TWI359029B - Liposomes useful for drug delivery - Google Patents

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TWI359029B TW094114317A TW94114317A TWI359029B TW I359029 B TWI359029 B TW I359029B TW 094114317 A TW094114317 A TW 094114317A TW 94114317 A TW94114317 A TW 94114317A TW I359029 B TWI359029 B TW I359029B
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Keelung Hong
Daryl C Drummond
Dmitri B Kirpotin
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Hermes Biosciences Inc
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Description

1359029 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明通常係關於脂質體之領域，且更特定而言，係關 於可用來遞送治療劑或顯影實體的脂質體組合物。 【先前技術】 脂質體，或脂質雙層囊泡’已經用來或打算用在研究、 工業和醫學的各種應用上，特別是用來作為活體内之診斷 或治療化合物的載劑。參見，例如：Lasic，D. Liposomes: from physics to applications. Elsevier, Amsterdam, 1993.
Lasic，D ’ 和 Papahadjopoulos，D.，編輯 Medical Applications of Lip〇s〇mes. Elsevier，Amsterdam，1998。脂質體之特徵 通常為具有内部的空間，藉著一或多個雙層的臈與外側的 介質隔開’形成顯微袋或囊泡。脂質體之雙層膜通常是由 脂質形成，即合成或天然來源的兩親分子，其在空間上包 括分開的親水性和忌水性功能部位。參見Lasie d·，1993在 月1J °亦可藉著兩親聚合物和界面活性劑（聚合物體 (P〇lymerosomes)、大泡囊（ni〇s〇mes))形成脂質體的雙層 膜°脂質體通常擔任實體的載劑，如但不限於化學化合 物、化合物的組合、合成或天然來源的超分子複合物、遺 傳物質、活生物、其一部分或其衍生物，其能夠具有有效 的特性或發揮有用的活性。為了該目的，製備脂質體，使 其在脂質體-倂入形式中含有想要的實體。通常將把想要 實體併入脂質體内的過程稱為”裝載，^倂入脂質體的實體 可完全或部分地位在脂質體的内部空間、在脂質體的雙層 93060.doc 膜内，或與脂質體膜的外側表面結合。將實體倂入脂質體 内亦可稱為包膠或陷入，而在本文中可交替使用這三個具 有相同意義的名詞。實體之脂質體包膠的意圖，通常是保 護該實體免於有害的環境，同時提供了被包膠之實體主要 在這類活性是有利的地方或環境中，而不在這類活性可能 /又用或不想要的其他地方，發揮其活性的機會。將該現象 稱為遞送。例如，可保護在脂質體中的藥物免於在體内被 酵素破壞，但在疾病之處從脂質體中釋放出來並提供治 療。 在理想上’可（i)以高裝載效率，即相對於包膠過程採用 的里’較高百分比的包膠實體；（ii)每單位脂質體雙層材 料車父N里的包膠實體；（in)以較高濃度的包膠實體，以及 (iv)以穩定的形式’即在儲存時或通常在脂質體出現在預 期陷入脂質體中之實體將發揮其預定活性的地方或環境之 則，幾乎沒有包膠實體的釋放（漏出），來製備含有想要化 合物的這類脂質體。 因此’在此項技藝中，需要提供可用來遞送各種化合 物’尤其是治療、診斷或顯影實體的各種脂質體組合物。 【發明内容】 本發明是以發現可用來裝載實體並將其維持在脂質體内 的經取代之銨和多聚陰離子為基礎。因此，本發明提供用 來遞送各種實體’尤其是治療實體的方法和脂質體組合 物，也就是用在活生物，例如人類、植物或動物中診斷、 預後、測試、篩選、治療或預防不想要的狀況，例如疾病 93060.doc 1359029 的實體。 在-個具體實施例中’本發明提供在介質中包括脂質體 的組合物，其中該脂質體的内部含有經取代之銨
Rt~^-r2 (I) % 其中、R2、R3和R4分別為氫或有機基團，總括而言，具 有總計高違18個碳原子，其中至少一個心、&、心和心是 有機基®，其中該有機基團㈣為具有高達8個碳原子的 碳氫化合物基團’且為烷基、伸烷基、雜環烷基、環烷 基、芳基、烯基或環烯基基團，或其羥基_取代之衍生 物，在其碳氫化合物鏈中可視需要包含s、〇或N原子，形 成醚、酯、硫醚、胺或醯胺鍵結，其中至少三個R丨、R2、 R3和R4是有機基團，或經取代之銨是位阻的銨，像是例如 至少一個有機基團具有直接與銨氮原子連接的二級或三級 碳原子。 在其他的具體實施例中，本發明提供包括在介質中之脂 質體的組合物，其中該脂質體的内部空間含有多聚陰離 子且其中該多聚陰離子是多陰離子化之多元醇或多陰離 子化的糖。該脂質體最好含有穿透膜梯度，能夠有效地裝 載貫體至脂質體内。該脂質體可視需要含有陷入之實體， 例如治療劑、可檢測標記或整體的陽離子有機分子。 在另—個具體實施例中，由本發明提供的組合物更包括 i膠在本發明之脂質體中的實體。該實體最好被包膠在脂 貝體的内部空間中。例如，脂質體的内部空間更包括抗- 93060.doc 1359029 秦，物的治療劑’且其中該組合物對個體的毒性程度，至 少等於或低於並非以組合物方式將該抗·贅生物治療劑投 與個體的毒性程度。 在另-個具體實施財，由本發明提供的組合物是包括 喜樹鹼化合物的脂質體組合物。該組合物具有比以類似但 缺少組合物之方式投與的喜樹鹼化合物高至少兩倍、四倍 或10倍的抗癌症活性，且該組合物的毒性未超過，且比以 類似但缺少組合物之方式投與的喜樹鹼化合物之毒性低至 乂兩倍，或至少四倍。在一個具體實施例中，喜樹驗化合 物是前藥’並在脂質體中，每1毫克脂質體臈材料，例如 脂質’含有至少(M毫克、〇·2毫克、〇3毫克或〇 5毫克。包 /在月曰質體中的吾樹鹼化合物，f質上最好是在脂質體的 内部空間。在一個案例+，喜樹鹼化合物是伊立替康 (irinotecan)(CPT-l 1) 〇 从在另一個具體實施<列巾，由纟發明提供的組合物是長春 f生物驗或其魅物的脂質體組合物。在活體内暴露在喷 礼動物的广液下24小時之後，在脂質體中的組合物昇有 】時藥物留，具有原始藥物裝載的至少50%、至少 6〇%Μ少7Q%。包膠在脂f體中的長春花生物驗或其衍 生物二貫：上最好是在脂質體的内部空間内。哺乳動物的 貫彳是大％。代表性的長春花生物鹼及衍生物是長春 新驗、長春花鹼和長春瑞賓（vin〇relMne)。 在另一個具體實施例中，本發明提供將實體包膠至脂質 體内的方法。該方法包括使本發明之脂f體與該實體接 93060.doc 1359029 觸，例如治療或可檢測實體。最好是在本發明之經取代之 銨或多聚陰離子在介質中的濃度低於在脂質體之内部空間 的濃度的條件下進行接觸。在一個具體實施例中，脂質體 組合物在水性介質中與該實體接觸。 在另一個具體實施例中，本發明提供將實體包膠至脂質 體内的方法。該方法包括使本發明之含有脂質體的組合物 與刚-實體接觸，其中該前-實體能夠在由該脂質體提供的 条牛下被轉變為貫體，藉此在脂質體的内部將前_實體轉 二為實體。在一個案例t，該實體為有機化合物，而前_ 貫體則是其驗性衍生物。 在另一個具體實施例中，本發明提供製造脂質體-包膠 之實體的套組。該套組包括裝有本發明之脂質體的容器， 並可視需要含有實體的容器，及/或供使用者例如來包 移實體的說明書。 【實施方式】 本發明通常係關於可用來遞送各種實體，尤其是治療和 顯影劑的方法和腊質體組合物。本發明發現經取代之敍和 多聚陰離子可用來裝載實體，例如化合物，並使其保持在 脂質體内。因& ’本發明提供含有經取代之敍及/或多聚 陰離子的脂質體組合物和套組，以及製造這些脂質體組合 物的方法。 根據本發明之特徵，其提供在其内部空間含有一或多個 下式之經取代之銨化合物的脂質體組合物 93060.doc 10 1359029
Rr-卜 (I)
’、中Ri汉2 R；}和R_4分別為氫或有機基團，且其中至少一 個Ri厌2、R3和尺4是有機基團，如烷基、伸烷基、雜環烷 基、裱烷基、芳基、烯基或環烯基基團、其羥基_取代之 衍生物，可視需要在其碳氫化合物鏈中包含S、〇或N原 子，例如在其中形成醚（包含乙縮醛或酮縮醇）、酯、硫化 物（硫醚）、胺或醯胺鍵結。若Ri、R2、尺3和R4中少於三個 疋有機基團，此時根據本發明，至少一個，最好是兩個有 機基團具有二級或三級碳原子（即分別具有2或3個碳碳鍵 結的碳原子）直接與銨氮連接，即該經取代冬銨是位阻的 錢。通常，已知可滴定之銨，如未經取代的銨離子 (NH4 )’以及一級和二級直鏈的烧基敍離子出現在本發明 之脂質體的内部空間，提高了兩親性弱鹼的包膠，例如經 由”主動”、"遠距"或"穿透膜梯度-驅動"裝載的機制（Haran ·# 人 ’ Biochim. Biophys. Acta, 1993，第 1152冊，第 253-
258 頁；Maurer-Spurej 等人，Biochim· Biophys. Acta, 1999 ’第1416冊，第卜1〇頁）。然而，這些銨化合物具有氫 原子，其容易進入親核取代的反應内，並另行與陷入脂質 體中之實體產生化學反應’而因此能夠在脂質體裝載（陷 入）過程的期間或之後，傷害實體的化學完整性。因此， 希望陷入的經取代敍化合物在化學上是較惰性的，缺少不 穩定的或輕易與脂質體組份’可能包括包膠之實體產生反 應的化學功能。意外的是’我們發現脂質體組合物，在其 93060.doc 『1359029 内部空間包括沒有可取代氫之經取代的三級和四級銨，或 有位阻的一級或二級銨，其中藉著旁邊巨大的有機基團在 二間上阻止接近敍氫原子，如有一或兩個二級或三級碳原 子與銨氮連接，顯示不僅有傑出的實體·裝載容量，亦改 善了陷入脂質體中之實體，例如藥物的穩定性，在活體中 對抗從脂質體中的過早釋放。 在一個具體實施例中，陷入脂質體中之經取代銨化合物 在藥學上是惰性的，也就是說當投與活.個體，例如人類或 動物時，不誘發有害的生理學反應，在脂質體膜材料中的 含量，足以遞送有效劑量的陷入脂質體中之實體。在其他 的具體實施例中，本發明之經取代銨化合物對個體具有可 接受程度之毒性。通常，可接受程度之毒性意指本發明之 經取代胺的中毒劑量，例如最大耐受劑量（MTD)或引起 50%致死（LD50)的劑量，比裝載在本發明脂質體内部的陷 入脂質體中之實體，例如藥物的中毒劑量更高至少兩倍、 至少四倍、至少八倍或至少十倍。例如，根據本發明，硫 酸三乙銨具有可接受程度之毒性，因為它的LD5〇比呵黴 素，一種抗癌藥物的LD50更高40倍。若不知道經取代銨 和感興趣之實體的毒性程度或生理學反應，則可經由熟諳 生物醫學技藝者已熟知的例行技術，迅速地建立。參見， 例如 S.C· Gad. Drug Safety Evaluation, Wiley，New York, 2002。在本文實例16中描述了 —種定量自由及/或以脂質 體之方式調配的藥物之毒性的方法。 在一個較佳的具體實施例中，在Ri、R2、心和心中的取 93060.doc •12· 1359029 代有機基團具有足以確保經取代之敍在水性環境中形成實 質上真的（分子）溶液，而非膠束、雙層或類似自我·組合結 構的尺寸和物-化特性。因此，本發明之經取代錢最好很 少或實質上沒有分布至脂質體的雙層部分内，因此使其中 已陷入經取代銨之脂質體的脫穩定、促溶或促通透風險減 至最少。 經取代銨之有機基團通常含有高達8個碳原子、高達6個 碳原子或高達4個碳原子的碳氫化合物，而經取代基團總 計含有高達18、高達16、高達12或高達9個碳原子。這些 經取代之碳氫化合物基團包括任何組合的互連一級、二級 或三級碳原子，且環烷基基團在其終端直接與銨氮連接， 形成雜環，或與銨氫·取代基的碳原子連接。這些經取代 之烷基基團亦可在其碳鏈中包含雜原子，例如氧、氮或 硫，形成官能基，例如醚、乙縮醛、胺或硫化物基團以 及形成與烷基碳鏈連接的官能基，例如羥基基團。本發明 之有機基團的實例包括，但不限於烷基、伸烷基、雜環烷 基、環烷基、芳基、烯基、環烯基或其羥基-取代之何生 物，例如羥基-取代之伸烷基，形成在經取代之銨中包含n 的環。 在其他的具體實施例中，經取代之銨是：環烷基銨，即 其中至少兩個Ri、I、I和I形成環的銨；有位阻的—級 錄，或有位阻的二級敍。通常，有位阻的一級或二級銨包 括任何經取代之銨，帶有一或兩個以烷基基團取代的Ri、 R"2 R3和R4 ’其在空間上擠滿該分子，例如任何經取代之 93060.doc •13· 1359029 銨，帶有一或兩個以一或兩個環烷基基團或烷基基團取代 的R!、R2、故3和R4，有至少一個二級或三級烷基碳原子與 該經取代銨的氮連接。這類雜環的、有位阻之一級銨和有 位阻之二級銨的實例包括，但不限於異丙基乙銨、異丙基 甲銨、二異丙銨、第三_丁基乙銨、二環己銨、嗎啉、吡 啶、六氫吡啶、吡咯啶、六氫吡畊、第三_ 丁胺、2_胺基· 2-甲基丙醇-1，2-胺基-2-甲基-丙二醇“口和三_(羥乙基）·胺 基甲烷的質子化形式。這些經取代的銨化合物通常以各種 鹽類在市面上販售，或可藉著利用酸的中和作用，從其相 對應的胺迅速地製備。 在另一個具體實施例中，該經取代之銨是三級或四級 銨，包括但不限於三甲銨、三乙銨、三丁銨、二乙基甲 銨、一異丙基乙銨、三異丙銨、N_甲基嗎姚、N—羥乙基六 氫吡錠、N-甲基吡咯錠和N，N，_:甲基六氫吡鉼、四甲 銨、四乙胺和四丁銨。這些經取代的銨化合物通常以各種 I類在市面上販售，或可藉著利用酸的中和作用，從其相 對應的胺迅速地製備。 在另一個具體實施例中，根據本發明之經取代銨化合物 是整體的陽離子性化合物，即在實體包膠的條件下，通常 在大約pH 2到大約pH 8之pH值的水性溶液中，攜帶淨正 電，例如由於氮原子之電離作用（質子化）的結果。 合在本發明之脂質冑中所含有的經取代録，可以是任何適 +當的形式，例如鹽。適當的鹽類包括在藥學上可接受的鹽 大員參見’例如Ρ·Η· Stahl, C.G. Wermuth(編輯），Handb〇〇k 93060.doc •14- 1359029
Pharmaceutical Salts，Wiley-VCH，Weinheim，2002。在 一個具體實施例中，經取代銨是含有一或多個本發明之多 聚陰離子的鹽《在本發明之經取代銨中使鹽成為水溶性的 抗衡離子（陰離子），最好是在藥學上惰性的，當與治療或 可檢測實體接觸時能夠形成沉澱物或凝膠，並/或比經取 代銨或其非_解離胺形式更不易經由脂質體膜通過。通 常，本發明之經取代銨鹽在脂質體内，例如水性空間中形 成真的溶液，而不是形成明顯含量的凝相，如膠束、雙 層、凝膠或結晶相。經取代銨和形成鹽之陰離子，例如多 聚陰離子的相對含量是或接近化學計算的當量點，且通常 ^有在3·9範圍内的pH值，更常見的是4_8，視例如經取代 錢離子之共軛鹼的解離常數而定。 通中，經取代銨被包含在内部，也就是在本發明之脂質 體的内部空間中。在-個具體實施例中，從圍繞脂質體的 P "質中’部分或實質上全部移除經取代之鐘。這類移 _除可藉耆任何熟諸此藝者已知的適當方法來完成，例如稀 釋、離子交換層析法、尺寸排阻層析法、透析、超過濟、
沉澱等等。 W 根據本發明的其他特徵，提供含有多聚陰離子之則 的組合物。本發明之多聚陰離子可以是任何適當的化a 體，具有-個以上帶負電之基團，結果在脂質體内部 如，性的空間產生兩個單位以上的淨負離子電荷… :多聚陰離子可以是：價陰離子、三價陰離子、多似 聚合的多價陰離子、多陰離子化的多元醇或多陰, 93060.doc 15 1359029
化的糖》硫酸、磷酸、焦磷酸、酒石酸、號珀酸、順丁歸 二酸、硼酸和檸檬酸，但不限於此，是這類二-和三價陰 離子的實例。在一個較佳的具體實施例中，本發明之多聚 陰離子是多聚陰離子之聚合#，具有有機（碳）或無機: 鏈’和多個陰離子官能基，即在中性水性溶液中可被離子 化成負電的官能基’並整合或附加至主鏈。聚合物是天然 或合成的化合物’ it常具有高分子量，由重複連接的單： 所構成，分別為相對上較輕且較簡單的分子。代表性的多 聚陰離子聚合物是多碟酸、聚乙歸硫酸、聚乙稀續酸、陰 離子化的聚丙料聚合物、陰離子化的，例如多續酸化: 多胺’如多磺酸化的聚卜丫丙咬）；多硫酸化、多缓基化或 多構醯激化的多醣類；酸性多胺基酸；多核普酸；其他多 填醯基化、多硫酸化、多績酸化、多卿化或錢基化的 聚合物。這類多價陰離子和聚合物為此項技藝中已熟知 的’且許多是市售的。本發明之聚合陰離子最好是生物可 降解的，即可在活生物中瓦解成無毒性的單元。代表性的 生物可降解之聚合陰離子是多磷酸。 在其他較佳的具體實施例中，多聚陰離子是多陰離子化 的多元醇或多陰離子化的糖。多元醇是有機分子，具有多 個經基基團’與例如直線、分古4严山 且冰刀支或裱狀的碳主鏈連接。因 此，從另一方面來說，容；齡> 夕兀*知之特徵為多羥基化的化合 物。多元醇（多原子的醇類卜道社y丄 貝』局此項技藝中已知的分子。本 發明之代表性多元醇是，作 ^ 疋1一不限於·乙二醇；甘油、海藻 糖醇（treitol)、赤蘚糖醇、季布 竽戊四醇、甘露糖醇、葡萄糖 93060.doc -16- 1359029 醇（glucitol)、山梨糖酵、木糖醇、乳糖醇（iacUt〇1)、麥芽 糖醇（maltitol)、果糖醇（fructit(^)和肌醇。糖通常在優先交 聯之經基化碳原子的基團内，包括環狀的乙縮醛、環狀的 酮縮醇、酮或醛基團，或其加合物。糖類通常是天然存在 的化合物。糖類在水性介質中的水解作用，導致叫做單醣 的單位。通常，在水性溶液中，單醣糖分子的五或六個碳 原子形成環狀的半縮醛，一環狀結構。本發明之糖類最好 是單醣或雙醣，即由1或2個單醣單位所組成，每個分別有 從3至7個，最好是從3至6個碳原子。本發明之代表性的糖 類是，但不限於單醣己糖，如葡萄糖（右旋糖）、半乳糖、 甘露糖、果糖；單醣戊糖，如木糖、核糖、阿拉伯糖和雙 醣類，如乳糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖。糖的 還原作用是獲得多元醇的一種方法。更穩定的"非還原"和 非-可代謝雙醣，如蔗糖或海藻糖是較佳的。各種多元 醇'單聽和雙醣是市售的。 多聚陰離子化的多元醇和糖是其羥基基團完全或部分以 陰離子基團修改或置換（陰離子化）的多元醇或糖。因此， 多陰離子化的多元醇或多陰離子化的糖包括多元醇部分或 糖部分，連同與其連接的陰離子基團。代表性的陰離子基 團包括，但不限於羧酸、碳酸、硫代碳酸、二硫代碳酸、 ^4自文、膦酸、硫酸、續酸、硝酸和硼酸。多陰離子化之糖 或多元醇的至少一個陰離子基團最好是強的陰離子基團， 即在水性介質中時，在廣泛的PH範圍，例如pH 3_12，最 好是PH2-12中超過50%離子化，或另外具有3或更低，最好 93060.doc • 17- 1359029 是2或更低的對數解離常數（pKa)。可藉著各種此項技藝中 已熟知的化學方法，達成多元醇或糖的多陰離子化作用。 例如，多元醇及/或糖與三氧化硫或氯磺酸在吡啶中的反 應，結果以硫酸殘基酯化一些或全部的羥基基團（硫酸 化），提供多硫酸化的糖或多元醇。本發明之代表性的硫 酸化糖是硫酸化的蔗糖，包括但不限於蔗糖六硫酸鹽、簾 糖七硫酸鹽和蔗糖八硫酸鹽（參見Ochi. K·，等人，1980, Chem. Pharm. Bull.，第28冊，第638·641頁）。在美國專利第 5,783,568號中揭示各種硫酸化的糖和多元醇。同樣地，在 鹼催化劑的存在下，與碳醯氯或二乙基鱗醯氣反應，結果 產生多磷醯基化的多元醇或糖。亦從天然來源中分離多碟 醯基化的多元醇。例如，肌醇多磷酸，如從玉米中分離出 肌醇六磷酸（肌醇六磷酸）。多元醇及/或糖與一個以上硼酸 分子的複合作用’亦產生多陰離子化（多硼酸化）的產物。 ^元醇及/或糖在驗存在下與二硫化碳的反應，產生多ρ 離子化（多二硫代碳酸化）的衍生物。多陰離子化之多元醇 或糖衍生物，可以自由酸的形式分離，並以適當的鹼中 和，例如以鹼金屬氫氧化物、氫氧化銨，或最好是以經取 代胺，以純淨之形式，或以經取代銨氫氧化物的形式，提 供本發明之經取代銨的多陰離子鹽。或者，可分離多陰離 子化之多元醇/糖的鈉、鉀、鈣 '鋇或鎂鹽，並藉著任何 已知的方法，例如藉著離子交換，轉變成適當的形式，例 如經取代之銨鹽形式。 本發月之夕聚陰離子通常具有每個單位，例如在碳鏈中 93060.doc -18- 1359029 的每個碳原子或環，或在糖尹的每個單聽單位，具有至少 2、3或續帶負電之基團的電荷密度。本發明之多陰離子 化的糖或環狀的多元醇，最好且古；I” 鮮取好具有至少75%可用於多陰 子化的羥基基團，且更佳的是 夕&離 可用於多陰離子化的 經基基團。此外，在本發明 、 月之月曰貝體内部的多陰離子化 ，通吊是在可相容或有助於遞 其想要之作用部位，或在，處釋放，^之實體至 及在該處釋放，但減少陷入實體過 早，即在脂質體到達其想要之作用部位之前釋放的層面。 :據本發明’可使用在脂質體内部之多陰離子化 動力與。Μ 中之實體的釋放速率和 千 。以相對於陰離子總量之多陰離子化之糖 醇的量為基礎，或在多聚陰離子是唯--種陰離子 ^案例中’以多陰離子化作用關於多聚陰離子之總多陰離 子化容量的百分比 •土礎，例如在本發明脂質體内部之多 陰離子化的糖或多元醇或其混合物，來評估多陰離子化的 ㈣°在一個具體實施例中，多陰離子化之糖或多元醇與 夕或夕個其他的陰離子混合，而超過其他陰離子（群）量的 :離子化之糖或多凡醇量越少，實體就越快從脂質體中 釋放。 ' @入實體在其想要作用❾地方太慢從月旨質體中 則可藉著使用多陰離子化之糖或多元醇與一或多個 /、他早價或多價降 ""離子，例如氣化物、硫酸鹽、磷酸鹽等 。物’達到想要的釋放速率。或者，亦可使用各種 夕陰離子化程度之多陰離子化之糖或多元醇的混合物。在 93060.doc -19· 1359029 -個具體實施例中，在本發明之脂質體内的多陰離子化程 度，是在脂質體内部之總_陰雜； 〜g離子（群）的0.1。/。到99¼、10〇/〇 到90%或20%到80%之間，例如與陷入之實體。 通常，本發明之脂質體组合物可含有一或多個任何適當 形式的本發明之多聚陰料’例如酸或 陽離子之鹽的形式。多聚陰離子的量，例如多：=1 糖或多元醇’可以是在化學計量上相等的，或與陽離子的 量不同。在-個具體實施例中，本發明之脂質體組合物含 有一或多個陽離子的多聚陰離子鹽類，其中跨越脂質體膜 出現陽離子濃度梯度或pH梯度。在另—個具體實施例中，、 本發明之脂質體組合物含有一或多個本發明之經取代銨多 聚陰離子鹽類。在另一個具體實施例中，本發明之脂質體 組合物含有在脂質體内部的多聚陰離子，同時藉著^諳此 藝者已知的任何適當之方法，例如稀釋、離子交換層析 法、尺寸排阻層析法、透析、超過濾、沉澱等等，部分或 實質上移除在脂質體所含有之介質中的多聚陰離子。在另 一個具體實施例中，帶有陷入多聚陰離子，例如多陰離子 化之多元醇或多陰離子化之糖的脂質體，亦具有穿透膜梯 度’將物質有效地保留在脂質體内。這類穿透膜梯度的實 例是pH梯度、電化學電位梯度、銨離子梯度、經取代銨離 子梯度或溶解度梯度。經取代銨的梯度通常包含銨離子的 經取代形式，包括至少一個C-N鍵結，如一級、二級、二 級或四級銨。創造穿透膜梯度的方法在脂質體技藝中是例 行的。 93060.doc -20· 1359029 根據本發明的其他特徵，本發明之脂質體組合物含有一 或夕個本發明之經取代銨及/或多聚陰離子，以及化學或 生物實體，例如治療劑或可檢測實體。例如，在本發明之 月9質體組合物中所含有的實體，可以是治療劑、墨汁、染 料、磁性化合物、肥料、誘餌、生物催化劑、味道或氣味 矯正物貝、漂白劑，或可藉著此項技藝中已知的任何適當 方法，例如磁共振顯影（MRI)、光學顯影、螢光/發光顯影 或核顯影技術檢測的任何實體。為了方便，本發明之脂質 _ 體”且σ物所含或可裝載的實體是弱驗性的，並可通透模 (親脂性）的實體，例如含胺或氮驗的實體。 在一個具體實施例中，在本發明之脂質體組合物中所含 的實體是治療劑。 在另個具體貫施例中，在脂質體組合物中所含的實體 疋抗癌實體。如下分類一些通常已知市售（或正旺盛發展） 之抗贅生物製劑的部分一覽表。 以結構為基礎來分類：氟嘧啶—5_FU、氟脫氧尿苦、富 馨多拉富（ft〇rafur)、51·脫氧氟展苦、UFT ' s]截瘤達 (Capecitabine);嘧啶核苷—脫氧胞苷、阿糖胞苷、5_氮雜 胞嘧啶、吉西他濱（Gemcitabine)、5-氮雜胞嘧啶阿拉伯糖 苷；嘌呤--6-毓基嘌呤、硫代烏嘌呤、硫唑嘌呤、異嘌呤 醇 '克拉君賓（cladribine)、氟達拉濱（Fludarabine)、噴司 •他丁（pentostatin)、2·氣腺嘌呤核苷；鉑類似物—順氣氨 - 鉑、卡鉑、奥沙利鉑（oxaliplatin)、特崔鉑（Tetrapiatin)、 鉑-DACH、奥馬鉑（Ormaplatin)、CI-973、JM-216 ;氨茴 93060.doc -21 - 環黴素/蒽二酮--阿黴素、道諾紅菌素、表柔比星(epirubicin)、 伊達比星（Idarubicin)、米托蒽醌（Mitoxantrone);表鬼臼毒 (epipodophyllotoxins)--依托泊苷（Etoposide)、替尼泊苷 (Teniposide);喜樹鹼--伊立替康、拓撲太肯、勒托替康 (Lurtotecan)、喜拉替康（Silatecan)、9-胺基喜樹鹼、 10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、TAS 103、7-(4-甲基-六氫°比畊·亞甲基）-10，1卜伸乙二氧基-2〇(S)-喜樹鹼、 7-(2-N-異丙胺基）乙基）-20(S)-喜樹驗；荷爾蒙和荷爾蒙類 似物--二乙基己烯雌齡'、他莫昔芬（Tamoxifen)、托瑞米芬 (Toremefine)、托莫特司（Tomudex)、塞米特克（Thymitaq)、 氟他胺（Flutamide)、卡比魯米（Bicalutamide)、非那雄胺 (Finasteride)、離二醇、曲沃昔芬（Trioxifene)、屈洛昔芬 (Droloxi fe n e)、醋酸曱經孕鋼（Medroxyprogesterone)、醋酸曱 地孕酮、氨魯米特（Aminoglutethimide)、睪内酯（Testolactone) 及其他；酵素、蛋白質和抗體--天冬醯胺酶、介白素、亮 丙里德（Leuprolide)、培加帕酶（Pegaspargase)及其他；長 春花生物驗--長春新驗、長春花驗、長春瑞賓、長春地辛 (Vindesine);紫杉烧--紫杉醇、多舍他昔。 以機制為基礎來分類：抗荷爾蒙製劑參見荷爾蒙和荷 爾蒙拮抗劑的分類，阿那曲。坐（anastrozole);抗葉酸--胺甲 碟呤、胺基蝶吟、三甲曲沙（Trimetrexate)、甲氧苄咬 (Trimethoprim)、派雷崔新（Pyritrexim)、乙胺嘴咬(Pyrimethamine)、 依達曲沙（Edatrexate)、MDAM ;抗微管製劑--紫杉烧和長春 花生物鹼；烷基化製劑（典型的和非典型的氮芥（氮芥 93060.doc -22- 1359029 (Mechlorethamine)、苯丁鲮氮芥、苯丙胺酸氮芥、尿嘧啶氮 芬）、氧氮填環類（oxazaphosphorines)(異環填醯胺 (Ifosfamide)'環填醯胺、過鱗醯胺（Perfosfamide)、曲填胺 (Trophosphamide))、烧基續酸龍（白消安（Busulfan))、亞硕 基脲（卡莫司汀（Carmustine)、洛莫司汀（Lomustine)、鏈佐 星（Streptozocin))、硫化三（環氮丙基）填、曱嗓咪嗤胺 (Dacarbazine)及其他；抗代謝產物--嘌呤、嘧啶和核苷， 上文列舉；抗生素一氨茴環黴素/蒽二酮、博菜黴素、放線 菌素D、絲裂黴素、普卡黴素（Plicamycin)、噴司他丁、鏈 佐星；拓樸異構酶抑制劑--喜樹鹼（拓樸I )、表鬼臼毒、 m-AMSA、玫瑰樹鹼（拓樸Π );抗病毒劑--AZT、扎西他賓 (Zalcitabine)、吉西他濱、去羥肌苷（Didanosine)及其他； 各種細胞毒性製劑--經基腺、米托坦（Mitotane)、融合毒 素、PZA、苔蘚蟲抑素（Bryostatin)、類 A 酸（Retinoids)、 丁酸及衍生物、木聚硫（Pentosan)、菸粬黴素（Fumagillin) 及其他。
除了以上的，抗癌症實體包括但不限於任何拓樸異構酶 抑制劑、長春花生物鹼，例如長春新鹼、長春花鹼、長春 % 負、長春氟寧（vinflunine)和長春西;^丁（vinp0Cetine)、微 官解聚或去穩定劑、微管穩定劑，例如紫杉烧、紫杉醇或 多舍他昔的胺烧基或胺酿基類似物，例如2'-[3-(N，N-二乙 胺基）丙醯基]紫杉醇、7·(Ν，Ν-二甲甘胺醯基）紫杉醇和7_L_ 丙fe醯基紫杉醇、烧基化製劑、受體-結合劑、赂胺酸激 酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、週期素依賴性激酶抑制劑、酵 93060.doc -23 · 1359029 素抑制劑、曙光（aurora)激酶抑制劑、核苷酸、多核苷酸 和法呢基轉移酶抑制劑》 在其他的具體實施例中，在本發明之脂質體組合物中所 含有的實體是氨g環黴素化合物或衍生物、喜樹鹼化合物 或衍生物、玫瑰樹鹼化合物或衍生物、長春花生物鹼或衍 生物、沃特曼寧（wortmannin),其類似物和衍生物，或具 有曙光激酶抑制特性之吡唑并嘧啶化合物的治療劑。 在另一個具體實施例中，在本發明之脂質體組合物中所 含有的實體是氨茴環黴素藥物、阿黴素、道諾紅菌素、絲 裂黴素c、表柔比星、吡柔比星（pirarubicin)、柔紅黴素 (rubidomycin)、卡西諾黴素（carcin〇mycin)、N乙酿基亞德 里亞黴素、路比達榮（rubidazone)、5-醯亞胺道諾紅菌素' N-乙酿基道祐紅菌素、道諾拉林（daun〇ryiine)、米托蒽 酿、喜樹驗化合物、喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、7_乙基喜樹 驗、10-羥基喜樹鹼' 9-硝基喜樹鹼、ι〇，ιι·亞曱二氧基喜 樹鹼、9-胺基-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、亞甲 二氧基喜樹臉、伊立替康、拓撲太肯、勒托替康、喜拉替 康、（7-(4-曱基六氫吡畊并亞甲基伸乙二氧基_ 20(S)-喜樹鹼、7-(4-甲基六氫〇比畊并亞甲基）_10，u_亞甲二 氧基-20(S)-喜樹鹼、7-(2-N-異丙胺基）乙基）-(20S)-喜樹 驗；玫瑰樹鹼化合物、玫瑰樹鹼、6_3_胺丙基-玫瑰樹鹼、 2-一乙胺基乙基-依利録（Ellipticinium)及其鹽類、達替氯 銨（datelliptium)、瑞特利亭（reteiiiptine)。 在另一個具體實施例中，在本發明之脂質體中所含有的 93060.doc • 24- 1359029
實體是藥學實體，包括但不限於任何下列的：抗組織胺乙 二胺衍生物（漠苯那敏（bromphenifamine)、苯海拉明 (diphenhydramine));抗原蟲藥：啥謹酮（雙埃喹琳 (iodoquinol))；脒（噴他脒（pentamidine));驅蟲藥（嚷嘧啶 (pyrantel));抗血吸蟲藥（奧沙尼啥（oxaminiquine));抗真 菌的三嗤衍生物（福利康嗅（fliconazole)、伊曲康唾 (itraconazole)、酿I 康吐（ketoconazole)、味康唾（miconazole)); 抗微生物的頭抱菌素（頭孢唾林（cefazolin)、頭抱尼西 (cefonicid)、頭抱嗔將（cefotaxime)、頭抱他定（ceftazidime)、 頭抱°夫新（cefuroxime));抗微生物的β-内酿胺衍生物（氨曲 南（aztreopam)、頭孢美唾（cefmetazole)、頭孢西丁 (cefoxitin));紅黴素群的抗微生物劑（紅黴素、阿齊黴素 (azithromycin)、澄清血徽素（clarithromycin)、竹桃黴素 (oleandomycin));青黴素（苄青黴素、苯氧甲基青黴素、鄰 氣青黴素（cloxacillin)、甲氧西林（methicillin)、萘夫西林 (nafcillin)、苯。圭西林（oxacillin)、叛节西林（carbenicillin)); 四環素；其他抗微生物的抗生素、新生黴素（novobiocin)、 壯觀黴素（spectinomycin)、萬古黴素（vancomycin);抗分枝 菌藥物；胺基水楊酸、捲曲黴素（capreomycin)、乙胺丁醇 (ethambutol)、異於肼（isoniazid)、°比 °秦酿胺（pyrazinamide)、 利福布丁（rifabutin)、利福平（rifampin)、氣法齊明（clofazime); 抗病毒之金剛烧類：金剛烧胺（amantadine)、金剛乙胺 (rimantadine);奎尼丁衍生物：氣喧（chloroquine)、經氣噎 (hydroxychloroquine)、普馬噎(promaquine)、喧歐諾（qionone); 93060.doc -25- 1359029 抗微生物的啥謹_ :環丙沙星（ciprofloxacin)、氟咬酸 (enoxacin)、洛美沙星（lomefloxacin)、萘咬酸（nalidixic acid)、諾氟沙星（norfloxacin)、氧氟沙星（ofloxacin);績臨胺 類；泌尿道抗微生物製劑：烏洛托品（methenamine)、吱痛 妥因（nitrofurantoin)、甲氧苄咬（trimethoprim);硝基咪唑 類：曱硝唑（metronidazole);膽驗能的四級銨化合物（安貝
西尼（ambethinium)、新斯的明（neostigmine)、毒扁且驗）； 抗-阿茲海默氏症的胺基吖啶（他克林（tacrine));抗-帕金森 氏症的藥物（苯札托品（benztropine)、比0底力奎（biperiden)、 丙環定（procyclidine)、苯海索（trihexylhenidyl));抗-繩簟 驗製劑（阿托品、天仙子胺（hyoscyamine)、東茛菪驗 (scopolamine)、丙胺太林（propantheline));腎上腺素能的多巴胺 (沙丁胺醇（albuterol)、多巴紛丁胺（dobutamine)、麻黃素、腎 上腺素、去曱腎上腺素、異丙腎上腺素（isoproterenol)、奥西那 林（metaproperenol)、沙美特羅（salmetrol)、特布他林 (terbutaline));麥角胺衍生物；肌肉鬆弛劑（myorelaxants)或 箭毒（curane)系列；中樞作用的肌肉鬆弛劑；巴氣芬 (baclophen)、環苯扎林（cyclobenzepine)、丹曲洛林 (dentrolene) ; β-腎上腺阻斷劑（醋丁洛爾（acebutill)、胺蛾_ (amiodarone));笨并二嗓（地爾硫萆（ditiazem));抗節律不 整藥（二異派胺（diisopyramide)、恩卡尼（encaidine)、局部 麻醉藥系列--普魯卡因、普魯卡因胺（procainamide)、利多 卡因、敗卡尼（flecaimide))、奎尼丁； ACE抑制劑：卡托 普利（captopril)、依那普利拉（enelaprilat)、福辛普利 93060.doc -26- 1359029 (f〇sin〇pr〇1)、喹那普利（quinapri丨）、雷米普利（ramiprii); 抗血脂藥.氟伐他汀（f丨uvastatin)、吉非貝齊 (gemfibrosil)、HMG-coA抑制劑（普伐他汀（pravastatin)); 低血壓藥物：可樂定（cl〇nidine)、胍那苄（guanabenz)、哌 嗤秦（prazocin)、胍乙唆（gUanethidine)、胍那決爾 (granadnl)、肼屈嗪（hydraiazine);以及非冠狀血管擴張 劑：潘生丁（dipyridamole)。
根據本發明’在本發明之脂f體組合物中所含有的實體 亦可以是前.實體，例如前_藥或製劑，其能夠在像是改變 pH值或不穩定鍵結之酵素切開的條件下，在—或多個轉變 步驟中轉變成想要的實體。這類轉變可在想要的藥物/脂 質體作用位置處，發生在從脂f體内部釋放實體之後。然 而，前·實體可在使用該脂質體作為遞送媒介，例如投與 患者之前’在本發明之脂質體内部轉變為想要的活性實 體。例如’可將實體修改成前_實體，使得其更容易被裝 入本發明之脂質體内，i當其在本發明脂質體的内部時， 可轉變回想要的實體。以此方式，根據本發明，可以其天 然、未經修改的形式，將福受尤 ^將通常不旎接党"主動”、”遠距，，或 其他以梯度為基礎之裝载方法的實體有效地裝載到 之内部空間内。 叫只姐衣戟1來忏下，能 夠達到帶淨正離子電荷的化合物， ,..尤其疋含有可滴定胺的 化合物，可有效地裝載到顯示出穿 牙边膜離子梯度的脂質體 内。若感興趣的實體是有機化合物、 +疋具有可滴定胺 93060.doc -27- 1359029 的整體陽離子化合物，可藉著適當的修改，製備其具有所 需離子特性的衍生物，例如根據w〇〇die等人，在 96/25147中描述的方法。例如，可藉著實體之歸基團與 胺基酸的醋化作用’導入胺基基團。或者，可將忌水性基 團導入水溶性的化合物中’幫助它在脂質體膜和橫跨膜至 脂質體内隔間之物質内，即脂質體内部的分溶。其他創造 脂質體-可裝載之前-實體的有用修改，是形成録基團加 合物’例如踪、朋：、乙縮酸^十 难酸或鋼Ifi醇。在將經過修改之化 合物裝載到根據本發明之脂諸内之後，可將經過修改之 含胺基的基團水解，或另行以化學方式與經過修改的化合 物分開。在脂質體内從前·實體中再生實體的代表性方法 為水解作用、錢作用、幅解作用、硫解作用、氣㈣ 用、還原作用、取代作用、氧化作用或消I。可藉著但不 限於改變PH值或藉著酵素作用，來完成這些方法。例如， 將紫杉醇或^舍他昔’非離子實體轉變為其(二乙胺基 丙醯基戈广(二乙胺基丙酿基)醋類，其為弱驗(前-實 體)。在耩考任何已知的方法，包括但不限於"主動"、"遠 距乂穿透膜梯度為基礎的”或"以溶解度梯度為基礎的” 方法，及/或本發明之古、土 _ 去’裝載到脂質體内之後，藉著
經由增加pH值至pH 7 〇以μ AI 上’刺激其水解，將脂質體内的 2’-(二乙胺基丙醯基）_势杉龄絲 '、t %轉邊為原始的紫杉醇。因此， 以母莫耳脂質體之脂暂# 超k 0.05莫耳的藥物/脂質比例，獲 :將二：杉燒分子包膠在其内部空間中的脂質體，不需 1杉烧々子的親水性共價修改（例如藉著附接PEG)、環糊精 93060.doc -28- 1359029 紫杉炫複合物或紫杉燒·促溶、膠束-形成的界面活性劑。 根據本發月’在本發明之脂質體組合物中所含有的脂質 可，疋任何在此項技藝中已知或較晚發現的脂質體。通 *本發明之脂質體可具有任何脂質體結構，例如具有由 -或多個脂質雙層與外部介質隔離之内部空間的結構，或 任=微移囊，其具有帶有親脂中心部分的半·通透膜’在 那裏膜將内部隔離。脂質雙層可以是任何排列的兩親分 子，其特徵為親水性部分（親水性部分）和忌水 性部分)。在雙層中的兩親分子通常排列成二次元(二; 片，其中忌水性的部分朝向薄片的内側，而親水性部分則 向外。形成本發明之脂質體的兩親分子，可以是任何已知 或較晚發現的兩親分子，例如合成或天然來源的脂質或生 物可相容的脂質。亦可藉著兩親聚合物或界面活性劑形成 本發明之脂質體’例如聚合物體和大泡囊。為了本揭示内 容’非限制性地，亦將這些形成脂質體的材料稱為,,脂質"。 根據本發明’在本發明之脂質體組合物中所含有的脂質 ，亦可以是瞎準的脂質體’例如在脂質體表面上含有—或 多個晦準部分或生物分布修改劑的脂質體。瞎準部分可以 是任何能夠專一地與想要標靶結合，或與其產生交互作用 的製劑。在-個具體實施例中’聪準部分是配體。根據本 發明，配體優先結合並/或内化至細胞（標靶細胞）内’陷入 脂質體之實體在該細胞中發揮其想要的效力。配體通常是 結合對的成員，第二個成員出現在標靶細胞上或其中’ $ 在包括該標靶細胞的組織中。適合本發明之配體的實例 93060.doc •29· 1359029 疋.葉酸、蛋白質’例如鐵傳遞蛋白、生長因子、酵素、 狀、文體、抗體或抗體片段，如Fab,、Fv、單鏈Fv、單一
功能部位抗體，或任何包括抗體分子之抗原·結合序列 (CDRS)的其他纽。將其中晦準部分是抗體或其標乾抗 原 '结合片段的配體-瞄準脂質體稱為免疫脂質體。在較佳 的具體實她例中’攜帶瞎準部分，例如配體的脂質體，被 標靶細胞内化。在另一個具體實施例中，瞎準部分是專一 地與酪胺酸激酶觉體，像是例如EGFR、HER2、HEW、 HER4、PD-GFR、VEGFR、bFGFR<IGFR^ 體產生交互作 用的配體。在另—個具體實施财H部分專-地與生 長因子丈體、A管生成因子受體、鐵傳遞蛋白受體、細胞 黏連分子或維生素受體產生交互作用。
根據本發明其他的具體實施例，在脂質體組合物中所含 有的脂質體顯示出本發明之經取代銨及/或多聚陰離子的 穿透膜濃度梯度。最好是在脂質體的内部（内側）空間中有 較尚的濃度。此外’本發明之脂質體組合物，除了由本發 明之經取代銨及/或多聚陰離子產生的梯度之外，亦可含 有-或多個穿透膜梯度。例如，在本發明之脂質體組合物 中所含有的脂質體可額外地包含穿透膜pH梯度、離子梯 度、電化學電位梯度及/或溶解度梯度。 根據本發明的另-個具體實施例，可以套組來提供本發 明之脂質體組合物’該套組包括裝有脂質體的容器，並可 視需要還有裝有實體的容器’以及說明書，例如與在一或 多個應用中使用脂質體有關的程序或資訊。可經由任何媒 93060.doc •30· 1359029 體，例如硬紙副本、電子媒體或進出含有說明書之資料庫 或網址，提供這類說明書。 可藉著任何熟諳此藝者已知或較晚發現的適當方法，製
造本發明之脂質體膜組合物。通常，可使用各種脂質組份 來製造本發明之脂質體。脂質組份通常包括，但不限於（ι) 不帶電荷之脂質組份，例如膽固醇、神經醯胺、甘油二 醋、醯基（聚醚）或烷基聚（醚）；（2)中性磷脂，例如二醯基 磷酯醯膽鹼、神經鞘磷脂和二醯基磷酯醯乙醇胺；（3)陰離 子！生的脂質，例如二醯基磷酯醯絲胺酸、二醯基磷酯醯甘 油、一醯基磷脂酸、心磷脂、二醯基磷酯醯肌醇、二醯基 甘油半琥珀酸酯、二醯基甘油半戊二酸酯、膽留烯基半琥 轴I 8Θ、膽㈣基半戊二酸g旨及其類似物；⑷與聚合物共 輛的脂f，例如N-[甲養基·（聚（乙二醇）二酿基填醋醯乙醇 胺、聚（乙二醇）-二醜基甘油、聚（乙二醇）_神經醯胺；以及 (5)陽離子性的脂質，例如1，2-二醯基-3-三甲銨·丙烷 (DOTAP)、〉臭化二甲基二十八烷基銨_八^)和二醯 基-sn-甘油·3_乙基碟酸膽驗。亦可使用這些鱗脂的單酿基 取代之衍生物，以及二-和單烷基-類似物。 可選擇各種月日質組份，滿^、修改或賦與—或多個想要 *力月b例如可使用磷脂作為主要形成囊泡的脂質。納 膽口醇可用以維持膜的剛性，並減少藥物漏出。可在脂 質體形成中使用與聚合物共輛的脂質，經由降低被肝臟和 脾臟清除脂質體，择‘ e m 田加循ί哀的壽命，或在缺少循環延長效 力下，改善在儲存期間脂質體對抗凝集的穩定性。宣稱以 93060.doc -31 . 1359029 脂質體之脂質的1莫耳％或以上的量納入PEG-脂質，具有 數倍延長的脂質體血液循環時間（參見，例如美國專利第 5’〇13,556號），我們已經驚訝地發現本發明之脂質體有非 常長的循環期，而在脂質體組合物中加入PEG-脂質，即使 有也僅延長循環壽命不超過兩倍。此外，亦可使用電荷_ 修改的（可滴定的）脂質，經由使某些種類之實體更容易逃 過内囊胞路徑的界限’而協助遞送包膠實體的脂質體至胞 液或核標乾》
在一個具體實施例中’本發明之脂質體包含卵磷脂、膽 固醇和兩親聚合物。納入本發明之脂質體中的卵磷脂可以 疋天然的卵麟脂、氫化的天然卵磷脂、合成的卵鱗脂、 1，2-二硬脂醯基-卵磷脂、二棕櫚醯基卵磷脂、二肉苴蔻醯 基卵磷脂、二油醯基卵磷脂、丨_硬脂醯基_2_油醯基卵磷脂 或1 -棕櫚醯基-2-油醯基卵磷脂，而兩親聚合物可以是聚乙
二醇-脂質衍生物，例如聚乙二醇磷酯醯乙醇胺、聚乙· 醇-二醯基甘油或聚乙二醇-神經醯胺衍生物，其中該聚^ 二醇）部分具有從大約250到大約2〇,〇〇〇，最常見的是從； 約500到大約5,000的分子量。在其他的具體實施例中，— 本發明之脂質體中的卵磷脂和膽固醇比例， 約b在另-個具體實施射，兩親聚合物為在;^ 之脂質體中形成脂質體之脂質的至少〇1莫耳％。在另一 4 具體實施例中，兩親聚合物的量是在本發明之脂質體中子 成脂質體之脂質的0.4物“莫耳％之間。兩親聚合$ 取好是中性的聚合物，即在藥物裝載條件下具有〇之;" 93060.doc -32· 1359029 子電荷f列如PEG-工醯基甘油、PEG·:炫基甘油或PEG_ 神L驢胺1外地發現納人離子中性的兩親脂質，高達總 月曰貝之大約5·7莫耳〇/〇的PEG_脂質内含量，提供例如長春花 生物鹼，如長春瑞賓的高效率脂質體裝載，而在帶陰離子 電荷之PEG.DSPE的案例中，在！ 6莫耳％或更多的㈣脂 質内含畺處，裝載效率明顯地下降（實例72)。 在另一個具體實施例中，本發明之脂質體含有喜樹鹼衍 生物，例如喜樹鹼前藥，如伊立替康，並由卵磷脂和膽固 醇組成，例如按莫耳計以大約3:2之比例，以及兩親聚合 物，例如以形成脂質體之脂質的至少〇丨莫耳％或低於 的量。 可藉著任何此項技藝中已知或將成為已知的方法，來製 is·本發月之月曰貝體。參見’例如G. Gregoriadis(編輯），
Liposome Technology ’ 第 1_3冊，第 1版，1983 ;第 2版，1993, CRC Press，Boca Rat〇n，FL。適用於製造本發明之脂質體組 合物之方法的實例’包括擠壓、逆相蒸發、超音波震盪、 溶劑（例如乙醇）注射、微流化作用（micr〇fluidizati〇n)、去 垢劑透析、乙醚注射和脫水/再水化作用。可藉著控制用 於低壓擠壓之膜的孔隙尺寸，或在微流化作用或任何其他 適當方法中利用之通道的壓力或數目來控制脂質體的尺 寸。在一個具體實施例中，首先藉著薄膜水合或藉著乙醇 /主射將想要的脂質水合，隨後藉著擠壓，通過限定孔隙尺 寸的膜按尺寸製造；最常用的是〇·〇 5微米、〇.〇8微米或 微米。 93060.doc •33 - 1359029 在脂質體内部含有本發明之經取代銨及/或多聚陰離子 的月曰貝體組合物，可藉著任何適當的方法來製造，例如在 本發明之經取代銨及/或多聚陰離子的存在下形成脂質 體，例如以鹽的形式。可在脂質體形成之後，或在裝载或 使想要之實體陷入之後，移除或稀釋在脂質體外面的經取 代銨及/或多聚陰離子。或者，可經由離子交換法，直接 或經由具有本發明之經取代銨，例如多陰離子化之糖或多 元醇的經取代銨之梯度的中間物自由酸步驟，製造含有本 發明之經取代銨及/或多聚陰離子的脂質體組合物。可使 用胺或其帶有揮發性酸，例如碳酸的鹽，中和這類脂質 體。可直接使用所得的脂質體溶液，或者若需要可移除其 中所含的鹽，例如藉著蒸發和結晶作用，接著在水性介質 中解離。 較佳的是，本發明之脂質體組合物具有經取代録及/或 多聚陰離子的穿透膜濃度梯度，例如在脂質體内之經取代 敍及/或多聚陰離子的濃度，比在脂質體外介質中之經取 代銨及/或多聚陰離子的濃度更高，通常是至少更高· 倍。 ° 在一個具體實施例中，在脂質體 隹钿頁體内之經取代銨及/或多 聚陰離子鹽的濃度’比在脂質體外 Α Α 負节之經取代銨 及/或夕聚陰離子鹽的濃度更高至少 #，且為至少大 約 10 mM、50 mM、〇1 Μ、〇2 Μ、〇5 . . . M、0.6 Μ或 0,7 Μ 的濃度。在其他的具體實施例中，在 日買體内之經取代銨 及/或多聚陰離子鹽的濃度，比在脂 祖外介質中之經取 93060.doc •34- 1359029 代銨及/或多聚陰離子鹽的濃度更高至少1〇〇倍，且為大約 0.65 Μ之濃度。 此外’本發明之脂質體組合物通常外側具有的pH值，其 在裝載進行崩間可與想要之實體相容，或有助於維持想要 實體的穩定性，並具有高裝載效率，例如9〇%以上的陷 入。例如’在4-7範圍内的ρίί值，或pH 4.5-6.5是較佳的。 特疋而言’根據本發明，喜樹驗化合物，例如拓撲太肯或 伊立替康的裝載，最好是在外部介質在大約4.0到大約7.0 之PH值範圍下完成，更佳的是在大約pH 5.0到pH 0.5之 間。長春花生物驗，例如長春新鹼、長春瑞賓或長春花鹼 的裝載，最好是在大約5.〇·7〇的pH值下完成，更佳的是在 大約6.5之pH值下。 根據本發明’可藉著在適當的溫度下，例如在裝載期 間，超過組份脂質之相變溫度的溫度，並在裝載實體之後 降低至相變溫度以下，在水性介質中，將想要的實體與本 發明之脂質體一起培養，將想要的實體裝載或使其陷入脂 質體内。培養時間通常以組份脂質的性質、欲裝載至脂質 體内之實體和培養溫度為基礎。通常，數分鐘到數小時的 培養時間是足夠的。因為達到超過85%之高陷入效率，通 常超過90%，故經常不需要移除未陷入的實體。然而，若 有乂鋇需求，可藉著各種方法，像是例如尺寸排阻層析 法、透析、超過濾、吸附或沉澱，從組合物中移除未陷入 的實體。意外地發現’在將實體，特別是喜樹驗衍生物或 長春花生物鹼衍生物與本發明之脂質體—起培養的期間 93060.doc -35· 1359029 内，維持低離子強度，接著在培養結束時增加離子強度， 1果有較问的裝載效率、未陷入藥物較完全的移除，以及 對抗凝集的較佳脂質體穩定性。通常，在低於相當50 mM NaC卜或更佳的是低於相當30 mM NaCl的離子強度下’ 在例如水性溶液中進行培養料之後，可加入濃縮的 ，，例如NaCl溶液’升高離子強度至比5〇瓜厘^以更 同，或更佳的是比100 mM NaC1更高。不需與理論結合， 我們假設增加離子強度，有助於實體從脂質體膜中解離， 留下實質上全部包膠在脂質體内部空間中的實體。 —通常’實體·對-脂質比例’例如在裝載實體時所獲得的 樂物裝载比例’視陷入脂質體内之實體的量、陷入經取代 2及/或多聚陰離子，例如鹽的濃度、陷人實體的物化特 =抗衡離子（陰離子），例如所使用之多聚陰離子的類型 疋因為在組合物中及/或 效率，陷入脂質體中之實Λ 方法達到高裝載 8〇0/ ^ . 實體的實體-對·脂質比例超過 80 乂、超過 9〇%，且播 ^ 4a 'ja. λ — 且通吊超過95〇/〇以在裝載過程中 貫體和脂質體脂質的量為基礎計算 (”輸入，，比例卜確實，實降u , 耳體對知質比例 *上100%(定量）包膠是很常貝 的。可從重量比例(每份脂質體脂質重量或莫耳 體重篁）或莫耳比例（每份 # 實 體莫耳)的觀點，$出在脂質體中實體 的實 徵。可藉著例行的計算， 卜月曰貝比例的特 脂質比例的單位轉換成另m “’j的w —種實體-對- 的實體重量比例，通常是每;=在#本發明之脂質體中 母亳克脂質至少0.05、（M、 93060.doc -36. 1359029 〇·2、〇_35、0·5，或至少 0 65 毫克 笔兄實體0從莫耳比例的觀點 來看，根據本發明之實體_對 X趙對知質比例是每莫耳脂質體脂 貝至少大約〇.〇2至大約5，較佳的β 议住的疋至少〇. 1至大約2 ,而f 佳的是從大約0.15到大約1.5莫耳 '斗的樂物。在一個具體實施 例中’實體-對-脂質比例，例 】如=樹驗衍生物的藥物裝萤 比例是至少0· 1 ’例如每1莫耳 , 旲斗舳質體脂質0.1莫耳的喜樹驗 诉生物，而較佳的是至少〇 疋王乂 υ.2。在其他的具體實施例中， 實體對-月旨質比例，例如藥物 β — 、物裝载疋母毫克形成脂質體之 脂質，至少大約3〇〇毫券眚栌 宅見實體（例如長春花生物鹼或其衍生 物）。在另一個具體實施例中， 頁體-對-脂質比例，例如单 物裝載是每毫克形成脂質體 ,、 取彻負體之脂質，至少大約500毫克實 體（例如喜樹鹼衍生物或喜樹鹼前藥）。 若脂質體包括碌脂，以I„ 以母莫耳早位之脂質體磷脂的藥物 之重量（質量）單位來袅頦宭辦β 一 衣見貫體内含：!：是方便的，例如毫克 樂物/毫莫耳鱗脂。然而，熟諳此藝者將知曉可以不依賴 出現在脂質體中之碟脂的方式，同樣地表示藥物内含量， =且可同等地以每單位（質量或莫耳）脂質體脂質内含量之 藥物莫耳量的觀點夾矣- *.來表不。例如，含有3莫耳比率的二硬 脂醒基鱗酯醯膽驗八7曰 酶（DSPC，分子量790)、2莫耳比率的膽固 醇（分子量 387)和 〇〇1ς^··Η· , + .15莫耳比率的聚（乙二醇）_衍生之二硬 脂醒基鱗酯酿乙醇胺fppr ncriT^ \ ，曰 * 妝（PEG-DSPE ’分子望· 2750)，並含有 按150毫克/毫莫耳碟脂之藥物/麟脂比例的藥物阿黴素（分 子里543.5)的脂質體，可如下從毫克藥物/毫克總脂質的觀 點，同等地表示相同的藥物内含量： 93060.doc -37- 1359029 (a)藉著將組份的莫耳量除以脂質體磷脂的總量，計算對 脂質體磷脂（在本例中為DSPC和PEG-DSPE)之莫耳單位標 準化的脂質體脂質組份之莫耳量： DSPC 3/(3+0.015)=0.99502 膽固醇2/(3+0.015)=0.66335 PG-DSPE 0.015/(3+0.015)=0.00498 (b)計算總脂質體脂質的質量，相當於脂質體脂質的單位 莫耳置和組份分子量：
總脂質’毫克/毫莫耳磷脂=0.99502x790+0.66335x387+ 0.00498x2750=1056.48 (c)藉著將以每莫耳單位磷脂之質量單位表示的藥物内含 量除以在步驟（b)中獲得的數目，來計算總磷脂之每質量單 位的藥物質量： 阿黴素，毫克/毫克總脂質=150/1056.48=0.14198
(d) 藉著將在步驟（c)中獲得的數目除以藥物分子量（在本 例中為543 _5) ’計算每單位質量之脂質的藥物莫耳量： 阿黴素，毫莫耳/克總脂質=034198/543.5x1000 = 0,261。 (e) 計算在脂質體脂質基質中之磷脂的莫耳比率： 磷脂莫耳比率=(磷脂的總莫耳量）/ (脂質的總莫耳量）= (3 + 0.015)/(3+2 + 0.015)=0.6012。 (f)計算阿黴素對總脂質的莫耳比例： 阿黴素，總脂質的莫耳/莫耳=(磷脂莫耳比率）χ(阿膜素，克/ 莫耳磷脂）/(阿黴素分子量）=〇.6〇12乂15〇/543 5=^166。 因此， 迅速建立以各種單位表示 的在藥物-對-脂質和藥 93060.doc •38· 1359029 物-對-填脂比例之間的關係。當在本文中使用時，"脂質，· 包括，但不限於脂質體膜之任何形成膜的組份，像是例如 聚合物及/或去垢劑。 使本發明之經取代銨及/或多聚陰離子鹽溶液陷入的脂 質體，通常具有幫助保持脂質體穩定對抗滲透傷害，而不 犧牲脂質體之裝載容量的滲透強度（滲透壓在一個具體 實施例中，本發明之脂質體組合物的滲透壓是在〇.1到15 莫耳/公斤或0.2到0.7莫耳/公斤。 通常，本發明之脂質體組合物在儲存期間是相當穩定 的’例如’藉著在某段時間之後，從最初裝載至本發明之 脂質體内的實體中，釋放至脂質體外或仍維持在脂質體内 之陷入實體的百分比來測量。例如，本發明之脂質體組合 物在4 C下疋穩定的，持續至少6個月，例如，在實體之最 初裝載之後6個月，釋放出低於1 〇〇/〇的陷入實體。在一個 具體實施例中’本發明之脂質體組合物在4°C下是穩定 的，持續至少2年，例如在實體的最初裝載之後2年，釋放 出低於20%的陷入實體。 陷入脂質體之實體在該脂質體中維持包膠，直到脂質體 到達它想要作用的地方，例如在投與脂質體之抗腫瘤藥物 至患者的案例中為腫瘤’是有利的。本發明之脂質.體顯示 出在活體内條件下，例如在哺乳動物的叙液中，對抗陷入 Λ體之釋放（漏出）的驚人穩定性。在活體内在大鼠的血液 中，從月曰質體中釋放5〇。/。陷入實體，例如藥物所需的暴露 時間超過24小時。特定而言，以長春花生物鹼藥物，例如 93060.doc .39- 1359029 長春化鹼、長春新鹼和長春瑞賓裝載的脂質體，顯示在活 體内對抗藥物漏出的顯著穩定性，具有至少24小時的一 “ 放時間，或在活體内在血液中，在24小時之後維持 匕膠的實體$是預先-投藥值的至少大約50%。通常觀察到 半-釋放時間超過33小時，或在活體内在血液中，維持 >之匕膠實體量至少大約60% ;即使超過46小時之一半_ 釋放時間，或在活體内在血液令，在24小時之後包夥實體 的里疋預先-投藥值的至少大約7〇%，亦是常見的。有時， 内在血液中，包膠藥物的一半-釋放時間超過93小 時，甚至超過120小時。裝載喜樹鹼衍生物，如拓撲太肯 1伊立替康的脂質體，亦顯示在活體内在血液中罕見的穩 疋性，在24小時之後仍有79_85%的原始藥物裝載維持包 膠。令人驚課的是，本發明之脂質體在血液循環中具有這 樣低的活體内藥物釋放速率，顯示超過自由藥物⑽以溶 液形式投藥）之相當大的活體内抗腫瘤活性。 6 :發明之脂質體提供高效率陷入治療劑與低毒性的意外 2 °通常，根據本發明以月旨質體方式包璆之治療實體的 • ’ ，例如喜樹鹼衍生物的抗-贅生物活性，至少耸私 3右以目同的1經由其例行非_脂質體調配物 如 使用本發明之脂質體組合物投與之治 倍，或？小® ▲ , J &庄吏问兩 性不超過/四。’同時以脂質體方式包耀之實體的毒 ’比以相同劑量和計畫但是以自纟 投與之相同治瘩音锕从主w s/ 已修屯式 I療貫體的毒性更低至少兩倍或至少四倍。例 ，通吊已知藉著其他公開的方法 抗-癌症喜樹鹼衍生 93060.doc 1359029 物的脂質體包膠，結果與未包膠藥物相比較產生增加的毒 性（較低的最大耐受劑量’較低的5〇%致死劑量）。參見美 國專利第6,355,268號；美國專利第6,465,008號；c〇ibem 等人 Clinical Cancer Res. 1998，第 4，第 3077-3082 頁；Tardi等人 Cancer Res.，2000，第 60，第 3389-3393 頁；Emerson等人Clinical Cancer Res. 2000，第6，第2903-2912頁。以脂質體方式包膠 的喜樹鹼前藥，如伊立替康（CPT_U)，它是水溶性的陽離 子性之喜樹鹼前藥衍生物，在一個在活體内腫瘤模式中， 具有實質上比在缺乏脂質體調配物之下，例如以自由（溶 液）形式之藥物的更高，例如更高至少4倍，且甚至1〇倍的 抗腫瘤活性。更明顯的是，因為治療化合物，例如喜樹鹼 月J藥需要酵素激活作用，例如藉著内源非-專一敌基酉旨 酶的作用，但根據本發明，實質上被包膠在脂質體的内部 空間内。換句話說，根據本發明，脂質體形式之喜樹鹼前 藥CPT 11(藥物/脂質質量比超過〇」，例如〇 6)的毒 性，比自由（未包膠）之CPT_U的毒性更低2倍以上，甚至 更低4倍以上。此外，在活體内達到從CPT-11脂質體中的 延長藥物釋放，在投與至血流内之後24小時，在脂質體中 =維持超過50〇/〇 ’甚至超過7〇%(79-86%)的原始藥物内含 里，亚有超過24小時的一半_釋放時間，通常超過“小 時。在活體内在脂質體中之藥物的延長殘留與較高抗腫瘤 效力有,。驚人的1 ’在含有低-分子多陰離子化之糖衍 生物蔗糖八硫酸鹽）’而非聚合陰離子（多磷酸）的脂質體 中’觀察到在活體内最慢的CPT-11釋放和最高的抗腫瘤活 93060.doc 1359029 性（實例15)。 根據本發明的其他具體實施例，可提供含有本發明之脂 質體組合物和載劑，例如在藥學上可接受之載劑的醫藥組 合物形式的本發明之脂質體組合物。在藥學上可接受之載 劑的實例是生理鹽水、等張的右旋糖、等張的嚴糖、林格 氏液和漢克氏液》可加入緩衝物質，提供最適合儲存穩定 性的pH值。例如，在大約6.0到大約75之間的pH值較佳 的是大約6.5之pH值，對脂質體膜脂質的穩定性是最佳 的，並提供陷入實體的極佳保留。通t濃度在2·2〇祕的 組胺酸、羥乙基六氫吡畊·乙基磺酸（HEpES)、嗎啉·乙基 續酸（MES)、號㈣、酒石酸和檸檬酸，是代表性的緩^ 物質。其他適當的載劑包括，例如水、經過緩衝的水性溶 液、0.4〇/〇^(：1、0.3。/〇甘胺酸及其類似物。可加入蛋白 質、碳水化合物或聚合的穩定劑和張力調整劑，例如明 膠、白蛋白、葡聚糖或聚乙婦。比洛炫明。可利用葡萄糖或 更惰性的化合物，如乳糖、嚴糖、甘露糖或糊精，將组人 物的張力調整到0.25-0.35莫耳/公斤的生理學水準。可藉 著傳統已熟知的滅g技術，例如藉著過濾，將這些組合^ 滅菌。可包裝所得的水性溶液以供應用，或在無菌的條件 下過滤，並冷涂乾燥，在投藥之前將冷來乾燥的製備物盘 無菌的水性介質混合。 醫藥脂質體組合物亦可含有其他在藥學上可接受的辅助 物質’根據概略的生理條件所需’如阳調整和緩㈣、張 力調整劑及其類似物，例如醋酸納、乳酸納、氯化納' 93060.doc -42· ::、氮化鈣等等。此外，脂質體懸浮液可包括脂質-保 s蔓劑’其在儲存時保護脂質免於自由基和脂質·過氧化物 °親知性自由基猝滅劑，如α_生育酚和水溶性鐵_ 的螯。劑，如酸胺鐵（ferrioxamine)是適合的》 發月之躺貝體在流體醫藥調配物中的濃度，可根據所 k擇的特殊投藥模式而廣泛地改變，即按重量計從通常低 於大約〇·〇5%或至少大約2-10%到30至50%那麼高，且主要 將糟著流體的體積、黏性等等來選擇。例如，可增加濃 ^以便降低與治療有關的流體裝載。這在患有與動脈粥 樣硬化有關之鬱血性心衰竭或嚴重高血壓的患者中是特別 心要的。或者，可將由刺激性脂質所組成的脂質體醫藥組 σ物稀釋成低濃度，減少在投藥位置的炎症反應。 所扠與之脂質體醫藥組合物的量將視陷入脂質體内的特 殊療實體、待治療之疾病狀態、所使用之脂質體的類型 和臨床醫師的判斷而定。通常所投與之脂質體醫藥組合物 的里將足以遞送在治療上有效劑量的特殊治療實體。 可藉著例行在活體外和在活體内的方法，通常在藥物測 試的技藝範圍内，判定遞送在治療上有效劑量所需的脂質 體醫藥組合物的量。參見，例如〇 B Budman，A.H. CaWert， K. Rowinsky(編輯）Handbook of Anticancer Drug Development LWW，2003。各種治療實體之在治療上有效的劑量，為熟 S3此藝者已熟知的；並根據本發明，經由本發明之醫藥脂 質體組合物遞送的治療實體’提供至少與藉著投與相同量 之以其例行非_脂質體調配物之形式的治療實體所獲得的 93060.doc •43- 1359029 活性相同，或更高2.倍、4_倍或1Q倍的活性。本發明之脂 質體醫藥組合物的劑量，範圍通常在每公斤體重大約 0.005到大約500毫克治療實體之間，最常見的是在大約〇ι 到大約100毫克治療實體/公斤體重之間。 通$冑本發明之脂質體醫藥組合物製備成局部或注射 用的’液體溶液或懸浮液。然而，亦可製備在注射之前， 適合在液體媒劑中形成溶液或懸浮液的固體形式。亦可根 據此項技藝中已知的方法，將組合物調配成腸衣鍵或凝膠 • 膠囊。 可以任何在醫學上可接受的方式投與本發明t脂質體組 口物其可視待治療之狀況或傷害而定。可能的投藥路徑 包括主射，藉著非經腸的路徑，例如血管内、靜脈内、硬 膜外内或其他，以及口服、經鼻、經眼、直腸、陰道、局 邛或肺臟，例如藉著吸入。組合物亦可直接塗抹在組織表 面。在本發明中亦明確地包括持續釋放、pH依賴性釋放， φ 或其他調解釋放投藥的特定化學或環境條件，例如藉著這 類方法作為緒積注射或可腐鞋的植入物。 實例 :列的實例企圖解釋，但並非以任何方式、形狀或形式 明不或暗示地限制本發明。雖然可使用那些代表性的，但 可另仃使用熟諳此藝者已知的其他程序、方法學或技術。 實例1.製備經取代銨鹽的溶液 、藉著以水稀釋硫酸至0.25M之濃度，然後用各種胺之一 濕磨硫醆溶液，製備用來將藥物（例如阿黴素）裝載至脂質 93060.d〇e -44- 1359029 體内的硫酸三烧基敍和二烷基銨溶液。用在本實例中的經 取代胺類疋二乙胺、二甲胺、二甲胺、二乙胺或二乙醇 胺。在加入胺類之後，將所得的溶液稀釋成終濃度〇 2m的 經取代銨鹽。使用露點滲透壓力計判定滲透壓。在下文表 1中出示所得之經取代烷基銨硫酸鹽溶液的特性。 表1.各種二院基銨和三烷基銨硫酸鹽溶液的特性 鹽 滲透壓，毫莫耳/公斤 pH值 硫酸二曱銨 472 5.65 - 1 . 硫酸二甲基乙醇胺 509 5.72 硫酸二乙胺 519 5.85 硫酸三甲胺 497 5.81 硫酸三乙銨 559 5.33 實例2.製備陷入二烷基敍和三烷基銨鹽的脂質體，並將 物質裝載到這些脂質體内 按3:2:0.015之莫耳比例’將二硬脂醯基磷酯醯膽鹼 (DSPC)、膽固醇（Choi)和N-(甲氧基-聚（乙二醇氧羰基）_ 二硬脂醯磷酯醯乙醇胺（PEG_DSPE)(從具有分子量2 〇〇〇之 的聚（乙二醇）來製備）共同-溶解於氣仿中，並藉著旋轉汽 化在55-60°C下移除氣仿。然後在6〇〇c下，在實例1中列舉 的每個硫酸二烷基-或三烷基銨之一的溶液中，水合脫水 的脂質薄膜30分鐘。在壓力下擠壓脂質懸浮液，通過兩個 具有0.1微米之孔隙尺寸的疊層聚碳酸酯軌道刻蝕之臈濾 紙（Corning Nuclepore)。藉著準彈性光散射法，判定脂質 體的尺寸為大約110· 120毫微米。藉著凝膠過濾，使用交 聯葡聚糖凝膠（交聯葡聚糖G_75，Amersharn Pharmacia Biotechnology)管柱，以HEPES_緩衝之生理鹽水，pH 7 2_ 93060.doc •45- 1359029 洗脫’從脂質體外部的介Η移除未包勝的三院基敍 ' —炫·基録鹽，並以瞢知的允址、—^ , .二隙谷積餾分收集脂質體。以 uo微克藥物/微莫耳脂質體 .買體鱗月曰^農度，將阿黴素鹽酸鹽 東乾燥的粉末，按重量計每份阿黴素含有$份乳㈣ 加至知質體t。在55°CT培養該混合物45分鐘，在冰上冷 :1〇刀鐘’亚猎著凝膠過濾層析法，使用交聯葡聚糖㈣ 管柱，以HEPES-緩衝之生理鹽，pH入4洗脫移除未包膠 的樂物。肉眼未檢測到自由阿黴素的存在（其特徵為出現 移動較慢的紅色譜帶）。分別根據實例脚7ι (分光光度分 析法），針對磷脂和阿黴素，分析經過^^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 的脂質體。在表2中出示所得的藥物裝載效率W素 表2.在帶有二烷基_和三烷基銨鹽之陷入溶液的脂質體中裝 陷入脂質體内的鹽 在脂質體中的藥物/磷 脂比例(微克/微莫耳） 陷入效率(％) 硫酸二曱敍 140.74±10.35 93.8±5.7 硫酸三乙銨 163.81±16.41 109.2±11.6 硫酸二乙胺 158.16±18.34 105.4±7 8 硫酸二甲基乙醇铭 155.08士 8.51 103.4 土 11.6 貫例3·製備含有各種二烷基_、三烷基和雜環-經取代銨 硫酸鹽的脂質體，並將阿擻素裝載至這些脂質體内 按照實例1來製備經取代硫酸銨鹽溶液，使用市售的烷 基-經取代、羥烷基_經取代的和雜環的胺類。按照實例丄形 成月曰質體’除了代替脂質薄膜水合步驟，將純淨的脂質溶 解於乙醇（每50微莫耳磷脂約1〇〇微升乙醇），並在6〇_65。〇 下與經取代銨鹽溶液混合，使所得的脂質分散體含有大約 93060.doc -46· 1359029 1〇體積％的乙醇。 藉著以155微克藥物/微莫耳脂質體磷脂（PL)的比例，將 阿黴素溶液（2毫克/毫升，在HEPES-緩衝之生理鹽水pH 6.5中）加至脂質體中，並在熱水浴中加熱至58°C 45分鐘， 完成阿黴素裝載。從任何剩下未包膠的阿黴素中分離所得 的脂質體，並按照實例1分析藥物和脂質内含量。在表3中 出示結果。 表3.將阿黴素裝載至具有位阻之經取代烷基-、二烷基- 、三烷基-和雜環銨鹽溶液陷入的脂質體内 用來製備經取代銨鹽的胺 滲透壓，毫 莫耳/公斤 藥物裝載，毫 克/毫莫耳磷脂 裝載效率， % 三甲胺 497 149.4±7.9 96.4±4.9 三乙胺 559 149.6±6.9 96.5 土 4.3 二甲基乙醇胺 509 163.1±6.6 105.3±4.5 二甲胺 472 158.6 土 7.4 102.3 士 4.9 二乙胺 519 156.7±13.0 101.1±8.5 二異丙胺 533 159.9±6.2 103.2 土 4.1 三(經甲基)-米諾(mino)曱烧 423 179.9 士 15.3 116.1±11.5 1-六氫°比咬乙醇 506 153.5±7.1 99.0 士 4.5 4-甲基嗎啉 465 152.4 土 9.8 98.3 士 6.2 六氫°比咬 479 158.5 士 12.5 102.3±8.2 1-甲基吡咯啶 492 153.6 土 12.3 99.1±7.8 二甲基六氫0比畊 378 158.0 士 6.5 101.9 士 4.3 實例4.製備三乙銨多磷酸（TEA-Pn)溶液 將每分子有13-18個磷酸單位的直線多（磷酸）鈉 (Phosphate glass; CALGON®，獲自 Sigma Chemical
Company)溶解於水中，至大約1 ·3Μ構酸的濃度。使該溶 液通過以120毫升氩形式之磺酸化聚苯乙烯-二乙烯苯共聚 物陽離子交換樹脂小珠（Dowex 50Wx8-200，Dow Chemical 93060.doc -47·
Co.)包裝的管柱。以含水的3_3.6 μ HC1預先平衡該管柱， 使樹脂成為氫形式，並以去離子水沖洗至中性的pH值。將 15毫升多磷酸鈉溶液裝入管柱，並以去離子h2〇洗脫。使 用電導檢測器監視管柱洗脫物。以純淨的三乙胺滴定相當 於電導峰值的管柱流出物至pH 5.5-6.0。如同在實例1中， 藉著電位計使用鈉-敏感性玻璃電極分析溶液中剩下的 納’並使用無機磷酸測定分析磷酸内含量。將具有低於 1°/〇之剩下鈉内含量的溶液稀釋至0.55M的終鉀濃度。通常 該溶液具有0.52-0.55M之TEA濃度，5.5-6.0之pH值，和 430-480毫莫耳/公斤的滲透壓。 實例5.從脂質體製備物中移除未陷入的多磷酸鹽 根據 Kirpotin等人，Biochemistry 36:66-75，1997製備具 有陷入螢光標記8-羥基宸三磺酸酯的脂質體（尺寸12〇毫微 米），並與多磷酸鈉的溶液混合。將該混合物裝入含有交 聯葡聚糖小珠（交聯葡聚糖G-75)、6%瓊脂糖小珠（瓊脂糖 6B-CL)或4%瓊脂糖小珠（瓊脂糖4B-CL)的尺寸排阻管柱 中，全部都得自AmershamPharmacia，並以MES-右旋糖緩 衝溶液化115.5)洗脫。使用丑3111;16讨（1959)的罐酸測定分析 流出物的磷内含量，並藉著分光螢光法分析脂質體内含 量。在進行研究的凝膠-層析法載劑中，交聯葡聚糖CL-6B 在B之試樣/管柱床體積比下，提供多磷酸從脂質體中的 完全分離。 實例6.製備蔗糖八硫酸三乙銨（TEA-SOS)的溶液 蔗糖八硫酸鈉（當量重144.8)是蔗糖衍生物的鈉鹽，其中 93060.doc -48- 1359029 所有羥基基團均已經形成硫酸鹽，蔗糖八硫酸（s〇s)鈉鹽 係購自 Toronto Research Chemicals，Toronto，Canada，p/n S699020。將6克蔗糖八硫酸鈉溶解於16 57毫升去離子水 中’得到終濃度大約2.5N的硫酸基團。按照在實例4中 的，藉著離子交換處理該溶液《獲得為離子交換管柱流出
物的蔗糖八硫酸之溶液，然後以純淨的三乙胺滴定至pH 5.7(中和點），並判定該溶液的pH值和滲透壓。所得的溶液 具有經過計算為0.643M的三乙銨濃度、pH 5.7和530毫莫 耳/公斤之滲透壓。藉著電位分析法，未檢測到殘餘鈉的 存在（低於0.1%)。 實例7.使用經取代錄鹽，以伊立替康（CpT11)裝載脂質 趙.製備以及在血漿存在下的活體外藥物釋放 在本實例進行研究的硫酸、擰檬酸、焦磷酸、三磷 酸和直線多填酸（13 -18體），在陷入脂質體之經取代銨鹽溶 液中為陰離子。選擇碌酸聚合物，因為它們的生物降解性 並因為天然在細胞中發現多磷酸，與其他合成的聚合陰離 子（聚丙烯酸、硫酸葡聚糖及其類似物）相反。再者，低分 子量多磷酸之溶液的黏性比其他聚合物的更低，使多磷酸 更適合加工。 使用下列的材料製備鹽溶液。 1. 多鱗酸納，NaO-[p〇3Na]n-Na，n=13-18，購自 Sigma(產 品編號P-85 10，"磷酸類，實用級"，亦稱為六偏磷酸鈉或 商標名CALGON); 2. 三多鎮酸五鈉’ Na5P3〇10 ’購自sigma(產品編號T- 93060.doc •49· 1359029 5883)； 3. 焦磷酸四鈉十水合物，Na4P207 · 10H2O，購自 Sigma(產品編號 P-9146); 4. 離子交換樹脂Dowex 50Wx4(4%交聯績酸化的聚苯乙 烯樹脂’ 100-200網孔），購自Sigma(產品編號50X4-200)嘿 Dowex HCR-W2(8%交聯磺酸化的聚苯乙烯樹脂，.50-100 網孔），購自Sigma(產品編號1-8880)，可交替使用。按下 列順序’藉著傾析沖洗樹脂：去離子水三次、1N HC1兩次 (超過樹脂體積3x)、水三次、IN NaOH兩次、水三次、1N HC1三次和水三次。在傾析之後，樹脂為H+-形式。 5. 三甲胺（TMA)，水溶液40%，得自 Aldrich Chemical Co.(產品編號43，326-8)。藉著酸滴定確立濃度為大約 5.9N。 6. 三乙胺（TEA) ’ 99%，HPLC級，得自Fisher(產品編號 04884)。藉著酸滴定，濃度為6.9-7.1N。 經由逆滲透、離子交換並移除有機物，將水純化，達成 不含有機物的"16-18 MOhm"品質。 藉著離子交換法’製備焦磷酸、三磷酸和多磷酸鹽的水 溶液。將多磷酸鈉（3克在25毫升水中）、焦磷酸（4克在27毫 升水中）或多填酸（6.7克在30毫升水中）裝入含有100毫升 (床體積）如上製備之離子交換樹脂的管柱中。以水洗脫該 管柱，並收集溶離份。集合顯示出酸性pH值（pH<3)的溶離 份。以20毫升水稀釋一式三份，每等份〇 5毫升之含有磷 酸的集合溶離份，並以0.100N NaOH滴定，至pH 4.5-5.0之 93060.doc -50- 1359029 終點(Fisher分㈣液），判定當量濃f。以三甲胺滴定在 離子父換之後集合的溶離份（獲得三甲銨鹽）至pH5 4_5 5。 在滴疋之後’稀釋該溶液，若需要可獲得接近G5N的三甲 銨終濃度》 藉著以80毫升水稀釋丨39毫升濃硫酸（17 9M)，並在pH_ 计的控制之下，以純淨的三乙胺或含水三甲胺滴定該稀釋 溶液至當量點（PH 5.^.5)，製備硫酸三甲銨和三乙銨。以 水將體積調整到100毫升。 藉著將1.572克得自Sigma的檸檬酸單水合物ACS(產品編 號C·1909)溶解於20毫升水中，並以含水三甲胺滴定該溶 液至當量點，製備檸檬酸三甲銨溶液。以水將體積調整到 25毫升。
使用正壓，通過〇.2_微米醋酸纖維素濾紙過濾該溶液。 分別使用蒸氣壓滲透壓力計和玻璃-甘汞電極？11計，測量 溶液的滲透壓和pH值。在酸水解之後（5分鐘，1〇〇〇c，3N
Ηβ〇4) ’藉著藍磷鉬酸鹽分光光度測定（參見實例7〇)，判 定陰離子在磷酸溶液中的當量濃度。陰離子當量濃度僅考 慮酸性官能基’其實質上在ρΗ 5.5處被離子化。以添加的 二烧基録驗為基礎，判定陽離子當量濃度。獲得具有下列 特性的溶液（表4): 表4.用來將CPT-11裝入脂質體内之經取代銨鹽溶液的牲# ΤΜΑ檸檬酸鹽 ΤΜΑ硫酸鹽 陽離子 陰離子 當量濃度當量濃度 0.58 0.50 0.60 0.50 pH值滲透壓~~~~一_(毫莫耳/g、 5.1 5.4 791 625 93060.doc 51 1359029 TMA焦磷酸鹽 0.44 0.54 5.4 651 TMA三磷酸鹽 0.57 0.68 5.4 695 TMA多磷酸鹽 0.49 0.58 5.5 336 TEA硫酸鹽 0.54 0.50 5.35 719 膽固醇和 DSPC 係購自 Avanti Polar Lipids, Alabaster， Alabama，USA。PEG-DSPE(PEG 分子量 2,000)則是來自 Shearwater Polymers，Huntsville, AL，USA。按 3:1:0.1 之重 量比（莫耳比約為3:2:0.03)，以60毫克/毫升DSPC，將 DSPC、膽固醇和PEG-DSPE溶解於氯仿（Fisher ;最優級， I 以戊烯使其穩定）中。以每個試管30毫克DSPC(0.5毫升）， 將該溶液分配至Pyrex試管中，並在60°C下使用旋轉式汽 化器，在減低的壓力下慢慢地蒸發。在室溫下，在真空下 將脂質薄膜脫水（100微米汞，油泵）30-60分鐘。 藉著在60°C下，在上述的含水鹽溶液中溫和地震盪15-20 分鐘，使脫水的脂質薄膜水化。脂質形成乳狀的懸浮液 (多層囊泡）。使該乳狀懸浮液經歷五回合在乾冰和異丙醇 的混合物中冷凍（-80°C，3分鐘），並在60°C水浴中融解3分 ^ 鐘。然後通過2個疊層聚碳酸酯膜遽紙（Nucleopore， Whatman，孔隙尺寸0.1微求），使用加熱至60°C之手工操 作的往復式擠Μ器（Avanti Polar Lipids)，撥壓脂質懸浮液 10次（雙-擊）。 將經過擠壓的脂質體保持在60°C下5分鐘，並在冰水（0-4 °C )中使其驟冷5分鐘。然後藉著凝膠-層析法，在交聯葡聚 糖G-75上，從在裝載緩衝溶液MES-右旋糖（50克/公升右旋 糖ACS、0.975克/公升2-(N-嗎啉基）-乙烷磺酸（MES)和足量 93060.doc -52- 1359029 的5M NaOH，使pH成為6.4)内形成梯度的鹽溶液中分離脂 質體。脂質體出現在空隙容積溶離份中（約管柱床體積的 3 0%) 〇 將每1毫克固體含有0.860毫克CPT-11鹼的CPT-11(伊立替 康鹽酸鹽）製備物溶解於0.001N HC1中，製成16.5毫克/毫 升CPT-11驗的母液《在MES-右旋糖緩衝溶液中，將該溶 液與脂質體混合，達到每1微莫耳脂質體磷脂150微克CPT-11的比例。在55°c下，在水浴中培養該混合物，偶爾溫和 地震盪（大約每隔5分鐘），持續30分鐘，然後在冰水（0_4 °c)中很快地冷卻。藉著凝膠-層析法，在交聯葡聚糖G_75 上，使用MES-右旋糖作為洗脫液，從未包勝的藥物中分 離脂質體。藉著分光光度測定判定包膠的藥物（實例7丨）， 並使用萃取測定判定磷脂（實例70)。
如下研究在50%人類血漿的存在下，從如此獲得之裝載 cPT-ii的脂質體中，在活體外的藥物釋放。在37<t下融解 冷床的人類捐贈者血漿’以14,5〇〇g離心10分鐘，並通過 0.45微米的醋酸纖維素注射筒濾紙過濾。藉著通過〇·2微米 不含界面活性劑之醋酸纖維素（SFCA)無菌注射筒濾紙，將 裝載CPT-11的脂質體製備物滅菌。在無菌的15-毫升共聚 物Eppendorf試管中，將〇.5毫升脂質體與〇5毫升血漿混 合，密封並在搖擺式平台上，在37<t下培養Μ小時。空白 試樣含有〇_5毫升無菌的MES•右旋糖代替脂質體。藉著凝 膠-層析法在小珠交聯的2%瓊脂糖凝膠（瓊脂糖cl_2b， Pharmacia; 10毫升床體積）上，使用144爪以Nac卜5 mM 93060.doc •53 - 1359029 HEPES-Na，pH 7.4緩衝溶液（HBS-5)分離脂質體。脂質體 出現在空隙容積溶離份中，而血漿蛋白質和（若有任何）釋 放的藥物則被凝膠阻止。針對CPT-11和磷脂測定脂質體溶 離份，並判定藥物/磷脂比例（輸出比例）。從含有脂質體之 試樣的讀值中減去空白試樣（僅有血漿）的讀值。藉著將輸 出藥物/脂質比例除以輸入藥物/脂質比例（在與血漿一起培 養之前的藥物/脂質比例），判定在培養之後保留在脂質體 中藥物的百分比。在表5中概述裝載和釋放數據。 表5.將CPT-11裝載至帶有三級烷基銨鹽的脂質體内，以 及在人類血漿的存在下，藥物的活體外釋放 陷入的鹽溶液 在與血聚一起培養之前 在與血漿一起培養之後 藥物/脂質比 包膠效率 藥物/脂質 仍包膠的藥物 例 (%) 比例 (%) TMA硫酸 127.2 土 5.6 84.8 土 3.8 132.1±6.9 103.8±10.0 TMA焦磷酸 136.2±9.0 90.8±6.0 132_3 士 5.0 97·1±10·1 TMA三磷酸 132.9 88.6 129.2 97.3 TMA-Pn 134.4±9.3 89.6±6.2 135.0±7.4 100.4±12.4 TEA硫酸 131.1 土 6.5 87.4 土 4.4 125.2 土 5.0 95.5±8.6 φ 實例8.使用焦磷酸、三磷酸、多磷酸、檸檬酸和硫酸三烷 基銨鹽裝載CPT-11之脂質體的活體内穩定性 雖然喜樹鹼脂質體可顯示在活體外，在血漿中可接受的 藥物漏出，藥物可能在活體内在血液循環中更快地漏出。 因此，在老鼠中使用單一時間點測定，就藥物在血液循環 中在活體内的穩定性，篩選CPT-11脂質體調配物的名單。 製備脂質體，並按照在實例6中的描述，具有下列修 改.，以CPT-11裝載。代替使用得自Shearwater Polymers的 93060.doc -54- 1359029 PEG-DSPE ’ 我們使用得自 Avanti Polar Lipids的類似 PEG- DSPE。欲定量在血液/組織試樣中的脂質體脂質基質，以 0.25毫居里/ ¾莫耳鱗脂的量，將不可交換的放射性標記 [3H]-膽固醇基十六烷基醚（[3h]-CHE; (Amersham，USA)加 至脂質的氯仿溶液中《以12毫克DSPC/試管，將脂質溶液 分配到Pyrex試管内，並藉著旋轉汽化/真空脫水形成脂質 薄膜。在0·7毫升形成梯度之經取代銨鹽的溶液中，使脂 質薄膜水化。藉著放射性閃爍計數，判定在有含磷酸鹽類 陷入之脂質體中的脂質濃度。亦分析沒有含磷酸鹽類陷入 之製備物的磷脂’沒有在實例70中描述的萃取作用，並用 來作為脂質的放射性標準。保留並測定為了裝載而製備的 脂質體-藥物混合物的部分，確認在裝載之前的添加CPT-11對脂質體脂質的預先-裝載比例。藉著準-彈性光散射法 (QELS)，使用高斯（Gaussian)模式，判定月旨質體尺寸分布 的體積-平均值和標準偏差。在表6中概述這些脂質體的特 性0 表6.關於在活體内之穩定性研究’裝載CPT-11至[3H]-CHE-標示之脂質體内的特徵 陷入的鹽溶液 在致載之前 的藥物/脂質 比例 在裝載之後 的藥物/脂 質比例 裝載效率 (%) 脂質體尺 寸’（平均值 土SD)毫微米 TMA檸檬酸鹽 159.2±3.5 156.7±3.6 98.5±4.4 122.1±25.3 TMA硫酸鹽 156.1±2.5 156.1±3.1 100.0±3.6 122.2±28.4 TMA焦磷酸鹽 164.6±5.8 156.6±4.3 95.2±6.0 121.1±19.9 TMA三磷酸鹽 163.6±5.7 156.0 土 3.2 95.3 土 5.3 122.4±12.9 TMA多磷酸鹽 170.5±8.0 162.4±4.0 95.3±6.8 123.0 士 12.7 TEA硫酸鹽 153. 士 3.3 154.9±4.9 101.0士5.3 121.1 土 18.0 93060.doc -55 · 1359029 以一式兩份，以10毫克/公斤（0.2毫克CPT-11/老鼠）之劑 1，使六週齡的雌性老鼠（Charles River)接受尾靜脈 注射這些脂質體CPT-11調配物。在8小時之後，麻醉老鼠 並經由開放心臟穿刺使其無血。將血液收集至有肝素的注 射筒内（10-20微升的1〇〇〇單位/毫升肝素1^1>)，並移至含有 0.4毫升含有〇.04% EDTA(Gibc〇 BRL)之磷酸緩衝生理鹽水 洛液（PBS)的秤重試管内，保持在冰上。將試管秤重，判 定灰液試樣的重量’藉著以9,000g離心5分鐘分離血球， 並保留含有PBS-稀釋血漿的上清液，進行藥物和脂質體脂 貝測定。藉著螢光分析測定（實例71)定量CPT-11。藉著驟 冷-校正的放射性閃爍計數定量脂質體脂質。將脂質體和 填月a -放射性標準物與血漿試樣平行計數。藉著將在血漿 5式樣中的藥物/放射性比例除以注射脂質體的藥物/放射性 比例，來計算仍維持包膠之藥物的百分比。因為從血液中 迅速地排除自由的cpTu(參見實例69)，並已知[3h]_che 對抗脂質交換穩定性，將測定的讀值視為脂質體CPT-11和 脂質之血液内含量的指標。假定100%的注射團塊進入循 環中，計算注射脂質劑量仍留在循環中的百分比·， 血液體積為老鼠體重的6·3%，且血溶比為45%。在表7中 概述結果。 表7.在老鼠中在注射後的單一點（8小時），CPT_U_包膠的 活體内穩定性和CPT-11-裝載之脂質體的循環壽命。 °/〇I.D·，注射劑量的％。 93060.doc -56· 陷入脂質體的鹽 藥物/脂質比例， 前值的％ '注射脂質體脂質，在血液中 的 0/〇LD. TMA檸檬酸鹽 80.2±7.8 18.8±3_4 TMA硫酸鹽 70.1±4.8 23.6±1.8 TMA焦磷酸鹽 67.3±9.2 23.2±3.1 TMA三填酸鹽 70.6 士 6·0 24.9 士 8.2 TMA多磷酸鹽 107.5 土 8.9 24.3±3.4 TEA硫酸鹽 76.6±13.1 23·6±0·1 1359029 所有的製備物均顯示在8小時之後在活體内在血液中的 藥物包膠程度為注射前程度的70-80%，而含有多磷酸的脂 質體是最穩定的（藥物包膠維持在大約100%)。 實例9.使用三乙銨多磷酸製備之CPT-11脂質體的血液藥 物動力學
按照在實例3中概述的，製備使用三乙銨多磷酸鹽調配 的脂質體CPT-11。以乾粉形式按3:2:0.015之莫耳比例，混 合脂質-DSPC、膽固醇和N-(甲氧基-聚（乙二醇）（分子量 2000)-氧羰基）-DSPC(PEG-DSPC)(均得自 Avanti Polar Lipids, Inc.)，並在 62-65°C 下溶解於 100°/。乙醇（USP等級， 約0.15毫升/100毫克脂質）中。關於藥物動力學研究，以 0.5毫居里/毫莫耳磷脂的量，將3H-膽固醇基十六烷基醚 (3H-CHE，獲自Amersham Pharmacia)力口至脂質中，作為不 可交換的放射性脂質標記。按照在實例4中的，製備TEA-卩11(0.5]^三乙銨，？115.7-6.2)的水溶液。在60-65°(：下，將 TEA-Pn溶液（加入乙醇之體積的10倍）與脂質溶液混合，並 在該溫度下攪拌，直到形成多層囊泡的均質乳狀懸浮液為 止。使用氬氣壓擠壓器（Lipex Biomembranes)，在60-6 5 °C 93060.doc -57- 1359029 下通過兩個具有100毫微米之孔隙尺寸的疊層聚碳酸輯軌 道-刻蝕濾紙（Corning Nuclepore)，擠壓該懸浮液15次，並 在冰中迅速地冷卻所得的單層脂質體，然後讓其達到周圍 溫度。藉著凝膠層析法，在瓊脂糖CL-4B管柱上移除乙醇 和未併入的多磷酸，以MES-右旋糖緩衝溶液洗脫（5 mM MES，50克/公升右旋糖’以NaOH將pH調整到6.5)。 以150-200毫克/毫莫耳破脂的藥物/脂質比例，將在水中 含有20毫克/毫升伊立替康鹼的cpt· 11 (伊立替康鹽酸鹽）母 ® 液加至脂質體内，並在60-62。(：下培養該混合物45-6〇分 鐘，偶爾攪動。很快地冷卻培養混合物，並在下培養 ίο分鐘，然後容許達到周圍溫度。加入1/20體積的2 88m NaCl，調整生理學離子強度，並改良與膜結合之cpT·丨i的 移動（與包膠在脂質體内部的藥物相反藉著凝膠層析 法’在父聯葡聚糖G-25或G-75管柱（Amersham Pharmacia) 上移除未包膠的藥物，以HBS-6.5緩衝溶液（5 mM 2-(4-(2-馨 羥乙基>六氫吡畊并l·乙基磺酸（HEPES：)，I44 mM NaCl’ PH6.5)洗脫《混合在空隙容積中洗脫的脂質體溶離份，藉 著0.2微米過濾滅菌，並在使用前儲存在4·6<)(：下。如同在 實例7中的，以脂質體濃度、藥物濃度和顆粒尺寸定出脂 質體之特徵。脂質體具有1〇8毫微米之平均尺寸，和每毫 莫耳磷脂139 士 18毫克CPT-11鹼的cpph内含量。 '在帶有留置中央靜脈套管的雌性Sprague_Daw〗ey大氣 (190-210克）中，研究脂質體脂質和脂質體藥物在血液中的 壽命，以及藥物在活體内從脂質體中釋放的特徵。以〇 2_ 93060.doc •58· 1359029
〇·3毫升3H-CHE-標示之伊立替康脂質體的團塊（每公斤體 重0.05毫莫耳填脂’或7·8毫克CpT•⑴注射大鼠。在注射 之後的各種時間，使用以肝素處理的注射筒抽取血液試樣 (0.2-0.3毫升）。使用磷酸緩衝之生理鹽水補滿取回的血液 體積。以〇·3毫升含有0.04% EDTA的冰冷PBS稀釋血液試 樣’科重並藉著離心分離血球。收集上清液，並使用實例 71之螢光分析程序測定CPT_U，使用傳統的方法藉著閃爍 放射性計數測定脂質體脂質標記。使用帶有已知藥物和 H-CHE·脂質濃度的脂質體製備物作為標準物。放射性標 準物含有等量的稀釋大鼠血漿足以說明驟冷。假定血液體 積按劣升計為按克計之體重的65%，且Α溶比為桃，計 算在血液中脂質體脂質和CPT_U的量。脂f和藥物在血液 中的總量，以注射劑量的％(%1.0.，％ID)表示，並對注射 後的時間作圖。藉著將在血液試樣中的藥物/脂質比例除
以注射脂質體的藥物/脂質比例（採用100%)，計算仍留在 脂質體中之藥物的百分比。因為作圖通常顯示完全符合單 一指數動力學（在半_對數刻度中的直線性），使用 EXCEL電腦程式（Micr〇s〇ft c〇rp，USAwtrend選項從 最吻合單-指數衰變等式的數據來計算藥物、脂質和從脂 質體中釋放之藥物的血液半_衰期。在圖〗中出示結果。從 ，吻合的參數中’月旨質和藥物的血液半表期分別為164小 時和6.61小時。在這些條件下，從循環中清除自由 是非常迅速的（參見實例69) ^ 體中釋放的兩相 血液藥物/脂質比例顯示CPT-11從脂質 93060.doc -59- 1359029 特徵（圖2) °在前24小時中，藥物的釋放遵循與時間有關的 直線（R=0.992) ’提供零-階釋放動力學的證據。在24小時 的時間點’僅在釋放大約75%藥物之後，更進一步的釋放 變成非-線性的。關於24小時，脂質體以大約3.6%的最初 裝載/小時之恒定速率釋放藥物。因此，在大約14小時的 期間内釋放50%的藥物/藥物的零-階釋放在持續釋放的調 配物甲是有吸引力的特質，因為藥物釋放的速率在時間内 維持恆定》 實例10.使用三乙銨多磷酸製備之CPT-11脂質體，在裸 鼠中對抗乳癌異種移植的抗腫瘤效力 在人類乳癌BT-474，一種過度表現C-ErbB2(HER2)受體 之雌激素依賴性管腺癌的模式中，研究CPT-11脂質體的抗 腫瘤效力》從美國典型培養物收集中心（American Type
Culture Collection(R〇ckville，MD))獲得 ^T-474細胞。按照 下述’從快速生長的異種移植腫瘤結節中建立具有較高腫 瘤生長速率的ΒΤ-474亞-株。在活體外，在τ-150燒瓶中之 帶有10%胎牛也清、0.1毫克/毫升硫酸鏈黴素和1〇〇單位/毫 升青破素G的RPMI-1640培養基中繁殖細胞，並每週將其 一分為三。將NCR nu/nu 雌鼠（4-6週齡；Taconic Farms)皮 下（在尾根部）植入60-天持續-釋放〇·72毫克17β-雌二醇的小 球（Innovative Research of America，Inc·)，並在兩天中， 在上背部皮下接種0.1毫升在細胞生長培養基中含有2χ1〇7 個ΒΤ-474細胞的懸浮液。藉著每週兩次觸診並以測徑器沿 著最大（長）和最小（寬）轴測量腫瘤，監視腫瘤進行。每週 93060.doc -60- 1359029 兩次從測徑器的測量值，使用公式（Geran，R_I.等人，1972 Cancer Chemother· Rep. 3:1·88):腫瘤體積=[(長）χ(寬）2]/2 判定腫瘤大小。 在接種之後13天，腫瘤達到200立方毫米的平均尺寸， 並將動物隨機分成三組，每組13-15隻動物。 按照實例8來製備脂質體CPT-11(藥物/磷脂比例192毫克/ 毫莫耳；平均脂質體尺寸86.8毫微米以MES-右旋糖媒 劑將自由和脂質體CPT-11稀釋成5毫克/毫升CPT-11驗。在 ® 腫瘤接種之後14、18、21和25天’經由尾靜脈對動物注射 自由的CPT-11、脂質體CPT-I1或僅注射媒劑。以每次注射 50毫克CPT-11/公斤之劑量給予含有藥物的調配物，其為 在文獻中關於在嚅齒類腫瘤模式中研究CPT-U時報告之劑 量的平均值。 欲評估與治療有關的毒性’動物亦每週秤重兩次。進行 觀察直到接種後第60天為止，此時雌激素補充小球耗盡。 φ 對時間進行跨組的平均腫瘤體積作圖並進行比較。如同圖 3所示，雖然自由的CPT-11降低了腫瘤生長速率，但在接 受脂質體治療的組別中，腫瘤戲劇化地退化。在第36天 時，在對照組中腫瘤達到可容許的最大尺寸，平均3,5〇〇 立方毫米’而在第46天，在以自由藥物治療的組別中，腫 . 瘤平均為大約1，000立方毫米，在相同的時間點，在以脂 質體治療的組別中，沒有動物有可觸模到的腫瘤。 藉著動物體重的動力學，評估與治療有關的毒性（圖4) ^ 沒有任何一組顯示出明顯的毒性。在對照組中之動物的體 93060.doc -61 - 1359029 重恆定地增加。在最後治療那天’接受脂質體cpT_u之動 物的平均體重上有些微降低，大約3.3%。然而’體重喪失 被逆轉，而動物達到其預期的重量。藉著Student,s卜檢 定，與處理前體重相比較（p=〇.274)，在平均體重上的降低 在統計學上並不是顯著的。因此，容忍所有的治療，沒有 顯著的毒性。 因此’藉著經由先前-陷入有位阻之多陰離子、生物可 降解之聚合物（多鱗酸）的經取代錄鹽（三乙錄）裝載藥物而 ® 獲得的CPT-11之脂質體調配物，在研究的腫瘤模式中，顯 不出延長的血液奇命、持續的釋放特性’並增加抗腫瘤活 性，但沒有可察覺的毒性增加。 實例11·使用預先-陷入三乙銨鹽製備之裝載CPT-Ui 脂質體的比較評估：預先-陷入陰離子之脂質體尺寸、 藥物/脂質比例和性質的影響 製備兩種裝載CPT-11之脂質體的原型調配物，一個使用 ^ 有預先_陷入TEA-Pn的脂質體，而另一個則帶有預先·陷入 TEA-SOS。這些脂質體的製備包括下列的製造步驟。 1)藉著在乙醇中共同-溶解，混合脂質。脂質基質組合物 由1，2-二硬脂醯基_SN-磷酯醯膽鹼（DSPC)(分子量790)3莫 耳比率（59.8莫耳。/。）；膽固醇（Chol)(分子量387)2莫耳比率 (39.9莫耳％)和Ν-(ω-曱氧基-聚（乙二醇）-氧羰基）-1，2-二硬 • 脂醯基磷酯醯乙醇胺（分子量2787)(PEG-DSPE)0.015莫耳 ' 比率（約0.3莫耳。/。）所組成。DSPC和PEG-DSPE係購自
Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama。膽固醇（最高 93060.doc -62- 1359029 純度等級）則是購自Calbiochem。以±〇· 1毫克的精確性，在 獨石夕玻璃容器中將脫水脂質秤重，並以適合下文之脂質分 散步驟的比例與絕對乙醇混合。因為DSPC的高轉變溫度 (5 5 C )，故通常在5 5-60°C下進行解離，直到獲得澄清的溶 液為止。 2)製備TEA-Pn和TEA-SOS溶液。多磷酸鈉（η=13·ΐ8)係 得自Sigma Chemical Co.，p/n P85 10。蔗糖八硫酸鈉係構自 Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, p/n • S699020 »將鹽壓下並溶解於水中，提供12_2 5N的溶液。 使用陰離子交換Dowex 50Wx8-200或H+-形式的Dowex HCR-W2(獲自Sigma)，將鈉鹽轉變為自由酸。在第一次使 用之則，先藉著與3倍體積的下列溶液授拌，接著倒出來 沖洗樹脂：（1)1.0-1.2河含水的11(：1兩次；（2)水兩次； (3)l.(M.2M含水的NaOH兩次；（4)水兩次；（5)10_12M含 水的HC1兩次。在重力流動之下，將沖洗過樹脂在水中的 籲懸洋液包裝在適當尺寸的層析管柱中，得到每毫升納鹽溶 液至少8毫升包裝樹脂。進一步藉著使2倍管柱體積的3 〇_ 3.6M含水HC1，接著是5倍管柱體積的水通過，或直到洗脫 液的傳導性降低至1微-8以下為止，來平衡樹脂。在使用 之後，藉著連續通過下列的使管柱再生：i 〇_i 2M hci_3 倍管柱體積；3.0-3.6M Ηα_2倍管柱體積；水-至少5倍管 柱體積，或直到洗脫液的傳導性降低至i以以下為止，並 儲存在室溫下，在以〇.2_微米過據過的水中。p_s〇s納 鹽溶液可應用在管柱的排液表面（每4毫升包裝樹脂體積大 93060.doc -63 - 1359029 約1¾升）’並對於75-150毫升的樹脂床尺寸，容許在重力 下以大約1-2毫升/分鐘之速率流動。以水洗脫管柱。測試 洗脫液的傳導性。收集10 mS或更高傳導性的溶離份。若 需要更濃縮的·多元酸溶液，可在20-50瓜呂開始收集，但代 價是較南的形成梯度之鹽的喪失。在多鱗酸的案例中，將 收集到的溶液保持冷藏（〇-4°C ) ’直到胺滴定步驟為止，因 為填酸二酯鍵結在低pH質下的水解不穩定性。收集到的洗 脫液將具有低於0_7之pH值（通常約〇.4)，和大約120-200 mS的傳導性。可視需要進行胺滴定步驟，不必延遲，因 為多磷酸在低pH值下的穩定性。使用得自Fisher, p/n 04884的11?1^(：-等級之三乙胺（99.5+%純度）’滴定獲自離子 交換的酸溶液。藉著電位滴定’判定純淨tea的當量濃 度。以一式三份將每等份0.100-毫升的ΤΕΑ(〇.ι 〇〇毫升）溶 解於20毫升水中。以〇.1N HC1標準溶液滴定各等份至5.5-6.0的pH終點（玻璃電極）。計算出的當量濃度（7.〇7N)接近 7.17N之理論值。在pH(玻璃）電極的控制之下，以純淨的 TEA滴定測量體積之多磷酸（Pn)或蔗糖八硫酸（s〇s)溶液。 需要徹底地攪拌分散胺。滴定終點為pH 5.6-6.2。精確地 記錄加入TEA的體積。測量滴定溶液的體積，並以加入之 TEA的體積和當量濃度為基礎，計算TEA的濃度。按照需 要加入水’根據以下的指示調整TEA濃度至所需的 0.5 5±0·05Ν或〇.65±〇·〇3Ν »藉著電位分析使用鈉-選擇性玻 璃電極（Corning) ’判定在所得TEA-Pn或TEA-SOS溶液中 剩餘鈉的量。以19毫升水稀釋1毫升的溶液，並根據電極 93060.doc -64- 1359029 製造者的手冊’使用漸增法判定納濃度。剩餘鈉的量低於 mM通；jj低於0.5福。使用正壓供給，使所得的ΤΕΑ· Ρη或TEA-SOS浴液通過0.2微米的醋酸纖維素滅菌濾紙。 .測量並記錄溶液的終{)11值和滲透壓。我們使用pH甘汞微_ 組合全·玻璃電極進行ρΗ值測量，以及蒸氣壓/露點滲透劑 進行滲透壓測量。將溶液儲存在冰箱十直到使用為止。 3)錯著將脂質的乙醇溶液與形成_梯度的緩衝溶液混合， 製備分散在形成-梯度之緩衝溶液中的脂質。使用乙醇混 合法，將脂質分散在形成_梯度的鹽溶液中。所有的步驟 均在60-65 t下進行。在耐化學的玻璃梨_型燒瓶或試管 中，以大約0.5-0.6]\4〇8?(：之濃度，將脂質溶解於1〇〇%乙 醇USP中。將形成-梯度的鹽溶液（TEA-Pn或TEA-SOS)預先 加溫至60-65 °C，並一次加至乙醇脂質溶液中，藉著打璇 及/或旋轉徹底混合組份。乙醇的終量為大約1〇體積％ ^為 了以超過2.1毫莫耳磷脂之規模來製備，將所得的懸浮液 放在60-65 °C的旋轉式汽化器上，並利用轉動使其形成真 空’直到乙醇的發出停止為止，藉著泡沫形成的中止來顯 不°至於0·1毫莫耳磷脂或更小的規模，在該步驟中不從 脂質分散體中移除乙醇。將所得的脂質懸浮液保持在6〇_ 65C下，並立刻用於擠壓步驟。 4)脂質分散體通過限定孔隙之膜的後續擠壓。對於體積 南達1毫升的脂質懸浮液，我們使用由Avanti Polar Lipids 提供的手工操作之往復式擠壓器。將19毫米執道刻蝕濾紙 膜裝入擠壓器’並藉著金屬加熱塊自動控溫。至於從1到 93060.doc • 65· 1359029 10毫升的體積，我們使用得自Lipex Biomembranes之自動 控溫、氣壓操作的單向流動擠壓器。將25毫米濾紙膜裝入 擠壓器。在60-65。(：下重複地擠壓脂質懸浮液，適當地使 用手工給料或氬氣壓，通過一系列2個具有1〇〇毫微米、8〇 毫微米或50毫微米之票面孔隙尺寸的疊層聚碳酸酯膜遽紙 (得自 Corning-Nuclepore和 Osmonics Corp·的濾紙均同樣適 合）。在對脂質體尺寸的影響感興趣之處，在1〇〇毫微米、 80毫微米或50毫微米步驟處停止擠壓。下文指出每個實驗 所使用之濾紙的正確類型和撥壓次數。將擠壓過的脂質體 保持在60-65eC下大約15分鐘，並在冰浴中快速冷卻至2_4 C。在冰浴甲大約丨5分鐘之後，容許脂質體達到室溫。 5)移除脂質體外形成_梯度的緩衝溶液，並將脂質體移到 藥物-裝載緩衝溶液中。使用尺寸排阻層析法（SEC)，移除 未包膠的形成-梯度之鹽，並將脂質體移至藥物裝載緩衝 溶液中。在遞增的製造中，可使用其他可按比例調整之步 驟的切向流過濾、空心絲透析。其在藉著陰離子_交換樹 月曰（例如Dowex-Ι或Dowex-2四級銨交聯聚苯乙烯小珠）處理 脂質體，確保完全移除脂質體外之多聚陰離子方面是有利 的。藥物-裝載緩衝溶液含有50克/公升無水右旋糖1；31>， 以及5 mM在水中之組織_培養檢定的hepeS，以NaOH調整 到PH6.5。通過〇.2微米尼龍濾紙（Whatman)，真空過濾緩 衝’谷液。在帶有續脂糖CL-4B(Pharmacia)的管柱上，層析 擠壓過的脂質體，並以藥物_裝載缓衝溶液洗脫。以洗脫 液濁度為基礎，收集出現在空隙體積溶離份中的脂質體， 93060.doc -66- 1359029 應用大約2x的體積。根據實例7〇，測定洗脫出之脂質體的 填脂，秸著QELS測定顆粒尺寸，並儲存在4_6。〇下。 6) 與藥物一起培養脂質體。在與脂質體混合之前，才藉 著將伊立替康鹽酸鹽溶解於水中，達到2〇毫克/毫升藥物 鹼的浪度，製備CPT-11 (伊立替康鹽酸鹽）的母液。該溶液 的pH值是在4.0到5.0之間。使用正壓，通過〇2微米聚鲢砜 (PES)無囷；慮紙過濾藥物溶液。在室溫下，將在步驟$中產 生的一#份在藥物裝載緩衝溶液中之脂質體與母伊立替康 溶液混合，達到範圍在每毫莫耳脂質體磷脂〇 15_〇·55克藥 物中的藥物/脂質比例。在下文指示適合的特定輸入藥物/ 脂質比例》以1Μ NaOH將混合物的ρΗ值調整到6.5，在58_ 62 C之自動控溫的水浴上，培養在玻璃小瓶中的混合物， 慢慢地攪拌30-45分鐘，在冰水浴中迅速冷卻，並 留在該溫度下15分鐘。然後為了下一個步驟（移除未包膠 的藥物並移到儲存緩衝溶液内），容許脂質體加溫至室 溫。該步驟結果在研究藥物/脂質比例的整體範圍中，產 生超過95%的包膠效力，通常是98·1〇〇0/〇。 7) 移除未包膠的CPT-11，將脂質體移至儲存緩衝溶液 内，最後過濾並儲存。使用尺寸排阻層析法，移除未包膠 的藥物，並將脂質體移到儲存緩衝溶液内。儲存緩衝溶液 含有 20 mM HEPES、135 mM NaCl，pH 6.5(以 Na0H 調整） 與水，並在使用前以〇·2微米真空-過濾。基本上按照在上 文步驟2中的描述，在交聯葡聚糖
Pharmacia Biotech)上進行凝膠·層析法。針對脂質體和 93060.doc -67· 1359029 CPT-l 1(藉著分光光度分析，參見實例7〇和71) ’測定從管 柱中洗脫出CPT- 11脂質體（空隙體積溶離份），並藉著QELS 測定體積-重量的平均顆粒尺寸。若需要，將藥物濃度調 整為在2.0-4.0毫克/毫升之範圍内。通過〇 2微米聚醚砜無 菌濾紙過濾脂質體，並以無菌的方式分散到無菌的聚丙烯 小瓶（Coming Cryo-Vials)或PTFE-劃線、有螺紋瓶蓋之硼 妙4-毫升玻璃小瓶中，至大約小瓶體積的7〇 8〇0/〇。以無菌 的方式關閉小瓶（在空氣中）、標示，並儲存在4_6°c下。 實例12.藥物/脂質比例對藥物裝載效率，以及含有 TEA-Pn之脂質體在活體内的藥物保留的影響 依據在實例11中的程序，製備陷入TEA_Pn之0.65N水溶 液’ pH 6.1滲透壓531毫莫耳/公斤的脂質體。通過兩個疊 層的100毫微米孔隙尺寸之聚碳酸酯濾紙，擠壓脂質分散 體10次。脂質體脂質基質亦以〇·5毫居里/毫莫耳磷脂，包 含[3H]-CHE。在藥物裝載之前的脂質體尺寸為985±34 3毫 微米。以200、300、400和500毫克CPT-11/毫莫耳磷脂的 最初藥物-對-磷脂比例，裝載脂質體。分別藉著根據實例 71的分光光度分析，以及實例72之磷脂萃取-消化藍磷鉬 酸鹽分光光度測定’判定在脂質體中的藥物和脂質含量。 欲評估在活體内的藥物釋放速率，依循實例8的方法。 以5毫克CPT-11 /公斤之劑量，經由尾靜脈將脂質體注射到 6-週齡雌性Swiss Webster老鼠（體重18-22克）。在注射後8 和24小時，麻醉三組中的老鼠，並經由開放心臟穿刺使其 無血。將血液與0.4毫升冰冷的0.04%在PBS中之EDTA混 93060.doc •68· 1359029 合，藉著離心分離血球細胞，並藉著在實例71中描述的分 光光度分析’測量cpt- 11的血漿濃度。藉著使用驟冷校 正液體閃爍計數測3 [3H]-CHE的量，來判定脂質，並藉著 將所判定之藥物/脂質比例除以在注射脂質體中的藥物/脂 質比例’計算仍留在脂質體中之藥物的量。因為自由CPT_ 11的快速血液清除’結果為低血液含量，我們假定所有測 定的藥物均以脂質體形式。 在表8中提交結果。在各組之間藥物保留的差異並不是 ® 在統計學上顯著的。由這些研究的結果，我們推論增加藥 物裝載至而達500宅克/毫莫耳對藥物裝載或在活體内的穩 定性將沒有不利的影響》進一步的研究採用該比例。 表藥物/脂質比例對藥物裝載和在活體内藥物保留在 伊立替康TEA-Pn脂質體中的影響（平均值土標準差） 藥物/脂質比例，毫克/毫莫耳磷脂 藥物保留在脂質體中，注射前值的 % 輸入 輸出 裝載％ 在8小時之後 在24小時之後 200 208.4 104.2 54.6+9.9 9.72±2.23 300 286.3 95.4 85.2±14.3 14.52+2.51 400 348.8 87.2 81.5+18.3 17.31±6.14 500 518.9 103.8 66.8±19.6 13.47±1.44 實例13.將CPT-11裝載到含有TEA-SOS之脂質體的藥 物裝載效率：脂質體尺寸和在活體内藥物保留在老鼠中 的影響 使用具有0.643N TEA-SOS, pH5.7，滲透壓530毫莫耳/公 斤的形成梯度溶液，根據實例11來製備含有陷入溶液的脂 質體。通過兩個具有50毫微米、80毫微米或1〇〇毫微米之 93060.doc -69· 1359029 孔隙尺寸的疊層聚碳酸酯膜濾紙，擠壓脂質分散體丨〇次。 脂質體脂質基質亦包含1.5毫居里/毫莫耳脂質體磷脂的 [3H]-CHE。藉著動力學光散射判定脂質體尺寸。以大約 550毫克伊立替康/毫莫耳碌脂的最初藥物·對填脂比例， 以CPT-11裝載脂質體。藉著qels定出藥物裝載的脂質體 尺寸，並按照在實例70和71中的描述測定。 經由尾靜脈，以10毫克/公斤之劑量，將這些CpT_丨i脂 質體調配物注射到_性5你183\^匕3161*老鼠（8-1〇週齡，平均 27-30克）内。在24小時時犧牲老鼠，並收集血液，按照在 實例11中的分析CPT-11和脂質體脂質。在表9中概述結 果。 表9.伊立替康裝載和在活體内在TEA_s〇s脂質體中的 藥物保留 擠壓膜孔隙 尺寸，毫微 米 脂質體尺寸， 毫微米 平均值SD 藥物裝載，毫克 伊立替康/毫莫耳 磷脂 在24小時之後，在 老鼠中保留在脂質 體中的藥物，注射 前值的％ 50 87.6±28.1 579.3±24.2 79.2±3.8 80 98.5±15.1 571.1±69_7 82.6±2.1 100 110.8±25.2 567.7±37.7 86.2±2.7 驚人的是，帶有蔗糖八硫酸之三乙銨鹽，一種非聚合多 陰離子化的有機羥基化之有機化合物（糖）的脂質體，與帶 有夕陰離子化聚合物（多磷酸）的類似脂質體相比較，戲劇 化地提供了較佳的（4_5倍）在活體内在脂質體中的藥物保 留。. 93060.doc •70· 1359029 實例I4·裝載CPT-11之SOS-ΤΕΑ脂質體在大鼠中的血 液藥物動力學 按照在實例12中的描述，製備脂質體（100毫微米擠壓膜 孔隙尺寸）。以10毫克CPT-11/公斤之劑量（17.6微莫耳的碟 脂/公斤）’將脂質體靜脈内投與兩隻帶有留置中央靜脈套 之9週齡的雌性SpragUe Dawley大鼠（Harlan)(體重大約 200克）。在指定的時間點採取血液試樣，並按照實例9分 析藥物和脂質體脂質内含量。在每個時間點，以注射脂質 劑量/毫升企漿的％和藥物留在脂質體内的％來表示數據， 對注射後時間進行作圖，並藉著最吻合單一指數動力學模 式’計算脂質體脂質的半衰期，以及從脂質體中釋放之藥 物的半衰期（圖5)。從裝載CPT-11之TEA-SOS脂質體中釋 放的藥物之半衰期為56.8小時，比類似TEA-Pn脂質體的長 很多。 實例15.自由CPT-11，以及包膠在含有TEA-Ρη和TEA-SOS之脂質體内的CPT-11，在帶有人類結腸癌（ΗΤ-29) 之皮下異種移植的無胸腺裸鼠中的抗腫瘤活性。 按照實例11，使用帶有0.65M TEA. PH 6_1和滲透壓531 毫莫耳/公斤的TEA-Pn溶液，或帶有0.643M TEA，pH 5.7和 滲透壓530毫莫耳/公斤的TEA_s〇s溶液，製備脂質體。擠 壓包括通過兩個具有100毫微米之孔隙尺寸的疊層聚碳酸 醋膜10次》所得的TEA_Pn和TEA_s〇S脂質體分別具有 112·3±15.5毫微米和12〇·5±42·5毫微米之尺寸（尺寸分布的 平均值士SD)。以500毫克/毫微米之藥物/磷脂比例，以 93060.doc 71 1359029 CPT-l 1裝載脂質體。所知的脂質體’ TEA-Pn和TEA-SOS 調配物分別具有465.6土26.5(93%裝載效率）和499.9±22.5毫 克（100%裝載效率）之CPT-11/毫莫耳磷脂的藥物内含量。 HT-29 細胞係獲自 American Type Culture collection,
Rockvme, MD，並根據供應者的建議，在37〇c，5% c〇2 下，在補充有10%胎牛血清、50單位/毫升青黴素G和5〇毫 克/毫升硫酸鏈黴素的DMEM培養基中繁殖。從ChaHes River獲得NCR nu/nu同種接合子的無胸腺雄裸鼠（6週齡， ® 重至少16公克）。在老鼠右側面，皮下接種〇1毫升含有懸 浮在無抗生素之生長培養基中的5χ1〇6個細胞的懸浮液。 在動物具有尺寸在150立方毫米到3〇〇立方毫米之間的腫瘤 之後11天，將其分派到根據下列方法的治療組中。根據腫 瘤的尺寸來排列動物，並隨著腫瘤尺寸的降低分成6個種 類。藉著從每種尺寸中隨機選出一隻動物，形成u隻動物 /組的八個治療組，使得在每個治療組中同等地出現所有 φ 的腫瘤尺寸。從第13天開始，動物以4天之間隔，接受四 次下列製備物的尾靜脈注射：υ對照組（HEpES_緩衝之生 理现pH 6.5)，2)自由CPT-11 50毫克/公斤，以在未經緩 衝之生理鹽水中新近製備的5毫克/毫升溶液投與；”每次 注射25毫克/公斤的TEA-Pn脂質體CPT.U ; 4)每次注射5〇 毫克/公斤的TEA_Pn脂質體CPT_U ; 5)每次注射以毫克/公 斤的TEA SOS月曰質體CPT_U ; 6)每次注射5〇毫克/公斤的 'TEA-Sos脂質體CpT_Ue按照在實例1〇中的描述，每週兩 次監視動物重和腫瘤尺寸。從動物重中減去腫瘤重，結果 93060.doc •72- 1359029 獲得動物的體重。在腫瘤接種之後，觀察動物60天。當在 各組中的腫瘤達到老鼠體重的20%時，將在該組中的動物 安樂死。在一些組別中有完全的腫瘤退化，並在研究結束 .時 >又有腫瘤再生的徵兆。從這些動物中枚集得自腫瘤接種 處的組織，並保存以供進行殘餘腫瘤細胞的病理學分析。 在圖6和7中出示這些研究的結果。自由cpt_丨丨對腫瘤生 長只有最少的影響。所有的脂質體均有重大的影響，結果 導致稍後腫瘤退化，接著在大多數老鼠中再生。在tea— _ 〜和TEA-S〇S CPT-11脂質體兩者令，5〇毫克/公斤劑量比 25毫克/公斤劑量更有效。從腫瘤尺寸資料（圖7)計算出平 均腫瘤變兩倍的時間為：對照組_4.2天；自由藥物，5〇毫 克/公斤_4.8天；TEA-Pn脂質體藥物，25毫克/公斤-43 6 天’ TEA-Pn脂質體藥物’ 50毫克/公斤·47·5天；TEA-SOS 月a質體藥物25毫克/公斤_48.2天，和丁EA-SOS脂質體藥物 5〇毫克/公斤-超過56天（未達到變兩倍的時間）^因此，根 Φ 據本發明製備的脂質體cpt- 11是比以相同劑量和計晝提供 之自由藥物更有活性至少大約10•倍。意外的是，TEA_ SOS CPT-11脂質體在降低腫瘤生長上，I然比以相同劑量 投與之TEA-Pn CPT-11脂質體更有效。而在以每次注射5〇 . 毫克/公斤的自由藥物和TES-Pn脂質體藥物處理之組中， 沒有動物無腫瘤再生，在接受25毫克/公斤每種脂質體調 配物之組中，一隻動物（9 1%)在研究結束時沒有腫瘤，而 在接受50毫克/公斤TEA_s〇^&質體cpT_n調配物之組 中，在研究結束時，4隻（36.4%)沒有腫瘤的動物沒有再生 93060.doc •73· 1359029 的徵兆。 藥物顯不出一些毒性。接受自由CPT_丨丨，但不是脂質體 CPT-11的動物，在藥物注射後大約丨小時體驗到暫時的病 態（喪失警覺性、駝背、皮毛起皺、降低移動性）。接受自 由CPT-11的動物在治療期間遭受永久大約6%的體重喪 失，且未恢復。接受兩種脂質體CPT-11調配物的動物在第 二和第三次注射之間，體驗到短暫的體重喪失，平均為治 療則值的大約5%(25毫克/公斤）或9%(5〇毫克/公斤），並最 •後達到正常的體重。因此’脂質體藥物的毒性並未比自由 (非-脂質體）藥物的更高，但脂質體藥物的效力實質上是更 尚的。當藥物治療結束時，逆轉體重喪失，而所有的動物 均恢復其體重，沒有末期病態或中毒死亡。以後，動物隨 著腫瘤退化而增加體重。在生理鹽水對照組，動物發展出 大腫瘤，顯然體驗到因與腫瘤有關之病態的體重喪失。整 體而言，證明其中將藥物裝載於預先_陷入多陰離子化之 ^ 糖（蔗糖八硫酸）之脂質體内的脂質體藥物調配物，是最有 效的’且具有比非-脂質體藥物更低的毒性。 實例16·自由和脂質體CPT-11在老鼠中的毒性 藉著在單一靜脈内注射合格的（免疫勝任的）老鼠之後， . 判定最大耐受劑量（MTD)，比較自由CPT-11和根據本發明 製備之脂質體-包膠CPT_丨丨的急性毒性。 使用下列的材料： i)cpt-ii(伊立替康鹽酸鹽）製備物，藉著1{1>]1(：知其具有 伊立替康鹽酸鹽98.9%和溼度7·6。/。。在本研究中，以”這樣 93060.doc -74- 1359029 的”基礎製備藥物調配物，不修正溼度内含量或伊立替康 驗内含量。 2)按照實例11製備脂質體CPT-ll(Ls-CPT-ll),使用 DSPC 200毫升比率，膽固醇⑴莫耳比率，pEG DspE !莫 耳比率的脂質基質；陷入溶液TEA_s〇s具有〇 65M tea， pH 6.4 ;在60°C下30分鐘，以500毫克藥物/毫莫耳磷脂的 輸入藥物/脂質比例，在5 mM HEPES緩衝溶液、5%右旋 糖，pH 6.5中將藥物裝載到脂質體内。裝載效率>99%。脂 質體尺寸（體積平均值士標準差，藉著QELS) : 1〇1±37毫微 米。在媒劑中調配脂質體，2〇 mM HEpES_Na、
NaC I ’ pH 6.5。在下表中陳述在注射調配物中的藥物濃 度》 3) 自由CPT-11溶液。藉著以22毫克/毫升，將伊立替康鹽 酉文鹽/合解於5 %含水右旋糖中，製備自由藥物母液，並藉 著0.2微米過濾滅菌。在注射之前以無菌的5%右旋糖稀釋 該母液^ 4) 動物。雌性Swiss Webster老鼠6-8週齡，得自Harlan， USA。 ’ MTD 判定通常遵循由 United States Ν_η&ι
Institute Developmental Therapeutics Pr〇gram採納的草 案。該草案包括下列三個步驟： 步驟1):利用1_8之劑量升高因數的連續-搜尋步驟。以 漸増劑量的自由或脂質體伊立替康注射到每組兩隻動物的 尾靜脈内，從60毫克/公斤的劑量開始，並以18之劑量升 93060.d〇c -75- 1359029 高因數持續，直到在任何動物中觀察到急性死亡或末期病 態（在注射後>1天内）為止。記錄在致死/末期病態劑量下一 個步驟的劑量。 步驟2):利用1.15之劑量升高因數的連續·搜尋步驟。以 漸增劑量的自由或脂質體伊立替康注射到每組兩隻動物的 尾靜脈内，從在步驟丨中記錄的劑量開始，並以115之劑 量升高因數持續，直到在任何動物中觀察到急性死亡或末 期病態（在注射後天内）為止。在試驗性MTD記錄在致死/ 末期病態劑量下一個步驟的劑量。 步驟3):批准步驟。以在步驟2中判定的試驗性mtd， 將自由或脂質體伊立替康靜脈注射（尾靜脈）到每組5隻動物 中。追蹤動物7天，每週兩次記錄動物體重，並與注射前 體重相比較。觀察動物的一般健康狀況（警覺性、修飾、 進食、排泄、皮膚、皮毛和黏膜狀況、移動、呼吸、姿 勢）。若在觀察期間沒有致死、進行的病態或超過15%注射 前體重的體重喪失’則認為該劑量被批准為急性單一注射 的MTD。若出現任何的這些影響，便以因數【^的下一個 較低劑量重複實驗。 欲獲得批准步驟的額外統計值，追蹤存活動物的體重動 力學持續兩達注射後"天。不可能投與超過324毫克/公斤 之脂質體伊立替康的劑量，因為濃度和注射體積的限帝卜 在表1 〇中提供結果。 表10. CPT-11調配物在老鼠中的町〇搜尋研办 結果 九 93060.doc -76· 1359029 步驟1·按1.8之因數增加劑量 藥物 注射劑量 (毫克/ 公斤） 藥物濃度 (毫克/ 毫升） 注射體 積(徵升） 老鼠 數目 動物體重， 0 1 (克）（克) 在注射後的天數： 2 4 5 (克）（克）（克） 6 (克） 7 (克） 11 (克） Ls-CPTll 60 8 150 1 19.2 18.0 nd 20.3 20.6 20.6 20.0 19.7 2 19.7 19.3 nd 20.6 20.4 19.6 19.7 20.7 100 12 165 1 19.5 18.6 nd 19.6 20.0 20.1 19.4 19.9 r 2 20.1 18.9 nd 20.2 21.5 22.2 21,8 22.5 180 22 165 1 19.4 18.4 nd 18.9 19.7 20.5 19.5 20.5 2 20.0 19-3 nd 19.6 20.6 21.4 21.6 21.7 324 30.6 210 1 21.8 21.2 21.2 nd 20.2 nd 20.2 nd 2 21.6 20.4 21.3 nd 20.8 nd 21.4 nd 自由CPT11 60 8 150 1 20.6 20.4 nd 22.1 22.1 22.2 22.0 22.5 2 19.5 19.1 nd 20.2 20.3 20.4 20.5 21.1 100 12 165 1 19J在注射之後N2分鐘死亡 2 20.1在注射之後1-2分鐘死亡 3 19.9在注射之後1-2分鐘死亡 在注射之後，所有以自由CPT1 1治療的老鼠均生病，呼吸 短促大約1小時，然後恢復。 在注射之後，所有以Ls-CPTll治療的老鼠均是正常的。 步驟2.按1.1 5之因數增加劑量 動物體重，在注射後的天數： 自由CPT11 注射劑量 (毫克/ 公斤） 藥物濃度 (毫克/ 毫升） 注射體 積(微升） 動物 數目 〇 (克） 1 (克） 2 (克） 5 (克） 7 (克）
ο ο ο ο 6 7 8 9 8 8 8128 0 5 0 0 5 5 7 0 5 2 34567891011 19.9 20.0 20.9 19.9 21.3 19.5 18.7 19.4 18.8 18.9 20.9 20.0 20,6 19.3 20.4 22.3 21.8 22.4 22.4 22:8 20.6 19.9 20.1 19.9 20.9 20.6 20.8 21.1 20.7 21.4 22.3在注射之後丨-2分鐘死亡 22.4在注射之後1-2分鐘死亡 20.6在注射之後1-2分鐘死亡 步驟3 .批准 動物體重，在注射後的天數： 藥物 注射劑量 (毫克/ 公斤） 藥物濃度 (毫克/ 毫升） 注射體 積(微升） 動物 數目 0 (克） 3 (克） 5 (克） 7 (克） 自由CPT11 80 8 200 1 20.2 19.3 20.0 21.7 ' 2 20.5 20.6 20.5 21.2 3 20.7 20.6 20.8 21.9 4 20.8 21.4 22.1 23.0 5 21.9 21.9 21.6 21.5 Ls-CPTll 324 36.5 180 6 21.0 20.0 20.1 20.2 7 20.4 20.4 20.2 19.2 ·- 8 20.4 19.8 20.3 20.7 9 20.9 19.9 20.5 21.5 10 20.7 19.5 19.8 20.2 -77 - 93060.doc 1359029 因此，自由CPT-11的MTD為80毫克/公斤，但驚人的是 即使是在324毫克/公斤的最高投藥劑量，仍未達到脂質體 CPT_11的MTD。因此，根據本發明以脂質體包膠CPT-11， 降低了藥物毒性至少4 -倍。 實例1*7.裝載CPT-11之TEA-SOS脂質體對抗藥物漏出 的儲存穩定性 使用TEA-SOS法（實例11)，以500-550毫克/毫莫耳磷脂 的藥物/脂質輸入比例製備五批脂質體CPT-11。使用膜擠 壓’通過具有在下表中指示之80毫微米或100毫微米孔隙 尺寸的聚碳酸酯膜來製備脂質體。以〇.2_微米濾紙滅菌脂 質體’並在 135 mM NaCl，20 mM HEPES-Na，Ph 6.5(儲存 緩衝溶液）中以3.4·14·5毫克/毫升之CPT-11儲存在4_8〇c 下。在指示的儲存時間之後，在交聯葡聚糖〇_75上藉著凝 膠-層析移除漏出的藥物’使用儲存緩衝溶液作為洗脫 液。按照在實例70和71中的描述，分別使用分光光度分析 法和酸消化·藍磷鉬酸鹽法測定在凝膠-層析之前和之後， 在月曰質體中的藥物和罐脂濃度。根據本發明製備的CPT-11 月曰質體疋非常穩定的。在儲存期間從這些脂質體中漏出的 CPT-11，在6個月内低於5%(表10)。 表丨1.在儲存期間CPT-11脂質體的包膠穩定性（數據為平 均值土SE)。 脂質體批號 梅壓孔隙尺 CPT-11 濃度， 毫克/毫升 儲存時 間，月 藥物保持"^厂 膠的％ - 1〇^''''-- 3.44±0.06 6 99.02+3.77 2 "8〇~"— · 7.88±0.19 6 102.38±4.78 93060.doc -78- 1359029 3 100 4.57+0.06 6 96.38±4.69 4 100 4.62±0.11 6 95.72±4.36 5 80 14.52±0.42 3 103.4+2.92 實例18.以拓撲太肯裝載脂質體 按照實例11製備陷入TEA-Pn溶液和TEA-SOS溶液的脂質 體。在與脂質體混合之前，藉著以15-20毫克/毫升將拓撲 太肯鹽酸鹽溶解於水中，立刻製備拓撲太肯鹽酸鹽 (GlaxoSmithKline, PA, USA)的母液，計算實際的拓撲太肯 HC1内含量。以IN HC1將pH值調整到3.0。使用正壓通過 | 0.2微米聚醚颯（PES)無菌濾紙過濾藥物溶液。在室溫下， 在藥物裝載缓衝溶液中，將一等份含有TEA-Pn或TEA-SOS的脂質體與母拓撲太肯HC1溶液混合，達到在範圍 0.1 5-0.45克/毫莫耳脂質體磷脂中的藥物/脂質輸入比例。 較佳的比例是每毫莫耳脂質體磷脂0.35克拓撲太肯HC1。 在自動控溫於55-62 °C的水浴中培養在玻璃容器中的混合 物，慢慢地攪動30-60分鐘，在冰水浴（0-2 °C )中快速冷 卻，並保持在該溫度下5-1 5分鐘。該步驟結果得到89-90°/〇(TEA-Pn梯度）或 97-100%(TEA-SOS梯度）的包膠效率。 使用尺寸排阻層析法，移除未包膠的拓撲太肯，並將脂質 體移到儲存緩衝溶液中。在施用於管柱之前，藉著與1/20 體積的2.88M含水氯化鈉混合，並培養該混合物大約1 5分 ' 鐘，增加脂質體製備物的離子強度。我們意外地發現在裝 ’ 載期間（通常相當於低於20 mM NaCl)，將脂質體介質的離 子強度從低值調整到20 mM NaCl以上的較高值，而較佳的 是50 mM NaCl和以上，改善了未包膠藥物的移除並增加了 93060.doc -79- 裝載拓撲太月之脂質體對抗凝集的穩定性，可能是藉著使 與膜結合之拓撲太肯更容易移除，與包移在脂質體内部的 藥物相反。其餘的程序依據實例11，步驟7。至於結果， 參見下文的表12。 實例19.製備拓撲太肯的抗-HERS-免疫脂質體調配物 藉著將拓撲太肯脂質體與抗-HER2單鏈人類Fv抗體片段 F5(因其高度内化至HER2-過度表現之細胞内而從噬菌體展 示庫中被選出來）共軛（Poul等人，2000，J. M〇lecular Biology，第301，第1149-1161頁），製備可明確地被過度 表現HER2(C-ErbB-2)表面受體酪胺酸激酶致癌蛋白 (oncoprotein)之癌細胞專一内化的拓撲太肯免疫脂質體。 F5是27-KDa蛋白質’其與HER2受體的細胞外功能部位結 合，具有大約150 nM的親和力，引起快速内化（Neve等 人，2001，Biophys. Biochim. Res. Commun.第 280，第 274-279頁）。至於脂質體共軛，通常依據美國專利第 6,210,707號和 Nielsen等人（2002)，Biochim. Biophys. Acta 第1591，第109-118頁的方法。首先製備F5的親水性脂質 聚合物共軛物。F5胺基酸鏈的C-終端具有添加的終端半耽 胺酸基團（F5Cys)。在大腸桿菌中表現F5Cys構築體，並藉 著蛋白質A管柱層析法從細菌的溶胞產物中分離。將蛋白 質A洗脫溶離份吸附在陰離子-交換樹脂上，移除熱原和宿 主DNA，並以硫醇還原劑處理，釋放終端半胱胺酸的硫醇 基。藉著離子交換樹脂，使用SP瓊脂糖速流（Amersham Pharmacia)，進一步純化還原的F5Cys。使經過純化的蛋白 93060.doc -80· 1359029 質與硫醇-反應性脂質-聚（乙二醇）交聯劑，N-(3-(N-順丁稀 二醯亞胺）丙炔醯胺基）-聚（氧乙烯）·氧羰基）_1，2·二硬脂醯 基填酯酿乙醇胺（Mal-PEG-DSPE)共辆，其為peg的衍生 物’具有分子莖2,000(圖4.1) ’在商業上由Avanti p〇iar Lipids，Inc.，Alabama, USA生產。可在含水的緩衝溶液 中’以1:4之莫耳比例培養蛋白質和交聯劑，並以1 半 胱胺酸使未-反應的交聯劑驟冷。在反應期間，F5Cys的終 端半胱胺酸與交聯劑的順丁烯二醯亞胺基團共價附接。所 籲 得的F5-pEG-DSPE共軛物以膠束之形式而為水溶性的，具 有高表觀分子量（500-850 KDa)，並藉著尺寸排阻層析法從 未反應的蛋白質（大約25 %)中分離出來。藉著uv分光光度 分析在2 8 0毫微米處判定在經過純化之共桃物中的蛋白質 含量’並使用與磷脂定量所使用之相同的分光光度分析法 (參見貫例70)，測定交聯劑的含量。經過純化之 DSPE共軛物在水中是穩定的，完全.具有免疫反應性，且 在6 5 C下可穩定對抗變性和反應性喪失至少1小時，而在 ® 37。。下至少3個月。 欲製備抗-HER2免疫脂質體拓撲太青，以每i微莫耳磷脂 1 5微克蛋白質的比例，在含水生理鹽水緩衝溶液中將實例 18之裝載拓撲太肯的脂質體與f5_PEG-DSPE混合（每個脂 質體大約45個F5的副本）。在60。〇下培養該混合物4〇分 ，.鐘，在冰上冷卻，並在帶有瓊脂糖CL_4B(交聯的4%瓊脂 . 糖小珠，Amersham Pharmacia)的管柱上層析，移除殘餘 的膠束共軛物、未共軛的蛋白質，以及任何可能已經在培 93060.doc 1359029 養期間釋放的脂質體外藥物之痕跡。以5 mM HEPES-144 mM NaCl緩衝溶液Ph 7.4洗脫帶有倂入F5-PEG-DSPE5之膜 的脂質體，在管柱的空隙容積中收集，滅菌-過濾，並分 配儲存（4-6°C)。倂入F5之脂質體的量，通常是>添加共軛 物的80%。其藉著脂質體的SDS-PAGE，並藉著光密度分 析法，以考馬斯藍染色之F5譜帶的定量來判定之。同樣地 對非-標靶脂質體判定在免疫脂質體製備物中的藥物和脂 質濃度。在表12中概述拓撲太肯脂質體和F5-免疫脂質體 的特性（實例18-19)。 表12.拓撲太肯脂質體和免疫脂質體的特徵 陷入脂 質體的 鹽 F5 scFv 附 接： 藥物/脂質比例，克/莫耳 鱗脂 輸入 輸出 包膠％ 脂質體尺寸， 平均值±SD， 毫微米 TEA-Pn 無 173.6 155.2+5.9 89.4+3.4% 96.4+38.7 TEA-Pn 有 173.6 156.2+5.2 90.0±3.0% 96.2+33.8 TEA- SOS 益 347.2 340.8+14.7 98.2±4.2°/〇 99.1±32.6 實例20.裝載緩衝溶液pH值和藥物/脂質比例對將拓撲 太青裝載到脂質體内的影響 使用乙醇注射法（實例18)，製備陷入0·5Ν TEA-Pn, pH 6.2、滲透壓413毫莫耳/公斤的脂質體（08卩(：/(：11〇1/?£0-DSPE，3:2:0.015莫耳比例），通過兩個具有100毫微米孔隙 尺寸的疊層聚碳酸酯濾紙擠壓5次，並通過具有50毫微米 扎隙尺寸的擠壓10次。裝載緩衝溶液是5 mM MES、50克/ 公升右旋糖，調整到在範圍5.0-6.5中的各種pH值。藉著 QELS判定脂質體尺寸為73.1±21.3毫微米。藉著在裝載緩 93060.doc •82 - 1359029 衝溶液中，以100毫克/毫莫耳的輸入藥物-對-磷脂比例， 混合拓撲太肯母液（20毫克/毫升）與脂質體，在60°c下培養 該混合物45分鐘，裝載脂質體，在冰上驟冷15分鐘，並使 用交聯葡聚糖G-75管柱移除未包膠的藥物，以20 mM HEPES，135 mM NaCl，pH 6.5洗脫。藉著分光光度分析（實 例70和71)，定量拓撲太肯和磷脂。結果（表13)指出在pH 5.5-6.5的範圍中，拓撲太肯的裝載幾乎是定量的。 表13.裝載緩衝溶液pH值對拓撲太肯包膠至陷入TEA-Pn 之脂質體内的影響 裝載緩衝溶液pH值 包膠％ 5.0 50.1±2.1 5.5 97.2±8.1 6.0 115.5±15.0 6.5 102.1±8.1 亦研究藥物對脂質體比例（0.1 5-0.45毫克/毫莫耳磷脂）對 裝載效率的影響。如上製備陷入TEA-Pn(0.5M TEA，pH 5.8，滲透壓480毫莫耳/公斤）的脂質體，除了終擠壓步驟 為通過兩個0.08微米的聚碳酸酯濾紙10次之外。裝載是在 pH 6.5之下。藉著QELS，脂質體尺寸為93.1± 15.1毫微 米。結果（表14)顯示藥物裝載效率超過85%，超過研究的 藥物/脂質比例之整體範圍。 表14.藥物/脂質比例對將拓撲太肯包膠到含有TEA-Pn之 脂質體内的效率的影響 拓撲太肯/填脂比例，毫克/毫莫耳 包膠％(平均值±8丑） 輸入比例 輸出比例(在裝載之後） 168.2 166.9+11.1 99.2±6.6 224.4 232.5±47.6 103.7+21.2 93060.doc -83- 1359029 280.3 253.5±19.8 90.4±7.0 —336.4 298.3+18.0 88.7+5.3 392.5 361.2+36.8 92.0+9.4 *448.5 394.9+29.5 88.0+6.6 實例21.拓撲太肯脂質體在活體外，在血漿存在下的穩 定性 按照在實例18中描述的，製備陷入〇.5N TEA-Pn，pH 6.2， 滲透壓413毫莫耳/公斤的脂質體（DSPC/Chol/ PEG-DSPE， 莫耳比例3 :2:0.015)。藉著通過兩個1 〇 〇毫微米孔隙尺寸的 Β 聚碳酸酯濾紙擠壓10次’產生具有96.4±29.3毫微米的脂質 體。為了定量血漿中的脂質體脂質，以〇_ 5微居里/微莫耳 DCPC將[3H]-CHE納入月旨質溶液中。在pH 6.0，58°C下， 以150毫克/毫莫耳的藥物/磷脂比例，裝載拓撲太肯45分 鐘。裝載效率為148.48±10.26微克拓撲太肯/微莫耳碟脂 (99.0±6.8〇/〇)。 在多孔微量透析裝置（Spectra-Por MicroDialyzer 10-孔 Spectrum，USA)中’將脂質體與50%人類血漿一起培養。 # 藉著等體積的含有0.02%疊氮化鈉之HEPES-緩衝的生理鹽 水（20 mM HEPES，135 mM NaCM)，pH 6·5 稀釋人類捐贈者 ▲•漿’並裝入透析器的下方储藏室内（32毫升）。藉著具有 30毫微米孔隙尺寸的聚碳酸酯膜將孔（〇 4毫升）與儲藏室分 開足以使血·漿蛋白質和小分子自由通過，但脂質體則 否。將脂質體與經過計算之含量的血漿和HEPES•緩衝之 生理鹽水混合，達到2.5 mM磷脂和50體積❶/。血漿的濃度。 在37°C下培養該裝置，並慢慢地攪拌儲藏室的内容物。在 93060.doc •84- 1359029 培養8小時之後，將下方儲藏室的内容物更換新鮮的鄉 =漿:在蚊的時間點（參見下文），從孔中取出5〇•微升等 伤，並在含有2.2-2.4毫升瓊脂糖CL_2B的管柱上進行層 ， 析，以HEPES-緩衝之生理貞水洗脫，&離脂質體與血聚 蛋白質和自由的藥物。在空隙容積溶離份中收集脂質體。 在使血漿試樣溶解於90%含水異丙醇·〇 1N HC1中之後，藉 著螢光分析定量拓撲太肯，使用在384毫微米處激發和在 524毫微米處發射，並藉著[3H]_CHE的閃爍計數定量脂質 •(驟冷校正）。將在該時間判定的藥物-對-脂質比例與在培 養之前的原始比例相比較，獲得在每個時間點仍維持包膠 之拓撲太肯的％。在培養8小時之後，藥物仍維持在脂質 體中的量是大約其原始值的55%(表15)。 表15.在37°C下在50%人類血漿中，拓撲太肯從被丁EA_ Pn梯度裝載之脂質體中的活體外釋放 培養時間，小時 藥物維持包膠的％ 1 95.5+5.4 4 76.8+7.3 8 55.9+4.1 24 55.4±16.8 實例22.以各種藥物/脂質比例陷入TEA-Pn梯度的拓撲太 肯脂質體：在活體内的藥物保留和在老鼠中的循環壽命 按照實例18，使用通過兩個疊層1 〇 〇毫微米孔隙尺寸聚 碳酸酯濾紙擠壓12次，製備帶有包膠形成梯度之鹽溶液 (0.5N TEA-Pn，pH 6.2，滲透壓413毫莫耳/公斤）的脂質體 (DSPC/Chol/PEG-DSPE，以 3:2:0.01 5 莫耳比例，以 〇·5 毫.居 93060.doc -85- 1359029 里/毫莫耳DSPC含有[3H]-CHE)。藉著QELS，脂質體尺寸 為107.7土19.1毫微米。以範圍在13〇_36〇微克/微莫耳中的 藥物/脂質比例，將在5 mM HEPES，50克/公升右旋糖，pH 6.5 中的脂質體與拓撲太肯（20毫克/毫升）的含水母液混合，接 著我們在58°C下培養該混合物45分鐘，放在冰上15分鐘， 並藉著交聯葡聚糖G-75層析法移除未包膠的藥物》經由尾 靜脈，以每公斤體重5毫克拓撲太肯的劑量（約〇.2毫克拓撲 太肯/動物）’以脂質體注射12週齡的雌性FvB老鼠，進行 一式三份。在指定的時間，通常是注射後8小時或24小 時，將老鼠麻醉、使其無血，並按照實例8測定血液試樣 的藥物和脂質體脂質。在表16中出示結果。在24小時之 後，大約6-32%的原始藥物裝載仍維持包膠。較高的藥物 裝載（>200宅克/毫莫耳麟脂）結果產生較長的藥物保留。 表16.使用TEA-Pn梯度法，以不同藥物/脂質比例，原 型拓撲太肯脂質體裝載的活體外藥物保留和循環壽命 包膠的藥物/ 磷脂比例， 毫克/毫莫耳 維持在循環中的脂質，注 射劑量的％ 維持包膠的拓撲太肯，原' 始裝載的°/〇 8小時後 24小時後 8小時後 24小時後 127.2±10.9 36.1±2.0 18.7±8.1 51.7+7.1 6.72±2.5 207.2±21.6 32.1±5.2 9.84±1.88 75.6±13.0 13.8±3.5 301.3±24.5 34.4±3.2 8.04±4.25 79.2±4.2 25.6±4.4 360.3+35.6 33.6±2.4 8.68±4.96 73.5+7.0 32.3+9.8 實例23.使用不同陷入銨和三乙銨鹽裝載之拓撲太肯脂 質體的在活體内藥物保留和循環壽命
按照實例18 ’製備包括DSPE、膽固醇和peG-DSPE(按重 量計3:1:0·1)，亦以0.22毫居里/毫莫耳DSPE含有[3H]-CHE 93060.doc •86· 1359029 的脂質體’除了擠壓步驟包括通過2個疊層的2〇〇·毫微米 孔隙遽紙10次，通過2個叠層的1〇〇_毫微米孔隙渡紙1〇次 和通過2個疊層的50-毫微米孔隙遽紙2〇次以外。脂質體含 有下列的鹽溶液： 從購自Sigma之葡聚糖硫酸鈉（分子量5〇〇〇)，並藉著類 似實例4的離子交換程序轉變為敍鹽，製備〇5Ν·聚糖硫 酸銨溶液（A-DS)。立刻以124Μ的氨水滴定葡聚糖硫酸的 溶液。A-DS溶液具有ρΗ 5 66，滲透壓2〇8毫莫耳/公斤。 以類似實例6的方式製備〇48Ν蔗糖八硫酸銨（A_s〇s)， 但使用氫氧化銨來進行滴定。該溶液具有pH 6 27，滲透 壓258毫莫耳/公斤。 按照實例6製備〇.47M蔗糖八硫酸三乙銨（TEA，s〇s)。該 溶液具有pH 6.6 ’滲透壓297毫莫耳/公斤。 藉著在61-62°C下，並以346：tl毫克/毫莫耳的輸入藥物/ 磷脂比例，將脂質體與藥物一起培養4〇分鐘，接著在冰上 培養10分鐘，在10 mM MES-Na，50克/公升葡聚糖，pH 6.5的 水溶液中將拓撲太肯裝载到脂質體内。藉著在交聯葡聚糖 G-25上層析’從未包膠的藥物中純化脂質體，洗脫液-含 水的 2 mM組胺酸、144 mM NaCI，pH 6.6(HCI)。 經由尾靜脈，以每公斤體重5毫克拓撲太肯的劑量（大約 〇·2毫克拓撲太青/動物），以這些脂質體拓撲太肯調配物注 射7至9週齡的雌性Swiss Webs ter老鼠，進行一式三份。在 主射後8小時或2 4小時之後’收集血液，並按照實例2 2分 析拓撲太青和脂質體脂質。 93060.doc -87· 1359029 在下文表1 7中提交結果。雖然所有三種脂質體調配物均 證實非常接近的脂質體循環壽命，在注射後24小時有大約 23-28%的注射劑量仍保留在血液中，但意外的是從等級 (在藥物保留上大約2-倍改善）和統計顯著性（2-尾不成對 Student’s t-檢定在95%信賴水準處的統計顯著性分別為 p = 0.0257和ρ=0·00995 ;而Mann's U-檢定之顯著差異為 α=0·01)兩方面來看，在TEA-SOS脂質體和A-SOS脂質體中 的藥物保留，比在A-DS脂質體中的更好。在含有ΤΕΑ-SOS之拓撲太肯脂質體中的藥物保留比在含有A-SOS之拓 撲太肯脂質體中的更好。 表17.使用TEA-SOS、銨-SOS(A-SOS)和葡聚糠硫酸銨CADS)之 拓撲太 肯脂質 體的活 體内藥 物保留 和循環 持續性 梯度 藥物/磷脂 比例，毫 裝載效 率，％ 脂質體尺 寸，毫微米 保留在循環中的脂 質，注射劑量的％ 維持包膠的拓撲太肯， 原始裝載的％ 克/毫莫耳 8小時後 24小時後 8小時後 24小時後 A-DS A-S0S TEA-SOS 288.1 士 20.6 346_2 士 14.3 340.8±14.7 83.3 士 6.0 100.0±4.1 98.5 土 4.2 76.9 土 22.7 99.7±28.9 99.1 土 32.6 43.7 土 1.2 42.3±2.2 42.1±2.3 27.7±1.5 23.4土2.0 23.0±2.9 43.6±6.8 53.3 士 0.8 57.0 士 5.6 18.7±1.5 31.3±3.2 38.1±6.1 實例24.脂質體拓撲太肯在大鼠中的藥物和脂質血漿藥 物動力學 在大鼠中評估循環壽命和拓撲太肯釋放參數。藉著乙醇 混合/擠壓法製備脂質體（DSPC/膽固醇/PEG-DSPE莫耳比 例3:2:0.015)，並按照在實例18中的描述，使用TEA-Pn梯 度或TEA-蔗糖八硫酸鹽（TEA-SOS)梯度，並按各種藥物/ 脂質比例（15-450毫克/毫莫耳磷脂），以拓撲太肯裝載。至 於脂質基質定量，脂質體脂質含有0.5-1.5毫居里/毫莫耳 DSPC的[3H]-CHE。以4-5毫克/公斤體重之劑量，以拓撲 93060.doc •88- 1359029 太肯脂質體靜脈注射（經由套管）帶有留置中央靜脈套管的 雖性Sprague Dawley大鼠（6-8週齡；體重大約200克）。以 生理鹽水沖刷套管β在選擇的時間（高達注射後48小時）， 經由套管將血液試樣（0.2-0.3毫升）抽到有肝素的注射筒 内’與0.4毫升帶有0.04% EDTA的冰冷磷酸緩衝生理鹽水 逼合，藉著離心分離血球細胞，藉著3H-CHE放射性計數 (帮冷校正）測定上清液（PBS -稀釋之血漿）的脂質，並藉著 螢光分析（實例71)測定拓撲太肯◊對血漿稀釋修正測定結 果’從獲得血液試樣之重量，並假定血容比4〇%來計算。 從按體重之6.5%什算出的血液體積，估計藥物和脂質的總 灰液劑1。藉著比較在特定時間點的藥物/脂質比例與注 射脂質體的藥物/脂質比例，計算保留在脂質體中的拓撲 太肯百分比。下文表18概述脂質、藥物的血液半衰期，和 藥物釋放的半衰期，以及脂質體的其他特性。在圖8Α(脂 質）和8Β(藥物/脂質比例）中出示藥物動力學（ρκ)曲線。總 括而言，藥物和脂質兩者的血液ρκ·線與單一代表模式吻 合（R2 〇.984_〇 999卜不管它們9〇1〇〇毫微米的尺寸和極少 量的PEG化之脂質（0.3莫耳％)，脂質體意外地顯示出良好 的循環壽命（脂質組份的血漿半衰期是在丨丨_丨6小時的範圍 内）。在使用TEA-SOS法裝載的脂質體中，觀察到拓撲太 肯的最慢釋放（半時間為22.9小時）β 93060.doc •89· 表18.在大鼠中脂質、藥物的循環半衰期，和藥物從原 型拓撲太肯脂質體中釋放的半-時間 .陷入的鹽， 和濃度 拓撲太肯裝 載，毫克/ 毫莫耳磷脂 脂質體尺寸， 毫微米(平均 值士SD) 注射劑 量，毫 克/公斤 Un 脂質* 小時 tt/2 藥物， 小時 藥物釋放 的 t|/2 · 小時 每组動 物的數 § TEA-Pn 0.5N 124.3 士 9.7 92.3+23.3 4 15.8 4.13 5.34 3 TEA-Pn 0.5N 360.3土 35.6 107.7+19.1 5 12.8 6.06 9.97 2 TEA-SOS 0.643N 439.2±15.9 108.8+13.4 5 10.8 7.36 22.87 2 實例25.在拓撲太肯脂質體的儲存期間，藥物對抗漏出 的穩定性 為了上述的研究，製備數個原型調配物的試樣，將其儲 存在4-6°C下各種時間，評估包膠之拓撲太青對抗藥物從 脂質體中漏出的儲存穩定性。使脂質體試樣通過交聯葡聚 糖G-75管柱，以20mMHEPES，135mMNaCl，pH6.5洗 脫，移除脂質體外的藥物，並藉著分光光度測定來分析藥 物内含量，並藉著[3H]-CHE放射性計數分析脂質。結果 (表19)指出在儲存期間，拓撲太肯良好地保留在脂質體 中〇 表19.在儲存期間，原型拓撲太肯脂質體中的藥物保留 形成脂質體梯度的鹽 脂質體尺寸， 平均值±SD， 毫微米 原始藥物裝載， 毫克藥物/毫莫 耳填脂 儲存時 間，月 在儲存後的藥物 裝載，以原始的 %表示 TEA-Pn 0.500N pH6.2 96.4±29.3 148.5±10.3 8 101.6+5.5 TEA-Pn 0.500N pH6_2 107.7±19.1 127·2±10_9 6 94.6±6.2 TEA-Pn 0.500N pH6.2 107.7±19.1 207.2±21.6 6 113.9+9.4 TEA-Pn 0.500N pH6.2 107.7±19.1 301.3±24.5 6 112.9+9.3 TEA-SOS 0.643N pH5.6 108.8+13.4 439.2±15.9 2 97.8+9.4 實例26.脂質體和免疫脂質體拓撲太肯在活體外被 HER2-過度表現之癌細胞攝取 •90- 93060.doc 1359029 本研究討論根據本發明製備之裝載拓撲太肯的抗_HER2_ 免疫脂質體’在細胞培養中將拓撲太肯專一地遞送至 HER2-過度表現之細胞内的能力。使用實例19的TEApn 法，製備（免疫）脂質體，並以拓撲太肯裝載。在37〇c，5〇/〇 C〇2下，在T-75燒瓶中，使HER-2過度表現的人類乳癌細 胞（SKBr-3，ATCC)生長在補充有胎牛企清、5〇微克/毫 升硫酸鏈黴素和50單位/毫升青黴素〇經過修改的MeC〇y 5 A培養基（無麥黃酮（tricine))(完全生長培養基）中生長至匯 9 合。藉著以胰蛋白酶消化收穫細胞，以150,000個細胞/孔 接種在24-孔細胞培養盤中的0.5毫升完全生長培養基中， 並容許適應過夜。以0.5毫升含有在o.o^o.1 磷脂範圍 内的選出濃度之拓撲太肯調配物的完全生長培養基更換培 養基。每種條件使用一式三孔。在缺少藥物及/或脂質體 (以便獲得藥物測定的背景讀值）下，培養對照組孔。在 37°C，5% C〇2下培養該盤4-8小時，並慢慢地攪動。吸去 培養基，以每份1毫升含有Ca和Mg鹽的冰冷漢克氏 (Hank's)平衡鹽溶液沖洗細胞4次。藉著加入〇1毫升1%在 水中的三通X- 1 〇〇促使細胞溶解’並藉著螢光分析（實例 7 1)判定在細胞溶胞產物中的藥物含量。獲得範圍在i 〇_ 2500毫微克拓撲太肯/孔内的標準曲線，並在減去細胞自 動螢光背景之後，吻合二階多項式（用來說明在較高藥物 濃度的自我·驟冷）〇當使用微量培養盤螢光分析計時，濾 ' 紙選擇為在4〇〇/3〇毫微米處激發，在530/25毫微米處發 射。比色杯-和微量培養盤螢光分析計兩者均得到相同的 93060.doc •91 · 1359029 結果。 在下文表20中概述兩個實驗的結果。瞄準HER2之脂質 體藥物有顯著的細胞攝取（比非瞄準之脂質體拓撲太肯更 问50 300倍）。有趣的是，自由拓撲太肯的攝取亦明顯比瞄 準HER2之免疫脂質體拓撲太肯的更低。可藉著拓撲太肯 分子之喜樹鹼内酯環在細胞生長培養基中，在血清存在下 快速水解，產生藥物的羧化形式，其可能具有較低的細胞 通透性和較低的細胞毒性來解釋之。總括而言，證實了瞄 準細胞、可内化、與配體共軛之免疫脂質體在細胞内地送 拓撲太肯的能力。 表20.活體外含有TEA-Pn之拓撲太肯脂質體及抗—HER2 免疫脂質體之細胞攝取（nd，未測得）。脂質體特徵見表 12。 脂質體 濃度，Mm 磷脂 拓撲太肯 濃霧，微 暴露時 間，小時 被SK-Br-3細胞攝取的拓撲太肯，毫微克 /100,000個細胞 克/毫升 非瞄準脂質體 F5-免疫脂質體 自由藥物 0.1 15.5 4 1.45±0.09 163±5.7 nd 0.01 1.55 4 0.185±0.03 60.2±2.0 nd 0.033 5.0 8 3.62±2.03 169.6±13.7 5.56±0.91 實例27·脂質體和免疫脂質體拓撲太肯在活體外對抗 HER2-過度表現之癌細胞的細胞毒性 一旦確立抗-HER2拓撲太肯免疫脂質體以細胞内將藥物 遞送至HER2-過度表現之癌細胞内的能力（實例26)，確保 内化之脂質體可以其活性形式釋放藥物是很重要的。為了 這個目的，研究自由拓撲太肯（即以溶液形式調配的拓撲 太肯）、脂質體拓撲太肯和抗-HER2-免疫脂質體拓撲太肯 的活體外細胞毒性。製備脂質體拓撲太肯調配物，並按照 93060.doc -92- 1359029 在實例26中的描述，使SKBr_3細胞生長並收穫之。以—弋 一伤，將5,〇〇〇個細胞接種在96_孔細胞培養盤内的〇i毫= 完全生長培養基中，並留下適應過夜。讓培養盤最靠邊的 打和列是空的。以完全藥物培養基稀釋拓撲太肯脂質體、 免疫脂質體或自由藥物的無菌製備物（最近藉著稀釋拓撲 太肯20毫克/毫升母液，pH 3至未緩衝之生理鹽水中，到2 毫克/毫升來製備）’達到從9〇、3〇或1〇微克/毫升開始的濃 度，並以3之因數連續以培養基向下稀釋。以〇2毫升藥物/ .月旨質體稀釋更換培養基，並在37t，5% c〇2下培養指定的 時間（4-6小時）。每一列中各有一孔培養的是作為未-處理 對照組的無藥物培養基。從孔中吸出含有藥物的培養基， 並以0.2毫升不含藥物的培養基沖洗細胞，並在所有的孔 中加入0.2毫升新鮮的不含藥物培養基。在mc〇2 下培養該盤4天。不更換培養基，在各孔中加入0.03毫升 在不含血清之培養基中的四銼染料（噻唑藍（Thiaz〇lyl _ Blue)’ MTT)(Slgma Chemical Co.)的 2毫克/毫升溶液 。在37 C 5 C〇2下額外培養該盤2 3小時。吸出培養基，以〇 2 毫升70體積％之含水異丙醇、〇 〇75N HCls滿各孔，並溫 和地攪動，直到甲腸染料溶解為止（15·3〇分鐘）。使用微量 .培養盤光度計在540毫微米處判定甲腊溶液的光密度。按 .照在實驗孔中的光密度與在含有未處理細胞之孔中的光密 度的比例，對彦景進行校正’計算出以未處理對照組之。 表不的細胞存活性。將數據對藥物濃度作圖，並從在圖解 上與50 /。存活線交又的存活濃度曲線，估計icw劑量。 93060.doc •93- 1359029 在圖9中提交結果。導致50%生長抑制之自由祐撲太肯或 未瞎準脂質體拓撲太肯的藥物劑量（IC5〇)，超過3〇微克/毫 升；而F5-免疫月旨質體拓撲太肯的則為〇 15微克/毫升。這 . 些結果與瞄準藥物攝取數據相符。 實例28.脂質體和F5_免疫腊質體拓撲太肯在老鼠中的 比較穩定性和血漿藥物動力學 根據實例11和19 ’使用乙醇脂質溶液混合-擠壓程序， 在下列的條件下，製備以1>5毫居里/毫莫耳碳脂含有放射 •性脂質標記邮咖的拓撲太肯脂質體：形成梯度的鹽溶 液0.643N簾糖八硫酸二乙敍；聚碳酸醋膜擠壓：通過兩 個疊層PCTE濾紙，80毫微米15次；拓撲太肯裝載：藥物/ 踏脂輸人比例35〇毫克/毫莫耳（針對拓撲太肯自由驗來計 算）；按照在實例19中的描述來進行F5 scFv共軛作用。脂 質體具有下列的特徵： 藉QELS判疋之尺寸：重量平均值1〇12毫微米；標準差 20.1毫微米。 ^藥物包膠：拓撲太肯脂質體（T〇p〇_Ls} Μ9.3土η.4毫克/ 毫莫耳填脂m肯F5scFv-免疫脂質體（T〇p〇_F5_iLs) 326.3 士 15.9毫克/毫莫耳磷脂。 _ 通常按照實例22進行研究。以5毫克拓撲太肯驗/每公斤 •體重（相田於14_ 1 6微莫耳磷脂/公斤體重的脂質劑量），經 由尾靜脈，以Top〇-Ls、T〇p〇_F5ILs或新近製備的丨毫克/毫 •升纟未緩衝生理鹽水中之4δ撲太肯注射每組9隻雄性Swiss Webster老鼠（8-10週齡，24_27克）。在注射後1小時、8小 93060.doc •94- 1359029 時或24小時的時間點，在氯胺萌/塞拉嗓蘇醉下，經由開 放心臟穿刺在每個時間點使3隻動物無血，將血液收集二 含有PBS-EDTA的試管内，並測定拓撲太肯（營光分析沐 月旦旨質體脂靖著放射性閃爍計數）。從採用贈。之投藥劑 量’假定每隻動物的血量為體重的63%，和45%的血球容 積’計算在特定時間點，藥物和脂質劑量保留在血液中的 量。藉著比較帶有注射脂質體之灰聚試樣的藥物/脂質放 射：比例’分別為每隻動物計算在每個時間點，在脂質體 中藥物仍維持包膠的量。在注射W小時收集之血聚試樣 中自由拓撲太肯的量，低於1%注射劑量(確實，它們低於 我們測定方法的檢測限制）；因此，未研究自由拓撲太肯 群的更多時間點。因為自由拓撲太肯的快速血液清除和低 血液含量，我龍定基本上在所㈣_，在錢中發現 的所有拓撲太肯均代表脂質體包膠的拓撲太肯。 在下文表21中概述結果。顯然根據本發明製備之脂質體 保留了 79福原始藥物裝載，即使是在注射至動物血流内 之後24小時°在脂質體和免疫脂質體群之間，在脂質或藥 物的平均血激值之間的差異，是在18_136%的範圍内，並 接近或在測定誤差的範圍内。使用Student,s t_檢定計算在 每個時間點’關於藥物或脂質，在脂質體和免疫脂質體組 之間無效假定的或然率’是在〇 543_〇 938的範圍内。我們 推論在兩種製備物之間’在藥物或脂質之剩餘血液含量上 的差異是可忽略的，且在統計學上是不可區別的。 93060.doc 1359029 表21.在靜脈内注射之後的各種時間點，在老鼠血漿中脂 質體脂質、拓撲太肯和仍包膠在脂質體内之拓撲太肯的量 注射後時間 脂質，注射劑量 藥物，注射劑量 藥物/脂質，注射 的％ 的％ 前值的％ F5-共軛的脂質體拓撲太肯(Topo-F5ILs): 1小時 57.58+4.95 55.45±7.23 96.14+7.32 8小時 35.37+3.84 34.18±5.87 96.31±11.92 24小時 15.51±11.84 12.30+9.02 79.36+8.03 脂質體拓撲太肯(未共軛)(Topo-Ls) • 1小時 58.88±9.51 57.63+9.45 97.90±5.29 8小時 39.61±1.99 38.82+1.49 98.06±4.44 24小時 15.84±3.85 13.45+2.64 85.25+7.03 實例29.脂質體和抗-HER2-免疫脂質體拓撲太肯在BT- 474異種移植模式中的抗腫瘤效力 在本研究令，我們使用第一個原型拓撲太肯免疫脂質 體，其使用三乙銨-多磷酸梯度進行藥物陷入。通常依據 實例11和19之方法製備脂質體。將脂質體基質組份- DSPC(Avanti Polar Lipids ; 3 莫耳比率）、膽固醇 φ (Calbiochem，98_3% ; 2 莫耳比率）和甲氧基-PEG(2000)-DSPE(Avanti Polar Lipids，0.0 1 5 莫耳比率）-與 100% 乙醇 USP混合，得到在60°C下含有0.5 mM磷脂的溶液。在60°C 以含水的三乙銨多磷酸溶液（0.608M三乙胺、0.65 N磷 • 酸，pH 6.1，滲透壓531毫莫耳/公斤）稀釋乙醇脂質溶液， ‘徹底混合，並在60°C下使用自動控溫的氣壓擠壓器（Lipex , Biomembranes)，通過2個具有1 00毫微米之孔隙尺寸的疊 層聚碳酸S旨膜（Nuclepore，Corning)擠壓10次。在冰上冷卻 93060.doc -96- 1359029 經過擠壓的脂質體，並在瓊脂糖CL-4B上藉著凝膠層析法 移除未包膠的三乙銨多磷酸，使用5%右旋糖-5 mM HEPES-Na緩衝溶液，pH 6.5作為洗脫液。藉著QELS判定 脂質體尺寸為1〇3·8±35·1毫微米。在6(TC下，以每莫耳磷 脂0.35毫克拓撲太肯鹼的比例，將在該緩衝溶液中的脂質 體與拓撲太肯鹽酸鹽一起培養30分鐘。在培養結束時，在 冰上冷卻脂質體，並在交聯葡聚糖G-75上層析，以20 mM HEPES-Na，135 mM NaCl，pH6.5洗脫，移除任何未包膠的 藥物。按照先前的報告，藉著螢光分析判定藥物内含量， 並藉著鱗酸測定判定脂質内含量《如此獲得的脂質體拓撲 太肯’每毫莫耳磷脂具有365.^23」*克拓撲太肯鹼。欲 製備瞄準HER2之拓撲太肯免疫脂質體，將一份該脂質體 拓撲太肯製備物與在實例19中普遍描述的抗_HER2 scFv F5和順丁稀一酿亞胺基- PEG-DSPE交聯劑的經過純化之 軛物一起培養。簡言之’以每毫莫耳脂質體磷脂15毫克蛋 白質之比例，將在含水的1 〇%嚴糖-1 〇 mM檸檬酸納溶液， pH 6.5中之F5-PEG-DSPE與拓撲太肯脂質體混合，並在6〇 C下培養30分鐘。在冰上冷卻培養混合物，並在缓脂糖
CL-4B上層析，以20 mM HEPES-Na、135 mM NaCl，pH 6.5洗脫，移除任何未包膠的scFv共軛物。在該額外的培養 之後，藥物-對-脂質比例降低14%。 使含有1-2毫克/毫升拓撲太肯的拓撲太肯脂質體和免疫 脂質體調配物通過0.2微米無菌注射筒據紙，以無菌的方 式分配至聚丙烯小瓶中，並在使用之前儲藏在4_6t下， 93060.doc -97- 1359029 最多持續1個月。 藉著以2毫克/毫升，將拓撲太肯鹽酸鹽粉末溶解於5 %右 旋糖中，製備新鮮的自由拓撲太肯，並藉著通過〇2微米 注射筒濾紙滅菌。 按照在實例ίο中的描述，建立HER2_過度表現之bt_474 人類乳腺癌異種移植模式。在腫瘤接種後13天，選出具有 範圍在120-350立方毫米中之腫瘤的動物，並隨機分成3個 治療組和1個對照組，每組有12隻動物。在腫瘤接種後 14、18和21天，以每次5毫克/公斤體重之注射劑量或等體 積的生理鹽水，靜脈内（尾靜脈）注射拓撲太肯調配物來處 理老鼠。每週兩次監視腫瘤尺寸和體重，最多持續至腫瘤 接種後53天。將其腫瘤達到體重之20%，或進行性體重喪 朱達到2〇%或更多的動物安樂死。 圖11和12分別顯示腫瘤生長和動物體重數據。脂質體拓 撲太肯調配物在腫瘤生長的抑制上，比自由藥物更具活 性，而F5-瞄準之脂質體調配物比未瞄準的更具活性。在 觀察期結束時’在治療組之間的平均腫瘤尺寸有顯著差異 (不成對2-尾Student’s t-檢定的p值，自由對免疫脂質體藥 物的是1.2X10·6，自由對脂質體藥物的是〇 〇〇〇114，而脂質 體對免疫脂質體藥物的是0.00718)。因此，以脂質體方式 包膠之拓撲太肯比自由藥物更具活性，而抗_HEr2免疫脂 質體拓撲太肯比未瞄準脂質體藥物更具活性β在脂質體和 免疫脂質體組中’在最初的退化之後，腫瘤再生發生在最 終治療的10天内。在自由藥物組中沒有腫瘤退化。注意特 93060.doc • 98- 1359029 定劑量的拓撲太肯之脂質體調配物比自由藥物更且毒性。 有胃腸毒性。接受脂質體拓撲太肯的動物發生下病，並遭 受體重喪失，平均約為其高峰的14%。而在未鞋準的脂質 體組中，除了-隻（12.5%)在研究結束時持續有15%體重喪 失之外，其餘的動物均恢復，在F5-瞄準組中，5隻動物 (41.6%)發展出末期病態並死亡；而兩個持續有大約⑽的 體重喪失(16.7%)。在對照組和自由藥物組中，沒有體重 喪失或與治療-有關的病態。 實例30.錢受3次每週靜脈内注射的老鼠中，自由和脂 質體拓撲太肯的最大耐受劑量（Mtd) 本研究使用按照實例29製備的脂質體拓撲太肯調配物， 除了以具有0.65M三乙銨之嚴糖八硫酸三乙敍溶液，pH 6·2代替三乙銨多磷酸溶液；並使用8〇_毫微米聚碳酸酯濾 紙擠壓代替100-毫微米。藉著在高斯近似值中的準彈性光 散射法（QELS)，判定加權脂質體的尺寸為大約95 1±19 6 毫微米（平均值士SD);藥物/脂質比例為369 1±18 3毫克/毫 莫耳磷脂。5-6週齡的雌性Swiss_Webster老鼠（18_2〇克）兩 隻一組，以一週-一次的計畫，接受三次靜脈内（尾靜脈）注 射自由或脂質體拓撲太肯，每次注射從2毫克/公斤拓撲太 肯鹼的劑量開始，且後續每組均以18之因數增加，至37 8 笔克/公斤之劑量β在本研究中未包括免疫脂質體拓撲太 肯。每天監視動物體重和一般健康狀況。在丨〇天的期間 内，在任何時間，每組兩隻動物中有任何一隻因為開始治 療而有進行性體重喪失超過2〇%或自然死亡，便認為代表 93060.doc -99- 1359029 毒性劑量。根據動物的死亡率和體重數據，判定自由扛 太肯的MTD落在u.7_21毫克/公斤的範圍内，脂質體㈣ 2)拓撲太肯則為2.〇·36毫克/公斤。在第二個研究中，、^ 2.〇毫克/公斤（脂質體/免疫脂質體拓撲太肯）或12毫克/公斤 (自由拓撲太肯）之劑量，後續每組以1.15之因數增加，使 老鼠接受自由、脂質體或F5_免疫脂質體拓撲太肯（按照在 實例29中的描述，從本實例之脂質體拓撲太肯來製備）的 注射，直到達到已確立MTD間隔之上限的下一個劑量為 止。將在任何動物中並未導致死亡或末期病態的最高劑量 視為MTD，並發現自由拓撲太肯為18.4毫克/公斤，脂質體 拓撲太肯為3.0毫克/公斤，而免疫脂質體拓撲太肯為毫 克/公斤。因此，脂質體拓撲太肯顯示出比自由藥物更大 的毒性。 實例31.範圍在0_125_1〇xMTd之脂質體拓撲太肯在Βτ. 4 74異種移植模式中的抗癌症效力 在本研究中使用實例30的拓撲太肯脂質體和F5-免疫脂 質體。择照實例29，使BT-474皮下異種移植在裸鼠中產 生。在腫瘤細胞接種之後18天，將具有腫瘤（1〇5_345立方 毫米’平均大約200立方毫米）的動物隨機分成6隻動物/組 的治療組’和8隻動物/組的對照組。動物在腫瘤接種後 19、23 和 27 天，以 lxMTD、0.5xMTD、0.25xMTD 或 0.125xMTD，接受三次靜脈（尾靜脈）注射自由或脂質體拓 撲太肯。對照組接受生理鹽水的注射。按照實例29監視腫 瘤尺寸和動物體重。欲獲得動物體重的測量值，從動物總 93060.doc -100- 1359029 重的測量值中減去腫瘤重量（假設腫瘤密度為1 .〇，從動物 尺寸來計算所有在MTD的藥物調配物均顯示抗腫瘤活 性（圖13A-13D) 〇在以其個別MTD，或其相同的部分（1/2、 1/4或1/8)給予的自由和脂質體藥物之間，在效力上並沒有 顯著差異。因此，使用TEA_S0S梯度的藥物之脂質體包 膠’結果增加大約6•倍的抗腫瘤活性，但亦在藥物毒性上 有類似的增加。動物體重的動力學顯示所有治療均是無_ 毒性的，除了利用MTD之自由拓撲太肯的治療之外，其顯 不體重的短暫降低（大約治療前值得15%)，稍後就解決了 (圖 14)。 實例32.製備使用蔗糖八硫酸三乙銨陷入法製備的拓撲太 月脂質體並瞄準其在活體外的細胞毒性 通常依據實例18的程序，使用具有643 mM TEA, pH 5.7，滲透壓530毫莫耳/公斤及藥物/磷脂比例為17〇毫莫 取。該脂質體具有15毫克藥物/毫莫耳磷脂；90%裝載效力 •和顆粒尺寸105毫微米的TEA-SOS陷入溶液，製備脂質體 拓撲太肯。如實例19中的描述，在6〇。〇下，以每個脂質體 大約30個scFv(l5毫克抗體/毫莫耳磷脂），將這些脂質體與 F5-PEG-DSPE共軛物的膠束溶液一起培養丨小時。藉著SEe •使用瓊月曰糖CL_4B*離抗體-共軛之脂質體，並在HBS-6.5 、HEPES·緩衝之生理鹽水中調配。在附接抗-her2 期間’在藥物/脂質比例上沒有可檢測的變化。 如下判定被癌細胞攝取的拓撲太肯調配物。以15〇,〇〇〇 個細胞/孔，將HER2-過度表現之人類乳腺癌細胞（SK_Br_3, 93060.doc -101 - ATCC HTB-30)平舖在24-孔細胞培養盤上，並適應過夜。 在37°C下，在完全生長培養基中，以0.1 mM和0.01 mM的 脂質體濃度，將細胞（一式三份）與F5-瞄準和未瞄準的脂質 體拓撲太肯一起培養4小時。以漢克氏平衡鹽溶液沖洗細 胞4次，以1:10的0.1%三通X-100-70%酸化異丙醇混合物促 溶，並藉著螢光分析判定每孔與細胞有關之拓撲太肯的含 量。在表22中概述結果（平均值土標準差）。瞄準脂質體遞 送至被瞄準之細胞中的藥物，比未瞄準脂質體更多100-300 倍。 表22.被SK-Br-3乳癌細胞攝取的脂質體拓撲太肯 調配物 在0.1 mM磷脂下攝取的拓 在0.01 mM磷脂下設取 撲太肯，毫微克/孔 的拓撲太青，毫微克/孔 未瞄準脂質體 4.76±0.24 0.607±0.088 HER2-瞄準脂質體 533.8±13.7 197.0±4.6 比例：瞄準/未瞄準 112.1±8.6 324±55 按照在實例27中的描述，判定這些拓撲太肯調配物對抗 SKBr-3乳癌細胞的細胞毒性。以5,000個細胞/孔，將 SKBr-3細胞接種至96-孔培養盤内，適應過夜，並在37°C 下，與在細胞生長培養基中之漸增濃度（0.004-30微克/毫 升）的自由、脂質體或F5-免疫脂質體拓撲太肯一起培養4 小時。移除含有藥物的培養基，並容許細胞在不含藥物的 培養基中生長72小時。使用噻唑藍（MTT)四銼測定，判定 每孔存活細胞的量，並以對照組（未處理）細胞的。/。表示。 在圖10中提交結果。拓撲太肯免疫脂質體（IC5〇 0.15-0.5微 克/毫升）比未-瞄準拓撲太青脂質體（IC5〇 2 3.1微克/毫升）和 自由拓撲太貪（IC5Gg 2.3微克/毫升）更具細胞毒性。 93060.doc 102· 1359029 實例33·不同尺寸之拓撲太肯的活體内穩定性 按照實例22，使用通過100毫微米孔隙尺寸之聚碳酸酯 膜擠壓12次，或額外通過50毫微米孔隙尺寸聚碳酸酯膜12 次，製備含有TEA-Pn的脂質體。以150微克/微莫耳磷脂之 比例加入拓撲太肯（TPT)。在58°C熱水浴中45分鐘完成裝 載，接著在冰上驟冷。50-毫微米和100-毫微米擠壓之脂質 體的裝載效率分別是126.80士19.24微克TPT/微莫耳PL(84.5 ± 12.8〇/〇)和 148.48± 10.26微克 TPT/微莫耳 PL(99.0±6.80/〇)。 以5毫克TPT/公斤之劑量，以兩種Ls-TPT調配物之一靜脈 内注射每組三隻雌性Swiss Webster老鼠。在6小時之後犧 牲老鼠，並收集血液。按照在實例22中的描述，分析血漿 的TPT和脂質體脂質。在表23中提交結果。 表23.使用TEA-Pn陷入法裝載之不同尺寸Ls-TPT的活體 内穩定性 脂質體尺 在血漿中的藥 在血漿中的脂質 藥物/脂質比例， 寸，毫微米 物， 注射劑量的％ 體脂質，注射劑 量的％ 注射前值的％ 74.2 土 21.6 32.93±1.97 45.7±2.2 72.06±5.51 96.4±29.3 33.26土 3.56 37.6±5.3 88.41 士 15.68 實例34. 6-(3-胺丙基）玫瑰樹鹼（6-APE)的合成和脂質體包膠 以 Werbel 等人，J. Med. Chem. 1986，第 29，第 1321-1322頁的程序為基礎，以兩個-步驟的方法，從玫瑰樹鹼 製備6-(3-胺丙基）玫瑰樹鹼。在室溫下，在5毫升無水二甲 基曱醯胺（DMF)中，將501.4毫克玫瑰樹鹼（NSC 7 1795)(Aldrioh Chemical Co.)與大約 100 毫克氫化鈉 93060.doc -103 - 1359029 (Sigma;以無水石油鍵沖洗）一起授拌3〇分鐘。在該混合物 中’逐滴加入在2毫升無水DMF中之678毫克N-溴丙基鄰苯 二甲醯亞胺（Aldrich)的溶液。在氬氣下攪拌該紫色反應混 合物過夜，以1毫升水處理’並倒入60毫升水中。以25毫 升一氣甲烧萃取該混合物兩次’將萃取物覆以無水硫酸鈉 脫水，並通過一層中性的礬土。以10毫升二氣曱烷沖洗釁 土層兩次，並在真空中使混合的濾液和沖洗液脫水。在室 溫下將產物與20毫升絕對乙醇和2毫升無水的肼一起授拌 過夜。在真空下過濾所得的淤漿’以5〇毫升0.2N NaOH稀 釋黃色的濾液’以兩份（75毫升和50毫升）氯仿萃取。將氣 仿萃取物覆以NazS〇4脫水，並在真空中乾燥。在石夕土 6〇管 柱上層析粗產物（產量408毫克），以氣仿-甲醇混合物（體積 比7.3 )同浴洗脫，以無水三曱胺使其飽和。溶離份洗脫在 第二個黃色譜帶中，接著是未-反應的玫瑰樹鹼，顯示含 有產量大約30。/。的想要化合物。藉著ih_NMR證實結構。 TLC ·· Rf0.29-0.31(矽土 60 ; CHCl3-Me〇H體積比 7:3，以三 甲胺使其飽和）。玫瑰樹鹼，Rf 0.81-0.83。藉著溶解於無 水乙醇’並在無水異丙醇中以6N HC1溶液濕磨，將所獲得 的化合物轉變為二鹽酸鹽。過濾出6_APE二鹽酸鹽的橘色 結晶（NSC 17632 8)，以乙趟沖洗，並在真空中脫水。二豳 酸鹽的產量為86%。 藉著在60°C下，在0·5Μ TMA，pH 5.6之三甲銨多磷酸 (TMA-Pn)的溶液中水合DSPC的純淨脂質薄膜、膽固醇和 PEG(分子量2,000)-DSPE(3:2:0.015莫耳比例），接著快速冷 93060.doc •104· 凍（-78°C)和融解（60°C)六次，並通過兩個疊層的50-毫微米 孔隙尺寸聚碳酸酯濾紙擠壓10次，製備脂質體。使用瓊脂 糖CL-4B管柱移除未包膠的TMA-Pn，以HEPES-右旋糖（5 mM HEPES，5%右旋糖，pH 5.5)洗脫。脂質體尺寸為85.7土 32.1毫微米。 以100微克APE/微莫耳磷脂的藥物-對-磷脂比例，將濃 縮的6-APE溶液（10毫克/毫升）加至含有TMA-Pn的脂質體 中，在58°C下培養該混合物45分鐘，並在冰上快速冷卻15 分鐘。藉著凝膠層析，在交聯葡聚糖G-75管柱上移除未包 膠的藥物，以HEPES-右旋糖緩衝溶液（5 mM HEPES-Na， 5%右旋糖，pH 6.5)洗脫。然後按照實例71，藉著分光光度 分析定量陷入APE的脂質體，並使用實例70的萃取測定判 定脂質體磷脂。藥物包膠實際上是定量的。 實例35·製備HER-2瞄準之免疫脂質體6-APE，以及6-APE調配物在活體外對抗HER2-過度表現BT-474乳癌細胞 的細胞毒性 按照上文實例34製備陷入6-APE的脂質體（Ls-APE)。藉 著實例19的方法，從Ls-APE製備包膠6-APE的抗-HER2免 疫脂質體（F5-ILS-APE)。使用實例27的以MTT-為基礎之細 胞存活性測定，判定以溶液、Ls-APE或HER2-瞄準之F5-ILs-APE形式遞送的6-APE對抗HER2-過度表現之人類乳癌 細胞（BT-474)的細胞毒性。使細胞暴露在含有藥物的培養 基下6小時，並在培養後在不含藥物的培養基中3天。在圖 15中出示結果。自由APE的IC50為0.26微克/毫升，F5-ILS- 93060.doc 105 - 1359029 APE為0.756微克APE/毫升，而未瞄準Ls-APE為5 1.0微克 APE/毫升。在瞄準和未瞄準脂質體6-APE之間，在活性上 有67.5倍的差異，表示相當大的瞄準遞送效果。 實例36. 6-APE的EGFR-瞄準之免疫脂質體調配物，以及 在活體外對抗癌細胞的細胞毒性 按照在實例34中的描述，製備6-APE-裝載的脂質體。藉 著如下附接EGFR-專一之Fab’抗體片段’製備EGFR-瞄準 的免疫脂質體。以胃蛋白酶消化EGFR-專一的IgG MAb C225(賽托斯單抗（cetuximab)，ERBITUX™, Imclone Systems)，產生（Fab’)2片段。藉著在 37°C 下以 10-20 mM 2-巯基乙胺處理15分鐘，還原經過純化的（Fab’）2片段，並藉 著凝膠過濾，使用交聯葡聚糖G-25純化（Fab')2片段。反應 性硫醇基團通常以每個蛋白質分子大約0.9個硫醇基團出 現（使用Ellmann's試劑定量）。在室溫下，在pH 6.2-6.5的水 溶液中，以1:4之蛋白質-交聯劑莫耳比例，將C225Fab·片 段與兩親交聯劑 Mal-PAG-DSPE(Avanti Polar Lipids，AL)共 價共軛2-4小時，或在4-6°C下過夜，產生C225Fab’-PEG-DSPE共軛物’具有30-50%之產量。藉著尺寸排阻管柱層 析法’在3%壤脂糖-4%聚丙稀酿胺小珠凝膠（ultrogel AcA34 ’獲自Sigma Chemical Co.)上，從未反應的蛋白質 中分離該形成膠束的共輛•物，以HB S - 6.5緩衝溶液洗脫。 在空隙容積溶離份中收集共軛物，藉著在60°C下，以30毫 克C225蛋白質/毫莫耳脂質體磷脂的比例，將這些帶有 C225Fab'-PEG-DSPE的脂質體與裝載藥物的脂質體一起培 93060.doc -106- 1359029
養30分鐘，形成免疫脂質體6-APE，在冰上驟冷15分鐘， 並藉著凝膠層析法在瓊脂糖CL-4B管柱上純化免疫脂質 體，亦以HBS-6.5缓衝溶液洗脫（脂質體出現在或接近管柱 的空隙容積）。
在其供應者建議的生長培養基中培養MDA-MB-468 EGFR-過度表現人類乳癌細胞和低EGFR表現的MCF-7人類 乳癌細胞（ATCC，Rockville, MD)，並根據實例27的方法研 究自由、脂質體和抗-EGFR-免疫脂質體6-APE對抗這些細 胞的細胞毒性。將細胞與含有藥物的培養基一起培養6小 時之後，接著在不含藥物的培養中培養3天。在圖16中出 示結果。在MDA-MB-468細胞中，自由6-APE的IC50約為 0.1微克/毫升，C225-ILS-APE約為0.9微克/毫升。在MCF-7 細胞中，自由6-APE的IC50約為0.5微克/毫升，C225-ILS-APE約為14微克/毫升。Ls-APE在兩種細胞株中的IC50均 >3 0微克/毫升。因此，證實EGFR-瞄準之6-APE-裝載的免 疫脂質體，在EGFR-過度表現之MDA-MB-468乳癌細胞中 的抗原-專一之細胞毒性活性，但在不過度表現EGFR的 MCF-7乳癌細胞中則否。在MCF-7細胞中，瞄準和未瞄準 6-APE月旨質體具有相等的活性。 實例37.脂質體6-APE在大鼠中的藥物動力學 按照上文實例11，製備陷入TEA-Pn溶液（557 mM磷酸基 團、500 mM TEA，pH 5.8，滲透壓480毫莫耳/公斤），以及 08?(：、膽固醇和卩£0-03?£(莫耳比例3:2:0.015)之脂質組 合物的脂質體。在60°C下將脂質的乙醇溶液與10倍體積的 93060.doc -107 - 1359029 含水TEA-Pn溶液混合’並通過兩個疊層的go毫微米孔隙 尺寸聚碳酸酯膜擠壓10次。使用瓊脂糖CL-4B管柱移除未 包朦的TEA-Pn ’以MES-右旋糖（5 mM MES-Na，5%右旋糖， 卩115.5)洗脱。藉著（^1^判定脂質體尺寸為92.3±23.3毫微 米。以0.5毫居里/毫莫耳磷脂，將不可交換的放射性脂質 標記[3H]-CHE納入脂質基質中《按照在實例34中描述的， 以6-APE裝載脂質體。 藥物動力學研究依據實例9的草案。以1〇毫克6·αρε/公 斤之劑量’靜脈注射雌性Sim Albino大鼠（9週，200克）。 在指定時間點抽血，並藉著螢光分析分析血漿的6_APe。 將等份的血漿（0.05-0.2毫升）與1-2毫升90%含水異丙醇· 〇. IN HC1混合’並按照實例71藉著螢光定量6-APE。藉著 [3H]-CHE放射性閃爍計數定量脂質。 在圖17中顯示結果。藥物的血液半衰期（ti/2)為13 7小 時，而脂質體脂質的是16.6小時（圖A)。從脂質體中釋放之 藥物的半衰期是77.9小時’證實明顯的包膠穩定性（圖b)。 實例38. 2-(2-(N，N-二乙胺基）乙基）玫瑰樹鹼（2-DAE)的合 成和脂質體包膠
2-(2-(N，N-二乙胺基）乙基）玫瑰樹鹼氯化物（NSC 359949) 是抗-癌的玫瑰樹鹼衍生物，藉著在甲醇中，在三乙胺的 存在下，玫瑰樹鹼與2-(N，N-二乙胺）乙基氣化物的烷基化 作用來製備（參見 Werbel，L.M” Angelo, M.，Fry, D.M.，和 Worth，D.F. J. Med. Chem. 1986, 29:1321-1322)。按照在實 例37中的描述’製備含有陷入TEA-Pn的脂質體。在5 mM 93〇60.d〇c •108· 1359029 HEPES-Na，5¾右旋糖，pH 7.4中，以100微克/微莫耳的2_ DAE-對-磷脂比例，將2-DAE.2HC1與TEA-Pn脂質體一起班 養。藥物裝載的量為88.2微克APE/微莫耳PL(效率 88.2%)。 實例39.脂質體2-DAE在大鼠中的藥物動力學 按照實例37，在大鼠中研究脂質體2_daE的血液藥物動 力學（實例38)。2-DAE的為17_8小時，脂質體脂質基質 的則是18.2小時（A)。在血液中從脂質體中釋放之藥物的半 衰期為tW2=677小時（B)。因此，這些脂質體在血液中對抗 藥物漏出是異常穩定的。 實例40.使用TEA-Pn法將長春瑞賓裝載到脂質體内，pH 值的影響 按照實例11 ’藉著乙醇注射法，使用0·608Μ TEA， 0.65M磷酸基團，pH 6.1和滲透壓531毫莫耳/公斤的TEA_Pn 溶液，並通過兩個疊層的100毫微米孔隙尺寸聚碳酸酯膜 擠壓脂質體懸浮液1 5次，製備脂質體。藉著QELS，所得 的脂質體尺寸為108.3±17.1毫微米。以長春瑞賓二酒石酸 鹽1〇毫克/毫升USP的母液形式，以35〇微克/微莫耳的藥 物-對-填脂比例’將長春瑞賓（VRB)加至在含水5福 HEPES-Na，5%右旋糖，pH 6.5中的脂質體中，並使用mn NaOH將pH調整到想要的值。並在58±2<t下培養該混合物 3 0分鐘。然後在冰上冷卻該混合物丨5分鐘，並藉著交聯葡 聚糖G-75凝膠過濾層析法移除未包膠的藥物，以hbs_65 緩衝溶液（20 mM HEPES-Na，135 mM NaC1，pH 6 5)洗脫。 93060.doc -109- 1359029 然後使經過純化之脂質體溶解於酸性異丙醇中，並使用分 光光度分析，在270毫微米處分析長春瑞賓。在曱醇-氯仿 萃取之後，使用Bartlett(1959)的磷酸測定，定量脂質體磷 脂。 在表24中出示在裝載之後，經過計算之藥物-對-脂質比 例。長春瑞賓裝載是定量的（即實際上是100%)，並與研究 範圍内的pH值無關。 表24.在各種pH值的外在緩衝溶液下，將長春瑞賓裝載 至陷入TEA-Pn之脂質體内 pH值 藥物-對-磷脂比例(微克/微莫耳） 裝载效率(％) 4.5 351.2±52.88 100.4±15.2 5.0 347.6±6.35 99.3±1.8 5.75 355.2+11.2 101.5±3.2 6.25 377.0±21.5 107.7±6.6 7.0 374.3±29.58 106.9±9.0 實例41.以各種藥物/脂質比例，藉著TEA-Pn法製備之脂 質體長春瑞賓：包膠效率和在老鼠中的活體内穩定性 根據實例40製備陷入TEA-Pn溶液的脂質體，除了以1.5 毫居里/毫莫耳磷脂將[3H]-CHE納入脂質基質中。藉著 QELS，月旨質體尺寸為98.5±34.3毫微米。在5 mM HEPES-Na，5°/。右旋糖，pH 6.5的含水緩衝溶液中，以150-450毫克 VRB/毫莫耳的藥物-對-鱗月旨比例，將月旨質體與長春瑞賓二 酒石酸鹽USP混合，並在58±2°C下培養30分鐘。在加入藥 物之後不調整pH值。分離裝載長春瑞賓的脂質體（Ls-VRB)，並按照實例40，分析藥物和磷脂。 以5毫克VRB/公斤之劑量，以Ls-VRB-Pn靜脈内注射每 93060.doc -110- 1359029 組一隻雄性5-6週齡Swiss Webster老氣（Harlan Bioresearch)。根據裝載的程度改變脂質劑量，並可從上 文汁的藥物-對-脂質比例來判定。在注射後8小時或24小 時，麻醉動物，使其無血，並在冰上將血液收集至含有已 知量的帶有0_04%EDTA之PBS的秤重試管_。藉著離心分 離血球，並藉著[3H]_CHE放射性閃爍計數分析上清液的 脂質體脂質’並如下使用HPLC分析長春瑞賓。以長春花 鹼(内部標準)釘住試樣，以二乙醚萃取，蒸發，並將殘餘 物冷解於由含水的5〇 mM醋酸三乙録（pI1 5 5)和乙腈（體積 比58:42)所組成的移動相中8將試樣裝入在C-18防護管柱 之前的cls逆相矽土管柱（Supelc〇 C18管柱，25〇毫米毫 米直徑，顆粒尺寸5微米）中。以丨〇毫升/分鐘之流速，利 用上文的移動相同溶洗脫管柱。使用吸光度檢測器在“Ο 亳微米處檢測VRB。VRB和長春花鹼（内部標準）的代表性 保留時間分別為9.1分鐘和7.8分鐘。 在表25中出示結果。裝載效率隨著藥物/脂質比例的增 加而降低，仗150¾克/宅莫耳的實際上到45〇毫克/毫 莫耳的大約66%。注意到以每毫莫耳磷脂超過25〇毫克長 春瑞賓的比例加入長春瑞賓二酒石酸鹽，引起脂質體懸浮 液的實質酸化（PH<4.0)，其導致裝載效率降低。因此，在 藥物裝載步驟期間，確立pH值控制的需求。在8小時之 後，在血液中檢測到脂質體基質的量，在注射劑量之 3〇.4±6.6%(%id)到38·6±5·2%ί(1的範圍内’與注射脂質的絕 對量沒有b月顯關聯。在24小時之後，仍可在a液中檢測到 93060.doc 111- 1359029 6.4% ID到14.8% ID的脂質基質《在8小時之後藥物仍維持 包膠的量，從37%變化至63%。然而，在注射後24小時， 藥物含量下降至所使用之分析方法的檢測限制以下。 表25_以不同藥物/脂質比例，使用TEA-Pn法製備之脂 質體長春瑞賓的包膠效率和活體内藥物保留（無裝載缓衝 溶液pH調整）。藥物保留數據為平均值土SD(N=3) 長春瑞賓/填脂比例 在注射後8小時維持 輸入，毫克/毫莫 耳，計算值 輸出，毫克/毫莫 耳，測量值 包膠效率，％ 包膠的藥物％ 150 156 104.0 36.6 士 4.2 250 238 95.2 56.3±1.3 350 260 74.3 65.9±2.3 450 299 66.4 63.0±4.1 實例42·使用TEA-SOS法，以各種藥物/脂質比例將長春 瑞賓裝載至脂質體内 按照實例40製備藥物裝載用的TEA-SOS脂質體，除了使 用含有0.65M TEA，pH 5.4，滲透壓521毫微米/公斤的TEA-SOS溶液取代TEA-Pn溶液，並通過80毫微米孔隙尺寸聚碳 酸酯膜擠壓脂質體。藉著QELS，脂質體尺寸為86.6± 12.9 • 毫微米。在含水的5 mM HEPES-Na，5%右旋糖，pH 6.5 中，以各種藥物-對-磷脂比例，將VRB加至脂質體中，並 接著在60°C下培養該混合物30分鐘。然後分離裝載VRB之 脂質體，並按照實例40分析之。 • 在表26中出示在VRB脂質體中經過計算的藥物-對-脂質 - 比例。與聚合陰離子協助的裝載相反，顯然利用多陰離子 . 化的糖（蔗糖八硫酸鹽）將長春瑞賓裝載到脂質體中，實際 上是定量的，與高達450毫克VRB/毫莫耳磷脂的藥物/脂質 93060.doc •112· 1359029 比例無關，且在550毫克VRB/毫莫耳磷脂處僅略少一些 (88%) 〇 表26.將長春瑞賓裝載至脂質體内對藥物-對-脂質比例的 依賴性 長春瑞賓/碟脂比例 ，毫克/毫莫耳 裝載效率(％) 總和 包膠至脂質體内 150 159.9+11.5 106.6+8.1 250 255±12.4 102.2±5.1 350 381.8±16.3 109.1±5.1 450 456.1+29.5 101.4+6.6 550 486.2±26.0 88.4±4.2 實例43.藉著TEA-Pn法製備以長春瑞賓裝載之HER2-瞄準免疫脂質體，並比較HER2-瞄準和未瞄準之長春瑞 賓脂質體在大鼠中的血液動力學 按照實例19製備抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE共軛物。 藉著在 60°C 下，在含水的 20 mM HEPES-Na，135 mM NaCl， pH 6.5緩衝溶液中，以15毫克/毫莫耳的蛋白質/磷脂比 例，將未-瞄準長春瑞賓脂質體（實例41，以350毫克/毫莫 耳之藥物/磷脂比例裝載）與F5-PEG-DSPE共軛物（實例19) _ 一起培養30分鐘，製備HER2-瞄準之長春瑞賓免疫脂質 體。藉著凝膠層析法，在瓊脂糖4B管柱上移除未倂入的F5 共軛物，以相同的緩衝溶液洗脫。以5毫克VRB/公斤之劑 量，將未-瞄準的脂質體（Ls-Pn-VRB)和HER2-瞄準者（F5-' ILs-Pn-VRB)靜脈内投與雌性Albino大鼠（8-9週齡；200 v 克）。在各種時間點，按照實例9中的描述收集血液，並按 * 照實例41分析VRB和脂質體脂質。藉著使用MICROSOFT EXCEL(Microsoft Corp.)試算表TREND功能，找出最吻合 93060.doc -113 - 的單一指數動力學，分別從脂質濃度-時間作圖，或藉著 藥物/脂質比例-時間作圖，計算脂質體脂質的血液半衰期 和50%藥物釋放時間。結果（圖18)指出瞄準和未瞄準長春 瑞賓脂質體兩者均具有相同的藥物和脂質藥物動力學，具 有大約12 · 1小時的脂質半衰期和大約4.3小時的5〇%藥物釋 放時間。 實例44.製備並比較使用銨和經取代銨鹽製備之長春瑞 賓脂質體的活體内穩定性 根據實例4的方法，分別使用12.4M氨水或純淨的三乙胺 滴定，從具有分子量1〇,〇〇〇之硫酸葡聚糖（Sigma Chemical Co.)來製備pH 5.8、0.65M NH4+，滲透壓390毫莫耳/公斤 的葡聚糖硫酸敍（DS-A)溶液，和pH 6.0，0.65M NH4+，滲 透壓465毫莫耳/公斤的硫酸葡聚糖三乙銨（DS_TEA)。從分 析級的硫酸銨來製備325 mM，pH 5.1，滲透壓703毫莫耳/ 公斤的硫酸錢（S-A)水溶液。所有三種溶液均含有低於1 〇/〇 Na+的總陽離子内含量。使用實例4 1的乙醇混合-擠壓法 (DSPC/膽固醇/PEG-DSPE 3:2:0.015莫耳比例），製備陷入 這些溶液的脂質體。在脂質基質中，以1.5毫居里/毫莫耳 磷脂’納入放射性脂質標記[3H]-CHE。擠壓步驟由通過兩 個0.1微米疊層的聚碳酸酯膜10次所組成《在5 mM HEPES-Na，5%右旋糖，pH 6·5中，以350毫克/毫莫耳之藥物-對-磷 脂比例，將VRB加至脂質體内，使用IN NaOH將pH值調整 到6.5，並在58-60°C下培養該混合物30分鐘。然後在冰上 冷卻該反應1 5分鐘，並使用交聯葡聚糖G-75凝膠過濾層析 93060.doc -114· 1359029 法’移除未包膠的藥物，以含水的20 mM HEPES-Na，135 mM NaCl’ pH 6.5洗脫。以分光光度分析，分析經過純 化、裝載VRB之脂質體的vrb，並使用Bartiett(1959)的磷 酸測定來分析磷脂（參見實例7〇、7〇。按照實例43，在大 鼠中研究脂質體脂質和藥物的血液動力學。 在圖19-20和表27中出示結果。比較利用硫酸葡聚糖三 乙敍裝載的脂質體，和使用硫酸葡聚糖之銨鹽裝載的那 些。意外的是，使用三乙銨鹽裝載的那些比使用銨鹽裝載 的那些穩定多了。三種不同調配物之脂質體載劑本身的藥 物動力學是類似的，並因此主要是依賴所使用的脂質組 成。從使用硫酸葡聚糖三乙銨裝載之Ls_VRJB中漏出的脂 質體，比從那些使用硫酸葡聚糖銨裝載中的慢大約三倍。 使用硫酸銨裝载之脂質體具有最快的藥物漏出速率β 表27.比較使用陷入銨和經取代銨鹽包膠至脂質體内之 藥物的活體内穩定性 調配物，陷入 脂質體的鹽 脂質體尺寸，毫微 米，平均值土SD(藉 著 QELS) 脂質基質的血液半 衰期，小時 在血液中5〇〇/0 釋放的時間，小時 DS-TEA 120.8±28.5 9.5土3.3 66.3±13.4 '— DS-A 1〇7.8±15.4 11.2±0.6 22.9±1.7 S-A 114.5±15.6 10.7±0.2 1.77±0.16 實例45.製備各種尺寸之長春瑞賓裝載的脂質體，以及 其在活體内的穩定性 藉著實例11的乙醇昆合-擠壓法，製備陷入蔗糖八硫酸 三乙銨溶液（0.65Μ TEA, pH 6.4，滲透壓502毫莫耳/公斤） 的[3H]-CHE-標示之脂質體（1.5毫居里/毫莫耳碟脂）。擠壓 93060.doc -115- 1359029 步驟含有通過兩個具有孔隙尺寸0.05、0.08或0.1微米的疊 層聚碳酸酯膜15次◊依據實例40的方法，裝載長春瑞賓， 分離長春瑞賓脂質體，並定出脂質體特徵◊使用雌性 Albino大鼠（8-9週齡；200克），研究脂質體的活體内穩定 性°按照實例43，在大鼠中研究脂質體脂質和藥物的藥物 動力學。 在圖21、22和下表28中出示結果。比較通過〇.〇5、〇.〇8 和0.1微米聚碳酸醋漶紙擠壓的脂質體，並顯示具有類似 的藥物和脂質體載劑藥物動力學，以及類似程度的内容物 漏出。賴·者範圍在大約40-80小時内，較佳的是在24小時 以上的50〇/〇釋放時間，定出藥物在血液中從脂質體中釋放 的特徵。 表28.長春瑞賓脂質體的特徵
脂質體尺寸，毫微 米，平均值 ±SD(藉著 QELS) 87.6±28.1 98.5±15.1 109.6 土 24.6 藥物裝載，毫 克/毫莫耳磷脂 352.4±13.9 322.6士 22.7 357.0士 10.5 裝載效率脂質基質的血液 〇/〇 半衰期，小時 液中釋放的時 --------^，小時 100.7±i0 14.6±0.7 Wl±37l- 92.2士6.5 13.〇i0.2 47 9i3 8 102.0 士 10 14.3 士 0.3__78!〇±L4 實例46.使用ΤΕΑ-SOS陷入法，製備HER2-瞄準的長春 瑞賓脂質體’以及HER2 scFv-瞄準和未·瞄準之免疫脂 質體長春瑞賓在大鼠中的藥物動力學 按照在實例43中描述的，製備脂質體，以35〇毫克/毫莫 耳藥物-磷脂比例裝載長春瑞賓，並分析之，除了以實例 45的TEA-SOS溶液取代TEA-Pn溶液之外。擠壓步驟包括 通過0.08微米孔隙尺寸聚碳酸酯渡紙丨5次》藉著qels , t 質體尺寸為95.0±26.0毫微米。從這些長春瑞賓脂質體製2 93060.doc •116- 1359029 F5scFv-交聯的抗-HER2長春瑞賓免疫脂質體，並按照在實 例43中的描述’在大鼠中研究HER2-瞄準和未瞄準的脂質 體長春瑞賓之脂質體脂質和藥物的血液藥物動力學。F5_ ILs-VRB和Ls-VRB的月旨質體月旨質之循環半衰期分別是I! 4 小時和10.3小時’而50%藥物釋放時間分別為30.9小時和 3 0.3小時。因此，Ls-VRB和F5-ILs-VRB的月旨質和藥物藥物 動力學是非常接近的’表示乾物的導 入，不影響載劑本身的清除，而在循環中也不會增加藥物 從載劑中漏出（圖23、24)。 實例47，製備包括聚（乙二醇）之非離子腊質衍生物的長 春瑞賓脂質體，及其藥物動力學特性 從Northern Lipids, Inc” Canada.獲得的 ψ 氧基_peg(分 子量2,000)-合成神經醯胺（PEG-神經醯胺）的衍生物。 從NOF Corp.，Japan獲得曱氧基-PEG(分子量2,000)_二硬脂 醯基甘油（PEG-DSG)(SUNBRIGHT GS20)。
藉著實例11的乙醇混合/擠壓法，製備具有32:〇 3之莫 耳比例的DSPC、膽固醇和PEG_脂質（PEG_神經醯胺或 PEG-DSG)之脂質組成’和陷入TEA_s〇s溶液（〇 65M TEA、PH 6.4、滲透壓502毫莫耳/公斤）的脂質體。擠壓步 驟包括通過兩個疊層聚碳酸酯膜，使用孔隙尺寸〇2微米 兩次，和使用0_08微米孔隙尺寸10次。以35〇毫克/毫莫耳 的藥物/磷脂比例，以長春瑞賓裝載脂質體，定出尺寸、 藥物和脂質濃度的特徵，並按照實例46在大鼠中研究其藥 物動力學特徵。兩種調配物顯示脂質基質的延長循環時 93060.doc -117· 1359029 間，並在活體内缓慢釋放藥物，在24小時之後，在活體内 在血液中，有至少50%的藥物維持包膠，如同在下表29中 所示。 表29.帶有各種PEG-脂質之長春瑞賓脂質體的特徵 PEG-脂質 脂質體尺 藥物裝載， 裝載效率 脂質基質的 在血液中 寸，毫微 毫克/毫莫 % 血液半衰 50%藥物 米，平均值 耳碟脂 期，小時 的釋放時 土SD(藉著 QELS) 間，小時 PEG-神經醯胺 103.3±30.9 291.4±18.0 83.26±5.14 14.0 102.7 PEG-DSG 101.3 土 20.1 359.3±7.2 102.7±2.1 15.1 24.6 令人驚異的是，這些脂質體增加的PEG化作用（PEG脂質 内含量約為總脂質的5.7莫耳％)，與具有總脂質之大約0.3 莫耳％的類似的、尺寸相配之脂質體相比較（實例45， 109.6 毫微米，t1/2=14.3 小時；98.5 毫微米，t1/2=13.0 小 時），實際上對脂質體血液循環壽命沒有影響。 實例48.製備HER2-瞄準脂質體長春瑞賓，以及在活體 外自由的HER2-瞄準和未瞄準脂質體長春瑞賓對抗 MDA-MB-453細胞的細胞毒性 按照實例42製備裝載長春瑞賓的脂質體（Ls-VRB)(無 [3H]-CHE)，使用pH 6.0和3 50微克長春瑞賓/微莫耳磷脂的 藥物裝載。藉著按照在上文實例19和42中的描述，將這些 脂質體與F5-PEG-DSPE共軛物一起培養，除了不加入[3H]-CHE之外，形成抗-HER2免疫脂質體長春瑞賓（F5-ILs-VRB)。藉著將長春瑞賓二酒石酸鹽10毫克/毫升溶液USP 稀釋至細胞培養基内，製備"自由的”長春瑞賓。 MDA-MB-453是人類乳腺癌細胞（American Type Culture 93060.doc -118- 1359029
Collection，Rockville，MD)，其適度地過度表現HER2受體 (大約3x 1 〇4至1 x 1 〇5個副本/細胞）。按照在實例27中的描 述’判定以自由藥物、以未瞄準脂質體長春瑞賓或以 HER2-聪準（F5)-免疫脂質體長春瑞賓遞送之VRB對抗 MDA-MB-453細胞的細胞毒性，除了以1〇,〇〇〇個細胞/孔之 密度’在供應商-建議的生長條件（Leibowitz L-15，帶有 10¾胎牛血清，無CCh補充）下，將細胞平舖在96-孔微量滴 定盤中’並從0.03-0.1毫克/毫升開始，以一系列1:3的逐步 稀釋’加入藥物調配物。將細胞存活數據對藥物濃度作圖 (圖25)，並從圖表中估計降低細胞存活達50%所需的藥物 濃度（ICso) ^ F5-瞄準長春瑞賓脂質體的IC5〇(0.06微克/毫 升）接近自由藥物的（0.07微克/毫升），且實質上比未-瞄準 脂質體的更低（2.2微克/毫升）^這代表藥物之癌細胞-專一 的瞄準遞送，結果增強活性37-倍。 實例49.自由的、HER2-瞄準和未瞄準脂質體長春瑞賓 在活體外對CaLu-3細胞的細胞毒性 使用先前實例（實例48)的脂質體和方法，研究自由長春 瑞賓、Ls-VRB和F5-ILS-VRB在HER2-過度表現人類非小細 胞肺癌細胞 CaLu-3(American Type Culture Collection, Rockville, MD)中的細胞毒性。使細胞生長在5% C02的存 在下，在帶有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。在圖 26中出示結果。自由VRB的IC50為1_2微克/毫升，F5-ILS-VRB的為1〇微克/毫升，而未瞄準Ls-VRB的為50微克/毫 升。這代表在脂質體-包膠藥物的活性上有5-倍增強，為瞄 93060.doc •119- 1359029 準遞送至細胞的功能。 實例50.自由的、HER2-瞄準和未瞄準脂質逋長春瑞賓 在活體外對SKBr-3細胞的細胞毒性 使用實例48的脂質體和方法，研究自由長春瑞賓、Ls_ VRB和F5-ILs-VRB在HER2-過度表現人類乳癌細胞§〖3!·-3(American Type Culture Collection，Rockville，MD)中的細 胞毋性，除了使細胞生長在5 % C Ο2的存在下，在帶有1 Q % 胎牛血清的經過修改之McCoy 5A培養基中，以5,〇〇〇個細 胞/孔的密度平舖’並將藥物與細胞一起培養6小時。 在圖27中出示結果。自由VRB的IC5〇為0.28微克/毫升， F5-ILS-VRB的為0.17微克/毫升，而未聪準Ls-VRB的為〇 8 微克/毫升。這代表在藥物活性上有4.7-倍增強，為晦準遞 送的功能。 實例51·脂質體長春瑞賓在老鼠中在uT29人類結腸癌 異種移植令的活體内抗腫瘤效力 藉者在庶糖八硫酸的二乙録水溶液（〇.6m三乙敍，pjj 5.7-6.2)中從濃縮乙醇溶液水化，由二硬脂醯基磷酯醯膽 驗、膽固醇和PEG-DSPE(3:2:0.045莫耳比例）來製備小的單 層囊泡脂質體（藉著QELS，93.2±26.4毫微米），接著通過聚 碳酸酯膜（100毫微米孔隙尺寸）重複擠壓，移除脂質體外的 多聚陰離子鹽，並藉著按照在實例42中描述的，在等滲的 缓衝溶液pH 6.5中，以325毫克VRB/毫莫耳磷脂之藥物/脂 質比例，在60t下與脂質體一起培養，來裝載長春瑞賓。 在側面以1χ106個HT_29人類結腸癌細胞（Amedcan Type 93060.doc -120- 1359029
Culture Collection，Rockville，MD)皮下注射雕性BALB/c同 種接合子的裸鼠（6-8週齡，重17-20克）。在腫瘤接種後16 天開始，此時平均腫瘤直徑達到5-8毫米，將老鼠隨機分 成三組，每組6隻動物，並以5毫克/公斤之劑量，每三天 經由尾靜脈以自由的或脂質體長春瑞賓治療，總共四次注 射。至於對照組，以等體積的生理鹽水治療老鼠。使用測 徑器測量每隻老鼠的腫瘤尺寸，並使用公式計算腫瘤體 積：（腫瘤長）x(腫瘤寬）2/2。欲評估與治療有關的毒性，亦 每週將動物秤重兩次。顯示脂質體長春瑞賓在抑制HT-29 腫瘤生長方面比自由長春瑞賓有效多了，引起腫瘤退化， 而在自由藥物組中，腫瘤總是持續生長（圖28)。在治療期 間’在動物體重上有少許的改變，表示完全耐受該治療， 且脂質體化作用並未增加藥物毒性（圖29) » 實例52·脂質體長春瑞賓對抗C-26同基因之老鼠結腸癌 腫瘤的活體内抗腫瘤效力 按照實例4 8製備脂質體長春瑞賓和自由長春瑞賓。以 2xl05個C-26老鼠結腸癌細胞皮下接種雄性BALB/c老良（6-8週齡，重17-20克）》在接種後17天，當平均腫瘤直徑達到 5-8毫米時，將老鼠隨機分成5隻動物/組的六個治療組。每 三天經由尾靜脈，以6毫克/公斤、8毫克/公斤或12毫克/公 斤的自由長春瑞賓，以及4毫克/公斤或6毫克/公斤之脂質 體長春知；負’主射攜帶腫瘤的老鼠，總共四次注射。至於對 照組，以等體積的生理鹽水注射老鼠，按照在實例51中的 追蹤腫瘤尺寸和動物體重。脂質體長春瑞賓即使是在4毫 93060.doc -121- 1359029 克/公斤，在減少腫瘤生長方面亦比12毫克/公斤的自由藥 物有效多了（圖30)，在治療過程中的動物體重顯示少許改 變（<10%降低），表示與自由藥物的相比較，脂質體長春瑞 賓的毒性並未增加（圖31)。 實例53. HER2-瞄準之脂質體長春瑞賓對抗在老鼠中之 BT-474人類乳癌異種移植腫瘤的活體内抗腫瘤效力：裝 載抗衡離子的影響 分別根據實例41之TEA_Pn法和實例42之TEA-SOS法， 製備尺寸99.5 土 10.2毫微米之裝載VRB的脂質體，除了不加 入[3H]-CHE。以350毫克/毫微米之藥物/磷脂比例裝载 VRB。藉著按照在實例43中描述的，將這些脂質體與FS-PEG-DSPE共軛物（參見實例19) 一起培養，形成HER2-瞄準 的脂質體長春瑞賓。按照實例10，使BT-474 HER2-過度表 現人類乳癌異種移植在同種接合子的裸鼠中產生。在腫瘤 細胞接種後25天，此時腫瘤達到大約200立方毫米之尺寸 (範圍144-309立方毫米），將老鼠隨機分成8隻動物/組的四 組’並以每週5毫克/公斤之自由VRB、帶有pn作為抗衡離 子的F5-ILS-VRB，或帶有SOS作為抗衡離子的F5_ILs· VRB，靜脈内治療動物，總共三次注射。對照組接受等體 積的生理鹽水。按照實例10監視腫瘤和動物體重。使用薦 糖八硫酸鹽裝載的HER2-瞄準之脂質體長春瑞賓，在降低 腫瘤生長方面明顯比使用多（構酸）裝載之相同瞄準構築體 更有效，且當以5毫克VRB/公斤投藥時，兩種免疫脂質體 製備物均比自由長春瑞賓有效得多（圖32)。以藥物治療之 93060.doc -122- 1359029 老鼠證實在體重上有少許改變，表示完全耐受該治療（圖 33)。 實例54· HER2-瞄準之脂質體長春瑞賓對抗在老鼠中之 BT-474人類乳癌異種移植腫瘤的活體内抗腫瘤效力： PEG化作用的影響 根據實例48，藉著經由乙醇溶液法，在含水的蔗糖八硫 酸三乙銨中，按3:2:0.015(，’0.5%PEG")或 3:2:0_3("10%PEG")之 莫耳比例的DSPC、膽固醇和具有PEG分子量2,000之PEG-二硬脂醯甘油（GS-20，NOFCoΓp.，Japan)之脂質基質的水 化作用，製備莫耳比例3:2的DSPC和膽固醇之脂質體，接 著根據實例48進行膜擠壓。以350毫克/毫莫耳之藥物/磷脂 比例，將VRB裝載到脂質體内。藉著按照實例43的描述， 將這些脂質體與F5-PEG-DSPE共軛物（實例19)一起培養， 形成F5免疫脂質體長春瑞賓。產生帶有BT-474異種移植的 裸鼠，並按照實例53，以5毫克/公斤之自由VRB、F5-ILS-VRB-”0.5%PEG”或 F5-ILs-VRB-”10%PEG"靜脈内治療。如 同在圖34中所示，具有較高PEG化作用之F5-ILS-VRB提供 非-離子PEG脂質衍生物PEG-DSG，在降低腫瘤生長上明 顯比具有較低含量之PEG-DSG的F5-ILS-VRB更有效，而兩 種製備物均比自由藥物更具活性。 實例55. EGFR-瞄準之脂質體長春瑞賓對抗在老鼠中之 U87人類腦癌異種移植腫瘤的活體内抗腫瘤效力 製備帶有包膠〇.65M TEA-SOS溶液之脂質體（藉著 QELS，尺寸為86.6±12.9毫微米），根據實例42裝載VRB。 93060.doc -123 - 1359029 按照在實例36中的描述，藉著將VRB脂質體與抗-EGFR抗 體Fab’片段的PEG-DSPE共軛物一起培養，製備抗-EGFR-免疫脂質體 VRB(C225Fab，-ILs-VRB)。 在側面以懸浮於生長培養基中，總體積150微升之1χ1〇7 個U87人類神經膠質母細胞瘤細胞（ATCc)皮下注射雄性 NCR nu/nu老鼠（5-6週齡，重17-20克）。當腫瘤達到250立 方毫来的平均尺寸時，將老鼠隨機分成10_12隻動物的四 組。以三次每週靜脈注射5毫克/公斤之劑量的"自由"Vrb、 未睡準Ls-VRB或C225Fab'-ILs-VRB治療老鼠。對照組接受 等體積的生理鹽水。按照實例1 〇監視腫瘤體積和動物體 重。C225-Fab’-ILs-VRB在抑制EGFR-過度表現之人類腦癌 異種移植腫瘤的生長上，明顯比相等劑量的未-瞄準脂質 體長春瑞賓或自由長春瑞賓更有效（圖35)。 實例56.製備包膠在使用硫酸三乙銨法之脂質體中的阿 黴素及其藥物動力學 按照在實例2中的描述’形成帶有各種脂質基質組成（如 下表所示）的脂質體。N-戊二醯基-DSPE(Glu-DSPE)係得自 Avanti Polar Lipids，AL，USA。純淨的脂質薄膜則是使用 旋轉汽化’從在氯仿中的脂質溶液形成，在真空下移除微 $的揮發物（90微米Hg，2小時），在硫酸三乙銨（TEA_S04) 溶液（0.65N TEA)中水化脂質薄膜，接受六回合的快速冷 陳和融解，並通過兩個疊層〇.丨微米孔隙尺寸的聚碳酸酯 遽紙10次’然後通過兩個疊層〇 〇5微米孔隙尺寸的聚碳酸 酉旨遽紙10次。至於在血液試樣中的脂質基質定量，以〇5_ 93060.doc _. 1359029 1.5毫居里/宅莫耳磷脂，將[3h]_che納入脂質基質中。根 據實例2 ’以阿徵素裝載陷入TEA-S04溶液的脂質體。在 60C下’將在HEPES-緩衝之生理鹽水（2〇 mM HEpES_Na， 135 mM NaCl’ pH 6.5)中的脂質體與阿徵素鹽酸鹽（14〇17〇 $克/$莫耳的藥物/鱗脂比例）—起培養45分鐘，接著在冰 上驟冷，並藉著凝膠層析法移除未包膠的阿黴素。藉著分 光光度分析（實例71)測定阿黴素，並藉著以川扣法（實例 70)測定磷脂。在下文表3〇中概述所得之脂質體的特性。 表30.各種脂質組成之脂質體阿黴素的特性 脂質組成(莫耳比例） 脂質體尺寸，毫微米 (藉著QELS，平均值±SD) 藥物/鱗脂 (毫克/毫莫耳） DSPC/Chol/PEG-DSPE(3:2:0.015) 81.8±27.3 163.6±4.4 DSPC/Chol(3:2) 79.1±27.9 137.0±17.5 DSPC/Chol/Glu-DSPE(2.85:2:0.15) 83.6±27.2 141.7 土 10.4 DSPC/Chol/PEG-DSPE(2.7:2:0.3) 83.7±23.1 175.0±6.8 按照在實例9中的描述，在大鼠中以5毫克阿黴素/公斤 的單一靜脈内劑量，研究具有DSPC/Chol/PEG-DSPE 2.7:2:0.3之脂質組成的這些含有阿黴素之脂質體的血液藥 φ 物動力學。脂質體是長期循環的（半衰期為大約28小時）（圖 3 6)。穩定的阿黴素-對-磷脂比例指出，調配物在循環中對 抗藥物漏出是明顯穩定的，在48-小時的期間内喪失少於 25°/。的藥物。 . 實例57.藉著TEA-硫酸鹽法製備裝載阿擻素之脂質體 _ 和抗·HER2免疫脂質體：製備和對抗HER2-過度表現人 類乳癌異種移植的活體内抗腫瘤效力 按照在實例56中的描述，製備具有各種脂質組成和特性 93060.doc •125· (在下表中列舉）的裝載阿黴素之脂質體。按照在實例19中 的描述，藉著與抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE共軛物（約30 個scFv/脂質體）共同培養，從裝載阿黴素之脂質體來製備 裝載阿黴素的抗-HER2免疫脂質體。產生攜帶皮下人類乳 房腫瘤異種移植（BT-474)的NCR nu/nu老鼠，每週一次以5 毫克/公斤之劑量，以脂質體或抗-HER2免疫脂質體阿黴素 治療（每組1 〇-12隻動物），總共3週，一旦腫瘤達到200立方 毫米的平均尺寸，便按照在實例29中的描述，監視腫瘤進 行和動物體重《關於未-瞄準阿黴素脂質體調配物，研究 不含 PEG-DSPE、含有 0.5 莫耳 ％PEG-DSPE 或 10 莫耳 ％PEG-DSPE的脂質組成；至於F5-免疫脂質體阿黴素，研究帶有 〇.5莫*%PEG-DSPE和10莫耳°/〇PEG-DSPE的調配物（在此 處以脂質體磷脂的莫耳％來表示PEG-DSPE之含量）。結果 (圖37，表3 1)證實所有的阿黴素治療在延遲腫瘤生長上均 是有效的。以在接種後53天的腫瘤尺寸為基礎，在所有三 個未-瞄準脂質體組中，在腫瘤生長抑制上的差異並沒有 統計上的顯著性（ANOVA p = 0.081)，但免疫脂質體阿黴素 顯然比未-瞄準脂質體阿黴素更有效（ANOVA p=5.5xlO·10)， ”10%PEG-DSPE” 調配物亦比"0.5o/〇PEG-DSPE” 更有效 (Student's t-檢定，ρ=0·027)。在 ” 100/〇PEG-DSPE”F5-ILs ·组 中，在67%動物中，腫瘤退化至1立方毫米或更小，而在 "0.5%PEG-DSPE”F5-ILs組中，僅在9%的動物中發生。在 對照組（生理鹽水治療）中，在38-43天腫瘤超過15%體重的 可接受之尺寸限制。 93060.doc -126- 1359029 表31.脂質體阿徵素在活體内的抗腫瘤效力研究：脂質 體特徵和治療成果 脂質组成 脂質體尺 寸，毫微米 (平均值土 SD) 藥物/鱗脂比 例，毫克/毫莫 耳(平均值±SD) 在58天的平均腫 瘤尺寸，立方毫 米(平均值士SEM) 490ΪΜ DSPC/Chol/PEG- DSPE(3:2:0.015) 83.4±23.3 136.7±6.7 DSPC/Chol(3:2) 80.5±26.6 151.2±1.9 587士 61 DSPC/Chol/PEG- DSPE(2.7:2:0.3) 81.0±24.7 140.1±4.2 365±6〇 DSPC/Chol/PEG- DSPE(3:2:0.015) +F5 scFv-PEG-DSPE 未測量 140.7±2.8 119Ϊ39-- DSPC/Chol/PEG- DSPE(2.7:2:0.3) +F5 scFv-PEG-DSPE 未測量 132.9±2.2 15.5±7.6 實例58.製備脂質體長春瑞賓和脂質鱧長春瑞賓在大氣 中的血液藥物動力學 藉著實例11的方法’使用通過兩個疊層0.2微米聚碳酸 酯膜擠壓兩次，並通過兩個疊層0.08微米聚碳酸酷膜擠壓 1〇次，製備帶有陷入TEA-SOS溶液（0.65M TEA, ph 6.4 滲透壓502毫莫耳/公斤）和尺寸99·5± 10.2毫微米（藉著 QELS，平均值±SD)的脂質體。以硫酸長春花鹼USP的形 式’以150毫克/毫莫耳的藥物-對-磷脂比例加入長春花驗 (VBL)。使用IN NaOH，將藥物-脂質體混合物的pH值調整 到6.5，並接著在60°C下培養該混合物30分鐘。然後在冰上 冷卻該反應15分鐘，並使用交聯葡聚糖G-75凝膠過濾層析 法，移除未包膠的藥物，以5 mM HEPES-Na, 135 mjvj NaCl，PH 6.5洗脫。然後以分光光度分析之方式，分析經 過純化之脂質體的VBL，並藉著在實例70和實例71中的 93060.doc -127- 1359029
Bartlett法分析磷脂。α1.5毫居里/毫莫耳磷脂的比例，將 [H]-CHE納入調配物中。脂質體長春花驗具有152.4 ±12.0 毫克VBL/毫莫耳磷脂（定量包膠）。 . 按照在實例9中的描述，以5毫克VBL/公斤之劑量，研 究脂質體長春花驗在離性Albino大鼠（8-9週齡；200克）中 的血液藥物動力學。按照在實例4丨中的描述（使用長春瑞 負.作為内部標準）’定直在血液血漿試樣中的長春花驗）。 長春it驗知質體顯示良好的循環壽命（脂質組份的金漿半 ® 衰期12.8土0·04小時）（圖38) ’以及對抗藥物從脂質體中漏出 的極佳穩定性，在24小時之後仍有超過7〇%的原始長春花 驗維持包膠（圖39)。發現達到50%包膠藥物釋放的注射後 時間為4 0.6 ± 1.2小時。 實例59.使用TEA-SOS法製備裝載長春新驗的脂質體， 以及pH值對裝載效率的影響 藉著貫例11的方法，使用通過兩個疊層0 _ 〇 8微米孔隙尺 ^ 寸的聚碳酸酯膜15次的擠壓步驟，製備尺寸86.6±12.9毫微 米（藉著（^1^)，以3:2:0.015之莫耳比例的〇5卩(：/(：11〇1/?丑〇-DSPE之脂質組成，和陷入含水的TEA_s〇s溶液（〇 65M TEA, pH 5.4，滲透壓521毫莫耳/公斤）的脂質體。以35〇微 克長春新鹼/微莫耳磷脂的藥物-對·磷脂比例，將以硫酸長 春新驗之形式的長春新鹼（VCR)加至在5 mM HEPES-Na, 5%右％糖含水緩衝溶液，pH 6.5中的脂質體中，使用1 n NaOH將pH值調整到指定的比例，在6〇t下培養3〇分鐘， 在冰上冷卻15分鐘，並使用交聯葡聚糖G_75凝膠過濾層析 93060.doc -128* 法，從未包膠藥物中分離脂質體，以HBS-6.5(20 mM HEPES，135 mM NaCl，pH 6.5)洗脫。以分光光度分析之方 式，分析經過純化之脂質體的長春新鹼，在溶解於酸性異 丙醇中之後，使用在265毫微米處的吸光度，並使用 Bartlett(1959)的磷酸測定，分析磷脂内含量。 在下文表32中出示結果。在？11 4.5-7.5的範圍内，藥物 裝載超過90%，並在pH 5.0-7.5處實際定量。在加入藥物之 後不調整pH值時，在脂質體混合物中觀察到的pH 3.5處， 裝載是相當低的。 表32.將長春新鹼裝載於帶有陷入TEA-SOS之脂質體内的 pH-依賴性 PH 藥物/填脂比例，微克/微莫耳 裝載效率(％) 3.5 39.7 土 4.9 11.3 土 0.2 4.5 327.2±20.6 93.5±5.4 5.0 360.6±5.8 103.0 土 1.7 5.5 371.2 士 30.2 106.1±9.1 6.0 347.7±20.4 99.3±5.8 6.5 347.7±20.9 99.4±5.9 7.0 377.3 士 22.2 107.8±6.8 7.5 371.5 士 24.9 106.1±7.6 實例60.使用TEA-SOS法製備以長春新鹼裝載之脂質 體：藥物/脂質比例對裝載效率的影響 按照實例59製備含有SOS-TEA的脂質體，並根據實例59 的程序，在pH 6.5下以150-550微克/長春新鹼/微莫耳磷脂 的藥物-對-磷脂比例，裝載硫酸長春新鹼。然後以分光光 度分析之方式，就VCR分析從未包膠藥物中純化的脂質 體，並使用BartleU(1959)的測定分析脂質體的磷脂。在整 93060.doc •129· 1359029 個藥物/脂質比例的研究範圍内，藥物裝載效率均超過 90%，並在150-450微克長春新鹼/微莫耳磷脂之間實際定 量（表33)。 表33.以不同的藥物-對-脂質比例，將長春新鹼裝載到含 有TEA-SOS的脂質體内 輸入藥物-對-磷脂 (微克/微莫耳） 包膠的樂物-對-填脂 (微克/微莫耳） 裝載效率(％) 150 163.6±6.6 109.0±4.8 250 251.1 土 17.0 100.5±6.8 350 347.7 士 20.9 99.4±5.9 450 452.0±18.8 100.4±4.2 550 521.6±24.9 94.8 士 4.3 實例61.製備免疫脂質體長春新鹼，以及脂質體和免疫 脂質體長春新鹼在活體外對抗癌細胞的細胞毒性 按照在實例59中的描述，使用350毫克/毫莫耳的藥物/磷 脂比例，製備脂質體長春新鹼（Ls-VCR)。按照在實例19中 的描述，藉著與抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE共軛物共同培 養，從脂質體長春新鹼製備HER2-專一的F5-免疫脂質體長 φ 春新鹼（F5-ILS-VCR)。藉著以水稀釋硫酸長春新鹼USP， 接著滅菌過濾，製備"自由"長春新鹼（VCR)。藉著以MTT 為基礎之細胞存活率測定，使用實例27的程序，判定 VCR、Ls-VCR和F5-ILS-VCR對抗HER2-過度表現之人類乳 、 癌細胞SKBr-3(ATCC)的細胞毒性，其中以5,000個細胞/孔 ^ 將細胞接種在96-孔微量滴定盤中，適應過夜，並與含有 藥物的培養基一起培養4小時，接著在培養後在不含藥物 的培養基中3天。在圖40中出示結果。自由VCR的IC50為75 93060.doc -130- 1359029 毫微克/毫升’ F5-ILS-VCR為11毫微克/毫升，而Ls-VCR為 3微克/毫升。根據本發明製備之瞄準脂質體長春新鹼的活 性比自由藥物更多6.8倍，比未瞄準脂質體藥物的活性更 ..多273倍，顯示在抗癌症活性上的實質增強，成為細胞-專 一之藥物遞送的功能。 實例62· Ls-VCR在大鼠中的血液藥物動力學 藉著實例11之方法’製備帶有陷入SOS-ΤΕΑ溶液（0.65M TEA，pH 5.8，滲透壓 530毫莫耳/公斤）和 DSPC/Ch〇1/pEG_ • dspe(莫耳比例3:2:0.015)之脂質組成，亦以1 5毫居里/毫 莫耳磷脂含有[3H]-CHE的脂質體，使用通過兩個具有8〇毫 微米或100毫微米之孔隙尺寸的疊層聚碳酸酯膜1〇次的擠 壓步驟。按照在實例59中的描述，在pH 6.5下以350毫克/ 毫莫耳的藥物/磷脂比例，以VCR裝载脂質體。以5毫克 VCR/公斤之劑量，將裝載VCR的脂質體靜脈内投與雌性 albino大鼠（180_22〇克），並按照在實例的描述，研究藥 物和脂質體脂質的血液藥物動力學。按照在實例41中的描 述，除了在移動相中之含水醋酸三乙銨（pH 5 5)和乙腈的 體積比為65:35之外，藉著HpLC定量在血液試樣中的 含量。VCR的代表性停留時間為8.8分鐘。在圖4i和表_ :出示結果。兩種製備物均具有廣泛的循環壽命（血液半衰 期12-17小時）。在兩種製借物中，脂質體長春新驗在對抗 樂物漏出上是明顯穩定的（半_釋放時間超過12〇小時）（圖 42) 〇 93060.doc -131 - 表34.使用TEA-SOS法，以350毫克/毫莫耳磷脂，以長春 新鹼裝載之脂質體的特徵 擠壓孔隙 脂質體尺寸，毫 藥物裝載， tl/2g 脂 ti/2pVCR， tl/2VCR 釋 尺寸，毫 微米(平均值 毫克/毫莫耳 質， 小時 放，小時 微米 ±SD) 碟脂 小時 80 101.2±20.2 347.7±20.93 17.5±1.5 16.0±2.0 >120 100 125.6±32.0 366.8±18.11 12.1 士 0.7 12.0±0.8 不可檢測 實例63.各種藥物/脂質比例之Ls-VCR在大鼠中的血液 藥物動力學 藉著實例11之方法，製備帶有陷入SOS-TEA溶液（0.65M TEA, pH 6·4，滲透壓 485 毫莫耳 / 公斤）和 DSPC/Chol/PEG-DSPE(莫耳比例3:2:0.015)之脂質組成，亦以1.5毫居里/毫 莫耳磷脂含有[3H]-CHE的脂質體，使用通過兩個具有50毫 微米或80毫微米之孔隙尺寸的疊層聚碳酸酯膜10次的擠壓 步驟。按照在實例59中的描述，在pH 6.5下以VCR裝載脂 質體，藉著以經過計算為100、200或350毫克/毫莫耳磷脂 的藥物/脂質比例，加入母20毫克/毫升的含水VCR硫酸溶 液。關於所有的製備物，藥物裝載效率均超過96%。以5 毫克VCR/公斤之劑量，將裝載VCR的脂質體靜脈内投與雌 性albino大鼠（8-9週齡，190-220克），並按照在實例62中的 描述，研究藥物和脂質體脂質的血液藥物動力學。在表35 中出示結果。脂質體長春新鹼具有良好的循環壽命（藥物 的血液半衰期約為20-30小時），且所有的研究尺寸和藥物-對-脂質比例均是極為穩定的（藥物釋放的半衰期超過93小 時）。 表35.使用TEA-SOS法，以各種藥物/脂質比例將長春新 93060.doc -132- 1359029 鹼裝載至脂質體的特徵 擠壓孔隙 尺寸，毫 微米 脂質體尺寸， 毫微米 (平均值±SD) VCR，毫克/ 毫莫耳磷脂 加入的包膠的 t|/2脂質， 小時 UnVCR* 小時 tl/2藥物釋 放 小時 50 76.8±27.2 100 96.1±3.0 35.6±2.7 30.3±4.0 227±96 200 193.3 士 3.9 20.8±2.2 18.4±0.7 244士130 350 375.2±1〇.〇 24.8±0.9 19.6±0.9 93.2±6.7 80 100 104.5±2.1 33.0±7.6 26.8 士 4.8 153±10 實例64•製備HER2·瞄準之脂質體長春新鹼，以及未-瞄 準和HER2-瞄準脂質體長春新驗對抗在老鼠中之HER2_ 過度表現之人類乳癌異種移植的抗腫瘤效力 根據實例63(省略[3H]-CHE組份），製備使用TEA-SOS法 b 的裝載長春新鹼之脂質體（Ls-VCR_SOS) ’使用50毫微米孔 隙尺寸的膜擠麼，並以宅克/毫莫耳的藥物/構脂比例來 裝載藥物。按照在實例43中的描述’藉著將Ls-VCR-SOS 與抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE共軛物（實例19)一起培養， 形成F5免疫脂質體長春新驗（F5_ILs-VCR)。以類似Ls-VCR-S0S脂質體的方式’除了以檸檬酸三乙銨溶液（藉著 以純淨的三乙胺滴定含水的檸檬酸至PH 5.1，並調整濃度 • 至0.65M三乙胺來製備）取代TEA-S0S溶液，製備使用TEA-檸檬酸鹽（Ls-VCR-Cit)的裝載長春新鹼之脂質體。治療研 究設計依據實例10的方法。在裸鼠中產生BT-474人類乳癌 的皮下異種移植腫瘤’並當腫瘤達到25〇立方毫米的尺寸 .(範圍144-309立方毫米）時，將老鼠分成8至9隻一組，並從 . 腫瘤接種後19天開始，以2毫克VCR/公斤的每週靜脈内劑 量，以自由VCR、Ls-VCR或F5-ILS-VCR治療。按照在實 例1 0中的描述監視腫瘤尺寸和動物體重。至於對照組以等 93060.doc 133· 1359029 體積的生理鹽水治療老鼠。在腫瘤接種後63天，使用 Mann-Whitney檢定，以統計學的方式評估在治療組之間， 在腫瘤尺寸上的差異。在圖43中出示各組的平均腫瘤尺寸 之動力學。當與Ls-VCR或自由VCR相比較時，F5-ILs-VCR證實最大的效力，在63天在8隻動物的6隻中引起完全 的腫瘤退化（75%)。Ls-VCR-Cit亦是有效的，在9隻動物的 2隻中（22%)仍觀察到引起完全的腫瘤退化，然而，它比 F5-ILS-VCR效力更低（p<0.005)。Ls-VCR-SOS和自由 VCR 具有相等的效力（p>〇_2)，且比F5-ILS-VCR或Ls-VCR-Cit效 力更低。因此，驚人的是，利用細胞-瞄準遞送，證明使 用本發明之多價陰離子包膠的脂質體藥物，比經由非-結 合陰離子進行脂質體包膠的藥物更有效。動物體重動力學 顯示所有的脂質體VCR製備物的毒性均比自由VCR更低， 在治療期間引起較少的體重喪失（圖44)。 實例65·製備EGFR-瞄準之脂質體長春新鹼，以及未-瞄準和EGFR-瞄準脂質體長春新鹼對抗在老鼠中之 EGFR-過度表現之人類腦癌異種移植的抗腫瘤效力 按照實例64，使用TEA-SOS法製備裝載長春新鹼的脂質 體（Ls-VCR)。按照在實例36中的描述，藉著將脂質體與 抗-EGFR Fab'C225Fab-PEG-DSPE共軛物共同培養，製備 EGFR-瞄準之免疫月旨質體長春新驗。 在側面以0.15毫升含有lxl07個U87人類神經膠質母細胞 瘤細胞的細胞生長培養基皮下注射雄性NCR nu/nu老鼠（5-6週齡，重17-20克），該細胞穩定地表現上皮生長因子受體 93060.doc •134· 1359029 (HER 1)突變EGFRv 在第11天，此時平均腫瘤尺寸達到 300-400立方毫米，將老鼠隨機分成ι〇12隻動物/組的四 組。在腫瘤接種後第11、18和25天，以自由VCR(硫酸長 春新驗1毫克/毫升在生理鹽水中）、Ls_vCR或C225Fab-ILs-VCR治療’投與1.5毫克/公斤之靜脈内劑量。在對照組中 的老鼠同樣地注射相等體積的生理鹽水。按照實例1〇監視 腫瘤尺寸和老鼠體重。在圖45中出示結果。所有以VCR調 配物治療的動物，與對照組動物相比較，均延遲腫瘤生 參 長。在以自由VCR和Ls-VCR治療的組之間沒有顯著差 異。EGFR-瞄準之C225Fab_ILs-VCR比自由VCR或未-瞄準 脂質體VCR更有效。 實例66.製備帶有陷入三乙銨肌醇六磷酸（tea-IHP)溶 液的脂質體 多陰離子化的多元醇，肌醇六磷酸（IHP)十二鈉鹽係獲 自Sigma(St. Louis, MO)。根據實例4的程序，藉著在 Dowex 50WX8-200交聯磺化聚苯乙烯樹脂上進行離子交 _ 換’接著以純淨的TEA滴定，並以水稀釋，製備含有 0.65M三乙銨和0.681M鱗酸群，pH 6.5，以及718毫莫耳/公 斤之滲透壓的水溶液。殘餘的鈉内含量低於陽離子總合的 1%。在60°C下將脫水脂質（150微莫耳DSPC、100微莫耳
* cho卜0.75微莫耳PEG-DSPE)溶解於0.5毫升100%乙醇USP • 中’並與4.5毫升預先加熱至相同溫度的三乙敍肌醇六麟 酸溶液混合。藉著在30-40毫米汞柱和40-45°C下旋轉汽 化，移除部份的乙醇，直到混合物顯示不起泡為止。然後 93060.doc •135· 1359029 在60-65°C下，通過兩個疊層的0.1微米孔隙尺寸聚碳酸酯 膜擠壓脂質懸浮液15次。藉著QELS，所得的脂質體之尺 寸為104.3±39.0毫微米。藉著凝膠層析法，在瓊脂糖4B管 柱上移除未包膠的三乙銨ΙΗΡ，以5 mM HEPES-Na，5%右 旋糖，pH 6.5緩衝溶液洗脫，並使用Bartlett's法，利用萃 取，根據實例70，藉著磷脂濃度定量脂質體。 實例67.將藥物裝載到帶有TEA-IHP溶液的脂質體内 以CPT11或長春瑞賓裝載實例67的脂質體。以175或350 克/莫耳之藥物-對-磷脂比例裝載長春瑞賓，並以250或500 克/莫耳之比例裝載CPT11。以下文指定的輸入藥物/磷脂 比例（參見表36)，將藥物加至在HEPES-右旋糖緩衝溶液中 的脂質體（實例67)。若需要，使用IN NaOH將pH值調整到 6.5-6.8。在60°C下培養該混合物30分鐘，在冰上冷卻15分 鐘，並在交聯葡聚糖G-25凝膠過濾管柱上層析，以5 mM HEPES-Na，145 mM NaCl，pH 6·5洗脫。使一等份的經過純 化之脂質體溶解於酸性甲醇中，並藉著分光光度分析來分 析之（實例71)。藉著Bartlett(1959)的方法，利用萃取來定 量鱗脂（實例70)。如同在表36中所示，兩種藥物均定量地 被裝載到脂質體中（即實際上100%)。 表36.裝載藥物到帶有陷入肌醇六磷酸之脂質體内的特性 藥物 輸入藥物/脂質比例， 克/莫耳磷脂 包膠藥物/脂質比例， 克/莫耳磷脂 裝載效率，％ 長春瑞賓 175 175_3±8.0 100.2士4.5 長春瑞賓 350 352.3±11.8 100.6±3.3 CPT-11 250 265.1±11.2 106.1±4.7 CPT-11 500 518.7±27.8 103.7±5.8 93060.doc -136- 1359029 實例68.在老鼠血漿的存在下，在活體外之自由或脂質 體CPT-11的化學穩定性
在體内，CPT· 11是前藥，經歷化學轉變形成有活性的藥 物代謝產物，稱為SN-38。SN-38和CPT-11兩者亦從其活性 内酯形式轉變為失活產物，稱為SN_38或CPT-11羧酸鹽。 在本實例中，研究根據本發明之CPT-11的脂質體化作用， 在血漿的存在下，對CPU丨化學轉變為這些產物的影響。 根據實例11，製備帶有陷入蔗糖八硫酸三乙銨（〇 65m TEA，pH 6.4 ,滲透壓485毫莫耳/公斤）和按3:2:〇 〇15莫耳 比例之DSPC、膽固醇和PEG_DSPE的脂f組成的脂質體， 使用通過兩個疊層的〇.08微米聚碳酸酯濾紙擠壓1〇次。藉 著QELS ’脂質體之尺寸為87_4±192毫微米。藉著在6代 下在含水的5 mM HEPES-Na，5%右旋糖，pH 65中培養3〇 分鐘，接著在冰上驟冷15分鐘，以大約5〇〇毫克cpTu鹼/ 毫莫耳脂質體磷脂裝載CPT_ i h然後在交聯葡聚糖g_75管 柱上純化裝載CPT-11的脂質體，以HEPES緩衝生理鹽水（5 mM HEPES，145 mM NaCl，pH 6.5)洗脫。所得的 cpT_u脂 質耀具有536.5±20.1毫克CPT-11/毫莫耳碟脂。藉著新近以 1毫克/毫升將伊立替康鹽酸鹽USP溶解於144 mM含水的 NaCl中，以稀釋的HC1酸化至pH 3，製備自由的cpT—^溶 液。將ίο微升等份的自由或脂質體CPT_U或自由cpt-^與 9〇微升肝素穩定化的老鼠血聚（Hadan Bi〇pr〇ducts，脱） 混合’並在抓下在震盪水浴中培養。在特定的時間點， 以一式三份，在瓊脂糖CL_4B尺寸排阻管柱（2毫升床體積） 93060.doc -137- 1359029
上層析脂質體試樣，以HBS-6.5洗脫，並藉著螢光檢測含 有藥物的溶離份。收集主要（空隙容積）和次要（殘餘）含有 藥物的高峰’並視為以脂質體方式包膠和釋放藥物溶離 份。藉著旋轉10秒’以400微升冰冷的曱醇萃取試樣，接 著以14，100xg離心5分鐘。分析上清液的CPT-11，並藉著 HPLC分析其轉變產物，使用經過修改之Warner和Burke, J
Chromatogr.，Ser. B Biomed. Sci. Appl. 1997，第 691，第
161-71頁的方法。移動相由3%醋酸三乙銨pH 5.5(溶液A) 和乙腈（溶液B)組成，在14分鐘内以20體積％B至50體積％B 的直線梯度’以1.0毫升/分鐘遞送。藉著在375毫微米處激 發和在500毫微米處發射的螢光檢測洗脫產物。停留時間 為5.3分鐘（CPT-11羧酸鹽）' 6.8分鐘（SN-38羧酸鹽）、9·3分 鐘（€卩！'-11)和11_〇分鐘（8>1-3 8)。結果（表3 7)指出雖然自由 CPT-11和從脂質體中釋放出的CPT-11經歷轉變，但脂質體 内的CPT-11仍是十分穩定的Q 表37.在老鼠血清中，在活體外自由和脂質體CPT-11轉 變為SN-38及羧酸鹽形式 試樣 時間， 小時 CPT-11，％ SN-38 · % 内酯 羧酸鹽 内酯 羧酸鹽 自由CPT-11 2 1.9±0.4 35.2±1.9 4.4±0.1 58.4±2.1 12 <0.1 11.5±0.9 9.9±0.8 78.6±1.3 24 <0.1 <0.1 22.5±9.8 77.5±9.8 Ls-CPT-11 12 97.7±0.1 <0.1 2.3±0.1 <0.1 (包膠的） 24 97.7±0.1 <0.1 2.3±0.1 <0.1 Ls-CPT-11 12 60.5±10.4 25.0±7.1 5.0±0.3 9.5±3.0 (釋放的） 24 78.3±6.7 14.0±5.2 6.5^0.5 1.2±1.7 實例69.自由或脂質體CPT-11在大鼠中的活體内化學穩 定性 93060.doc -138 - 1359029 按照實例68製備脂質體CPT_n，使用具有〇65m tea， pH 6.4和滲透壓502毫莫耳/公斤的蔗糖八硫酸三乙銨。脂 質體的尺寸為98.5±18.4毫莫耳，而CPT_U包膠為51〇 1 + 16.5毫克CPT-11/毫莫耳磷脂。以25毫克/公斤之劑量，將 脂質體和自由CPT-11靜脈内投與帶有留置中央靜脈套管的 雌性Albino大鼠（180-220克）内，並在48小時的期間内時時 抽取血液試樣。將血液試樣與含有〇 〇4% edta的冰冷pBS 混合，並快速離心移除血球。按照上文實例68，藉著 HPLC測定-等份上清液的CPT_n、SN 38及其幾酸鹽形 式。在圖46和47中出示結果。雖然極快地清除自由cpT_ 11，在3〇分鐘後便無法檢測，但脂質體cpT U持續在循環 中（tm 15.2小時），在24小時仍有37.8%的藥物在血液中， 且在48小時之後，仍有大約1〇%藥物在循環中。並沒有檢 測到CPT-ii的脂質體形式轉變為SN_384CpT_u的羧酸形 式。自由CPT-U，即以溶液形式投與，很快從循環中清除 (半衰期約16分鐘），並察覺到轉變為藥物的羧酸鹽形式。 實例70·脂質體磷脂的定量 經過修改的酸消化-藍磷鉬酸鹽法j。在BarUett(i959)之 後修改該方法。將-等份毫升的脂質體放在耐熱玻 璃試管中’藉著在no-ucrc下與0.5毫升1〇N硫酸一起加熱 2小時來消化’藉著加入50毫升9%過氧化氫礦化，並加献 額外的3〇分鐘，直到藉著W職條檢料#過氧化氣為、 止》在周圍溫度下，以i毫升〇.2%含水的钥酸敍稀釋經過 消化的試樣’與(M毫升5%含水的抗壞血酸混合，並在彿 93060.doc •139· 1359029 水浴中培養1〇分鐘。在800毫微米處測量還原之磷鉬酸鹽 複合物的吸光度，並與同時使用無機磷酸標準溶液產生的 標準曲線相比較。 經過修改的酸消化-藍磷鉬酸鹽法π。該方法為 M〇rm〇n(1964)之方法的修改。在耐熱玻璃試管中，將一 等份5微升之具有mM磷脂的脂質體與6〇微升濃硫酸和 10微升30/。過氧化氫混合。將該混合物加熱至w 分鐘，以〇·7微升去離子水稀釋，與1〇微升1〇%含水的亞硫 馨 H匕合，在彿水浴中培養5分鐘，並冷卻至周圍溫度。 加入200微升2%含水的鉬酸銨和1〇微升1〇%含水的抗壞血 酸，並在沸水浴中培養該試樣1〇分鐘。將試樣很快地冷卻 至周圍溫度，並在825毫微米處對空白試樣判定還原之磷 鉬酸鹽複合物的吸光度》從以相同行程，使用具有2、4、 6 ' 8和1〇 mM磷酸二氫鉀之標準溶液獲得的標準曲線來判 定磷脂的含量。 萃取法。以每份200微升甲醇-氣仿混合物（體積比1:2)萃 取一等份25-100微升的脂質體3次。在耐熱玻璃試管中混 合有機相，並在真空中移除溶劑。以1〇N硫酸處理殘餘 物’並進一步根據上文方法I測定磷。 . 除非另行指定，均以一式三份行程的平均值±標準差來 提交分析數據。 實例71.定量在脂質體中的藥物 分光光度分析定量。將一等份脂質體（1〇_5〇微升）與1毫 升70體積。/。之含有0.075·〇 1N HC1的含水異丙醇混合並 93060.doc •140· 1359029 在下列波長處對空白試樣測量吸光度：阿黴素，485毫微 米，CPT-11和拓撲太肯，372毫微米；玫瑰樹鹼，寫毫微 米，長春瑞負，270毫微米，·長春新鹼和長春花鹼，265毫 微米。藉著與同時執行的標準西線比較來判定藥物的量。 螢光分析定量。以酸化的異丙醇稀釋一等份含有脂質體 的试樣（例如血漿）（〇.〇2-〇.ι毫升的等份· ！毫升7〇%異丙醇· 0.075N HCI ; >〇.1毫升的等份：9〇%異丙醇_〇 1N狀丨至i 毫升）。若出現蛋白質沉澱，在冰上培養該試樣丨_2小時， 並藉著以12，l〇〇xg離心10分鐘使其澄清。在下列波長處測 1上清液的螢光：CPT_U，激發37〇毫微米，發射423425 毫微米；拓撲太肯，激發380-385毫微米，發射520-525毫 微米；玫塊樹鹼，激發306毫微米，發射52〇毫微米，從同 時執行的標準曲線，減去空白螢光之後，計算藥物的量。 實例72.脂聚合物對將長春瑞賓裝載至脂質體内之效率 的影響 根據實例11的方法，製備由DSPC 200莫耳比率、膽固醇 133莫耳比率和聚（乙二醇）（分子量2,〇〇〇)_衍生之脂質pEG· DSPE(l-20莫耳比率）或PEG-DSG(20莫耳比率），並含有包 膠0.65M TEA-SOS溶液所組成的脂質體，擠壓步驟係使用 8〇毫微米孔隙尺寸的膜。以350毫克/毫莫耳之藥物/磷脂比 例以長春瑞賓裝載脂質體，並根據實例4 Q的方法，從未 包膠的藥物中純化。按照在實例70、71中的描述，分析脂 質體的藥物和脂質内含量’並使用體積-重量高斯近似 值藉著QELS判定脂質體尺寸。結果（表）指出雖然以超過 93060.doc -141 - 1359029 1莫耳％脂質體磷脂的量（總脂質的0.3莫耳％)，陰離子性的 PEG衍生物，PEG-DSPE對藥物裝載效率有負面的影響， 但驚人的是中性衍生物，PEG-DSG卻對裝載效率沒有3 響，即使是以脂質體磷脂的9.1莫耳。/。（總脂質的57莫耳 〇/〇)。 表38.藉著TEA-SOS法，以各種量的咖·脂質衍生物製 備之長春瑞賓脂質體的特性 PEG-«~~PEG-^f f . ~ ---- _總脂質的莫耳％ 毫克/ 359·5±17·8 346.6±14.5 332.0±14.0 259.8±9.5 155.4±7.〇 61.2±5.2 362.7 士 14.2 PEG-DSPE 〇3 -复莫耳磷脂 包膠％ 102.7±5.2 99.0±4.1 94.9±3.8 74.2±2.0 44.4士0.9 17.5±0.3 103.6±4.2 PEG-DSPE 0.6 一 PEG-DSPE 1.8 ^ PEG-DSPE 2.9 PEG-DSPE 4.0 :33 PEG-DSPE 5.7 PEG-DSG 5.7 品:31 除非另行指定，否則均以 ,, 1从一式三份行程的平均值士標2| 差分析數據來提交分析數Μ 丄θ 」 據。大乳血襞的藥物動力學數邊 則是一式兩份行程的平均值+標準差。 雖然已經參考目前較佳的目η» ^ 1主的具體實施例來描述本發明，书 應了解可進行不違背本發明 货月之精神的各種修改。因此，肩 參考附錄的申請專利範圍，$ ^ ^ m 連同這類申請專利範圍認為肩 資格之相等物的完整範圍，來判U發明之範圍。所有指 及之文章和參考文獻的揭示时，包括專利申請案和公拐 案，全部以引用的方式倂入本文中。 【圖式簡單說明】 圖 之後 顯不在將CPT- I載的脂質體靜脈内團塊投與大鼠 脂質體脂質（圓形1_ )矛藥物（二角形）的血液藥物動力 93060.doc ' 142- 1359029 學。使用TEA-Pn法裝載脂質體（參見實例9)。 圖2顯示在靜脈内團塊投與使用τΕΑ_ρη法裝載咖山的 脂質^後’在活㈣在大“液中之藥物·對脂質體脂 質比例的動力學（參見實例9)。 圖3顯示自由CPT·#脂質體^丁七在裸鼠中 梢人類乳癌異種移植的抗腫瘤效力。"對照組••指派僅以 不含藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例ι〇卜 圖4顯示在以自由CPT_U或脂質體CPT-H治療攜帶BT_ 474腫瘤之裸鼠的期間，動物體重的動力學。，對照組"指 派僅以不含藥物和月旨質體之媒劑處理的纟鼠(參見實例 10)。 圖5顯示在靜脈内團塊投與使用TEA-SOS法裝載CPT_U 的脂質體之後，在活體内在大鼠血液中之藥物-對-脂質體 脂質比例的動力學（參見實例〗4)。 圖6顯不自由和脂質體CPT-11在裸鼠中對抗HT_29人類結 腸癌異種移植的抗腫瘤效力。在面板上的標題指出藥物裝 載方法和母次注射的投藥劑量。„生理鹽水對照組"指派僅 以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例1 5)。 圖7顯示在以自由或CPT-11之脂質體調配物治療攜帶Ητ_ 29腫瘤之裸良的期間，動物體重的動力學。誤差柱代表數 據的標準差。”生理鹽水對照組"指派僅以不含藥物和脂質 體之媒劑處理的老鼠（參見實例15)。 圖8A顯示在對大鼠靜脈内團塊投與裝載拓撲太肯 (p tecan)的脂質體之後’脂質體脂質的血液藥物動力 93060.doc -143- 1359029 θ 板上的#題指出藥物裝載方法和月旨質體的藥物内 含量（參見實例24)。 / θ帛丁在靜脈内團塊投與裝載拓撲太肯的脂質體之 後在活體内在大鼠血液中之藥物_對_脂質體脂質比例的 動力于纟面板上的帛題指出藥物裝載方法和月旨質體的藥 物内含量（參見實例24) 〇 圖9顯示自由、脂質體或HER2__準之免疫脂質體拓撲 太肯（TEA-Pn法）對SKBr_3乳癌細胞之在活體外的細胞毒性 (參見實例27)。 圖1〇顯示自由、脂質體或HER2·瞄準之免疫脂質體拓撲 太肯（TEA-SOS法）對SKBr-3乳癌細胞之在活體外的細胞毒 性（參見實例32)。 圖11顯示各種拓撲太肯（TPT)調配物在裸鼠中對BT-474 人類乳癌異種移植的抗腫瘤效力。"生理鹽水對照組"指派 僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例29)。 圖12顯示在以自由拓撲太肯（τρτ)、脂質體拓撲太肯（Ls_ TPT)或抗-HER2免疫脂質體拓撲太肯（F5 iLs_TPT)治療攜 帶BT-474腫瘤之裸鼠的期間，動物體重的動力學。，，對照 組''指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實 例 29)。 圖13A顯示拓撲太肯調配物在裸鼠中對抗bt-474人類乳 癌異種移植的抗腫瘤效力。以其最大耐受劑量的8分之一 投與自由拓撲太肯（自由TPT)或脂質體拓撲太肯（Ls-TPT)。誤差柱代表數據的標準差。"對照組•，指派僅以不含 93060.doc -144- 1359029 藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例3 〇。 圖13Β顯示拓撲太肯調配物在裸鼠中對抗Βτ_474人類乳 癌異種移植的抗腫瘤效力。以其最大耐受劑量的4分之一 .技與自由拓撲太肯（自由ΤΡΤ)或脂質體拓撲太肯（Ls_ TPT)。誤差柱代表數據的標準差p "對照組"指派僅以不含 藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例31)β 圖13C顯示拓撲太肯調配物在裸鼠中對抗Βτ_474人類乳 癌異種移植的抗腫瘤效力。以其最大耐受劑量的2分之一 # 投與自由拓撲太肯（自由TpT)或脂質體拓撲太肯（Ls-丁PT)。誤差柱代表數據的標準差^ ”對照組"指派僅以不含 藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例3 i。 圖13D顯示拓撲太肯調配物在裸鼠中對抗bt_474人類乳 癌異種移植的抗腫瘤效力。以其最大耐受劑量投與自由拓 撲太肯（自由TPT)或脂質體拓撲太肯（Ls-TPT)。誤差柱代 表數據的標準差。"對照組"指派僅以不含藥物和脂質體之 媒劑處理的老鼠（參見實例3 1)。 ® 圖14顯示在以其最大耐受劑量投與自由拓撲太肯（自由 TPT)或脂質體拓撲太肯（Ls-TPT)，治療攜帶BT-474腫瘤之 裸鼠的期間’平均體重的動力學。，，對照組”指派僅以不含 藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例3丨）。 圖15顯示自由6-(3-胺丙基）-玫瑰樹驗（ellipticine)(自由 . AE)、脂質體6-(3-胺丙基）-玫瑰樹鹼（Ls_AE)或HER2-瞄準 之免疫脂質體6-(3-胺丙基）-玫瑰樹鹼（F5 ILs-AE)在活體外 對抗BT-474乳癌細胞的細胞毒性（參見實例35)。 93060.doc • 145 · 1359029 圖16顯示自由6-(3-胺丙基）-玫瑰樹鹼（自由APE)、脂質 體6-(3-胺丙基）-玫瑰樹鹼（Ls-APE)或EGFR-瞄準之免疫脂 質體6-(3-胺丙基）-玫瑰樹鹼（C225-ILS-APE)對抗具有EGF 受體低（MCF-7)或高（MDA-MB468)表現之乳癌細胞的活體 外細胞毒性（參見實例36)。 圖17顯示以脂質體方式調配之6-(3-胺丙基）玫瑰樹鹼 (APE)的血液藥物動力學特性：在將ape脂質體的靜脈内 團塊投與大鼠之後，脂質體脂質（圖A，空心圓形）、藥物 (圖A，實心圓形）的血液藥物動力學，以及藥物-對-脂質體 脂質比例的動力學（圖B)(參見實例37)。 圖18顯示在脂質體（Ls-VRB)和抗-HER2免疫脂質體（F5-ILs-VRB)内調配之長春瑞賓的血液藥物動力學特性：在將 長春瑞賓脂質體的靜脈内團塊投與大鼠之後，脂質體脂質 (圖A)、藥物（圖B)的企液藥物動力學，以及藥物-對-脂質 體脂質比例的動力學（圖C)(參見實例43)。 圖19顯示在將裝載長春瑞賓之脂質體以靜脈内團塊投與 大鼠之後’脂質體脂質的血液藥物動力學。使用預先_陷 入硫酸葡聚糖三乙銨（DS-TEA)、硫酸葡聚糖銨（DS-A)或硫 酸銨（S-A)來裝載脂質體（參見實例44)。 圖20顯示在使用預先-陷入硫酸葡聚糖三乙敍（ds_ TEA)、硫酸葡聚糖錢（DS-A)或硫酸敍（S-A)以長春瑞賓裝 載脂質體的靜脈内團塊投藥之後，在活體内在大鼠之血液 中藥物-對-脂質體脂質比例的動力學（參見實例44)。 圖21顯示在將裝載長春瑞賓之脂質體以靜脈内團塊投與 93060.doc -146- 1359029 大鼠之後，脂質體脂質的血液藥物動力學。該脂質體使用 預先-陷入蔗糖八硫酸三乙銨（ΤΕΑ-SOS)來裝載，並具有在 面板上之標題指示的平均尺寸（參見實例45)。 圖22顯示在以長春瑞賓裝載脂質體的靜脈内團塊投藥之 後，在活體内在大鼠之血液中藥物-對-脂質體脂質比例的 動力學。該脂質體使用預先-陷入蔗糖八硫酸三乙銨（TEA-SOS)來裝載，並具有在面板上之標題指示的平均尺寸（參 見實例45)。 圖23顯示在使用ΤΕΑ-SOS法，在脂質體（Ls-VRB)或抗· HER2免疫脂質體（F5-ILS-VRB)内調配之長春瑞賓的靜脈内 團塊投藥之後，在大鼠中之脂質體脂質的血液藥物動力學 (參見實例46)。 圖24顯示在使用ΤΕΑ-SOS法，在脂質體（Ls-VRB)或抗-HER2免疫脂質體（F5-ILS-VRB)内調配之長春瑞賓的靜脈内 團塊投藥之後，在活體内在大鼠血液中之藥物-對-脂質體 脂質比例的動力學（參見實例46)。 圖25顯示自由長春瑞賓（自由VRB)、脂質體長春瑞賓 (Ls-VRB)或HER2-瞄準之免疫脂質體長春瑞賓（F5-ILS-VRB)對抗HER2-過度表現之人類乳癌細胞MDA-MB-453的 在活體外之細胞毒性（參見實例48)。 圖26顯示自由長春瑞賓（自由VRB)、脂質體長春瑞賓 (Ls-VRB)或HER2-瞄準之免疫脂質體長春瑞賓（F5-ILS-VRB)對抗HER2-過度表現之CaLu-3人類非小細胞肺癌細胞 的在活體外之細胞毒性（參見實例49)。 93060.doc -147- 1359029 圖27顯不自由長春瑞賓（自由VRB)、脂質體長春瑞賓（Ls VRB/SOS-TEA)或HER2-瞄準之免疫脂質體長春瑞賓（F5_ ILs-VRB/SOS-TEA)對抗HER2-過度表現之人類乳癌細胞 SKBr-3的在活體外之細胞毒性（參見實例5〇)。 圖28顯不自由長春瑞賓（自由VRB)或脂質體長春瑞賓（Ls VRB)對抗在裸鼠t之^29人類結腸癌異種移植的抗腫瘤 效力。生理鹽水指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理 的老鼠。誤差柱代表數據的標準差（參見實例51)。 圖29顯示在以自由長春瑞賓（自由vrb )、脂質體長春瑞 賓（Ls VRB)或僅有媒劑（生理鹽水）治療攜帶hT_29腫瘤之 裸鼠的期間，平均體重的動力學。誤差柱代表數據的標準 差（參見實例51)。 圖30顯示自由長春瑞賓（自由VRB)或脂質體長春瑞賓（Ls VRB)在同基因之C-26老鼠結腸癌模式中的抗腫瘤效力。 在面板標題上指示每次注射的藥物劑量。誤差柱代表數據 的標準差。"生理鹽水"指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑 處理的老鼠（參見實例52)。 圖31顯示在以各種劑量之自由長春瑞賓（自由vrB)、脂 質體長春瑞賓（Ls VRB)或僅有媒劑（生理鹽水）治療攜帶同 基因C-26老鼠結腸癌腫瘤的期間，平均體重的動力學。在 面板標題上指出每次注射的藥物劑量（參見實例52)。 圖32顯示自由長春瑞賓（自由藥物），或藉著tea-SOS法 製備之scFv F5-共輕之抗-HER2免疫脂質體長春瑞賓（F5_ ILs-VRB TEA-SOS)、藉著TEA_Pn法製備之抗_HER2免疫 93060.doc •148· 1359029 脂質體長春瑞賓（F5-ILs-VRB TEA-Pn)，對抗在裸鼠中之 HER2-過度表現之人類乳癌（BT-474)異種移植的抗腫瘤效 力° "生理鹽水"指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的 老鼠（參見實例53)。 圖33顯示在以自由長春瑞賓、使用TEA-SOS法製備之 scFv F5-共軛之抗-HER2免疫脂質體長春瑞賓、使用TEA-Pn法製備之抗_HER2免疫脂質體長春瑞賓或僅有媒劑治療 攜帶HER2-過度表現之人類乳癌（BT_474)異種移植之裸鼠 的期間，平均體重的動力學。關於符號的解釋，參見圖32 的標題（亦參見實例53)。 圖34顯示自由長春瑞賓（自由藥物）或使用各種含量之 PEG-脂質製備的scFv F5-共軛之抗-HER2免疫脂質體長春 瑞賓，對抗在裸鼠中之HER2-過度表現之人類乳癌（BT-474)異種移 植的抗 腫瘤效 力 。 誤差柱 代表數據的標 準差。 "媒劑對照組"指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老 鼠（參見實例54)。 圖35顯示自由長春瑞賓（自由NAV).、脂質體長春瑞賓 (NAV Lip)或FC225Fab’-共軛之抗-EGFR-免疫脂質體長春 瑞賓（C225-NAV Lip)，對抗在裸鼠中之EGFR-過度表現之 人類神經膠質母細胞瘤（U87)異種移植的抗腫瘤效力。生 理鹽水"指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老氡（參 見實例55)。 圖3 6顯示在使用硫酸三乙敍法在脂質體内調配之阿黴素 (doxorubicin)的靜脈内團塊投藥之後，在大鼠血液中之脂 93060.doc -149· 1359029 質體脂質的血液藥物動力學和藥物/脂質體脂質比例的動 力學（參見實例56) » 圖37顯示脂質體阿黴素（Ls-Dox)，和使用各種含量PEG-脂質製備的scFv F5-共軛之抗-HER2免疫脂質體阿黴素（F5 ILs-Dox)對抗在裸鼠中之HER2-過度表現之人類乳癌（BT-474)異種移植的抗腫瘤效力》面板上的標題顯示以脂質體 磷脂之分子％表達的PEG-脂質含量。，，生理鹽水對照組|，指 派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例 57) 。 圖38顯示脂質體長春花鹼在大鼠中的血液動力學（參見 實例58)。 圖39顯示在脂質體長春花鹼的靜脈内團塊投藥之後，在 大鼠血液中之藥物/脂質體脂質比例的動力學（參見實例 58) 。 圖40顯示自由長春新鹼（自由vcr) '脂質體長春新鹼 (Ls-VCR)或HER2-猫準之免疫脂質體長春新鹼（F5_ILs_ VCR)對抗HER2-過度表現之人類乳癌細胞sKBr-3的活體外 細胞毒性（參見實例61)。 圖41顯不在具有不同平均尺寸（在面板標題上指示）的脂 質體内調配之長春新驗的靜脈内團塊投藥之後，在大鼠中 之脂質體脂質的血液動力學（參見實例62)。 圖42顯示在具有不同平均尺寸（在面板標題上指示）的脂 質體内調配之長春新鹼的靜脈内團塊投藥之後，在大鼠血 液中之藥物/脂質體脂質比例㈣力學（參見實例62)。 93060.doc -150- 圖43顯示自由長春新鹼（自由VCR)、藉著檸檬酸三乙銨 法製備的脂質體長春新鹼（Ls-VCR檸檬酸）、藉著蔗糖八硫 酸三乙銨法製備的脂質體長春新鹼（Ls-VCR SOS)或藉著薦 糖八硫酸三乙銨法製備的scFv F5-共軛之抗-HER2免疫脂 質體長春新鹼（F5 ILs-VCR SOS)對抗在裸鼠申之HER2-過 度表現之人類乳癌（BT-474)異種移植的抗腫瘤效力。"生理 鹽水對照組"指派僅以不含藥物和脂質體之媒劑處理的老 鼠（參見實例64)。 圖44顯示在以自由長春新鹼（自由VCR)、藉著檸檬酸三 乙銨法製備的脂質體長春新鹼（Ls_VCR檸檬酸）、藉著蔗糖 八硫酸三乙銨法製備的脂質體長春新鹼（Ls-VCR SOS)、藉 著蔗糖八硫酸三乙銨法製備的scFv F5-共軛之抗-HER2免 疫脂質體長春新鹼（F5 ILs-VCR SOS)或僅以媒劑（生理鹽水 對照組）處理攜帶HER2-過度表現之人類乳癌（BT-474)異種 移植之老鼠的期間，平均體重的動力學（參見實例64)。 圖45顯示自由長春新鹼（長春新鹼）、脂質體長春新鹼 (nt-vcr)或C225 Fab·-共軛之抗-EGFR免疫脂質體長春新鹼 (C225-vcr)對抗在裸鼠中之EGFRvUI-過度表現之人類腦癌 (U87)異種移植的抗腫瘤效力。"生理鹽水"指派僅以不含 藥物和脂質體之媒劑處理的老鼠（參見實例65)。 圖46顯示在脂質體CPT-11的靜脈内團塊投藥之後，CPT-11的血液藥物動力學，以及出現在大鼠血液中之活性（内 酯）形式之CPT-11百分比的動力學（參見實例69)。 圖47顯示在CPT-11溶液（自由CPT-11)的靜脈内團塊投藥 93060.doc -151 - 1359029 之後，CPT-11的血液藥物動力學，以及出現在大鼠血液中 之活性（内酯）形式之CPT-11百分比的動力學（參見實例 69)。
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Claims (2)

  1. 年？月“日修(更^正本 第〇94丨14317號專利申請案 十、~~1 [麵卿⑻年w 1 · 在介暂 . A L· · I 買中之包含脂質體的組合物，該脂質體具有藉 著包括—9 一或多個脂質的膜與介質分開的内部空間，其中 該内，空間含有多聚陰離子及陽離子其中該多聚陰離 二夕元醇或糖，該多元醇係選自乙二醇、丙二醇、甘 油:海藻糖醇、赤癖糖醇、季戊四醇、核糖醇、阿拉伯 糖醇—山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、果糖 醇葡萄糖醇、木糖醇及肌醇，且該糖由一或二個分別 有從至7個碳原子之單醣單位所組成；該多聚陰離子係 經至少兩個陰離子性官能基多陰離子化，該至少兩個陰 i吕犯基選自至少兩個硫酸酯基團、至少兩個磷酸 西曰基團、至少兩個硼酸酯基團、至少兩個磺酸基團、至 v兩個膦酸基目、至少兩個硫代破酸基團及至少兩個二 硫代奴酸基團；且該陽離子為紫杉烷或喜樹鹼。 2·如叫求項丨之組合物，其中該多聚陰離子是多陰離子化 的糖或多陰離子化的肌醇。 3. 如明求項1或2之組合物，其中該至少兩個陰離子性官能 基為至少兩個硫酸鹽基團或至少兩個磷酸鹽基團。 4. 如請求項1之組合物，其中該糖為葡萄糖、半乳糖、甘 露糖、果糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、乳糖、海蕩糖、 嚴糖、麥芽糖或纖維二糖。 5. 如清求項1之組合物，其中該喜樹鹼包含伊立替康 (irin〇tecan)、拓撲太肯（t〇p〇tecan)、勒托替康 (lurtotecan)、喜拉替康（silatecan)、9胺基喜樹鹼、 93060-l000916.doc 1359029 10,11-亞曱二氧基喜樹驗或9_硝基喜樹驗。 6. 如請求項丨之組合物，其中該喜樹鹼為伊立替康。 7. 如請求们之組合物，纟令該紫杉⑥包含紫杉醇或多舍 他昔（docetaxel)。 8. 如請求項丨之組合物，其中該脂質體另包含經取代銨， 其係選自由下列組成之群：異丙基乙銨、異丙基甲銨、 異丙錄、第三-丁基乙錄、二環己錢、嗎琳 '。比錠、六 氫吡錠、吡咯錠、六氫吡畊、第三_丁銨、2_胺基_2_曱 基丙醇-1，2-胺基-2-甲基-丙二醇_1，3，三_(經乙基）胺基甲 烷、N，N，-二乙基-乙醇銨、N，N，，N"-三_(2羥乙基）銨、 N，N’-雙_(2-羥乙基）乙銨、三甲銨、三乙銨二乙基曱 銨、二異丙基乙銨、三異丙銨、N-曱基嗎貅、1-(2_羥乙 基）六氫吡錠、1-甲基吡咯錠、M_二甲基六氫吡鉼、四 甲錢、四乙銨和四丁銨。 9. 如請求項8之組合物，其中在該脂質體内部空間中之經 取代銨的濃度比在含有脂質體之介質中經取代銨的濃度 更高。 10. 如請求項1之組合物，其中該一或多個脂質包含pEG神 經酿胺或PEGH-二醯基甘油。 11. 如睛求項1之組合物，其中該一或多個脂質包含N_ (PEG)-二醯基·磷酯醯乙醇胺。 12. 如請求項U之組合物，其中該N_(PEG)_:醯基磷醋酿乙 醇胺係低於脂質體所包含總脂質的1莫耳％。 13. 如請求項1之組合物，其中該一或多個脂質包含大約3:2 93060-1000916.doc 1359029 莫耳比例之卵磷脂和膽固醇。 14. 如請求項1之組合物，其中該一或多個脂質包含磷酯醯 膽驗β 15. 如請求項14之組合物其甲該磷酯醯膽鹼係選自由以下 組成之群：i，2_二硬脂醯基-卵磷脂、丨，2_二棕櫚醯基卵 構脂、1,2-二肉莖蔻醯基卵磷脂、1，2·二油醯基卵磷脂、 1_硬胳醯基_2·油醯基卵磷脂和1-棕櫚醯基-2-油醯基卵磷 脂。 16. 如請求項1之組合物，其中該多聚陰離子是多硫酸化的 廣、糖’每個分子具有3至8個硫酸根基團。 17. 如請求項16之組合物，其中該多硫酸化的蔗糖是蔗糖八 硫酸。、 18. 如請求項1之組合物，其中該多聚陰離子是肌醇六磷 酸。 19. 如請求項丨之組合物，其中在該脂質體内部之多聚陰離 子的濃度是至少大約0.05 ' 0.1、0.2、0.5、0.6或〇 7克_ 當量/公升。 20. 如請求項1之組合物，其中在該脂質體内部之多聚陰離 子的濃度是大約0.65克-當量/公升。 21. 如請求項丨之組合物，其中該紫杉烷或喜樹鹼以超過該 紫杉烷或喜樹鹼在介質中之濃度的濃度存在該内部空間 中。 工 22. 如請求項21之組合物，其中該介質基本上不含- °〆*杉烧 或喜相·驗。 93060-1000916.doc 1359029 23.如請求項丨之組合物，其中該紫杉烷或喜樹鹼對全體脂 質的莫耳此例為至少大約〇.〇5、大約G1、大約Q 2或大約 0·3。 24. 如請求们之組合物，其中該紫杉烷或喜樹鹼為伊立替 康，且在2-8艽下6個月之後，該伊立替康的至少卯^仍 包膠在脂質體内。 25. 如請求机組合物’其中該紫杉烷或喜樹鹼為伊立替 康’且在2-8°C下2年之後，該伊立替康的至少8〇%仍包 膠在脂質體内。 26·如請求項丨之組合物，其中該陽離子為伊立替康，且將 該陽離子在按照第-個陽離子_對_脂質比例包膠在該組 合物的脂質體内’且其中在將該組合物投與哺乳動物之 血流内之後24小時，該陽離子仍以第二個陽離子_對_脂 質比例包膠在脂質體中，其中該第二個陽離子务脂質 比例超過第-個陽離子_對脂質比例的5q%，至少仙％， 或至少70%。 27.如請求項26之組合物，其中該哺乳動物是大鼠。 从如請求们之組合物’其中該一或多個脂質及包膠在其 中的紫杉烧或喜樹驗之紫杉统-對-脂質或喜樹驗-對-脂 質莫耳比例為至少約〇 · i 〇 ’其中該組合物具有在活體内 的抗-贅生物活性，至少比以自由非脂質體形式之紫杉 烷或喜樹鹼的抗-贅生物活性高至少4倍。 29.如請求項28之組合物，其 合物的毒性相等或低於或 中投與哺乳動物之該脂質體組 至少2倍低於以自由非-脂質體 93060-1000916.doc 1359029 形式投與該哺乳動物之該紫杉烷或喜樹鹼的毒性。 30. 如請求項28之組合物，其中投與哺乳動物之該脂質體組 合物的毒性比以自由非-脂質體形式投與該哺乳動物之該 紫杉烧或喜樹驗的毒性低至少4倍。 31. 如請求項28之組合物，其中投與至哺乳動物之血流内的 該組合物具有至少10小時的從該脂質體之該紫杉烷或喜 樹鹼的半-釋放時間。 32. 如請求項31之組合物，其中投與至哺乳動物之血流内的 該紫杉烷或喜樹鹼具有至少24小時的從該脂質體之半釋 放時間。 33. 如請求項28之組合物，其中以每莫耳脂質至少大約〇3〇 莫耳糸杉烧或喜樹驗的濃度使該紫杉烧或喜樹驗陷入。 34. 如請求項28之組合物，其中以在每莫耳脂質大約〇4〇莫 耳紫杉院或喜樹驗到每莫耳脂質大約1 .〇莫耳紫杉烧或直 樹驗之間的濃度，使該紫杉烷或喜樹鹼陷入。 3 5.如請求項29之組合物，其中該哺乳動物是老鼠。 36. 如请求項28-35中任一項之組合物，其中在ht-29腫瘤模 式或BT-474腫瘤模式中，在活體内判定該紫杉烷或喜樹 驗具抗-腫瘤活性。 37. 如請求項31或32之組合物，其中該哺乳動物為大鼠。 38. 如請求項2之組合物，其中該紫杉烷或喜樹鹼為包含紫 杉醇或多舍他昔之紫杉烷，其中該紫杉烷基本上包含於 該脂質體的内部空間内。 39. 如請求項38之組合物，其中該紫杉烷是離子中性。 93060-1000916.doc 1359029 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 如凊求項38之組合物，其中該包膠紫杉烧的量是每莫耳 該脂質至少0.05莫耳。 如請求項40之組合物，其中該包膠紫杉烷的量是每莫耳 該脂質至少0.1莫耳β 如請求項38-41中任一項之組合物，其中該内部空間基本 上不含加溶劑’其選自形成膠束的界面活性化合物和環 糊精化合物。 ^ 如請求項1之組合物，其中該一或多個脂質包括利用聚 (乙二醇）衍生的脂質。 如請求項43之組合物，其中該聚（乙二醇）_衍生之脂質包 括高達該脂質總額的20莫耳0/〇。 如請求項43之組合物，其中該聚（乙二醇）-衍生之脂質包 括低於該脂質總額的1莫耳％。 如請求項43之組合物，其中該脂質體在哺乳動物中具有 的血液循環壽命比除了缺少該聚（乙二醇）_衍生之脂質之 外相同組成的脂質體的循環壽命高出兩倍以下。 如清求項46之組合物，其中該哺乳動物為大鼠。 如請求項45之組合物，其中該聚（乙二醇）、衍生之脂質包 括從該脂質總額的大約〇. 1莫耳％到大約0.9莫耳0/〇。 仰Μ水項43之組合物，其中該聚（乙二醇广衍生之脂質 聚（乙二醇）·衍生之磷脂、聚（乙二醇）·衍生之二醯基 油、聚（乙二醇）-衍生之二烷基甘油、聚（乙二醇）衍生 神經醯胺、聚（乙二醇）-衍生之脂肪酸、聚（乙二醇）_衍 之脂肪醇或聚（乙二醇）-衍生之脂醇。 9306040009丨 6.doc -6- 1359029 50. 如請求項49之組合物，其中該聚（乙二醇）具有至少三個 乙一醇單元。 51. 如請求項49之組合物，其中該聚（乙二醇）具有大約2〇〇到 大約10,000之分子量。 52. 如請求項49之組合物，其中該聚（乙二醇）具有從大約5⑼ 到大約5,〇〇〇之分子量。 53. 如請求項49之組合物，其中該脂質體包括瞄準部分其 為包括抗體的抗原結合序列之天然、合成或重組產生的 蛋白質。 54_如請求項53之組合物，其中該瞄準部分是抗體、其抗原_ 結合片段、包括抗體之抗原-結合多肽序列的單鏈蛋白質 或單—-功能部位抗體。 55. 如請求項53之組合物，其中該瞄準部分與該脂質體膜連 接’並暴露在該介質中。 56. 如凊求項55之組合物，其中該連接瞄準部分包括聚（乙二 醇）’其連接該脂質體膜與該部分。 57·如明求項56之組合物，其中該聚（乙二醇）具有大約250到 大約3〇,〇〇〇之分子量。 58. 如凊求項55之組合物，其中該瞄準部分影響該脂質體内 化至細胞中的作用。 59. 如凊求項56之組合物其中該瞄準部分選擇性地結合受 體酪胺酸激酶、生長因子受體、血管生成因子受體、鐵 運載蛋白受體、細胞黏連分子或維生素受體。
  2. 60. Yg _ 959之組合物，其中該酷胺酸激酶受體是生長因 93060-1000916.doc 1359029 子受體》 61. 62. 63. 64. 65. 如請求項60之組合物，其中該酪胺酸激酶生長因子受體 疋 EGFR、ErbB-2(HER-2)、ErbB-3(HER-3)或 ErbB-4(HER-4)。 如請求項59之組合物，其中該血管生成因子受體是bFGF 受體或VEGF受體。 如請求項59之組合物’其中該細胞黏連分子是整聯蛋 白0 如凊求項58-63中任一項之組合物’其中該細胞是惡性細 胞。 一種將為喜樹驗或紫杉烧之化合物包膠至介質中脂質體 内的方法，該脂質體具有藉著包括一或多個脂質的膜與 介質分開的内部空間，其中該内部空間包含為多元醇或 糖之多聚陰離子，其中該多元醇係選自乙二醇、丙二 醇、甘油、海藻糖醇、赤癬糖醇、季戊四醇、核糖醇、 阿拉伯糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇、麥芽糖 醇、果糖醇、葡萄糖醇、木糖醇及肌醇；該糖由—或二 _ 個分別有3至7個碳原子之單醣單位所組成；該多聚陰離 子係經至少兩個硫酸酯、磷酸酯、硼酸酯、磺酸基團、 鱗酸基團'硫代碳酸基團或二硫代碳酸基團多陰離子 化’且s亥脂質體另包括介於該内部空間及該介質間之有 效地將該紫杉烷或喜樹鹼保留在該脂質體内的穿透膜梯 度’該梯度為錄離子梯度，其係選自由以下組成之群： 異丙基乙銨、異丙基曱銨、二異丙銨、第三·丁基乙銨、 93060-1000916.doc 1359029 —環己敍、嗎琳、η比咬、六氫β比咬、n比洛咬、六氫。比 11井、第三-丁銨、2-胺基-2·甲基丙醇-1,2-胺基-2-甲基-丙 二醇-1,3,三-(羥乙基胺基甲烷、N，N'-二乙基-乙醇銨、 N，N’，N"-三-(2-羥乙基）銨、N，N，-雙-(2-羥乙基）乙銨、三 甲敍、三乙銨、二乙基甲銨、二異丙基乙銨、三異丙
    敍、N-甲基嗎啉、^(八羥乙基）六氫吡啶、丨·甲基吡咯 咬、1，4-二甲基六氫吡畊、四甲銨、四乙銨和四丁銨； 該方法包括將該紫杉烷或喜樹鹼以足以使該紫杉烷或喜 樹驗包膠至該脂質體之時間接觸該脂質體。 66.如請求項65之方法，其中該紫杉烷或喜樹鹼的至少一部 分進入該脂質體的内部空間。 67. 如清求項65之方法，其中該紫杉烧或喜樹驗的至少$ 進入該脂質體的内部空間。 68. 如請求項65之方法’其中該紫杉统或喜樹驗中成為包 至脂質體内的比例為至少80%、至少9G%或至少95%。
    69·如請求項65之方法，其中該糖為葡萄糖 '半乳糖、甘 糖 '果糖、木糖 '仿撼 核糖、阿拉伯糖、乳糖、海藻糖、 糖、麥芽糖或纖維二糖。 μ 70.如請求項65之方法 的莫耳比例為至少 0.3。 其中该紫杉烷或喜樹鹼對全體脂質 大約0.05、大約〇,】 大約0.2或大約 其中該多 71.如清求項65之方法糖。 疋醇為肌醇或該糖為蔗 糖八硫酸或肌 72·如清求項65之方法 其中多聚陰離子為蔗 93060-I0009l6.doc 1359029 醇六鱗酸。 73.如請求項65之方法，其中該接觸是在含水溶液中。 月长項73之方法，其中該含水溶液具有範圍在大約* 到大約7内的卩只值β %如請求項73之方法’其中該含水溶液具有等於或低㈣ mM氣化鈉所具有的離子強度。 76. 如請求項73之方法，其中該含水溶液具有等於或低㈣ mM氯化鈉所具有的離子強度。 77. 如明求項73之方法，其中該含水溶液具有纟約6〇到大約 7·〇之間的pH值’且該紫㈣或喜樹驗為包括紫杉醇或 多舍他昔之紫杉烷。 78. 如請求項77之方法，其中該含水溶液的PH值大約6.5。 79· U項76之方法’其中該含水溶液的pH值是在大約5 到大約7之間，且該紫杉烷或喜樹鹼為包括伊立替康、 拓撲太肯、勒托替康、喜拉替康、9·胺基喜樹驗、 1〇，11_亞甲二氧基喜樹驗或9-硝基喜樹驗之喜樹鹼。 8〇.如請求項79之方法，其中該含水溶液的PH值是在大約 到大約6.5之間’且該喜樹鹼為拓撲太肯或伊立替 8L如請求項75之方法’其中在該接觸之後，增加該含水溶 液的離子強度到50 mM氣化鈉所具有的離子強度以上。 82.如_81之方法’纟中增加該離子強度值到至少100 mM氯化鈉所具有的離子強度。 83·如明求項82之方法 其中增加該離子強度值到至少150 93060-1000916.doc 1359029 mM氣化鈉所具有的離子強度。 84. —種包含喜樹鹼或紫杉烷化合物之脂質體，其中該化合 物係經如請求項65至83中任一項之方法包膠至該脂質體 内。
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