ES2616047T3 - Liposomas útiles para la administración de fármacos - Google Patents

Liposomas útiles para la administración de fármacos Download PDF

Info

Publication number
ES2616047T3
ES2616047T3 ES05745505.7T ES05745505T ES2616047T3 ES 2616047 T3 ES2616047 T3 ES 2616047T3 ES 05745505 T ES05745505 T ES 05745505T ES 2616047 T3 ES2616047 T3 ES 2616047T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
liposomes
drug
liposome
topotecan
liposomal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05745505.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Keelung Hong
Daryl C. Drummond
Dmitri B. Kirpotin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merrimack Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Merrimack Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35320018&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2616047(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merrimack Pharmaceuticals Inc filed Critical Merrimack Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2616047T3 publication Critical patent/ES2616047T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/12—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by acids having the group -X-C(=X)-X-, or halides thereof, in which each X means nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium, e.g. carbonic acid, carbamic acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/906—Drug delivery
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/906—Drug delivery
    • Y10S977/907—Liposome

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Una composición que comprende un liposoma en un medio, en donde el liposoma comprende 1,2- diestearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi-poli[etilenglicol]oxicarbonil)-1,2- distearoilfosfatidil-etanolamina en la relación molar 3:2:0,015, y capturados en el interior del liposoma se encuentran irinotecán y octasulfato de sacarosa.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Liposomas utiles para la administracion de farmacos DESCRIPCION
Campo de la invencion
Esta invencion se refiere con caracter general al campo de los liposomas, y mas espedficamente a las composiciones de liposomas utiles para la administracion de entidades terapeuticas o diagnosticas.
Antecedentes de la invencion
Los liposomas, o vesfculas de doble capa Kpida, se han utilizado o propuesto para usar en diversas aplicaciones de investigacion, industria y medicina, especialmente para el uso como portadores de compuestos diagnosticos o terapeuticos in vivo. Consulte, entre otros: Lasic, D. Liposomes: from physics to applications. Elsevier, Amsterdam, 1993. Lasic, D, and Papahadjopoulos, D., eds. Medical Applications of Liposomes. Elsevier, Amsterdam, 1998. Los liposomas suelen caracterizarse por tener un espacio interior aislado del medio exterior por una membrana de una o varias bicapas que forman un saco microscopico o vesfcula. Las membranas bicapa de los liposomas suelen estar formadas por lfpidos, es decir, moleculas anfifflicas de origen sintetico o natural que incluyen dominios hidrofobicos e hidrofflicos especialmente separados. Consulte Lasic D., 1993, supra. Las membranas bicapa de los liposomas tambien pueden formarse por polnrieros anfifflicos y tensioactivos (polimerosomas, niosomas). Un liposoma suele actuar como portador de una entidad como, por ejemplo, sin caracter restrictivo, un compuesto qdmico, una combinacion de compuestos, un complejo supramoleclar de origen natural o sintetico, un material genetico, un organismo vivo, una porcion de los anteriores, o una derivacion de los anteriores, que es capaz de tener propiedades utiles o ejercer una actividad util. Para ello, los liposomas se preparan para contener la entidad deseada en una forma de liposoma incorporado. El proceso de incorporacion de una entidad deseada en un liposoma suele conocerse como “carga”. La entidad de liposoma incorporado puede cargarse total o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o bien puede asociarse con la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporacion de entidades en liposomas tambien se conoce como encapsulacion o captura, y estos tres terminos se utilizan en el presente documento de forma indistinta y con el mismo significado. El proposito de la encapsulacion liposomica de una entidad suele ser proteger la entidad del entorno destructivo, al tiempo que ofrece la oportunidad a la entidad encapsulada de ejercer su actividad mayoritariamente en el lugar o en el entorno donde dicha actividad resulta ventajosa pero menos que en otros lugares donde dicha actividad puede ser inutil o indeseada. Este fenomeno suele conocerse como administracion. Por ejemplo, una sustancia farmacologica dentro del liposoma puede estar protegida de la destruccion por las enzimas del organismo, pero son liberadas del liposoma y proporcionan tratamiento en el lugar de la enfermedad.
Idealmente, dichos liposomas pueden prepararse para incluir el compuesto deseado (i) con una alta eficacia de carga, es decir, un alto porcentaje de la entidad encapsulada respecto de la cantidad capturada durante el proceso de encapsulacion; (ii) alta cantidad de entidad encapsulada por unidad de material bicapa de liposoma; (iii) en una concentracion alta de la entidad encapsulada, y (iv) en una forma estable, como, por ejemplo, con una liberacion escasa (fuga) de una entidad encapsulada tras su almacenamiento o generalmente antes de que el liposoma aparezca en el lugar o en el entorno donde se preve que la entidad capturada en el liposoma ejerza su actividad prevista.
WO2005/002546, WO98/17256, US-4321259, US-5316771, US-5785987 y US-6110491 describen liposomas para encapsulacion y los metodos de produccion.
Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de proporcionar varias composiciones de liposomas que sean utiles para la administracion de diversos compuestos, especialmente entidades terapeuticas, diagnosticas o de creacion de imagenes.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que el amonio substituido y el polianion son utiles para cargar y retener las entidades dentro de los liposomas. En consecuencia, la descripcion presente proporciona metodos y composiciones de liposomas que resultan utiles para administrar diversas entidades, especialmente las entidades terapeuticas, es decir, entidades utiles en el diagnostico, pronostico, realizacion de pruebas, exploracion, tratamiento o prevencion de una afeccion no deseada, por ejemplo, una enfermedad en un organismo vivo, como un ser humano, una planta o un animal.
La invencion proporciona una composicion formada por un liposoma en un medio, donde el liposoma comprende 1,2-diestearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol)oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidil -etanolamina en la relacion molar 3:2:0,015, y capturado dentro del liposoma se encuentran irinotecan y octasulfato de sacarosa.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica formada por la composicion del liposoma de la invencion, un portador aceptable a nivel farmaceutico y una sustancia tampon.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una realizacion, la presente descripcion proporciona una composicion formada por un liposoma en un medio, donde el interior del liposoma contiene un amonio sustituido
n:
R4—N—R2 (|)
R3
en donde cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente un hidrogeno o un grupo organico que tiene, inclusivamente, un total de hasta 18 atomos de carbono, donde al menos uno de los Ri, R2, R3 y R4 es un grupo organico, donde el grupo organico es independientemente un grupo hidrocarburo con hasta un total de 8 atomos de carbono, y es un grupo alquilo, alquilideno, alquilo heterodclico, cicloalquilo, arilo, alquenilo o cicloalquenilo o bien un derivado hidroxi sustituido de los anteriores, que incluye opcionalmente dentro de su cadena de hidrocarburo atomos de S, O o N, que forma un eter, ester, tioeter, amina o enlace amida, donde al menos tres de los Ri, R2, R3 y R4 son grupos organicos, o el amonio sustituido es un amonio con impedimento esterico como, por ejemplo, los casos en que al menos uno de los grupos organicos tienen un atomo de carbono secundario o terciario unido directamente al atomo de nitrogeno amoniacal. Preferiblemente, el compuesto de amonio sustituido encapsulado en liposomas tiene un logaritmo negativo de la constante de disociacion acida (despronotacion) (pKa) de al menos aproximadamente 8,0, al menos aproximadamente 8,5 al menos aproximadamente 9,0, al menos 9,5, o al menos 10,0, segun se ha determinado en una solucion acuosa a temperatura ambiente.
En otra realizacion, la presente descripcion proporciona una composicion formada por un liposoma en un medio, donde el espacio interior del liposoma contiene un polianion y donde el polianion es un poliol polianonizado o un azucar polianonizado. El liposoma contiene preferiblemente un gradiente transmembrana que puede efectuar la carga de cualquier entidad en el liposoma. En una realizacion, el gradiente transmembrana es un gradiente de un amonio, un amonio cuaternario o un amonio sustituido primario, secundario o terciario que tiene en una solucion acuosa diluida a temperatura ambiente un logaritmo negativo de la constante de disociacion acida (despronotacion) (pKa) de al menos aproximadamente 8,0, al menos 8,5, al menos 9,0, al menos 9,5 o al menos 10,0 aproximadamente. El liposoma contiene opcionalmente una entidad capturada, por ejemplo, un marcador terapeutico detectable o una molecula organica cationica globalmente.
En otra realizacion, la composicion proporcionada por la presente descripcion contiene ademas una entidad encapsulada en los liposomas de la presente descripcion. Preferiblemente, la entidad esta encapsulada dentro del espacio interior del liposoma. Por ejemplo, el espacio interior del liposoma contiene un compuesto terapeutico antineoplasico, en el cual el nivel de toxicidad de la composicion para un sujeto es al menos igual o inferior al nivel de toxicidad del compuesto terapeutico antineoplasico administrado a un sujeto sin la composicion.
En otra realizacion, la composicion proporcionada por la presente descripcion es una composicion de liposoma que forma un compuesto de camptotecina. La composicion tiene una actividad anti-cancengena de al menos dos veces, cuatro veces, o diez superior al compuesto de camptotecina administrado de forma similar en ausencia de la composicion, mientras que la toxicidad de la composicion no se supere, es de al menos dos veces, o al menos cuatro veces inferior a la toxicidad del compuesto de camptotecina administrado de forma similar en ausencia de la composicion. En una realizacion, el compuesto de camptotecina es un profarmaco y esta contenido en el liposoma en al menos 0,1 mg, al menos 0,2 mg, al menos 0,3 mg, al menos 0,5 mg o al menos 1 mg por 1 mg de los materiales de la membrana del liposoma, p. ej. lfpidos. El compuesto de camptotecina esta encapsulado preferiblemente en el liposoma sustancialmente dentro del espacio interno del liposoma. En un caso, el compuesto de camptotecina es irinotecan (CPT-11).
En otra realizacion, la composicion proporcionada por la presente descripcion es una composicion de liposoma de un alcaloide de la vinca o un derivado del mismo. La composicion tiene una retencion del farmaco de 24 horas dentro del liposoma despues de una exposicion de 24 horas en la sangre de un mairnfero in vivo de al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 70% de la carga de farmaco original. El alcaloide de la vinca o un derivado del mismo esta encapsulado preferiblemente en el liposoma sustancialmente dentro del espacio interior del liposoma. Un ejemplo de mai^ero es una rata. Algunos alcaloides de la vinca ilustrativos y sus derivados son vincristina, vinblastina y vinorelbina.
En otra realizacion adicional, la presente descripcion proporciona un metodo de encapsular una entidad en un liposoma. El metodo incluye poner en contacto los liposomas de la presente descripcion con una entidad, p. ej. entidad terapeutica o detectable. Preferiblemente, el contacto se realiza bajo las condiciones cuando la concentracion del amonio sustituido o un polianion de la presente descripcion en el medio es inferior a la del espacio interno de los liposomas. En una realizacion, la composicion del liposoma entra en contacto con una entidad en un medio acuoso.
En otra realizacion adicional, la presente descripcion proporciona un metodo de encapsular una entidad en un liposoma. El metodo comprende poner en contacto de la composicion que contiene el liposoma de la presente descripcion con una pre-entidad, donde la pre-entidad es capaz de convertirse en una entidad bajo una condicion, y proporcionar la condicion dentro del liposoma, convirtiendo de esta forma la pre-entidad en la entidad dentro del liposoma. En un caso, la entidad es un compuesto organico y la pre-entidad es un derivado basico del mismo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otra realizacion adicional. la presente descripcion proporciona un kit para crear entidades encapsuladas en liposomas. El kit esta formado por un liposoma de la descripcion actual y, opcionalmente, un recipiente que contiene una entidad y/o instrucciones para el usuario, por ejemplo, para encapsular una entidad.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido del liposoma (drculos) y el farmaco (triangulos) despues de la administracion intravenosa del bolo de liposomas cargados con CPT-11 a una rata. Los liposomas se cargan usando el metodo TEA-Pn (consulte el Ejemplo 9).
La Figura 2 muestra la dinamica de la relacion lipfdica de farmaco-liposoma en la sangre de una rata in vivo despues de una administracion intravenosa del bolo del liposoma cargado con CPT-11 usando el metodo TEA-Pn (consulte el Ejemplo 9).
La Figura 3 muestra la eficacia antitumoral de CPT-11 libre y CPT-11 liposomal frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones lampinos. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 10).
La Figura 4 muestra la dinamica de pesos corporales de los animales durante el tratamiento de ratones lampinos con tumores BT-474 con CPT-11 libre o CPT-11 liposomal. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 10).
La Figura 5 muestra la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-liposoma en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa in vivo del bolo del liposoma cargado con CPT-11 usando el metodo TEA-SOS. (Consulte el Ejemplo 14).
La Figura 6 muestra la eficacia antitumoral de CPT-11 libre y CPT-11 liposomal frente a xenoinjertos de cancer de colon humano HT-29 en ratones. La leyenda del panel indica el metodo de carga del farmaco y la dosis administrada por inyeccion. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 15).
La Figura 7 muestra la dinamica de los pesos corporales de los animales durante el tratamiento de ratones lampinos con tumores HT-29 con formulaciones de CPT-11 libre o CPT-11 liposomal. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 15).
La Figura 8A muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma despues de la administracion intravenosa a una rata del bolo de liposomas cargados con topotecan. La leyenda del panel indica el metodo de carga del farmaco y el contenido de farmaco de los liposomas. (Consulte el Ejemplo 24).
La Figura 8B muestra la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-a-liposoma en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa in vivo del bolo con topotecan. La leyenda del panel indica el metodo de carga del farmaco y el contenido de farmaco de los liposomas. (Consulte el Ejemplo 24).
La Figura 9 muestra la citotoxicidad in vitro de topotecan libre, liposomal, o inmunoliposomal dirigido a HER2 (metodo TEA-Pn) contra las celulas de carcinoma de mama SKBr-3. (Consulte el Ejemplo 27).
La Figura 10 muestra la citotoxicidad in vitro de topotecan libre, liposomal o inmunoliposomal dirigido a HER2 (metodo TEA-SOS) contra las celulas de carcinoma de mama SKBr-3. (Consulte el Ejemplo 32).
La Figura 11 muestra la eficacia antitumoral de varias formulaciones de topotecan (TPT) frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 29).
La Figura 12 muestra la dinamica de pesos corporales de los animales durante el tratamiento de ratones lampinos con tumores BT-474 con topotecan libre (TPT), topotecan liposomal (Ls-TPT) o topotecan inmunoliposomal dirigido contra HER2 (F5 ILs-TPT). “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 29).
La Figura 13A muestra la eficacia antitumoral de formulaciones de topotecan frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones lampinos. Se administraron topotecan libre (TPT libre) o topotecan liposomal (Ls-TPT) a una octava parte de sus dosis maximas toleradas. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 31).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La Figura 13B muestra la eficacia antitumoral de formulaciones de topotecan frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones. Se administraron topotecan libre (TPT libre) o topotecan liposomal (Ls-TPT) a una cuarta parte de sus dosis maximas toleradas. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehfculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 31).
La Figura 13C muestra la eficacia antitumoral de formulaciones de topotecan frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones. Se administraron topotecan libre (TPT libre) o topotecan liposomal (Ls-TPT) a la mitad de sus dosis maximas toleradas. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehfculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 31).
La Figura 13D muestra la eficacia antitumoral de formulaciones de topotecan frente a xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones. Se administraron topotecan libre (TPT libre) o topotecan liposomal (Ls-TPT) a sus dosis maximas toleradas. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 31).
La Figura 14 muestra la dinamica pesos corporales promedio durante el tratamiento de ratones lampinos con tumores BT-474 con topotecan libre (TPT libre), o topotecan liposomal (Ls-TPT) administrados a sus dosis maximas toleradas. “Control” hace referencia a ratones tratados solo con un vehfculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 31).
La Figura 15 muestra la citotoxicidad de 6-(3-aminopropil)-elipticina libre (AE libre), 6-(3-aminopropil)-elipticina liposomal (Ls-AE) o 6-(3-aminopropil)-elictina (F5 ILs-AE)) inmunoliposomal dirigida a HER2 contra celulas de carcinoma de mama BT-474 in vitro. (Consulte el Ejemplo 35).
La Figura 16 muestra la citotoxicidad in vitro de 6-(3-aminopropil)-elipticina libre (APE libre), 6-(3-aminopropil)-elipticina liposomal (Ls-APE) o 6-(3-aminopropil)-elipticina inmunoliposomal (C225-ILs-APE) dirigido a EGFR contra celulas de carcinoma de mama con una expresion baja (MCF-7) o alta (MDA-MB468) del receptor EGF. (Consulte el Ejemplo 36).
La Figura 17 muestra los atributos farmacocineticos en sangre de la 6-(3-aminopropil)elipticina (APE) formulada liposomicamente: farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma (panel A, drculos abiertos), el farmaco (Panel A, drculos llenos) y la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-a-liposoma (Panel B) despues de la administracion intravenosa del bolo de liposomas APE a una rata. (Consulte el Ejemplo 37).
La Figura 18 muestra los atributos farmacocineticos en sangre de la vinorelbina formulada en liposomas (Ls- VRB), y los inmunoliposomas dirigidos contra HER2 (F5-ILs-VRB): farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma (Panel A), el farmaco (Panel B) y dinamica de la relacion lipfdica farmaco-a-liposoma (Panel C) despues de la administracion intravenosa del bolo de liposomas de vinorelbina a una rata. (Consulte el Ejemplo 43).
La Figura 19 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma despues de la administracion intravenosa del bolo de liposomas cargados con vinorelbina a una rata. Los liposomas se cargan usando dextransulfato de trietilamonio (DS-TEA), dextransulfato de amonio (DS-A) o sulfato de amonio (S-A) pre-capturado. (Consulte el Ejemplo 44).
La Figura 20 muestra la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-liposoma en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa in vivo del bolo del liposoma cargado con vinorelbina usando dextransulfato de trietilamonio (DS-TEA), dextransulfato de amonio (DS-A) o sulfato de amonio (S-A) pre-capturado. (Consulte el Ejemplo 44).
La Figura 21 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma despues de la administracion intravenosa del bolo de liposomas cargados con vinorelbina a una rata. Los liposomas se cargan usando octasulfato de trimetilamonio sacarosa (TEA-SOS) pre-capturado y tienen el tamano medio indicado en la leyenda del panel. (Consulte el Ejemplo 45).
La Figura 22 muestra la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-liposoma en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa in vivo del bolo del liposomas cargados con vinorelbina. Los liposomas se cargan usando trimetilamonio octasulfato de sacarosa (TEA-SOS) pre-capturado y tienen el tamano medio indicado en la leyenda del panel. (Consulte el Ejemplo 45).
La Figura 23 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma en una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de vinorelbina formulada en liposomas (Ls-VRB) o inmunoliposomas dirigidos contra HER2 (F5-ILs-VRB) usando el metodo TEA-SOS. (Consulte el Ejemplo 46).
La Figura 24 muestra la dinamica de la relacion lipfdica farmaco-liposoma en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa in vivo del bolo del vinorelbina formulada en liposomas (Ls-VRB) o inmunoliposomas dirigidos contra HER2 (F5-ILs-VRB) usando el metodo TEA-SOS. (Consulte el Ejemplo 46).
La Figura 25 muestra la citotoxicidad in vitro de vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls-VRB) o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-Ils-VRB) contra celulas de cancer de mama humano MDA-MB- 453 con una sobreexpresion de HER2. (Consulte el Ejemplo 48).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La Figura 26 muestra la citotoxicidad in vitro de vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls-VRB) o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-Ils-VRB) contra celulas de cancer de pulmon humano no microdticas CaLu-3 con una sobreexpresion de HER2. (Consulte el Ejemplo 49).
La Figura 27 muestra la citotoxicidad in vitro de vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB/SOS- TEA) o vinorelbina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-ILs VRB/SOS-TEA) contra celulas de cancer de mama humano SKBr-3 con una sobreexpresion de HER2. (Consulte el Ejemplo 50).
La Figura 28 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (VRB libre) o vinorelbina liposomal (Ls VRB) frente a xenoinjertos de cancer de colon humano Ht-29 en ratones lampinos. “Salino” hace referencia al raton tratado solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. (Consulte el Ejemplo 51).
La Figura 29 muestra la dinamica de pesos corporales promedio durante el tratamiento de ratones lampinos con tumores HT-29 con vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB) o solo vetnculo (salino). Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. (Consulte el Ejemplo 51).
La Figura 30 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (VRB libre) o vinorelbina liposomal (Ls VRB) en un modelo singenico de cancer de colon murino C-26. La dosis del farmaco por inyeccion se ha indicado en la leyenda del panel. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Salino” hace referencia al raton tratado solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 52).
La Figura 31 muestra la dinamica de pesos corporales promedio durante el tratamiento de ratones con tumores singenicos de carcinoma de colon murino C-26 con varias dosis de vinorelbina libre (VRB libre), vinorelbina liposomal (Ls VRB) o solo con vetnculo (salino). La dosis del farmaco por inyeccion se ha indicado en la leyenda del panel. (Consulte el Ejemplo 52).
La Figura 32 muestra la eficacia antitumoral de vinorelbina libre (farmaco libre) o conjugada con scFv F5, vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 preparada usando un metodo TEA-SOS (F5-ILs-VRB TEA-SOS), vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 preparada usando un metodo TEA-Pn (F5-ILs-VRB TEA-Pn) frente a xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 en ratones lampinos. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 53).
La Figura 33 muestra la dinamica de los pesos corporales promedio durante el tratamiento de ratones con xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 con vinorelbina libre, scFv conjugado con F5, vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 preparada usando un metodo TEA-SOS, vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 preparada usando un metodo TEA-Pn, o solo con vetnculo. Para ver una explicacion de los sfmbolos, consulte la leyenda de la Figura 32. (Consulte tambien el Ejemplo 53).
La Figura 34 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (farmaco libre) o scFv conjugado con F5, la vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 preparada usando diversas cantidades de lfpido PEG frente a xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 en ratones lampinos. Las barras de error representan la desviacion estandar de los datos. “Control del vetnculo” hace referencia a ratones tratados solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 54).
La Figura 35 muestra la eficacia antitumoral de la vinorelbina libre (NAV libre), la vinorelbina liposomal (NAV Lip) o la vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra EGFR (C225-NAV Lip) conjugada con FC225Fab' frente a xenoinjertos de glioblastoma humano (U87) con sobreexposicion de eGR en ratones lampinos. “Salino” hace referencia al raton tratado solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 55).
La Figura 36 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma y la dinamica de la relacion lipfdica farmaco/liposoma en la sangre de una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de doxorrubicina formulada en liposomas usando el metodo de sulfato de trietilamonio. (Consulte el Ejemplo 56).
La Figura 37 muestra la eficacia antitumoral de la doxorrubicina liposomal (Ls-Dox) o de la doxorrubicina inmunoliposomal dirigida cotraHER2 (F5 ILs-Dox) conjugada con scFv F5 preparada usando diversas cantidades de lfpido PEG frente a xenoinjertos de carcinoma de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 en ratones lampinos. La leyenda del panel muestra la cantidad del lfpido PEG expresada en mol.% de fosfolfpidos de liposoma. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vetnculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 57).
La Figura 38 muestra la farmacocinetica en sangre de la vinblastina liposomal en una rata. (Consulte el Ejemplo 58).
La Figura 39 muestra la dinamica de la relacion lipfdica de liposoma/farmaco en la sangre de una rata despues de una administracion intravenosa del bolo de vinblastina liposomal. (Consulte el Ejemplo 58).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La Figura 40 muestra la citotoxicidad in vitro de vinblastina libre (VCR libre), vinblastina liposomal (Ls-VCR) o vinblastina inmunoliposomal dirigida a HER2 (F5-Ils-VCR) contra celulas de cancer de mama humano SKBr-3 con una sobreexpresion de HER2. (Consulte el Ejemplo 61).
La Figura 41 muestra la farmacocinetica en sangre del lfpido de liposoma en una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de vincristina formulada en liposomas de distinto tamano promedio (indicados en la leyenda del panel). (Consulte el Ejemplo 62).
La Figura 42 muestra la dinamica de la relacion lipfdica de liposoma/farmaco en una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de vincristina formulada en liposomas de distinto tamano promedio (indicados en la leyenda del panel). (Consulte el Ejemplo 62).
La Figura 43 muestra la eficacia antitumoral de la vincristina libre (VCR libre), la vincristina liposomal preparada con el metodo de citrato de trietilamonio (citrato Ls-VCR), la vincristina liposomal preparada usando el metodo de trimetilamonio octasulfato de sacarosa (Ls-VCR SOS), o la vincristina inmunoliposomal dirigida contra HER2 conjugada con scFv F5, preparada usando el metodo de trimetilamonio octasulfato de sacarosa (F5 ILs-VCR SOS) contra xenoinjertos de cancer de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 en ratones. “Control salino” hace referencia a ratones tratados solo con un vehuculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 64).
La Figura 44 muestra la dinamica de los pesos corporales medios durante el tratamiento de ratones con xenoinjertos de cancer de mama humano (BT-474) con una sobreexpresion de HER2 con vincristina libre (VCR libre), vincristina liposomal preparada usando el metodo de citrato de trietilamonio (citrato Ls-VCR), vincristina liposomal preparada usando el metodo de trimetilamonio octasulfato de sacarosa (Ls-VCR SOS), vincristina inmunoliposomal dirigida contra HER2 conjugada con scFv F5 preparada usando el metodo de trimetilamonio octasulfato de sacarosa (F5 ILs-VCR SOS), o solo con vehuculo (control salino). (Consulte el Ejemplo 64).
La Figura 45 muestra la eficacia antitumoral de la vincristina libre (vincristina), la vincristina liposomal (nt-vcr) o la vincristina inmunoliposomal dirigida contra EGFR conjugada con C225 Fab' (C225-vcr) frente a xenoinjertos de cancer de cerebro humano (U87) con una sobreexpresion de EGFRvIII en ratones lampinos. “Salino” hace referencia al raton tratado solo con un vehuculo exento de farmacos y liposomas. (Consulte el Ejemplo 65).
La Figura 46 muestra la farmacocinetica en sangre de CPT-11 y la dinamica del porcentaje de CPT-11 presente en la forma activa (lactona) en la sangre de una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de CPT- 11 liposomal. (Consulte el Ejemplo 69).
La Figura 47 muestra la farmacocinetica en sangre de CPT-11 y la dinamica del porcentaje de CPT-11 presente en la forma activa (lactona) en la sangre de una rata despues de la administracion intravenosa del bolo de solucion CPT-11 (CPT-11 libre). (Consulte el Ejemplo 69).
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
La presente descripcion se refiere en general a metodos y composiciones de liposomas que son utiles para administrar diversas entidades, especialmente agentes terapeuticos y de formacion de imagenes. El descubrimiento de la presente descripcion es que el amonio y el polianion sustituidos son utiles para cargar y conservar las entidades, por ejemplo, los compuestos dentro de los liposomas. Por consiguiente, la presente descripcion proporciona composiciones de liposomas y kits que contienen amonio y/o polianion sustituido, asf como metodos para realizar estas composiciones de liposomas.
Segun una caractenstica de la presente descripcion, proporciona una composicion de liposomas que contienen en su espacio interno uno o varios compuestos de amonio sustituido de una formula
R1 (I)
R4—N—R2 4 I 2 R3
en donde cada R1, R2, R3, y R4 es independientemente un hidrogeno o grupo organico, y donde al menos un R1, R2, R3, y R4 es un grupo organico, como un grupo alquilo, alquilideno, alquilo heterodclico, cicloalquilo, arilo, alquenilo o cicloalquelino o bien un derivado hidroxi sustituido de los anteriores, que incluye opcionalmente dentro de su cadena de hidrocarbonos atomos S, O u N, por ej. formando un enlace eter (incluyendo un acetal o cetal), ester, sulfuro (tioeter), amina o amida en los anteriores. Si menos de tres de los R1, R2, R3, y R4 son grupos organicos, entonces, segun esta descripcion, al menos uno, y preferiblemente dos, de los grupos organicos tienen atomos de carbono secundarios o terciarios (p. ej. atomos de carbono que tienen 2 o 3 uniones carbono-carbono, respectivamente) directamente unidos al nitrogeno de amonio, es decir, el amonio sustituido es un amonio con impedimento esterico. En general, la presencia de un amonio titulable, como el ion amonio no sustituido (NH4+), asf como los iones alquilamonio de cadena lineal primarios y secundarios en el espacio interior del liposoma de la presente descripcion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se sabe que proporcionan una mejora en la encapsulacion de las bases anfifflicas debiles, por ejemplo, a traves de un mecanismo de carga “activa”, “remota” o “impulsada por gradiente transmembrana” (Haran, y col, Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1152, pag. 253-258; Maurer-Spurej, y col., Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1416, pag. 1-10). Sin embargo, estos compuestos de amoniaco contienen atomos de hidrogeno que entran mas facilmente en reacciones de sustitucion nucleofflica y por el contrario reaccionan qmmicamente con las entidades capturadas en el liposoma. Por lo tanto, pueden afectar negativamente a la integridad qmmica de las entidades durante o despues del proceso de carga (captura) de liposomas. Por ello, es deseable que el compuesto de amonio sustituido capturado sea mas inerte a nivel qmmico, sin funciones qmmicas que son inestables o reactivas con los componentes del liposoma, que pueden incluir una entidad encapsulada. Inesperadamente, los inventores han descubierto que las composiciones de liposomas que contienen en su espacio interno un amonio terciario y cuaternario sustituido no tienen un hidrogeno sustituible, o un amonio primario o secundario con impedimento esterico, donde el acceso a un atomo de hidrogeno de amonio tiene impedimento esterico por un grupo organico voluminoso vecino, tal como tener uno o dos atomos de carbono secundarios o terceros asociados a un nitrogeno de amonio, muestran no solo una capacidad de carga de entidad excelente, sino tambien una mejora de la estabilidad de la entidad con el liposoma capturado, p. ej. un farmaco contra la liberacion prematura del liposoma en el cuerpo vivo.
En una realizacion descrita en la presente memoria, el compuesto de amonio sustituido capturado en el liposoma es inerte a nivel farmaceutico, no genera una respuesta fisiologica adversa cuando se administra a un sujeto vivo, p. ej. un ser humano o un animal, dentro de la cantidad de material de membrana del liposoma que es suficiente para administrar una dosis efectiva de la entidad capturada en el liposoma. En otra realizacion, el amonio sustituido tiene un nivel de toxicidad aceptable para un sujeto. Normalmente, un nivel de toxicidad aceptable significa que la dosis toxica, p. ej., una dosis maxima tolerada (MTD), o una dosis que provoca un 50% de letalidad (DL50) del amonio sustituido es al menos dos veces, al menos cuatro veces, al menos ocho veces o al menos diez veces superior a la dosis toxica de una entidad capturada en el liposoma, p. ej. farmaco, cargado dentro de los liposomas. Por ejemplo, el sulfato de trietilamonio tiene un nivel de toxicidad aceptable ya que su DL50 es de unas 40 veces superior a la DL50 de la doxorrubicina, un farmaco anti-cancengeno. Los niveles de toxicidad de las respuestas fisiologicas de los amonios sustituidos, asf como de las entidades de interes, si todavfa no se conocen, pueden determinarse facilmente a traves de tecnicas rutinarias bien conocidas por las personas expertas en la tecnica biomedica. Consulte, entre otros, S.C. Gad. Drug Safety Evaluation, Wiley, New York, 2002. En el ejemplo 16 de la presente memoria se describe un metodo para cuantificar la toxicidad de farmacos formulados libres y/o con liposomas.
En una realizacion preferida, los grupos organicos de sustitucion entre R1, R2, R3, o R4 tienen el tamano y las propiedades ffsico-qmmicas suficientes para garantizar que se forma el amonio sustituido en entornos acuosos sustancialmente una solucion verdadera (molecular), pero no ocurre lo mismo con micelas, bicapas o estructuras autoensambladas similares. Por lo tanto, el amonio sustituido tiene preferiblemente poca o sustancialmente nula distribucion en la porcion de bicapa de los liposomas, reduciendo por tanto el riesgo de desestabilizacion, solubilizacion o permeabilizacion de los liposomas que capturan el amonio sustituido.
El grupo organico del amonio sustituido suele ser un hidrocarburo que contiene de forma inclusiva hasta 8 atomos de carbono, hasta 6 atomos de carbono o hasta 4 atomos de carbono y en total los grupos sustituyentes contienen de forma inclusiva hasta 18, hasta 16, hasta 12 o hasta 9 atomos de carbono. Estos grupos hidrocarburo sustituyentes incluyen cualquier combinacion de atomos de carbono primarios, secundarios o terciarios unidos entre sf, asf como grupos cicloalquilo asociados en sus extremos directamente al nitrogeno de amonio para formar un heterociclo, o a un atomo de carbono de un grupo sustituyente de hidrogeno de amonio. Estos grupos alquilo tambien pueden incluir heteroatomos, p. ej. oxfgeno, nitrogeno o azufre en sus cadenas de carbono para formar un grupo funcional, p. ej. grupo, eter, acetal, amina o sulfuro, asf como formar un grupo funcional, p. ej., un grupo hidroxilo, asociado a la cadena de carbono del alquilo. Algunos ejemplos del grupo organico de la presente descripcion incluyen, sin caracter restrictivo, alquilos, alquilidenos, alquilos heterodclicos, cicloalquilos, arilos, alquenilos o cicloalquenilos o sus derivados hidroxi sustituidos, p. ej, un alquilideno hidroxi sustituido que forman un anillo que incluye N en el amonio sustituido.
En otra realizacion, el amonio sustituido es: un amonio heterodclico, es decir, un amonio en el que al menos dos de R1, R2, R3, o R4 forman un anillo; un amonio primario con impedimento esterico; o un amonio secundario con impedimento esterico. En general, un amonio primario o secundario con impedimento esterico incluye cualquier amonio sustituido con uno o dos de los R1, R2, R3 y R4 sustituidos con grupos alquilos que desplazan estericamente la molecula, p. ej. cualquier amonio sustituido con uno o dos de los R1, R2, R3 y R4 sustituidos con uno o dos grupos cicloalquilo o grupos alquilo que tengan al menos un atomo de carbono del alquilo secundario o terciario asociado al nitrogeno del amonio sustituido. Algunos ejemplos de dichos amonios primarios heterodclicos con impedimento esterico y amonios secundarios con impedimento esterico incluyen, sin ninguna limitacion, isopropiletilamonio, isopropilmetilamonio, disopropilamonio, terc-butilmetilamonio, dicicloexilamonio, formas protonizadas de morfolina, piridina, piperidina, pirrolidina, piperazina, terc-butilamina, 2-amino-2-metilpropanol-1, 2-amino-2-metil-propanodiol-1,3 y tris-(hidroximetil)- aminometano. Estos compuestos de amonio sustituido suelen estar disponibles comercialmente en forma de diversas sales, o estan preparados en base a sus aminas correspondientes mediante neutralizacion con acidos.
En otra realizacion, el amonio sustituido es un amonio terciario o cuaternario que incluye, sin caracter restrictivo, trimetilamonio, trietilamonio, tributilamonio, dietilmetilamonio, diisopropiletilamonio, triisopropilamonio, N- metilmorfolina, N-hidroxietilpiperidina, N-metilpirrolidina y N, N'-dimetilpiperidina, tetrametilamonio, tetraetilamonio y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tetrabutilamonio. Estos compuestos de amonio sustituido suelen estar disponibles comercialmente en forma de diversas sales, o estan preparados en base a sus aminas correspondientes mediante neutralizacion con acidos.
En otra realizacion, el compuesto de amonio sustituido es un compuesto cationico global, es dedr, bajo las condiciones de la encapsulacion de la entidad, normalmente una solucion acuosa a un pH de entre aproximadamente pH 2 y aproximadamente pH 8 lleva una carga positiva neta, p. ej. como resultado de la ionizacion (pronotacion) del atomo de nitrogeno.
En otra realizacion, el compuesto de amonio sustituido primario, secundario o terciario encapsulado en liposomas tiene un logaritmo negativo de la constante de disociacion acida (despronotacion) (pKa) de al menos aproximadamente 8,0, de al menos aproximadamente 8,5 al menos aproximadamente 9,0, al menos el 9,5, o de al menos aproximadamente 10,0, segun se ha determinado en una solucion acuosa diluida a temperatura ambiente (normalmente 25 °C). El parametro pKa es una caractenstica bien conocida de los compuestos de amonio que suele caracterizar la fuerza de sus propiedades basicas, y los metodos para la determinacion del pKa son convencionales y rutinarios en esta tecnica. Los valores pKa para muchas aminas y sus formas protonadas (amonios) aparecen en los libros de referencia de qmmica y farmacologfa. Consulte, por ejemplo, IUPAC Handbook of Pharmaceutical Salts, ed. por P.H. Stahl and C.G Wermuth, Wiley-VCH, 2002; CRC Handbook of Chemistry and Physics, 82a Edicion, ed. por D.R.Lide, CRC Press, Florida, 2001, p. 8-44 a 8-56. En general, un valor pKa alto caracteriza las bases mas fuertes. Los compuestos de amonio sustituido ilustrativos y de amonio no sustituido (enumerados como sus bases de amina conjugada) tienen los siguientes valores pKa: pirrolidina, 11,31; piperidina, 11,12; diisopropilamina, 11,05; dietilamina, 10,93; trietilamina, 10,75; dimetilamina, 10,73; terc- butilamina, 10,68; ciclohexilamina, 10,66; metilamina, 10,66; etilamina, 10,65; propilamina, 10,54; Isopropilamina, 10,53; N-etilpiperidina, 10,45; diciclohexilamina; 10,4; N-metilpiperidina, 10,38; dietilmetilamina, 10,35; dimetilpropilamina, 10,15; trimetilamina, 9,8; piperazina, 9,73 (I),5,33 (II); 2-amino-2-metilpropanol, 9,69; N,N'- dimetilpiperazina, 9,66 (I),52 (II); dietil-(2-hidroxietil)amina, 9,58; etanolamina, 9,5; N-hidroxietilpirrolidina, 9,44; dietanolamina, 9,28; amoniaco, 9,27; dimetil-(2-hidroxietil)amina, 8,83; 2-amino-2-metilpropanodiol-1,3, 8,8; morfolina, 8,5; tris-(hidroximetil)-aminometano, 8,3; N-metilglucamina, 8,03; trietanolamina, 7,76; N-etilformolina, 7,67; N-hidroxietilmorfolina, 7,39; imidazol, 7,03; piridina, 5,23. Como norma general, la sustitucion del grupo alquilo o cicloalquilo por un hidrogeno en un compuesto de amonio aumenta el valor pKa. En particular, las multiples funciones de hidroxilo o eter en los grupos alquilo sustituyentes, o la presencia de aromaticidad en un grupo heterodclico que contiene nitrogeno, reducen el valor pKa respecto del amonio sustituido similar sin funciones de hidroxilo o eter. Los compuestos con mas de un grupo de amonio suelen tener el pKa del segundo y posterior grupo de amonio muy inferior al primero. Los inventores han descubierto de forma inesperada que el amomaco sustituido con valores kPa mas altos, es decir, formado por aminas mas intensamente basicas, era mas efectivo que los amonios formados con aminas mas debiles a la hora de estabilizar el farmaco dentro de los liposomas. Por ejemplo, tanto las sales IHP como las SOS de trietilamonio (pKa = 10,75) fueron mas notablemente efectivas que las sales correspondientes de trietanolamonio (pKa = 7,76) a la hora de estabilizar el irinotecan dentro de los liposomas in vivo (Ejemplo 73).
El amonio sustituido contenido en la composicion del liposoma puede estar en cualquier forma adecuada, p. ej. sal. Las sales adecuadas son las sales aceptables para uso farmaceutico. Consulte, por ejemplo, P.H. Stahl, C.G. Wermuth (eds), Handbook of Pharmaceutical Salts, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. En una realizacion, el amonio sustituido es una sal que contiene uno o varios polianiones. De manera optima, el contraion (anion) en la sal de amonio sustituido vuelve la sal soluble en agua, es inerte a nivel farmaceutico, puede formar precipitados o geles cuando entra en contacto con una entidad terapeutica o detectable, y/o es menos permeable a traves de la membrana del liposoma que el amonio sustituido o su forma de amina no disociada. En general, las sales de amonio sustituido forman una verdadera solucion en p. ej., el espacio acuoso intraliposomal, y no forma una cantidad significante de fase condensada como la fase cristalina, gel, bicapa o micela. La cantidad relativa de un amonio sustituido y un anion con formacion de sal, p. ej. un polianion, esta en el punto de equivalencia estequiometrico o cerca de este, y normalmente tiene el pH dentro del intervalo 3-9, mas a menudo, pH 4-8, dependiendo, por ejemplo, de la constante de disociacion de la base conjugada del ion amonio sustituido.
En general, el amonio sustituido esta contenido dentro, es decir, es el espacio interno de los liposomas. En una realizacion, el amonio sustituido se extrae parcial o completamente de forma sustancial del medio externo que rodea los liposomas. Dicha extraccion puede realizarse usando un medio adecuado conocido por un experto en la materia, p. ej. dilucion, cromatograffa de intercambio de iones, cromatograffa de exclusion por tamanos, dialisis, ultrafiltracion, precipitacion, etc.
Segun otra caractenstica de la presente descripcion, proporciona una composicion de liposomas que contiene un polianion. El polianion de la presente descripcion puede ser cualquier entidad qmmica adecuada con mas de un grupo cargado negativamente que provoca una carga ionica negativa de mas dos unidades en, por ejemplo, el espacio acuoso interno del liposoma,. El polianion de la presente descripcion puede ser un anion divalente, un anion trivalente, un anion polivalente, un anion polivalente polimerico, un poliol polianionizado o un azucar polianionizado. El sulfato, el fosfato, el pirofosfato, el tartrato, el succinato, el maleato, el borato y el citrato son, sin limitacion, los ejemplos de estos aniones divalentes y trivalentes. En una realizacion preferida, el polianion de la presente descripcion es un poffmero polianionico que tiene una estructura principal organica (carbono) o inorganica, y una pluralidad de grupos funcionales anionicos, p. ej. grupos funcionales inonizables a una carga negativa en solucion acuosa neutra, e integrados o anexos a la estructura principal. Un poffmero es un compuesto
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
natural o sintetico, normalmente de alto peso molecular, que esta formado por unidades asociadas repetidas, y cada una tiene una molecula simple y relativamente ligera. Algunos ejemplos de polfmeros polianionicos son polifosfatos, polivinilsulfatos, polivinilsulfonatos, polfmeros poliacnlicos anionizados, p. ej. poliaminas polisulfonadas anionizadas, como la poli(etileno imina) polisulfonatada; polisacaridos polisulfatados, policarboxilados o polifosforilados; poliaminoacidos acidos; polinucleotidos; otros poUmeros polifosforilados, polisulfatados, polisulfonados, poliboratados o policarboxilados. Estos polfmeros y aniones polivalentes son bien conocidos en la materia y muchos estan disponibles comercialmente. Un anion polimerico de la presente descripcion es preferiblemente biodegradable, es decir, capaz de descomponer las unidades no toxicas dentro del organismo vivo. Un ejemplo de anion polimerico biodegradable es polifosfato.
En otra realizacion preferida, el polianion es un poliol polianionizado o un azucar polianionizado. Un poliol es una molecula organica que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo asociados a una estructura principal de carbono lineal, ramificado o dclico. Ademas, un poliol puede caracterizarse en otros terminos como un compuesto polihidroxilado. Preferiblemente, una mayona de atomos de carbono en un poliol son hidroxilados. Los polioles (alcoholes poliatomicos) son moleculas muy conocidas en esta materia. Pueden usarse polioles de cadena lineal (recta o ramificada) y polioles dclicos. Algunos ejemplos de polioles de la presente descripcion son, sin caracter restrictivo: etilenglicol; glicerol, treitol, eritritol, pentaeritritol, manitol, glucitol, sorbitol, sorbitan, xilitol, lactitol, maltitol, fructitol e inositol. Un azucar suele estar formado por un acetal dclico, un cetal dclico, una cetona o un grupo aldeddo, o un aducto de los anteriores, dentro de un grupo de atomos de carbono unidos entre sf predominantemente hidroxilados hidroxilatados. Los azucares son compuestos que se producen de forma natural. La hidrolisis de azucares en medios acuosos genera unidades conocidas como monosacaridos. Normalmente, en una solucion acuosa, una molecula de azucar monosacarido de cinco o seis atomos de carbono forma una estructura de anillo de tipo hemiacetal dclico. Preferiblemente, los azucares de las presentes descripciones son monosacaridos o disacaridos, es decir, estan formados por una o varias unidades monosacaridas, cada una con de tres a siete, preferiblemente de tres a seis atomos de carbono. Algunos ejemplos de azucar de la presente descripcion son, sin limitacion, hexosas monosacaridas, como glucosa (dextrosa), galactosa, manosa, fructosa; pentosas monosacaridas, como la xilosa, ribosa, arabinosa y disacaridos como lactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. Tambien pueden usarse compuestos formados por varias unidades de azucar unidas entre sf formando un anillo (ciclodextrinas) y sus derivados. La reduccion de azucares es un metodo para obtener polioles. Se prefieren los disacaridos mas estables “no reductores” y no metabolizables, tales como sacarosa o trehalosa. Varios polioles, monosacaridos y disacaridos estan disponibles comercialmente.
Un poliol o azucar polianionizado es un poliol o un azucar que tiene sus grupos hidroxilos completa o parcialmente modificados o sustituidos con grupos anionicos (anionizados). Por lo tanto, un azucar polianionizado o un poliol polianionizado esta formado por una fraccion de poliol o una fraccion de azucar junto con los grupos anionicos asociados a la misma. Algunos ejemplos de grupos anionicos incluyen, sin ninguna limitacion, carboxilato, carbonato. tiocarbonato, ditiocarbonato, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, nitrato y borato. Es preferible que al menos un grupo anionico de un azucar polianionizado o poliol sea un grupo anionico fuerte, es decir, que este ionizado en mas del 50% dentro del intervalo amplio de pH, p. ej. pH 3-12, preferiblemente, pH 2-12, cuando este en un medio acuoso o, alternativamente, tenga un log de la constante de disociacion (pKa) de 3 o menos, preferiblemente 2 o menos. La polianionizacion de un poliol o un azucar puede conseguirse por diversos procesos qdmicos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la reaccion de los polioles y/o azucares con el trioxido de azufre o el acido clorosulfonico en la piridina o 2 picolina hace que algunos o todos los grupos hidroxilos se esterifiquen con residuos de acido sulfurico (sulfatados), proporcionando un azucar polisulfatado o poliol. Un ejemplo de azucar sulfatado de la presente descripcion es la sacarosa sulfatada, incluyendo, sin limitacion, hexasulfato de sacarosa, heptasulfato de sacarosa y octasulfato de sacarosa (Consulte Ochi. K., y col., 1980, Chem. Pharm. Bull., v. 28, pag. 638-641). El azucar sulfatado de la presente invencion es octasulfato de sacarosa. De forma similar, la reaccion con oxicloruro de fosforo o clorofosfato de dietilo en presencia de un catalizador basico da como resultado azucares o polioles polifosforilados. Los polioles polifosforilados tambien se afslan de las fuentes naturales. Por ejemplo, los polifosfatos de inositol, como hexafosfato de inositol (acido frtico) se afslan del mafz. Diversos polioles y azucares sulfatados, sulfonados y fosforilados adecuados para practicar la presente descripcion se enumeran, p. ej. en las patentes US-5.783.568 y US-5.281.237. Se descubrio inesperadamente que los compuestos polianionizados polihidroxilados solo con etapas de disociacion acida fuertes, p. ej. los grupos con un pKa inferior a 3,0. preferiblemente inferior a 2,0 como, por ejemplo, los monoesteres de sulfato (pKa de 1,0 o menos), proporcionan una encapsulacion liposomal con una mejor retencion del farmaco que los compuestos polianionizados polihidroxilados que tienen tambien etapas de disociacion acida debiles, como los monoesteres de fosfato (etapa 1, pKa de aproximadamente 1,5.; etapa 2, pKa de aproximadamente 6,7.; consulte Stahl and Wermuth, Op. cit., 2002). El ejemplo 73 siguiente ilustra este descubrimiento. La complejacion de polioles y/o azucares con mas de una molecula de acido borico genera un producto polioanionizado (poliborado). La reaccion de polioles y/o azucares con disulfuro de carbono en presencia de alcalis genera derivados polianionizados (poliditiocarbonatado, polixantogenato). Un derivado de azucar o poliol polianonizado puede aislarse en la forma de un acido libre y neutralizarse con una base adecuada, por ejemplo, con un hidroxido de metal alcalino, hidroxido de amonio o preferiblemente con una amina sustituida, p. ej. amina correspondiente a un amonio sustituido de la presente descripcion, en estado puro o en estado de hidroxido de amonio sustituido proporcionando una sal polianionica de un amonio sustituido de la presente descripcion. Alternativamente, puede aislarse un sal de sodio, potasio, calcio, bario o magnesio de un azucar/poliol polianionizado y convertirla en una forma adecuada, p. ej. una forma de sal de amonio sustituido, por cualquier metodo conocido, por ejemplo, por intercambio de iones.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El polianion de la presente descripcion suele tener una densidad de carga de al menos dos, tres o cuatro grupos cargados negativamente por unidad, p. ej., por atomo de carbono o anillo en una cadena de carbono o por unidad monosacarida en un azucar. El poliol dclico o azucar polianionizado de la presente descripcion tiene preferentemente el 75% como mmimo de grupos hidroxilo disponibles polianionizados, y mas preferiblemente el 100% de grupos hidroxilo disponibles polianionizados. Ademas, la polianionizacion dentro de los liposomas suele estar en un nivel compatible con o que facilita la administracion y liberacion de la entidad capturada dentro de los liposomas en el lugar de su accion previsto, pero reduce la liberacion de la entidad capturada de forma prematura, es dedr, antes de que el liposoma llegue al lugar de la accion prevista.
El grado de polianionizacion dentro de los liposomas puede usarse para regular las caractensticas de liberacion, p. ej. coeficiente y cinetica de liberacion de una entidad capturada dentro de los liposomas. En general el grado de polianionizacion puede evaluarse en funcion de la cantidad de poliol o azucar polianionizado respecto de la cantidad total de aniones o si solo hay un polianion, el porcentaje de polianionizacion respecto de la capacidad total de polianionizacion del polianion, p. ej. poliol o azucar polianionizado o una mezcla de los anteriores dentro de los liposomas. En una realizacion, el poliol o azucar polianionizado se mezcla con uno o varios de los diferentes aniones y cuanto menor sea la cantidad de poliol o azucar polianionizado sobre la cantidad de los diferentes aniones, mas rapido se liberara la entidad de los liposomas.
Normalmente, si una entidad capturada se libera de los liposomas en el lugar de su accion prevista con demasiada lentitud, el coeficiente de liberacion deseado de la entidad puede conseguirse usando una mezcla de poliol o azucar polianionizado con uno o varios aniones monovalentes o polivalentes, p. ej. cloro, sulfato, fosfato, etc. Alternativamente, se pueden usar mezclas de polioles o azucares polianionizados con varios grados de polianionizacion. En una realizacion, el grado de polianionizacion dentro de los liposomas se encuentra entre 0,1% a 99%, 10% a 90%, o 20% a 80% del(de los) anion(ones) totales dentro de los liposomas, p. ej. con una entidad capturada.
En general, la composicion del liposoma puede contener uno o varios polianiones en cualquier forma adecuada, p. ej. en forma de acido o sal formado por un polianion y un cation. La cantidad de polianiones, p. ej. poliol o azucar polianionizado puede ser estequiometricamente equivalente o diferir de la cantidad del cation. En una realizacion, la composicion del liposoma contiene una o varias sales de polianion de un cation, donde existe un gradiente de concentracion de cationes o un gradiente de pH presente a traves de la membrana del liposoma. En otra realizacion, la composicion del liposoma contiene una o varias sales de polianion de amonio sustituido. En otra realizacion, la composicion del liposoma contiene el polianion dentro de los liposomas, mientras que el polianion en el medio que contiene los liposomas es extrafdo parcial o sustancialmente por cualquier medio adecuado conocido y por un experto en la materia, p. ej. dilucion, cromatograffa de intercambio de iones, cromatograffa de exclusion por tamanos, dialisis, ultrafiltracion, absorcion, precipitacion, etc. En otra realizacion adicional, el liposoma con el polianion capturado, p. ej. azucar polianionizado o poliol polianionizado, tambien tiene una gradiente transmembrana efectivo a la hora de conservar las sustancias dentro del liposoma. Algunos ejemplos de dichos gradientes transmembrana son el gradiente de pH, el gradiente del potencial electroqmmico, el gradiente del ion amonio, el gradiente del ion amonio sustituido o el gradiente de solubilidad. Un gradiente de amonio sustituido suele incluir una forma sustituida de ion amonio formada por un enlace C-N como mmimo, como amonio primario, cuaternario, terciario o cuaternario. Los metodos para crear gradientes transmembrana son rutinarios en materia de liposomas.
Segun otra caractenstica de la presente descripcion, la composicion del liposoma de la presente descripcion contiene uno o varios amonios sustituidos y/o polianiones de la presente descripcion y una entidad qmmica o biologica, p. ej. entidad terapeutica o detectable. Por ejemplo, la entidad contenida en la composicion de liposoma de la presente descripcion puede ser un agente terapeutico, tinta, colorante, compuesto magnetico, fertilizante, senuelo, biocatalizador, sustancia que modifica el sabor o el olor, lejfa o cualquier entidad que sea detectable por medio de metodos adecuados y conocidos en la materia, p. ej. tecnicas de obtencion de imagen por resonancia magnetica (IRM), formacion de imagenes opticas, formacion de imagenes fluorescente/luminiscente o formacion de imagenes nuclear. De forma conveniente, una entidad contenida o cargada en la composicion del liposoma de la presente descripcion es una entidad basica debil y con membrana permeable (lipofflica). p. ej. entidad con contenido de amina o entidad con nitrogeno base.
En una realizacion, la entidad contenida en la composicion del liposoma de la presente descripcion es un agente terapeutico.
En otra realizacion, la entidad contenida en la composicion del liposoma es una entidad anticancengena. A continuacion se muestra una lista de agentes antineoplasicos conocidos comunmente, homologados comercialmente (o en fase de desarrollo) mediante clasificacion.
Clases segun la estructura: Fluoropirimidinas--5-FU, Fluorodesoxiuridina, Ftorafur, 5'-desoxifluorouridina, UFT, S-1 Capecitabina; nucleosidos de pirimidina --desoxicitidina, arabinosido de citosina, 5-Azacitosina, Gemcitabina, 5- Azacitosina-Arabinosido; Purinas--6-Mercaptopurina, Tioguanina, Azatioprina, Alopurinol, Cladribina, Fludarabina, Pentostatina, 2-Cloro Adenosina; Analogos de platino-Cisplatino, Carboplatino, Oxaliplatino, Tetraplatino, Platino-DACH, Ormaplatino, CI-973, JM-216; Antraciclinas/ antracenodionas--Doxorrubicina, Daunorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Mitoxantrona; Epipodofilotoxinas--Etoposido, Teniposido; Camptotecinas--Irinotecan, Topotecan, Lurtotecan, Silatecan, 9- Amino Camptotecina, 10,11-metilendioxi Camptotecina, 9-Nitro Camptotecina, TAS 103, 7-(4-metil-piperazino-metileno)-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina, 7-(2-N-isopropilamino)etil)-20(S)-camptotecina; Hormonas y analogos de hormonas-- Dietilestilbestrol, Tamoxifeno, Toremifeno, Tolmudex, Thymitaq, Flutamida, Bicalutamida, Finasterida, Estradiol, Trioxifeno, Droloxifeno, Acetato de Medroxiprogesterona, Acetato de Megesterol, Aminoglutetimida, Testolactona y otros; Enzimas, Protemas y Anticuerpos-Asparaginasa, Interleuquinas, Interferones, Leuprolide, Pegaspargasa y otros; Alcaloides de la vinca-Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Vindesina; Taxanos-Paclitaxel, Docetaxel.
Clases segun el Mecanismo: Antihormonales--Consulte la clasificacion para hormonas y analogos hormonales, Anastrozol; Antifolatos-Metotrexato Aminopterina, Trimetrexato, Trimetoprima, Piritexima, Pirimetamina, Edatrexato, MDAM; Agentes antimicrotubulos-Taxanos y alcaloides de la vinca; Agentes alquilantes (clasicos y no clasicos)--Mostazas nitrogenadas (Mecloretamina, Clorambucilo, Melfalan, Mostaza de uracilo), Oxazafosforinas (Ifosfamida, Ciclofosfamida, Perfosfamida, Trofosfamida), Alquilsufonatos (Busulfan), Nitrosoureas (Carmustina, Lomustina, Estreptozocina), Tiotepa, Dacarbacina y otros; Antimetabolitos--Purinas, pirimidinas y nucleosidos, enumerados anteriormente; Antibioticos-- Antraciclinas/Antracenodionas, Bleomicina, Actinomicina, Mitomicina, Plicamicina, Pentostatina, Estreptozocina; Inhibidores de la topoisomerasa-Camptotecinas (Topo I), Epipodofilotoxinas, m-AMSA, Elipticinas (Topo II); Antivirales-- AZT, Zalcitabina, Gemcitabina, Didanosina y otros; Agentes citotoxicos varios--Hidroxiurea, Mitotano, Toxinas de fusion, PZA, Briostatina, Retinoides, Acido butrnco y derivados, Pentosan, Fumagilina y otros.
Ademas de lo anterior, una entidad anticancengena incluye, sin ninguna limitacion, cualquier inhibidor de topoisomerasa, alcaloide de la vinca, p. ej. vincristina, vinblastina, vinorelbina, vinflunina y vinpocetina, agente desestabilizador o despolimerizador de microtubulos, agente estabilizador de microtubulos, p. ej. taxano, analogo de aminoalquilo o aminoacilo de paclitaxel o docetaxel, p. ej. 2'-[3-(N,N-Dietilamino)propionil]paclitaxel, 7-(N,N- Dimetilglicil)paclitaxel y 7-L-alanilpaclitaxel, agente alquilante, agente de union al receptor, inhibidor de la tirosina quinasa, inhibidor de fosfatasa, inhibidor de quinasas dependiente de ciclina, inhibidor enzimatico, inhibidor de aurora quinasa, nucleotido, polinucleotido e inhibidor de farnesil transferasa.
En otra realizacion, la entidad contenida en la composicion de liposomas de la presente descripcion es un agente terapeutico de compuestos o derivados de antraciclinas, compuestos o derivados de camptotecina, compuestos o derivados de elipticina, alcaloides o derivados de la vinca, wortmanina, sus analogos y derivados, o compuestos de pirazolopirimidina con las propiedades inhibidoras de aurora quinasa.
En otra realizacion, la entidad contenida en la composicion de liposomas de la presente descripcion es un farmaco de antraciclina, doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, epirrubicina, pirarrubicina, rubidomicina, carcinomicina, N-acetiladriamicina, rubidazona, 5-imidodaunomicina, N-acetildaunomicina, daunorilina, mitoxantrona; un compuesto de camptotecina, camptotecina, 9-aminocamptotecina, 7-etilcamptotecina, 10- hidroxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, 10,11-metilenedioxicamptotecina, 9-amino-10,11-
metillenedioxicamptotecina, 9-cloro-10,11-metilenedioxicamptotecina, irinotecan, topotecan, lurtotecan, silatecan, (7-(4-metillpiperazinometileno)-10,11 -etilenodioxi-20(S)-camptotecina, 7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11-
metilenodioxi -20(S)-camptotecina, 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)-camptotecina; un compuesto de elipticina, elipticina, 6-3-aminopropil-elipticina, 2-dietilaminoetil-ellipticinio y sales del mismo, detaliptio, reteliptina.
En otra realizacion, la entidad contenida en el liposoma de la presente descripcion es una entidad farmaceutica que incluye, entre otros, cualquiera de los siguientes: derivados de etilendiamina antihistammica (bromfenifamina, difenhidramina); Antiprotozoarios: quinolonas (yodoquinol); amidinas (pentamidina); antihelmmticos (pirantel); farmacos anti-esquistosoma (oxaminiquina); derivados del triazol antimicotico (fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol); cefalosporinas antimicrobianas (cefazolina, cefonicida, cefotaxima, ceftazimida, cefuoxima); derivados betalactamicos antimicrobianos (aztreopam, cefmetazol, cefoxitina); antimicrobianos del grupo de eritromicinas (eritromicina, azitromicina, claritromicina, oleandomicina); penicilinas (bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina, cloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, carbenicilina); tetraciclinas; otros antibioticos antimicrobianos, novobiocina, espectinomicina, vancomicina; farmacos antimicrobacterianos: acido aminosalidlico, capreomicina, etambutol, isoniacida, pirazinamida, rifabutina, rifampicina, clofazime; adamantanos antivirales: amantadina, rimantadina; derivados de la quinidina: cloroquina, hidroxicloroquina, promaquina, qionona; qionolonas antimicrobianas: ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina, acido nalidfxico, norfloxacina, ofloxacina; sulfonamidas; antimicrobianos para el tracto urinario: metenamina, nitrofurantoma, trimetoprim; nitroimidazoles: metronidazol; compuestos de amonio cuaternario colinergicos (ambetinio, neoestigmina, fisostigmina); aminoacridinas para tratamiento del Alzheimer (tacrina); farmacos para tratamiento del Parkinson (benztropina, biperideno, procyclidina, trihexilhenidilo); agentes anti-muscarmicos (atropina, hiosciamina, escopolamina, propantelina); dopaminas adrenergicas (albuterol, dobutamina, efedrina, epinefrina, norepinefrina, isoproterenol, metaproperenol, salmetrol, terbutalina); derivados de ergotamina; relajantes musculares o derivados de curare; relajantes musculares de accion central; baclofen, ciclobenzepina, dentroleno; nicotina; beta-adrenobloqueantes (acebutilo, amiodarona); benzodiazepinas (ditiazem); farmacos anti-arntmicos (diisopiramida, encaidina, series de anestesia local--procaina, procainamida, lidocaina, flecaimida), quinidina; inhibidores de ACE: captoprilo, enelaprilat, fosinoprol, quinaprilo, ramiprilo; antilipidemicos: fluvastatina, gemfibrosilo, inhibidores de HMG-coA (pravastatina); farmacos hipotensivos: clonidina, guanabenz, prazocina, guanetidina, granadril, hidralazina; y vasodilatadores no coronarios: dipiridamol.
Segun la presente descripcion, la entidad contenida en la composicion del liposoma de la presente descripcion tambien puede ser una pre-entidad, p. ej. un pro-farmaco o un agente que es capaz de convertirse en una entidad deseada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
despues de uno o varias etapas de conversion bajo una condicion como un cambio en el pH o una separacion enzimatica de la union labil. Dicha conversion puede producirse despues de la liberacion del pro-farmaco desde el interior del liposoma en el lugar previsto de la accion del farmaco/liposoma. Sin embargo, la pre-entidad puede convertirse en la entidad activa deseada dentro de los liposomas de la presente descripcion antes de usar los liposomas como vetffculo de entrega, p. ej. administracion a un paciente. Por ejemplo, una entidad puede modificarse en una pre-entidad para que sea mas facil cargarla en los liposomas y despues volver a convertirla en la entidad deseada una vez que este dentro de los liposomas de la presente descripcion. De esta forma, segun la presente descripcion, las entidades que en general no son susceptibles del proceso “activo”, “remoto” u otros metodos de carga basados en el gradiente, pueden cargarse de forma efectiva en los liposomas, p. ej. en el espacio interno del liposoma, en su forma nativa no modificada.
A nivel global, los compuestos cationicos, es decir, los compuestos capaces de llevar una carga ionica positiva neta bajo las condiciones de carga del liposoma, especialmente los compuestos que contienen una amina titulable, se sabe que pueden cargarse de forma efectiva en los liposomas que exhiben gradientes de iones transmembrana. Si una entidad de interes es un compuesto organico y no un compuesto cationico global con una amina titulable, puede prepararse un derivado del mismo con las propiedades ionicas necesarias usando una modificacion apropiada, p. ej. siguiendo los metodos descritos en Woodle y col., en WO 96/25147. Por ejemplo, es posible introducir un grupo amina mediante la esterificacion de un grupo hidroxilo de la entidad con un aminoacido. Alternativamente, puede introducirse un grupo hidrofobico en un compuesto soluble en agua para facilitar su particion en la membrana del liposoma y atravesar posteriormente la membrana hasta el compartimento intraliposomal. p. ej. dentro de los liposomas. Otra modificacion util para crear una pre-entidad cargable en el liposoma es la formation de un aducto de grupo carbonilo, p. ej. una hidrazona, una oxima, un acetal o un cetal. Un grupo que contiene un amino modificado puede hidrolizarse o dividirse qdmicamente de otra forma del compuesto modificado despues de la carga del compuesto modificado en los liposomas segun la presente invention. Los procesos ffpicos para regenerar intraliposomalmente la entidad desde una pre-entidad son la hidrolisis, la fotolisis, la radiolisis, la tiolisis, la amonolisis, la reduction, la sustitucion, la oxidation o la elimination. Estos procesos pueden realizarse, sin limitation, mediante el cambio del pH o mediante una accion enzimatica. Por ejemplo, paclitaxel o docetaxel, unas entidades no ionicas, se convierten en sus esteres de 2'- (dietilaminopropionilo)- o 7'-(dietillaminopropionilo), que son bases debiles (pre-entidades). Despues de cargarlos en los liposomas usando cualquier metodo conocido, incluidos, sin limitacion, los metodos “activo”, “remoto”, “basado en gradiente transmembrana” o “basado en gradiente de solubilidad”, y/o los metodos de la presente descripcion, el 2'- (dietillaminopropionilo)-paclitaxel intraliposomal se convierte en el paclitaxel original estimulando su hidrolisis a traves del aumento del pH a un valor superior a pH 7,0. De esta forma, el liposoma que encapsula una molecula de taxano neutro en su espacio interno se obtiene con la relation farmaco/ffpido de mas de 0,05 moles del ffpido del liposoma, sin la ayuda de las modificaciones covalentes hidrofflicas de la molecula de taxano (p. ej. mediante la fijacion de PEG), complejos de taxano ciclodextrinado, o tensioactivos de formacion de micelas y solubilizantes del taxano.
Los liposomas contenidos en la composition liposomal de la presente descripcion pueden ser cualquier liposoma conocido o descubierto posteriormente en la materia. En general, los liposomas de la presente invencion pueden tener cualquier estructura liposomal. p. ej. estructuras con un espacio interno aislado del medio exterior por una o varias bicapas ffpidas, o cualquier microcapsula que tenga una membrana semi-permeable con una parte central lipofflica donde la membrana afsla un interior. Una bicapa ffpida puede ser cualquier combination de moleculas anfifflicas caracterizadas por una parte hidrofflica (fraction hidrofflica) y una parte hidrofobica (fraction hidrofobica). Normalmente, las moleculas anfifflicas en una bicapa se ordenan en laminas bidimensionales en las cuales las fracciones hidrofobicas se orientan hacia dentro de la lamina, mientras que las fracciones hidrofflicas se orientan hacia fuera. Las moleculas anfifflicas que forman los liposomas pueden ser cualesquiera moleculas anfifflicas conocidas o descubiertas posteriormente, p. ej. ffpidos de origen natural o sintetico o ffpidos biocompatibles. Los liposomas tambien pueden formarse por tensioactivos y poffmeros anfifflicos, p. ej. polimerosomas y niosomas. Para los efectos de esta descripcion, sin caracter restrictivo, estos materiales que forman liposomas tambien reciben el nombre de “ffpidos”.
Segun la presente invencion, los liposomas contenidos en la composicion liposomal de la presente invencion tambien pueden ser liposomas diana, p. ej. liposomas que contienen una o varias fracciones diana o modificadores de biodistribucion en la superficie de los liposomas. La fraccion diana puede ser cualquier agente que sea capaz de unir o interactuar espetificamente con un compuesto diana deseado. En una realization, una fraccion diana es un ligando. El ligando, segun la presente invencion, se une preferiblemente y/o se internaliza en una celula en la que la entidad capturada en el liposoma ejerce un efecto deseado (una celula diana). Un ligando suele ser un miembro de una molecula asociada donde el segundo miembro esta presente en las celulas diana o en un tejido que forma la celula diana. Algunos ejemplos de ligandos adecuados para la presente invencion son: acido folico, protemas, p. ej. transferrina, factor de crecimiento, enzima, peptido, receptor, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tales como Fab', Fv, Fv de cadena unica, anticuerpo de dominio unico o cualquier otro polipeptido que contenga secuencias de union de anffgenos (CDR) de una molecula de anticuerpo. Un liposoma diana de ligando donde una fraccion diana es un anticuerpo o un fragmento de union de anffgeno objetivo recibe el nombre de inmunoliposoma. En una realizacion preferida, el liposoma que porta una fraccion diana, p. ej. un ligando, es internalizado por una celula diana. En otra realizacion, una fraccion diana es un ligando que interactua espetificamente con un receptor de tirosina quinasa como, por ejemplo, los receptores EGFR, HER2, HER3, HER4, PD-GFR, VEGFR, bFGFR o IGFR. En otra realizacion, la fraccion diana interactua espedficamente con un receptor de factor de crecimiento, un receptor de factor angiogenico, un receptor de transferrina, una molecula de adhesion celular o un receptor de vitamina.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Segun otra realizacion, los liposomas contenidos en la composicion liposomal presentan un gradiente de concentracion transmembrana de un amonio y/o polianion sustituido. Preferiblemente, la concentracion es alta en el espacio interior (interno) de los liposomas. Ademas, la composicion liposomal puede incluir uno o varios gradientes transmembrana ademas del gradiente creado por el amonio y/o polianion sustituido. Por ejemplo, los liposomas contenidos en la composicion liposomal pueden incluir adicionalmente un gradiente de pH transmembrana, un gradiente ionico, un gradiente de potencial electroqmmico y/o un agente de solubilidad.
Segun otra realizacion de la presente invencion, la composicion liposomal de la presente invencion puede proporcionarse en un kit formado por un contenedor con los liposomas, y opcionalmente, un contenedor con la entidad y una instruccion, p. ej. procedimientos o informacion relacionados con la utilizacion de la composicion liposomal en una o varias aplicaciones. Dicha instruccion puede proporcionarse a traves de cualquier medio, p. ej. copia en papel ffsico, medio electronico, o acceso a una base de datos o pagina web que contiene la instruccion.
La composicion de la membrana liposomal de la presente invencion puede realizarse por medio de cualquier metodo conocido o descubierto posteriormente por parte de un experto en la materia. En general, pueden usarse varios componentes lfpidos para preparar los liposomas. Los componentes lfpidos suelen incluir, pero no de forma limitativa, (1) componentes lfpidos sin carga, p. ej. colesterol, ceramida, diacilglicerol, acil(polieteres) o alquilpoli(eteres); (2) fosfolfpidos neutros, p. ej. diacilfosfatidilcolinas, esfingomielinas y diacilfosfatidiletanolaminas, (3) lfpidos anionicos, p. ej. diacilfosfatidilserina, diacilfosfatidilglicerol, diacilfosfatidato, cardiolipina, diacilfosfatidylinositol, diacilglicerolemisuccinato, diacilglicerolhemigluratato, colesterilhemisucinato, colesterilhemiglutarato y similares; (4) lfpidos conjugados con polfmero, p. ej. N-[metoxi-(poli(etilenglicol)diacilfosfatidiletanolamina, poli(etilenglicol)-diacilglicerol, poli(etilenglicol)- ceramida; y (5) lfpidos cationicos, p. ej. 1,2,-diacil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y 1,2-diacil-sn-glicero-3-etilfosfocolina. Pueden emplearse derivados de monoacilo sustituidos de estos lfpidos, asf como analogos de dialquilo y monoalquilo.
Pueden seleccionarse varios componentes de lfpidos para realizar, modificar o transmisor una o varias funciones deseadas. Por ejemplo, el fosfolfpido puede emplearse como lfpido formador de la vesfcula principal. La inclusion del colesterol es util para mantener la rigidez de la membrana y reducir la fuga de farmaco. Los lfpidos conjugados de polfmero pueden usarse en la formulacion liposomal para aumentar la vida util de la circulacion reduciendo la separacion del liposoma mediante el tugado y el bazo, o para mejorar la estabilidad de los liposomas frente a la agregacion durante su almacenamiento, en ausencia de un efecto de alargamiento de la circulacion. Por otro lado, la inclusion de los lfpidos-PEG en una cantidad de 1% en moles o superior del lfpido liposomal se ha demostrado que tiene una prolongacion de varias veces el tiempo de circulacion en sangre del liposoma (consulte p.ej., la patente US-5.013.556). Los inventores han descubierto de forma sorprendente que los liposomas de la presente invencion tienen una circulacion bastante larga, y la adicion del lfpido PEG a la composicion liposomal solo amplfa la duracion de circulacion en menos de dos veces, si es que lo hace. Ademas, los lfpidos de modulacion de carga (titulables) pueden usarse para ayudar a entregar entidades encapsuladas en los liposomas a dianas nucleares o citosolicas, facilitando la fuga de algunas clases de entidades fuera de los confines de la ruta endosomica.
En una realizacion, los liposomas de la presente descripcion incluyen lecitina, colesterol y un polfmero anfipatico. La lecitina incluida en los liposomas puede ser una lecitina natural, una lecitina natural hidrogenada, una lecitina sintetica, 1,2-diestearoil-lecitina, dipalmitoil lecitina, dimiristoil lecitina, dioleolil lecitina, 1-estearoil-2-oleoil lecitina o 1 -palmitoil-2-oleoil lecitina, mientras que el polfmero anfipatico puede ser un derivado de polietileno glicol-lfpido, p. ej. derivados de polietileno glicol fosfatidiletanolamina, polietileno glicol-diacilglicerol o polietilleneglicol- ceramida, mientras que la porcion de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 250 a aproximadamente 20.000, mas comunmente de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000. En otra realizacion, la relacion entre lecitina y colesterol en los liposomas de la presente descripcion es de aproximadamente 3:2 por mol. En otra realizacion, el polfmero anfipatico es de al menos 0,1% en moles del lfpido de formacion de liposoma en los liposomas de la presente descripcion. En otra realizacion, la cantidad de polfmero anfipatico esta situada entre 0,1% en moles y 1% en moles del lfpido de formacion de liposoma en los liposomas de la presente descripcion. Preferiblemente, el polfmero anfipatico es un polfmero neutro, es decir, posee en las condiciones de carga del farmaco la carga ionica neta de cero, por ejemplo, PEG-diacilglicerol, PEG- dialquilglicerol o PEG-ceramida. Se ha descubierto inesperadamente que la inclusion de lfpidos amfipaticos ionicamente neutros al contenido de lfpido PEG de aproximadamente 5,7% en moles. del lfpido total consigue una carga liposomal de alta eficacia de p. ej. alcaloides de la vinca, tales como vinorelbina, mientras que en el caso de PEG-DSPE cargado anionicamente, la eficacia de carga se redujo considerablemente en el contenido de lfpido- PEG de 1,6% en moles. o mas (Ejemplo 72).
En otra realizacion, los liposomas de la presente descripcion contienen un profarmaco de camptotecina como irinotecan y esta formado por lecitina y colesterol, p. ej. en una relacion de aproximadamente 3:2 por mol, y un polfmero anfipatico, p. ej. en una cantidad de al menos 0,1% en moles o menos del 1% del lfpido formador de liposoma.
Los liposomas de la presente invencion pueden prepararse usando cualquier metodo que sea conocido o que sera conocido en esta materia. Consulte, por ejemplo, G. Gregoriadis (editor), Liposome Technology, vol. 1-3, 1a edicion, 1983; 2a edicion, 1993, CRC Press, Boca Raton, FL. Algunos ejemplos de metodos adecuados para preparar la composicion liposomal de la presente invencion seran la extrusion, evaporacion de fase inversa,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
sonicacion, inyeccion de solvente (p. ej. sonicacion), microfluidizacion, analisis de detergente, inyeccion de eter y deshidratacion/rehidratacion. El tamano de los liposomas puede controlarse supervisando el tamano de los poros de las membranas usadas para extrusiones a baja presion o la presion y el numero de pasos usados en la microfluidizacion o cualquier otro metodo apropiado. En una realizacion, los lfpidos deseados primero se hidratan por medio de la hidratacion de capa fina o la inyeccion de etanol, y posteriormente se miden mediante extrusion a traves de las membranas de un tamano de poro definido; mas comunmente 0,05 pm, 0,08 pm o 0,1 pm.
Las composiciones liposomales que contienen el polianion y/o amonio sustituido de la presente descripcion dentro de los liposomas pueden elaborarse usando cualquier metodo adecuado, p. ej. formacion de liposomas en presencia del polianion y/o amonio sustituido de la presente descripcion, p. ej. en forma de sal. El polianion y/o amonio sustituido fuera de los liposomas pueden extraerse o diluirse despues de la formacion del liposoma o antes de cargar o capturar la entidad deseada. Alternativamente, la composicion liposomal que contiene el polianion y/o amonio sustituido de la presente descripcion puede prepararse usando el metodo de intercambio de iones directamente o a traves de una etapa de un intermedio de acido libre con un gradiente de amonio sustituido de la presente descripcion, p. ej. sal de amonio sustituido de poliol y azucar polianionizado. Dichos liposomas pueden neutralizarse usando la amina o sus sales con un acido volatil, por ejemplo, carbonato. La solucion liposomal resultante puede usarse directa o alternativamente y la sal contenida en el anterior puede eliminarse si se desea, p. ej. mediante evaporacion y cristalizacion seguidas de disolucion en un medio acuoso.
Preferiblemente, la composicion liposomal de la presente descripcion tiene un gradiente de concentracion transmembrana del polianion y/o amonio sustituido, p. ej, la concentracion de la sal del polianion y/o amonio sustituido dentro del liposoma es superior, normalmente y como mmimo 100 veces superior que la concentracion del polianion y/o amonio sustituido en el medio fuera del liposoma.
En una realizacion, la concentracion de la sal del polianion y/o amonio sustituido dentro del liposoma es como mmimo 100 veces superior que la concentracion de la sal del polianion y/o amonio sustituido en el medio fuera del liposoma y tiene al menos una concentracion minima de 10 mM, 50 mM, 0,1 M, 0,2 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M o 1,0 M, donde la molaridad se calcula en base al amonio sustituido. En una realizacion, la concentracion de la sal del polianion y/o amonio sustituido dentro del liposoma es como mmimo 100 veces superior que la concentracion de la sal del polianion y/o amonio sustituido en el medio fuera del liposoma y es tiene una concentracion de 0,65 M o aproximadamente 1,0 M.
Ademas, la composicion liposomal de la presente invencion suele tener un pH externo que es compatible o util para mantener la estabilidad de la entidad deseada durante el proceso de carga, junto con la alta eficacia de carga, p. ej. captura superior al 90%. Por ejemplo, se prefiere un pH que este dentro del intervalo 4-7 o 4,5-6,5. En particular, segun la presente invencion, la carga del irinotecan se consigue mejor con un pH del medio externo dentro de un intervalo de 4,0 y 7,0, y mas preferiblemente entre un pH de 5,0 y 6,5. La carga de un derivado de vinca como vincristina, vinorelbina o vinblastina se realiza mejor con un pH de unos 5,0-7,0, y mas preferiblemente con un pH de unos 6,5.
Segun la presente invencion, puede cargarse o capturarse una entidad deseada en los liposomas incubando la entidad deseada con los liposomas de la presente descripcion en un medio acuoso y a una temperatura adecuada, p. ej. una temperatura superior a la temperatura de transicion de la fase de los lfpidos del componente durante la carga mientras se reduce por debajo de la temperatura de la fase de transicion despues de cargar la entidad. El tiempo de incubacion suele basarse en la naturaleza de los lfpidos del componente, la entidad que debe cargarse en los liposomas y la temperatura de incubacion. Normalmente, los tiempos de incubacion de unos pocos minutos a varias horas suelen ser suficientes. Dado que se consiguen un alto nivel de eficacia de captura de mas del 85% y normalmente mas del 90%, no suele ser necesario extraer la entidad no capturada. Si existe esta necesidad, no obstante, la entidad no capturada puede extraerse de la composicion usando varios metodos, como, por ejemplo, cromatograffa de exclusion de tamanos, dialisis, ultra filtracion, adsorcion o precipitacion. Se ha descubierto inesperadamente que mantener la fuerza ionica baja durante la incubacion de una entidad, como, en especial, un derivado de camptotecina o un derivado de alcaloide de la vinca, con los liposomas de la presente descripcion, seguido de un aumento en la fuerza ionica al final de la incubacion, genera una eficacia de carga mas alta, una mejor extraccion del farmaco no capturado y una mejor estabilidad del liposoma frente a la agregacion. Normalmente, la incubacion se realiza, p. ej. en una solucion acuosa, con una fuerza ionica menor a la equivalente a NaCl 50 mM, o mas preferiblemente, menor a la equivalente a NaCl 30 mM. Despues de la incubacion, puede anadirse una sal concentrada, por ej., como una solucion de NaCl, para aumentar la fuerza ionica a un valor superior a la de NaCl 50 mM, o mas preferiblemente, superior a NaCl 100 mM. Sin pretender estar vinculado por teorfa alguna, nuestra hipotesis es que el aumento de la fuerza ionica facilita la disociacion de la entidad de la membrana liposomal, dejando toda la entidad sustancialmente encapsulada dentro del espacio interno del liposoma.
En general, la relacion entidad a lfpido, p. ej. el coeficiente de carga del farmaco obtenido despues de cargar una entidad depende de la cantidad de la entidad capturada dentro de los liposomas, la concentracion del polianion y/o amonio sustituido capturado, p. ej. sal, las propiedades fisioqmmicas de la entidad capturada y el tipo de contraion (anion), p. ej., polianion usado. Debido a la alta eficacia de carga conseguida en las composiciones y/o usando los metodos de la presente invencion, la relacion entidad-lfpido para la entidad capturada en los liposomas es superior al 80%, superior al 90%, y normalmente superior al 95% de la relacion entidad-lfpido calculada en funcion de la cantidad de la entidad y el lfpido del liposoma capturados en el proceso de carga (la relacion de “entrada”). De hecho, suele conseguirse practicamente el 100% de encapsulacion (cuantitativo). La relacion entidad-a lfpido en los liposomas puede caracterizarse
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en terminos de relacion en peso (cantidad en peso de la entidad por peso o unidad molar del Ifpido del liposoma) o relacion molar (moles de la entidad por peso o unidad molar del lfpido del liposoma). Una unidad de la relacion entidad-a lfpido puede convertirse a otras unidades usando un calculo rutinario, como se explica a continuacion. La relacion en peso de una entidad en los liposomas de la presente invencion suele ser 0,05, 0,1, 0,2, 0,35, 0,5 o al menos 0,65 mg de la entidad por mg de lfpido. A nivel de relacion molar, la relacion entidad-a-lfpido segun la presente invencion es de al menos aproximadamente 0,02 a aproximadamente 5, preferiblemente de al menos 0,1 a aproximadamente 2, y mas preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 1,5 moles del farmaco por mol del lfpido del liposoma. En una realizacion, la relacion entidad-a-lfpido, p. ej. el coeficiente de carga del farmaco de derivados de camptotecina es de al menos 0,1, p. ej. 0,1 mol de derivado de camptotecina por un mol de lfpido de liposoma, y preferiblemente de al menos 0,2. En otra realizacion, la relacion entidad-a-lfpido, p. ej. la carga de farmaco es de al menos aproximadamente una entidad de 300 mg (p. ej. alcaloide de la vinca o un derivado del mismo) por mg de lfpido que forma el liposoma. En otra realizacion, la relacion entidad-a-lfpido, p. ej. la carga de farmaco es de al menos una entidad de 500 mg (p. ej. derivado de camptotecina o profarmaco de camptotecina) por mg de lfpido formador de liposoma. Sorprendentemente, la invencion se mantuvo estable y cercana a la encapsulacion liposomal cuantitativa del irinotecan, en la relacion farmaco-a-lfpido de mas de 0,8 mmol de la entidad por 1 g de lfpido del liposoma, mas de 1,3 mmol de entidad por 1 g de lfpido del liposoma, e incluso tan alto como 1,7 mmol de entidad por 1 g de lfpido de liposoma (consulte el Ejemplo 74).
Si el liposoma esta formado por un fosfolfpido, se recomienda expresar el contenido de la entidad en las unidades de cantidad en peso (masa) del farmaco por unidad molar del fosfolfpido del liposoma, p. ej. mg farmaco/mmol de fosfolfpido. Sin embargo, una persona experta en la materia apreciarfa que el contenido del farmaco puede ser equivalente si se expresa de forma independiente de la presencia de los fosfolfpidos en un liposoma, y ademas, puede expresarse de forma equivalente en terminos de cantidad molar del farmaco por unidad (masa o molar) del contenido del lfpido del liposoma. Por ejemplo, un liposoma que contiene 3 partes molares de distearoilfosfatidilcolina (DSPC, peso molecular 790), 2 partes molares de colesterol (peso molecular 387) y 0,015 partes molares de distearoilfosfatidiletanolamina derivatizada con poli(etilenglicol)- (PEG-DSPE, peso molecular 2750), y contiene una doxorrubicina de farmaco (peso molecular 543,5) en la relacion farmaco/lfpido de 150 mg/mmol fosfolfpido, el mismo contenido del farmaco puede ser equivalente si se expresa en terminos de mg farmaco/mg total lfpido de la siguiente forma:
(a) Calcular las cantidades molares de los componentes lfpidos del liposoma normalizados a la unidad molar de los fosfolfpidos del liposoma (DSPC y PEG-DSPE en este ejemplo) dividiendo la cantidad molar de un componente por el total de las cantidades molares de los fosfolfpidos del liposoma:
DSPC 3/(3+0,015) = 0,99502 Colesterol 2/(3+0,015) = 0,66335 PG-DSPE 0,015/(3+0,015) = 0,00498
(b) Calcular la cantidad de masa del lfpido del liposoma correspondiente a la cantidad molar de la unidad del fosfolfpido del liposoma y los pesos moleculares de los componentes:
LfpidoTotal, mg/mmol fosfolfpido = 0,99502x790 + 0,66335x387 + 0,00498x2750 = 1056,48
(c) Calcular la cantidad de masa del farmaco por unidad de masa del lfpido total dividiendo el contenido de farmaco expresado en unidades de masa por unidad molar del fosfolfpido por el numero obtenido en la etapa (b):
Doxorrubicina, mg/mg total lfpido = 150/1056,48 = 0,14198.
(d) Calcular la cantidad molar del farmaco por masa unitaria del lfpido total dividiendo el numero obtenido en la etapa (c) por el peso molecular del farmaco (en este caso, 543,5):
Doxorrubicina, mmol/g total lfpido = 0,14198/543,5x1000 = 0,261.
(e) Calcular la parte molar de los fosfolfpidos en la matriz lipfdica del liposoma:
Parte molar del fosfoKpido = (moles totales de fosfolfpidos) (cantidad de moles totales de lfpidos) =
(3+0,015)/(3+2+0,015) = 0,6012.
(f) Calcular la relacion molar de la doxorrubicina para el lfpido total.
Doxorrubicina, mol/mol de lfpido total = (Parte molar de fosfolfpido)x(Doxorrubicina, g/mol fosfolfpido)/(peso molecular de Doxorrubicina) = 0,6012x150/543,5 = 0,166
Gracias a ello, la relacion entre la relacion farmaco-a-lfpido y farmaco-a-fosfolfpido expresada en diversas unidades puede establecerse facilmente. Como hemos mencionado anteriormente, un “lfpido” incluye, sin caracter restrictivo, cualquier componente que forme una membrana de la membrana del liposoma, como, por ejemplo, los polnmeros y/o detergentes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El amonio sustituido capturado en el liposoma y/o la solucion salina del polianion de la presente descripcion suele tener una fuerza osmotica (osmolalidad) que ayuda a mantener los liposomas estables contra los danos osmoticos (hinchazon o explosion) sin sacrificar la capacidad de carga de los liposomas. En una realizacion, la osmolalidad de la composicion del liposoma de la presente descripcion esta en el intervalo de 0,1 a 1,5 mol/kg o, preferiblemente, 0,2 a 1,0 mol/kg. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que los liposomas de la presente descripcion son estables frente al efecto adverso de la alta fuerza osmotica intraliposomal en la carga del farmaco. Los osmolaridades intraliposomales tan altas como 0,727 mol/kg se toleraban bien, generando una carga practicamente cuantitativa de un farmaco hasta un maximo teorico de intercambio estequiometrico de los iones de amonio sustituidos intraliposomales para moleculas del farmaco (en el caso del irinotecan, una molecula de farmaco por un ion de amonio sustituido), incluso aunque la osmolaridad del medio acuoso extraliposomal durante la incubacion simultanea del farmaco y los liposomas era cercana al valor fisiologico de unos 0,3 mol/kg (Ejemplo 74).
En general, la composicion del liposoma de la presente invencion es bastante estable durante el almacenamiento, p. ej. medido por el porcentaje de entidad capturada que se libera al exterior de los liposomas o se mantiene dentro de los liposomas despues de un periodo de tiempo espedfico desde la carga inicial de la entidad dentro de los liposomas de la presente invencion. Por ejemplo, la composicion liposomal de la presente invencion es estable a 4 °C durante al menos 6 meses, p. ej. menos del 10% de la entidad capturada se libera 6 meses despues de la carga inicial de la entidad. En una realizacion, la composicion liposomal de la presente invencion es estable a 4 °C durante al menos 2 anos, p. ej. menos del 20% de la entidad capturada se libera 2 anos despues de la carga inicial de la entidad.
Para una entidad capturada en el liposoma resulta beneficioso permanecer encapsulada en el liposoma hasta que este alcance el lugar de su accion prevista, p. ej. en el caso de un farmaco antitumoral liposomal administrado al paciente, un tumor. Los liposomas de la presente invencion han mostrado una estabilidad sorprendente frente a la liberacion (fuga) de la entidad capturada en condiciones in vivo, p. ej. en la sangre de un mairnfero. El tiempo de exposicion necesario para una liberacion del 50% de la entidad capturada, p. ej., un farmaco, de los liposomas (tiempo de liberacion media) en la sangre de una rata in vivo era superior a 24 horas. En particular, los liposomas cargados con farmacos de alcaloides de la vinca, p. ej. vinblastina, vincristina y vinorelbina, mostraron una estabilidad remarcable contra la fuga de farmaco in vivo, con un tiempo de liberacion medio de al menos 24 horas, o la cantidad de entidad que queda encapsulada despues de 24 horas en la sangre in vivo de al menos el 50% del valor pre-administrado. Normalmente, se observa un tiempo de liberacion medio superior a 33 horas o una cantidad de entidad encapsulada que permanece encapsulada despues de 24 horas en la sangre in vivo de al menos el 60%; e incluso se observa un tiempo de liberacion medio superior a 46 horas o una cantidad de entidad encapsulada que permanece encapsulada despues de 24 horas en la sangre in vivo de al menos el 70% del valor de preadministracion de forma comun. Algunas veces, el tiempo de liberacion medio para un farmaco encapsulado en la sangre in vivo era de mas de 93 horas, e incluso de mas de 120 horas. El liposoma cargado con derivados de camptotecina, como el topotecan y el irinotecan, tambien mostraron una estabilidad excepcional in vivo en la sangre, permaneciendo encapsulado el 79-85% de la carga de farmaco original despues de 24 horas. Cabe destacar que los liposomas de la presente invencion, aunque tienen un coeficiente bajo de liberacion del farmaco in vivo en la circulacion sangumea, mostraron una actividad antitumoral sustancial in vivo que superaba la del farmaco libre (p. ej. administrado como una solucion).
Los liposomas de la presente invencion proporcionaron una combinacion inesperada de alta eficacia del agente terapeutico capturado y una baja toxicidad. En general, la actividad de una entidad terapeutica encapsulada liposomalmente segun la presente invencion, p. ej. la actividad antineoplasica del irinotecan en un mai^ero, es como mfriimo igual o dos veces superior, o como mfriimo cuatro veces superior a la actividad de la entidad terapeutica si se administra en la misma cantidad que su formulacion no liposomal rutinaria, p. ej. sin usar la composicion liposomal de la presente invencion, mientras que la toxicidad de la entidad encapsulada liposomalmente no se supere, es al menos dos veces, al menos tres veces, o al menos cuatro veces inferior a la de la misma entidad terapeutica administrada en la misma dosis y el mismo calendario pero de forma libre y no encapsulada. Por ejemplo, es de sobras conocido que la encapsulacion liposomal de los derivados de la camptotecina anticancerfgena por los metodos publicados de terceros acaba aumentando la toxicidad (dosis tolerada maxima mas baja, dosis de letalidad un 50% mas baja) en comparacion con el farmaco no encapsulado. Consulte la patente US-6.355268; US-6.465.008; Colbern, y col. Clinical Cancer Res. 1998, v. 4, pag. 3077-3082; Tardi, y col. Cancer Res., 2000, v. 60, pag. 3389-3393; Emerson, y col. Clinical Cancer Res. 2000, v. 6, pag. 2903-2912. Los pro-farmacos de camptotecina encapsulados liposomalmente, como el irinotecan (CPT- 11), que es soluble en el agua, los derivados de profarmaco de la camptotecina cationica, tienen una actividad considerablemente superior, p. ej. al menos 4 veces, e incluso 10 veces superior a la actividad antitumoral evaluada en un modelo de tumor in vivo que el farmaco en ausencia de una formulacion liposomal, p. ej. en una forma libre (solucion). Esto es incluso mas remarcable, ya que el irinotecan requiere una activacion enzimatica, p. ej. mediante la accion de carboxilesterasica endogena no espedfica, pero segun la presente invencion esta encapsulado sustancialmente dentro del espacio interno del liposoma. Por otro lado, sorprendentemente, la toxicidad del profarmaco de camptotecina como el CpT-11 en la forma liposomal (relacion de masa de farmaco/lfpido superior a 0,1, p. ej. 0,2-0,6 o mas) segun la presente invencion era mas de 2 veces, mas de 3 veces e incluso mas de 4 veces inferior a la del profarmaco libre (no encapsulado) CPT-11. Ademas, se consiguio una liberacion prolongada del farmaco de los liposomas CPT-11 in vivo, con mas del 50% e incluso mas del 70% (79-86%) del contenido del farmaco original que permanece en los liposomas 24 horas despues de la administracion en el torrente sangumeo, y con tiempos de liberacion medios superiores a 24 horas, normalmente superando las 48 horas. La permanencia prolongada del farmaco en el liposoma in vivo se ha asociado con su efecto antitumoral superior. Sorprendentemente, la liberacion de CPT-11 in vivo mas lenta y la actividad antitumoral mas alta se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ha observado en los liposomas que contienen derivados de azucar polianionizado de bajo peso molecular (octasulfato de sacarosa) en lugar de un anion polimerico (polifosfato) (Ejemplo 15).
Segun otra realizacion de la presente invencion, la composicion liposomal de la presente invencion puede proporcionarse como una composicion farmaceutica que contenga la composicion liposomal de la presente invencion y un portador, p. ej. un portador aceptable a nivel farmaceutico. Algunos ejemplos de portadores aceptables a nivel farmaceutico son la solucion salina normal, la dextrosa isotonica, la sacarosa isotonica, la solucion de Ringer y la solucion de Hanks. Puede anadirse una sustancia tampon para proporcionar un pH optimo para conseguir su estabilidad durante el almacenamiento. Por ejemplo, un pH de entre 6,0 y 7,5, mas preferiblemente un pH de aproximadamente 6,5, es optimo para la estabilidad de los lfpidos de la membrana liposomal, y proporciona una retencion excelente de las entidades capturadas. La histidina, hidroxietilpiperazina- etilsulfonato (HEPES), morfolipo-etilsulfonato (MES), succinato, tartrato y citrato, normalmente a una concentracion de 2-20 mM, son ejemplos de sustancias tampon. Otros portadores adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solucion acuosa amortiguadora, NaCl al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Pueden anadirse ajustadores de tonicidad y estabilizadores polimericos, carbohidratos o protemas, p. ej. gelatina, albumina, dextrano o polivinilpirrolidona. La tonicidad de la composicion puede ajustarse al nivel fisiologico de 0,25-0,35 mol/kg con glucosa o un compuesto mas inerte como la lactosa, sacarosa, manitol o dextrina. Estas composiciones pueden esterilizarse usando tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas, por ejemplo, la filtracion. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse bajo condiciones asepticas espedficas y liofilizarse, al tiempo que la preparacion liofilizada se combina con un medio acuoso esteril antes de su administracion.
Las composiciones liposomales farmaceuticas tambien pueden contener otras sustancias auxiliares aceptables a nivel farmaceutico segun sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiologicas, como ajustadores del pH y soluciones tampon, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Ademas, la suspension liposomal puede incluir agentes de proteccion de los lfpidos que los protegen de los danos provocados por los radicales libres y la peroxidacion lipfdica durante su almacenamiento. Son adecuados los inactivadores lipofflicos de radicales libres, como el alfa-tocoferol y los quelantes solubles en agua espedficos de hierro, tales como la ferrioxamina.
La concentracion de los liposomas de la presente invencion en las formulaciones farmaceuticas fluidas puede variar ampliamente, es decir, de menos de 0,05% normalmente o al menos sobre el 2-10% tanto como el 30-50% en peso y sera seleccionado principalmente en funcion de los volumenes de los fluidos, las viscosidades, etc. dependiendo del modo de administracion espedfico que se haya seleccionado. Por ejemplo, la concentracion puede aumentarse para reducir la carga de fluido asociada al tratamiento. Esto puede ser especialmente deseable en pacientes que tienen una insuficiencia cardfaca congestiva asociada a ateroesclerosis o una hipertension severa. Alternativamente, las composiciones farmaceuticas liposomales formadas por lfpidos irritantes pueden diluirse a bajas concentraciones para disminuir la inflamacion en el lugar de administracion.
La cantidad de composicion farmaceutica liposomal administrada dependera de la entidad terapeutica espedfica capturada dentro de los liposomas, el estado patologico que se esta tratando, el tipo de liposomas usados y el criterio del medico. En general, la cantidad de composicion farmaceutica liposomal administrada sera suficiente para suministrar una dosis efectiva a nivel terapeutico de la entidad terapeutica espedfica.
La cantidad de composicion farmaceutica liposomal necesaria para suministrar una dosis efectiva a nivel terapeutico puede determinarse con los metodos rutinarios in vivo e in vitro, habituales en materia de analisis farmacologico. Consulte, por ejemplo, D.B.Budman, A.H.Calvert, E.K.Rowinsky (editores). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003. Las dosis efectivas a nivel terapeutico para las distintas entidades terapeuticas son bien conocidas por los tecnicos de esta materia; y, segun la presente invencion, una entidad terapeutica suministrada a traves de la composicion liposomal de la presente invencion proporciona al menos la misma actividad, o dos veces mas, 4 veces mas o 10 veces mas de la actividad obtenida mediante la administracion de la misma cantidad de entidad terapeutica en su formulacion no liposomal rutinaria. Normalmente, las dosis para la composicion farmaceutica liposomal de la presente invencion van de 0,005 a aproximadamente 500 mg. de la entidad terapeutica por kilogramo de peso corporal, y mas menudo, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 mg de entidad terapeutica/kg de peso corporal.
Normalmente, la composicion farmaceutica liposomal de la presente invencion se prepara como una solucion topica o inyectable, tanto en solucion como en suspension lfquida. Sin embargo, tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para la solucion o suspension en vehuculos lfquidos antes de la inyeccion. La composicion tambien puede formularse en un comprimido de revestimiento enterico o una capsula de gel, dependiendo de los metodos conocidos en esta materia.
La composicion liposomal de la presente invencion puede administrarse de cualquier forma que sea medicamente aceptable, lo que dependera de la afeccion o la lesion en tratamiento. Las rutas de administracion posibles incluyen inyecciones, por rutas parenterales como la intramuscular, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraepidural, intratecal, u otras, asf como por via oral, nasal, oftalmica, rectal, vaginal, topica o pulmonar, p. ej. por inhalacion. Para el suministro de farmacos liposomales formulados segun la invencion, a tumores del sistema nervioso central, resulta especialmente ventajoso realizar una infusion intracraneal sostenida lenta de los liposomas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
directamente en el tumor (una administracion potenciada por conveccion, o CED). Consulte Saito, y col., Cancer Research, vol.64, pag. 2572-2579, 2004; Mamot, y col., J. Neuro-Oncology, vol. 68, pag. 1-9, 2004. Las composiciones tambien pueden aplicarse directamente a las superficies del tejido. La invencion incluye la liberacion sostenida, la liberacion dependiente del pH u otra administracion por liberacion mediada por la condicion ambiental o qmmica espedfica, p. ej. mediante los mencionados medios como inyecciones de deposito o implantes erosionables.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar, sin animo de limitar la invencion de ninguna forma, modo o manera, ya sea implfcita o explfcitamente. Aunque son tfpicos para los usuarios, los expertos en la materia pueden usar otros procedimientos, otras metodologfas y otras tecnicas de forma alternativa.
Ejemplo 1. Preparacion de las soluciones de sales de amonio sustituido.
Las soluciones de sulfato trialquilamonio y dialquilamonio utiles para cargar farmacos (p. ej. doxorrubicina) en liposomas se prepararon diluyendo acido sulfurico con agua a una concentracion de 0,25 M y despues titulando la solucion de acido sulfurico con una o varias aminas. Las aminas sustituidas que se han usado en este ejemplo han sido la trietilamina, trimetilamina, dimetilamina, dietilamina o dietanolamina. Despues de la adicion de las aminas, la solucion resultante se ha diluido a una concentracion final de 0,2 M de la sal de amonio sustituido. La osmolalidad se ha determinado usando un osmometro de punto de rodo. Las propiedades de las soluciones salinas de sulfato de alquilamonio sustituido se muestran en la Tabla 1 de mas abajo.
Tabla 1. Propiedades de diversas soluciones de sulfato dialquilamonio y trialquilamonio
Sal
Osmolalidad, mmol/kg pH
Sulfato de dimetilamonio
472 5,65
Sulfato de dimetiletanolamonio
509 5,72
Sulfato de dietilamonio
519 5,85
Sulfato de trimetilamonio
497 5,81
Sulfato de trietilamonio
559 5,33
Ejemplo 2. Preparacion de liposomas con sales de dialquilamonio y trialquilamonio capturadas, y carga de una sustancia en estos liposomas.
Se disolvieron simultaneamente distearoilfosfatilcolina (DSPC), colesterol (Chol) y N-(metoxi-poli(etilenglicol)-oxicarbonil)- distearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) (preparado a partir de poli(etilenglicol) con un peso mol. de 2000) en cloroformo en una relacion molar de 3:2:0,015, y el cloroformo se extrajo a 55-60 °C mediante evaporacion rotatoria. A continuacion, la pelfcula lipfdica secada se hidrato en una solucion de uno de cada sulfato de dialquil- o trialquilamonio enumerados en el Ejemplo 1 a 60 °C durante 30 min. La suspension lfpida se extrudio bajo presion a traves de dos filtros de membrana grabados con pistas de policarbonato apilados con un tamano de poro de 0,1 pm (Corning Nuclepore). El tamano del liposoma determinado mediante el metodo de dispersion cuasi-elastica de luz era aproximadamente 110120 nm. Las sales de trialquilamonio o dialquilamonio no encapsuladas se extrajeron del medio externo de los liposomas por medio de filtracion de gel usando una columna de gel de dextrano reticulada (Sephadex G-75, Amersham Pharmacia Biotechnology) eluida con solucion salina tamponada con HEPES, pH 7,2-7,4, y los liposomas se recogieron en una fraccion de volumen vado de la columna. Se anadio clorhidrato de doxorrubicina USP (polvo liofilizado que contiene 5 partes de peso de lactosa por 1 parte de doxorrubicina) a los liposomas a una concentracion de 150 pg de farmaco/pmol del fosfolfpido liposomal. La mezcla se incubo a 55 °C durante 45 min, se enfrio en hielo durante 10 min, y el farmaco no encapsulado se extrajo mediante cromatograffa de filtracion de gel usando una columna Sephadex G-75 eluida con solucion salina tamponada con HEPES, pH 7,4. La presencia de doxorrubicina libre (caracterizada por la aparicion de una banda de color rojo en movimiento lento) no era detectable visualmente. Los liposomas cargados con doxorrubicina purificados se analizaron para fosfolfpidos y doxorrubicina siguiendo los Ejemplos 70 y 71 (metodo espectrofotometrico), respectivamente. Las eficiencias de carga de farmacos resultantes se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Carga de doxorrubicina en liposomas con soluciones capturadas de sales de dialquil- y trialquilamonio. Coeficiente de entrada de farmaco/fosfolfpido 150 pg/pmol.
Sal capturada en el liposoma:
Coeficiente de farmaco/fosfolfpido en liposomas (pg/pmol) Eficacia de captura (%)
Sulfato de trimetilamonio
140,74 ± 10,35 93,8 ± 5,7
Sulfato de trietilamonio
163,81 ± 16,41 109,2 ± 11,6
Sulfato de dietilamonio
158,16 ± 18,34 105,4 ± 7,8
Sulfato de dimetiletanolamonio
155,08 ± 8,51 103,4 ± 11,6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 3. Preparacion de liposomas que contienen varias sales de sulfato de amonio sustituido de dialquilo, trialquilo y heteroddico y carga de doxorrubicina en estos liposomas.
Las soluciones de sal de sulfato de amonio sustituido se prepararon como en el Ejemplo 1 usando aminas heterodclicas y sales de alquilo sustituido, hidroxialquilo sustituido. Los liposomas se formaron como en el Ejemplo 1, excepto en que el lugar de la etapa de hidratacion con pelfcula lfpida, los lfpidos netos se disolvieron en etanol (aproximadamente 100 pl de etanol por cada 50 pmol de fosfolfpido) y se mezclaron con la solucion de sal de amonio sustituido a 60-65 °C, por lo que la dispersion del lfpido resultante contema cerca de 10% en vol. de etanol.
La carga de doxorrubicina se realizo anadiendo una solucion de doxorrubicina (2 mg/ml en solucion salina tamponada con HEPES pH 6,5) a los liposomas con una concentracion de 155 pg farmaco/pmol liposoma fosfolfpido (PL) y calentando a 58 °C durante 45 minutos en un bano de agua caliente. Los liposomas resultantes se separaron de cualquier doxorrubicina no encapsulada residual y se analizaron para desvelar el contenido de farmaco y lfpido como en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Carga de doxorrubicina en liposomas con soluciones de sales de amonio sustituido con alquilo, dialquilo, trialquilo y heterodclico con impedimento esterico.
Amina usada para preparar la sal de amonio sustituido
Osmolalidad, mmol/kg carga de farmaco, mg/mmol de fosfolfpido Eficacia de carga, %
Trimetilamina
497 149,4 ± 7,9 96,4 ± 4,9
Trietilamina
559 149,6 ± 6,9 96,5 ± 4,3
Dimetiletanolamina
509 163,1 ± 6,6 105,3 ± 4,5
Dimetilamina
472 158,6 ± 7,4 102,3 ± 4,9
Dietilamina
519 156,7 ± 13,0 101,1 ± 8,5
Diisopropilamina
533 159,9 ± 6,2 103,2 ± 4,1
Tris(hidroximetil)-aminometano
423 179,9 ± 15,3 116,1 ± 11,5
1-Piperidinaetanol
506 153,5 ± 7,1 99,0 ± 4,5
4-Metilmorfolina
465 152,4 ± 9,8 98,3 ± 6,2
Piperidina
479 158,5 ± 12,5 102,3 ± 8,2
1-Metilpirolidina
492 153,6 ± 12,3 99,1 ± 7,8
Dimetilpiperazina
378 158,0 ± 6,5 101,9 ± 4,3
Ejemplo 4. Preparacion de solucion de polifosfato de trietilamonio (TEA-Pn).
Poli(fosfato) de sodio lineal con 13-18 unidades de fosfato por molecula (cristal de fosfato; CALGON®, obtenido de la empresa Sigma Chemical Company) se disolvio en agua a una concentracion de aproximadamente fosfato 1,3 M. La solucion se paso por una columna con 120 ml de perlas de resina de intercambio de cationes de copolfmero de poliestireno-divinilbenceno sulfonado (Dowex 50Wx8-200, Dow Chemical Co.) en forma de hidrogeno. La columna se preequilibro con una solucion acuosa de HCl 3-3,6 M para convertir la resina en forma de hidrogeno y lavarla con agua desionizada a un pH neutro. Se aplicaron 15 ml de la solucion de polifosfato de sodio a la columna y se eluyeron con H2O desionizada. El eluyente de columna se ha supervisado usando un detector de conductividad. El flujo saliente de la columna correspondiente al pico de conductividad se titulo con trietilamina pura con un pH de 5,5-6,0. La solucion se analizo para detectar sodio residual mediante un potenciometro usando un electrodo de cristal sensible al sodio. Tambien se detecto el contenido de fosfato usando un analisis de fosfato inorganico como en el Ejemplo 1. La solucion que tema un contenido de sodio residual inferior al 1% se diluyo a una concentracion final de fosfato 0,55 M. La solucion normalmente tiene una concentracion TEA de 0,52-0,55 M, pH de 5,5-6,0, y una osmolalidad de 430-480 mmol/kg
Ejemplo 5. Extraccion de sales de polifosfato no capturado de las preparaciones de liposomas.
Los liposomas (120 nm de tamano) con un marcador fluorescente capturado de trisulfonato 8-hidroxipireno se prepararon siguiendo las indicaciones de Kirpotin, y col., Biochemistry 36:66-75, 1997, y se mezclaron con la solucion de polifosfato de sodio. La mezcla se cargo en columnas de exclusion por tamano que conteman perlas de dextrano reticuladas (Sephadex G-75), perlas de agarosa al 6% (Sepharose 6B-CL) o perlas de agarosa al 4% (Sepharose 4B-CL), de Amersham Pharmacia, y se eluyeron con la solucion tampon MES-Dextrosa (pH 5,5). Se realizo el analisis de los efluentes para detectar el contenido de fosfato usando el analisis de fosfato de Bartlett (1959), y para detectar el contenido de liposomas usando la espectrofluorometna. De los analisis por cromatograffa de gel estudiados, Sepharose CL-6B proporciono una separacion completa del polifosfato y los liposomas con una relacion volumetrica del lecho de columna/muestra de 13.
Ejemplo 6. Preparacion de la solucion de trietilamonio de octasulfato de sacarosa (TEA-SOS).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El octasulfato de sacarosa de sodio (peso equivalente 144,8) es la sal de sodio del derivado de la sacarosa donde todos los grupos de hidroxilo han formado esteres de acido sulfurico. La sal de sodio de octasulfato de sacarosa (SOS) se adquirio de la empresa Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, ref. S699020. Se disolvieron seis gramos de octasulfato de sacarosa de sodio en 16,57 ml de agua desionizada para conseguir una concentracion final de unos 2,5 N de los grupos de sulfato. La solucion se trato por intercambio de iones como en el Ejemplo 4. La solucion de acido de sacarosaoctasulfurico se obtuvo ya que el efluente de la columna de intercambio de iones se titulo con trietilamina pura con un pH de 5,7 (punto de neutralizacion), y se determino el pH y la osmolalidad de la solucion. La solucion resultante tema la concentracion de trietilamonio calculada de 0,643 M, pH 5,7, y la osmolalidad de 530 mmol/kg. La presencia de sodio residual no pudo detectarse usando un potenciometro (inferior al 0,1%).
Ejemplo 7. Liposomas cargados con irinotecan (CPT-11) usando sales de amonio sustituido; preparacion y liberacion del farmaco in vitro en presencia de plasma sangu^neo.
En este ejemplo, se han estudiado el sulfato, citrato, pirofosfato, trifosfato y polifosfato lineal (13-18 mer) como aniones en las soluciones de sal de amonio sustituido capturada en el liposoma. Se escogieron los polfmeros de fosfato por su biodegradabilidad y porque los polifosfatos se encuentran naturalmente en las celulas, al contrario que otros aniones polimericos sinteticos (poliacrilato, sulfato de dextrano y similares). Ademas, la viscosidad de las soluciones de polifosfatos de bajo peso molecular era inferior a la de otros polfmeros, por lo que los polifosfatos resultaban mas adecuados para el proceso.
Se utilizaron los siguientes materiales para preparar las soluciones salinas.
1. Polifosfato de sodio, NaO-[PO3Na]n-Na, n=13-18, adquirido de Sigma (ref. P-8510, “Vidrio fosfatado. Calidad laboratorio”, tambien conocido como hexametafosfato de sodio o por el nombre de marca CALGON);
2. Tripolifosfato de pentasodio, Na5P3O10, adquirido de Sigma (ref. T-5883); 3. Decahidrato de pirofosfato de tetrasodio, Na4P2Oy10H2O, adquirido de Sigma (ref. P-9146).
4. Se utilizaron resinas de intercambio de iones Dowex 50Wx4 (resina de poliestireno sulfonado reticuladas al 4%, malla de 100-200) adquiridas de Sigma (ref. 50X4-200) o Dowex HCR-W2 (resinas de poliestireno sulfonado reticuladas al 8%, malla de 50-100) adquiridas de Sigma (ref. I-8880) de forma indistinta. Las resinas se han lavado mediante decantacion en el siguiente orden: tres veces con agua desionizada, dos veces con HCl 1 N (3x en exceso sobre la resina por volumen), tres veces con agua, dos veces con NaOH 1 N, tres veces con agua, tres veces con HCl 1 N y tres veces con agua. Despues de la decantacion, las resinas teman la forma H+.
5. Trimetilamina (TMA), solucion acuosa al 40%, de Aldrich Chemical Co. (ref. 43, 326-8). La concentracion se establecio mediante titulacion acida a alrededor de 5,9 N.
6. Trietilamina (TEA), 99%, calidad HPLC, de Fisher (ref. 04884). La concentracion por titulacion acida era de 6,9-7,1 N.
El agua se purifico a traves de osmosis inversa, intercambio de iones y extraccion organica para conseguir una calidad libre de componentes organicos de “16-18 MOhm”.
Se prepararon soluciones acuosas de sales de pirofosfato, trifosfato y polifosfato empleando el metodo de intercambio de iones. Se cargaron soluciones de polifosfato de sodio (3 g en 25 ml de agua), pirofosfato (4 g en 27 ml de agua), o polifosfato (6,7 g en 30 ml de agua) en la columna que conteda 100 ml (volumen del lecho) de resina de intercambio de iones preparados como se ha descrito anteriormente. La columna se eluyo con agua y se recogieron fracciones. Las fracciones con un pH addico (pH<3) se combinaron. Se diluyeron alfcuotas de 0,5-ml de la fraccion combinada que contema el fosfato acido por triplicado con 20 ml de agua y se titularon con NaOH 0,100 N hasta el punto final de pH 4,55,0 (solucion analftica de Fisher) para determinar la normalidad. Las fracciones combinadas despues del intercambio de iones se titularon con trimetilamina (para obtener sales de trimetilaminio) a un pH de 5,4-5,5. Despues de la titulacion, las soluciones se diluyeron, en caso necesario, para obtener una concentracion final de trimetilamonio cercana a 0,5 N.
Los sulfatos de trimetilamonio y trietilamonio se prepararon diluyendo 1,39 ml de acido sulfurico concentrado (17,9 M) con 80 ml de agua, y titulando la solucion diluida con trietilamina pura o trietilamina acuosa bajo el control de un medidor de pH hasta el punto de equivalencia (pH 5,1-5,5). El volumen se ajusto a 100 ml con agua.
La solucion de citrato de trimetilamonio se preparo disolviendo 1,572 g de acido dtrico monohidratado ACS de Sigma (ref. C-1909) en 20 ml de agua, y titulando la solucion con una solucion acuosa de trimetilamina hasta el punto de equivalencia. El volumen se ajusto a 25 ml con agua.
Las soluciones se filtraron usando un filtro de acetato de celulosa de 0,2-pm aplicando una presion positiva. La osmolalidad y el pH de las soluciones se midieron usando un osmometro de presion de vapor y un medidor de pH de electrodo de calomelanos de vidrio, respectivamente. La normalidad del anion en las soluciones de fosfato se determino mediante un analisis espectrofotometrico de fosfomolibdato azul (consulte el Ejemplo 70) despues de la hidrolisis acida (5 min. 100 °C, 3 N H2SO4). La normalidad del anion solo tuvo en cuenta los grupos funcionales
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
acidos que se ionizan sustancialmente a un pH de 5,5. La normalidad del cation se determino basandose en la base de trialquilamonio anadida. Las soluciones obtenidas teman las propiedades siguientes (Tabla 4):
Tabla 4. Propiedades de soluciones de sales de amonio sustituido para cargar CPT-11 en liposomas.
Sal
normalidad de cation normalidad de anion pH Osmolalidac (mmol/kg)
Citrato de TMA
0,58 0,60 5,1 791
Sulfato de TMA
0,50 0,50 5,4 625
Pirofosfato de TMA
0,44 0,54 5,4 651
Trifosfato de TMA
0,57 0,68 5,4 695
Polifosfato de TMA
0,49 0,58 5,5 336
Sulfato de TEA
0,54 0,50 5,35 719
El colesterol y el DSPC se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE. UU. PEG-DSPE (PEG peso mol. 2000) se adquirio de Shearwater Polymers, Huntsville, AL, EE. UU. El DSPC, colesterol y PEG-DSPE con la proporcion de peso 3:1:0,1 (relacion molar aproximada 3:2:0,03) se disolvieron en cloroformo (Fisher; Calidad optima, estabilizado con amileno) a 60 mg/ml de DSPC. La solucion se dispenso en tubos Pyrex a 30 mg de DSPC (0,5 ml) por tubo y se evaporo lentamente a presion reducida usando un evaporador rotatorio a 60 °C. Las peffculas lipfdicas se secaron al vado (mercurio de 100 micrometros de mercurio, bomba de aceite) durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
Las peffculas lipfdicas secas se hidrataron agitando suavemente las soluciones salinas acuosas anteriores a 60 °C durante 15-20 minutos. Los ffpidos formaron una suspension lechosa (vesfculas multilamelares). Esta suspension lechosa se sometio a cinco ciclos de congelacion en la mezcla de hielo seco e isopropanol (-80 °C, 3 minutos) y se descongelo en un bano de agua a 60 °C durante 3 minutos. A continuacion, la suspension lipfdica se extrudio 10 veces (doble efecto) a traves de dos filtros de membrana de policarbonato apilados (Nucleopore, Whatman, tamano de poro 0,1 pm) usando un extrusor alternativo de accionamiento manual (Avanti Polar Lipids) calentado a 60 °C.
Los liposomas extrudidos se mantuvieron a 60 °C durante cinco minutos y se inactivaron en agua helada (0-4 °C) durante cinco minutos. A continuacion, los liposomas se separaron de la solucion salina formadora de gradiente en la solucion de tampon de carga MES-Dextrosa (50 g/l de Dextrosa ACS, 0,975 g/l de acido 2-(N-morfolino)-etanosulfonico (MES) y una cantidad suficiente de NaOH 5 M para que el pH alcanzase el valor de 6,4) mediante cromatograffa en gel en Sephadex G- 75. Aparecen liposomas en la fraccion de volumen vado (aproximadamente el 30% del volumen del lecho de la columna).
La preparacion de CPT-11 (clorhidrato de irinotecan) que contiene 0,860 mg de la base de CPT-11 por 1 mg de solido se disolvio en HCl 0,001 N para preparar una solucion madre de 16,5 mg/ml de base de CPT-11 base. Esta solucion se mezclo con los liposomas en la solucion tampon MES-Dextrosa para conseguir la relacion de 150 pg de CPT-11 por 1 pmol de fosfoffpidos de liposoma. La mezcla se incubo a 55 °C en un bano de agua, con agitacion suave ocasional (aproximadamente cada cinco minutos) durante 30 minutos, y despues se enfrio rapidamente en agua helada (0-4 °C). Los liposomas se separaron del farmaco encapsulado usando cromatograffa en gel en Sephadex G-75, utilizando MES- Dextrosa como eluyente. El farmaco encapsulado se determino mediante un analisis espectrofometrico (Ejemplo 71) y los fosfoffpidos se determinaron usando un analisis de extraccion (Ejemplo 70).
La liberacion del farmaco in vitro de los liposomas cargados con CPT-11 obtenidos de esta manera en presencia de 50% de plasma humano se estudio de la forma siguiente. El plasma donante humano congelado se descongelo a 37 °C, centrifugo a 14.500 g durante 10 minutos y se filtro usando un filtro de jeringa de acetato de celulosa de 0,45-pm. Las preparaciones liposomales con CPT-11 cargado se esterilizaron haciendolas pasar por un filtro de jeringa esteril de acetato de celulosa (SFCA) exento de tensioactivos de 0,2-pm. 0,5-ml de los liposomas se mezclaron con 0,5 ml del plasma en tubos Eppendorf esteriles de copoffmero de 1,5-ml, sellados e incubados en una plataforma oscilante a 37 °C durante 24 horas. La muestra en blanco contema 0,5 ml de MES-Dextrosa esteril en lugar de liposomas. Los liposomas se aislaron mediante cromatograffa en gel en un gel de agarosa reticulado con perlas al 2% (Sepharose CL-2B, Pharmacia; volumen del lecho 10 ml) usando NaCl 144 mM, HEPES-Na 5 mM, solucion tampon a pH 7,4 (HBS-5). Los liposomas aparecieron en la fraccion de volumen vado, mientras que las protemas de plasma y el farmaco liberado (si existe) fueron retardados por el gel. Las fracciones liposomales se sometieron a un analisis para detectar CPT-11 y fosfoffpidos, y se determino la relacion farmaco/fosfoffpidos (relacion de salida). Las lecturas de las muestras en blanco (solo plasma) se restaron de las lecturas de las muestras que conteman liposomas. Se determino el porcentaje de farmaco que quedaba en los liposomas despues de la incubacion dividiendo la relacion de salida farmaco/ffpido la relacion de entrada farmaco/ffpido (relacion farmaco/ffpido antes de la incubacion con plasma). Los datos de carga y liberacion se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5. Carga de CPT-11 en liposomas con sales de alquilamonio terciario y liberacion in vitro del farmaco en presencia del plasma humano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Solucion salina capturada
Antes de la incubacion con plasma Despues de la incubacion con plasm
relacion farmaco/lfpido
eficacia de encapsulacion (%) relacion farmaco/lfpido farmaco que qued; encapsulado (%)
Sulfato de TMA
127,2 ± 5,6 84,8 ± 3,8 132,1 ± 6,9 103,8 ± 10,0
Pirofosfato de TMA
136,2 ± 9,0 90,8 ± 6,0 132,3 ± 5,0 97,1 ± 10,1
Trifosfato de TMA
132,9 88,6 129,2 97,3
TMA-Pn
134,4 ± 9,3 89,6 ± 6,2 135,0 ± 7,4 100,4 ± 12,4
Sulfato de TEA
131,1 ± 6,5 87,4 ± 4,4 125,2 ± 5,0 95,5 ± 8,6
Ejemplo 8. Estabilidad in vivo de los liposomas cargados con CPT-11 usando sales de trialquilamonio sulfato, citrato, polifosfato, trifosfato y pirofosfato.
Mientras que los liposomas de camptotecina pueden mostrar una fuga de farmaco aceptable en el plasma sangumeo in vitro, el farmaco puede perderse mas rapidamente en la circulacion sangumea in vivo. Por lo tanto, se ha evaluado un panel de formulaciones liposomales de CPT-11 para conocer la estabilidad del farmaco en la circulacion sangumea in vivo usando un analisis de punto temporal unico en ratones.
Los liposomas se prepararon y cargaron con CPT-11 como se ha descrito en el Ejemplo 6 con las siguientes modificaciones. En lugar de usar PEG-DSPE de Shearwater Polymers, los inventores utilizaron un PEG-DSPE similar de Avanti Polar Lipids. Para conseguir la cuantificacion de la matriz lfpida del liposoma en las muestras de sangre/tejido, se anadio una etiqueta radioactiva no intercambiable, [3H]-Colesteril hexadecil eter ([3H]-CHE; (Amersham, EE. UU.) a la solucion de cloroformo de los lfpidos en una cantidad de 0,25 mCi/mmol de fosfolfpidos. Las soluciones lfpidas se dispensaron en tubos Pyrex a 12 mg de DSPC/tubo, y se formaron pelmulas lfpidas mediante secado al vado/evaporacion rotatoria. Las pelmulas lfpidas se hidrataron con 0,7 ml de las soluciones de sal de amonio sustituido formadoras de gradiente. La concentracion lfpida en los liposomas con sales que conteman fosfato capturado se determino por recuento por centelleo de radioactividad. Las preparaciones sin sales que conteman fosfato capturado tambien se sometieron a la evaluacion de los fosfolfpidos sin extraccion como se describe en el Ejemplo 70 y se usaron como estandares de radioactividad lfpida. Las porciones de mezclas de liposoma-farmaco preparadas para la carga se guardaron y se evaluaron para confirmar el coeficiente de pre-carga del CPT-11 anadido al lfpido del liposoma antes de la carga (“relacion de entrada”). La desviacion estandar y media promediadas en volumen de la distribucion del tamano del liposoma se determinaron por medio de dispersion de luz cuasi-elastica (QELS) usando el modelo Gaussiano. Las propiedades de estos liposomas se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6. Caracterizacion de la carga de CPT-11 en liposomas etiquetados con [3H]-CHE para un estudio de estabilidad in vivo
Solucion salina capturada
relacion farmaco/lfpido antes de la carga relacion farmaco/lfpido despues de la carga eficacia de carga (%) tamano de liposoma, (promedio±SD) nm
Citrato de TMA
159,2 ± 3,5 156,7 ± 3,6 98,5 ± 4,4 122,1 ± 25,3
Sulfato de TMA
156,1 ± 2,5 156,1 ± 3,1 100,0 ± 3,6 122,2 ± 28,4
Pirofosfato de TMA
164,6 ± 5,8 156,6 ± 4,3 95,2 ± 6,0 121,1 ± 19,9
Trifosfato de TMA
163,6 ± 5,7 156,0 ± 3,2 95,3 ± 5,3 122,4 ± 12,9
Polifosfato de TMA
170,5 ± 8,0 162,4 ± 4,0 95,3 ± 6,8 123,0 ± 12,7
Sulfato de TEA
153. ± 3,3 154,9 ± 4,9 101,0 ± 5,3 121,1 ± 18,0
Ratones CD-1 hembras de seis semanas de edad (Charles River) recibieron inyecciones en la vena de la cola de estas formulaciones liposomales CPT-11 a una dosis de 10 mg/kg (0,2 mg de CpT-11/raton) por duplicado. Ocho horas despues, se anestesiaron los ratones y se desangraron a traves de una puncion a corazon abierto. La sangre se recogio en jeringas heparinizadas (10-20 pl de 1000 U/ml de heparina uSp) y se transfirio a tubos pesados que conteman 0,4 ml de la solucion salina fisiologica tamponada con fosfato (PBS) con EDTA al 0,04% (Gibco BRL), conservado en hielo. Los tubos se pesaron para determinar el peso de las muestras de sangre, las celulas sangumeas se separaron mediante centrifugacion a 9000 g durante 5 minutos, y los sobrenadantes que conteman plasma diluido en PBS se guardaron para realizar analisis de lfpidos de liposomas y farmacos. CPT-11 se cuantifico mediante un analisis fluorometrico (Ejemplo 71). El lfpido del liposoma se cuantifico mediante recuento de radioactividad por centelleo corregido segun la inactivacion. Los patrones de radioactividad de fosfolfpidos y liposomas se contaron en paralelo a las muestras de plasma. Un porcentaje del farmaco que permanecio encapsulado se calculo dividiendo la relacion farmaco/radioactividad en las muestras de plasma por la relacion farmaco/radioactividad de los liposomas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inyectados. Debido a la rapida eliminacion del CPT-11 puro de la sangre (consulte el Ejemplo 69) y la estabilidad conocida del [3H]-CHE contra los intercambios de ffpidos, las lecturas del analisis se consideraron indicativas del contenido sangumeo del CPT-11 liposomal y el ffpido. Un porcentaje de la dosis ffpida inyectada (% D.I.) remanente en la circulacion se calculo asumiendo que el 100% del bolo inyectado habfa entrado en circulacion; siendo el volumen sangumeo del 6,3% del peso corporal del raton y el hematocrito del 45%. Los resultados se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7. Estabilidad in vivo de la duracion de circulacion y encapsulacion de los liposomas cargados con CPT-11 en ratones en un punto unico (8 horas) despues de la inyeccion. % D.I., % de dosis inyectada.
Sal capturada en el liposoma
Relacion farmaco/ffpido, % de valor antes de la inyeccion Lfpido del liposoma, % D.I en sangre
Citrato de TMA
80,2 ± 7,8 18,8 ± 3,4
Sulfato de TMA
70,1 ± 4,8 23,6 ± 1,8
Pirofosfato de TMA
67,3 ± 9,2 23,2 ± 3,1
Trifosfato de TMA
70,6 ± 6,0 24,9 ± 8,2
Polifosfato de TMA
107,5 ± 8,9 24,3 ± 3,4
Sulfato de TEA
76,6 ± 13,1 23,6 ± 0,1
Todas las preparaciones mostraron un nivel de encapsulacion del farmaco despues de 8 horas en la sangre in vivo al 70-80% del nivel previo a la inyeccion, mientras que los liposomas que conteman polifosfato eran los mas estables (la encapsulacion del farmaco se mantiene a aproximadamente el 100%).
Ejemplo 9. Farmacocinetica en sangre de liposomas CPT-11 preparados usando polifosfato de trietilamonio.
La formulacion del CPT-11 liposomal usando sal de polifosfato de trietilamonio se preparo como se describe en el Ejemplo 3. Los ffpidos - DSPC, colesterol y N-(metoxi-poli(etilenglicol) (P.m. 2000)-oxicarbonil)-DSPE (PEG-DSPE) (todo de Avanti Polar Lipids, Inc.) - se combinaron como polvo en seco en la relacion molar de 3:2:0,015 y se disolvieron en etanol al 100% (calidad USP, aprox. 0,15 ml/100 mg de los ffpidos) a 62-65 °C. Para estudios farmacocineticos, se anadio 3H-colesteril hexadecil eter (3H-CHE, adquirido de Amersham Pharmacia) a los ffpidos en la cantidad de 0,5 mCi/mmol de fosfoffpidos a modo de etiqueta de ffquido radioactivo no intercambiable. La solucion acuosa de TEA-Pn (0,5 M trietilamonio, pH 5,7-6,2) se preparo como se explica en el Ejemplo 4. La solucion de TEA-Pn (10 veces el volumen del etanol anadido) se mezclo con una solucion ffpida a 60-65 °C y se agito a esta temperatura hasta formar una suspension lechosa y homogenea de vesmulas multilamelares. Esta suspension se extrudio 15 veces a traves de 2 filtros grabados con pistas de policarbonato apilados (Corning Nuclepore) con un tamano de poro de 100 nm usando un extrusor de presion de argon (Lipex Biomembranes) a 60-65 °C, y los liposomas unilamelares resultantes se enfriaron rapidamente en hielo y despues se dejo que alcanzaran la temperatura ambiente. La sal de polifosfato no incorporado y etanol se extrajo por medio de cromatograffa de gel en la columna Sepharose CL-4B eluida con la solucion tampon MES-Dextrosa (MES 5 mM, 50 g/l de dextrosa, pH ajustado a 6,5 con NaOH).
Se anadio una solucion madre de CPT-11 (clorhidrato de irinotecan) que contema 20 mg/ml de base de irinotecan en agua a los liposomas con una relacion farmaco/ffpido de 150-200 mg/mmol fosfoffpidos, y la mezcla se incubo con agitacion ocasional durante 45-60 minutos a 60-62 °C. La mezcla de incubacion se enfrio rapidamente y se incubo durante 10 minutos a 0 °C, y despues se dejo que alcanzara la temperatura ambiente. Se anadio 1/20 del volumen de NaCl 2,88 M para ajustar la fuerza ionica fisiologica y mejorar la extraccion del CPT-11 unido a membrana (al contrario que el farmaco encapsulado dentro del interior del liposoma). El farmaco no encapsulado se extrajo mediante cromatograffa en gel en una columna Sephadex G-25 o G-75 (Amersham Pharmacia) eluido con solucion tampon HBS-6,5 (5 mM de acido 2-(4-(2-hidroxietil)-piperazino)-etilsulfonico (HEPES), NaCl 144 mM, pH 6,5). Las fracciones del liposoma eluidas en el volumen vacfo se combinaron, esterilizaron mediante filtracion de 0,2 micrometros y se almacenaron a 4-6 °C antes del uso. Los liposomas se caracterizaron por la concentracion del ffpido, la concentracion del farmaco y el tamano de parffculas como en el Ejemplo 7. Los liposomas teman un tamano promedio de 108 nm y un contenido de CPT-11 de 139 ± 18 mg de base de CPT-11 por mmol de fosfoffpidos.
La duracion del ffpido del liposoma y el farmaco del liposoma en la sangre, asf como las caractensticas de la liberacion del farmaco de los liposomas in vivo, se estudiaron en ratas hembra Sprague-Dawley (190-210 g) con cateteres venosos centrales permanentes. Se inyecto a las ratas con un bolo de 0,2-0,3 ml de liposomas de irinotecan etiquetados con 3H- CHE (0,05 mmol de fosfoffpidos o 7-8 mg de CPT-11 por kg de peso corporal). Se extrajeron muestras de sangre (0,20,3 ml) varias veces despues de la inyeccion usando una jeringa tratada con heparina. El volumen de sangre extrafda se repuso usando solucion salina fisiologica tamponada con fosfato. Las muestras de sangre se diluyeron con 0,3 ml de PBS frio en hielo que contema EDTA al 0,04%, pesado, y las celulas sangrnneas se separaron por medio de centrifugacion. Los fluidos sobrenadantes se recogieron y evaluaron para CPT-11 usando el procedimiento fluorometrico del Ejemplo 71, y para la etiqueta de ffpido liposomal mediante recuento de radioactividad por centelleo usando metodos convencionales. Las preparaciones de liposomas con concentraciones conocidas de farmaco y ffpido 3H-CHE se utilizaron como patrones. Los patrones de radioactividad contienen una cantidad equivalente de plasma de rata diluido para contabilizar la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inactivacion. La cantidad de CPT-11 y Kpido liposomal en la sangre se calculo suponiendo un volumen sangumeo en ml del 6,5% del peso corporal en gramos, y un hematocrito del 40%. La cantidad total del lfpido y el farmaco en la sangre se expreso como % de la dosis inyectada (% de D.I., %D.I.) y se represento graficamente frente al tiempo posterior a la inyeccion. El porcentaje de farmaco remanente en los liposomas se ha calculado dividiendo la relacion farmaco/lfpido en las muestras de sangre por la relacion farmaco/lfpido de los liposomas inyectados (tomado como 100%). Dado que los graficos demostraban en general una buena coincidencia con la cinetica monoexponencial (linealidad en escala semi- logantmica), la semivida del farmaco, el lfpido y la liberacion del farmaco desde los liposomas, se calculo a partir del mejor ajuste de los datos a la ecuacion de desintegracion monoexponencial usando la opcion TREND del programa informatico Microsoft EXCEL (Microsoft Corp., EE.UU.). Los resultados se muestran en la Figura 1. A partir de los parametros de mejor ajuste, la semivida en sangre para el lfpido y el farmaco era de 16,4 horas y 6,61 horas, respectivamente. En estas condiciones, el CPT-11 puro se elimina de la circulacion muy rapidamente (consulte el Ejemplo 69).
La relacion farmaco/lfpido en sangre relevo un caracter bifasico de la liberacion de CPT-11 desde los liposomas (Figura 2). En las primeras 24 horas, la liberacion del farmaco fue lineal con el paso del tiempo (R=0,992) proporcionando evidencias de cinetica de liberacion de orden cero. Solo despues, aproximadamente un 75% del farmaco se libero en un plazo de 24 horas, y posteriormente la liberacion dejo de ser lineal. Durante 24 horas, los liposomas liberaron el farmaco a una tasa constante de aproximadamente el 3,6% carga inicial/hora. De esta forma, el 50% del farmaco se libero en un periodo de tiempo de unas 14 horas. La liberacion de orden cero del farmaco es un elemento de calidad atractivo en las formulaciones de liberacion sostenida, ya que la liberacion del farmaco permanece constante en el tiempo.
Ejemplo 10. Eficacia antitumoral de los liposomas CPT-11 preparados usando polifosfato de trietilamonio contra xenoinjertos de cancer de mama en ratones.
La eficacia antitumoral de los liposomas CPT-11 se estudio en el modelo de carcinoma de mama humano BT-474, un adenocarcinoma ductal dependiente de estrogenos que produce en exceso el receptor C-ErbB2 (HER2). Las celulas BT-474 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se establecio una sub-lmea BT-474 con una velocidad de crecimiento tumoral superior a partir del nodulo tumoral del xenoinjerto de crecimiento rapido obtenido como se describe a continuacion. Las celulas se propagaron in vitro en medio RPMI-1460 con suero fetal bovino al 10%, 0,1 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G en frascos T-150, y se dividieron en una proporcion 1:3 cada semana. Se implantaron subcutaneamente a ratones hembra NCR nu/nu (4-6 semanas de edad; Taconic Farms) (en la base de la cola) 0,72-mg de granulos de 17p-estradiol de liberacion sostenida durante 60 dfas de (Innovative Research of America, Inc.), y en dos dfas se inocularon subcutaneamente en la zona posterior superior 0,1 l de una suspension que contema 2x107 celulas BT-474 en el medio de crecimiento celular. La progresion del tumor se superviso mediante palpacion y mediciones de mediante calibre de los tumores a lo largo del eje mas grande (longitud) y mas pequeno (anchura) dos veces a la semana. Los tamanos del tumor se determinaron dos veces a la semana a partir de las mediciones de las pinzas usando la formula (Geran, R.I., y col., 1972 Cancer Chemother. Rep. 3:1-88):
Volumen tumoral = [(longitud) x (anchura)2] / 2
En el dfa 13 despues de la inoculacion, el tumor alcanzo un tamano medio de 200 mm3 y los animales se asignaron aleatoriamente a tres grupos de 13-15 animales.
Se preparo CPT-11 liposomal como se ha descrito en el Ejemplo 8 (relacion farmaco/fosfolfpido 192 mg/mmol; tamano promedio del liposoma 86,8 nm). El CPT-11 puro y liposomal se diluyeron con el vefuculo MES-dextrosa a 5 mg/ml de base de CPT-11. Se inyecto a los animales en la vena de la cola con CPT-11 puro, CPT-11 liposomal o el vehfculo solo en los dfas 14, 18, 21 y 25 despues de la inoculacion del tumor. Las formulaciones que conteman el farmaco se administraron a una dosis de 50 mg de CPT-11/kg por inyeccion, que es el valor promedio de las dosis registradas en la bibliograffa para los estudios de CPT-11 en modelos de tumores en roedores.
Para evaluar la toxicidad relacionada con el tratamiento, los animales tambien se pesaron dos veces a la semana. Las observaciones se realizaron hasta el dfa 60 despues de la inoculacion, momento en que se agoto el granulo de suplemento de estrogenos. Los volumenes tumorales promedio en los grupos se representaron conjuntamente y se compararon en el tiempo. Como se muestra en la Figura 3, mientras que el CPT-11 puro reducfa la velocidad de crecimiento tumoral, en el grupo que recibio el tratamiento liposomal, los tumores sufrieron una regresion drastica. Mientras que en el dfa 36 en el grupo de control los tumores alcanzaron el tamano promedio maximo permisible de 3500 mm3, y en el dfa 46 en el grupo tratado con el farmaco puro, los tumores eran aproximadamente de 1000 mm3 en promedio, en el mismo momento ningun animal en el grupo tratado con liposomas tema tumores palpables.
La toxicidad relacionada con el tratamiento se evaluo a partir de la dinamica en el peso corporal de los animales (Figura 4). Ningun grupo revelo una toxicidad significativa. El peso de los animales en el grupo de control aumento de forma consistente. Hubo una ligera disminucion en el peso corporal promedio de los animales que recibfan CPT- 11 liposomalde aproximadamente un 3,3%, en el dfa del ultimo tratamiento. Sin embargo, esta perdida de peso se invirtio, y los animales alcanzaron su peso esperado. Esta reduccion en el peso corporal promedio no era significativa a nivel estadfstico segun el test de la t de Student, en comparacion con el peso previo al tratamiento (p=0,274). Por ello, podemos afirmar que todos los tratamientos se toleraron sin una toxicidad relevante.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Por tanto, la formulacion liposomal de CPT-11 obtenida mediante la carga del farmaco a traves de la sal de amonio sustituido capturada previamente con impedimento esterico (trietilamonio) de un polfmero polianionico biodegradable (polifosfato) mostro un aumento extendido de la vida en sangre, caractensticas de liberacion sostenida y un aumento de la actividad antitumoral en el modelo de tumor estudiado sin un aumento apreciable en la toxicidad.
Ejemplo 11. Evaluacion comparativa de liposomas cargados con CPT-11 preparados usando sales de trietilamonio -capturadas previamente: efecto del tamano del liposoma, relacion farmaco/l^pido y naturaleza del anion -capturado previamente.
Se prepararon dos formulaciones prototipo de liposomas cargados con CPT-11, una usando los liposomas con TEA-Pn -capturado previamente y la otra con TEA-SOS -capturado previamente. La preparacion de estos liposomas incluyo las siguientes etapas de fabricacion.
1) Combinacion de Hpidos mediante disolucion simultanea en etanol. La composicion de la matriz de lfpidos estaba formada por 1,2-Distearoil-SN-fosfatidilcolina (DSPC) (Pm 790) 3 partes molares (59,8% en moles); Colesterol (Chol) (peso mol. 387) 2 partes molares (39,9% en moles); y N-(omega-metoxi-poli(etilenglicol)- oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidil etanolamina (Peso mol. 2787) (PEG-DSPE) 0,015 partes molares (aprox. 0,3% en moles). DSPC y PEG-DSPE se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama. El colesterol (grado de pureza mas alto) se adquirio de Calbiochem. Los lfpidos secos se pesaron con una precision de ±0,1 mg en un contenedor de vidrio de borosilicato y se combinaron con etanol absoluto en la proporcion adecuada para la siguiente etapa de dispersion del lfpido. Debido a la temperatura de transicion elevada de DSPC (55 °C), la disolucion se realizo tfpicamente a 55-60 °C hasta obtener una solucion transparente.
2) Preparacion de las soluciones de TEA-Pn y TEA-SOS. El polifosfato de sodio (n=13-18) se compro a Sigma Chemical Co., ref. P 8510. El octasulfato de sacarosa de sodio se compro a Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, ref. S699020. Las sales se pesaron y disolvieron en agua para obtener soluciones 1,2-2,5 N. Se usaron intercambiadores anionicos Dowex 50Wx8-200 o Dowex HCR-W2 en forma H+ (disponible de Sigma) para convertir las sales de sodio en acidos libres. Antes del primer uso, las resinas se lavaron mediante agitacion con 3 volumenes de las soluciones siguientes, seguido de una decantacion: (1) Solucion acuosa de HCl 1,0-1,2 M 2 veces; (2) Agua 2 veces; (3) Solucion acuosa de NaOH 1,0-1,2 M 2 veces; (4) Agua 2 veces; (5) Solucion acuosa de HCl 1,0-1,2 M 2 veces. La suspension de la resina lavada en agua se envaso bajo flujo por gravedad en una columna cromatografica de un tamano adecuado que tiene al menos 8 ml de la resina envasada para cada ml de las soluciones de sal de sodio. La resina se equilibro adicionalmente pasando 2 volumenes de columna de una solucion acuosa de HCl 3,0-3,6 M, seguido de 5 volumenes de columna de agua o hasta que la conductividad del eluato disminuye por debajo de 1 micro-S. Despues del uso, las columnas se regeneraron mediante el paso secuencial de: HCl 1-1,2 M - 3 volumenes de columna; HCl 3,0-3,6 M - 2 volumenes de columna; agua - al menos 5 volumenes de columna, o hasta que la conductividad del eluato sea inferior a 1 |jS, y se almaceno en agua filtrada con un filtro de 0,2-um a temperatura ambiente. Las soluciones de sal de sodio Pn y SOS se aplicaron a la superficie drenada de la columna (aproximadamente 1 ml por cada 4 ml del volumen de resina envasada) y permitio el flujo bajo gravedad a la velocidad de aproximadamente 1-2 ml/min para el tamano del lecho de la resina de 75-150 ml. La columna se eluyo con agua. El eluato se sometio a una prueba de conductividad. Se recogieron las fracciones con una conductividad de 10 mS o superior se recogieron. Si se necesitan mas soluciones concentradas de poliacidos, la recogida puede empezar a 20 50 mS, pero a costa de una perdida relativamente alta de la sal de formacion de gradiente. En el caso del acido polifosforico, la solucion recogida se mantiene refrigerada (0-4 °C) hasta la etapa de titulacion de la amina, debido a la inestabilidad hidrolftica del enlace fosfodiester a un pH bajo. Los eluatos recogidos tendnan un pH inferior a 0,7 (normalmente aproximadamente 0,4) y una conductividad de aproximadamente 120-200 mS. Opcionalmente, la etapa de titulacion de la amina puede realizarse sin retardo debido a la estabilidad del polifosfato a un valor de pH bajo. Se utilizo trietilamina de calidad HPLC (99,5+% de pureza) procedente de Fisher, ref. 04884 para titular las soluciones acidas obtenidas del intercambio de iones. La normalidad del TEA puro se determino mediante titulacion potenciometrica. Se recogieron alfcuotas de 0,100-ml de TEA (0,100 ml) en 20 ml de agua por triplicado. Las alfcuotas se titularon con HCl 0,1 N en solucion patron al punto final de pH (electrodo de vidrio) de 5,5-6,0. La normalidad calculada (7,07 N) era cercana al valor teorico de 7,17 N. Se titulo un volumen medido del acido polilfosforico (Pn) o la solucion del acido sacarosa octasulfurico (SOS) con TEA puro bajo el control del electrodo de pH (vidrio). Se necesito un proceso de agitado intenso para dispersar la amina. El punto final de titulacion fue un pH de 5,6-6,2. El volumen del TEA anadido se registro de forma precisa. El volumen de solucion titulada se midio y se calculo la concentracion de TEA sobre la base del volumen de TEA anadido y la normalidad. Se anadio el agua necesaria para ajustar la concentracion de TEA a los valores de 0,55±0,05 N o 0,65±0,03 N requeridos, como se indica a continuacion. La cantidad de sodio residual en las soluciones de TEA-Pn o TEA-SOS obtenidas se determino mediante un potenciometro usando un electrodo de vidrio selectivo al sodio (Corning). Un ml de la solucion se diluyo en 19 ml de agua, y la concentracion de sodio se determino usando el metodo incremental de conformidad con el manual del fabricante del electrodo. La cantidad de sodio residual era inferior a 1 mM y normalmente inferior a 0,5 mM. Las soluciones de TEA-Pn o TEA-SOS obtenidas se pasaron por un filtro esteril de acetato de celulosa de 0,2 jm usando una alimentacion de presion positiva. El valor de la osmolalidad y el pH final de las soluciones se midio y registro. Los inventores utilizan un electrodo de pH totalmente de vidrio fabricado a partir de una microcombinacion de calomelanos para las mediciones del pH y un osmometro de punto de rodo/presion de vapor para las mediciones de osmolalidad. Las soluciones se almacenaron refrigeradas hasta el momento de su uso.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3) . Preparacion de dispersion ffpida en una solucion tampon formadora de gradiente mezclando la solucion etanolica de los ffpidos con la solucion tampon formadora de gradiente. Los lfpidos se dispersaron en la solucion de sal formadora de gradiente usando el metodo de mezcla con etanol. Todos los pasos se realizaron a 60-65 °C. Los lfpidos se disolvieron en Etanol al 100% USP a una concentracion de aproximadamente 0,5-0,6 M de DSPC en un tubo o frasco piriforme de vidrio resistente a los productos qmmicos. La solucion de sal formadora de gradiente (TEA-Pn o TEA-SOS) se precalento a 6065 °C y se anadio a la solucion ffpida etanolica de una vez, y los componentes se mezclaron vigorosamente realizando espirales y/o remolinos. La cantidad final de etanol fue de aproximadamente 10% en vol. Para preparaciones a una escala superior a 0,1 mmol de fosfoffpido la suspension resultante se coloco en un evaporador rotatorio a 60-65 °C y se evaporo al vado con rotacion hasta que la evolucion del etanol se detuvo, y se manifesto por la ausencia de formacion de espuma. Para una escala de 0,1 mmol de fosfoffpido o menos, el etanol no se elimino de la dispersion ffpida en esta etapa. Las suspensiones ffpidas resultantes se mantuvieron a 60-65 °C y se usaron puntualmente para la etapa de extrusion.
4) . Extrusion secuencial de la dispersion de tfpidos a traves de membranas de poro definido. Para volumenes de suspension de ffpidos de hasta 1 ml, los inventores utilizaron un extrusor de movimiento alternativo accionado manualmente adquirido de Avanti Polar Lipids. El extrusor esta cargado con membranas de filtro grabadas con pistas de 19 mm y se ha termostatizado por medio de un bloque calefactor metalico. Para volumenes de 1 a 10 ml, los inventores utilizaron un extrusor de flujo unidireccional termostatizado con accionamiento mediante presion de gas adquirido de Lipex Biomembranes. El extrusor esta cargado con membranas de filtro de 25 mm. Las suspensiones de ffpidos se extrudieron repetidamente a 60-65 °C usando alimentacion manual o presion de gas argon, segun proceda, a traves de una serie de 2 filtros de membrana de policarbonato apilados (los filtros de Corning-Nuclepore y Osmonics Corp. eran adecuados de igual forma) que teman tamanos de poro nominales de 100 nm, 80 nm o 50 nm. Cuando el efecto del tamano del liposoma era de interes, la extrusion se detuvo en el paso de 100 nm, 80 nm o 50 nm. El tipo exacto de filtros usados y el numero de extrusiones se indican a continuacion para cada experimento. Los liposomas extrudidos se mantuvieron a 60-65 °C durante aproximadamente 15 min. y se enfriaron rapidamente a 2-4 °C en un bano de hielo. Despues de aproximadamente 15 min. en el bano de hielo, se dejo que los liposomas alcanzaran la temperatura ambiente.
5) . Extraccion de la solucion tampon formadora del gradiente extraliposomal y transferencia de los liposomas a una solucion tampon de carga del farmaco. Se extrajo la sal formadora del gradiente no encapsulado, y los liposomas se transfirieron a la solucion tampon de carga del farmaco usando la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC). La filtracion de flujo tangencial, la dialisis de fibras huecas y otros pasos escalables pueden usarse en la fabricacion del escalado. Resulta ventajoso garantizar la completa extraccion del polianion extraliposomal mediante el tratamiento de los liposomas con una resina de intercambio de aniones (<. perlas de poliestireno reticulado con amonio cuaternario Dowex-1 o Dowex-2). La solucion tampon de carga del farmaco contema 50 g/l de dextrosa anhidra USP y HEPES certificado para cultivo de tejidos 5 mM en agua, ajustado a un pH de 6,5 con NaOH. La solucion tampon se filtro al vado usando un filtro de nylon de 0,2 micrometros (Whatman). Los liposomas extrudidos se sometieron a cromatograffa en una columna con Sepharose CL-4B (Pharmacia) y se eluyeron con la solucion tampon de carga del farmaco. Los liposomas aparecieron en la fraccion de volumen vado y se recogieron en funcion de la turbidez del eluato, en el doble de volumen aproximadamente del aplicado. Los liposomas eluidos se evaluaron para determinar la concentracion de fosfoffpidos siguiendo el Ejemplo 70 de tamano de parffculas segun QELS, y se almacenaron a 46 °C.
6) Incubacion de liposomas con el farmaco. La solucion madre de CPT-11 (Clorhidrato de irinotecan) se preparo inmediatamente antes de mezclarla con los liposomas disolviendo el clorhidrato de irinotecan en agua para conseguir una concentracion base del farmaco de 20 mg/ml. El pH de la solucion estaba entre 4,0 y 5,0. La solucion del farmaco se filtro usando un filtro esteril de polietersulfona (PES) de 0,2 micrometros aplicando presion positiva. Las affcuotas de los liposomas en la solucion tampon de carga del farmaco producidas en la etapa 5 anterior se mezclaron a temperatura ambiente con la solucion madre de irinotecan para conseguir una relacion de entrada farmaco/ffpido en el iuntervalo de 0,15-0,55 g de farmaco por mmol de fosfoffpido de liposoma. Mas abajo se indican las relaciones de farmaco/ffpido de entrada, cuando corresponde. El pH de las mezclas se ajusto a 6,5 con NaOH 1 M, las mezclas en los viales de vidrio se incubaron en el bano de agua termostatizado a 58-62 °C con agitacion suave durante 30-45 min, y se enfrio rapidamente en bano de agua con hielo (0-2 °C), y se dejo reposar a esta temperatura durante 15 min. A continuacion, los liposomas se dejaron calentar a temperatura ambiente para la etapa siguiente (extraccion del farmaco no encapsulado y transferencia a la solucion tampon de almacenamiento). Esta etapa genero una eficacia de encapsulacion superior al 95%, normalmente 98-100%, en el intervalo completo de de las relaciones farmaco/ffpido estudiadas.
7) . Extraccion de CPT-11 no encapsulado, transferencia de los liposomas a la solucion tampon de almacenamiento, filtracion final y almacenamiento. El farmaco no encapsulado se extrajo y los liposomas se transfirieron a la solucion tampon de almacenamiento usando la cromatograffa de exclusion por tamano. La solucion tampon de almacenamiento contema HEPES 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5 (ajustado con NaOH) en agua, y se filtro al vado con un filtro de 0,2 micrometros antes del uso. La cromatograffa en gel en Sephadex G-75 (Amersham Pharmacia Biotech) se realizo basicamente como se describe en la Etapa 2 anterior. Los liposomas CPT-11 eluidos de la columna (fraccion de volumen vado) se evaluaron para el fosfoffpido del liposoma y CPT-11 (mediante espectrometna, consulte los Ejemplos 70 y 71), y el tamano de parffculas promedio ponderado en volumen mediante QELS. La concentracion del farmaco se ajusto, en caso necesario, para que se encontrase en el intervalo de 2,0-4,0 mg/ml. Los liposomas se filtraron usando filtros esteriles de polietersulfona de 0,2 micrometros y se dispensaron asepticamente en viales de polipropileno esteriles (Corning Cryo-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Vials) o viales de vidrio de 4 ml de borosilicato con tapon roscado con revestimiento de PTFE aproximadamente 70-80% del volumen del vial. Los viales se cerraron asepticamente (en aire), se etiquetaron y se almacenaron a 4-6 °C.
Ejemplo 12. Efecto de la relacion farmaco/tfpido en la eficacia de carga del farmaco y en la retendon del farmaco in vivo de los liposomas que contienen TEA-Pn
Se prepararon liposomas con solucion acuosa de TEA-Pn capturada 0,65 N, pH 6,1, osmolalidad 531 mmol/kg, siguiendo el procedimiento del Ejemplo 11. La dispersion lfpida se extrudio diez veces usando filtros de policarbonato de tamano de poro de 100 nm apilados. La matriz lfpida de liposoma tambien inclma el fosfolfpido [3H]-CHE a 0,5 mCi/mmol. El tamano del liposoma antes de la carga del farmaco era de 98,5 ± 34,3 nm. Los liposomas se cargaron a proporciones iniciales de farmaco-fosfolfpido de 200, 300, 400 y 500 mg CPT-11/ mmol fosfolfpido. Las cantidades de farmaco y fosfolfpido en los liposomas se determinaron mediante espectrometna siguiendo el Ejemplo 71 y mediante el analisis de fosfomolibdato para extraccion de fosfolfpido-digestion-azul del Ejemplo 72, respectivamente.
Para evaluar el coeficiente de liberacion del farmaco in vivo se siguio el metodo del Ejemplo 8. Los liposomas se inyectaron en la vena de la cola de ratones Swiss Webster de seis semanas de edad (peso corporal 18-22 g) con una dosis de 5 mg CPT-11/kg. En las horas 8 y 24 despues de la inyeccion, se anestesiaron a los ratones del grupo 3 y se desangraron a traves de una puncion a corazon abierto. La sangre se mezclo con 0,4 ml de 0,04% EDTA enfriado en hielo en PBS, las celulas en sangres se separaron mediante centrifugacion, y la concentracion de plasma de CPT-11 se midio mediante espectrofluorometna como se describe en el Ejemplo 71. El lfpido se determino midiendo el contenido de [3H]- CHE usando el recuento de centelleo lfpido corregido por inactivacion, y la cantidad de farmaco retenido en los liposomas se calculo dividiendo la proporcion de farmaco/lfpido determinada por la proporcion de farmaco/lfpido en los liposomas inyectados. Debido a la rapida separacion en sangre del CPT-11 libre, que genera un nivel sangmneo bajo, hemos asumido que todo el farmaco sometido a analisis tenfa la forma liposomal.
Los resultados se presentan en la Tabla 8. Las diferencias entre la retencion del farmaco entre los grupos no era significativa a nivel estadfstico. Como resultado de estos estudios, hemos concluido que el aumento de la carga del farmaco a 500 mg/mmol no afectara negativamente a la carga del farmaco ni a la estabilidad in vivo. Esta proporcion se ha adoptado para estudios posteriores.
Tabla 8. Efecto de la proporcion farmaco/lfpido en la carga de farmaco y en la retencion del farmaco in vivo en liposomas TEA-Pn de irinotecan (promedio ± desviacion estandar).
Proporcion farmaco/lfpido, mg/mmol fosfolfpido
Farmaco remanente en los liposomas, % de valor pre- inyeccion
Entrada
Salida % cargado Despues de 8 horas Despues de 24 horas
200
208,4 104,2 54,6±9,9 9,72±2,23
300
286,3 95,4 85,2±14,3 14,52±2,51
400
348,8 87,2 81,5±18,3 17,31±6,14
500
518,9 103,8 66,8±19,6 13,47±1,44
Ejemplo 13. Eficacia de carga de farmaco para la carga de CPT-11 en liposomas que contienen TEA-SOS: efecto del tamano de los liposomas y retencion del farmaco in vivo en los ratones.
Liposomas con soluciones capturadas preparadas como en el Ejemplo 11 usando una solucion de formacion de gradiente con 0,643 N TEA-SOS, pH 5,7, osmolalidad 530 mmol/kg. La dispersion lfpida se extrudio diez veces a traves de dos filtros de policarbonato apilados con un tamano de poro de 50 nm, 80 nm o 100 nm. La matriz lfpida de liposoma tambien inclma [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolfpido de liposoma. El tamano del liposoma se determino por medio de dispersion de luz dinamica. Los liposomas se cargaron con CPT-11 en las relaciones iniciales de farmaco-fosfolfpido de aproximadamente 550 mg de irinotecan/mmol de fosfolfpido. Los liposomas cargados de farmaco se dimensionaron mediante QELS y se evaluaron como se describe en los Ejemplos 70 y 71.
Se inyecto a ratones hembra Swiss Webster (8-10 semanas, 27-30 g de promedio) en la vena de la cola con estas formulaciones de liposomas CPT-11 aplicando una dosis de farmaco de 10 mg/kg. Se sacrificaron los ratones 24 horas despues y se recogio y evaluo su sangre para realizar un analisis de CPT-11 y lfpidos del liposoma como en el Ejemplo 11. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9. Carga de irinotecan y retencion del farmaco in vivo en liposomas de TEA-SOS.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tamano de poro de la membrana de extrusion, nm
Tamano de liposoma, SD promedio en nm Carga de farmaco, fosfolfpido de irinotecan/mmol Farmaco remanente en los liposomas despues de 24 horas en ratones. % de valor pre-inyeccion
50
87,6±28,1 579,31±24,2 79,2±3,8
80
98,5±15,1 571,1±69,7 82,6±2,1
100
110,8±25,2 567,7±37,7 86,2±2,7
Sorprendentemente, los liposomas con sal de trietilamonio de octasulfato de sacarosa, un compuesto organico hidroxilado polianionizado no polimerico (azucar), proporciono una retencion del farmaco in vivo muy superior (4 o 5 veces) en los liposomas, en comparacion con liposomas similares con un polfmero polianionico (polifosfato).
Ejemplo 14. Farmacocinetica sangunea de liposomas de SOS-TEA cargados con CPT-11 en ratas.
Los liposomas (tamano de poro de membrana de extrusion de 100 nm) se prepararon como se describe en el Ejemplo 12. El liposoma se administro intravenosamente a una dosis de 10 mg de CPT11/kg a dos ratas hembra Sprague (Harlan) de nueve semanas de edad (peso corporal de aproximadamente 200 g) con un cateter venoso central permanente y una dosis de 10 mg de CPT-11/kg (17,6 pmol de fosfoKpidos/kg). Se recogieron muestras de sangre en los puntos temporales indicados y se analizaron para determinar el contenido de lfpido en el liposoma como en el ejemplo 9. Los datos se expresaron en % de dosis de lfpido inyectado/ml de plasma y el % del farmaco retenido dentro del liposoma en cada punto temporal, representado graficamente frente al tiempo posterior a la inyeccion, y la semivida para el lfpido del liposoma, asf como la semivida de liberacion del farmaco desde los liposomas, calculados para adaptarse mejor al modelo cinetico monoexponencial (Fig. 5). La semivida de liberacion del farmaco de los liposomas TEA-SOS cargados con CPT-11 fue de 56,8 horas, mucho mas que la semivida de liposomas TEA-Pn similares.
Ejemplo 15. Actividad antitumoral de CPT-11 libre y CPT-11 encapsulado en ratones admicos lampinos con xenoinjertos subcutaneos de carcinoma de colon humano (HT-29).
Los liposomas se prepararon como en el Ejemplo 11 usando la solucion TEA-Pn con TEA 0,65 M, pH 6,1, y una osmolalidad de 531 mmol/kg, o solucion TEA-SOS con TEA 0,643 M, pH 5,7, y osmolalidad de 530 mmol/kg. La extrusion inclrna 10 pasos por dos membranas de policarbonato apilados con un tamano de poro de 100 nm. Los liposomas TEA-Pn y TEA-SOS resultantes teman un tamano de 112,3±15,5 nm y 120,5±42,5 nm, respectivamente (media± SD de la distribucion de tamanos). Los liposomas se cargaron con CPT-11 en la proporcion de entrada de farmaco/fosfolfpido de 500 mg/mmol. Los liposomas resultantes teman un contenido de farmaco de 465,6 ± 26,5 (93% de eficacia de carga) y 499,9±22,5 mg (100% de eficacia de carga) del fosfolfpido CPT-11/mmol para las formulaciones de TEA-Pn y TEA-SOS, respectivamente.
Las celulas HT-29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, y se propagaron en el medio DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 50 U/ml de penicilina G y 50 pg/ml de sulfato de estreptomicina a 37 °C, CO2 al 5% siguiendo las recomendaciones del proveedor. Los ratones macho atfmicos lampinos NCR nu/nu homocigoticos (6 semanas de edad, peso de 16 g como mmimo) se adquirieron de Charles River. Se inoculo a los ratones por via subcutanea en el costado derecho con 0,1 ml de suspension que contema 5 x l06 celulas suspendidas en el medio de crecimiento sin antibioticos. Once dfas despues, los animales con tumores con tamanos entre 150 mm3 y 350 mm3 se asignaron a los grupos de tratamiento siguiendo el metodo siguiente. Los animales se clasificaron en funcion del tamano del tumor y se dividieron en 6 categonas de tamano de tumor decreciente. Se formaron seis grupos de tratamiento de 11 animales/grupo seleccionando de forma aleatoria un animal de cada categona de tamano, para que en cada grupo de tratamiento todos los tamanos de tumores estuviesen representados de forma igualitaria. Empezando en el dfa 13, los animales recibieron cuatro inyecciones en la vena de la cola, a intervalos de 4 dfas, de las preparaciones siguientes: 1) Control (solucion salina tamponada con HEPES pH 6,5); 2) CPT-11 libre a 50 mg/kg, administrado como 5 mg/ml de solucion preparada recientemente en solucion salina fisiologica sin tampon; 3) CPT-11 de TEA-Pn liposomal a 25 mg/kg por inyeccion; 4) CPT-11 de TEA-Pn liposomal a 50 mg/kg por inyeccion; 5) CPT-11 de TEA-SOS liposomal a 25 mg/kg por inyeccion; 6) CPT-11 de TEA-SOS liposomal a 50 mg/kg por inyeccion. El peso del animal y el tamano del tumor se supervisaron dos veces a la semana como se describe en el Ejemplo 10. El peso del tumor se resto de los resultados de pesada de los animales para obtener el peso corporal del animal. Los animales se observaron en los 60 dfas posteriores a la inoculacion del tumor. Cuando los tumores en el grupo alcanzaron el 20% del peso corporal de los ratones, los animales del grupo se sometieron a eutanasia. Se produjeron regresiones completas de los tumores en algunos grupos sin signos de recrecimiento tumoral al final del estudio. Los tejidos en el lugar de inoculacion del tumor de estos animales se recogieron y preservaron para realizar analisis patologicos de celulas tumorales residuales.
Los resultados de este estudio se muestran en las Figuras 6 y 7. El CPT-11 libre solo tuvo un efecto menor en el crecimiento del tumor. Todos los liposomas teman un efecto pronunciado resultante en la regresion del tumor seguida de un recrecimiento en la mayona de animales. La dosis de 50 mg/kg fue mas efectiva que la dosis de 25 mg/kg en los liposomas TEA-Pn y TEA-SOS CPT-11. Los tiempos medios de duplicacion del tumor calculados a partir de los datos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
sobre el tamano de los tumores (Fig- 7) fueron: control - 4,2 dfas; farmaco libre, 50 mg/kg - 4,8 dfas; Farmaco liposomal TEA-Pn, 25 mg/mg - 43,6 d^as; Farmaco liposomal TEA-Pn, 50 mg/kg - 47,5 dfas; Farmaco TEA-SOS liposomal a 25 mg/kg - 48,2 dfas y farmaco liposomal TEA-SOS a 50 mg/kg - mas de 56 dfas (no se duplico el tiempo). De esta forma, el CPT-11 liposomal preparado como se indica en la presente invencion era al menos 10 veces mas activo que el farmaco libre, administrado en la misma dosis y en el mismo calendario. Inesperadamente, los liposomas TEA-SOS CPT-11 fueron mas efectivos a la hora de reducir el crecimiento tumoral que los liposomas TEA-Pn CPT-11 administrados con la misma dosis. Mientras que en los grupos tratados con el farmaco libre y el farmaco TES-Pn liposomal a 50 mg/kg por inyeccion no habfa animales sin recrecimiento tumoral, en los grupos que recibfan 25 mg/kg de cada formulacion liposomal, un animal (9,1%) no tema tumor al final del estudio, y en el grupo que recibfa 50 mg/kg de formulacion CPT-11 de TEA-SOS liposomal, al final del estudio 4 animales (36,4%) no teman tumor ni signos de recrecimiento.
El farmaco manifesto cierta toxicidad. Los animales que recibieron CPT-11 libre, y no CPT-11 liposomal, experimentaron una morbilidad temporal (perdida del estado de alerta, postura encorvada, pelaje erizado, movilidad reducida) durante una hora despues de la inyeccion del farmaco. Los animales que recibieron CPT-11 libre sufrieron una perdida permanente del 6% de peso durante el tratamiento, y no se recuperaron. Los animales que recibieron las dos formulas liposomales de CPT-11 experimentaron una perdida de peso transitoria entre las inyecciones segunda y tercera con una media del 5% (a 25 mg/kg) o cerca del 9% (a 50 mg/kg) del valor previo al tratamiento, y eventualmente alcanzaron el peso normal. Por lo tanto, la toxicidad del farmaco liposomal no era superior a la del farmaco libre (no liposomal), mientras que la eficacia del farmaco liposomal era sustancialmente superior. La perdida de peso se invirtio al finalizar el tratamiento con el farmaco y todos los animales recuperaron su peso sin morbilidad terminal ni fallecimiento toxico. Posteriormente, los animales ganaron peso simultaneamente con regresiones tumorales. En el grupo de control con solucion salina, los animales que desarrollaron tumores grandes experimentaron perdida de peso debido de forma evidente a la morbilidad asociada al tumor. En general, la formulacion del farmaco liposomal donde el farmaco se habfa cargado en los liposomas con azucar polianionizado -capturado previamente (octasulfato de sacarosa) demostro ser la mas eficaz y menos toxica que el farmaco no liposomal.
Ejemplo 16. Toxicidad de CPT-11 libre y liposomal en ratones.
Las toxicidades agudas de CPT-11 encapsulado en liposomas y CPT-11 libre preparados segun de la presente invencion se compararon mediante la determinacion de la dosis maxima tolerada (MTD) despues de la inyeccion unica intravenosa en ratones ordinarios (inmunocompetentes).
Se emplearon los siguientes materiales:
1) Preparacion de CPT-11 (clorhidrato de irinotecan) con clorhidrato de irinotecan al 98,9% mediante HPLC, y 7,6% de humedad. En este estudio se prepararon formulaciones de farmacos “tal cual”, sin correccion del contenido de humedad ni del contenido de base de irinotecan.
2) El CPT-11 (Ls-CPT-11) liposomal se preparo como en el Ejemplo 11, usando una matriz lfpida de 200 partes en moles de DSPC, 133 partes en moles de colesterol y 1 parte en moles de PEG-DSPE; solucion capturada de TEA-SOS con TEA 0,65 M, pH 6,4; farmaco cargado en los liposomas en solucion tampon HEPES 5 mM, dextrosa al 5%, pH 6,5, a 60 °C durante 30 min en la relacion de entrada farmaco/lfpido de 500 mg farmaco/mmol de fosfolfpido. La eficacia de carga era >99%. Tamano del liposoma (promedio de volumen medio ± desviacion estandar segun QELS): 101 ± 37 nm. Los liposomas se formularon en el vefnculo, HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM; pH 6,5. Las concentraciones de farmacos en las formulaciones inyectadas fueron las que se especifican en las Tablas siguientes.
3) Solucion CPT-11 libre. La solucion madre de farmaco libre se preparo disolviendo clorhidrato de irinotecan en una solucion acuosa de dextrosa al 5% a 22 mg/ml, esterilizado mediante filtracion con un filtro de 0,2-pmn. Esta solucion madre se diluyo con dextrosa esteril al 5% antes de la inyeccion.
4) Animales. Ratones hembra Swiss Webster, 6-8 semanas de edad, adquiridos de Harlan, EE. UU.
La determinacion de MTD iba seguida generalmente del protocolo adoptado por el United States National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program (Programa terapeutico del desarrollo del Instituto Nacional del Cancer de los Estados Unidos). El protocolo inclrna los siguientes tres etapas:
Etapa 1): Etapa de determinacion del intervalo con el factor de escalado de dosis de 1,8. Se inyecto a los grupos de dos animales en la vena de la cola con dosis crecientes del irinotecan libre o irinotecan liposomal, empezando con una dosis de 60 mg/kg, y siguiendo con un factor de escalado de la dosis de 1,8, hasta observar una mortalidad aguda o morbilidad terminal (en >1 dfa despues de la inyeccion) en cualquiera de los animales. Se registro la dosis en una etapa por debajo de la dosis de morbilidad /mortalidad terminal.
Etapa 2): Etapa de determinacion del intervalo con el factor de escalado de dosis de 1,15. Se inyecto a los grupos de dos animales en la vena de la cola con dosis crecientes del irinotecan libre o el irinotecan liposomal, empezando con la dosis registrada en la Etapa 1, y siguiendo con un factor de escalado de la dosis de 1,15, hasta observar una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mortalidad aguda o morbilidad terminal (en >1 d^a despues de la inyeccion) en cualquiera de los animales. Se registro la dosis en una etapa por debajo de la dosis de morbilidad /mortalidad terminal en el MTD tentativo.
Etapa 3): Etapa de validacion. Se inyecto al grupo 5 de animales por via intravenosa. (vena de la cola) con irinotecan libre o liposomal en el mTd tentativo determinado en la Etapa 2. Se hizo un seguimiento de los animales durante 7 dfas, se registro el peso corporal de los animales dos veces a la semana y se comparo con el peso previo a la inyeccion. Se observo el estado de salud general de los animales (estado de alerta, aseo, alimentacion, excreciones, piel, pelaje y membrana mucosa, deambulacion, respiracion, postura). Si durante el periodo de observacion no hay mortalidad, morbilidad progresiva o perdida de peso superior al 15% del peso corporal previo a la inyeccion, la dosis se considera validada como inyeccion de MTD unica aguda. Si se produce uno de estos efectos, el experimento se repite en la siguiente dosis inferior en un factor de 1,15.
Para obtener estadfsticas adicionales para la etapa de validacion, la dinamica de peso corporal de los animales supervivientes se supervisa hasta en los 11 dfas posteriores a la inyeccion. La dosis superior a 324 mg/kg del irinotecan liposomal no se pudo administrar debido a las limitaciones de volumen de inyeccion y concentracion. Los resultados se presentan en la Tabla 10.
Tabla 10. Estudio de determinacion de MTD de formulaciones CPT-11 en ratones.
Resultados
Etapa 1. Aumentar la dosis en un factor de 1,8
Peso corporal del animal, en dfa posterior a la inyeccion
farmaco
iny. Dosis conc. Volumen (mg/kg) farmaco iny. (jl) (mg/ml) N.° raton 0 (g) 1 (g) 2 (g) 4 (g) 5 (g) 6 (g) 7 (g) 11 (g
Ls-CPT11
60 8 150 1 19,2 18,0 nd 20,3 20,6 20,6 20,0 19,7
2 19,7 19,3 nd 20,6 20,4 19,6 19,7 20,7
100 12 165 1 19,5 18,6 nd 19,6 20,0 20,1 19,4 19,9
2 20,1 18,9 nd 20,2 21,5 22,2 21,8 22,5
180 22 165 1 19,4 18,4 nd 18,9 19,7 20,5 19,5 20,5
2 20,0 19,3 nd 19,6 20,6 21,4 21,6 21,7
324 30,6 210 1 21,8 21,2 21,2 nd 20,2 nd 20,2 nd
2 21,6 20,4 21,3 nd 20,8 nd 21,4 nd
CPT11 libre
60 8 150 1 20,6 20,4 nd 22,1 22,1 22,2 22,0 22,5
2 19,5 19,1 nd 20,1 20,3 20,4 20,5 21,1
100 12 165 1 19,3 murio 1-2 min despues de la inyeccion
2 20,1 murio 1-2 min despues de la inyeccion
3 19,9 murio 1-2 min despues de la inyeccion
Despues de la inyeccion, todos los ratones tratados con CPT11 estaban enfermos, sin aliento durante 1 hora y despues se recuperaron
Despues de la inyeccion, todos los ratones tratados con Ls-CPT11 se encontraban en condiciones normales.
Etapa 2. Aumentar la dosis en un factor de 1,15
Peso corporal del animal, en dfa posterior a la inyeccion
farmaco
iny. Dosis (mg/kg) conc. Volumen farmaco iny. (jl) (mg/ml) N.° raton 0 (g) 1 (g) 2 (g) 5 (g) 7 (g)
CPT11 libre
60 8 150 3 19,9 20,0 20,9 19,9 21,3
4 19,5 18,7 19,4 18,8 18,9
70 8 175 5 20,9 20,0 20,6 19,3 20,4
6 22,3 21,8 22,4 22,4 22,8
80 8 200 7 20,6 19,9 20,1 19,9 20,9
8 20,6 20,8 21,1 20,7 21,4
90 12 150 9 murio 1-2 min despues de la inyeccion
10 murio 1-2 min despues de la inyeccion 8 225 11 murio 1-2 min despues de la inyeccion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Etapa 3. Validacion
Peso corporal del animal, en dfa posterior a la inyeccion
farmaco
iny. Dosis (mg/kg) conc. farmaco (mg/ml) Volumen iny. (Ml) N.° raton 0 (g) 3 (g) 5 (g) 7 (g)
CPT11 libre
80 8 200 1 20,2 19,3 20,0 21,7
2 20,5 20,6 20,5 21,2
3 20,7 20,6 20,8 21,9
4 20,8 21,4 22,1 23,0
5 21,9 21,9 21,6 21,5
Ls-CPT 11
324 365 180 6 21,0 20,0 20,1 20,2
7 20,4 20,4 20,2 19,2
8 20,4 19,8 20,3 20,7
9 20,9 19,9 20,5 21,5
10 20,7 19,5 19,8 20,2
Por ello, mientras el MTD de CPT-11 libre era de 80 mg/kg, el MTD de CPT-11 liposomal, sorprendentemente, no se alcanzo incluso en la dosis administrada mas alta de 324 mg/kg. Por consiguiente, la encapsulacion de liposomas de CPT-11 segun la presente invencion redujo la toxicidad del farmaco en al menos 4 veces.
Ejemplo 17. Estabilidad en almacenamiento de liposomas TEA-SOS cargados con CPT-11 frente a fugas de farmaco.
Se prepararon cinco lotes de CPT-11 liposomal usando el metodo TEA-SOS (Ejemplo 11), con una relacion de entrada farmaco/ffpido de 500-550 mg/mmol de fosfoffpido. Los liposomas se prepararon mediante extrusion de membrana usando membrana de policarbonato con un tamano de poro de 80 nm o 100 nm, como se indica en la tabla siguiente. Los liposomas se esterilizaron con un filtro de 0,2-pm y se almacenaron a 3,4-14,5 mg/ml de CPT-11 en NaCl 135 mM, HEPES-Na 20 mM, pH 6,5 (solucion tampon de almacenamiento), a 4-8 °C. Despues del tiempo de almacenamiento indicado, la fuga de farmaco se elimino mediante cromatograffa en gel en Sephadex G-75 usando la solucion tampon de almacenamiento como eluyente. Las concentraciones de farmaco y fosfoffpido en los liposomas antes y despues de la cromatograffa en gel se sometieron a analisis usando el metodo de espectrofotometna y el metodo de digestion acida del fosfomolibdato azul, respectivamente, como se describe en los Ejemplos 70 y 71. Los liposomas CPT-11 preparados segun la presente invencion eran muy estables. La fuga de CPT-11 de estos liposomas durante el almacenamiento fue inferior al 5% en un periodo de 6 meses (Tabla 10).
Tabla 11. Estabilidad a la encapsulacion de liposomas CPT-11 durante el almacenamiento (los datos son promedios±SE).
N.° lote liposoma
Tamano de poro de extrusion, nm Concentracion de CPT- 11, mg/ml Tiempo de almacenamiento, meses % farmaco que quedc encapsulado
1
80 3,44±0,06 6 99,02±3,77
2
80 7,88±0,19 6 102,38±4,78
3
100 4,57±0,06 6 96,38±4,69
4
100 4,62±0,11 6 95,72±4,36
5
80 14,52±0,42 3 103,4±5,92
Ejemplo 18. Liposomas cargados con topotecan.
Los liposomas con solucion TEA-Pn capturada y solucion TEA-SOS se prepararon como en el Ejemplo 11. La solucion madre de clorhidrato de topotecan (GlaxoSmithKline, PA, EE. UU.) se preparo inmediatamente antes de mezclarla con los liposomas disolviendo el clorhidrato de topotecan en agua a 15-20 mg/ml, contando el contenido de HCI en el topotecan real. El pH se ajusto a 3,0 con HCl 1 N. La solucion del farmaco se filtro usando un filtro esteril de polietersulfona (PES) de 0,2 micrometres aplicando presion positiva. Las affcuotas de los liposomas que contienen TEA-Pn o TEA-SOS en la solucion tampon de carga del farmaco se mezclaron a temperatura ambiente con la solucion madre de HCl de topotecan para conseguir una relacion de entrada de farmaco/ffpido en el intervalo de 0,150,45 g/mmol de fosfoffpido liposomal. La proporcion recomendada era 0,35 g de HCl de topotecan por mmol de fosfoffpido liposomal. Las mezclas en los contenedores de vidrio se incubaron en un bano de agua termostatizado a 5562 °C con agitacion lenta durante 30-60 min, se enfriaron rapidamente en banos de agua helada (0-2 °C) y se dejaron reposar a esta temperatura durante 5-15 min. Esta etapa genero una eficacia de encapsulacion del 89-90% (gradiente TEA-Pn) o del 97-100% (gradiente TEA-SOS). El topotecan no encapsulado se extrajo y los liposomas se transfirieron a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la solucion tampon de almacenamiento usando la cromatograffa en columna por exclusion de tamano. Antes de la aplicacion en la columna, la fuerza ionica de la preparacion del liposoma se aumento mezclando con 1/20 vol. de una solucion acuosa de cloruro de sodio 2,88 M y la mezcla se incubo durante aproximadamente 15 minutos. Los inventores descubrieron de forma inesperada que ajustar la fuerza ionica del medio del liposoma desde el valor bajo durante la carga (normalmente equivalente a menos de NaCl 20 mM) al valor mas alto del anterior NaCl 20 mM, y preferiblemente a NaCl 50 mM y superior, mejoraba la extraccion de farmaco no encapsulado y aumentaba la estabilidad de los liposomas cargados con topotecan frente a la agregacion, posiblemente facilitando la extraccion del topotecan unido a la membrana, de forma contraria al farmaco encapsulado en el interior del liposoma. El resto del procedimiento siguio el Ejemplo 11, etapa 7. Para los resultados, consulte la siguiente Tabla 12.
Ejemplo 19. Preparacion de formulaciones inmunoliposomales de topotecan dirigidas contra HER2.
Los inmunoliposomas de topotecan especialmente internalizables por celulas cancengenas con una sobreexpresion de oncoprotema de tirosina quinasa del receptor superficial de HER2 (C-ErbB-2) se prepararon conjugando liposomas de topotecan en un fragmento de anticuerpo Fv humano monocatenario dirigido contra HER2, F5, seleccionado de la biblioteca de expresion de fagos para su internalizacion alta en celulas con una sobreexpresion de HER2 (Poul, y col.,
2000, J. Molecular Biology, v. 301, pag.1149-1161). F5 es una protema de 27-KDa que se une al dominio extracelular del receptor HER2 con una afinidad de aproximadamente 150 nM, provocando una rapida internalizacion (Neve, y col.,
2001, Biophys. Biochim. Res. Commun. v. 280, pag. 274-279). Para la conjugacion de liposomas, se siguio el metodo de la patente US-6.210.707 y el de Nielsen, y col. (2002), Biochim. Biophys. Acta, v. 1591, pag.109-118, con caracter general. Primero se preparo un conjugado del lipopoffmero hidrofilo de F5. El extremo C de la cadena de aminoacidos F5 tema un grupo cistema terminal anadido (F5Cys). La construccion de F5Cys se expreso en E. coli y se aislo del lisado bacteriano por medio de cromatograffa en columna de la protema A. Las fracciones eluidas de protema A se adsorbieron en la resina de intercambio anionico para eliminar los pirogenos y el ADN hospedador, y se trataron con un agente reductor del tiol para liberar el grupo tiol de la cistema terminal. El F5Cys reducido se purifico adicionalmente mediante cromatograffa de intercambio de iones usando SP Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia). La protema purificada se conjugo con un enlazador de ffpido-poli(etilenglicol) reactivo al tiol, N-(3-(N-maleimido)propionilamido)- poli(oxietileno)-oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidil etanolamina (Mal-PEG-DSPE), un derivado de PEG con un peso mol. de 2000 (Figura 4.1), producido comercialmente por Avanti Polar Lipids, Inc., Alabama, EE. UU. La protema y el enlazador se incubaron en una solucion tampon acuosa con una relacion molar 1:4, y el enlazador no reaccionado se inactivo con cistema 1 mM. Durante la reaccion, la cistema terminal de F5Cys se unio covalentemente al grupo maleimido del enlazador. El conjugado F5-PEG-DSPE resultante era soluble en agua en forma de micelas con un peso molecular aparente alto (500-850 KDa), y se separo de la protema sin reaccionar (aproximadamente 25%) mediante cromatograffa de exclusion por tamano. La cantidad de protemas en el conjugado purificado se determino mediante espectrofotometna UV a 280 nm, y la cantidad de enlazador se evaluo usando un metodo espectrofotometrico identico al utilizado para la cuantificacion de fosfolfpidos (consulte el Ejemplo 70). El conjugado F5-PEG-DSPE purificado era estable en agua, completamente inmunorreactivo, y era estable frente a la desnaturalizacion y la perdida de reactividad durante al menos 1 hora a 65 °C y al menos durante 3 meses a 37 °C.
Para preparar topotecan inmunoliposomal dirigidos contra HER2, los liposomas cargados con topotecan del Ejemplo 18 de mezclaron con F5-PEG-DSPE en solucion salina tamponada acuosa con una proporcion de 15 microgramos de protema por 1 micromol de fosfolfpido (aproximadamente 45 copias de F5 por liposoma). La mezcla se incubo durante 40 min. a 60 °C, se enfrio en hielo, y se realizo una cromatograffa en una columna con Sepharose CL-4B (perlas de agarosa reticuladas al 4%, Amersham Pharmacia) para eliminar el conjugado micelar residual, la protema no conjugada y cualquier traza de farmaco extraliposomal que pueda haberse liberado durante la incubacion. Los liposomas con F5-PEG-DSPE incorporado en la membrana se eluyeron con solucion tampon HEPES 5 mM - NaCl 144 mM pH 7,4, y se recogieron en el volumen vado de la columna, se filtraron de forma esteril y se dispensaron para su almacenamiento (4-6 °C). La cantidad de F5 incorporado en el liposoma era normalmente >80% del conjugado anadido. Se determino mediante SDS-PAGE de los liposomas con cuantificacion de la banda F5 con tinte Coomassie mediante densiometna. Las concentraciones de farmaco y ffpido en las preparaciones inmunoliposomales se determinaron de forma similar a los liposomas no dirigidos. Las propiedades de los liposomas de topotecan y los inmunoliposomas F5 (Ejemplos 18-19) se resumen en la Tabla 12.
Tabla 12. Caractensticas de liposomas de topotecan e inmunoliposomas.
Sal capturada en el liposoma
Union F5 scFv: Relacion farmaco/ffpido, g/mmol de fosfoffpido % de encapsulacion Tamano del liposoma, promedio±SD, nm
Entrada Salida
TEA-Pn
No 173,6 155,2±5,9 89,4±3,4% 96,4±38,7
TEA-Pn
Sf 173,6 156,2±5,2 90,0±3,0% 96,2±33,8
TEA-SOS
No 347,2 340,8±14,7 98,2±4,2% 99,1±32,6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 20. Efecto del pH de la solucion tampon de carga y la relacion farmaco/l^pido para cargar el topotecan en los liposomas.
Se prepararon liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE, relacion molar 3:2:0,015) con TEA-Pn 0,5 N capturado, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg, usando el metodo de inyeccion de etanol (Ejemplo 18), extrudido a traves de dos filtros de policarbonato apilados con un tamano de poro de 100 nm 5 veces y con un tamano de poro de 50 nm 10 veces. La solucion tampon de carga era MES 5 mM, 50 g/l de Dextrosa, ajustada a varios pH en el intervalo 5,0-6,5. El tamano del liposoma era de 73,1 ± 21,3 nm segun QELS. Los liposomas se cargaron mezclando una solucion madre de topotecan (20 mg/ml) con los liposomas en la solucion tampon de carga en la relacion de entrada farmaco-fosfolfpido de 100 mg/mmol, incubando la mezcla a 60 °C durante 45 min, inactivandola en hielo durante 15 minutos y extrayendo el farmaco no encapsulado usando una columna Sephadex G-75 eluida con HEPES 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5. El topotecan y el fosfolfpido se cuantificaron mediante espectrofotometna (Ejemplos 70 y 71). Los resultados (Tabla 13) indicaron que la carga de topotecan era casi cuantitativa en el intervalo de pH 5,5-6,5.
Tabla 13. Efecto del pH de la solucion tampon de carga sobre el % de encapsulacion de topotecan en los liposomas con TEA-Pn capturado.
pH de la solucion tampon de carga
% de encapsulacion
5,0
50,1 ±2,1
5,5
97,2±8,1
6,0
115,5±15,0
6,5
102,1±8,1
Se estudio tambien el efecto de la relacion farmaco-lfpido (0,15-0,45 mg/mmol de fosfolfpido) sobre la eficacia de carga. Los liposomas con TEA-Pn (0,5 M TEA, pH 5,8, osmolalidad 480 mmol/kg) capturado se prepararon como se ha descrito anteriormente, excepto la etapa de extrusion final que era de 10 veces a traves de dos filtros de policarbonato de 0,08 pm apilados. La carga se realizo a un pH de 6,5. El tamano del liposoma era de 93,1 ± 15,1 nm segun QELS. Los resultados (Tabla 14) indicaron que la eficacia de carga del farmaco era superior al 85% sobre el intervalo completo de relaciones farmaco/lfpido estudiadas.
Tabla 14. Efecto de la relacion farmaco/lfpido sobre la eficacia de encapsulacion de topotecan en los liposomas que contienen TEA-Pn.
Relacion de topotecan/fosfolfpido, mg/mmol
% de encapsulacion (promedio±S
Relacion de entrada
Relacion de salida (despues de la carga)
168,2
166,9±11,1 99,2±6,6
224,4
232,5±47,6 103,7±21,2
280,3
253,5±19,8 90,4 7,0
336,4
298,3±18,0 88,7±5,3
392,5
361,2±36,8 92,0±9,4
448,5
394,9±29,5 88,0±6,6
Ejemplo 21. Estabilidad del liposoma de topotecan in vitro en presencia de plasma.
Se prepararon liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE, relacion molar 3:2:0,015) con TEA-Pn 0,5 capturado, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg, como se describe en el Ejemplo 18. Los liposomas con un tamano de 96,4 ± 29,3 nm se produjeron mediante 10 extrusiones a traves de dos filtros de policarbonato de tamano de poro 100 nm. Para la cuantificacion del lfpido del liposoma en plasma, se incluyo [3H]-CHE en la solucion lfpida a 0,5 pCi/pmol de DSPC. El topotecan se cargo a un pH de 6,0, 58 °C durante 45 min en una proporcion de farmaco/fosfolfpido de 150 mg/mmol. La eficacia de la carga era de 148,48 ± 10,26 pg topotecan/pmol fosfolfpido (99,0 ± 6,8%).
Los liposomas se incubaron con plasma humano al 50% en un dispositivo de microdialisis de varios pocillos (Spectra-Por MicroDialyzer 10 pocillos, Spectrum, EE. UU.). El plasma de donante humano se diluyo con el mismo volumen de solucion salina tamponada con HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 135 mM), pH 6,5, que contema azida de sodio al 0,02% y se cargo en el deposito inferior del dializador (32 ml). Los pocillos (0,4 ml) se separaron del deposito usando una membrana de policarbonato con un tamano de poro de 30 nm, para permitir el paso libre de las protemas de plasma y las moleculas pequenas pero no de los liposomas. Los liposomas se mezclaron con cantidades calculadas de plasma y solucion salina tamponada con HEPES para conseguir una concentracion de fosfolfpido 2,5 mM y 50% en vol. de plasma. El dispositivo se incubo a 37 °C y los contenidos del deposito se agitaron lentamente. Despues de 8 horas de incubacion, los contenidos del deposito inferior se cambiaron por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
plasma fresco al 50%. En puntos temporales espedficos (consulte mas abajo), se extrajeron aKcuotas de 50-jl de los pocillos, y se realizo una cromatograffa en las columnas con 2,2-2,4 ml de Sepharose CL-2B, solucion salina tamponada con HEPES de eluyente para separar los liposomas de las protemas de plasma y el farmaco libre. Los liposomas se recogieron en las fracciones de volumen vado. El topotecan se cuantifico mediante fluorometna usando excitacion a 384 nm y emision a 524 nm despues de la solubilizacion de las muestras de plasma en una solucion acuosa de isopropanol al 90% - HCl 0,1 N, y el lfpido se cuantifico mediante recuento por centelleo de [3H]-CHE (corregido para la inactivacion). La relacion farmaco-lfpido determinada se comparo con la relacion inicial antes de la incubacion para obtener el % de topotecan que quedaba encapsulado en cada punto temporal. Despues de 8 horas de incubacion, la cantidad de farmaco remanente en el liposoma era aproximadamente del 55% de su valor inicial (Tabla 15).
Tabla 15. Liberacion in vitro de topotecan desde los liposomas cargados en un gradiente de TEA-Pn en plasma humano al 50% a 37 °C.
Tiempo de incubacion, horas
% farmaco que queda encapsulado
1
95,5±5,4
4
76,8±7,3
8
55,9±4,1
24
55,4±16,8
Ejemplo 22. Liposomas de topotecan en un gradiente de TEA-Pn capturado en varias relaciones de farmaco/Hpido: retendon del farmaco in vivo y duracion de circulacion en ratones.
Los liposomas (DSPC/Chol/PEG-DSPE en la relacion molar 3:2:0,015, que contienen [3H]-CHE a 0,5 mCi/mmol DSPC) con solucion salina formadora de gradiente encapsulado (TEA-Pn 0,5 N, pH 6,2, osmolalidad 413 mmol/kg) se prepararon como en el Ejemplo 18 usando extrusion 12 veces a traves de dos filtros de policarbonato de tamano de poro 100 nm apilados. El tamano del liposoma era de 107,7 ± 19,1 nm segun QELS. Los liposomas en HEPES 5 mM, 50 g/l de Dextrosa, pH 6,5 se mezclaron con la solucion madre acuosa de topotecan (20 mg/ml) en las relaciones de farmaco/fosfolfpido en el intervalo de 130-360 |jg /jmol, seguido de la incubacion de la muestra a 58 °C durante 45 min, colocandola en hielo durante 15 minutos y retirando el farmaco no encapsulado mediante cromatograffa con Sephadex G-75. Se inyecto a los ratones hembra FvB de doce semanas de edad con liposomas en la vena de la cola con una dosis de 5 mg de topotecan por kg de peso corporal (aprox. 0,2 mg topotecan/animal) por triplicado. En los tiempos indicados, normalmente 8 o 24 horas despues de la inyeccion, se anestesio a los ratones, se desangraron y las muestras de sangre se analizaron para detectar el contenido de farmaco y lfpido de liposoma como en el Ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Tabla 16. Despues de 24 horas, cerca del 6-32% de la carga de farmaco inicial segrna estando encapsulada. Las cargas superiores del farmaco (>200 mg/mmol fosfolfpido) dieron como resultado una retencion prolongada del farmaco.
Tabla 16. Retencion del farmaco in vivo y duracion en circulacion de los liposomas de topotecan prototipo cargados usando el metodo de gradiente TEA-Pn en distintas relaciones de farmaco/lfpido.
Relacion de farmaco/fosfolfpido encapsulado, mg/mmol
Lfpido remanente en circulacion, % dosis inyectada Topotecan que queda encapsulado, % de carga inicial
Despues de 8 horas
Despues de 24 horas Despues de 8 horas Despues de 24 horas
127,2±10,9
36,1±2,0 18,7±8,1 51,7±7,1 6,72±2,5
207,2±21,6
32,1±5,2 9,84±1,88 75,6±13,0 13,8±3,5
301,3±24,5
34,4±3,2 8,04±4,25 79,2±4,2 25,6±4,4
360,3±35,6
33,6±2,4 8,68±4,96 73,5±7,0 32,3±9,8
Ejemplo 23. Retencion del farmaco in vivo y duracion en circulacion de liposomas de topotecan cargados usando distintas sales de trietilamonio y amonio capturadas.
Se prepararon liposomas compuestos por DSPE, colesterol y PEG-DSPE (3:1:0,1 por peso), que tambien contienen [3H]-CHE a 0,22 mCi/mmol de DSPE, como en el Ejemplo 18, excepto en que la etapa de extrusion inclrna 10 pases a traves de 2 filtros de 200-nm de poro apilados, 10 pases a traves de 2 filtros de 100-nm de poro apilados y 20 pases a traves de 2 filtros de 50-nm de poro apilados. Los liposomas conteman las siguientes soluciones salinas:
Se preparo una solucion de sulfato de dextrano de amonio 0,5 N (A-DS) a partir de sulfato de dextrano de sodio (P.m. 5000), adquirido de Sigma, y se convirtio en sal de amonio aplicando un procedimiento de intercambio de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
iones similar al del Ejemplo 4. La solucion de acido dextrano sulfurico se titulo inmediatamente con una solucion acuosa de amomaco 12,4 M. La solucion de A-DS tiene un pH de 5,66 y una osmolalidad de 208 mmol/kg.
Se preparo octasulfato de sacarosa de amonio 0,48 N (A-SOS) de forma similar al Ejemplo 6, pero se utilizo hidroxido de amonio para la titulacion. La solucion tema un pH de 6,27 y una osmolalidad de 258 mmol/kg.
Se preparo de octasulfato de sacarosa de trietilamonio 0,47 M (TEA-SOS) como en el Ejemplo 6. La solucion tiene un de pH 6,6 y una osmolalidad de 297 mmol/kg.
El topotecan se cargo en los liposomas en la solucion acuosa de MES-Na 10 mM, 50 g/l de dextrosa, pH 6,5, incubando los liposomas con el farmaco a 61-62 °C y una relacion de entrada de farmaco/fosfolfpido de 346±1 mg/mmol, durante 40 min, seguida de una incubacion en hielo durante 10 min. Los liposomas se purificaron partiendo del farmaco no encapsulado mediante cromatograffa en Sephadex G-25, eluyente - solucion acuosa de histidina 2 mM, NaCl 144 mM, pH 6,6 (HCl).
Se inyectaron ratones hembra Swiss Webster de siete a nueve semanas de edad en la vena de la cola con estas formulaciones de topotecan liposomal en una dosis de 5 mg de topotecan por kg de peso corporal (aprox. 0,2 mg de topotecan/animal) por triplicado. 8 horas o 24 horas despues de la inyeccion, se recogieron muestras de sangre y se analizaron para detectar el topotecan y el lfpido del liposoma como en el Ejemplo 22.
Los resultados se incluyen en la Tabla 17 siguiente. Mientras las tres formulaciones de liposomas demostraron una duracion en circulacion del liposoma muy cercana, con aproximadamente un 23-28% de la dosis inyectada remanente en la sangre 24 horas despues de la inyeccion, inesperadamente la retencion del farmaco en liposomas TEA-SOS y en liposomas A-SOS era mejor que en los liposomas A-DS tanto a nivel de magnitud (casi una mejora del doble de retencion del farmaco) con un nivel de significancia estadfstica (significancia estadfstica del 95% de nivel de confianza derivada de una prueba de la T de Student bilateral no emparejada p=0,0257 y p=0,00995, respectivamente; y segun el test de la U de Mann la diferencia era significativa con a=0,01). La retencion del farmaco en TEA-SOS que conteman liposomas de topotecan era mejor que en los liposomas A-SOS que conteman topotecan.
Tabla 17. Retencion del farmaco in vivo y la persistencia en circulacion de liposomas de topotecan preparados usando TEA-SOS, amonio-SOS (A-SOS) y sulfato de dextrano de amonio (A-DS.
Gradiente Relacion farmaco/ Eficacia de Tamano de Lfpido remanente en Topotecan que queda
fosfolfpido, carga, % liposoma, nm circulacion, % dosis encapsulado, % de carga
mg/mmol inyectada_______________inicial__________________
Despues de Despues de Despues de 8 Despues de
__________________________________________________8 horas______24 horas horas_______24 horas
A-DS 288,1±20,6 83,3±6,0 76,9±22,7 43,7±1,2 27,7±1,5 43,6±6,8 18,7±1,5
A-SOS 346,2±14,3 100,0±4,1 99,7±28,9 42,3±2,2 23,4±2,0 53,3±0,8 31,3±3,2
TEA-SOS 340,8±14,7 98,5±4,2 99,1±32,6 42,1±2,3 23,0±2,9 57,0±5,6 38,1±6,1
Ejemplo 24. Farmacocinetica del farmaco y Hpidos en plasma del topotecan liposomal en ratas
La duracion en circulacion y los parametros de liberacion del topotecan se evaluaron en ratas. Se prepararon liposomas (relacion molar DSPC/colesterol/PEG-DSPE 3:2:0,015) mediante el metodo de extrusion/mezclado de etanol y se cargaron con topotecan usando el gradiente TEA-Pn o el gradiente de TEA -octasulfato de sacarosa (TEA-SOS) como se describe en el Ejemplo 18 y se cargaron en distintas relaciones de farmaco/lfpidos (fosfolfpido 15-450 mg/mmol). Para la cuantificacion de la matriz de lfpidos, el lfpido del liposoma contema [3H]-CHE a 0,5-1,5 mCi/mmol de DSPC. Se inyectaron por via intravenoso ratas hembra Sprague Dawley (6-8 semanas de edad; peso corporal aproximado 200 g) con cateteres venosos centrales permanentes. (a traves del cateter) con liposomas de topotecan en una dosis de 4 - 5 mg/kg de peso corporal. El cateter se aclaro con solucion salina. En tiempos seleccionados (de hasta 48 horas despues de la inyeccion), se recogieron muestras de sangre (0,2-0,3 ml) a traves del cateter en jeringas heparinizadas, mezcladas con 0,4 ml de solucion salina tamponada con fosfato fria con EDTA al 0,04%. Las celulas sangumeas se separaron mediante centrifugacion y los sobrenadantes (plasma diluido en PBS) se sometieron a un analisis para evaluar los lfpidos mediante recuento de radioactividad 3H-CHE (corregida para la inactivacion) y para analizar el topotecan mediante fluorometna (Ejemplo 71). Los resultados del analisis se corrigieron para dilucion en plasma, calculada a partir del peso de la muestra de sangre obtenida y suponiendo un hematocrito del 40%. La dosis total de sangre del farmaco y el lfpido se estimo a partir del volumen sangumeo calculado como el 6,5% del peso corporal. El porcentaje de topotecan retenido en los liposomas se calculo comparando la relacion farmaco/lfpido en un punto temporal determinado con la relacion farmaco/lfpido de los liposomas inyectados. La Tabla 18 siguiente resume las semividas en sangre del lfpido, el farmaco y las semividas para la liberacion del farmaco, asf como otras propiedades de los liposomas. Las curvas de farmacocinetica (PK) se muestran en las Figuras 8A (lfpido) y 8b (relacion farmaco/lfpido). En resumen, las curvas de PK en sangre para el farmaco y el lfpido se corresponden bien con el modelo de exponente unico (R2 0,984-0,999). A pesar de su tamano de 90-100 nm y de la muy pequena cantidad de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ifpido PEGilado (0,3%) en moles., los liposomas mostraron inesperadamente una buena duracion en circulacion (las semividas en plasma del componente del Kpido estaban en el intervalo de 11-16 horas). La liberacion mas lenta de topotecan (tiempo medio 22,9 horas) se observo con los liposomas cargados usando el metodo TEA-SOS.
Tabla 18. Semivida en circulacion (t1/2) de Kpido, farmaco y semivida para la liberacion del farmaco desde los liposomas de topotecan prototipo en ratas.
Sal capturada y concentracion
Carga de topotecan, mg / mmol fosfolfpido Tamano de liposoma, nm (promedio±SD) Dosis inyectada, mg/kg t1/2 lfpido, horas t1/2 farmaco, horas t1/2 de liberacion del farmaco, horas N.° de animales po grupo
TEA-Pn 0,5 N
124,3±9,7 92,3±23,3 4 15,8 4,13 5,34 3
TEA-Pn 0,5 N
360,3±35,6 107,7±19,1 5 12,8 6,06 9,97 2
TEA-SOS 0,643 N
439,2±15,9 108,8±13,4 5 10,8 7,36 22,87 2
Ejemplo 25. Estabilidad del farmaco frente a fugas durante el almacenamiento de liposomas de topotecan.
Las muestras de varias formulaciones prototipo preparadas para los estudios descritos anteriormente se almacenaron a 4-6 °C varias veces para evaluar la estabilidad en almacenamiento del topotecan encapsulado frente a la fuga de farmaco desde los liposomas. Se pasaron las muestras de liposomas por columnas Sephadex G-75, eluidas con HEPES 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5, para extraer el farmaco extraliposomal, y se analizo el contenido de farmaco mediante espectrofotometna y el contenido de lfpido mediante recuento de radioactividad [3H]-CHE. Los resultados (Tabla 19) indican una buena retencion del topotecan en los liposomas durante su almacenamiento.
Tabla 19. Retencion del farmaco en liposomas de topotecan prototipo durante su almacenamiento.
Sal formadora de gradiente del liposoma
Tamano del liposoma, promedio±SD, nm Carga inicial del farmaco, mg de farmaco/mmol de fosfolfpido Tiempo de almacenamiento, meses Carga del farmaco despues de almacenamiento como % inicial
TEA-Pn 0,500 N pH 6,2
96,4±29,3 148,5±10,3 8 101,6±5,5
TEA-Pn 0,500 N pH 6,
107,7±19,1 127,2±10,9 6 94,6±6,2
TEA-Pn 0,500 N pH 6,2
107,7 ±19,1 207,2±21,6 6 113,9±9,4
TEA-Pn 0,500 N pH 6,2
107,7±19,1 301,3±24,5 6 112,9±9,3
TEA-SOS 0,643 N pH 5,6
108,8±13,4 439,2±15,9 2 97,8±9,4
Ejemplo 26. Captacion in vitro de topotecan inmunoliposomal y liposomal por celulas cancengenas con una sobreexpresion de HER2.
Este estudio se centraba en la capacidad de los inmunoliposomas dirigidos contra HER2 cargados con topotecan preparados segun la descripcion para suministrar topotecan espedficamente en celulas con una sobreexpresion de HER2 en un cultivo celular. Los (inmuno)liposomas se prepararon y cargaron con topotecan usando el metodo TEA-Pn descrito en el Ejemplo 19. Las celulas de carcinoma de mama humano con una sobreexpresion de HER2 (SKBr-3, ATCC) se hicieron crecer en un medio de McCoy 5A modificado (sin tricina) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 50 pg/ml de sulfato de estreptomicina y 50 U/ml de penicilina G (medio de crecimiento completo) en frascos T-75 a 37 °C, CO2 al 5% hasta confluencia. Las celulas se recogieron mediante tripsinizacion, se inocularon en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 150.000 celulas/pocillo en 0,5 ml del medio de crecimiento completo, y se dejaron aclimatar durante la noche. El medio se sustituyo con 0,5 ml de medio de crecimiento completo que contema formulaciones de topotecan en la concentracion seleccionada en el intervalo de 0,01-0,1 mM de fosfolfpido. Para cada condicion se usaron pocillos por triplicado. Los pocillos de control se incubaron en ausencia de farmaco y/o liposomas (para obtener lecturas de fondo para el analisis del farmaco). Las placas se incubaron con agitacion lenta a 37 °C, CO2 al 5% durante 4-8 horas. El medio se aspiro, y las celulas se enjuagaron 4 veces con porciones de 1 ml de solucion salina equilibrada de Hanks frfa que contema sales de Ca y Mg. Las celulas se solubilizaron anadiendo 0,1 ml de Triton X-100 al 1% en agua, y la cantidad del farmaco en los lisados celulares se determino mediante fluorometrfa (Ejemplo 71). La curva estandar se obtuvo en el intervalo de 10-2500 ng de topotecan/pocillo, y se ajusto al polinomio de segundo orden (para compensar la autoinactivacion en concentraciones superiores del farmaco) despues de sustraer el fondo de autoflorescencia de la celula. Si se ha usado un fluorometro de microplaca, la seleccion del filtro era 400/30 nm para la excitacion, 530/25 nm para la emision. Los fluorometros de cubeta y de microplaca dieron los mismos resultados.
Los resultados de los dos experimentos se resumen en la Tabla 20 siguiente. Hubo una captacion celular prominente del farmaco liposomal dirigido contra HER2 (50-300 veces mas alto que el topotecan liposomal no dirigido). Curiosamente, la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
captacion de topotecan libre tambien era considerablemente inferior a la de topotecan inmunoliposomal dirigido contra HER2. Esto puede explicarse por la rapida hidrolisis del anillo de lactona de la camptotecina de la molecula de topotecan en el medio de crecimiento celular en presencia de suero, generando la forma carboxilada del farmaco que puede tener menor permeabilidad celular y menor citotoxicidad. En resumen, se confirmo la capacidad de los inmunoliposomas conjugados a ligandos, intenalizables, dirigidos a celulas para suministrar topotecan intracelularmente.
Tabla 20. Captacion celular in vitro de liposomas de topotecan e inmunoliposomas dirigidos contra HER2 que contienen TEA-Pn (nd, no determinado). Para las caractensticas del liposoma, consulte la Tabla 12.
Concentracion del liposoma, fosfolfpido mM
Concentracion de topotecan pg/ml Tiempo de exposicion, horas Admision de topotecan por las celulas SK-Br-3, ng/100.000 celulas
Liposomas no dirigidos
F5-Inmunoliposomas Farmaco libre
0,1
15,5 4 1,45±0,09 163±5,7 nd
0,01
1,55 4 0,185±0,03 60,2±2,0 nd
0,033
5,0 8 3,62±2,03 169,6±13,7 5,56±0,91
Ejemplo 27. Citotoxicidad de topotecan liposomal e inmunoliposomal frente a celulas cancengenas con una sobreexpresion de HER2 in Vitro.
Despues de determinar la capacidad de los inmunoliposomas de topotecan dirigidos contra HER2 para suministrar farmacos intracelularmente en celulas cancengenas con una sobreexpresion de HER2 (Ejemplo 26), era importante asegurar que los liposomas internalizados pudiesen liberar el farmaco en su forma activa. Para ello, se estudio la citotoxicidad in vitro del topotecan libre (p. ej. topotecan formulado como una solucion), topotecan liposomal y topotecan inmunoliposomal dirigido contra HER2. Se prepararon formulaciones de topotecan liposomal y se hicieron crecer y cultivaron celulas SKBr-3 como se describe en el Ejemplo 26. Se inocularon celulas en placas de cultivo celular de 96 pocillos a 5000 celulas/pocillo en 0,1 ml de medio de crecimiento completo, por triplicado, y se dejaron aclimatar durante la noche. Las columnas y las filas situadas en los bordes de la placa se dejaron vadas. Las preparaciones esteriles de liposomas de topotecan, inmunoliposomas o el farmaco libre (preparado de forma reciente diluyendo 20 mg/ml de la solucion madre de topotecan, pH 3, en solucion salina sin tampon a 2 mg/ml) se diluyeron con un medio farmaco completo para conseguir concentraciones de partida de 90, 30 o 10 pg/ml y se diluyeron en serie en el medio por el factor de 3. Los medios en los pocillos se sustituyeron por 0,2 ml de diluciones de farmaco/liposoma, y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5%, durante el tiempo especificado (4-6 horas). Un pocillo en cada hilera se incubo con medio exento de farmaco para servir como control no tratado. Los medios que conteman el farmaco se aspiraron de los pocillos, las celulas se enjuagaron con 0,2 ml de medio exento de farmaco y se anadieron 0,2 ml de medio exento de farmaco fresco a todos los pocillos. Las placas se incubaron durante 4 dfas a 37 °C, CO2 al 5%. Sin cambio de medio, se anadieron 0,03 ml de la solucion de 2 mg/ml de un colorante de tetrazolio (Thiazolyl Blue, MTT) (Sigma Chemical Co.) en un medio exento de de suero a cada pocillo. Las placas se incubaron durante unas 2-3 horas adicionales a 37 °C, CO2 al 5% Se aspiraron los medios y los pocillos se llenaron con 0,2 ml de una solucion acuosa de isopropanol al 70% de vol., HCl 0,075 N y se agito suavemente hasta la disolucion del colorante de formazan (15-30 min). La densidad optica de las soluciones de formazan se determino usando un fotometro de microplacas a 540 nm. La viabilidad celular como % de control no tratado se calculo como la relacion de la densidad optica en los pocillos experimentales a la densidad optica en los pocillos que conteman celulas no tratadas, corregido para el fondo. Los datos se representaron graficamente con la concentracion del farmaco y la dosis de CI50 se estimo graficamente a partir de la interseccion de la curva de concentracion de viabilidad con la lmea de viabilidad del 50%.
Los resultados se presentan en la Figura 9. La dosis de farmaco resultante en un de inhibicion del crecimiento del 50% (CI50) para el topotecan libre o el topotecan liposomal no dirigido era superior a 30 pg/ml; para F5-topotecan inmunoliposomal, 0,15 pg/ml. Estos resultados son consistentes con los datos de captacion del farmaco dirigido.
Ejemplo 28. Estabilidad comparativa y farmacocinetica en plasma de topotecan inmunoliposomal-F5 y liposomal en ratones.
Los liposomas de topotecan con etiqueta de lfpido radioactivo [3H]-CHE a 1,5 mCi/mmol de fosfolfpido se prepararon siguiendo los Ejemplos 11 y 19 usando un procedimiento de mezcla-extrusion de solucion lfpida de etanol bajo las siguientes condiciones: solucion salina formadora de gradiente: de octasulfato de sacarosa de trietilamonio 0,643 N; extrusion por membrana de policarbonato: 15 pases por 2 filtros de PCTE apilados, 80 nm de tamano de poro; Carga de topotecan: relacion de entrada farmaco/fosfolfpido 350 mg/mmol (calculado para la base de topotecan libre); La conjugacion de F5 scFv se realizo como se describe en el Ejemplo 19. Los liposomas teman las caractensticas siguientes:
Tamano segun QELS: promedio en peso 101,2 nm; desviacion estandar, 20,1 nm.
Encapsulacion del farmaco: Liposomas de topotecan (Topo-Ls) 359,3±27,4 mg/mmol fosfoKpido; Inmunoliposomas de topotecanF5scFv (Topo-F5-ILs) 326,3±15,9 mg/mmol fosfolfpido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El estudio se realizo a nivel general como en el Ejemplo 22. Se inyecto a grupos de nueve ratones macho Swiss Webster (8-10 semanas de edad, 24-27 g) en la vena de la cola Topo-Ls, Topo-F5ILs o 1 mg/ml de una nueva preparacion de topotecan en solucion sin tampon, a una dosis de 5 mg de topotecan base por kg de peso corporal (equivalente a la dosis de ffpido de 14-16 pmol de fosfoffpido/kg de peso corporal). En los puntos temporales de 1 hora, 8 horas o 24 horas posteriores a la inyeccion, se desangraron 3 animales por punto temporal a traves de una puncion a corazon abierto con anestesia de ketamina/xilazina, la sangre se recogio en tubos que conteman PBS-EDTA, y se analizo el contenido de topotecan (fluorometna) y ffpido de liposoma (mediante recuento por centello de la radioactividad). Se calcularon las cantidades de dosis de farmaco y ffpido en sangre en los puntos temporales especificados a partir de la dosis administrada tomada suponiendo el 100% del volumen de sangre por animal como el 6,3% del peso corporal, y una fraccion de celula sangumea sedimentada del 45%. La cantidad de farmaco que quedaba encapsulado en los liposomas en cada punto temporal se calculo para cada animal individualmente comparando la relacion de radioactividad farmaco/ffpido de las muestras de plasma con las de los liposomas inyectados. La cantidad de topotecan libre en las muestras de plasma recogidas en la primera hora despues de la inyeccion era inferior al 1% de la dosis inyectada (de hecho, era inferior al ffmite de deteccion del metodo de analisis de los inventores); por lo tanto, los puntos temporales adicionales del grupo de topotecan libre no se estudiaron. Debido a la rapida depuracion en sangre y los niveles sangumeos bajos del topotecan libre, los inventores supusieron que esencialmente todo el topotecan encontrado en la sangre en todos los puntos temporales representa el topotecan encapsulado liposomalmente.
Los resultados se resumen en la Tabla 21 siguiente. Cabe destacar que los liposomas preparados siguiendo la presente descripcion conservaron el 79-85% de la carga del farmaco original incluso 24 horas despues de la inyeccion en el torrente sangumeo de los animales. Las diferencias entre los valores promedios en plasma del ffpido o el farmaco entre los grupos de liposomas e inmunoliposomas estaban en el intervalo de 1,8-13,6% y estaban cerca o comprendidos en el intervalo de errores del analisis. Las probabilidades de la hipotesis nula entre el grupo de liposomas e inmunoliposomas a nivel de valores de farmaco o ffpido en cada punto temporal, calculadas usando la prueba de la T de Student, estaban en el intervalo de 0,543-0,938. Los inventores concluyeron que las diferencias en los niveles en sangre residuales del farmaco o el ffpido entre las dos preparaciones eran insignificantes y no distinguibles a nivel estadfstico.
Tabla 21. Cantidades de ffpido liposomal, topotecan y topotecan que queda encapsulado en los liposomas en el plasma de los ratones en distintos puntos temporales despues de la inyeccion intravenosa.
Tiempo posterior a la inyeccion
Lfpido, % de dosis inyectada Farmaco, % de dosis inyectada Farmaco/ffpido, % de valor antes de la inyeccion
Topotecan liposomal conjugado con F5 (Topo-F5ILs):
1 hora
57,58±4,95 55,45±7,23 96,14±7,32
8 horas
35,37±3,84 34,18±5,87 96,31±11,92
24 horas
15,51±11,84 12,30±9,02 79,36±8,03
Topotecan liposomal (no conjugado) (Topo-Ls):
1 hora
58,88±9,51 57,63±9,45 97,90±5,29
8 horas
39,61±1,99 38,82±1,49 98,06±4,44
24 horas
15,84±3,85 13,45±2,64 85,25±7,03
Ejemplo 29. Eficacia antitumoral de topotecan liposomal y topotecan inmunoliposomal dirigido contra HER2 en el modelo de xenoinjerto BT-474.
En este estudio los inventores utilizaron los inmunoliposomas de topotecan del primer prototipo que emplean el gradiente de polifosfato de trietilamonio para la captura del farmaco. Los liposomas se prepararon generalmente siguiendo los metodos de los Ejemplos 11 y 19. Los componentes de la matriz ffpida - DSPC (Avanti Polar Lipids; 3 mol.), colesterol (Calbiochem, 98,3%; 2 mol.) y metoxi-PEG(2000)-DSPE (Avanti Polar Lipids, 0,015 mol.) se combinaron con etanol USB al 100% para proporcionar una solucion que contema fosfoffpido 0,5 mM a 60 °C. La solucion ffpida de etanol se diluyo a 60 °C con la solucion acuosa de polisfosfato de trietilamonio (trietilamina 0,608 M, fosfato 0,65 N, pH 6,1, osmolalidad 531 mmol/kg), se mezclaron exhaustivamente, y se extrudieron 10 veces a traves de 2 membranas de policarbonato apiladas con un tamano de poro de 100 nm (Nuclepore, Corning) usando un extrusor de presion de gas termostatizado (Lipex Biomembranes) a 60 °C. Los liposomas extrudidos se enfriaron en hielo y se extrajo el polifosfato de trietilamonio no encapsulado mediante cromatograffa de gel en Sepharose CL-4B usando la solucion tampon de dextrosa al 5%- hEpES 5 mM-Na, pH 6,5 como eluyente. El tamano del liposoma era de 103,8 ± 35,1 nm segun QELS. Los liposomas en esta solucion tampon se incubaron con clorhidrato de topotecan a 60 °C durante 30 minutos en una relacion de 0,35 mg de topotecan base por pmol de fosfoffpido. Al final de la incubacion, los liposomas se enfriaron en hielo y se realizo una cromatograffa en Sephadex G-75, eluyente HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5, para retirar el farmaco no encapsulado. El contenido de farmaco se determino mediante fluorometna y el contenido de ffpido por medio de un analisis de fosfatos como se ha explicado anteriormente. El topotecan liposomal obtenido de esta forma tiene una base de topotecan de 365,4±23,1 mg por mmol de fosfoffpido. Para preparar inmunoliposomas de topotecan dirigidos contra HER2, se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incubo una parte de esta preparacion de topotecan liposomal con el conjugado purificado de scFv F5 dirigido contra HER2 y el enlazador de maleimido-PEG-DSPE como se describe en el Ejemplo 19. En resumen, el conjugado F5- PEG-DSPE en una solucion acuosa de sacarosa al 10%- citrato de Na 10 mM, pH 6,5, se combino con liposomas de topotecan en una relacion de 15 mg de protema por mmol de fosfolfpido de liposoma, y se incubo a 60 °C durante 30 min. La mezcla de incubacion se enfrio en hielo y se realizo una cromatograffa en Sefarosa CL-4B, eluyente HEPES 20 mM-Na, NaCl 135 mM, pH 6,5, para retirar todo el conjugado scFv no incorporado. La relacion farmaco- a-lfpido se redujo en un 14% despues de esta incubacion adicional.
Las formulaciones de inmunoliposomas y liposomas de topotecan con 1-2 mg/ml de topotecan se pasaron por un filtro de jeringa esteril de 0,2 micrometros, se dispensaron asepticamente en viales de polipropileno y se almacenaron a 4-6 °C durante hasta 1 mes antes del uso.
El topotecan libre se preparo de nuevo disolviendo polvo de clorhidrato de topotecan a 2 mg/ml en dextrosa al 5% y se esterilizo pasando la solucion por un filtro de jeringa de 0,2 micrometres.
Se establecio un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de mama humano BT-474 con sobreexpresion de HER2 como se describe en el Ejemplo 10. En el dfa 13 despues de la inoculacion del tumor, los animales que teman tumores en el intervalo de 120-350 mm cubicos se seleccionaron y aleatorizaron en 3 grupos de tratamiento y 1 grupo de control de 12 animales cada uno. En los dfas 14, 18 y 21 despues de la inoculacion del tumor los ratones se trataron con inyecciones intravenosas (vena de la cola) de formulaciones de topotecan en la dosis por inyeccion de 5 mg/kg de peso corporal, o con un volumen equivalente de solucion salina fisiologica. El estado de salud general de los animales se controlo todos los dfas. Los tamanos de los tumores y los pesos corporales se controlaron dos veces a la semana hasta el dfa 53 despues de la inoculacion del tumor. Los animales cuyos tumores alcanzaron el 20% del peso corporal, o aquellos con una perdida de peso progresiva igual o superior al 20% fueron sometidos a eutanasia.
Las Figuras 11 y 12 muestran el crecimiento tumoral y los datos sobre peso corporal en animales, respectivamente. Las formulaciones de topotecan liposomal fueron mas activas en la supresion de crecimiento tumoral que el farmaco libre, y la formulacion liposomal de dirigida a F5 fue mas activa que la no dirigida. Los tamanos medios tumorales al final del periodo de observacion eran significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (valores p de la prueba de la T de Student bilateral sin correspondencia fueron 1,2x10'6 para farmaco libre vs. farmaco inmunoliposomal, 0,000114 para farmaco libre vs. farmaco liposomal y 0,00718 para farmaco liposomal vs. farmaco inmunoliposomal). Por tanto, el topotecan encapsulado liposomalmente era mas activo que el farmaco libre, y el topotecan inmunoliposomal dirigido contra HER2 era mas activo que el farmaco liposomal no dirigido. En el grupo liposomal e inmunoliposomal, despues de la regresion inicial, se produjo un recrecimiento del tumor en los 10 dfas posteriores al ultimo tratamiento. No se produjo regresion tumoral en el grupo de farmaco libre. Se observo que las formulaciones liposomales de topotecan a una dosis espedfica eran mas toxicas que el farmaco libre. Se produjo toxicidad gastrointestinal. Los animales que recibieron topotecan liposomal desarrollaron diarrea y sufrieron una perdida de peso corporal media aproximadamente del 14% en su maximo. Mientras que en el grupo liposomal no dirigido, los animales se recuperaron, excepto uno (12,5%) que sufrio perdida de peso corporal persistente del 15% al final del estudio, en el grupo dirigido a F5 cinco animales (41,6%) desarrollaron morbilidad terminal y murieron; y dos mas (16,7%) sufrieron perdida de peso persistente de aproximadamente15% En el grupo de control y en el grupo de farmaco libre, no se produjo perdida de peso ni morbilidad relacionada con el tratamiento.
Ejemplo 30. Dosis maxima tolerada (MTD) de topotecan libre y liposomal en ratones a los que se administro 3 inyecciones intravenosas a la semana.
En este estudio se empleo una formulacion de topotecan liposomal preparada como en el Ejemplo 29, excepto la solucion de polisfosfato de trietilamonio que se sustituyo por una solucion de octasulfato de sacarosa de trietilamonio con trietilamonio 0,65 M, pH 6,2; y para la extrusion se emplearon filtros de membrana de policarbonato de 80 nm en lugar de 100-nm. El tamano del liposoma ponderado en volumen determinado por el metodo de dispersion de luz cuasi-elastica en la aproximacion gaussiana (QELS) era de 95,1±19,6 nm (promedio±SD); la relacion farmaco/lfpido era de 369,1±18,3 mg/mmol de fosfolfpido. Ratones hembra Swiss- Webster de cinco-seis semanas de edad (18-20 g) en grupos de dos y recibieron tres inyecciones intravenosas (vena de la cola) de topotecan libre o liposomal en un calendario de una vez a la semana, empezando con una dosis de 2 mg/kg de topotecan base por inyeccion y aumentando hasta cada grupo posterior en un factor de 1,8 hasta la dosis de 37,8 mg/kg. El topotecan inmunoliposomal no se incluyo en este estudio. El peso corporal de los animales y su estado de salud general se supervisaron todos los dfas. Una perdida de peso progresiva de mas del 20% o la muerte natural en cualquier momento en cualquiera de los dos grupos durante los diez dfas posteriores al inicio del tratamiento se consideraron indicativos de una dosis toxica. Segun los datos sobre peso y mortalidad animal, se determino que MTD estaba comprendido en el intervalo de 11,7-21 mg/kg para topotecan libre y de 2,0-3,6 mg/kg para topotecan liposomal (Prototipo 2). En el segundo estudio, los ratones recibieron inyecciones de topotecan libre, liposomal o F5-inmunoliposomal (preparado a partir del topotecan liposomal de este Ejemplo como se describe en el Ejemplo 29) con dosis que van de 2,0 mg/kg (topotecan liposomal/inmunoliposomal) o 12 mg/kg (topotecan libre), y se aumento a cada grupo posterior en el factor de 1,15 hasta alcanzar la siguiente dosis en el intervalo superior del intervalo de MTD establecido. La dosis mas alta que no provoco la muerte o la morbilidad terminal en ningun animal se considero como una MTD y se determino
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en 18,4 mg/kg para topotecan libre, 3,0 mg/kg para topotecan liposomal y 3,0 mg/kg para topotecan inmunoliposomal. Por lo tanto, el topotecan liposomal mostro una mayor toxicidad que el farmaco libre.
Ejemplo 31. Eficacia antitumoral de topotecan liposomal en el modelo de xenoinjerto BT-474 en el intervalo de 0,125-1,0xMTD
En este estudio se han usado liposomas de topotecan e inmunoliposomas F5 del Ejemplo 30. Se obtuvieron xenoinjertos subcutaneos BT 474 en ratones lampinos como se explica en el Ejemplo 29. En el dfa 18 despues de la inoculacion de celulas tumorales, los animales con tumores (105-345 mm cubicos, promedio de aproximadamente 200 mm cubicos) se aleatorizaron en grupos de tratamiento de 6 animales/grupo, y un grupo de control de 8 animales/grupo. Los animales recibieron topotecan libre o liposomal a 1xMTD, 0,5xMTD, 0,25xMTD o 0,125xMTD en tres inyecciones intravenosas (vena de la cola) en los dfas 19, 23 y 27 despues de la inoculacion del tumor. El grupo de control recibio inyecciones de solucion salina fisiologica. Los tamanos tumorales y los pesos corporales de los animales se controlaron como en el Ejemplo 29. Para obtener mediciones del peso corporal de los animales, el peso del tumor (calculado a partir del tamano del tumor y suponiendo una densidad tumoral de 1,0) se sustrajo de las mediciones del peso total de los animales. Todas las formulaciones de farmacos en MTD mostraron actividad antitumoral (Figuras 13A-13D). No hubo una diferencia significativa en la eficacia entre el farmaco libre y liposomal proporcionada en su MTD respectivo o en fracciones identicas (1/2, 1/4 o 1/8) del mismo. Por ello, la encapsulacion liposomal del farmaco usando el gradiente TEA-SOS genero un aumento de aproximadamente 6 veces del gradiente TEA-SOS en la actividad antitumoral, pero tambien un aumento similar en la toxicidad del farmaco. La dinamica de pesos corporales en los animales desvelo que todos los tratamientos eran no toxicos, excepto el tratamiento con topotecan libre en MTD que mostro una reduccion transitoria en el peso corporal (aproximadamente del 15% del valor previo al tratamiento) que se resolvio posteriormente (Figura 14).
Ejemplo 32. Preparacion y citotoxicidad in vitro dirigida de los liposomas de topotecan preparados usando el metodo de captura del octasulfato de sacarosa de trietilamonio.
El topotecan liposomal se preparo generalmente siguiendo el procedimiento del Ejemplo 18, usando la solucion capturada de TEA-SOS con tEa 643 mM, pH 5,7, osmolalidad de 530 mmol/kg y una relacion farmaco/fosfolfpido de 170 mg/mmol. Los liposomas teman un 155 mg farmaco/mmol de fosfolfpido; 90% de eficacia de carga y tamano de partfcula de 105 nm. Estos liposomas se incubaron con la solucion micelar del conjugado F5-PEG- DSPE a unos 30 scFv por liposoma (15 mg anticuerpo/mmol fosfolfpido) a 60 °C durante 1 hora generalmente como se describe en el Ejemplo 19. Los liposomas conjugados a anticuerpos se separaron mediante SEC usando Sefarosa CL-4B y se formularon en solucion salina tamponada HBS-6,5 HEPES. No hubo ningun cambio detectable en la relacion farmaco/lfpido durante la union del scFv (F5) dirigida contra HER2.
La captacion de las formulaciones de topotecan por parte de las celulas cancerosa se determino de la forma siguiente. Las celulas de adenocarcinoma de mama humano con una sobreexpresion de HER2 (SK-Br-3, ATCC HTB-30) se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 150.000 celulas/pocillo y se dejaron aclimatar durante la noche. Las celulas se incubaron (por triplicado) con topotecan liposomal dirigido a F5 y no dirigido a F5 en medio de cultivo completo en las concentraciones liposomales de 0,1 mM y 0,01 mM durante 4 horas a 37 °C. Las celulas se aclararon 4 veces con solucion salina equilibrada de Hank, se solubilizaron en Triton X-100 al 0,1% - mezcla de isopropanol acidificado al 70% 1:10, y se determino la cantidad de topotecan asociada a celula por pocillo mediante fluorometna. Los resultados (error medio ± error estandar) se resumen en la Tabla 22. Los liposomas dirigidos suministraron de 100 a 300 veces mas farmaco en las celulas diana que en los liposomas no dirigidos.
Tabla 22. Captacion de topotecan liposomal por las celulas de carcinoma de mama SK-Br-3.
Formulacion
Captacion de topotecan en fosfolfpido 0,1 mM, ng/pocillo Captacion de topotecan en fosfolfpido 0,01 mM, ng/pocillo
Liposoma no dirigido
4,76 ± 0,24 0,607 ± 0,088
Liposoma dirigido contra HER2
533,8 ± 13,7 197,0 ± 4,6
Relacion: Dirigido/No dirigido
112,1 ± 8,6 324 ± 55
La citotoxicidad de estas formulaciones de topotecan contra las celulas de cancer de mama SKBr-3 se determino como se describe en el Ejemplo 27. Las celulas SKBr-3 se inocularon en placas de 96 pocillos a 5000 celulas/pocillo, se dejaron aclimatar durante la noche, y se incubaron con concentraciones crecientes (0,00430 |jg/ml) de topotecan libre, liposomal o inmunoliposomal F5 en un medio de cultivo celular durante 4 horas a 37 °C. Se eliminaron los medios que conteman el farmaco y se dejo que las celulas creciesen en el medio exento de farmaco durante 72 horas. La cantidad de celulas viables por pocillo se determino usando un analisis de tetrazolio Thiazolyl Blue (MTT) y se expreso como % de celulas de control (no tratadas). Los resultados se enumeran en la Figura 10. Los inmunoliposomas de topotecan eran mas citotoxicos (CI50 0,15-0,5 jg/ml) que los liposomas de topotecan no dirigidos (CI50 s 3,1. jg/ml) y el topotecan libre (CI50 s 2,3 jg/ml)
Ejemplo 33. Estabilidad in vivo de liposomas de topotecan de distintos tamanos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los liposomas que conteman TEA-Pn se prepararon como se indica en el Ejemplo 22 usando extrusion 12 veces a traves de membranas de policarbonato de tamano de poro 100 nm o adicionalmente 12 veces a traves de membranas de policarbonato de tamano de poro 50 nm. Se anadio topotecan (TPT) en una relacion de 150 |jg /jmol fosfoKpido. La carga se completo a 58 °C durante 45 min en un bano de agua caliente, seguido de un proceso de inactivacion en hielo. La eficacia de carga para el liposoma extrudido de 50-nm- y 100-nm era de 126,80 ± 19,24 jg TPT/jmol PL (84,5 ± 12,8%) y de 148,48 ± 10,26 jg TPT/jmol PL (99,0 ± 6,8%), respectivamente. Los ratones hembra Swiss Webster en los grupos de tres se inyectaron intravenosamente con una de las dos formulaciones de Ls-TPT a una dosis de 5 mg de TPT/kg. Los ratones se sacrificaron despues de 6 horas y se recogio su sangre. Se analizo el plasma para detectar el TPT y el ffpido liposomal como se describe en el Ejemplo 22. Los resultados se presentan en la Tabla 23.
Tabla 23. Estabilidad in vivo de Ls-TPT de distintos tamanos cargados usando el metodo de captura de TEA-Pn.
Tamano de liposoma, nm
Farmaco en plasma, % de dosis inyectada Lfpido liposomal en plasma, % de dosis inyectada Relacion farmaco/ffpido, % de valor antes de la inyeccion
74,2 ± 21,6
32,93 ± 1,97 45,7 ± 2,2 72,06 ± 5,51
96,4 ± 29,3
33,26 ± 3,56 37,6 ± 5,3 88,41 ± 15,68
Ejemplo 34. Sntesis y encapsulacion de liposomas de 6-(3-aminopropil) elipticina (6-APE).
Se preparo 6-(3-aminopropil)elipticina se preparo a partir de elipticina en un metodo de dos etapas basado en el procedimiento de Werbel y col., J. Med. Chem. 1986, v. 29, pag. 1321-1322. Se agitaron 501,4 mg de elipticina base (NSC 71795) (Aldrich Chemical Co.) con aproximadamente 100 mg de hidruro de sodio (Sigma; se lavaron con eter de petroleo anhidro) en 5 ml de dimetilformamida seca (DMF) a temperatura ambiente durante 30 min. A esta mezcla, se anadio gota a gota una solucion de 678 mg de N-bromopropilftalimida (Aldrich) en 2 ml de DMF seco. La mezcla de reaccion de color morado se agito durante la noche bajo argon, se titulo con 1 ml de agua y se vertio en 60 ml de agua. Esta mezcla se extrajo dos veces con 25 ml de cloruro de metileno, el extracto de seco sobre sulfato de sodio anhidro y se paso a traves de una capa de alumina neutra. La capa de alumina se aclaro dos veces con 10 ml de cloruro de metileno y el filtrado combinado y los aclarados se secaron al vado. El producto se agito durante la noche con 20 ml de etanol absoluto y 2 ml de hidrazina anhidra a temperatura ambiente. La suspension obtenida se filtro al vado, se diluyo el filtrado de color amarillo con 50 ml de NaOH 0,2 N y se extrajo con dos porciones (75 ml y 50 ml) de cloroformo. El extracto de cloroformo se seco con Na2SO4 y se llevo a sequedad al vado. Se realizo una cromatograffa del producto bruto (rendimiento 408 mg) en una columna de sflice 60 eluida isocraticamente con una mezcla de cloroformo-metanol (7:3 en volumen), saturada con trimetilamina seca. Las fracciones se eluyeron en una segunda banda de color amarillo, despues que la elipticina no reaccionara, paredan contener el compuesto deseado con aproximadamente un rendimiento del 30%. La estructura se confirmo mediante RMN -1H-. TLC: Rf 0,29-0,31 (sflice 60; CHCb-MeOH 7:3 en volumen, saturado con trimetilamina). Elipticina, Rf 0,81-0,83. El compuesto obtenido se convirtio en sal de diclorhidrato disolviendo en etanol antffdrido y titulando con la solucion de HCl 6 Nen isopropanol seco. Los cristales de color naranja de diclorhidrato de 6-APE (NSC 176328) se filtraron, se aclararon con eter, y se secaron al vado. Rendimiento del diclorhidrato 86%.
Los liposomas se prepararon mediante la hidratacion de la peffcula ffpida bruta de DSPC, colesterol y PEG(P.m. 2000)-DSPE (3:2:0,015 de relacion molar) en una solucion de polifosfato de trimetilamonio (TMA-Pn) a TMA 0,5 M, pH 5,6, a 60 °C, seguido de seis ciclos de congelacion rapida (-78 °C) y descongelacion (60 °C), y extrusion diez veces a traves de filtros de policarbonato de tamano de poro 50 nm apilados. El TMA-Pn no encapsulado se elimino usando una columna de Sefarosa CL-4B eluida con HEPES-Dextrosa (HEPES 5 mM, 5% Dextrosa, pH 5,5). El tamano del liposoma era de 85,7 ± 32,1 nm.
Se anadio solucion 6-APE concentrada (10 mg/ml) a los liposomas que conteman TMA-Pn con una relacion farmaco-fosfoffpido de 100 jg de APE/jmol fosfoffpido, la mezcla se incubo a 58 °C durante 45 min y se enfrio rapidamente en hielo durante 15 min. El farmaco no encapsulado se extrajo mediante cromatograffa en gel en una columna Sephadex G-75 eluida con la solucion tampon HEPES-Dextrosa (HEPES-Na 5 mM, dextrosa al 5%, pH 6,5). A continuacion, se cuantifico el APE capturado en el liposoma mediante espectrofotometna como en el Ejemplo 71 y el fosfoffpido liposomal se determino usando el analisis de extraccion del Ejemplo 70. La encapsulacion del farmaco fue practicamente cuantitativa.
Ejemplo 35. Preparacion de 6-APE inmunoliposomal dirigido contra HER2 y citotoxicidad in vitro de las formulaciones 6-APE frente a celulas de cancer de mama BT-474 con una sobreexpresion de HER2.
Se prepararon liposomas con 6-APE encapsulado (Ls-APE) como en el Ejemplo 34 anterior. Se prepararon inmunoliposomas dirigidos contra HER2 con 6-APE encapsulado (F5-ILs-APE) a partir de Ls-APE usando el metodo del Ejemplo 19. Se utilizo un analisis de viabilidad celular basado en MTT del Ejemplo 27 para determinar la citotoxicidad de 6-APE administrado como una solucion, Ls-APE o como F5-ILs-APE dirigido contra HER2 frente a celulas de cancer de mama humano con una sobreexpresion de HER2 (BT-474). Las celulas se expusieron al medio que contema el farmaco durante 6 horas y posteriormente se incubaron en un medio exento de farmaco durante 3 dfas. Los resultados se muestran en la Figura 15. La CI50 para APE libre es de 0,26 jg de APE/ml, para F5-ILs-APE era de 0,756 jg de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
APE/ml, y para Ls-APE no dirigido era 51,0 |jg de APE/ml. Hubo una diferencia de 67,5 veces en la actividad entre el 6- APE liposomal dirigido y no dirigido, lo que indicaba un efecto de suministro dirigido considerable.
Ejemplo 36. Formulaciones inmunoliposomales dirigidas a EGFR de 6-APE y citotoxicidad frente a celulas de cancer in vitro.
Se prepararon liposomas cargados con 6-APE como se explica en el Ejemplo 34. Se prepararon inmunoliposomas dirigidos contra EGFR uniendo fragmentos de anticuerpos Fab' espedficos de EGFR de la forma siguiente. Se digirio un IgG MAb C225 (cetuximab, ERBITUX™, Imclone Systems) espedfico de EGFR con pepsina para producir fragmentos (Fab')2. Se redujeron los fragmentos purificados (Fab')2 mediante el tratamiento con 2-mercaptoetilamina 10-20 mM durante 15 min a 37 °C, y los fragmentos Fab' se purificaron mediante filtracion en gel usando Sephadex G-25. La presencia de grupos tioles reactivos era normalmente de aproximadamente 0,9 grupos tioles por molecula de protema (cuantificados usando el reactivo de Ellmann). C225Fab' se conjugo covalentemente a un enlazador anfifflico Mal-PEG-DSPE (Avanti Polar Lipids, AL) en solucion acuosa a un valor de pH 6,2-6,5 y una relacion molar protema-enlazador de 1:4 durante 2-4 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4-6 °C, para producir el conjugado C225Fab'-PEG-DSPE con un rendimiento del 30-50% de la protema. Este conjugado formador de micelas se separo de la protema no reaccionada realizando cromatograffa en columna de exclusion por tamanos en gel con perlas de agarosa al 3% - poliacrilamida al 4% (Ultrogel AcA34, obtenidas de Sigma Chemical Co.), eluidas con solucion tampon HBS-6,5. El conjugado se recupero en fracciones de volumen vado. Se formo 6-APE inmunoliposomal incubando estos liposomas con C225 Fab'-PEG-DSPE con liposomas cargados con farmaco en la relacion de 30 mg C225 protema/mmol de fosfolfpido de liposoma durante 30 min a 60 °C, inactivando en hielo durante 15 min, y purificando los inmunoliposomas por medio de cromatograffa en gel en una columna Sepharose CL-4B tambien eluida con solucion tampon HBS-6,5 (los liposomas aparecen en o cerca del volumen vado de la columna).
Se cultivaron celulas de cancer de mama humano MDA-MB-468 con una sobreexpresion de EGFR y celulas de cancer de mama humano MCF-7 con una baja expresion de EGFR (ATCC, Rockville, MD) en sus medios de cultivo recomendados por el proveedor, y se estudio la citotoxicidad de 6-APE libre, liposomal e inmunoliposomal dirigido contra EGFR frente a estas celulas siguiendo el metodo del Ejemplo 27. Las celulas se incubaron con medios que conteman el farmaco durante 6 horas, seguido de 3 dfas de incubacion posterior en el medio exento de farmaco. Los resultados se muestran en la Figura 16. En celulas MDA-MB-468 la CI50 para 6-APE libre era de aproximadamente 0,1 jg/ml y para C225-ILs-APE de aproximadamente 0,9 jg/ml. En celulas MCF-7 la CI50 era aproximadamente de 0,1 para 6-APE libre era aproximadamente de 0,5 jg/ml y para C225-ILs-APE era aproximadamente de 14 jg/ml. La CI50 de Ls-APE en ambas lmeas celulares era >30 jg/ml. Por ello, los inmunoliposomas cargados con 6-APE dirigidos contra EGFR demostraron una actividad citotoxica espedfica de antfgenos en celulas de cancer de mama MDA-MB-468 con una sobreexposicion de EGFR, pero no en celulas de cancer de mama MCF-7 que no tienen una sobreexpresion de EGFR. En celulas MCF-7, los liposomas 6-APE dirigidos y no dirigidos eran igualmente activos.
Ejemplo 37. Farmacocinetica de 6-APE liposomal en ratas.
Los liposomas con solucion TEA-Pn capturada (grupos fosfato 557 mM, TEA 500 mM, pH 5,8, osmolalidad 480 mmol/kg) y composicion lfpida de DSPC, colesterol y PEG-DSPE (relacion molar 3:2:0,015) se prepararon como en el Ejemplo 11 anterior. La solucion etanolica de los lfpidos se combino a 60 °C con 10 volumenes de la solucion acuosa de TEA-Pn y se extrudio diez veces a traves de dos membranas de policarbonato de tamano de poro 80 nm apiladas. El TEA-Pn no encapsulado se extrajo usando una columna de Sefarosa CL-4B eluida con MES-Dextrosa (MES-Na 5 mM, Dextrosa al 5%, pH 5,5). El tamano del liposoma era de 92,3 ± 23,3 nm segun QELS. Se incluyo una etiqueta lfpida radioactiva no intercambiable [3H]-CHE en la matriz lfpida a 0,5 mCi/mmol de fosfolfpido. Los liposomas se cargaron con 6-APE como se describe en el Ejemplo 34.
El estudio de farmacocinetica siguio el protocolo del Ejemplo 9. Se inyecto a ratas hembra Sim Albino (9 semanas, 200 g) intravenosamente con una dosis de 10 mg de 6-APE/kg. La sangre se recogio en los puntos temporales prescritos y el plasma se analizo para detectar el nivel de 6-APE mediante fluorometna. Las almuotas de plasma (0,05-0,2 ml) se mezclaron con 1-2 ml de isopropanol acuoso al 90%- HCl al 0,1 N, y el 6-APE se cuantifico mediante fluorescencia como en el Ejemplo 71. El lfpido se cuantifico a traves del recuento de radioactividad [3H]-CHE por centelleo.
Los resultados se muestran en la Figura 17. La semivida en sangre (ti/2) del farmaco era de 13,7 horas y la del lfpido liposomal era de 16,6 horas (panel A). La semivida de la liberacion del farmaco de los liposomas era de 77,9 horas, demostrando una estabilidad de encapsulacion remarcable (panel B).
Ejemplo 38. Sntesis y encapsulacion liposomal de 2-(2-(N,N-dietilamino)etil)elipticina (2-DAE).
Cloruro de 2-(2-(N,N-dietilamino)etil-elipticina (NSC 359449) es un derivado anti-cancengeno de la elipticina que se prepara mediante alquilacion de elipticina con 2-(N,N-dietilamino)etilcloruro en metano en presencia del trietilamina (consulte Werbel, L.M., Angelo, M., Fry, D.M., and Worth, D.F. J. Med. Chem. 1986, 29:1321-1322). Se prepararon liposomas que conteman TEA-Pn capturado como se describe en el Ejemplo 37. 2-DAE.2HCl se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incubo con los liposomas TEA-Pn en HEPES-Na 5 mM, Dextrosa al, 5% pH 7,4, en una relacion de 2-DAE-a- fosfoKpido de 100 pg/pmol. La cantidad de farmaco cargado era de 88,2 |jg de APE/pmol de PL (eficacia 88,2%).
Ejemplo 39. Farmacocinetica de 2-DAE liposomal en ratas.
Se estudio la farmacocinetica en sangre de 2-DAE liposomal (Ejemplo 38) en ratas como en el Ejemplo 37. La ti/2 de 2-DAE fue de 17,8 h y de la matriz del lfpido de liposoma, 18,2 h (A). La semivida de liberacion del farmaco desde los liposomas en la sangre era ti/2 = 677 h (B). Por ello, estos liposomas eran extraordinariamente estables frente a fugas de farmaco en el torrente sangumeo.
Ejemplo 40. Carga de vinorelbina en liposomas usando el metodo TEA-Pn. Efecto del pH.
Los liposomas se prepararon mediante el metodo de inyeccion de etanol como en el Ejemplo 11 usando una solucion TEA-Pn de TEA 0,608 M, grupos fosfato 0,65 M, pH 6,1 y una osmolalidad de 531 mmol/kg, y extrusion en suspension lfpida 15 veces usando dos filtros de membrana de policarbonato de tamano de poro 100 nm apilados. El tamano del liposoma resultante era de 108,3 ± 17,1 nm segun QELS con Vinorelbina (VRB) en forma de 10 mg/ml de solucion madre de bitartrato de vinorelbina USP anadida a los liposomas en una solucion acuosa de HEPES-Na 5 mM, dextrosa al 5%, pH 6,5, en una relacion farmaco-fosfolfpido de 350 pg/pmol. El pH se ajusto al valor deseado usando NaOH 1-5 N y la mezcla se incubo a 58±2 °C durante 30 min. A continuacion, la mezcla se enfrio en hielo durante 15 min, y el farmaco no encapsulado se elimino mediante cromatograffa de filtracion en gel con Sephadex G-75, eluyendo con solucion tampon HBS-6,5 (HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5). Posteriormente, se solubilizaron alfcuotas de liposomas purificados en isopropanol acido y se analizaron para detectar el nivel de vinorelbina usando espectrofotometna a 270 nm. El fosfolfpido de liposoma se cuantifico usando el analisis de fosfatos de Bartlett (1959) despues de la extraccion de metanol-cloroformo.
Las relaciones farmaco-lfpido calculadas despues de la carga se muestran en la Tabla 24. La carga de vinorelbina era cuantitativa (es dear, practicamente del 100%) e independiente del pH en el intervalo estudiado.
Tabla 24. Carga de vinorelbina en los liposomas con TEA-Pn capturado a distintos valores de pH de solucion tampon externa
pH
Relacion farmaco-a-fosfolfpido (pg/pmol) Eficacia de carga (%)
4,5
351,2 ± 52,88 100,4 ± 15,2
5,0
347,6 ± 6,35 99,3 ± 1,8
5,75
355,2± 11,2 101,5 ± 3,2
6,25
377,0 ± 21,5 107,7 ± 6,6
7,0
374,3 ± 29,58 106,9 ± 9,0
Ejemplo 41 Vinorelbina liposomal preparada usando el metodo TEA-Pn en diversas relaciones farmaco/l^pido: eficacia de encapsulacion y estabilidad in vivo en ratones.
Se prepararon liposomas con solucion TEA-Pn capturada segun el Ejemplo 40 excepto en que se incluyo [3H]-CHE en la matriz lfpida a 1,5 mCi/mmol de fosfolfpido. El tamano del liposoma era de 98,5 ± 34,3 nm segun QELS. Los liposomas se mezclaron con bitartrato de vinorelbina USP en solucion tampon acuosa de HEPES-Na 5 mM, dextrosa al 5%, pH 6,5 en la relacion farmaco-a-fosfolfpido de 150-450 mg de VRB/mmol, y se incubo a 58±2 °C durante 30 min. No se realizaron ajustes del pH despues de la adicion del farmaco. Los liposomas cargados con vinorelbina (Ls-VRB) se aislaron y analizaron para conocer el contenido de farmaco y fosfolfpido como en el Ejemplo 40.
Se inyecto a seis ratones hembra Swiss Webster (Harlan Bioresearch) de cinco a seis semanas de edad en grupos de tres intravenosamente con Ls-VRB-Pn a una dosis de 5 mg VRB/kg. La dosis de lfpido vario en funcion del grado de carga y puede determinarse a partir de las proporciones de farmaco-a-lfpido calculadas anteriormente. 8 horas o 24 horas despues de la inyeccion, los animales se anestesiaron y desangraron, y la sangre se recogio en tubos pesados, en hielo que conteman cantidades conocidas de PBS con EDTA al 0,04%. Las celulas sangumeas se separaron mediante centrifugacion, y los sobrenadantes se analizaron para conocer el nivel de lfpido liposomal por medio recuento de radioactividad [3H]-CHE por centelleo y para conocer el nivel de vinorelbina usando HPLC de la forma siguiente. Las muestras se enriquecieron con vinblastina (patron interno), se extrajeron con eter dietilico, se evaporaron y los residuos se disolvieron en la fase movil consistente en una solucion acuosa de acetato de trietilamonio 50 mM (pH 5,5) y acetonitrilo (58:42 en volumen). Las muestras se cargaron en una columna de sflice de fase inversa C18 (columna Supelco C-18, 250 mm x 4 mm de D.I., tamano de partfcula de 5 pm) precedida por una columna de proteccion C-18. La columna se eluyo isocraticamente con la fase movil anterior a un caudal de 1,0 ml/min. VRB se detecto usando un detector de absorbancia a 280 nm. Los tiempos de retencion tfpicos para VRB y vinblastina (patron interno) eran de 9,1 min y 7,8 min, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los resultados se muestran en la Tabla 25. La eficacia de carga se redujo con el aumento en la relacion farmaco/Kpido, de practicamente 100% a 150 mg/mmol a aproximadamente 66% a 450 mg/mmol. Se observo que la adicion de bitartrato de vinorelbina en las relaciones de mas de 250 mg de vinorelbina por mmol fosfoKpido provocaba una acidificacion sustancial de la suspension de liposoma (pH <4,0) que conduce, a una eficacia de carga reducida. Por ello, se determino la necesidad de controlar el pH durante la etapa de carga del farmaco. Las cantidades de matriz de liposoma detectadas en la sangre despues de 8 horas estaban en el intervalo de 30,4 ± 6,6% de la dosis inyectada (% de D.I.) a 38,6 ± 5,2% de D.I. sin relacion aparente con la cantidad absoluta de lfpido inyectado. Despues de 24 horas segrna habiendo del 6,4% de D.I. a 14,8% de D.I. de la matriz lfpida detectable en la sangre. La cantidad de farmaco que quedaba encapsulado despues de 8 horas variaba del 37% al 63%. Sin embargo, 24 horas despues de la inyeccion, los niveles de farmaco despues de la inyeccion disminuyeron por debajo del lnmite de deteccion del metodo analftico empleado.
Tabla 25. Eficacia de encapsulacion y la retencion del farmaco in vivo de la vinorelbina liposomal preparada en distintas relaciones farmaco/lfpido usando el metodo TEA-Pn (sin ajustar el pH de la solucion tampon de carga). Los datos sobre retencion del farmaco son promedios ± SD (N=3).
Relacion vinorelbina/fosfolfpido % de farmaco que permanece encapsulado
________________________________________ 8 horas despues de la inyeccion
Entrada, mg/mmol, calculada
Salida, mg/mmol, medida Eficacia de encapsulacion, %
150
156 104,0 36,6 ± 4,2
250
238 95,2 56,3 ± 1,3
350
260 74,3 65,9 ± 2,3
450
299 66,4 63,0 ± 4,1
Ejemplo 42. Carga de vinorelbina en los liposomas usando el metodo TEA-SOS en distintas proporciones de farmaco/l^pido.
Los liposomas TEA-SOS para la carga del farmaco se prepararon como en el Ejemplo 40 excepto que se utilizo solucion TEA-SOS con TEA 0,65 M, pH 5,4, osmolalidad 521 mmol/kg en lugar de la solucion TEA-Pn y los liposomas se extrudieron a traves de membranas de policarbonato con un tamano de poro de 80 nm. El tamano del liposoma era de 86,6 ± 12,9 nm segun QELS. Se anadio VRB a los liposomas en solucion acuosa de HEPES-Na 5 mM, Dextrosa al 5%, pH 6,5, en distintas relaciones farmaco-a-fosfolfpido, y la mezcla se incubo posteriormente a 60 °C durante 30 min. A continuacion, los liposomas cargados con VRB se aislaron y analizaron como en el Ejemplo 40.
Las relaciones farmaco-a-lfpido calculadas en los liposomas VRB se muestran en la Tabla 26. Cabe destacar, contrariamente a la carga asistida por anion polimerico, que la carga de vinorelbina en los liposomas con azucar polianionizado (octasulfato de sacarosa) era practicamente cuantitativa independientemente de la relacion farmaco-lfpido para hasta 450 mg VRB/mmol de fosfolfpido, y solo ligeramente inferior (88%) a 550 mg de VRB/mmol de fosfolfpido.
Tabla 26. Dependencia de la carga de vinorelbina en los liposomas en la proporcion farmaco-a-lfpido.
Relacion de vinorelbina/fosfolfpido, mg/mmol
Eficacia de carga (%)
Total
Encapsulado en liposomas
150
159,9 ± 11,5 106,6 ± 8,1
250
255, ± 12,4 102,2 ± 5,1
350
381,8 ± 16,3 109,1 ± 5,1
450
456,1 ± 29,5 101,4 ± 6,6
550
486,2 ± 26,0 88,4 ± 4,2
Ejemplo 43. Preparacion de inmunoliposomas dirigidos contra HER2 cargados con vinorelbina mediante el metodo TEA-Pn, y farmacocinetica en sangre comparativa de liposomas de vinorelbina dirigidos contra HER2 y no dirigidos contra HER2 en ratas.
Se preparo el conjugado scFv F5-PEG-DSPE dirigido contra HER2 como en el Ejemplo 19. Se prepararon inmunoliposomas de vinorelbina dirigidos contra HER2 mediante incubacion de liposomas de vinorelbina no dirigida (Ejemplo 41, cargados en la relacion farmaco-fosfolfpido de 350 mg/mmol) con el conjugado F5-PEG-DSPE (Ejemplo 19) en solucion acuosa de HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5 en la relacion farmaco-lfpido de 15 mg/mmol a 60 °C durante 30 min. El conjugado F5 no incorporado se elimino mediante cromatograffa en gel en una columna Sepharose 4B eluida con la misma solucion tampon. Se administraron liposomas no dirigidos (Ls-Pn- VRB) y otros dirigidos contra HER2 (F5-ILs-Pn-VRB) por via intravenosa a ratas Albino hembras (8-9 semanas de edad; 200 g) a una dosis de 5 mg VRB/kg. En varios puntos temporales, se recogio sangre como se describe en el Ejemplo 9, y se analizo para detectar el nivel de VRB y lfpido de liposoma como en el Ejemplo 41. La semivida en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
sangre de los Ifpidos de liposomas y el 50% de tiempo de liberacion del farmaco se calcularon a partir de graficos de concentracion-tiempo del lfpido o graficos de relacion farmaco/Upido-tiempo, respectivamente, encontrando la mejor configuracion para la cinetica exponencial utilizando la funcion TREND de la hoja de calculo de MICROSOFT EXCEL (Microsoft Corp.). Los resultados (Figura 18) indicaron que los liposomas de vinorelbina dirigidos y no dirigidos teman una farmacocinetica de farmaco y lfpido identica con una semivida del lfpido de aproximadamente 12,1 horas y un 50% de tiempo de liberacion del farmaco de aproximadamente 4,3 horas.
Ejemplo 44. Preparacion y estabilidad comparativa in vivo de los liposomas de vinorelbina usando sales de amonio y sales de amonio sustituido.
Solucion de sulfato de dextrano amonio (DS-A) con pH 5,8, 0. NH4+ 65 M, osmolalidad de 390 mmol/kg, y solucion de sulfato de dextrano de trietilamonio (DS-TEA) con un pH de 6,0, 0. NH4+ 65 M, osmolalidad de 465 mmol/kg, se prepararon con sulfato de dextrano con un peso mol. de 10.000 (Sigma Chemical Co.) segun el metodo del Ejemplo 4, usando titulacion con una solucion acuosa de amomaco 12,4 M o trietilamina pura, respectivamente. Se preparo una solucion acuosa de sulfato de amonio (S-A) 325 mM, pH 5,1, osmolalidad 703 mmol/kg, partiendo de sulfato de amonio de calidad analftica. Las tres soluciones conteman menos de 1% de Na+ del contenido total del cation. Se prepararon liposomas con estas soluciones capturadas usando el metodo de mezclado-extrusion de etanol del Ejemplo 41 (DSPC/Colesterol/PEG-DSPE relacion molar 3:2:0,015). Se incluyo una etiqueta lfpida radioactiva [3H]-CHE en la matriz lfpida a 1,5 mCi/mmol de fosfolfpido. La etapa de extrusion consistio en 10 pases a traves de dos membranas de policarbonato de 0,1 pm apiladas. Se anadio VRB a los liposomas en HEPES-Na 5 mM, Dextrosa al 5%, pH 6,5, a una relacion farmaco-a-fosfolfpido de 350 mg/mmol, el pH se ajusto a 6,5 usando NaOH 1 N, y la mezcla se incubo a 58-60 °C durante 30 min. A continuacion, se enfrio la reaccion en hielo durante 15 min. y el farmaco no encapsulado se retiro usando la cromatograffa de filtracion en gel Sephadex G-75 eluyendo con una solucion acuosa HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5. Los liposomas cargados con vinorelbina purificados se analizaron para detectar el nivel de VRB mediante espectrofotometna y para detectar el nivel de fosfolfpidos usando el analisis de fosfatos de Bartlett (1959) (consulte los Ejemplos 70, 71). La farmacocinetica en sangre del lfpido liposomal y el farmaco se estudio en ratas como en el Ejemplo 43.
Los resultados se muestran en las Figuras 19-20 y en la Tabla 27. Los liposomas cargados con dextransulfato de trietilamonio se compararon con los cargados usando sal amonica de sulfato de dextrano. Inesperadamente, los liposomas cargados usando la sal de trietilamonio se consideraron mas estables que los cargados usando sal de amonio. La farmacocinetica del portador liposomal en sf mismo era similar al de las tres formulaciones distintas y por ello dependfa principalmente de la composicion lfpida empleada. La fuga de vinorelbina del Ls-VRB cargado usando sulfato de dextrano de trietilamonio era aproximadamente tres veces mas lenta que la de las soluciones cargadas usando dextransulfato de amonio. Los liposomas cargados usando sulfato de amonio teman velocidad de fuga de farmaco mas rapida.
Tabla 27. Estabilidad comparativa in vivo de encapsulacion de farmaco en liposomas usando sal de amonio sustituido y sal de amonio capturado.
Formulacion, sal capturada en el liposoma
Tamano del liposoma, nm, promedio ± SD (segun QELS) Semivida en sangre de la matriz lfpida, horas Tiempo para el 50% de liberacion de farmaco en sangre, horas
DS-TEA
120,8 ± 28,5 9,5 ± 3,3 66,3 ± 13,4
DS-A
107,8 ± 15,4 11,2 ± 0,6 22,9 ± 1,7
S-A
114,5. ± 15,6 10,7 ± 0,2 1,77 ± 0,16
Ejemplo 45. Preparacion y estabilidad in vivo de liposomas cargados con vinorelbina de distintos tamanos.
Se prepararon liposomas etiquetados con [3H]-CHE (1,5 mCi/mmol de fosfolfpido) con solucion capturada de octasulfato de sacarosa de trietilamonio (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) siguiendo el metodo de mezclado-extrusion de etanol del Ejemplo 11. La etapa de extrusion inclma 15 pases por dos membranas de policarbonato apiladas con un tamano de poro de 0,05, 0,08 o 0,1 pm. La carga de vinorelbina, el aislamiento de liposomas de vinorelbina y la caracterizacion de liposomas se realizaron siguiendo el metodo del Ejemplo 40. Se utilizaron ratas Albino hembras (8-9 semanas de edad; 200 g) para estudiar la estabilidad in vivo del liposoma. Se estudio la farmacocinetica del farmaco y el lfpido liposomal en ratas como en el Ejemplo 43.
Los resultados se muestran en las Figuras 21, 22 y en la Tabla 28 a continuacion. Se compararon los liposomas extrudidos a traves de filtros de policarbonato de 0,05, 0,08 y 0,1 pm y muestran tener una farmacocinetica similar del portador del farmaco y el liposomal, asf como una extension similar de la fuga de contenidos. La liberacion del farmaco de los liposomas en la sangre estaba caracterizada por de tiempos de liberacion del 50% en el intervalo de aproximadamente 40-80 horas y por encima de 24 horas.
Tabla 28. Caracterizacion de liposomas de vinorelbina.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tamano del liposoma, nm, promedio ± SD (segun QELS)
Carga de farmaco, mg/mmol de fosfolfpido Eficacia de carga, % Semivida en sangre de la matriz lfpida (horas) Tiempo para el 50% de liberacion de farmaco en sangre (horas)
87,6 ± 28,1
352,4 ± 13,9 100,7 ± 4,0 14,6 ± 0,7 39,7 ± 3,1
98,5 ± 15,1
322,6 ± 22,7 92,2 ± 6,5 13,0 ± 0,2 47,9 ± 3,8
109,6 ± 24,6
357,0 ± 10,5 102,0 ± 3,0 14,3 ± 0,3 78,0 ± 1,4
Ejemplo 46. Preparacion de liposomas de vinorelbina dirigidos contra HER2 usando el metodo de captura TEA-SOS y farmacocinetica de vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 scFv y no dirigida contra HER2 scFv en ratas.
Se prepararon liposomas, se cargaron con vinorelbina en una relacion de farmaco-fosfoKpido de 350 mg/mmol, y se analizaron como se describe en el Ejemplo 43, excepto que la solucion TEA-SOS del Ejemplo 45 se sustituyo por la solucion TEA-Pn. La etapa de extrusion incluyo 15 pases a traves de filtros de policarbonato de tamano de poro 0,08 pm. El tamano del liposoma era de 95,0 ± 26,0 nm segun QELS. Se prepararon inmunoliposomas de vinorelbina dirigida contra HER2 unida a F5scFv a partir de estos liposomas de vinorelbina, y se estudio la farmacocinetica en sangre del lfpido liposomal y el farmaco de vinorelbina de liposoma dirigido o no dirigido contra HER2 en ratas como se describe en el Ejemplo 43. La semivida en circulacion del lfpido liposomal era de 11,4 horas y 10,3 horas, y el 50% del tiempo de liberacion del farmaco era de 30,9 horas y de 30,3 horas para F5-ILs-VRB y Ls-VRB, respectivamente. Por ello, la farmacocinetica del farmaco y el lfpido de Ls-VRB y F5-ILs-VRB era muy similar, indicando que la introduccion del conjugado scFv-PEG-DSPE no afectaba a la depuracion del portador por sf mismo ni provocaba un aumento de fugas del farmaco procedente del portador mientras estaba en circulacion (Figs. 23, 24).
Ejemplo 47. Preparacion y propiedades farmacocineticas de liposomas de vinorelbina formados por derivados Hpidos no ionicos de poli(etilenglicol).
Se obtuvo metoxi-PEG (Peso mol. 2000)-derivado de C20-ceramida sintetica (PEG-ceramida) de Northern Lipids, Inc., Canada. El metoxi-PEG(peso mol. 2000)-distearoilglicerol (PEG-DSG) (SuNbRIGHT GS20) se adquirio de NOF Corp., Japon.
Se prepararon liposomas con la composicion lfpida de DSPC, colesterol y lfpido PEG (PEG-ceramida o PEG-DSG) en la relacion molar de 3:2:0,3 y solucion de TEA-SOS capturado (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) siguiendo el metodo de mezclado/extrusion con etanol del Ejemplo 11. La etapa de extrusion inclrna dos pases a traves de dos filtros de membrana de policarbonato apilados 2 veces usando un tamano de poro de 0,2 pm y 10 veces usando un tamano de poro de 0,08 pm. Los liposomas se cargaron con vinorelbina en la relacion farmaco- fosfolfpido de 350 mg/mmol, caracterizados por el tamano, y concentracion de farmaco y lfpido, y su farmacocinetica se estudio en ratas como en el Ejemplo 46. Ambas formulaciones mostraron un tiempo de circulacion prolongado de la matriz lfpida y mostraron una liberacion del farmaco in vivo, con al menos el 50% del farmaco permaneciendo encapsulado despues de 24 horas en la sangre in vivo, como se muestra en la Tabla 29 de mas abajo.
Tabla 29 Caracterizacion de liposomas de vinorelbina con varios lfpidos PEG
Lfpido PEG
Tamano del liposoma, nm, promedio ± SD (segun QELS) Carga de farmaco, mg/mmol de fosfolfpido Eficacia de carga en % Semivida en sangre de la matriz lfpida (horas) Tiempo para el 50% de liberacion de farmaco en sangre (horas)
PEG-ceramida
103,3 ± 30,9 291,4 ± 18,0 83,26 ± 5,14 14,0 102,7
PEG-DSG
101,3 ± 20,1 359,3 ± 7,2 102,7 ± 2,1 15,1 24,6
Cabe destacar que el aumento de PEGilacion de estos liposomas (contenido lfpido de PEG de aproximadamente 5,7% en moles. del lfpido total) no tema practicamente ningun efecto en la duracion de la circulacion en sangre del liposoma, comparado con liposomas similares con el tamano correspondiente y que teman una baja PEGilacion de aproximadamente 0,3 mol. % del lfpido total (Ejemplo 45, 109,6 nm, ti/2=14,3 horas; 98,5 nm, t1/2=13,0 horas).
Ejemplo 48. Preparacion de vinorelbina liposomal dirigida contra HER2 y citotoxicidad de vinorelbina liposomal dirigida contra HER2 y no dirigida contra HER2 frente a celulas MDA-MB-453 in vitro.
Los liposomas cargados con vinorelbina (Ls-VRB) se prepararon como en el Ejemplo 42 (sin [3H]-CHE) usando la carga del farmaco con un pH 6,0 y 350 pg de vinorelbina/pmol de fosfolfpido. Se formo vinorelbina inmunoliposomal dirigida contra HER2 (F5-ILs-VRB) incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE como se describe en los Ejemplos 19 y 42 anteriores, excepto en que no se anadio [3H]-CHE. Se preparo vinorelbina “libre” diluyendo 10 mg/ml de una solucion de bitartrato de vinorelbina USP en el medio de cultivo celular.
MDA-MB-453 son celulas de adenocarcinoma de cancer de mama (American Type Culture Collection, Rockville, MD) que sobreexpresan de forma moderada el receptor de HER2 (aproximadamente 3x104 a 1x105 copias/celula). Se determino la citotoxicidad de VRB suministrado como farmaco libre, como vinorelbina liposomal no dirigida, o como vinorelbina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inmunoliposomal (F5) dirigida contra HER2 frente a celulas MDA-MB-453 como se describe en el Ejemplo 27, excepto en que las celulas se colocaron en placas de microtitulacion de 96 pocillos con las condiciones de cultivo recomendadas por el proveedor (Leibowitz L-15 con un 10% de suero fetal bovino, sin suplemento de CO2) a una densidad de 10.000 celulas/pocillo, y las formulaciones de farmacos se anadieron en una serie de diluciones por etapas de 1:3 empezando con 0,03-0,1 mg/ml. Los datos sobre viabilidad celular se representaron graficamente con la concentracion de farmaco (Figura 25) y las concentraciones de farmacos necesarias para reducir la viabilidad celular al 50% (CI50) se estimaron a partir de los graficos. La CI50 del liposoma de vinorelbina dirigido contra F5 de 0,06 pg/ml) estaba muy cerca de la del farmaco libre (0,07 pg/ml) y era sustancialmente inferior a la de los liposomas no dirigidos (2,2 pg/ml). Esto representa una mejora de la actividad en 37 veces como resultado de la administracion del farmaco espedfica celulas cancerosas.
Ejemplo 49. Citotoxicidad de vinorelbina liposomal libre, dirigida y no dirigida contra HER2 frente a las celulas CaLu-3 in vitro.
Los liposomas y los metodos del ejemplo anterior (Ejemplo 48) se usaron para estudiar la citotoxicidad de la vinorelbina libre, Ls-VRB y F5-ILs-VRB en celulas de carcinoma de pulmon no microcftico humano que sobreexpresan HER2 CaLu-3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Las celulas se cultivaron en medio RPMI-1460 con un 10% de suero fetal bovino en presencia de CO2 al 5%. Los resultados se muestran en la Figura 26. La CI50 de VRB libre era de 1,2 pg/ml, 10 pg/ml para F5-ILs-VRB y 50 pg/ml para Ls-VRB no dirigido. Esto representa una mejora de 5 veces en la actividad del farmaco encapsulado en el liposoma en funcion de administracion dirigida a las celulas.
Ejemplo 50. Citotoxicidad de la vinorelbina liposomal libre, dirigida contra HER2 y no dirigida contra HER2 frente a celulas SKBr-3 in vitro.
Los liposomas y los metodos del Ejemplo 48 se usaron para estudiar la citotoxicidad de la vinorelbina libre, Ls- VRB y F5-ILs-VRB en celulas SKBr-3 de carcinoma de mama humano con una sobreexpresion de HER2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD), excepto que las celulas se cultivaron en el medio McCoy 5A modificado con el 10% de suero fetal bovino en presencia de CO2 al 5%, sembradas en placas con una densidad de 5000 celulas/pocillo, y el farmaco se incubo con las celulas durante 6 h.
Los resultados se muestran en la Figura 27. La CI50 de VRB libre era de 0,28 pg/ml, 0,17 pg/ml para F5-ILs-VRB y 0,8 pg/ml para Ls-VRB no dirigido. Esto representa una mejora de 4,7 veces en la actividad del farmaco como una funcion de la administracion dirigida.
Ejemplo 51 Eficacia antitumoral in vivo de la vinorelbina liposomal en xenoinjertos de cancer de colon humano HT29 en ratones.
Se prepararon liposomas en vesfculas unilamelares pequenas (93,2 ± 26,4 nm segun QELS) a partir de distearoilfosfatidilcolina, colesterol y PEG-DSPE (relacion molar 3:2:0,045) mediante hidratacion a partir de una solucion etanolica concentrada en una solucion acuosa de octasulfato de sacarosa de trietilamonio (trietilamonio 0,6 M, pH 5,7-6,2), seguido de una extrusion repetida a traves de membranas de policarbonato (tamano de poro 100 nm), retirada de la sal polianionica extraliposomal y carga con vinorelbina mediante incubacion con los liposomas en una solucion tampon isoosmotica a pH 6,5, relacion farmaco/lfpido de 325 mg VRB/mmol de fosfolfpido a 60 °C como se describe en el Ejemplo 42
Se inyecto a ratones lampinos homocigoticos BALB/c hembras (6-8 semanas, peso 17-20 g) subcutaneamente en el costado con 1x106 de celulas de carcinoma de colon humano HT-29 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Empezando en el dfa 16 posterior a la inoculacion del tumor, cuando el diametro medio del tumor era de 58 mm, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de seis animales cada uno y se trataron con vinorelbina libre o liposomal a una dosis de 5 mg/kg en la vena de la cola cada tres dfas durante un total de cuatro inyecciones. Para el grupo de control, los ratones se trataron con un volumen igual de solucion salina. El tamano del tumor de cada raton se midio usando un calibre y el volumen del tumor se calculo usando la formula siguiente: (longitud del tumor)x(anchura del tumor)2/2. Para evaluar la toxicidad relacionada con el tratamiento, los animales tambien se pesaron dos veces a la semana. La vinorelbina liposomal mostro una eficacia superior en la supresion del crecimiento de los tumores HT-29 en comparacion con la vinorelbina libre, haciendo que los tumores entraran en regresion, mientras en el grupo del farmaco libre los tumores continuaron creciendo (Figura 28). Hubo un ligero cambio en el peso corporal de los animales durante el transcurso del tratamiento, lo que indicaba que el tratamiento era bien tolerado y que la liposomalizacion no aumentaba la toxicidad del farmaco (Figura 29).
Ejemplo 52 Eficacia antitumoral in vivo de la vinorelbina liposomal contra tumores singenicos C-26 de cancer de colon de murino.
La vinorelbina liposomal y la vinorelbina libre se prepararon como en el Ejemplo 48. Se inocularon ratones BALB/c machos (6-8 semanas, 17-20 g de peso) subcutaneamente con 2x105 de celulas de carcinoma de colon murino C-26. En el dfa 17 despues de la inoculacion, cuando el diametro del tumor medio alcanzo los 5-8 mm, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos de tratamiento de cinco animales/grupo. Se inyecto a los ratones con tumor a traves de la vena de la cola con vinorelbina libre a 6 mg/kg, 8 mg/kg o 12 mg/kg, y con vinorelbina liposomal a 4 mg/kg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
o 6 mg/kg cada tres dfas para un total de cuatro inyecciones. Para el grupo de control, se inyecto a los ratones un volumen equivalente de solucion salina normal. Los tamanos tumorales y los pesos corporales de los animales se controlaron como en el Ejemplo 51. La vinorelbina liposomal incluso a 4 mg/kg, fue considerablemente mas eficaz a la hora de reducir el crecimiento del tumor que el farmaco libre a 12 mg/kg (Figura 30). Los pesos corporales de los animales en el transcurso del tratamiento mostraron ligeros cambios (<10% disminucion), lo que indicaba que la toxicidad de la vinorelbina liposomal no habfa aumentado en comparacion con la del farmaco libre (Figura 31).
Ejemplo 53 Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal dirigida contra HER2 frente a tumores de xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones: efecto del contraion de carga.
Se prepararon liposomas cargados con VRB 99,5 ± 10,2 nm de tamano siguiendo el metodo TEA-Pn del Ejemplo 41 y el metodo TEA-SOs del Ejemplo 42, respectivamente, excepto en que no se anadio [3H]-CHE. Se cargo VRB en una relacion farmaco/fosMpido de 350 mg/mmol. Se formo vinorelbina liposomal dirigida contra HER2 incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE (consulte el Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Se realizaron xenoinjertos de carcinoma de mama humano que sobreexpresan BT-474 HER2 con en ratones lampinos homocigoticos como en el Ejemplo 10. En el dfa 25 despues de la inoculacion de celulas tumorales, cuando los tumores habfan alcanzado un tamano de 200 mm3 (intervalo 144-309 mm3), los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de ocho animales/grupo, y se trataron intravenosamente con 5 mg/kg de VRB libre, F5-ILs-VRB con Pn como contraion o F5- ILs-VRB con SOS como contraion, a una dosis de 5 mg/kg semanalmente para un total de tres inyecciones. El grupo de control recibio un volumen equivalente de solucion salina normal. Los tumores y el peso corporal de los animales se controlaron como en el Ejemplo 10. La vinorelbina liposomal dirigida contra HER2 cargada usando octasulfato de sacarosa era mucho mas eficaz a la hora de reducir el crecimiento del tumor que la misma construccion dirigida cargada usando poli(fosfato), y ambas preparaciones inmunoliposomales eran considerablemente mas eficaces que la vinorelbina libre cuando se administraba a una dosis de 5 mg VRB/kg (Figura 32). Los ratones tratados con el farmaco demostraron pocos cambios de peso, lo que indicaba que el tratamiento se estaba tolerando bien (Figura 33).
Ejemplo 54. Eficacia antitumoral in vivo de vinorelbina liposomal dirigida a HER2 contra tumores de xenoinjertos de cancer de mama humano BT-474 en ratones: efecto de PEGilacion.
Se prepararon liposomas de DSPC y colesterol en la relacion molar 3:2 siguiendo el Ejemplo 48 mediante hidratacion de la matriz lfpida de DSPC, colesterol y PEG-diestearoilglicerol con PEG de peso molecular 2000 (GS-20, NOF Corp., Japon) en una relacion molar 3:2:0,015 (“PEG al 0,5%”) o 3:2:0,3 (“PEG al 10%”) a traves del metodo de la solucion etanolica en una solucion acuosa de octasulfato de sacarosa de trietilamonio, seguido de una extrusion con membrana como se describe en el Ejemplo 48. Se cargo VRB en los liposomas en la relacion farmaco/fosfolfpido de 350 mg/mmol. Se formo vinorelbina inmunoliposomal F5 incubando estos liposomas con el conjugado F5-PEG-DSPE (Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Se realizaron xenoinjertos de BT-474 a ratones lampinos y se trataron con VRB libre, “F5-ILs-VRB-PEG al 0,5%” o “F5-ILs-VRB-PEG al 10%” a 5 mg/kg como en el Ejemplo 53. Como se muestra en la Figura 34, F5-ILs-VRB con una alta PEGilacion proporciono un PEG-DSG derivado del lfpido PEG no ionico que era mucho mas eficaz a la hora de reducir el crecimiento del tumor que F5-ILs-VRB con una cantidad inferior de PEG-DSG, mientras que ambas preparaciones era mas activas que el farmaco libre.
Ejemplo 55 Eficacia antitumoral in vivo de la vinorelbina liposomal dirigido contra EGFR en xenoinjertos de cancer cerebral humano U87 en ratones.
Los liposomas (86,6 ± 12,9 nm de tamano segun QELS) con solucion 0,65 M TEA-SOS encapsulada se prepararon y cargaron con VRB siguiendo el Ejemplo 42. Se preparo VRB inmunoliposomal dirigida contra EGFR (C225Fab'-ILs-VRB) mediante incubacion de los liposomas vRb con el conjugado PEG-DSPE de fragmentos Fab de anticuerpos dirigidos contra EGFR como se describe en el Ejemplo 36.
Se inyecto subcutaneamente a los ratones macho NCR nu/nu (5-6 semanas, 17-20 g de peso) en el costado con 1x107 de celulas de glioblastoma humano U87 (ATCC) suspendidas en el medio de cultivo en un volumen total de 150 pl. Cuando el tumor alcanzo un tamano medio de 250 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de 10-12 animales. Los ratones fueron tratados con tres inyecciones intravenosas semanales de VRB libre, Ls-VRb no diana o C225Fab'-ILs-VRB a una dosis de 5 mg VRB/kg. El grupo de control recibio un volumen equivalente de solucion salina. Los tamanos tumorales y los pesos corporales de los animales se controlaron como en el Ejemplo 10. C225-Fab'-ILs-VRB era mas eficaz a la hora de inhibir el crecimiento de los tumores con xenoinjertos de cancer cerebral humano con una sobreexpresion de EGFR que la vinorelbina liposomal no dirigida o la vinorelbina libre a una dosis igual (Figura 35).
Ejemplo 56. Preparacion y farmacocinetica de doxorrubicina encapsulada en los liposomas usando el metodo de sulfato de trietilamonio.
Los liposomas con varias composiciones de matriz lfpida (como se indica en la tabla de mas abajo) se formaron como se describe en el Ejemplo 2. N-Glutaril-DSPE (Glu-DSPE) se adquirio de Avanti Polar Lipids, AL, EE. UU. Se formo una capa lfpida pura a partir de la solucion lfpida en cloroformo usando evaporacion rotatoria, las trazas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
compuestos volatiles se eliminaron al vado (90 pm Hg, 2 horas), la capa Ifpida se hidrato en sulfato de trietilamonio (TEA-SO4) solucion (TEA 0,65 N), se sometio a seis ciclos de congelacion y descongelacion rapidas, y se extrudio a traves de dos filtros de policarbonato de tamano de poro 0,1 pm diez veces y a traves de dos filtros de policarbonato apilados de tamano de poro 0,05 pm diez veces. Para la cuantificacion de la matriz lfpida en las muestras de sangre, se incluyo [3H]-CHE en la matriz lfpida a 0,5-1,5 mCi/mmol fosfoUpido. Los liposomas con la solucion de TEA-SO4 capturada se cargaron con doxorrubicina segun el Ejemplo 2. Los liposomas en solucion salina tamponada con hEpES (HEPES-Na 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5) se incubaron con clorhidrato de doxorrubicina (relaciones farmaco/fosfolfpido de 140-170 mg/mmol) a 60 °C durante 45 min, seguido de inactivacion en hielo y eliminacion de la doxorrubicina no encapsulada mediante cromatograffa en gel. Se realizo un analisis de la doxorrubicina mediante espectrofotometna (Ejemplo 71) y se realizo un analisis del fosfolfpido usando el metodo de Barlett (Ejemplo 70). Las propiedades de los liposomas resultantes se resumen en la Tabla 30 siguiente.
Tabla 30. Propiedades de doxorrubicina liposomal en varias composiciones lfpidas.
Composicion lfpida (relacion molar)
Tamano del liposoma, nm, (promedio ± SD segun QELS) farmaco/fosfolfpido, (mg/mmol)
DSPC/Chol/PEG-DSPE (3:2:0,015)
81,8 ± 27,3 163,6 ± 4,4
DSPC/Chol (3:2)
79,1 ± 27,9 137,0 ± 17,5
DSPC/Chol/Glu-DSPE (2,85:2:0,15)
83,6 ± 27,2 141,7 ± 10,4
DSPC/Chol/PEG-DSPE (2,7:2:0,3)
83,7 ± 23,1 175,0 ± 6,8
La farmacocinetica en sangre de estos liposomas que contienen doxorrubicina con una composicion lfpida de DSPC/Chol/PEG-DSPE 2,7:2:0,3 se estudio en ratas en una dosis intravenosa unica de 5 mg doxorrubicina/kg como se describe en el Ejemplo 9. Los liposomas teman una circulacion larga (semivida de aproximadamente 28 horas) (Figura 36). La relacion estable doxorrubicina-a-fosfolfpido indicaba que la formulacion era muy estable contra las fugas de farmaco en la circulacion, perdiendo menos del 25% del farmaco en un periodo de tiempo de 48 horas.
Ejemplo 57. Liposomas cargados con doxorrubicina e inmunoliposomas dirigidos contra HER2 preparados mediante el metodo de TEA-sulfato: preparacion y eficacia antitumoral in vivo contra xenoinjertos de cancer de mama humano con una sobreexpresion de HER2.
Se prepararon liposomas cargados con doxorrubicina y que teman diversas composiciones y propiedades de lfpidos (enumerados en la siguiente tabla) como se describe en el Ejemplo 56. Se prepararon inmunoliposomas dirigidos contra HER2 cargados con doxorrubicina se prepararon a partir de liposomas cargados con doxorrubicina mediante incubacion simultanea con conjugados scFv F5-PEG-DSPE dirigidos contra HER2 (aprox. 30 scFv/liposoma) como se describe en el Ejemplo 19. Se sensibilizaron ratones NCR nu/nu con xenoinjertos tumorales de cancer de mama humano subcutaneo (BT-474), se trataron (en grupos de 10-12 animales) con doxorrubicina liposomal e inmunoliposomal dirigida contra HER2 a una dosis de 5 mg/kg una vez a la semana durante un total de tres semanas una vez que los tumores alcanzaron un tamano promedio de 200 mm3, y se controlo la progresion del tumor y el peso corporal de los animales como se describe en el Ejemplo 29. Para las formulaciones de liposomas de doxorrubicina no dirigidos, se estudiaron las composiciones lfpidas que no conteman PEG-DSPE, 0,5% en moles. PEG-DSPE, o 10% en moles. PEG-DSPE; para doxorrubicina inmunoliposomal-F5, se estudiaron las formulaciones con 0,5% en moles. PEG-DSPE y 10% en moles. PEG- DSPE (aqm la cantidad de PEG-DSPE se expresa como % en moles. de fosfolfpido de liposoma). Los resultados (Figura 37, Tabla 31) demostraron que todos los tratamiento de doxorrubicina eran efectivos a la hora de retrasar el crecimiento del tumor. Sobre la base de los tamanos tumorales, en el dfa 53 despues de la inoculacion, las diferencias en la inhibicion del crecimiento tumoral entre los tres grupos de liposomas no dirigidos no aumentaron la significancia estadfstica (ANOVA p=0,081), pero la doxorrubicina inmunoliposomal era mucho mas eficaz que la doxorrubicina liposomal no dirigida (ANOVA p=5,5x10'10), donde la formulacion de “PEG-DSPE al 10%” era mucho mas efectiva que “PEG-DSPE al 0,5%” (prueba de la t de Student, p=0,027). En el grupo de “PEG-DSPE al 10%” F5-ILs, los tumores entraron en regresion hasta 1 mm3 o menos en el 67% de los animales, mientras que en el grupo “PEG-DSPE al 0,5%” F5-ILs solo en el 9%. En el grupo de control (tratamiento con solucion salina), los tumores superaron el lfmite de tamano aceptable del 15% de peso corporal en el dfa 38-43.
Tabla 31. Estudio sobre eficacia antitumoral in vivo de la doxorrubicina liposomal: caractensticas del liposoma y resultados del tratamiento.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Composicion lfpida
Tamano del liposoma, nm (promedio ± SD) Relacion farmaco/fosfolfpido, mg/mmol (promedio ± SD) Tamano promedio del tumor en el dfa 58, mm3 (promedio ± SEM)
DSPC/Chol/PEG-DSPE (3:2:0,015)
83,4 ± 23,3 136,7 ± 6,7 490 ± 74
DSPC/Chol (3:2)
80,5 ± 26,6 151,2 ± 1,9 587 ± 61
DSPC/Chol/PEG-DSPE (2,7:2:0,3)
81,0 ± 24,7 140,1 ± 4,2 365 ± 60
DSPC/Chol/PEG-DSPE (3:2:0,015) + F5 scFv-PEG-DSPE
no medido 140,7 ± 2,8 119 ± 39
DSPC/Chol/PEG-DSPE (2,7:2:0,3) + F5 scFv-PEG-DSPE
no medido 132,9 ± 2,2 15,5 ± 7,6
Ejemplo 58 Preparacion de vinblastina liposomal y farmacocinetica en sangre de vinblastina liposomal en ratas.
Se prepararon liposomas con solucion TEA-SOS acuosa capturada (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 502 mmol/kg) y tamano 99,5 ± 10,2 nm (promedio± SD segun QELS) siguiendo el metodo del Ejemplo 11 usando extrusion 2 veces a traves de dos membranas de policarbonato apiladas de 0,2 pm y diez veces a traves de dos membranas de policarbonato apiladas de 0,08 pm. Se anadio vinblastina (VBL) en forma de sulfato de vinblastina USP en una relacion farmaco-a-fosfolfpido de 150 mg/mmol. El pH de la mezcla de farmaco-liposoma se ajusto a
6,5 usando NaOH 1 N, y la mezcla se incubo posteriormente a 60 °C durante 30 min. Posteriormente, se enfrio la reaccion en hielo durante 15 min y el farmaco no encapsulado se elimino usando cromatograffa de filtracion en gel Sephadex G-75, eluyendo con HEPES-Na 5 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5. Los liposomas purificados se analizaron espectrofometricamente para VBL y para conocer el nivel de fosfolfpido siguiendo el metodo de Barlett como en los Ejemplos 70 y 71. [3H]-CHE se incluyo en la formacion en una relacion de 1,5 mCi/mmol fosfolfpido. La vinblastina liposomal tema 152,4 ± 12,0 mg VBL/mmol fosfoKpido (encapsulacion cuantitativa).
Se estudio la farmacocinetica en sangre de la vinblastina liposomal en ratas Albino hembra (8-9 semanas de edad; 200 g) a una dosis de 5 mg VBL/kg como se describe en el Ejemplo 9. La vinblastina se cuantifico en muestras de plasma sangumeo como se describe en el Ejemplo 41 (usando vinorelbina como patron interno). Los liposomas de vinblastina mostraron una buena circulacion en sangre (semivida en plasma del componente lfpido 12,8± 0,04 horas) (Figura 38) y una estabilidad muy buena frente a las fugas de farmaco de los liposomas con una carga de vinblastina inicial remanente encapsulada superior al 70% despues de 24 horas (Figura 39). El tiempo posterior a la inyeccion para conseguir una liberacion del 50% del farmaco encapsulado fue de 40,6 ± 1,2 horas.
Ejemplo 59 Preparacion de liposomas cargados con vincristina usando el metodo TEA-SOS y efecto del pH sobre la eficacia de carga.
Se prepararon liposomas con un tamano de 86,6 ± 12,9 nm (segun QELS), composicion lfpida de DSPC/Chol/PEG- DSpE en la relacion molar de 3:2:0,015 y solucion TEA-SOS acuosa capturada (TEA 0,65 M, pH 5,4, osmolalidad 521 mmol/kg) siguiendo el metodo del Ejemplo 11 usando una etapa de extrusion de 15 pases a traves de dos membranas de policarbonato apiladas de tamano de poro 0,08 pm. Se anadio vincristina (VCR) a los liposomas en HEPES-Na 5 mM, solucion tampon acuosa de Dextrosa al 5%, pH 6,5, como sulfato de vincristina en una relacion farmaco-fosfolfpido de 350 pg vincristina/pmol fosfolfpido, el pH se ajusto a la relacion indicada usando NaOH 1 N, y la mezcla se incubo a 60 °C durante 30 min. A continuacion, se enfrio en hielo durante 15 min. y los liposomas se separaron del farmaco no encapsulado usando cromatograffa de filtracion en gel Sephadex G-75 eluyendo con HBS-
6.5 (HEPES 20 mM, NaCl 135 mM, pH 6,5). A continuacion, los liposomas purificados se analizaron para la vincristina mediante espectrofotometna usando absorbancia a 265 nm despues de la solubilizacion en isopropanol acido, y para el contenido de fosfolfpido, usando el analisis de fosfato de Bartlett (1959).
Los resultados se muestran a continuacion en la Tabla 32. La carga de farmaco era superior al 90% en el intervalo de pH 4,5-7,5, y practicamente cuantitativa a pH 5,0-7,5. A un pH de 3,5, que es el pH observado en la mezcla liposomal despues de la adicion del farmaco, pero sin ajuste de pH, la carga era considerablemente inferior.
Tabla 32. Dependencia del pH de la vincristina cargada en liposomas con TEA-SOS capturado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
pH
Proporcion farmaco/fosfolfpido, jg/jmol Eficacia de carga (%)
3,5
39,7 ± 4,9 11,3 ± 0,2
4,5
327,2 ± 20,6 93,5 ± 5,4
5,0
360,6 ± 5,8 103,0 ± 1,7
5,5
371,2 ± 30,2 106,1 ± 9,1
6,0
347,7 ± 20,4 99,3 ± 5,8
6,5
347,7 ± 20,9 99,4 ± 5,9
7,0
377,3 ± 22,2 107,8 ± 6,8
7,5
371,5 ± 24,9 106,1 ± 7,6
Ejemplo 60. Preparacion de liposomas cargados con vincristina usando el metodo TEA-SOS: efecto de la relacion farmaco/l^pido sobre la eficacia de carga.
Los liposomas que conteman SOS-TEA se prepararon como en el Ejemplo 59 y se cargaron con sulfato de vincristina en una relacion farmaco-fosfoKpido de 150-550 |jg vincristina/jmol fosfolfpido a un pH de 6,5 siguiendo el procedimiento del Ejemplo 59. Los liposomas purificados a partir del farmaco no encapsulado se analizaron posteriormente para detectar el nivel de VCR mediante espectrofotometna y para el fosfolfpido liposomal usando el analisis de Bartlett (1959). La eficacia de carga del farmaco era superior al 90% durante todo el intervalo de relaciones farmaco/lfpido del estudio, y era practicamente cuantitativa entre 150-450 jg vincristina/jmol de fosfolfpido (Tabla 33).
Tabla 33. Carga de vincristina en liposomas que contienen TEA-SOS en diferentes relaciones de farmaco-a-lfpido.
Farmaco-a-fosfolfpido de entrada (jg/jmol)
Farmaco-a-fosfolfpido encapsulado (jg/jmol) Eficacia de carga (%)
150
163,6 ± 6,6 109,0 ± 4,8
250
251,1 ± 17,0 100,5 ± 6,8
350
347,7 ± 20,9 99,4 ± 5,9
450
452,0 ± 18,8 100,4 ± 4,2
550
521,6 ±24,9 94,8 ± 4,3
Ejemplo 61. Preparacion de vincristina inmunoliposomal y citotoxicidad de vincristina liposomal e inmunoliposomal frente a celulas cancerosas in vitro.
Se preparo vincristina liposomal (Ls-VCR) como se ha descrito en el ejemplo 59 usando una relacion farmaco/fosfolfpido de 350 mg/mmol. Se preparo vincristina inmunoliposomal F5 espedfica de HER2 (F5-ILs-VCR) a partir de vincristina liposomal mediante incubacion simultanea con conjugado scFv F5-PEG-DSPE dirigido contra HER2 como se describe en el Ejemplo 19. Se preparo solucion de vincristina “libre” (VCR) diluyendo sulfato de vincristina USP en agua, seguido de una filtracion esteril. Se determino la citotoxicidad de VCR, Ls-VCR y F5-ILs-VCR frente a las celulas SKBr-3 (ATCC) de carcinoma de mama humano con una sobreexpresion de HER2 realizando un analisis de viabilidad celular basado en MTT usando el procedimiento del Ejemplo 27, donde las celulas se inocularon en placas de microtitulacion de 96 pocillos a 5000 celulas/pocillo, se aclimataron durante la noche, y se incubaron con el medio que contema el farmaco durante 4 horas, seguido de una incubacion posterior en un medio exento de farmaco durante 3 dfas. Los resultados se muestran en la Figura 40. La CI50 era 75 ng/ml para VCR libre, 11 ng/ml para F5-ILs-VCR y 3 jg/ml para Ls-VCR. La vincristina liposomal dirigida preparada segun la presente descripcion era 6,8 veces mas activa que el farmaco libre, y 273 veces mas activa que el farmaco liposomal no dirigido, mostrando una mejora sustancial en la actividad anticancerosa como una funcion de la administracion de farmaco espedfica de celula.
Ejemplo 62 Farmacocinetica en sangre de Ls-VCR en ratas.
Se prepararon liposomas con solucion SOS-TEA capturada (TEA 0,65 M, pH 5,8, osmolalidad 530 mmol/kg) y composicion lfpida de DSPC/Chol/PEG-DSPE (relacion molar 3:2:0,015), que tambien conteman [3H]-CHE a
1,5 mCi/mmol de fosfolfpido, siguiendo el metodo del Ejemplo 11 usando una etapa de extrusion formada por 10 pases a traves de membranas de policarbonato apiladas con un tamano de poro de 80 nm o 100 nm. Los liposomas se cargaron con VCR a un pH de 6,5, relacion farmaco/fosfolfpido de 350 mg/mmol, como se describe en el Ejemplo 59. Los liposomas cargados con VCR se administraron a ratas Albino hembra intravenosamente (180-220 g) a una dosis de 5 mg de VCR/kg, y se estudio la farmacocinetica en sangre del farmaco y el lfpido del liposoma como se describe en el Ejemplo 9. La cantidad de VCR en las muestras de sangre se cuantifico mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 41, excepto en que el relacion volumetrica de la solucion acuosa de acetato de trietilamonio (pH 5,5) y el acetonitrilo en la fase movil era de 65:35. El tiempo de retencion tfpico para VCR era de 8,8 min. Los resultados se muestran en la Figura 41 y en la Tabla 34. Ambas preparaciones teman una duracion en circulacion extensa (semivida en sangre de 12-17 horas). La vincristina liposomal era muy estable contra fugas de farmaco en las dos preparaciones (semivida de mas de 120 horas) (Figura 42).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 34. Caractensticas de liposomas cargados con vincristina a 350 mg/mmol de fosfoKpido usando el metodo TEA-SOS.
Tamano de
Tamano del Carga de farmaco, t1/2p lfpido, t1/2P VCR, t1/2 VCR
poro de extrusion, nm
liposoma, nm (promedio ± SD) mg/mmol de fosfolfpido horas horas liberacion, horas
80
101,2 ± 20,2 347,7 ± 20,93 17,5 ± 1,5 16,0 ± 2,0 >120
100
125,6 ± 32,0 366,8 ± 18,11 12,1 ± 0,7 12,0 ± 0,8 No detectable
Ejemplo 63. Farmacocinetica en sangre de Ls-VCR en ratas en diversas relaciones farmaco-Hpido.
Se prepararon liposomas con solucion SOS-TEA capturada (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 485 mmol/kg) y composicion lfpida de DSPC/Chol/PEG-DSPE (relacion molar 3:2:0,015), que tambien conteman [3H]-CHE a
1,5 mCi/mmol de fosfolfpido, siguiendo el metodo del Ejemplo 11 usando una etapa de extrusion formado por 10 pases a traves de membranas de policarbonato apiladas con un tamano de poro de 50 nm o 80 nm. Los liposomas se cargaron con VCR a un pH de 6,5 como se describe en el Ejemplo 59 anadiendo 20 mg/ml de una solucion madre acuosa de sulfato de VCR en las relaciones farmaco/lfpido calculadas de 100, 200 o 350 mg/mmol de fosfolfpido. La eficacia de la carga de farmaco era superior al 96% para todas las preparaciones. Los liposomas cargados con VCR se administraron a ratas Albino hembra intravenosamente (8-9 semanas de edad, 190-220 g) a una dosis de 5 mg de VCR/kg, y se estudio la farmacocinetica en sangre del farmaco y el lfpido del liposoma como se describe en el Ejemplo 62. Los resultados se muestran en la Tabla 35. La vincristina liposomal tema una buena duracion en circulacion (semivida en sangre de unas 20-30 horas) y era excepcionalmente estable en todos los tamanos y relaciones farmaco-lfpido estudiados (semivida de liberacion del farmaco superior a 93 horas).
Tabla 35. Caractensticas de liposomas cargados con vincristina usando el metodo TEA-SOS en varias relaciones farmaco-lfpido.
Tamano de poro de extrusion, nm
Tamano del liposoma, nm (promedio ± SD) VCR, mg/mmol fosfolfpido anadido encapsulado t1/2 lfpido, horas t1/2 VCR, horas t1/2 liberacion del farmaco, horas
50
76,8 ± 27,2 100 96,1 ± 3,0 35,6 ± 2,7 30,3 ± 4,0 227 ± 96
200 193,3 ± 3,9 20,8 ± 2,2 18,4 ± 0,7 244±130
350 375,2 ± 10,0 24,8 ± 0,9 19,6 ± 0,9 93,2 ± 6,7
80
101,6 ± 25,3 100 104,5 ± 2,1 33,0 ± 7,6 26,8 ± 4,8 153 ± 10
Ejemplo 64. Preparacion de vincristina liposomal dirigida contra HER2 y eficacia antitumoral de vincristina liposomal dirigida y no dirigida contra hER2 frente a xenoinjertos de cancer de mama humano con sobreexpresion de HER2 en ratones.
Se prepararon liposomas cargados con vincristina (Ls-VCR-SOS) usando el metodo TEA-SOS siguiendo el Ejemplo 63 (con omision del componente [3H]-CHE) usando extrusion con membranas de 50 nm de tamano de poro y cargando el farmaco en una relacion farmaco-fosfolfpido de 100 mg/mmol. Se formo vincristina inmunoliposomal F5 (F5-ILs-VCR) incubando Ls-VCR-SOS con el conjugado F5-PEG-DSPE dirigido contra HER2 (Ejemplo 19) como se describe en el Ejemplo 43. Se prepararon los liposomas cargados con vincristina usando citrato de TEA (Ls-VCR-Cit) de forma similar a los liposomas Ls-VCR-SOS, excepto que la solucion de citrato de trietilamonio (preparada titulando la solucion acuosa de acido dtrico con la trietilamina pura con un pH de 5,1 y ajustando la concentracion a trietilamina 0,65 M) se sustituyo por la solucion de TEA-SOS. El diseno del estudio de tratamiento siguio el metodo del Ejemplo 10. Se practicaron xenoinjertos subcutaneos de cancer de mama humano BT-474 en ratones lampinos, y cuando los tumores alcanzaron un tamano de 250 mm3 (intervalo 144-309 mm3) los ratones en grupos de ocho a nueve fueron tratados con VCR libre, Ls-VCR o F5-ILs-VCR con una dosis intravenosa semanal de 2 mg de VCR/kg durante un total de tres semanas, empezando en el dfa 19 despues de la inoculacion del tumor. Los tamanos tumorales y los pesos corporales de los animales se controlaron como se describe en el Ejemplo 10. Para el grupo de control, los ratones se trataron con un volumen igual de solucion salina. Las diferencias en los tamanos tumorales entre los grupos de tratamiento se evaluaron estadfsticamente en el dfa 63 despues de la inoculacion del tumor usando la prueba de Mann-Whitney. La dinamica del tamano promedio del tumor en los grupos se ilustra en la Figura 43. F5-ILs-VCR demostro una eficacia maxima en comparacion tanto con Ls-VCR como con VCR libre, provocando en el dfa 63 una regresion completa del tumor en seis de los ocho animales (75%). Ls-VCR-Cit tambien fue efectivo, provocando regresiones completas del tumor en el dfa 63 en dos de los nueve animales (22%). aunque fue menos efectivo que F5-ILs-VCR (p<0,005). Ls- VCR-SOS y VCR libre fueron igual de efectivos (p>0,2) y menos efectivos que F5-ILs-VCR o Ls-VCR-Cit. Por ello, sorprendentemente, con la administracion dirigida a celulas, un farmaco liposomal encapsulado usando un anion polivalente de la presente descripcion demostro ser mas eficaz que el farmaco encapsulado liposomalmente a traves de un anion sin union. La dinamica de peso corporal de los animales indico que todas las preparaciones de VCR eran menos toxicas que el VCR libre, provocando menos perdida de peso corporal durante el tratamiento (Figura 44).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 65. Preparacion de vincristina liposomal dirigida contra EGFR y eficacia antitumoral de vincristina liposomal no dirigida y dirigida contra EGFR frente a xenoinjertos de cancer cerebral humano con sobreexpresion de EGFR en ratones.
Se prepararon liposomas cargados con vincristina (Ls-VCR) se prepararon usando el metodo TEA-SOS como en el Ejemplo 64. Se prepare vincristina inmunoliposomal dirigida contra EGFR mediante incubacion simultanea de los liposomas con el conjugado Fab' C225Fab-PEG-DSPE dirigido contra HER2 como se describe en el Ejemplo 36.
Se inyectaron ratones macho NCR nu/nu (5-6 semanas de edad, 17-20 g de peso) subcutaneamente en el costado con 0,15 ml del medio de cultivo celular que contema 1x107 celulas de glioblastoma humano U87 que expresaban un mutante EGFRvIII del receptor del factor de crecimiento epidermico de forma estable (HER1). En el dfa 11, cuando el tamano del tumor alcanzo los 300-400 mm3, los ratones se dividieron de forma aleatoria en cuatro grupos de 10-12 animales/grupo. Se administraron tratamientos con VCR libre (sulfato de vincristina 1 mg/ml en solucion salina), Ls-VCR o C225Fab-ILs- VCR en una dosis intravenosa de 1,5 mg/kg en los dfas 11, 18 y 25 despues de la inoculacion del tumor. Se inyecto a los ratones en el grupo de control de forma similar con un volumen equivalente de solucion salina normal. Se controlaron los tamanos tumorales y los pesos corporales de los animales como en el Ejemplo 10. Los resultados se muestran en la Figura 45. Todos los animales tratados con formulaciones de VCR mostraron un crecimiento tumoral retardado en comparacion con los animales de control. No hubo una diferencia significativa entre los grupos tratados con VCR libre y Ls- VCR. C225Fab-ILs-VCR dirigido contra EGFR era mas eficaz que el VCR libre o liposomal no dirigido.
Ejemplo 66. Preparacion de liposomas con solucion de hexafosfato de inositol trietilamonio (TEA-IHP).
Se obtuvo sal de dodecasodio de hexafosfato de inositol, un poliol anionizado (IHP) de Sigma (St. Louis, MO). La solucion acuosa que contema trietilamonio 0,65 M y 0,681 M de los grupos fosfatos, pH 6,5 y osmolalidad de 718 mmol/kg, se prepare mediante intercambio de iones en la resina de poliestireno sulfonada reticulada Dowex 50Wx8-200, seguido de una titulacion con TEA puro y dilucion con agua siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. El contenido de sodio residual fue inferior al 1% de la suma de cationes. Los ffpidos secos (150 pmol de DSPC, 100 pmol de Chol, 0,75 pmol de PEG-DSPE) se disolvieron en 0,5 ml de etanol al 100% USP a 60 °C y se mezclaron con 4,5 ml de solucion de hexafosfato de inositol trietilamonio precalentada a la misma temperatura. El etanol se extrajo parcialmente mediante evaporacion rotatoria a 30-40 mm Hg y 40-45 °C hasta que la mezcla no mostro burbujas. A continuacion, la suspension ffpida se extrudio a 60-65 °C 15 veces usando membranas de policarbonato de tamano de poro de 0,1 nm apiladas. Los liposomas resultantes teman 104,3 ± 39,0 nm de tamano segun QELS. El trietilamonio IHP no encapsulado se extrajo mediante cromatograffa en gel en una columna Sepharose 4B, se eluyo con HEPES-Na 5 mM, dextrosa al 5%, solucion tampon a pH 6,5 y los liposomas se cuantificaron mediante la concentracion de fosfoffpidos usando el metodo de Bartlett con la extraccion segun el Ejemplo 70.
Ejemplo 67. Carga de farmacos en liposomas con solucion TEA-IHP capturada.
Los liposomas del Ejemplo 67 se cargaron con CPT11 o vinorelbina. La vinorelbina se cargo en una relacion farmaco-a- fosfoffpido de 175 o 350 g/mol, y CPT11 en una relacion de 250 o 500 g/mol. Los farmacos se anadieron a los liposomas en la solucion tampon de HEPES-dextrosa (Ejemplo 67) en las relaciones de entrada de farmaco/fosfoffpido indicadas a continuacion (consulte la Tabla 36). En caso necesario, el pH se ajusto a 6,5-6,8 usando NaOH 1 N. Las mezclas se incubaron a 60 °C durante 30 min, se enfriaron en hielo durante 15 minutos y se realizo una cromatograffa en una columna de filtracion en gel Sephadex G-25, eluida con HEPES-Na 5 mM, NaCl 145 mM, pH 6,5. Las affcuotas de los liposomas purificados se solubilizaron en metanol acidificado y se analizaron mediante espectrofotometna (Ejemplo 71). El fosfoffpido se cuantifico siguiendo el metodo de Bartlett (1959) con extraccion (Ejemplo 70). Ambos farmacos se cargaron cuantitativamente (es decir, practicamente al 100%) en los liposomas, como se muestra en la Tabla 36 a continuacion.
Tabla 36. Propiedades de farmacos cargados en liposomas con hexafosfato de inositol capturado.
Farmaco
Relacion de entrada farmaco/ffpido, g/mmol fosfoffpido Relacion farmaco/ffpido encapsulado, g/mmol fosfoffpido Eficacia de carga, %
Vinorelbina
175 175,3 ± 8,0 100,2 ± 4,5
Vinorelbina
350 352,3 ± 11,8 100,6 ± 3,3
CPT-11
250 265,1 ± 11,2 106,1 ± 4,7
CPT-11
500 518,7 ± 27,8 103,7 ± 5,8
Ejemplo 68. Estabilidad qumica de CPT-11 libre o liposomal en presencia de plasma de raton in vitro.
En el cuerpo, CPT-11, que es un pro-farmaco, experimenta una transformacion qmmica para formar un metabolito de farmaco activo conocido como SN-38. Tanto el SN-38 como el CPT-11 tambien se convierten de su forma de lactona activa en productos inactivos conocidos como carboxilatos SN-38 o CPT-11. En este Ejemplo, se estudio el efecto de la liposomalizacion de CPT-11 segun la presente invencion sobre la conversion qmmica de CPT-11 en estos productos en presencia de plasma sangmneo. Se prepararon liposomas con octasulfato de sacarosa de trietilamonio capturado (TEA 0,65 M, pH 6,4, osmolalidad 485 mmol/kg) y la composicion ffpida de DSPC, Colesterol y PEG-DSPE en una relacion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
molar de 3:2:0,015 segun el Ejemplo 11, usando extrusion diez veces a traves de dos filtros de policarbonato apilados de 0,08 pm. Los liposomas teman un tamano de 87,4 ± 19,2 nm segun QELS. CPT-11 se cargo aproximadamente a 500 mg de CPT-11 base/mmol fosfolfpido liposomal mediante incubacion en una solucion acuosa de HEPES-Na 5 mM, dextrosa al 5%, pH 6,5, a 60 °C durante 30 min., seguida por inactivacion en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados con CPT- 11 se purificaron posteriormente en una columna Sephadex G-75 eluida con solucion salina tamponada con HEPES (HEPES 5 mM, NaCl 145 mM, pH 6,5). Los liposomas CPT-11 resultantes teman 536,5 ± 20,1 mg de CPT-11/mmol de fosfolfpido. La solucion de CPT-11 libre se preparo disolviendo clorhidrato de irinotecan USP preparado recientemente en 1 mg/ml en 144 mM de solucion acuosa de NaCl, acidificada a pH 3 con HCl diluido. Se mezclaron alfcuotas de 10 pl de CPT-11 libre o liposomal o CPT-11 libre con 90 pl de plasma de raton estabilizado con heparina (Harlan Bioproducts, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C en un bano de agua con agitacion. En un momento espedfico, se realizo una cromatograffa por triplicado de las muestras de liposomas en columnas de exclusion por tamanos Sepharose CL-4B (2 ml volumen basal) eluidas con HBS-6,5, y las fracciones con farmaco se detectaron mediante fluorescencia. Los picos primero (volumen vado) y segundo (seguimiento) con contenido de farmaco se recogieron y consideraron como fracciones del farmaco liberadas y encapsuladas liposomalmente. Las muestras se extrajeron con 400 pl de metanol enfriado en hielo mediante vortizacion durante 10 s, seguido de centrifugacion a 14.100xg durante 5 min. Los sobrenadantes se analizaron para detectar el CPT-11 y sus productos de conversion mediante HPLC usando una modificacion de un metodo de Warner and Burke, J Chromatogr., Ser. B Biomed. Sci. Appl. 1997, vol. 691, pag. 161-71. La fase movil estaba formada por acetato de trietilamonio al 3% pH 5,5 (solucion A) y acetonitrilo (solucion B) suministrados a 1,0 ml/min en una gradiente lineal de 20% en vol. de B a 50% en vol. de B en 14 min. Los productos eluidos se detectaron mediante fluorescencia con excitacion a 375 nm y emision a 500 nm. Los tiempos de retencion fueron de 5,3 min (CPT-11 carboxilado), 6,8 min (SN- 38 carboxilado), 9,3 min (CPT-11) y 11,0 min (SN-38). Los resultados (Tabla 37) indicaron que mientras que el CPT-11 libre y el CPT-11 liberado de los liposomas hadan sufrido conversion, el CPT-11 intraliposomal se mantema estable.
Tabla 37. Conversion de CTP-11 libre y liposomal en SN-38 y formas carboxiladas en plasma de raton in vitro.
Muestra
Tiempo, horas CPT-11, % SN-38, %
lactona
carboxilato lactona carboxilato
CPT-11 libre
2 1,9 ± 0,4 35,2± 1,9 4,4± 0,1 58,4± 2,1
12 <0,1 11,5± 0,9 9,9 ± 0,8 78,6 ± 1,3
24 <0,1 <0,1 22,5 ± 9,8 77,5 ± 9,8
Ls-CPT-11
12 97,7 ± 0,1 <0,1 2,3 ± 0,1 <0,1
(encapsulado)
24 97,7 ± 0,1 <0,1 2,3 ± 0,1 <0,1
Ls-CPT-11
12 60,5 ± 10,4 25,0 ± 7,1 5,0 ± 0,3 9,5 ± 3,0
(liberado)
24 78,3 ± 6,7 14,0 ± 5,2 6,5 ± 0,5 1,2 ± 1,7
Ejemplo 69. Estabilidad qumica in vivo de CPT-11 libre o liposomal en ratas.
Se preparo CPT-11 liposomal como en el Ejemplo 68 usando octasultato de sacarosa trietilamonio con TEA 0,65 M, pH 6,4 y osmolalidad de 502 mmol/kg. El tamano del liposoma era de 98,5 ± 18,4 nm, y la encapsulacion de CPT-11 era de 510,1 ± 16,5 mg de CPT-11/mmol fosfolfpido. El CPT-11 libre y el liposomal se administraron intravenosamente con una dosis de 25 mg/kg en ratas Albino hembra (180-220 g) con cateteres centrales permanentes, y las muestras de sangre se recogieron a intervalos durante un periodo de 48 horas. Las muestras de sangre se mezclaron con PBS enfriado en hielo que contema EDTA al 0,04% y se centrifugaron rapidamente para retirar las celulas sangumeas. Se evaluaron alfcuotas de los fluidos sobrenadantes para detectar el nivel de CPT-11, SN-38, y sus formas carboxiladas mediante HPLC como en el Ejemplo 68 anterior. Los resultados se muestran en las Figuras 46 y 47. Mientras el CPTG-11 libre se elimino rapidamente, siendo indetectable despues de 30 minutos, el CPT-11 liposomal era persistente en la circulacion (t1/2 15,2 horas) con el 37,8% del farmaco en la sangre a las 24 horas, y aproximadamente el 10% del farmaco todavfa en circulacion despues de 48 horas. No hubo una conversion detectable de la forma liposomal de CPT-11 ni SN-38, asf como tampoco de la forma carboxilada de CPT-11. Se administro CPT-11 libre intravenosamente a modo de solucion, se elimino de la circulacion con bastante rapidez (semivida de unos 16 min) y se produjo una conversion apreciable a la forma carboxilada del farmaco.
Ejemplo 70. Cuantificacion del fosfotfpido liposomal.
Digestion acida modificada - metodo de fosfomolibdato azul I. Este metodo se ha modificado despues de Bartlett (1959). Las alfcuotas de 10-20 ml de liposomas se colocaron en tubos de vidrio resistentes al calor, se digirieron mediante calentamiento con 0,5 ml de acido sulfurico 10 N durante 2 horas a 110-130 °C, se mineralizaron mediante la adicion de 50 ml de peroxido de hidrogeno al 9%, y se calentaron durante otros 30 min. Hasta no detectar peroxido de hidrogeno con una tira de papel indicador. Las muestras digeridas a temperatura ambiente se diluyeron con 1 ml de solucion acuosa de molibdato de amonio al 0,2% y se mezclaron con 0,1 ml de solucion acuosa de acido ascorbico al 5% y se incubaron en un bano de agua hirviendo durante 10 min. La absorbancia del complejo de fosfomolibdato reducido se midio a 800 nm y se comparo con una curva patron producida simultaneamente usando soluciones patron de fosfato inorganico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Digestion acida modificada - metodo de fosfomolibdato azul II. Este metodo es una modificacion del metodo de Morrison (1964). Se mezclaron alfcuotas de 5 |jl de liposomas que teman fosMpido 1-10 mM con 60 |jl de acido sulfurico concentrado y 10 jl de peroxido de hidrogeno al 30% en tubos de vidrio resistentes al calor. Las mezclas se calentaron a 200-220 °C durante 10 min., se diluyeron con 0,7 jl de agua desionizada, mezclada con 10 jl de solucion acuosa de sulfito de sodio al 10%, se incubaron en un bano de agua hirviendo durante 5 min, y se enfriaron a temperature ambiente. Se anadieron 200 jl de solucion acuosa de molibdato de amonio al 2% y 10 jl de solucion acuosa de acido ascorbico al 10%, y las muestras se incubaron en un bano de agua hirviendo durante 10 min. Las muestras se enfriaron rapidamente a temperatura ambiente y se determino la absorbancia del complejo de fosfomolibdato reducido a 825 nm en comparacion con la muestra en blanco. Se determino la cantidad de fosfolfpido a partir de la curva patron obtenida en el mismo analisis usando soluciones patron con 2, 4, 6, 8 y 10 mM de dihidrogeno fosfato de potasio.
Metodo de extraccion. Se extrajeron alfcuotas de 25-100 jl de liposomas se extrajeron 3 veces con porciones de 200 jl de la mezcla de lmetanol-cloroformo (1:2 en volumen). Las fases organicas se combinaron en tubos de vidrio resistentes al calor, y los disolventes se retiraron al vacfo. Los residuos se trataron con acido sulfurico 10 N y se sometieron a un analisis adicional para determinar el nivel de fosforo segun el metodo I anterior.
Salvo que se indique lo contrario, los datos analtticos se presentan como un promedio ± error estandar de analisis por triplicado.
Ejemplo 71. Cuantificacion de farmacos en los liposomas.
Cuantificacion espectrofotometrica. Se mezclaron alfcuotas de liposomas (10-50 jl) con 1 ml de solucion acuosa de isopropanol de 70% en vol. con HCl 0,075-0,1 N, y la absorbancia frente a la muestra en blanco se midio en las longitudes de onda siguientes: doxorrubicina, 485 nm; CPT-11 y topotecan, 372 nm; elipticinas, 306 nm, vinorelbina, 270 nm; vincristina y vinblastina, 265 nm. La cantidad de farmaco se determino comparando con una curva patron de un analisis simultaneo.
Cuantificacion fluorometrica. Se diluyeron alfcuotas de muestras que conternan liposomas (p. ej. plasma sangumeo) se diluyen con isopropanol acidificado (alfcuotas de 0,02-0,1 ml: 1 ml de isopropanol al 70%- HCl 0,075 N; alfcuotas >0,1 ml: isopropanol al 90%- HCl 0,1 N a 1 ml). Si se produce una precipitacion de proternas, las muestras se incuban en hielo 1-2 horas y se clarifican mediante 10 min de centrifugacion a 12.100xg. La fluorescencia de los sobrenadantes se mide en las siguientes longitudes de onda: CPT-11, excitacion 370 nm, emision 423-425 nm;
Topotecan, excitacion 380-385 nm, excitacion 520-525 nm; elipticinas, excitacion 306 nm, emision 520 nm. La cantidad de farmaco se calcula a partir de las curvas estandar de un analisis simultaneo despues de restar la fluorescencia en blanco.
Ejemplo 72. Efecto de los lipopotfmeros sobre la eficacia de carga de la vinorelbina en liposomas.
Los liposomas compuestos por 200 partes molares de DSPC, 133 partes molares de colesterol y lfpidos PEG-DSPE (120 partes molares) derivatizados con poli(etilenglicol)(peso molar 2000)-lfpidos o PEG-DSG (20 partes molares), y que conternan solucion de TEA-SOS 0,65 M de encapsulada se prepararon siguiendo el metodo del Ejemplo 11, usando una membrana de 80 nm de tamano de poro para la etapa de extrusion. Los liposomas se cargaron con vinorelbina en una relacion farmaco-fosfolfpido de 350 mg/mmol y se purificaron a partir del farmaco no encapsulado siguiendo el metodo del Ejemplo 40. Se realizo un analisis de los liposomas para detectar el contenido de farmaco y lfpidos como se describe en los Ejemplos 70, 71 y para el tamano del liposoma segun QELS usando la aproximacion gaussiana ponderada en volumen. Los resultados (Tabla 38) indicaron que mientras que aunque el derivado de PEG anionico, PEG-DSPE, en la cantidad de mas de 1% en moles del fosfolfpido del liposoma (0,3% en moles del lfpido total) tema un efecto negativo en la eficacia de carga del farmaco, el derivado neutro, PEG-DSG, sorprendentemente no afectaba a la eficacia de carga incluso a 9,1% en moles del fosfolfpido del liposoma (5,7% en moles del lfpido total).
Tabla 38. Propiedades de los liposomas de vinorelbina preparados con el metodo TEA-SOS en diversas cantidades de derivados del lfpido PEG.
Lfpido PEG
Cantidad del lfpido PEG, mol. % del lfpido total Tamano del liposoma, nm (promedio SD) Carga de farmaco, mg/mmol de fosfolfpido Eficacia de carga, % encapsulacion
PEG-DSPE
0,3 108 ± 32 359,5 ± 17,8 102,7 ± 5,2
PEG-DSPE
0,6 110 ± 18 346,6 ± 14,5 99,0 ± 4,1
PEG-DSPE
1,8 104 ± 35 332,0 ± 14,0 94,9 ± 3,8
PEG-DSPE
2,9 94 ± 33 259,8 ± 9,5 74,2 ± 2,0
PEG-DSPE
4,0 100 ± 36 155,4 ± 7,0 44,4 ± 0,9
PEG-DSPE
5,7 103 ± 31 61,2 ± 5,2 17,5 ± 0,3
PEG-DSG
5,7 97 ± 36 362,7 ± 14,2 103,6 ± 4,2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 73. Efecto del agente de captura del farmaco intraliposomal en la duracion de CPT-11 en sangre en ratones.
Los liposomas con soluciones a 0,65 N de sales de trietilamonio (TEA) o trietanolamonio (TEOA) capturadas de hexafosfato de inositol (IHP, acido fftico) u octasulfato de sacarosa se prepararon y cargaron con CPT-11 a 500 g/mol de fosMpido siguiendo el procedimiento general descrito en el Ejemplo 66. Los liposomas se administraron intravenosamente a ratones Swiss-Webster con una dosis de 5 mg CPT-l1/kg de peso corporal. 24 horas despues, los ratones se anestesiaron y desangraron mediante una puncion a corazon abierto. La sangre se recogio, se analizo para conocer el contenido de CPT-11 en el plasma sangumeo mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 68, y la cantidad de farmaco se expreso como % de la dosis inyectada remanente en la sangre (% de D.I.). TEOA-IHP era menos efectivo a la hora de mejorar la duracion en sangre del farmaco que TEA-IHP, TEOA-SOAS y TEA-SOS (Tabla 39).
Tabla 39. Permanencia de CPT-11 en sangre 24 horas despues de la administracion intravenosa de liposomas CPT-11 en ratones.
Agente de captura del farmaco intraliposomal
% de D.I. remanente en la sangre
TEOA-IHP
2,74 ± 0,54
TEA-IHP
5,86 ± 0,20
TEOA-SOS
7,03 ± 0,17
TEA-SOS
11,32 ± 0,46
Ejemplo 74. Carga del farmaco en liposomas que contienen octasulfato de sacarosa dietilamonio 1,05 N
Se preparo una solucion acuosa de octasulfato de sacarosa dietilamonio 1,05 N (DEA-SOS) pH 6,0, osmolaridad 727 mmol/kg, usando el metodo de intercambio de iones/titulacion descrito en el Ejemplo 6 empleando dietilamina pura (pureza del 99,5%). La matriz lfpida de 3 partes molares de DSPC, 2 partes molares de colesterol y 0,015 partes molares de PEG2000-DSPE, se formulo en liposomas (tamano promedio ponderado en volumen 92,4 nm) en presencia de la solucion DEA-SOS, y se cargo en CPT-11 en los liposomas en diversas relaciones de entrada de farmaco/lfpido siguiendo el metodo del Ejemplo 11. El farmaco no encapsulado se extrajo mediante cromatograffa en gel y se determino la cantidad de farmaco encapsulado por lfpido unitario (relacion de salida farmaco/lfpido). Se calculo la eficacia de encapsulacion como % de la relacion de salida farmaco/lfpido en relacion con la relacion de entrada. Los resultados se muestran en la Tabla 40. La carga consiguio su nivel maximo de aproximadamente 1,76 mol de farmaco por mol fosfolfpido (1,67-1,70 mol farmaco/g lfpido total), lo que coincide bastante bien con la cantidad (1,78 mol de dietilamonio/mol de fosfolfpido) basado en el contenido de dietilamonio de los liposomas, suponiendo un intercambio estequiometrico de iones de dietilamonio intraliposomal para las moleculas de farmaco y un volumen capturado intraliposomal estimado de unos 1,7 l/mol de fosfolfpido.
Tabla 40. Carga de CPT-11 en liposomas de DSPC/Chol/PEG-DSPE que contienen DEA-SOS 1,05 N.
Proporcion de entrada farmaco/lfpido, mol/g
Proporcion de salida farmaco/lfpido, mol/g Eficacia de encapsulacion, %
1,25
1,247 ± 0,038 99,8 ± 3,0
1,50
1,534 ± 0,052 102,3 ± 3,5
1,80
1,669 ± 0,043 92,7 ± 2,4
2,06
1,690 ± 0,054 82,0 ± 2,6
2,20
1,704 ± 0,062 77,5 ± 2,8
2,42
1,685 ± 0,103 69,6 ± 4,3
Salvo que se indique lo contrario, los datos analfticos se presentan como un promedio ± error estandar de analisis por triplicado. Los datos sobre farmacocinetica de plasma de rata son el promedio ± error estandar de analisis duplicados.

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Una composicion que comprende un liposoma en un medio, en donde el liposoma comprende 1,2- diestearoil-SN-fosfatidilcolina, colesterol y N-(omega-metoxi-poli[etilenglicol]oxicarbonil)-1,2- distearoilfosfatidil-etanolamina en la relacion molar 3:2:0,015, y capturados en el interior del liposoma se encuentran irinotecan y octasulfato de sacarosa.
    2 La composicion de la reivindicacion 1, en donde el trietilamonio tambien esta capturado en el interior del
    liposoma.
  2. 3. Una composicion farmaceutica que comprende la composicion del liposoma de la reivindicacion 1, un portador aceptable a nivel farmaceutico y una sustancia tampon.
  3. 4. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 3, en la que el pH esta entre 6,0 y 7,5.
  4. 5. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, en donde la composicion farmaceutica se prepara como un inyectable.
  5. 6. La composicion de la reivindicacion 1, o la composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde el N-(omega-metoxi-poli[etilenglicol]oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidil - etanolamina es N- (omega-metoxi-poli[etilenglicol] (peso molecular 2000)-oxicarbonil)-1,2-distearoilfosfatidil etanolamina.
ES05745505.7T 2004-05-03 2005-05-02 Liposomas útiles para la administración de fármacos Active ES2616047T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56792104P 2004-05-03 2004-05-03
US567921P 2004-05-03
PCT/US2005/015349 WO2005107712A1 (en) 2004-05-03 2005-05-02 Liposomes useful for drug delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2616047T3 true ES2616047T3 (es) 2017-06-09

Family

ID=35320018

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05745505.7T Active ES2616047T3 (es) 2004-05-03 2005-05-02 Liposomas útiles para la administración de fármacos
ES23165619T Active ES2967961T3 (es) 2004-05-03 2005-05-02 Liposomas útiles en la administración de fármacos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES23165619T Active ES2967961T3 (es) 2004-05-03 2005-05-02 Liposomas útiles en la administración de fármacos

Country Status (20)

Country Link
US (22) US8147867B2 (es)
EP (3) EP3173073A1 (es)
JP (3) JP4971142B2 (es)
KR (4) KR101376895B1 (es)
CN (3) CN103948545B (es)
AU (1) AU2005240131C1 (es)
CA (4) CA2821167C (es)
DK (1) DK1746976T3 (es)
ES (2) ES2616047T3 (es)
FR (1) FR17C1027I2 (es)
HK (2) HK1200694A1 (es)
LU (1) LUC00026I2 (es)
NL (1) NL300885I2 (es)
NO (2) NO345218B1 (es)
PL (1) PL1746976T3 (es)
PT (1) PT1746976T (es)
RU (3) RU2574926C9 (es)
TW (1) TWI359029B (es)
UA (1) UA86063C2 (es)
WO (1) WO2005107712A1 (es)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
KR101376895B1 (ko) 2004-05-03 2014-03-25 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
AP2255A (en) * 2004-06-01 2011-07-21 Yakult Honsha Kk Irinotecan preparation.
CA2581133A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 British Columbia Cancer Agency Free or liposomal gemcitabine alone or in combination with free or liposomal idarubicin
CA2584279C (en) * 2004-11-05 2015-01-27 Index Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for stabilizing liposomal drug formulations
US8349359B2 (en) * 2004-11-07 2013-01-08 Your Energy Systems, LLC Liposomal formulation for oral administration of glutathione (reduced)
US20090148506A1 (en) * 2005-12-22 2009-06-11 Awa Dicko Liposomal formulations comprising secondary and tertiary amines and methods for preparing thereof
DE102006015271A1 (de) * 2006-04-01 2007-10-11 Lohmann & Rauscher Gmbh & Co. Kg Biguanidhaltige Liposomen
US8343539B2 (en) * 2006-07-14 2013-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Compounds that bind α5β1 integrin and methods of use
US20080118500A1 (en) * 2006-11-16 2008-05-22 Taiwan Liposome Company Sustained releasing composition via local injection for treating eye diseases
CN101209243B (zh) * 2006-12-29 2010-12-08 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种脂质体药物及其制备方法
FR2910812B1 (fr) * 2006-12-29 2009-03-20 Pierre Fabre Medicament Sa Compositions pharmaceutiques injectables lyophilisees de derives hemi-synthetiques d'alcaloide de vinca stables a temperature ambiante
JP5515075B2 (ja) * 2007-01-18 2014-06-11 国立大学法人 千葉大学 微粒子製剤
WO2008114274A1 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 Fresenius Kabi Onclology Ltd. Proliposomal and liposomal compositions
US20100173014A1 (en) * 2007-05-24 2010-07-08 Nanosolutions, Llc Methods of making and using nano scale particles
US20080305157A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 University Of Maryland Office Of Technology Commercialization Encapsulation and separation of charged organic solutes inside catanionic vesicles
EP2200613B1 (en) 2007-09-21 2018-09-05 The Johns Hopkins University Phenazine derivatives and uses thereof
JP2011508780A (ja) * 2008-01-04 2011-03-17 ケラー，ブライアン，チャールズ 抗真菌薬の増強された送達
CN101536981B (zh) * 2008-03-19 2010-11-17 上海医药工业研究院 一种盐酸可乐定多囊脂质体及其制备方法
WO2009138806A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Dendrigen S.A. Novel liposome cocktail formulations containing doxorubicin and the potent multidrug resistance inhibitor amiodarone
EP2123258A1 (en) 2008-05-23 2009-11-25 Liplasome Pharma A/S Liposomes for drug delivery
EP2282724B1 (en) * 2008-05-23 2018-09-05 The University Of British Columbia Modified drugs for use in liposomal nanoparticles
US9492417B2 (en) 2008-08-21 2016-11-15 The Johns Hopkins University Methods and compositions for administration of 3-halopyruvate and related compounds for the treatment of cancer
CN101565384B (zh) * 2008-12-23 2012-12-26 南开大学 环糊精修饰单层石墨及其超分子复合物和制备方法及用途
EP2601934A1 (en) * 2009-01-22 2013-06-12 Ludwig-Maximilians-Universität München Vesicular phospholipid gels comprising proteinaceous substances
JP5588619B2 (ja) * 2009-03-11 2014-09-10 一丸ファルコス株式会社 ｐＨ応答性リポソーム
EP2415464B1 (en) * 2009-03-30 2017-05-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for producing liposome composition
CN102369008B (zh) 2009-03-30 2014-10-29 卫材R&D管理有限公司 脂质体组合物
JP5392707B2 (ja) * 2009-03-31 2014-01-22 株式会社Ｎｔｔドコモ 膜小胞分裂システム
BRPI1012980A2 (pt) * 2009-05-19 2016-03-29 Vivia Biotech Sl dispositivo e métodos para analisar a capacidade de resposta celular e a resposta de células neoplásticas a drogas
DK177532B1 (en) 2009-09-17 2013-09-08 Bio Bedst Aps Medical use of sPLA2 hydrolysable liposomes
RU2526114C2 (ru) * 2009-12-03 2014-08-20 Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. Липосомы иринотекана или его солей, способ их получения
KR101000358B1 (ko) 2010-04-29 2010-12-13 서울대학교산학협력단 인테그린 αⅤβ３ 결합성 지질 유도체 및 그를 포함하는 지질 나노입자
SG185366A1 (en) 2010-05-04 2012-12-28 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against epidermal growth factor receptor (egfr) and uses thereof
CN103153283B (zh) 2010-06-19 2017-05-17 健康科学西部大学 Peg化脂质体包封的糖肽抗生素的新制剂
JP6046041B2 (ja) 2010-10-25 2016-12-14 メドトロニック アーディアン ルクセンブルク ソシエテ ア レスポンサビリテ リミテ 神経変調療法の評価及びフィードバックのためのデバイス、システム、及び方法
US20130302253A1 (en) * 2011-01-28 2013-11-14 Koninklijke Philips N.V. Carriers for the local release of hydrophilic prodrugs
US20140205654A1 (en) * 2011-04-26 2014-07-24 Cedars-Sinai Medical Center Liposomal vancomycin for the treatment of mrsa infections
SG2014010409A (en) 2011-05-10 2014-05-29 Penn State Res Found Ceramide anionic liposome compositions
US8691231B2 (en) 2011-06-03 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of tumors expressing predominantly high affinity EGFR ligands or tumors expressing predominantly low affinity EGFR ligands with monoclonal and oligoclonal anti-EGFR antibodies
CN102805729A (zh) * 2011-06-03 2012-12-05 齐鲁制药有限公司 一种长春氟宁脂质体制剂及其制备方法
ES2764105T3 (es) * 2011-10-17 2020-06-02 Massachusetts Inst Technology Administración intracelular
WO2013152034A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of monospecific and bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
US9511155B2 (en) 2012-04-17 2016-12-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-invasive imaging
AU2013202947B2 (en) 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
US9717724B2 (en) 2012-06-13 2017-08-01 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies
KR101949125B1 (ko) 2012-07-04 2019-02-18 고려대학교 산학협력단 ｐＨ 민감성 형광 발광의 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 포함하는 약물 전달체
JP6230538B2 (ja) * 2012-08-10 2017-11-15 大鵬薬品工業株式会社 安定なオキサリプラチン封入リポソーム水分散液及びその安定化方法
RU2655964C2 (ru) 2012-11-20 2018-05-30 Спектрум Фармасьютикалз, Инк. Улучшенный способ получения инкапсулированного в липосомы винкристина для терапевтического применения
RU2514000C1 (ru) * 2012-12-14 2014-04-27 Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий" Липосомальная композиция и способ ее получения
EP3922241B1 (en) 2013-02-01 2023-11-15 Celator Pharmaceuticals, Inc. Remote loading of sparingly water-soluble drugs into liposomes
US10828255B2 (en) 2013-03-05 2020-11-10 The Regents Of The University Of California Lipid bilayer coated mesoporous silica nanoparticles with a high loading capacity for one or more anticancer agents
US9993427B2 (en) 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
SG11201507110WA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Taiwan Liposome Co Ltd Engineering a control drug release profile via liposome composition in both aqueous andnon-aqueous compartments
US10220095B2 (en) * 2013-03-15 2019-03-05 Taiwan Liposome Company, Ltd Controlled drug release liposome compositions and methods thereof
RU2015145135A (ru) * 2013-04-09 2017-05-12 Крессет Биомолекьюлар Дискавери Лтд Лечение воспалительных расстройств
WO2014179760A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
WO2015061592A1 (en) * 2013-10-23 2015-04-30 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes for non-invasive imaging and drug delivery
US9592198B2 (en) * 2013-10-28 2017-03-14 University Of Maryland, College Park Microfluidic liposome synthesis, purification and active drug loading
US20170224726A1 (en) 2014-02-18 2017-08-10 Glenn Abrahmsohn Compositions and methods for pain relief without numbness
JP6263609B2 (ja) * 2014-04-30 2018-01-17 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物及びその製造方法
WO2015166987A1 (ja) 2014-04-30 2015-11-05 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物及びその製造方法
PL3138555T3 (pl) * 2014-04-30 2021-04-06 Fujifilm Corporation Kompozycja liposomowa i sposób jej wytwarzania
MA39599A (fr) 2014-05-14 2016-10-05 Merrimack Pharmaceuticals Inc Dosage et administration d'agents thérapeutiques anti-egfr
EP3177269A4 (en) 2014-08-04 2018-02-28 Zoneone Pharma, Inc. Remote loading of sparingly water-soluble drugs into lipid vesicles
US20170246175A1 (en) * 2014-09-24 2017-08-31 Nanyang Technological University Sustained timolol maleate delivery from liposomes for glaucoma therapy and occular hypertension
EP3229802A1 (en) 2014-12-09 2017-10-18 Ipsen Biopharm Ltd. Treatment of breast cancer with liposomal irinotecan
US11318131B2 (en) 2015-05-18 2022-05-03 Ipsen Biopharm Ltd. Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
US9931298B2 (en) * 2015-05-26 2018-04-03 Comfort Care For Animals Llc Liposome loading
US9855216B2 (en) * 2015-05-27 2018-01-02 Ghasem Amoabediny Targeted nano-liposome co-entrapping anti-cancer drugs
TWI678213B (zh) 2015-07-22 2019-12-01 美商史倍壯製藥公司 用於長春新鹼硫酸鹽脂質體注射之即可使用的調配物
CA2992789A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Ipsen Biopharm Ltd. Combination therapy using liposomal irinotecan and a parp inhibitor for cancer treatment
WO2017034418A1 (en) * 2015-08-21 2017-03-02 Reynolds John Noble James Acoustic driven drug delivery systems
EP3791876A1 (en) 2015-08-21 2021-03-17 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating metastatic pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan and oxaliplatin
US11613759B2 (en) 2015-09-04 2023-03-28 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
EP3349731B1 (en) 2015-09-16 2023-11-01 Board of Regents, The University of Texas System Combination of topoisomerase-i inhibitors with immunotherapy in the treatment of cancer
JP6924431B2 (ja) * 2015-10-13 2021-08-25 株式会社ケーナインラボ ヒトを除く哺乳動物への薬剤の投与方法
CN105153339B (zh) * 2015-10-13 2017-10-24 浙江大学 一种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物、制备方法和应用
MX2018004328A (es) * 2015-10-16 2018-08-01 Ipsen Biopharm Ltd Composiciones farmaceuticas estabilizantes de camptotecina.
US20170319573A1 (en) * 2015-10-16 2017-11-09 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing Camptothecin Pharmaceutical Compositions
ES2869283T3 (es) * 2015-11-02 2021-10-25 Fujifilm Corp Agente terapéutico antitumoral que contiene composición de liposoma de gemcitabina y kit
WO2017078009A1 (ja) * 2015-11-02 2017-05-11 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物およびその製造方法
WO2017079563A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Johns Hopkins University Methods of treating liver fibrosis by administering 3-bromopyruvate
PL3373910T3 (pl) 2015-11-10 2023-10-09 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Preparat echinomycyny, sposób wytwarzania i sposób stosowania
CN105287264B (zh) * 2015-11-25 2018-06-19 上海赢嘉实业有限公司 一种包封芳香油复合物的脂质体的制备方法和用途
US20180271998A1 (en) 2015-12-04 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
CN105496992A (zh) * 2015-12-08 2016-04-20 青岛正大海尔制药有限公司 氨溴索沙丁胺醇脂质固体分散体
JP7068173B2 (ja) * 2016-01-08 2022-05-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア カーゴ送達のための、脂質二重層コーティングを備えたメソ多孔性シリカナノ粒子
US10570119B2 (en) 2016-01-11 2020-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Inhibiting ataxia telangiectasia and Rad3-related protein (ATR)
AU2017206731A1 (en) * 2016-01-11 2018-08-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Inhibiting B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and related proteins
EP3416623B1 (en) * 2016-02-15 2021-08-11 University of Georgia Research Foundation, Inc. Ipa-3-loaded liposomes and methods of use thereof
CN108697681B (zh) * 2016-02-15 2022-01-25 建明(中国)科技有限公司 水溶性亲脂性材料
WO2017161071A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc Treating ephrin receptor a2 (epha2) positive cancer with targeted docetaxel-generating nano-liposome compositions
SG11201807148RA (en) 2016-03-16 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals Inc Ephrin receptor a2 (epha2)-targeted docetaxel-generating nano-liposome compositions
CN109640995A (zh) * 2016-05-18 2019-04-16 易普森生物制药有限公司 用脂质体伊立替康治疗小细胞肺癌
US9655847B1 (en) * 2016-07-18 2017-05-23 National Guard Health Affairs Therapeutic liposome and method of treating a subject having cancer
US10583083B1 (en) * 2016-08-10 2020-03-10 Verily Life Sciences Llc ROS-responsive multilamellar liposomal vesicles for targeting inflammatory macrophages
US10517823B1 (en) 2016-08-10 2019-12-31 Verily Life Sciences Llc ROS—responsive liposomes for specific targeting
CA3033077C (en) 2016-08-12 2024-06-18 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha and gamma-d polyglutamated antifolates and uses thereof
WO2018031967A1 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Polyglutamated antifolates and uses thereof
KR20190041519A (ko) * 2016-08-31 2019-04-22 큐피가부시키가이샤 난황 인지질 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 그 난황 인지질 조성물을 사용한 지방 유제 및 리포화 제제
MX2019002733A (es) * 2016-09-09 2019-08-29 Irisys Inc Composiciones anticancerígenas liposomales.
SG11201903615WA (en) 2016-11-02 2019-05-30 Ipsen Biopharm Ltd Treating gastric cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan, oxaliplatin, 5-fluoruracil (and leucovorin)
US10800817B2 (en) * 2016-12-19 2020-10-13 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release
AU2017258901A1 (en) 2016-12-30 2018-07-19 Allarity Therapeutics Europe ApS Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients
BR112019014718A2 (pt) * 2017-01-18 2020-03-10 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Lipossomas hiperestabilizados aumentam o direcio-namento de células mitóticas
WO2018218052A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Northwestern University Nanoparticle-lipid composite carriers and uses thereof
CN108926719B (zh) * 2017-05-25 2020-09-01 北京格瑞特森生物医药科技有限公司 用c(RGD-ACP-K)修饰的长循环脂质体
KR102444524B1 (ko) * 2017-09-12 2022-09-19 오르가노 코포레이션 전해액의 정제장치 및 정제방법
WO2019054220A1 (ja) * 2017-09-12 2019-03-21 オルガノ株式会社 電解液の精製装置および精製方法
CN108047494B (zh) * 2017-11-15 2019-11-08 四川大学 植酸铵盐阻燃剂及其制备方法和用以制备的阻燃增韧聚乳酸材料
CN109364025A (zh) * 2017-11-17 2019-02-22 和龙 脂质体组合物、其制备方法及其应用
CA3090387A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated pralatrexate and uses thereof
WO2019157123A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated aminopterin and uses thereof
EP3749314A4 (en) * 2018-02-07 2022-02-23 L.E.A.F Holdings Group LLC METHOTREXATE ALPHA-POLYGLUTAMATE AND ASSOCIATED USES
US20210338675A1 (en) * 2018-02-07 2021-11-04 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated lometrexol and uses thereof
EP3749317A4 (en) 2018-02-07 2022-06-22 L.E.A.F Holdings Group LLC PEMETREXED ALPHA-POLYGLUTAMATE AND ASSOCIATED USES
CN111954530A (zh) * 2018-02-07 2020-11-17 L.E.A.F.控股集团公司 γ聚谷氨酸化培美曲塞及其用途
CA3090875A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated lometrexol and uses thereof
CN111936145A (zh) * 2018-02-14 2020-11-13 L.E.A.F.控股集团公司 γ聚谷氨酸化氨甲蝶呤及其用途
CA3090753A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated pralatrexate and uses thereof
US20210338583A1 (en) * 2018-07-23 2021-11-04 Robert B. Campbell Cell membrane lipid-extracted nanoparticles (clens) for selective targeting, image analysis and cancer therapy
TWI767133B (zh) * 2018-08-02 2022-06-11 台灣微脂體股份有限公司 含有治療憂鬱症或焦慮症之治療劑的緩釋組合物及其用途
CN112543630B (zh) * 2018-08-08 2023-07-18 台湾微脂体股份有限公司 含有抗精神病药物的缓释药物组合物及其用途
US20210393524A1 (en) * 2018-10-17 2021-12-23 Taiwan Liposome Co., Ltd. Sustained-release pharmaceutical compositions comprising an immunomodulating agent and uses thereof
CN109528654B (zh) * 2018-12-14 2021-04-23 沈阳药科大学 一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法
CN109528655A (zh) * 2018-12-18 2019-03-29 沈阳药科大学 一种双载药脂质体及其制备和应用
WO2020176789A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Sqz Biotechnologies Company Delivery of biomolecules to pbmcs to modify an immune response
EP3953039A1 (en) 2019-04-08 2022-02-16 SQZ Biotechnologies Company Cartridge for use in a system for delivery of a payload into a cell
WO2020242996A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Nevakar Inc. Vancomycin liposome compositions and methods
EP3753549A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-23 InnoMedica Holding AG Liposomal doxorubicin formulation, method for producing a liposomal doxorubicin formulation and use of a liposomal doxorubicin formulation as a medicament
AU2020315645A1 (en) * 2019-07-16 2022-02-17 Coastar Therapeutics Inc. Process of making membrane lipid coated nanoparticles
US11083705B2 (en) 2019-07-26 2021-08-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating tumor
WO2021183131A1 (en) * 2020-03-12 2021-09-16 Aphios Corporation Dosage forms for improving organ transplantation, graft versus host disease and stem cells transplants
BR112022025918A2 (pt) 2020-06-18 2023-03-14 Akagera Medicines Inc Compostos de oxazolidinona, composições lipossomais que compreendem compostos de oxazolidinona e métodos de uso dos mesmos
CN112190715B (zh) * 2020-10-21 2022-09-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 纳米药物、其制备方法及医药应用
US11058637B1 (en) * 2020-11-25 2021-07-13 King Abdulaziz University Surface-modified emulsomes for intranasal delivery of drugs
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
WO2022153211A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Sun Pharma Advanced Research Company Limited Liposomal composition of a camptothecin derivative
WO2022171777A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for prognosis and treating a patient suffering from cancer
WO2023288103A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 Celator Pharmaceuticals, Inc. Methods for preparing liposomal formulations
WO2023029041A1 (zh) * 2021-09-06 2023-03-09 北京茵诺医药科技有限公司 靶向动脉粥样硬化脂质体纳米载体递送系统及其制备方法
CN117750944A (zh) * 2021-09-30 2024-03-22 上海济煜医药科技有限公司 一种酒石酸长春瑞滨脂质体及其原料组合物、制备方法和应用
EP4169928A1 (en) * 2021-10-25 2023-04-26 Sandoz Ag Process for the preparation of sucrose octasulfate octakistriethylammonium salt (tasos) powder and uses thereof
CN114099691A (zh) * 2021-11-22 2022-03-01 京东方科技集团股份有限公司 一种人造细胞及其制备方法
WO2023112038A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Immunyx Pharma Ltd. Neutrophil exocytosis inhibitors
CN114306243B (zh) * 2022-01-07 2023-03-28 中国人民解放军空军军医大学 一种靶向梭型柔性脂质体水凝胶及其制备方法和应用
CN116602923A (zh) * 2023-07-20 2023-08-18 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种用于关节炎治疗的靶向仿生纳米治疗载体系统

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4192869A (en) * 1977-09-06 1980-03-11 Studiengesellschaft Kohle Mbh. Controlled improvement of the O2 release by intact erythrocytes with lipid vesicles
ES473087A1 (es) * 1977-09-06 1979-04-16 Studiengesellschaft Kohle Mbh Procedimiento para la preparacion de eritrocitos intactos modificados.
DE2740053A1 (de) * 1977-09-06 1979-05-03 Klaus Prof Dr Med Gersonde Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten
US4397846A (en) 1981-05-15 1983-08-09 Murray Weiner Storage-stable lipid vesicles and method of preparation
US5059591B1 (en) * 1983-05-26 2000-04-25 Liposome Co Inc Drug preparations of reduced toxicity
JPS6019790A (ja) 1983-07-14 1985-01-31 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体
IL72420A (en) 1983-07-22 1987-10-30 Hoffmann La Roche Aqueous vitamin e solutions and their manufacture
US5736155A (en) * 1984-08-08 1998-04-07 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US5077056A (en) * 1984-08-08 1991-12-31 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US4755388A (en) 1984-11-09 1988-07-05 The Regents Of The University Of California Liposome-encapsulated 5-fluoropyrimidines and methods for their use
DE3634392A1 (de) 1986-10-09 1988-04-14 Knoll Ag Verwendung polysulfatierter niedermolekularer dextransulfate
MX9203808A (es) * 1987-03-05 1992-07-01 Liposome Co Inc Formulaciones de alto contenido de medicamento: lipido, de agentes liposomicos-antineoplasticos.
JPH0720857B2 (ja) 1988-08-11 1995-03-08 テルモ株式会社 リポソームおよびその製法
IL91664A (en) * 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
US5043165A (en) * 1988-12-14 1991-08-27 Liposome Technology, Inc. Novel liposome composition for sustained release of steroidal drugs
US5043164A (en) 1989-01-17 1991-08-27 The University Of Tennessee Research Corporation Blood-stable, cholesterol-free liposomes
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
US5618798A (en) * 1989-04-20 1997-04-08 Bar-Shalom; Daniel Use of sucralfate to treat baldness
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
PL296382A1 (en) 1991-02-02 1993-11-02 Nika Health Products Ltd Li Li Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system
US5498420A (en) 1991-04-12 1996-03-12 Merz & Co. Gmbh & Co. Stable small particle liposome preparations, their production and use in topical cosmetic, and pharmaceutical compositions
ATE128621T1 (de) * 1991-07-03 1995-10-15 Vestar Inc Beladungstechnik zur herstellung arzneistoffhaltiger liposomen.
US5281237A (en) 1992-09-25 1994-01-25 Gimpelson Richard J Surgical stitching device and method of use
US5552156A (en) 1992-10-23 1996-09-03 Ohio State University Liposomal and micellular stabilization of camptothecin drugs
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
DE4320597A1 (de) 1993-06-22 1995-01-05 Heinz C Prof Dr Dr Schroeder Verwendung von Polyphosphaten zur antiviralen Therapie und als Immunmodulatoren
US6743917B2 (en) * 1993-06-30 2004-06-01 University Of Pittsburgh Camptothecin analogs and methods of preparation thereof
US5994341A (en) 1993-07-19 1999-11-30 Angiogenesis Technologies, Inc. Anti-angiogenic Compositions and methods for the treatment of arthritis
US5534241A (en) * 1993-07-23 1996-07-09 Torchilin; Vladimir P. Amphipathic polychelating compounds and methods of use
US5538954A (en) * 1994-06-24 1996-07-23 A/S Dumex (Dumex Ltd.) Salts of tetracyclines
GB9323588D0 (en) 1993-11-16 1994-01-05 Cortecs Ltd Hydrophobic preparation
NZ279953A (en) * 1994-02-04 1998-02-26 Scotia Lipidteknik Ab Lipid-polar solvent bilayer carrier preparation (eg liposomes) comprising digalactosyldiacylglycerols as the bilayer material
US6312719B1 (en) 1994-03-04 2001-11-06 The University Of British Columbia Liposome compositions and methods for the treatment of atherosclerosis
US6110481A (en) * 1994-03-04 2000-08-29 Trustees Of The Stevens Institute Of Technology Controlled release device based on aqueous-organic partitioning in porous membranes
US5783568A (en) 1994-06-10 1998-07-21 Sugen, Inc. Methods for treating cancer and other cell proliferative diseases
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
GB9424902D0 (en) 1994-12-09 1995-02-08 Cortecs Ltd Solubilisation Aids
AU4981896A (en) 1995-02-14 1996-09-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome composition and method for administering liposome-loadable drugs
US5800833A (en) 1995-02-27 1998-09-01 University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
DE69700887T2 (de) 1996-01-31 2000-06-29 Nisshin Flour Milling Co Isoprenderivate
DE19605024A1 (de) 1996-01-31 1997-08-07 Schering Ag Neue selektive Taxane, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung
US6441025B2 (en) 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
CA2252055C (en) 1996-04-11 2007-01-16 The University Of British Columbia Fusogenic liposomes
US5997899A (en) 1996-10-01 1999-12-07 Skyepharma Inc. Method for producing liposomes with increased percent of compound encapsulated
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
WO1998017256A1 (en) * 1996-10-22 1998-04-30 Dmitri Kirpotin Compound-loaded liposomes and methods for their preparation
US6210707B1 (en) 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US6143740A (en) 1996-11-19 2000-11-07 Georgetown University Heregulin antagonists and methods for their use
US5827533A (en) 1997-02-06 1998-10-27 Duke University Liposomes containing active agents aggregated with lipid surfactants
WO1998051302A1 (en) * 1997-05-15 1998-11-19 University Of Washington Composition and methods for treating alzheimer's disease and other amyloidoses
US6063400A (en) 1997-07-02 2000-05-16 Sdg, Inc. Targeted liposomal constructs for diagnostic and therapeutic uses
US6316612B1 (en) 1997-08-22 2001-11-13 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Xylofuranosly-containing nucleoside phosphoramidites and polynucleotides
US6083923A (en) 1997-10-31 2000-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Liposomal oligonucleotide compositions for modulating RAS gene expression
US6787132B1 (en) 1997-12-04 2004-09-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Combined chemo-immunotherapy with liposomal drugs and cytokines
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
RU2130771C1 (ru) * 1998-06-01 1999-05-27 Автушенко Сергей Сергеевич Способ получения липосомальных препаратов
US6726925B1 (en) * 1998-06-18 2004-04-27 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
GB9813100D0 (en) 1998-06-18 1998-08-19 Secr Defence Method of forming liposomes
US6200598B1 (en) 1998-06-18 2001-03-13 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
AU1678900A (en) 1998-08-11 2000-03-06 All India Institute Of Medical Sciences A novel liposomal formulation useful in treatment of cancer and other proliferation diseases
ATE355827T1 (de) 1998-08-12 2007-03-15 Yissum Res Dev Co Mittels ammoniumsulfatgradient hergestellte liposomale therapeutische zusammensetzungen
DK1121102T3 (da) * 1998-09-16 2003-08-11 Alza Corp Liposomindesluttede topoisomeraseinhibitorer
US6291676B1 (en) * 1999-03-03 2001-09-18 University Of Kentucky Research Foundation Water-soluble derivatives of camptothecin/homocamptothecin
US7311924B2 (en) 1999-04-01 2007-12-25 Hana Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer
DE60008234T2 (de) 1999-04-29 2004-12-30 Alza Corp., Mountain View Liposomenzusammensetzungen zur verbesserten wirkstoffzurückhaltung
US6720001B2 (en) 1999-10-18 2004-04-13 Lipocine, Inc. Emulsion compositions for polyfunctional active ingredients
US6511676B1 (en) * 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US20020049176A1 (en) * 1999-11-10 2002-04-25 Anderson Christen M. Modulation of mitochondrial mass and function for the treatment of diseases and for target and drug discovery
WO2001056548A2 (en) * 2000-02-04 2001-08-09 Lipoxen Technologies Limited Liposomes composition produced by a dehydration-rehydration process
US6545010B2 (en) 2000-03-17 2003-04-08 Aventis Pharma S.A. Composition comprising camptothecin or a camptothecin derivative and a platin derivative for the treatment of cancer
CA2408710C (en) 2000-05-15 2010-01-26 Celgene Corp. Compositions and methods for the treatment of colorectal cancer
ATE309787T1 (de) 2000-06-30 2005-12-15 Inex Pharmaceuticals Corp Verbesserte liposomale camptothecine und deren verwendungen
US6486320B2 (en) 2000-09-15 2002-11-26 Aventis Pharma S.A. Preparation of camptothecin and of its derivatives
EP1341497A4 (en) 2000-11-02 2005-10-19 Smithkline Beecham Corp RECEPTOR-LIPID ANTAGONIST CONJUGATES AND DELIVERY VEHICLES CONTAINING THE SAME
WO2002062316A1 (de) 2001-02-08 2002-08-15 Vectron Therapeutics Ag Invasomen zur therapie von erkrankungen, ihre herstellung und verwendung
CA2442261A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-03 Alza Corporation Liposome composition for improved intracellular delivery of a therapeutic agent
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
WO2003030864A1 (en) * 2001-05-29 2003-04-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of irinotecan
IL161187A0 (en) * 2001-10-03 2004-08-31 Celator Technologies Inc Liposome compositions containing metal ions and therapeutic agents
US7850990B2 (en) 2001-10-03 2010-12-14 Celator Pharmaceuticals, Inc. Compositions for delivery of drug combinations
ITBO20010610A1 (it) * 2001-10-05 2003-04-05 Haworth S P A Dispositivo per la connessione di gambe ad elementi di arredamento, ed elemento di arredamento comprendente tale dispositivo
US20030129224A1 (en) * 2001-11-13 2003-07-10 Paul Tardi Lipid carrier compositions and methods for improved drug retention
JP4555569B2 (ja) 2001-11-13 2010-10-06 セレーター ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 増強された血中安定性を有する脂質キャリア組成物
US20030220284A1 (en) * 2002-02-22 2003-11-27 Patricia Yotnda Delivery of adenoviral DNA in a liposomal formulation for treatment of disease
US7084115B2 (en) 2002-04-29 2006-08-01 Oxyplus, Inc. Inositol pyrophosphates, and methods of use thereof
CA2752143C (en) 2002-05-15 2014-09-23 Sutter West Bay Hospitals Delivery of nucleic acid-like compounds
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
US20040243101A1 (en) * 2002-07-02 2004-12-02 Gillis Edward M. Minimally invasive drug delivery catheter
AU2003296897A1 (en) 2002-08-20 2004-05-04 Neopharm, Inc. Pharmaceutical formulations of camptothecine derivatives
AR036316A1 (es) 2002-08-29 2004-08-25 Monte Verde S A Una composicion farmaceutica de liposomas de tamano pequeno y metodo de preparacion
DE10242367A1 (de) 2002-09-12 2004-03-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Thermolabiles Liposom mit geregelter Freigabetemperatur
AU2003298738A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Su-Ming Chiang Liposomal formulations
EP1643972A4 (en) 2003-06-27 2010-01-20 Smithkline Beecham Corp STABILIZED LIPOSOMAL TOPOTECAN COMPOSITION AND METHOD
CA2530224A1 (en) * 2003-07-09 2005-02-24 California Pacific Medical Center Remote detection of substance delivery to cells
KR20070057701A (ko) 2004-03-17 2007-06-07 토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템 면역응답 시스템을 이용한 약물전달 시스템
KR101376895B1 (ko) * 2004-05-03 2014-03-25 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
AP2255A (en) 2004-06-01 2011-07-21 Yakult Honsha Kk Irinotecan preparation.
WO2006002050A1 (en) 2004-06-15 2006-01-05 Encore Therapeutics, Inc. Phospholipid compositions and methods for their preparation and use
JP4838255B2 (ja) * 2004-10-05 2011-12-14 ジェンザイム・コーポレーション 階段状カニューレ
US20060129126A1 (en) * 2004-11-19 2006-06-15 Kaplitt Michael G Infusion device and method for infusing material into the brain of a patient
US20060127467A1 (en) 2004-12-14 2006-06-15 Watkin Kenneth L Nanoparticles for delivery of therapeutic agents using ultrasound and associated methods
WO2006069181A2 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
US20100189771A1 (en) 2005-10-25 2010-07-29 Lawrence Mayer Fixed ratio drug combination treatments for solid tumors
US20090148506A1 (en) 2005-12-22 2009-06-11 Awa Dicko Liposomal formulations comprising secondary and tertiary amines and methods for preparing thereof
EA200802166A1 (ru) 2006-04-20 2009-06-30 Эмджен Инк. Стабильная фармацевтическая композиция с защитным действием от раздражения (варианты), способ ее получения и способ лечения кальций-миметиком с ее помощью
GB0614835D0 (en) 2006-07-26 2006-09-06 Isis Innovation Formation of bilayers of amphipathic molecules
EP3248617A3 (en) 2007-02-16 2018-02-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
WO2009097011A1 (en) 2007-08-17 2009-08-06 Celator Pharmaceuticals, Inc. Improved platinum drug formulations
JP2010540498A (ja) 2007-09-28 2010-12-24 ウニヴェルズィテーツシュピタール バーゼル 癌の治療のための免疫リポソーム
WO2009059449A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Celsion Corporation Novel thermosensitive liposomes containing therapeutic agents
US8067432B2 (en) 2008-03-31 2011-11-29 University Of Kentucky Research Foundation Liposomal, ring-opened camptothecins with prolonged, site-specific delivery of active drug to solid tumors
US8852630B2 (en) 2008-05-13 2014-10-07 Yale University Chimeric small molecules for the recruitment of antibodies to cancer cells
AU2013202947B2 (en) * 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
WO2016168451A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions for improving the pharmacokinetics and therapeutic index of cancer treatment
CA2992789A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Ipsen Biopharm Ltd. Combination therapy using liposomal irinotecan and a parp inhibitor for cancer treatment
MX2018004328A (es) 2015-10-16 2018-08-01 Ipsen Biopharm Ltd Composiciones farmaceuticas estabilizantes de camptotecina.
US20180110771A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Ipsen Biopharm Ltd. Liposomal Irinotecan Preparations
US20170202840A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Treatment of pancreatic cancer with liposomal irinotecan
US20170333421A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Ipsen Biopharm Ltd. Population Pharmacokinetics of Liposomal Irinotecan

Also Published As

Publication number Publication date
CA2821167C (en) 2016-06-28
CA2928387A1 (en) 2005-11-17
US20170079914A1 (en) 2017-03-23
RU2006142766A (ru) 2008-06-20
US20180169014A1 (en) 2018-06-21
US20160030342A1 (en) 2016-02-04
FR17C1027I2 (fr) 2020-09-04
US20210137914A1 (en) 2021-05-13
HK1200694A1 (en) 2015-08-14
US10722508B2 (en) 2020-07-28
US20150182460A1 (en) 2015-07-02
EP1746976B1 (en) 2017-01-11
NL300885I1 (es) 2017-07-19
US20180235954A1 (en) 2018-08-23
EP3173073A1 (en) 2017-05-31
RU2574926C9 (ru) 2020-06-16
NO345218B1 (no) 2020-11-09
US20140154298A1 (en) 2014-06-05
US9730891B2 (en) 2017-08-15
US20160030341A1 (en) 2016-02-04
US8703181B2 (en) 2014-04-22
CA2566007A1 (en) 2005-11-17
EP1746976A4 (en) 2010-09-29
EP4218730A1 (en) 2023-08-02
CA3006109A1 (en) 2005-11-17
CA2821167A1 (en) 2005-11-17
US20230181567A1 (en) 2023-06-15
KR20140000348A (ko) 2014-01-02
US10350201B2 (en) 2019-07-16
CN107811971A (zh) 2018-03-20
JP2014055172A (ja) 2014-03-27
KR101462825B1 (ko) 2014-11-21
RU2015155368A (ru) 2017-06-28
JP4971142B2 (ja) 2012-07-11
US20170079912A1 (en) 2017-03-23
US8329213B2 (en) 2012-12-11
CN103948545B (zh) 2017-10-03
UA86063C2 (ru) 2009-03-25
TWI359029B (en) 2012-03-01
US20160339014A1 (en) 2016-11-24
US20130122081A1 (en) 2013-05-16
RU2757110C2 (ru) 2021-10-11
AU2005240131B2 (en) 2011-03-03
HK1252167A1 (zh) 2019-05-17
CN1980637A (zh) 2007-06-13
JP5502842B2 (ja) 2014-05-28
US20160081928A1 (en) 2016-03-24
WO2005107712A1 (en) 2005-11-17
NO20065532L (no) 2006-12-13
CN1980637B (zh) 2014-02-19
US20160106672A1 (en) 2016-04-21
US9782349B2 (en) 2017-10-10
FR17C1027I1 (es) 2017-09-08
RU2011112461A (ru) 2012-10-10
RU2015155368A3 (es) 2019-08-19
US8147867B2 (en) 2012-04-03
EP1746976A1 (en) 2007-01-31
AU2005240131A1 (en) 2005-11-17
KR20130032401A (ko) 2013-04-01
KR20070036055A (ko) 2007-04-02
US20170071858A1 (en) 2017-03-16
DK1746976T3 (en) 2017-04-10
TW200605908A (en) 2006-02-16
US9724303B2 (en) 2017-08-08
US20160338956A1 (en) 2016-11-24
PL1746976T3 (pl) 2017-09-29
KR101223366B1 (ko) 2013-01-16
AU2005240131C1 (en) 2014-05-08
KR101462819B1 (ko) 2014-11-21
ES2967961T3 (es) 2024-05-06
US20120171283A1 (en) 2012-07-05
CN107811971B (zh) 2021-10-29
EP4218730B1 (en) 2023-11-01
JP5665950B2 (ja) 2015-02-04
US11052079B2 (en) 2021-07-06
LUC00026I2 (es) 2017-09-08
NL300885I2 (nl) 2022-02-24
JP2007536247A (ja) 2007-12-13
RU2424792C2 (ru) 2011-07-27
US8992970B2 (en) 2015-03-31
US20160095817A1 (en) 2016-04-07
US20070116753A1 (en) 2007-05-24
CN103948545A (zh) 2014-07-30
US20160095852A1 (en) 2016-04-07
US20170079913A1 (en) 2017-03-23
PT1746976T (pt) 2017-04-24
CA2566007C (en) 2013-09-24
LUC00026I1 (es) 2017-07-11
NO2021004I1 (no) 2021-01-22
US10413510B2 (en) 2019-09-17
US9717723B2 (en) 2017-08-01
KR20120082039A (ko) 2012-07-20
US20170340624A1 (en) 2017-11-30
KR101376895B1 (ko) 2014-03-25
JP2012092119A (ja) 2012-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2616047T3 (es) Liposomas útiles para la administración de fármacos
US9737528B2 (en) Liposomes useful for drug delivery to the brain
AU2016203354B2 (en) Liposomes useful for drug delivery
RU2574926C2 (ru) Липосомные композиции, используемые для доставки лекарственных средств