se preparó una solución acuosa de octasulfato de sacarosa de dietilamonio 1,05 N (DEA-SOS) pH 6,0, osmolaridad 727 mmol/kg, usando el método de intercambio iónico/titulación del Ejemplo 6 usando dietilamina pura (99,5% de pureza). La matriz lipídica de 3 partes molares de DSPC, 2 partes molares de colesterol y 0,015 partes molares de PEG2000-DSPE, se formuló en liposomas (tamaño medio ponderado en volumen de 92,4 nm) en presencia de la solución DEA-SOS, y el CPT-11 se cargó en los liposomas como varias proporciones de entrada de fármaco/lípido usando el método del Ejemplo 11. El fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en gel, y se determinó la cantidad de fármaco encapsulado por unidad de lípido (proporción de salida fármaco/lípido). La eficacia de la encapsulación se calculó como % de la proporción de salida fármaco/lípido con respecto a la proporción de entrada. Los resultados se muestran en la Tabla 40. La carga alcanzó su nivel máximo de aproximadamente 1,76 mol de fármaco por mol de fosfolípido (1,67-1,70 mol de fármaco/g de lípido total), lo que concuerda bien con la cantidad (1,78 mol de dietilamonio/mol de fosfolípido) sobre la base del contenido de dietilamonio de los liposomas, suponiendo un intercambio estequiométrico de iones de dietilamonio intraliposomal por las moléculas de fármaco y un volumen intraliposomal atrapado estimado de aproximadamente 1,7 l/mol de fosfolípido.
Ta l 4. r PT-11 n li m D P h lPE -D PE ni n n 1 N DEA- S.
A menos que se indique lo contrario, los datos analíticos se presentan como la media ± error estándar de series por triplicado. Los datos farmacocinéticos en plasma de rata son la media ± error estándar de series por duplicado.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende
una composición que comprende un liposoma en un medio, en donde el liposoma comprende 1,2-distearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi poli(etilenglicol)oxicarbonil)-1,2-distearoil-fosfatidil etanolamina en la proporción molar 3:2:0,015, y atrapados dentro del liposoma hay irinotecán y octasulfato de sacarosa; y un portador farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica se prepara como un inyectable.
3. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en dond la N-(omega-metoxipoli(etilenglicol)oxicarbonil)-1,2-destearoioilfosfatidiletanolamina es N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol) (peso molecular 2000)-oxicarbonil)-1,2-destearoioilfosfatidiletanolamina.
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