NO345218B1 - Sammensetning og farmasøytisk sammensetning omfattende et liposom - Google Patents

Sammensetning og farmasøytisk sammensetning omfattende et liposom Download PDF

Info

Publication number
NO345218B1
NO345218B1 NO20065532A NO20065532A NO345218B1 NO 345218 B1 NO345218 B1 NO 345218B1 NO 20065532 A NO20065532 A NO 20065532A NO 20065532 A NO20065532 A NO 20065532A NO 345218 B1 NO345218 B1 NO 345218B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
drug
liposomes
liposome
lipid
topotecan
Prior art date
Application number
NO20065532A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20065532L (no
Inventor
Keelung Hong
Daryl C Drummond
Dimitri Kirpotin
Original Assignee
Ipsen Biopharm Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35320018&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO345218(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ipsen Biopharm Ltd filed Critical Ipsen Biopharm Ltd
Publication of NO20065532L publication Critical patent/NO20065532L/no
Publication of NO345218B1 publication Critical patent/NO345218B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/12—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by acids having the group -X-C(=X)-X-, or halides thereof, in which each X means nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium, e.g. carbonic acid, carbamic acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/906—Drug delivery
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/906—Drug delivery
    • Y10S977/907—Liposome

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse angår generelt liposomer og mer spesifikt liposomsammensetninger nyttige for levering av terapeutiske eller diagnostiske helheter (”entities”).
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Liposomer, eller vesikler med lipiddobbeltlag, er anvendt eller foreslått for anvendelse i en rekke applikasjoner innen forskning, industri og medisin, spesielt for anvendelse som bærere av diagnostiske eller terapeutiske forbindelser in vivo. Se for eksempel: Lasic, D. Liposomes: from physics to applications. Elsevier, Amsterdam, 1993. Lasic, D. og Papahadjopoulos, D., red. Medical Applications of Liposomes. Elsevier, Amsterdam, 1998. Liposomer er vanligvis karakterisert ved å ha et indre rom adskilt fra et ytre medium ved en membran av ett eller flere dobbeltlag som danner en mikroskopisk sekk eller vesikkel. Dobbeltlagmembraner til liposomer er typisk dannet av lipider, dvs. amfifile molekyler av syntetisk eller naturlig opprinnelse som omfatter spatialt separerte hydrofile og hydrofobe domener. Se Lasic D., 1993, supra. Dobbeltlagmembraner til liposomene kan også dannes ved amfifile polymerer og overflateaktive midler (polymerosomer, niosomer). Et liposom tjener typisk som en bærer av en helhet slik som, uten begrensning, en kjemisk forbindelse, en kombinasjon av forbindelser, et supramolekylært kompleks av syntetisk eller naturlig opprinnelse, et genetisk materiale, en levende organisme, en del derav eller et derivat derav, som kan ha en nyttig egenskap eller som utøver en nyttig aktivitet.
For dette formålet blir liposomene fremstilt til å inneholde den ønskede helheten i en liposominnført form. Prosessen for innføring av en ønsket helhet i et liposom blir ofte henvist til som ”fylling” (”loading”). Den liposominnførte helheten kan være helt eller delvis lokalisert i det indre rommet av liposomet, i dobbeltlagmembranen til liposomet eller assosiert med den utvendige overflaten av liposommembranen. Innføring av helheter i liposomer er også henvist til som innkapsling eller omslutning (”entrapment”), og disse tre betegnelsene blir her anvendt om hverandre med samme betydning. Hensikten med liposomal innkapsling av en helhet er ofte for å beskytte helheten fra det destruktive miljøet, mens den innkapslede helheten får mulighet til å utøve sin aktivitet for det meste på stedet eller i miljøet der slik aktivitet er fordelaktig, men mindre på andre steder der slik aktivitet kan være unyttig eller uønsket. Dette fenomenet blir henvist til som levering. For eksempel kan en medikamentsubstans i liposomet beskyttes fra nedbrytning ved enzymer i kroppen, men blir frisatt fra liposomet og gir behandling på sykdomsstedet.
Ideelt kan slike liposomer fremstilles til å omfatte den ønskede forbindelsen (i) ved høy fyllingseffektivitet, dvs. høy prosent av innkapslet helhet i forhold til mengden anvendt i innkapslingsprosessen; (ii) stor mengde av innkapslet helhet per enhet av liposomdobbeltlagmateriale; (iii) ved en høy konsentrasjon av innkapslet helhet og (iv) i en stabil form, dvs. med liten frisetting (lekkasje) av en innkapslet helhet ved lagring eller generelt før liposomet kommer frem til stedet eller miljøet der den liposomomsluttede helheten er forventet å utøve dens tilsiktede aktivitet.
Det er derfor et behov på området for å tilveiebringe ulike liposomsammensetninger som er nyttige for levering av en rekke forbindelser, spesielt terapeutiske-, diagnostiske- eller avbildningshelheter.
Tzung-Han Chou, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003, 95(4), 405-408 angir liposomer fremstilt ved anvendelse av en EPC/Chol/PEG-DSPE-lipidblanding og som inneholder irinotekan og dekstransulfat. Da stabiliteten til disse liposomene ble testet in vitro, hadde omtrent 70% eller mer av irinotekanet lekket ut fra liposomene etter kun fire timer (se Figur 4 i Chou). Likeledes hadde minst omtrent 50% av irinotekanet lekket ut etter fire timer da liposomene i Chou Figur 1 ble testet.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen at substituert ammonium og polyanion er nyttige for å fylle og beholde helheter inni liposomer. Følgelig beskrives det fremgangsmåter og liposomsammensetninger nyttige for levering av en rekke helheter, spesielt terapeutiske helheter, dvs. helheter nyttige i diagnose, prognose, testing, screening, behandling eller forebygging av en uønsket tilstand, f.eks. en sykdom, i levende organisme, slik som et menneske, en plante eller et dyr.
Det beskrives en sammensetning omfattende et liposom i et medium, der innsiden av liposomet inneholder et substituert ammonium
der hver av R1, R2, R3 og R4 uavhengig er et hydrogen eller en organisk gruppe som har, inklusivt, i alt opp til 18 karbonatomer, der minst én av R1, R2, R3 og R4 er en organisk gruppe, der den organiske gruppen uavhengig er en hydrokarbongruppe som har opp til 8 karbonatomer og er en alkyl-, alkyliden-, heterosyklisk alkyl-, cykloalkyl-, aryl-, alkenyl- eller cykloalkenylgruppe eller et hydroksysubstituert derivat derav, som i sin hydrokarbonkjede eventuelt omfatter S-, O- eller N-atomer, som danner en eter-, ester-, tioeter-, amin- eller amidbinding, der minst tre av R1, R2, R3 og R4 er organiske grupper, eller det substituerte ammoniumet er et sterisk hindret ammonium, slik som for eksempel der minst én av de organiske gruppene har et sekundært eller tertiært karbonatom direkte bundet til ammoniumnitrogenatomet. Fortrinnsvis har den substituerte ammoniumforbindelsen innkapslet i liposomer en negativ logaritme av den sure (deprotonering) dissosiasjonskonstanten (pKa) på minst ca.8,0, minst ca.8,5, minst ca.9,0, minst 9,5 eller minst 10,0, som bestemt i en vandig løsning ved omgivelsestemperatur.
Det beskrives en sammensetning omfattende et liposom i et medium, der det indre rommet av liposomet inneholder et polyanion og der polyanionet er en polyanionisert polyol eller et polyanionisert sukker. Liposomet inneholder fortrinnsvis en transmembran gradient som kan få i stand fylling av en helhet inn i liposomet. Det beskrives at den transmembrane gradienten er en gradient av et ammonium, et kvaternært ammonium eller en primært, sekundært eller tertiært substituert ammoniumforbindelse som i en fortynnet vandig løsning ved omgivelsestemperatur har en negativ logaritme av den sure (deprotonering) dissosiasjonskonstanten (pKa) på minst ca.8,0, minst ca.8,5, minst ca.9,0, minst 9,5 eller minst 10,0. Liposomet inneholder eventuelt en omsluttet helhet, for eksempel et terapeutikum, en detekterbar markør eller et globalt kationisk organisk molekyl.
Det beskrives ytterligere at sammensetningen fremskaffet som beskrevet videre omfatter en helhet innkapslet i liposomene som beskrevet. Fortrinnsvis er helheten innkapslet i det indre rommet av liposomet. For eksempel omfatter det indre rommet av liposomet videre et antineoplastisk terapeutikum og der toksisitetsnivået av sammensetningen for et individ er minst lik eller mindre enn toksisitetsnivået av det antineoplastiske terapeutikumet administrert til individet uten sammensetningen.
Det beskrives ytterligere at sammensetningen fremskaffet som beskrevet er en liposomsammensetning omfattende en camptotecinforbindelse.
Sammensetningen har en antikreftaktivitet minst to ganger, fire ganger eller ti ganger høyere enn camptotecinforbindelsen administrert på liknende måte i fravær av sammensetningen, mens toksisiteten til sammensetningen ikke overstiger, er minst to ganger eller minst fire ganger lavere enn toksisiteten til camptotecinforbindelsen administrert på liknende måte i fravær av sammensetningen. Det beskrives at camptotecinforbindelsen er et promedikament og er inneholdt i liposomet ved minst 0,1 mg, minst 0,2 mg, minst 0,3 mg, minst 0,5 mg eller minst 1 mg per 1 mg av liposommembranmaterialene, f.eks. lipider. Camptotecinforbindelsen er fortrinnsvis innkapslet i liposomet hovedsakelig i det indre rommet av liposomet. I ett tilfelle er camptotecinforbindelsen irinotecan (CPT-11).
Det beskrives ytterligere at sammensetningen fremskaffet som beskrevet er en liposomsammensetning av et vincaalkaloid eller et derivat derav.
Sammensetningen har 24 timers medikamentretensjon i liposomet etter 24 timers eksponering i blodet til et pattedyr in vivo på minst 50 %, minst 60 % eller minst 70 % av den opprinnelige medikamentmengden. Vincaalkaloid eller et derivat derav er fortrinnsvis innkapslet i liposomet hovedsakelig i det indre rommet av liposomet. Ett eksempel på pattedyr er en rotte. Eksempler på vincaalkaloider og derivater er vinkristin, vinblastin og vinorelbin.
Det beskrives ytterligere tilveiebringelse som beskrevet av en fremgangsmåte for innkapsling av en helhet i et liposom. Fremgangsmåten omfatter å kontakte liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse med en helhet, f.eks. terapeutisk eller detekterbar helhet. Fortrinnsvis blir kontakten utført under betingelsene når konsentrasjonen av substituert ammonium eller et polyanion ifølge foreliggende oppfinnelse i mediet er lavere enn den i det indre rommet av liposomene. Det beskrives at liposomsammensetningen blir brakt i kontakt med en helhet i et vandig medium.
Det beskrives ytterligere tilveiebringelse som beskrevet av en fremgangsmåte for innkapsling av en helhet i et liposom. Fremgangsmåten omfatter å kontakte den liposominneholdende sammensetningen som beskrevet med en pre-helhet, der pre-helheten kan omdannes til en helhet under en betingelse, og tilveiebringelse av betingelsen inni liposomet hvilket omdanner prehelheten til helheten inni liposomet. I ett tilfelle er helheten en organisk forbindelse og pre-helheten er et basisk derivat derav.
Det beskrives ytterligere tilveiebringelse som beskrevet av et sett for å lage liposominnkapslede helheter. Settet omfatter en beholder med et liposom som beskrevet og, eventuelt, en beholder inneholdende en helhet og/eller instruksjoner for en bruker, f.eks. for innkapsling av en helhet.
I et aspekt av foreliggende oppfinnelse beskrives det en sammensetning omfattende et liposom i et medium. Liposomet omfatter 1,2-distearoyl-SN-fosfatidylkolin, kolesterol og N-(omega-metoksy-poly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin i et molart forhold på 3:2:0,015. Irinotecan og sukroseoktasulfat er innsluttet i liposomet.
Trietylammonium kan også være innsluttet i liposomet. En farmasøytisk sammensetning kan omfatte en liposomsammensetning som beskrevet i aspektet, en farmasøytisk akseptabel bærer og en buffersubstans. Den farmasøytiske sammensetningen kan ha en pH mellom 6,0 og 7,5. Den farmasøytiske sammensetningen kan være fremstilt som en injiserbar sammensetning. N-(omega-metoksy-poly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolaminet kan være N-(omega-metoksypoly(etylenglykol)(molekylvekt 2000)- oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin i sammensetningen eller den farmasøytiske sammensetningen.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet (sirkler) og medikamentet (trekanter) etter i.v. bolusadministrering av CPT-11-fylte liposomer til en rotte. Liposomene blir fylt ved anvendelse av TEA-Pn metode (se Eksempel 9).
Figur 2 viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av liposomet fylt med CPT-11 ved anvendelse av TEA-Pn metode (se Eksempel 9).
Figur 3 viser antitumoreffektivitet av fritt CPT-11 og liposomalt CPT-11 mot BT-474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 10).
Figur 4 viser dynamikken av dyrenes kroppsvekter i løpet av behandling av BT-474 tumorbærende nakne mus med fritt CPT-11 eller liposomalt CPT-11. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 10).
Figur 5 viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av liposomet fylt med CPT-11 ved anvendelse av TEA-SOS metode (se Eksempel 14).
Figur 6 viser antitumoreffektivitet av fritt og liposomalt CPT-11 mot HT-29 humane kolonkreftxenotransplantater i nakne mus. Billedteksten med symboler indikerer medikamentfyllingsmetoden og den administrerte dosen per injeksjon. ”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 15).
Figur 7 viser dynamikken av dyrenes kroppsvekter i løpet av behandling av HT-29 tumorbærende nakne mus med frie eller liposomale formuleringer av CPT-11. Feilstørrelsene representerer standardavvik av dataene. ”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 15).
Figur 8A viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet etter i.v. bolusadministrering av topotecanfylte liposomer til en rotte. Billedteksten med symboler indikerer medikamentfyllingsmetoden og medikamentinnholdet i liposomene (se Eksempel 24).
Figur 8B viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av liposomene fylt med topotecan. Billedteksten med symboler indikerer medikamentfyllingsmetoden og medikamentinnholdet i liposomene (se Eksempel 24).
Figur 9 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt, liposomalt eller HER2-målrettet immunliposomalt topotecan (TEA-Pn fremgangsmåte) mot SKBr-3 brystkarsinomceller (se Eksempel 27).
Figur 10 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt, liposomalt eller HER2-målrettet immunliposomalt topotecan (TEA-SOS fremgangsmåte) mot SKBr-3 brystkarsinomceller (se Eksempel 32).
Figur 11 viser antitumoreffektivitet av ulike topotecan (TPT)-formuleringer mot BT-474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus.
”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 29).
Figur 12 viser dynamikken av dyrenes kroppsvekter i løpet av behandling av BT-474 tumorbærende nakne mus med fritt topotecan (TPT), liposomalt topotecan (Ls-TPT) eller anti-HER2 immunliposomalt topotecan (F5 ILs-TPT). ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 29).
Figur 13A viser antitumoreffektivitet av topotecanformuleringer mot BT- 474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus. Fritt topotecan (fritt TPT) eller liposomalt topotecan (Ls-TPT) ble administrert ved en åttendedel av deres maksimalt tolererte doser. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 31).
Figur 13B viser antitumoreffektivitet av topotecanformuleringer mot BT- 474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus. Fritt topotecan (fritt TPT) eller liposomalt topotecan (Ls-TPT) ble administrert ved en fjerdedel av deres maksimalt tolererte doser. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 31).
Figur 13C viser antitumoreffektivitet av topotecanformuleringer mot BT- 474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus. Fritt topotecan (fritt TPT) eller liposomalt topotecan (Ls-TPT) ble administrert ved halvparten av deres maksimalt tolererte doser. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 31).
Figur 13D viser antitumoreffektivitet av topotecanformuleringer mot BT- 474 humane brystkreftxenotransplantater i nakne mus. Fritt topotecan (fritt TPT) eller liposomalt topotecan (Ls-TPT) ble administrert ved deres maksimalt tolererte doser. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 31).
Figur 14 viser dynamikken av gjennomsnittlige kroppsvekter i løpet av behandling av BT-474 tumorbærende nakne mus med fritt topotecan (fritt TPT) eller liposomalt topotecan (Ls-TPT) administrert ved deres maksimalt tolererte doser. ”Kontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 31).
Figur 15 viser cytotoksisiteten av fri 6-(3-aminopropyl)-ellipticin (fri AE), liposomal 6-(3-aminopropyl)-ellipticin (Ls-AE) eller HER2-målrettet immunliposomal 6-(3-aminopropyl)-ellipticin (F5 ILs-AE)) mot BT-474 brystkarsinomceller in vitro (se Eksempel 35).
Figur 16 viser in vitro-cytotoksisitet av fri 6-(3-aminopropyl)-ellipticin (fritt APE), liposomal 6-(3-aminopropyl)-ellipticin eller EGFR-målrettet immunliposomal 6-(3-aminopropyl)-ellipticin (C225-ILs-APE) mot brystkarsinomceller med lav (MCF-7) eller høy (MDA-MB468) ekspresjon av EGF-reseptor (se Eksempel 36).
Figur 17 viser farmakokinetiske egenskaper i blod av liposomalt formulert 6-(3-aminopropyl)ellipticin (APE): farmakokinetikk i blod av liposomlipidet (Panel A, åpne sirkler), medikamentet (Panel A, fylte sirkler) og dynamikken av medikamenttil-liposomlipid forhold (Panel B) etter i.v. bolusadministrering av APE-liposomer til en rotte (se Eksempel 37).
Figur 18 viser farmakokinetiske egenskaper i blod av vinorelbin formulert inn i liposomer (Ls-VRB) og anti-HER2 immunliposomer (F5-ILs-VRB): farmakokinetikk i blod av liposomlipidet (Panel A), medikamentet (Panel B) og dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold (Panel C) etter i.v. bolusadministrering av vinorelbinliposomer til en rotte (se Eksempel 43).
Figur 19 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet etter i.v. bolusadministrering av vinorelbinfylte liposomer til en rotte. Liposomene blir fylt ved anvendelse av forhåndsomsluttet trietylammoniumdekstransulfat (DS-TEA), ammoniumdekstransulfat (DS-A) eller ammoniumsulfat (S-A) (se Eksempel 44).
Figur 20 viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av liposomene fylt med vinorelbin ved anvendelse av forhåndsomsluttet trietylammoniumdekstransulfat (DS-TEA), ammoniumdekstransulfat (DS-A) eller ammoniumsulfat (S-A) (se Eksempel 44).
Figur 21 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet etter i.v. bolusadministrering av vinorelbinfylte liposomer til en rotte. Liposomene blir fylt ved anvendelse av forhåndsomsluttet trietylammoniumsukroseoktasulfat (TEA-SOS) og har gjennomsnittsstørrelsen som angitt i billedteksten med symboler (se Eksempel 45).
Figur 22 viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av vinorelbinfylte liposomer.
Liposomene blir fylt ved anvendelse av forhåndsomsluttet trietylammoniumsukrooktasulfat (TEA-SOS) og har gjennomsnittsstørrelsen som angitt i billedteksten med symboler (se Eksempel 45).
Figur 23 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet i en rotte etter i.v. bolusadministrering av vinorelbin formulert inn i liposomer (Ls-VRB) eller anti-HER2 immunliposomer (F5-ILs-VRB) ved anvendelse av TEA-SOS metode (se Eksempel 46).
Figur 24 viser dynamikken av medikament-til-liposomlipid forhold i blodet til en rotte in vivo etter i.v. bolusadministrering av vinorelbin formulert inn i liposomer (Ls-VRB) eller anti-HER2 immunliposomer (F5-ILs-VRB) ved anvendelse av TEA-SOS metode (se Eksempel 46).
Figur 25 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt vinorelbin (fritt VRB), liposomalt vinorelbin (Ls-VRB) eller HER2-målrettet immunliposomalt vinorelbin (F5-Ils-VRB) mot HER2-overuttrykkende humane brystkreftceller MDA-MB-453 (se Eksempel 48).
Figur 26 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt vinorelbin (fritt VRB), liposomalt vinorelbin (Ls-VRB) eller HER2-målrettet immunliposomalt vinorelbin (F5-Ils-VRB) mot HER2-overuttrykkende CaLu-3 humane ikke-småcellede lungekreftceller (se Eksempel 49).
Figur 27 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt vinorelbin (fritt VRB), liposomalt vinorelbin (Ls VRB/SOS-TEA) eller HER2-målrettet immunliposomalt vinorelbin (F5-ILs VRB/SOS-TEA) mot HER2-overuttrykkende humane brystkreftceller SKBr-3 (se Eksempel 50).
Figur 28 viser antitumoreffektivitet av fritt vinorelbin (fritt VRB) eller liposomalt vinorelbin (Ls VRB) mot HT-29 humane kolonkreftxenotransplantater i nakne mus. ”Saltløsning” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene (se Eksempel 51).
Figur 29 viser dynamikken av gjennomsnittlige kroppsvekter i løpet av behandling av HT-29 tumorbærende nakne mus med fritt vinorelbin (fritt VRB), liposomalt vinorelbin (Ls VRB) eller bare konstituent (saltløsning). Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene (se Eksempel 51).
Figur 30 viser antitumoreffektivitet av fritt vinorelbin (fritt VRB) eller liposomalt vinorelbin (Ls VRB) i en syngen C-26 murin kolonkarsinommodell.
Dosen av medikamentet per injeksjon var som angitt i billedteksten med symboler. Feilstørrelser representerer standardavvik av dataene. ”Saltløsning” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 52).
Figur 31 viser dynamikken av gjennomsnittlige kroppsvekter i løpet av behandling av musene som bærer syngene C-26 murine kolonkarsinomtumorer med ulike doser av fritt vinorelbin (fritt VRB), liposomalt vinorelbin (Ls VRB) eller med bare konstituent (saltløsning). Dosen av medikamentet per injeksjon var som angitt i billedteksten med symboler (se Eksempel 52).
Figur 32 viser antitumoreffektivitet av fritt vinorelbin (fritt medikament) eller scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin fremstilt ved en TEA-SOS metode (F5-ILs-VRB TEA-SOS), anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin fremstilt ved en TEA-Pn metode (F5-ILs-VRB TEA-Pn) mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater i nakne mus.
”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 53).
Figur 33 viser dynamikken av gjennomsnittlige kroppsvekter i løpet av behandling av musene som bærer HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater med fritt vinorelbin, scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin fremstilt ved anvendelse av en TEA-SOS metode, anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin fremstilt ved en TEA-Pn metode eller med bare konstituent. For forklaring av symbolene, se billedteksten til Figur 32 (se også Eksempel 53).
Figur 34 viser antitumoreffektivitet av fritt vinorelbin (fritt medikament) eller scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin fremstilt ved anvendelse av ulike mengder av PEG-lipid mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater i nakne mus. Feilstørrelsene er standardavvik av dataene. ”Konstituentkontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 54).
Figur 35 viser antitumoreffektivitet av fritt vinorelbin (fritt NAV), liposomalt vinorelbin (NAV Lip) eller FC225Fab’-konjugert, anti-EGFR-immunliposomalt vinorelbin (C225-NAV Lip) mot EGFR-overuttrykkende humane glioblastom (U87) xenotransplantater i nakne mus. ”Saltløsning” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 55).
Figur 36 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet og dynamikken av medikament/liposomlipid forholdet i blodet til en rotte etter i.v. bolusadministrering av doksorubicin formulert inn i liposomer ved anvendelse av trietylammoniumsulfatmetode (se Eksempel 56).
Figur 37 viser antitumoreffektivitet av liposomalt doksorubicin (Ls-Dox) eller scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt doksorubicin (F5 ILs-Dox) fremstilt ved anvendelse av ulike mengder av PEG-lipid mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater i nakne mus. Billedteksten med symboler viser mengden av PEG-lipid uttrykt i molprosent av liposomfosfolipider. ”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 57).
Figur 38 viser farmakokinetikk i blod av liposomalt vinblastin i en rotte (se Eksempel 58).
Figur 39 viser dynamikken av medikament/liposomlipid forholdet i blodet til en rotte etter i.v. bolusadministrering av liposomalt vinblastin (se Eksempel 58).
Figur 40 viser in vitro-cytotoksisitet av fritt vinkristin (fritt VCR), liposomalt vinkristin (Ls-VCR) eller HER2-målrettet immunliposomalt vinkristin (F5-ILs-VCR) mot HER2-overuttrykkende humane brystkreftceller SKBr-3 (se Eksempel 61).
Figur 41 viser farmakokinetikk i blod av liposomlipidet i en rotte etter i.v. bolusadministrering av vinkristin formulert inn i liposomer av ulik gjennomsnittsstørrelse (angitt i billedteksten med symboler) (se Eksempel 62).
Figur 42 viser dynamikken av medikament/liposomlipid forholdet i blodet til en rotte etter i.v. bolusadministrering av vinkristin formulert inn i liposomer av ulik gjennomsnittsstørrelse (angitt i billedteksten med symboler) (se Eksempel 62).
Figur 43 viser antitumoreffektivitet av fritt vinkristin (fritt VCR), liposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsitratmetode (Ls-VCR sitrat), liposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsukrooktasulfatmetode (Ls-VCR SOS) eller scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsukrooktasulfatmetode (F5ILs-VCR SOS) mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater i nakne mus. ”Saltløsningskontroll” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 64).
Figur 44 viser dynamikken av gjennomsnittlige kroppsvekter i løpet av behandling av musene som bærer HER2-overuttrykkende humane brystkarsinom (BT-474) xenotransplantater med fritt vinkristin (fritt VCR), liposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsitratmetode (Ls-VCR sitrat), liposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsukrooktasulfatmetode (Ls-VCR SOS), scFv F5-konjugert, anti-HER2 immunliposomalt vinkristin fremstilt ved trietylammoniumsukrooktasulfatmetode (F5 ILs-VCR SOS) eller med bare konstituent (saltløsningskontroll) (se Eksempel 64).
Figur 45 viser antitumoreffektivitet av fritt vinkristin (vinkristin), liposomalt vinkristin (nt-vcr) eller C225 Fab’-konjugert, anti-EGFR immunliposomalt vinkristin (C225-vcr) mot EGFRvIII-overuttrykkende humane hjernekreft (U87) xenotransplantater i nakne mus. ”Saltløsning” angir musene behandlet med bare medikament- og liposomfri konstituent (se Eksempel 65).
Figur 46 viser farmakokinetikk i blod av CPT-11 og dynamikken av prosentdelen av CPT-11 foreliggende i aktiv (lakton) form i blodet til en rotte etter i.v. bolusadministrering av liposomalt CPT-11 (se Eksempel 69).
Figur 47 viser farmakokinetikk i blod av CPT-11 og dynamikken av prosentdelen av CPT-11 foreliggende i aktiv (lakton) form i blodet til en rotte etter i.v. bolusadministrering av CPT-11 løsning (fritt CPT-11) (se Eksempel 69).
BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMENE
Foreliggende oppfinnelse angår generelt fremgangsmåter og liposomsammensetninger nyttige for levering av en rekke helheter, spesielt terapeutika og avbildningsmidler. Det er oppdagelsen ifølge foreliggende oppfinnelse at substituert ammonium og polyanion er nyttige for å fylle og beholde helhetene, f.eks. forbindelse, inni liposomer. Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse liposomsammensetninger og sett inneholdende substituert ammonium og/eller polyanion og fremgangsmåter for å lage disse liposomsammensetningene.
I henhold til én egenskap ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer den en sammensetning av liposomer inneholdende i sitt indre rom én eller flere substituerte ammoniumforbindelser med en formel
der hver av R1, R2, R3 og R4 uavhengig er et hydrogen eller en organisk gruppe og der minst én av R1, R2, R3 og R4 er en organisk gruppe, slik som, en alkyl-, alkyliden-, heterosyklisk alkyl-, cykloalkyl-, aryl-, alkenyl- eller cykloalkenylgruppe, et hydroksysubstituert derivat derav, som i sin hydrokarbonkjede eventuelt omfatter S-, O- eller N-atomer, f.eks. som danner en eter- (omfattende en acetal eller ketal), ester-, sulfid- (tioeter), amin- eller amidbinding deri. Hvis mindre enn tre av R1, R2, R3 og R4 er organiske grupper, så har ifølge oppfinnelsen minst én, og fortrinnsvis to, av de organiske gruppene et sekundært eller tertiært karbonatom (dvs. karbonatomer som har henholdsvis to eller tre karbon-karbon bindinger) direkte bundet til ammoniumnitrogenet, dvs. det substituerte ammoniumet er et sterisk hindret ammonium. Generelt er nærvær av titrerbart ammonium, slik som usubstituert ammoniumion (NH4<+>), så vel som primære og sekundære rett kjede-alkylammoniumioner i det indre rommet av liposomet ifølge foreliggende oppfinnelse kjent for å sørge for økt innkapsling av svakt amfifile baser, for eksempel via en mekanisme av ”aktiv”, ”på avstand” eller ”transmembran gradient-styrt” fylling (Haran, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1152, s.253-258; Maurer-Spurej, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1999, v.1416, s. 1-10). Imidlertid har disse ammoniakkforbindelsene hydrogenatomer som lett deltar i reaksjoner av nukleofil substitusjon og på annen måte reagerer kjemisk med de liposomomsluttede helhetene og derfor kan svekke den kjemiske integriteten av helhetene i løpet av eller etter liposomfyllings (omslutnings) prosessen. Det er derfor ønskelig for en omsluttet substituert ammoniumforbindelse å være mer kjemisk inert, ved å mangle kjemiske funksjoner som er ustabile eller lett reaktive med liposomkomponentene, som kan omfatte en innkapslet helhet. Uventet oppdaget vi at liposomsammensetninger omfattende i deres indre rom et substituert tertiært og kvaternært ammonium som ikke har et substituerbart hydrogen, eller et sterisk hindret primært eller sekundært ammonium, hvor tilgangen til et ammoniumhydrogenatom er sterisk hindret ved en stor organisk nabogruppe, så som har ett eller to sekundære eller tertiære karbonatomer bundet til ammoniumnitrogenet, ikke bare viser fremragende helhetfyllingskapasitet, men også forbedret stabilitet av den liposomomsluttede helheten, f.eks. et medikament, mot for tidlig frisetting fra liposomet i den levende kroppen.
I én utførelsesform er den liposomomsluttede substituerte ammoniumforbindelsen farmasøytisk inert, dvs. fremkaller ikke en ugunstig fysiologisk respons når administrert til et levende individ, f.eks. et menneske eller dyr, i en mengde av liposommembranmaterialet som er tilstrekkelig for å levere en effektiv dose av den liposomomsluttede helheten. I en annen utførelsesform har det substituerte ammoniumet ifølge foreliggende oppfinnelse et akseptabelt toksisitetsnivå for et individ. Vanligvis betyr et akseptabelt toksisitetsnivå at den toksiske dosen, f.eks. en maksimalt tolerert dose (MTD) eller en dose som forårsaker 50 % dødelighet (LD50) av det substituerte ammoniumet ifølge foreliggende oppfinnelse, er minst to ganger, minst fire ganger, minst åtte ganger eller minst ti ganger høyere enn den toksiske dosen av en liposomomsluttet helhet, f.eks. medikament, fylt inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel har trietylammoniumsulfat et akseptabelt toksisitetsnivå ifølge foreliggende oppfinnelse, siden dets LD50 er ca.40 ganger høyere enn LD50 for doksorubicin, et antikreftmedikament. Toksisitetsnivåene eller fysiologiske responser av substituerte ammonium, så vel som av helhetene av interesse, hvis ikke allerede kjent, kan lett stadfestes via rutineteknikker velkjent for fagfolk innen det biomedisinske området. Se for eksempel S. C. Gad. Drug Safety Evaluation, Wiley, New York, 2002. Én metode for kvantifisering av toksisiteten til fritt og/eller liposomalt formulert medikament er beskrevet i Eksempel 16 her.
I én foretrukket utførelsesform har de substituerende organiske gruppene blant R1, R2, R3 eller R4 størrelse og fysisk-kjemiske egenskaper tilstrekkelig for å sikre at det substituerte ammoniumet i vandig miljø hovedsakelig danner en ekte (molekylær) løsning, men ikke miceller, dobbeltlag eller lignende selvsammensatte strukturer. Derfor har det substituerte ammoniumet ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis lite eller hovedsakelig ingen fordeling i dobbeltlagdelen av liposomer, som derfor minimaliserer risikoen for destabilisering, solubilisering eller permeabilisering av liposomene som omslutter det substituerte ammoniumet.
Den organiske gruppen til det substituerte ammoniumet er typisk et hydrokarbon inneholdende, inklusivt, opp til 8 karbonatomer, opp til 6 karbonatomer eller opp til 4 karbonatomer, og i alt inneholder de substituerende gruppene, inklusivt, opp til 18, opp til 16, opp til 12 eller opp til 9 karbonatomer. Disse substituerende hydrokarbongruppene omfatter hvilken som helst kombinasjon av interbundne primære, sekundære eller tertiære karbonatomer, så vel som cykloalkylgrupper som blir bundet på deres terminaler direkte til ammoniumnitrogenet for å danne en heterosykel eller til et karbonatom av en ammoniumhydrogensubstituerende gruppe. Disse substituerte alkylgruppene kan også omfatte heteroatomer, f.eks. oksygen, nitrogen eller svovel, i deres karbonkjeder som danner en funksjonell gruppe, f.eks. eter-, acetal-, amin- eller sulfidgruppe, så vel som danner en funksjonell gruppe, f.eks. hydroksylgruppe, bundet til alkylkarbonkjeden. Eksempler på den organiske gruppen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, uten noen begrensning, alkyler, alkylidener, heterosykliske alkyler, cykloalkyler, aryler, alkenyler, cykloalkenyler eller hydroksysubstituerte derivater derav, f.eks. et hydroksysubstituert alkyliden som danner en ring inklusive N i det substituerte ammoniumet.
I en annen utførelsesform er det substituerte ammoniumet: et heterosyklisk ammonium, dvs. et ammonium der minst to av R1, R2, R3 eller R4 danner en ring; et sterisk hindret primært ammonium; eller et sterisk hindret sekundært ammonium. Generelt omfatter et sterisk hindret primært eller sekundært ammonium hvilket som helst substituert ammonium med én eller to av R1, R2, R3 og R4 substituert med alkylgrupper som sterisk tetter molekylet, f.eks. hvilket som helst substituert ammonium med én eller to av R1, R2, R3 og R4 substituert med én eller to cykloalkylgrupper eller alkylgrupper som har minst ett sekundært eller tertiært alkylkarbonatom bundet til nitrogenet av det substituerte ammoniumet. Eksempler på slike heterosykliske, sterisk hindrede primære ammonium og sterisk hindret sekundært ammonium omfatter, uten noen begrensning, isopropyletylammonium, isopropylmetylammonium, diisopropylammonium, tertbutyletylammonium, dicykloheksylammonium, protoniserte former av morfolin, pyridin, piperidin, pyrrolidin, piperazin, tert-bulylamin, 2-amino-2-metylpropanol-1, 2-amino-2-metyl-propandiol-1,3 og tris- (hydroksyetyl)-aminometan. Disse substituerte ammoniumforbindelsene er generelt kommersielt tilgjengelig i form av ulike salter eller blir lett fremstilt fra deres tilsvarende aminer ved nøytralisering med syrer.
I ytterligere en annen utførelsesform er det substituerte ammoniumet et tertiært eller kvaternært ammonium omfattende, uten noen begrensning, trimetylammonium, trietylammonium, tributylammonium, dietylmetylammonium, diisopropyletylammonium, triisopropylammonium, N-metylmorfolinium, N-hydroksyetylpiperidinium, N-metylpyrrolidinium og N,N’-dimetylpiperazinium, tetrametylammonium, tetraetylammonium og tetrabutylammonium. Disse substituerte ammoniumforbindelsene er generelt kommersielt tilgjengelig i form av ulike salter eller blir lett fremstilt fra deres tilsvarende aminer ved nøytralisering med syrer.
I ytterligere en annen utførelsesform er den substituerte ammoniumforbindelsen ifølge oppfinnelsen en global kationisk forbindelse, dvs. har under betingelsene for helhetinnkapsling, typisk i vandig løsning ved en pH mellom ca. pH 2 og ca. pH 8, netto positiv ladning, f.eks. som et resultat av ionisering (protonering) av nitrogenatomet.
I ytterligere en annen utførelsesform har den substituerte primære, sekundære eller tertiære ammoniumforbindelsen innkapslet i liposomer en negativ logaritme av den sure (deprotonering) dissosiasjonskonstanten (pKa) på minst ca.
8,0, minst ca.8,5, minst ca.9,0, minst 9,5 eller minst ca.10,0, som bestemt i en fortynnet vandig løsning ved omgivelsestemperatur (typisk 25 ºC). pKa-parameter er en velkjent karakteristikk for ammoniumforbindelser som generelt karakteriserer styrken av deres basiske egenskaper, og fremgangsmåter for pKa-bestemmelse er konvensjonelle og rutine på området. pKa-verdier for mange aminer og deres protonerte former (ammonium) er tabulert i referansebøker for kjemi og farmakologi. Se for eksempel ”IUPAC Handbook of Pharmaceutical Salts”, red. ved P. H. Stahl og C. G. Wermuth, Wiley-VCH, 2002; CRC Handbook of Chemistry and Physics, 82. utgave, red. ved D. R. Lide, CRC Press, Florida, 2001, s. 8-44 til 8-56. Generelt karakteriserer høyere pKa sterkere baser. Eksempler på substituerte ammoniumforbindelser, så vel som usubstituert ammonium (nevnt som deres konjugerte aminbaser) har følgende pKa-verdier: pyrrolidin, 11,31; piperidin, 11,12; diisopropylamin, 11,05; dietylamin, 10,93; trietylamim, 10,75; dimetylamin, 10,73; tert-butylamin, 10,68; cykloheksylamin, 10,66; metylamin, 10,66; etylamin, 10,65; propylamin, 10,54; isopropylamin, 10,53; N-etylpiperidin, 10,45; dicykloheksylamin, 10,4; N-metylpiperidin, 10,38; dietylmetylamin, 10,35; dimetylpropylamin, 10,15; trimetylamin, 9,8; piperazin, 9,73 (I), 5,33 (II); 2-amino-2-metylpropanol, 9,69; N,N’-dimetylpiperazin, 9,66 (I), 5,2 (II); dietyl-(2-hydroksyetyl)amin, 9,58; etanolamin, 9,5; N-hydroksyetylpyrrolidin, 9,44; dietanolamin, 9,28; ammoniakk, 9,27; dimetyl-(2-hydroksyetyl)amin, 8,83; 2-amino-2-metylpropandiol-1,3, 8,8; morfolin, 8,5; tris-(hydroksymetyl)-aminometan, 8,3; N-metylglukamin, 8,03; trietanolamin, 7,76; N-etylmorfolin, 7,67; N-hydroksyetylmorfolin, 7,39; imidazol, 7,03; pyridin, 5,23. Som en regel øker substitusjon av alkyl- eller cykloalkylgruppe for et hydrogen i en ammoniumforbindelse pKa-verdi. Særlig reduserer multiple hydroksyl- eller eterfunksjoner i substituerende alkylgrupper eller nærvær av aromatisitet i en nitrogeninneholdende heterosyklisk gruppe pKa-verdi i forhold til lignende substituert ammoniakk uten hydroksyl- eller eterfunksjoner. Forbindelsene med mer enn én ammoniumgruppe har vanligvis pKa av den andre og påfølgende ammoniumgruppen mye lavere enn av den første. Uventet oppdaget vi at substituert ammoniakk med høyere pKa-verdier, dvs. dannet ved sterkere basiske aminer, var mer effektive enn de dannet fra svakere aminer i stabilisering av medikamentet inni liposomer. For eksempel var både IHP- og SOS-salter av trietylammonium (pKa = 10,75) særlig mer effektive enn tilsvarende salter av trietanolammonium (pKa = 7,76) i stabilisering av irinotecan i liposomene in vivo (Eksempel 73).
Substituert ammonium i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i hvilken som helst egnet form, f.eks. salt. Egnede salter omfatter farmasøytisk akseptable salter. Se for eksempel P. H. Stahl, C. G.
Wermuth (red.), Handbook of Pharmaceutical Salts, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. I én utførelsesform er det substituerte ammoniumet et salt inneholdende ett eller flere polyanioner ifølge foreliggende oppfinnelse. Optimalt gjør motionet (anion) i det substituerte ammoniumsaltet ifølge foreliggende oppfinnelse saltet vannløselig, er farmasøytisk inert, kan danne presipitater eller geler når i kontakt med en terapeutisk eller detekterbar helhet, og/eller er mindre permeabel gjennom liposommembranen enn det substituerte ammoniumet eller dets ikke-dissosierte aminform. Generelt danner det substituerte ammoniumsaltet ifølge foreliggende oppfinnelse en ekte løsning i det intraliposomale, f.eks. vandige, rommet og utgjør ikke en betydelig mengde av en kondensert fase slik som micelle, dobbeltlag, gel eller krystallinsk fase. Den relative mengden av et substituert ammonium og et saltdannende anion, f.eks. polyanion, er på eller nær punktet for støkiometrisk ekvivalens og har typisk pH i området 3-9, oftere pH 4-8, avhengig for eksempel av dissosiasjonskonstanten til den konjugerte basen av det substituerte ammoniumionet.
Generelt er det substituerte ammoniumet inneholdt inni, dvs. i det innvendige (indre) rommet av liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. I én utførelsesform er det substituerte ammoniumet delvis eller hovedsakelig fullstendig fjernet fra det ytre mediet som omgir liposomene. Slik fjerning kan utføres ved hvilken som helst egnet måte kjent for en fagperson, f.eks. fortynning, ionebytterkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, dialyse, ultrafiltrering, utfelling, osv.
I henhold til en annen egenskap ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer den en sammensetning av liposomer inneholdende et polyanion.
Polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse kan være hvilken som helst egnet kjemisk helhet med mer enn én negativt ladet gruppe resulterende i netto negativ ioneladning av mer enn to enheter i liposomets indre, f.eks. vandige, rom.
Polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et divalent anion, et trivalent anion, et polyvalent anion, et polymert polyvalent anion, en polyanionisert polyol eller et polyanionisert sukker. Sulfat, fosfat, pyrofosfat, tartrat, suksinat, maleat, borat og sitrat er, uten begrensning, eksempler på slike di- og trivalente anioner. I én foretrukket utførelsesform er polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse en polyanionisk polymer, som har en organisk (karbon) eller uorganisk ryggrad og flere anioniske funksjonelle grupper, dvs. funksjonelle grupper ioniserbare til en negativ ladning i en nøytral vandig løsning og integrert eller festet til ryggraden. En polymer er en naturlig eller syntetisk forbindelse, vanligvis av høy molekylvekt, bestående av repeterte bundne enheter, hver et relativt lett og enkelt molekyl. Eksempler på polyanioniske polymerer er polyfosfat, polyvinylsulfat, polyvinylsulfonat, anioniserte polyakrylsyrepolymerer, anioniserte, f.eks. polysulfonerte polyaminer, slik som polysulfonert poly(etylenimin); polysulfaterte, polykarboksylerte eller polyfosforylerte polysakkarider; sure polyaminosyrer; polynukleotider; andre polyfosforylerte, polysulfaterte, polysulfonerte, polyborerte eller polykarboksylerte polymerer. Slike polyvalente anioner og polymerer er velkjente på området og mange er kommersielt tilgjengelig. Et polymert anion ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis biodegraderbart, dvs. kan brytes ned til ikke-toksiske enheter i den levende organismen. Eksempler på biodegraderbart polymert anion er polyfosfat.
I en annen foretrukket utførelsesform er polyanionet en polyanionisert polyol eller et polyanionisert sukker. En polyol er et organisk molekyl som har flere hydroksylgrupper bundet til, f.eks. lineær, forgreinet eller syklisk, karbonryggrad. Derfor kan en polyol karakteriseres i andre betegnelser som en polyhydroksylert forbindelse. Fortrinnsvis er en majoritet av karbonatomer i en polyol hydroksylert. Polyoler (polyatomiske alkoholer) er molekyler velkjent på området. Både rett kjede (lineær eller forgreinet) og sykliske polyoler kan anvendes. Eksempler på polyoler ifølge foreliggende oppfinnelse er, uten begrensning: etylenglykol; glyserol, treitol, erytritol, pentaerytritol, mannitol, glucitol, sorbitol, sorbitan, xylitol, laktitol, maltitol, fruktitol og inositol. Et sukker omfatter vanligvis en syklisk acetal-, en syklisk ketal-, en keton- eller en aldehydgruppe eller en addukt derav, i en gruppe av interbundne hovedsakelig hydroksylerte karbonatomer. Sukker er ofte naturlig forekommende forbindelser. Hydrolyse av sukker i vandig medium fører til enheter kalt monosakkarider. I en vandig løsning danner typisk et monosakkarid sukkermolekyl på fem eller seks karbonatomer en syklisk hemiacetal, en ringstruktur. Fortrinnsvis er sukker ifølge de foreliggende oppfinnelsene monosakkarider eller disakkarider, dvs. består av én eller to monosakkaridenheter, der hver har fra tre til sju, fortrinnsvis fra tre til seks karbonatomer. Eksempler på sukker ifølge foreliggende oppfinnelse er, uten begrensning, monosakkaridheksoser, slik som glukose (dekstrose), galaktose, mannose, fruktose; monosakkaridpentoser, slik som xylose, ribose, arabinose, og disakkarider, slik som laktose, trehalose, sukrose, maltose og cellobiose.
Forbindelser bestående av flere interbundne sukkerenheter som danner en ring (cyklodekstriner) og deres derivater kan også anvendes. Reduksjon av sukker er én fremgangsmåte for å oppnå polyoler. Mer stabile ”ikke-reduserende” og ikkemetaboliserbare disakkarider, slik som sukrose eller trehalose, er foretrukket. Ulike polyoler, monosakkarider og disakkarider er kommersielt tilgjengelig.
En polyanionisert polyol eller sukker er en polyol eller et sukker som har sine hydroksylgrupper fullstendig eller delvis modifisert eller byttet ut med anioniske grupper (anionisert). Derfor omfatter en polyanionisert polyol eller polyanionisert sukker en polyolgruppe eller en sukkergruppe sammen med anioniske grupper bundet dertil. Eksempler på anioniske grupper omfatter, uten noen begrensning, karboksylat, karbonat, tiokarbonat, ditiokarbonat, fosfat, fosfonat, sulfat, sulfonat, nitrat og borat. Det er foretrukket at minst én anionisk gruppe med et polyanionisert sukker eller polyol er sterk anionisk gruppe, dvs. er mer enn 50 % ionisert i det brede pH-området, f.eks. pH 3-12, fortrinnsvis pH 2-12, når i det vandige mediet, eller har alternativt en log dissosiasjonskonstant (pKa) på 3 eller mindre, fortrinnsvis på 2 eller mindre. Polyanionisering av en polyol eller et sukker kan oppnås ved mange kjemiske prosesser velkjent på området. For eksempel resulterer reaksjon av polyoler og/eller sukker med svoveltrioksyd eller klorsulfonsyre i pyridin eller 2-pikolin i noen eller alle hydroksylgrupper esterifisert med svovelsyrerester (sulfatert), som tilveiebringer et polysulfatert sukker eller polyol. Eksempler på sulfatert sukker ifølge foreliggende oppfinnelse er sulfatert sukrose omfattende, uten begrensning, sukroseheksasulfat, sukroseheptasulfat og sukroseoktasulfat (se Ochi. K., et al., 1980, Chem. Pharm. Bull., v.28, s.638-641). Likeledes resulterer reaksjon med fosforoksyklorid eller dietylklorfosfat i nærvær av basekatalysator i polyfosforylerte polyoler eller sukker. Polyfosforylerte polyoler er også isolert fra naturlige kilder. For eksempel er inositolpolyfosfater, slik som inositolheksafosfat (fytinsyre) isolert fra mais. En rekke sulfaterte, sulfonerte og fosforylerte sukker og polyoler egnet for å utføre foreliggende oppfinnelse er beskrevet f.eks. i U.S. pat.5.783.568 og U.S. pat.5.281.237. Det ble uventet oppdaget at polyanioniserte polyhydroksylerte forbindelser med bare sterkt sure dissosiasjonstrinn, f.eks. gruppene som har pKa på mindre enn ca.3,0, fortrinnsvis mindre enn ca.2,0, slik som for eksempel sulfatmonoestere (pKa 1,0 eller mindre), gir liposomal innkapsling med bedre medikamentretensjon enn polyanioniserte polyhydroksylerte forbindelser som også har svakt sure dissosiasjonstrinn, slik som fosfatmonoestere (trinn 1, pKa ca.1,5; trinn 2, pKa ca.
6,7; se Stahl og Wermuth, Op. cit., 2002). Eksempel 73 nedenfor illustrerer denne oppdagelsen. Kompleksdannelse av polyoler og/eller sukker med mer enn ett molekyl av borsyre resulterer også i et polyanionisert (polyborert) produkt.
Reaksjon av polyoler og/eller sukker med karbondisulfid i nærvær av alkali resulterer i polyanioniserte (polyditiokarbonerte, polyxantogenerte) derivater. Et polyanionisert polyol- eller sukkerderivat kan isoleres i form av en fri syre og nøytraliseres med en egnet base, for eksempel med et alkalimetallhydroksyd, ammoniumhydroksyd eller fortrinnsvis med et substituert amin, f.eks. amin som svarer til et substituert ammonium ifølge foreliggende oppfinnelse, i en ren form eller i form av et substituert ammoniumhydroksyd som tilveiebringer et polyanionisk salt av et substituert ammonium ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan et natrium-, kalium-, kalsium-, barium- eller magnesiumsalt av en polyanionisert polyol/sukker isoleres og omdannes til en egnet form, f.eks. en substituert ammoniumsaltform, ved hvilken som helst kjent fremgangsmåte, for eksempel ved ionebytting.
Polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse har vanligvis en ladningstetthet på minst to, tre eller fire negativt ladede grupper per enhet, f.eks. per karbonatom eller ring i en karbonkjede eller per monosakkaridenhet i et sukker. Polyanionisert sukker eller syklisk polyol ifølge foreliggende oppfinnelse har fortrinnsvis minst 75 % av tilgjengelige hydroksylgrupper polyanionisert, og mer foretrukket 100 % av tilgjengelige hydroksylgrupper polyanionisert. I tillegg er polyanionisering inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis på et nivå som er kompatibelt med eller letter levering og frisetting av helheten omsluttet inni liposomene på stedet for dens tilsiktede effekt, men reduserer frisetting av den omsluttede helheten for tidlig, dvs. før liposomet når frem til stedet for dens tilsiktede effekt.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan graden av polyanionisering inni liposomene anvendes for å regulere frisettingskarakteristikaene, f.eks. frisettingshastighet og kinetikker av en helhet omsluttet inni liposomene. Generelt kan graden av polyanionisering vurderes basert på mengden av polyanionisert sukker eller polyol i forhold til den totale mengden av anion(er), eller i tilfellet der polyanion er eneste type anion, prosentdelen av polyanionisering med hensyn til den totale polyanioniseringskapasiteten av polyanionet, f.eks. polyanionisert sukker eller polyol eller en blanding derav inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. I én utførelsesform blir polyanionisert sukker eller polyol blandet med ett eller flere andre anioner, og jo mindre mengden av polyanionisert sukker eller polyol er i forhold til mengden av annet anion(er), desto raskere blir helheten frisatt fra liposomene.
Vanligvis, hvis en omsluttet helhet blir frisatt for sakte fra liposomene på stedet for dens tilsiktede aktivitet, kan den ønskede frisettingshastigheten for helheten oppnås ved anvendelse av en blanding av polyanionisert sukker eller polyol med ett eller flere andre monovalente eller polyvalente anioner, f.eks. klorid, sulfat, fosfat, osv. Alternativt kan man anvende blandinger av polyanionisert sukker eller polyoler med ulik grad av polyanionisering. I én utførelsesform er graden av polyanionisering inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse mellom 0,1 % til 99 %, 10 % til 90 % eller 20 % til 80 % av det totale anionet (anionene) inni liposomene, f.eks. med en omsluttet helhet.
Generelt kan liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde ett eller flere polyanioner ifølge foreliggende oppfinnelse i hvilken som helst egnet form, f.eks. i form av en syre eller et salt omfattende et polyanion og et kation. Mengden av polyanion, f.eks. polyanionisert sukker eller polyol, kan være støkiometrisk ekvivalent til eller forskjellig fra mengden av kationet. I én utførelsesform inneholder liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse ett eller flere polyanionesalter av et kation, der det er en kationekonsentrasjonsgradient eller en pH-gradient foreliggende over liposommembranen. I en annen utførelsesform inneholder liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse ett eller flere substituerte ammoniumpolyanionesalter ifølge foreliggende oppfinnelse. I ytterligere en annen utførelsesform inneholder liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse polyanionet inni liposomene, mens polyanionet i mediet inneholdende liposomene er delvis eller hovedsakelig fjernet ved hvilken som helst egnet metode kjent for en fagperson, f.eks. fortynning, ionebytterkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, dialyse, ultrafiltrering, absorpsjon, utfelling, osv. I ytterligere en annen utførelsesform har liposomet med omsluttet polyanion, f.eks. polyanionisert polyol eller polyanionisert sukker, også en transmembran gradient som er effektiv i å beholde substanser i liposomet. Eksempler på slike transmembrane gradienter er pH-gradient, elektrokjemisk potensial-gradient, ammoniumionegradient, substituert ammoniumionegradient eller løselighetsgradient. En substituert ammoniumgradient omfatter typisk en substituert form av ammoniumion omfattende minst én C-N binding, slik som primært, kvaternært, tertiært eller kvaternært ammonium. Fremgangsmåter for å lage transmembrane gradienter er rutine på området for liposomer.
I henhold til fortsatt en annen egenskap ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse ett eller flere substituerte ammonium og/eller polyanioner ifølge foreliggende oppfinnelse og en kjemisk eller biologisk helhet, f.eks. terapeutisk eller detekterbar helhet. For eksempel kan helheten inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse være et terapeutisk middel, farge, magnetisk forbindelse, gjødningsstoff, åte, biokatalysator, smaks- eller luktsmodifiserende substans, blekemiddel eller enhver helhet som er detekterbar ved hvilken som helst egnet metode kjent på området, f.eks. bildefremstilling ved hjelp av magnetisk resonans (MRI), optiske-, fluorescerende/luminescerende- eller kjernemedisinske avbildningsteknikker. En helhet inneholdt i eller som kan fylles i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse er hensiktsmessig en svakt basisk og membranpermeabel (lipofil) helhet, f.eks. en amininneholdendeeller nitrogenbasehelhet.
I én utførelsesform er helheten inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse et terapeutisk middel.
I en annen utførelsesform er helheten inneholdt i liposomsammensetningen en antikrefthelhet. En liste over noen av de vanlig kjente kommersielt godkjente (eller i aktiv utvikling) antineoplastiske midler ved inndeling er som følger.
Strukturbaserte klasser: Fluorpyrimidiner--5-FU, fluordeoksyuridin, ftorafur, 5’-deoksyfluoruridin, UFT, S-1 kapecitabin; pyrimidinnukleosider-- deoksycytidin, cytosinarabinosid, 5-azacytosin, gemcitabin, 5-azacytosin- arabinosid; puriner--6-merkaptopurin, tioguanin, azatioprin, allopurinol, kladribin, fludarabin, pentostatin, 2-kloradenosin; platinaanaloger-- cisplatin, karboplatin, oksaliplatin, tetraplatin, platina-DACH, ormaplatin, CI-973, JM-216; antrasykliner/antracendioner--doksorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoksantron; epipodofyllotoksiner--etoposid, teniposid; camptoteciner-- irinotecan, topotecan, lurtotecan, silatecan, 9-aminocamptotecin, 10,11-metylendioksycamptotecin, 9-nitrocamptotecin, TAS 103, 7-(4-metyl-piperazino-metylen)-10,11-etylendioksy-20(S)-camptotecin, 7-(2-N-isopropylamino)etyl)-20(S)-camptotecin; hormoner og hormonelle analoger--dietylstilbestrol, tamoksifen, toremefin, tolmudex, tymitaq, flutamid, bikalutamid, finasterid, østradiol, trioxifen, droloxifen, medroksyprogesteronacetat, megesterolacetat, aminoglutetimid, testolakton og andre; enzymer, proteiner og antistoffer-- asparaginase, interleukiner, interferoner, leuprolid, pegaspargase og andre; vincaalkaloider--vinkristin, vinblastin, vinorelbin, vindesin; taksaner--paklitaksel, docetaksel.
Mekanismebaserte klasser: Antihormonelle midler--Se inndeling for hormoner og hormonelle analoger, anastrozol; antifolater--metotreksat, aminopterin, trimetreksat, trimetoprim, pyritrexim, pyrimetamin, edatreksat, MDAM; antimikrotubulusmidler--taksaner og vincaalkaloider; alkyleringsmidler (klassiske og ikke-klassiske)--nitrogensennep (mekloretamin, klorambucil, melfalan, uracilsennep), oksazafosforiner (ifosfamid, cyklofosfamid, perfosfamid, trofosfamid), alkylsulfonater (busulfan), nitrosoureaer (karmustin, lomustin, streptozocin), tiotepa, dakarbazin og andre; antimetabolitter--puriner, pyrimidiner og nukleosider, nevnt ovenfor; antibiotika--antrasykliner/antracendioner, bleomycin, daktinomycin, mitomycin, plikamycin, pentostatin, streptozocin; topoisomerasehemmere--camptoteciner (Topo I), epipodofyllotoksiner, m-AMSA, ellipticiner (Topo II); antivirale midler--AZT, zalcitabin, gemcitabin, didanosin og andre; diverse cytotoksiske midler--hydroksyurea, mitotan, fusjonstoksiner, PZA, bryostatin, retinoider, smørsyre og derivater, pentosan, fumagillin og andre.
I tillegg til det ovenfor omfatter en antikrefthelhet, uten noen begrensning, hvilken som helst topoisomerasehemmer, vincaalkaloid, f.eks. vinkristin, vinblastin, vinorelbin, vinflunin og vinpocetin, mikrotubulusdepolymeriserende eller -destabiliserende middel, mikrotubulusstabiliserende middel, f.eks. taksan, aminoalkyl eller aminoacylanalog av paklitaksel eller docetaksel, f.eks.2’-[3-(N,N-dietylamino)propionyl]paklitaksel, 7-(N,N-dimetylglysyl)paklitaksel og 7-L-alanylpaklitaksel, alkyleringsmiddel, reseptorbindende middel, tyrosinkinasehemmer, fosfatasehemmer, cyklinavhengig kinasehemmer, enzymhemmer, aurorakinasehemmer, nukleotid, polynikleotid og farnesyltransferasehemmer.
I en annen utførelsesform er helheten inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse et terapeutisk middel av antrasyklinforbindelser eller derivater, camptotecinforbindelser eller derivater, ellipticinforbindelser eller derivater, vincaalkaloinder eller derivater, wortmannin, dets analoger og derivater eller pyrazolopyrimidinforbindelser med aurorakinasehemmende egenskaper.
I ytterligere en annen utførelsesform er helheten inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse et antrasyklinmedikament, doksorubicin, daunorubicin, mitomycin C, epirubicin, pirarubicin, rubidomycin, karcinomycin, N-acetyladriamycin, rubidazon, 5-imidodaunomycin, N-acetyldaunomycin, daunorylin, mitoksantron; en camptotecinforbindelse, camptotecin, 9-aminocamptotecin, 7-etylcamptotecin, 10-hydroksycamptotecin, 9-nitrocamptotecin, 10,11-metylendioksycamptotecin, 9-amino-10,11-metylendioksycamptotecin, 9-klor-10,11-metylendioksycamptotecin, irinotecan, topotecan, lurtotecan, silatecan, (7-(4-metylpiperazinometylen)-10,11-etylendioksy-20(S)-camptotecin, 7-(4-metylpiperazinometylen)-10,11-metylendioksy-20(S)-camptotecin, 7-(2-N-isopropylamino)etyl)-(20S)-camptotecin; en ellipticinforbindelse, ellipticin, 6-3-aminopropyl-ellipticin, 2-dietylaminoetylellipticinium og salter derav, datelliptium, retelliptin.
I ytterligere en annen utførelsesform er helheten inneholdt i liposomet ifølge foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk helhet omfattende, uten begrensning, hvilken som helst av følgende: antihistaminetylendiaminderivater (bromfenifamin, difenhydramin); anti-protozoal: kinoloner (jodkinol); amidiner (pentamidin); antihelmintmidler (pyrantel); anti-schistosoma-medikamenter (oksaminikin); antifungale triazolderivater (flikonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol); antimikrobielle cefalosporiner (cefazolin, cefonicid, cefotaksim, ceftazimid, cefuoksim); antimikrobielle beta-laktam derivater (aztreopam, cefmetazol, cefoksitin); antimikrobielle stoffer av erytromycingruppe (erytromycin, azitromycin, klaritromycin, oleandomycin); penicilliner (benzylpenicillin, fenoksymetylpenicillin, kloksacillin, meticillin, nafcillin, oksacillin, karbenicillin); tetrasykliner; andre antimikrobielle antibiotika, novobiocin, spektinomycin, vankomycin; antimykobakterielle medikamenter: aminosalisylsyre, kapreomycin, etambutol, isoniazid, pyrazinamid, rifabutin, rifampin, klofazim; antivirale adamantaner: amantadin, rimantadin; kinidinderivater: klorokin, hydroksyklorokin, promakin, qionon; antimikrobielle qionoloner: ciprofloksacin, enoksacin, lomefloksacin, nalidiksinsyre, norfloksacin, ofloksacin; sulfonamider; antimikrobielle midler for urinveiene: metenamin, nitrofurantoin, trimetoprim; nitroimidazoler: metronidazol; kolinerge kvaternære ammoniumforbindelser (ambetinium, neostigmin, fysostigmin); anti-Alzheimer aminoakridiner (takrin); anti-Parkinson medikamenter (benztropin, biperiden, procyklidin, triheksylhenidyl); antimuskarine midler (atropin, hyoscyamin, skopolamin, propantelin); adrenerge dopaminer (albuterol, dobutamin, efedrin, adrenalin, noradrenalin, isoproterenol, metaproperenol, salmetrol, terbutalin); ergotaminderivater; myorelakserende midler eller curantype; sentraltvirkende myorelakserende midler; baklofen, cyklobenzepin, dentrolen; nikotin; beta-adrenoblokkere (acebutil, amiodaron); benzodiazepiner (ditiazem); antiarytmiske medikamenter (diisopyramid, encaidin, lokalanestetiske midler--prokain, prokainamid, lidokain, flecaimid), kinidin; ACE-hemmere: kaptopril, enelaprilat, fosinoprol, kinapril, ramipril; antilipidemiske midler: fluvastatin, gemfibrosil, HMG-CoA hemmere (pravastatin); hypotensive medikamenter: klonidin, guanabenz, prazocin, guanetidin, granadril, hydralazin; og ikke-koronare vasodilaterende midler: dipyridamol.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan helheten inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse også være en prehelhet, f.eks. et promedikament eller et middel som kan omdannes til en ønsket helhet ved ett eller flere omdannelsestrinn under en betingelse slik som en forandring i pH eller en enzymatisk kutting av en labil binding. Slik omdannelse kan forekomme etter frisetting av promedikamentet fra liposomets indre på det tilsiktede stedet for medikament/liposom effekt. Imidlertid kan pre-helheten omdannes til den ønskede aktive helheten inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse før anvendelse av liposomene som en leveringskonstituent, f.eks. administrering til en pasient. For eksempel kan en helhet modifiseres til en prehelhet slik at den enklere blir fylt inn i liposomene, og deretter kan den omdannes tilbake til den ønskede helheten med en gang den er inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. På denne måten, ifølge foreliggende oppfinnelse, kan helhetene som generelt ikke er mottakelige for metoder for ”aktiv”, ”på avstand” eller annen gradientbasert fylling effektivt bli ladet inn i liposomer, f.eks. inn i liposomets indre rom, i deres native, ikke-modifiserte form.
Globalt kationiske forbindelser, dvs. forbindelser som kan oppnå en netto positiv ioneladning under liposomfyllingsbetingelsene, spesielt forbindelsene inneholdende et titrerbart amin, er kjent for å fylle effektivt inn i liposomer som har transmembrane ionegradienter. Hvis en helhet av interesse er en organisk forbindelse og ikke er en global kationisk forbindelse som har et titrerbart amin, kan et derivat derav som har de nødvendige ioneegenskapene fremstilles ved en egnet modifikasjon, f.eks. i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Woodle et al., i WO 96/25147. For eksempel kan en amingruppe innføres ved esterifisering av en hydroksylgruppe til helheten med en aminosyre. Alternativt kan en hydrofob gruppe innføres i en vannløselig forbindelse for å medvirke i dens medvirkning i liposommembranen og påfølgende kryssing av membranen til det intraliposomale området, dvs. inni liposomene. En annen nyttig modifikasjon for å lage en liposomfyllbar pre-helhet er dannelse av et karbonylgruppeaddukt f.eks. et hydrazon, et oksim, en acetal eller en ketal. En modifisert aminoinneholdende gruppe kan hydrolyseres eller på annen måte spaltes kjemisk fra den modifiserte forbindelsen etter fyllingen av den modifiserte forbindelsen inn i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. Typiske prosesser for å regenerere helheten fra en prehelhet intraliposomalt er hydrolyse, fotolyse, radiolyse, tiolyse, ammonolyse, reduksjon, substitusjon, oksidasjon eller eliminasjon. Disse prosessene kan fremkalles, uten begrensning, ved endring av pH eller ved en enzymatisk effekt.
For eksempel blir paklitaksel eller docetaksel, en ikke-ionisk helhet, omdannet til deres 2’- (dietylaminopropionyl)- eller 7’-(dietylaminopropionyl) estere, som er svake baser (pre-helheter). Etter fylling inn i liposomene ved hvilken som helst kjent metode, omfattende, uten begrensning, ”aktive”, ”fjerne”, ”transmembran gradient-baserte” eller ”løselighetsgradient-baserte” metoder og/eller metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, blir intraliposomal 2’-(dietylaminopropionyl)-paklitaksel omdannet til opprinnelig paklitaksel ved å stimulere hydrolyse ved økning av pH til over pH 7,0. Derfor blir et liposom som innkapsler et nøytralt taksanmolekyl i dets indre rom fremskaffet med medikament/lipid forhold på over 0,05 mol per mol av liposomlipidet, uten hjelp av hydrofile kovalente modifikasjoner av taksanmolekylet (f.eks. ved binding av PEG), cyklodekstrintaksankomplekser eller taksansolubiliserende, micelledannende overflateaktive midler.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan liposomene inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse være hvilket som helst liposom kjent eller senere oppdaget på området. Generelt kan liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse ha hvilken som helst liposomstruktur, f.eks. strukturer som har et indre rom adskilt fra det ytre mediet ved ett eller flere lipiddobbeltlag, eller hvilken som helst mikrokapsel som har en semipermeabel membran med en lipofil sentral del der membranen adskiller et indre. Et lipiddobbeltlag kan være hvilken som helst ordning av amfifile molekyler karakterisert ved en hydrofil del (hydrofil gruppe) og en hydrofob del (hydrofob gruppe). Vanligvis er amfifile molekyler i et dobbeltlag ordnet i todimensjonale lag hvor hydrofobe grupper er orientert innover i laget, mens hydrofile grupper er orientert utover. Amfifile molekyler som danner liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være hvilke som helst kjente eller senere oppdagede amfifile molekyler, f.eks. lipider av syntetisk eller naturlig opprinnelse eller biokompatible lipider. Liposomer ifølge foreliggende oppfinnelse kan også dannes av amfifile polymerer og overflateaktive midler, f.eks. polymerosomer og niosomer. For formålet med denne beskrivelsen, blir disse liposomdannende materialene, uten begrensning, også henvist til som ”lipider”.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan liposomene inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse også være målrettede liposomer, f.eks. liposomer inneholdende én eller flere målrettede grupper eller biodistribusjonsmodifiserende midler på overflaten av liposomene. En målrettet gruppe kan være hvilket som helst middel som spesifikt kan binde eller interagere med et ønsket mål. I én utførelsesform er en målrettet gruppe en ligand. Liganden ifølge foreliggende oppfinnelse binder fortrinnsvis til og/eller internaliserer inn i en celle hvor den liposomomsluttede helheten utøver dens ønskede effekt (en målcelle). En ligand er vanligvis et medlem av et bindingspar der det andre medlemmet foreligger på eller i en målcelle eller i et vev omfattende målcellen. Eksempler på ligander egnet for foreliggende oppfinnelse er: folsyre, protein, f.eks. transferrin, vekstfaktor, enzym, peptid, reseptor, antistoff eller antistoffragment, slik som Fab’, Fv, enkeltkjedet Fv, enkeltdomeneantistoff eller hvilket som helst annet polypeptid omfattende antigenbindende sekvenser (CDR’er) av et antistoffmolekyl. Et ligandmålrettet liposom der en målrettet gruppe er et antistoff eller et målantigenbindende fragment derav blir kalt et immunliposom. I en foretrukket utførelsesform blir liposomet som bærer en målrettet gruppe, f.eks. en ligand, internalisert ved en målcelle. I ytterligere en annen utførelsesform er en målrettet gruppe en ligand som spesifikt interagerer med en tyrosinkinasereseptor, slik som for eksempel EGFR-, HER2-, HER3-, HER4-, PD-GFR-, VEGFR-, bFGFR- eller IGFR-reseptorer. I ytterligere en annen utførelsesform interagerer den målrettede gruppen spesifikt med en vekstfaktorreseptor, en angiogen faktor-reseptor, en transferrinreseptor, et celleadhesjonsmolekyl eller en vitaminreseptor.
I henhold til en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser liposomene inneholdt i liposomsammensetningen en transmembran konsentrasjonsgradient av et substituert ammonium og/eller polyanion ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er den høyere konsentrasjonen i det innvendige (indre) rommet av liposomene. Dessuten kan liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte én eller flere transmembrane gradienter i tillegg til gradienten dannet ved det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan liposomene inneholdt i liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg omfatte en transmembran pH-gradient, ionegradient, elektrokjemisk potensial-gradient og/eller løselighetsgradient.
I henhold til fortsatt en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffes i et sett omfattende en beholder med liposomene og eventuelt en beholder med helheten og en bruksanvisning, f.eks. prosedyrer eller informasjon relatert til anvendelse av liposomsammensetningen i én eller flere applikasjoner. Slik bruksanvisning kan fremskaffes via hvilket som helst medium, f.eks. papirkopi, elektronisk medium eller tilgang til en database eller nettsted inneholdende bruksanvisningen.
Liposommembransammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hvilken som helst egnet fremgangsmåte kjent for eller senere oppdaget av en fagperson. Generelt kan en rekke lipidkomponenter anvendes for å lage liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. Lipidkomponenter omfatter vanligvis, men er ikke begrenset til, (1) uladede lipidkomponenter, f.eks. kolesterol, ceramid, diacylglyserol, acyl(polyetere) eller alkylpoly(etere); (2) nøytrale fosfolipider, f.eks. diacylfosfatidylkoliner, sfingomyeliner og diacylfosfatidyletanolaminer, (3) anioniske lipider, f.eks. diacylfosfatidylserin, diacylfosfatidylglyserol, diacylfosfatidat, kardiolipin, diacylfosfatidylinositol, diacylglyserolhemisuksinat, diacylglyserolhemiglutarat, kolesterylhemisuksinat, kolesterylhemiglutarat og lignende; (4) polymerkonjugerte lipider, f.eks. N-[metoksy-(poly(etylenglykol)diacylfosfatidyletanolamin, poly(etylenglykol)-diacylglyserol, poly(etylenglykol)-ceramid; og (5) kationiske lipider, f.eks.1,2,-diacyl-3-trimetylammonium-propan (DOTAP), dimetyldioktadecylammoniumbromid (DDAB) og 1,2-diacyl-sn-glysero-3-etylfosfokolin. Monoacylsubstituerte derivater av disse lipidene, så vel som di- og monoalkylanaloger kan også anvendes.
Ulike lipidkomponenter kan velges for å oppfylle, modifisere eller tildele én eller flere ønskede funksjoner. For eksempel kan fosfolipid anvendes som vesikkeldannende lipid. Inklusjon av kolesterol er nyttig for opprettholdelse av membranstivhet og reduksjon av medikamentlekkasje. Polymerkonjugerte lipider kan anvendes i den liposomale formuleringen for å øke sirkulasjonslevetiden ved å redusere liposomclearance ved lever og milt eller for å bedre stabiliteten til liposomer mot aggregering under lagring, i fravær av sirkulasjonsforlengende effekt. Mens inklusjon av PEG-lipider i mengden 1 mol % eller mer av liposomlipidet er hevdet å ha en mange gangers forlengelse av liposomers sirkulasjonstid i blod (se f.eks. U.S. pat.5.013.556), har vi overraskende oppdaget at liposomer ifølge foreliggende oppfinnelse er ganske ”lengesirkulerende”, og tilsetning av PEG-lipid til liposomsammensetningen forlenget bare sirkulasjonslevetiden mindre enn tofold, hvis noe i det hele tatt. I tillegg kan ladningsmodulerende (titrerbare) lipider anvendes for å fremme levering av liposominnkapslede helheter til cytosoliske- eller kjernemål ved å lette at noen klasser av helheter unngår avgrensingen til endosomal vei.
I én utførelsesform omfatter liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse lecitin, kolesterol og en amfipatisk polymer. Lecitin inkludert i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et naturlig lecitin, et hydrogenert naturlig lecitin, et syntetisk lecitin, 1,2-distearoyl-lecitin, dipalmitoyl lecitin, dimyristoyl lecitin, dioleolyl lecitin, 1-stearoyl-2-oleoyl lecitin eller 1-palmitoyl-2-oleoyl lecitin, mens den amfipatiske polymeren kan være et polyetylen glykol-lipid derivat, f.eks. polyetylenglykol fosfatidyletanolamin, polyetylenglykol-diacylglyserol eller polyetylenglykol-ceramid derivat, der poly(etylenglykol)-delen har molekylvekt fra ca. 250 til ca.20.000, vanligst fra ca.500 til ca.5.000. I en annen utførelsesform er forhold mellom lecitin og kolesterol i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse ca. 3:2 ved mol. I ytterligere en annen utførelsesform er den amfipatiske polymeren minst 0,1 mol % av det liposomdannende lipidet i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. I ytterligere en annen utførelsesform er mengden av en amfipatisk polymer mellom 0,1 mol % og 1 mol % av det liposomdannende lipidet i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er den amfipatiske polymeren en nøytral polymer, dvs. har netto ioneladning lik null under medikamentfyllingsbetingelsene, for eksempel PEG-diacylglyserol, PEG-dialkylglyserol eller PEG-ceramid. Det ble uventet oppdaget at inklusjon av ionisk nøytrale amfipatiske lipider opp til PEG-lipidinnhold på ca.5,7 mol % av totalt lipid frembringer høyeffektiv liposomfylling av f.eks. vincaalkaloider, slik som vinorelbin, mens i tilfellet av anionisk ladet PEG-DSPE avtok fyllingseffektiviteten bemerkelsesverdig ved PEG-lipidinnhold på 1,6 mol % eller mer (Eksempel 72).
I ytterligere en annen utførelsesform inneholder liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse et camptotecinderivat, f.eks. et camptotecinpromedikament slik som irinotecan og består av lecitin og kolesterol, f.eks. ved et forhold på ca.3:2 ved mol, og en amfipatisk polymer, f.eks. ved en mengde på minst 0,1 mol % eller mindre enn 1 % av det liposomdannende lipidet.
Liposomer ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hvilken som helst metode som er kjent eller vil bli kjent på området. Se for eksempel G.
Gregoriadis (redaktør), Liposome Technology, vol.1-3, 1. utgave, 1983; 2. utgave, 1993, CRC Press, Boca Raton, FL. Eksempler på fremgangsmåter egnet for å lage liposomsammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ekstrusjon, fasereversert inndamping, sonikering, løsningsmiddel (f.eks. etanol) injeksjon, mikrofluidisering, detergentdialyse, eterinjeksjon og dehydrering/rehydrering.
Størrelsen på liposomer kan kontrolleres ved å kontrollere porestørrelsen til membraner anvendt for lavtrykksekstrusjoner eller trykket og antall passeringer anvendt i mikrofluidisering eller hvilken som helst annen egnet metode. I én utførelsesform blir de ønskede lipidene først hydrert ved tynnfilmhydrering eller ved etanolinjeksjon og deretter størrelsesbestemt ved ekstrusjon gjennom membraner med en definert porestørrelse; vanligst 0,05 μm, 0,08 μm eller 0,1 μm.
Liposomsammensetninger inneholdende det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse inni liposomene kan fremstilles ved hvilken som helst egnet metode, f.eks. dannelse av liposomer i nærvær av det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. i form av salt. Det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet utenfor liposomene kan fjernes eller fortynnes enten etter liposomdannelse eller før fylling eller omslutting av en ønsket helhet. Alternativt kan liposomsammensetning inneholdende det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles via ionebyttingmetode direkte eller via et mellomtrinn med fri syre som har en gradient av substituert ammonium ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. substituert ammoniumsalt av polyanionisert sukker eller polyol. Slike liposomer kan nøytraliseres ved anvendelse av aminet eller dets salt med en flyktig syre, f.eks. karbonat. Den resulterende liposomløsningen kan anvendes direkte eller alternativt kan saltet inneholdt deri om ønskelig fjernes, f.eks. ved inndamping og krystallisering fulgt av oppløsning i et vandig medium.
Fortrinnsvis har liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse en transmembran konsentrasjonsgradient av det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet, f.eks. er konsentrasjonen av det substituerte ammonium- og/eller polyanionesaltet inni liposomet høyere, vanligvis minst 100 ganger høyere, enn konsentrasjonen av det substituerte ammoniumet og/eller polyanionet i mediet utenfor liposomet.
I én utførelsesform er konsentrasjonen av det substituerte ammoniumog/eller polyanionesaltet inni liposomet minst 100 ganger høyere enn konsentrasjonen av det substituerte ammonium- og/eller polyanionesaltet i mediet utenfor liposomet og er minst i en konsentrasjon på ca.10 mM, 50 mM, 0,1 M, 0,2 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M eller 1,0 M, der molaritet blir beregnet basert på det substituerte ammoniumet. I en annen utførelsesform er konsentrasjonen av det substituerte ammonium- og/eller polyanionesaltet inni liposomet minst 100 ganger høyere enn konsentrasjonen av det substituerte ammonium- og/eller polyanionesaltet i mediet utenfor liposomet og er i en konsentrasjon på ca.0,65 M eller ca.1,0 M.
I tillegg har liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis en pH utenfor som er kompatibel med eller egnet for å opprettholde stabiliteten til en ønsket helhet i løpet av fyllingsprosessen, sammen med den høye fyllingseffektiviteten, f.eks. over 90 % omslutning. For eksempel er pH i området 4-7, eller pH 4,5-6,5, foretrukket. Spesielt, ifølge foreliggende oppfinnelse, blir fylling av en camptotecinforbindelse, f.eks. topotecan eller irinotecan, best utført ved pH i det ytre mediet i området mellom ca.4,0 og ca.7,0, mer foretrukket mellom ca. pH 5,0 og pH 6,5. Fylling av et vincaderivat, f.eks. vinkristin, vinorelbin eller vinblastin, blir best utført ved pH ca.5,0-7,0, mer foretrukket ved pH ca.6,5.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan en ønsket helhet fylles eller omsluttes i liposomene ved å inkubere den ønskede helheten med liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse i et vandig medium ved en egnet temperatur, f.eks. en temperatur over komponentlipidenes fasetransisjonstemperatur i løpet av fylling, mens den blir redusert under fasetransisjonstemperaturen etter fylling av helheten. Inkubasjonstiden er vanligvis basert på typen komponentlipider, helheten som skal fylles i liposomene og inkubasjonstemperaturen. Typisk er inkubasjonstid på få minutter til flere timer tilstrekkelig. Fordi høy omslutningseffektivitet på mer enn 85 %, typisk mer enn 90 %, blir oppnådd, er det vanligvis ikke behov for å fjerne ikke-omsluttet helhet. Hvis det imidlertid er et slikt behov, kan den ikke-omsluttede helheten fjernes fra sammensetningen ved ulike metoder, slik som for eksempel størrelseseksklusjonskromatografi, dialyse, ultrafiltrering, adsorpsjon eller utfelling. Det ble uventet funnet at opprettholdelse av den lave ionestyrken i løpet av inkubasjonen av en helhet, slik som spesielt et camptotecinderivat eller et vincaalkaloidderivat, med liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse, etterfulgt av økning i ionestyrke på slutten av inkubasjonen, resulterer i høyere fyllingseffektivitet, bedre fjerning av ikkeomsluttet medikament og bedre liposomstabilitet mot aggregering. Inkubasjonen blir typisk utført f.eks. i en vandig løsning ved ionestyrke på mindre enn den ekvivalent til 50 mM NaCl, eller mer foretrukket mindre enn den ekvivalent til 30 mM NaCl. Etter inkubasjonen kan en konsentrert salt-, f.eks. NaCl, løsning tilsettes for å øke ionestyrken til høyere enn den til 50 mM NaCl, eller mer foretrukket høyere enn den til 100 mM NaCl. Uten å være bundet av en teori, har vi en hypotese at økning av ionestyrke støtter dissosiering av helheten fra liposommembranen, hvilket fører til hovedsakelig all helhet innkapslet i det indre liposomale rommet.
Generelt avhenger helhet-til-lipid forholdet, f.eks. medikamentmengdeforhold oppnådd ved fylling av en helhet, på mengden av helheten omsluttet inni liposomene, konsentrasjonen av omsluttet substituert ammonium og/eller polyanion, f.eks. salt, de fysisk/kjemiske egenskapene til den omsluttede helheten og type motion (anion), f.eks. polyanion, anvendt. På grunn av høy fyllingseffektivitet oppnådd i sammensetningene og/eller ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, er helhet-til-lipid forholdet for helheten omsluttet i liposomene over 80 %, over 90 % og typisk mer enn 95 % av helhet-til-lipid forholdet beregnet på grunnlag av mengde helhet og liposomlipid tatt inn i fyllingsprosessen (”startforholdet”). Faktisk er praktisk talt 100 % (kvantitativ) innkapsling vanlig. Helhet-til-lipid forholdet i liposomene kan karakteriseres ved vektforhold (vekt mengde av helheten per vekt eller molar enhet av liposomlipidet) eller molart forhold (mol av helheten per vekt eller molar enhet av liposomlipidet). Én enhet av helhet-til-lipid forholdet kan omdannes til andre enheter ved en rutineberegning, som eksemplifisert nedenfor. Vektforholdet av en helhet i liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse er typisk minst 0,05, 0,1, 0,2, 0,35, 0,5 eller minst 0,65 mg av helheten per mg lipid. I form av molart forhold er helhet-til-lipid forholdet ifølge foreliggende oppfinnelse minst fra ca.0,02, til ca.
5, fortrinnsvis minst 0,1 til ca.2 og mer foretrukket fra ca.0,15 til ca.1,5 mol av medikamentet per mol av liposomlipidet. I én utførelsesform er helhet-til-lipid forholdet, f.eks. medikamentmengdeforhold av camptotecinderivater minst 0,1, f.eks. 0,1 mol av camptotecinderivat per ett mol liposomlipid, og fortrinnsvis minst 0,2. I en annen utførelsesform er helhet-til-lipid forholdet, f.eks. medikamentmengde, minst ca. 300 mg helhet (f.eks. vincaalkaloid eller et derivat derav) per mg liposomdannende lipid. I ytterligere en annen utførelsesform er helhet-til-lipid forholdet, f.eks. medikamentmengde, minst ca.500 mg helhet (f.eks. camptotecinderivat eller camprothecinpromedikament) per mg liposomdannende lipid. Overraskende tilveiebrakte oppfinnelsen stabil og nær kvantitativ liposomal innkapsling av et camptotecinderivatmedikament, f.eks. irinotecan, ved medikament-til-lipid forhold på over 0,8 mmol av helheten per 1 g liposomlipid, over 1,3 mmol av helhet per 1 g liposomlipid og til og med så høyt som 1,7 mmol helhet per 1 g liposomlipid (se Eksempel 74).
Hvis liposomet omfatter et fosfolipid, er det hensiktsmessig å uttrykke helhetinnholdet i enheter av vekt (masse) mengde av medikamentet per molar enhet av liposomfosfolipidet, f.eks. mg medikament/mmol fosfolipid. Imidlertid vil en fagperson sette pris på at medikamentinnholdet kan uttrykkes ekvivalent på en måte uavhengig av nærvær av fosfolipider i et liposom og videre kan uttrykkes ekvivalent i form av en molar mengde av medikamentet per enhet (masse eller molar) av liposomlipidinnholdet. For eksempel et liposom inneholdende 3 molare deler av distearoylfosfatidylkolin (DSPC, molekylvekt 790), 2 molare deler av kolesterol (molekylvekt 387) og 0,015 molare deler av poly(etylenglykol)-derivatisert distearoylfosfatidyletanolamin (PEG-DSPE, molekylvekt 2750) og inneholdende et medikament doksorubicin (molekylvekt 543,5) ved medikament/lipid forhold på 150 mg/mmol fosfolipid, det samme medikamentinnholdet kan uttrykkes ekvivalent i form av mg medikament/mg totalt lipid som følger:
a) Beregn de molare mengdene av liposomlipidkomponenter normalisert til den molare enheten av liposomfosfolipider (DSPC og PEG-DSPE i dette eksempelet) ved å dividere den molare mengden av en komponent med totalen av de molare mengdene av liposomfosfolipidene:
DSPC 3/(3+0,015) = 0,99502
Kolesterol 2/(3+0,015) = 0,66335
PG-DSPE 0,015/(3+0,015) = 0,00498
(b) Beregn massemengden av totalt liposomlipid som svarer til en enhet molar mengde av liposomfosfolipid og komponentenes molekylvekter:
Totalt lipid, mg/mmol fosfolipid = 0,99502x790 0,66335x387 0,00498x2750 = 1056,48
(c) Beregn massemengden av medikament per masseenhet av totalt lipid ved å dividere medikamentinnholdet uttrykt i masseenheter per molar enhet av fosfolipid med antallet fremskaffet i trinn (b):
Doksorubicin, mg/mg totalt lipid = 150/1056,48 = 0,14198.
(d) Beregn den molare mengden av medikamentet per enhet masse av totalt lipid ved å dividere antallet fremskaffet i trinn (c) med medikamentmolekylvekten (i dette tilfellet, 543,5):
Doksorubicin, mmol/g totalt lipid = 0,14198/543,5x1000 = 0,261.
(e) Beregn den molare delen av fosfolipider i liposomlipidmatriksen:
Fosfolipid molar del = (totale mol av fosfolipider)/(total molmengde av lipider) = (3+0,015)/(3+2+0,015) = 0,6012.
(f) Beregn molart forhold av doksorubicin til totalt lipid.
Doksorubicin, mol/mol av totalt lipid = (fosfolipid molar del) x (doksorubicin, g/mol fosfolipid)/(doksorubicin molekylvekt) = 0,6012x150/543,5 = 0,166
Derfor er forholdet mellom medikament-til-lipid og medikament-til-fosfolipid forhold uttrykt i ulike enheter lett stadfestet. Slik det er anvendt her, omfatter et ”lipid”, uten begrensning, hvilken som helst membrandannende komponent av liposommembranen, slik som for eksempel polymerer og/eller detergenter.
Liposomomsluttet substituert ammonium- og/eller polyanionesaltløsning ifølge foreliggende oppfinnelse har vanligvis en osmotisk styrke (osmolalitet) som bidrar til å holde liposomene stabile mot osmotisk skade (svelling og/eller bristing) uten tap av fyllingskapasiteten av liposomene. I én utførelsesform er osmolaliteten av liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse i området av 0,1 til 1,5 mol/kg eller fortrinnsvis 0,2 til 1,0 mol/kg. Overraskende fant vi at liposomer ifølge foreliggende oppfinnelse er stabile mot ugunstig effekt av høy intraliposomal osmotisk styrke på medikamentfylling. Intraliposomale osmolariteter så høye som 0,727 mol/kg ble godt tolerert, hvilket resulterer i praktisk talt kvantitativ fylling av et medikament opp til teoretisk maksimum av støkiometrisk utveksling av intraliposomale substituerte ammoniumioner for molekyler av medikamentet (i tilfellet av irinotecan, ett medikamentmolekyl per ett substituert ammoniumion), selv om osmolariteten til det ekstraliposomale vandige mediet i løpet av saminkubering av medikamentet og liposomene var nær den fysiologiske verdien på ca.0,3 mol/kg (Eksempel 74).
Generelt er liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse ganske stabil under lagring, f.eks. som målt ved prosentdelen av omsluttet helhet frisatt utenfor liposomene eller fortsatt holdt inni liposomene etter en viss tidsperiode fra den initielle fyllingen av helheten inni liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel er liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse stabil ved 4 ºC i minst 6 måneder, f.eks. er mindre enn 10 % av omsluttet helhet frisatt 6 måneder etter den initielle fyllingen av helheten. I én utførelsesform er liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse stabil ved 4 ºC i minst 2 år, f.eks. er mindre enn 20 % av omsluttet helhet frisatt 2 år etter den initielle fyllingen av helheten.
Det er fordelaktig for en liposomomsluttet helhet å forbli innkapslet i liposomet inntil liposomet når frem til stedet for dens tilsiktede effekt, f.eks. i tilfellet av et liposomalt antitumormedikament administrert til en pasient, en tumor.
Liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse viste overraskende stabilitet mot frisetting (lekkasje) av den omsluttede helheten under in vivo-betingelser, f.eks. i blodet til et pattedyr. Eksponeringstiden nødvendig for 50 % frisetting av den omsluttede helheten, f.eks. medikament, fra liposomene (halv-frisettingstid) i blodet til en rotte in vivo var mer enn 24 timer. Spesielt viste liposomer fylt med vincaalkaloidmedikamenter, f.eks. vinblastin, vinkristin og vinorelbin, bemerkelsesverdig stabilitet mot medikamentlekkasje in vivo, med halvfrisettingstid på minst 24 timer, eller mengden av helhet som forblir innkapslet etter 24 timer i blodet in vivo minst ca.50 % av pre-administreringsverdien. Typisk ble halv-frisettingstid over 33 timer, eller mengden av innkapslet helhet som forble innkapslet etter 24 timer i blodet in vivo minst ca.60 %, observert; og til og med var halv-frisettingstid over 46 timer, eller mengden av innkapslet helhet etter 24 timer i blodet in vivo minst ca.70 % av pre-administreringsverdien, vanlig. Noen ganger var halv-frisettingstid for et innkapslet medikament i blodet in vivo over 93 timer, og til og med over 120 timer. Liposomet fylt med camptotecinderivater, slik som topotecan og irinotecan, viste også ualminnelig in vivo-stabilitet i blodet, med 79-85 % av den opprinnelige medikamentmengden fortsatt innkapslet etter 24 timer. Bemerkelsesverdig viste liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse, selv om de har slik lav medikamentfrisettingshastighet i blodsirkulasjonen in vivo, vesentlig antitumoraktivitet in vivo som overskrider den til det frie medikamentet (dvs. administrert som en løsning).
Liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffet uventet kombinasjon av høy effektivitet av det omsluttede terapeutiske midlet og lav toksisitet. Generelt er aktiviteten til en terapeutisk helhet innkapslet liposomalt ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. den antineoplastiske aktiviteten til et camptotecinderivat hos et pattedyr, minst lik, minst to ganger høyere eller minst fire ganger høyere enn aktiviteten til den terapeutiske helheten hvis den blir administrert i samme mengde via dens rutine ikke-liposom formulering, f.eks. uten anvendelse av liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse, mens toksisiteten til den liposomalt innkapslede helheten ikke overstiger, er minst to ganger, minst tre ganger eller minst fire ganger lavere enn den til samme terapeutiske helhet administrert i samme dose og plan, men i en fri, ikkeinnkapslet form. For eksempel er det generelt kjent at liposomal innkapsling av antikreft-camptotecinderivater ved de publiserte fremgangsmåtene ifølge andre resulterer i økt toksisitet (lavere maksimalt tolerert dose, lavere 50 % dødelighetsdose) sammenlignet med uinnkapslet medikament. Se U.S. pat.
6.355.268; U.S. pat.6.465.008; Colbern, et al., Clinical Cancer Res.1998, v.4, s.
3077-3082; Tardi, et al., Cancer Res., 2000, v.60, s.3389-3393; Emerson, et al., Clinical Cancer Res.2000, v.6, s.2903-2912. Liposomalt innkapslede camptotecinpromedikamenter, slik som irinotecan (CPT-11), som er et vannløselig, kationisk camptotecinpromedikamentderivat, har hovedsakelig høyere, f.eks. minst fire ganger og til og med ti ganger høyere, antitumoraktivitet vurdert i en in vivo-tumormodell enn medikamentet i fravær av en liposomal formulering, f.eks. i en fri (løsning) form. Dette er til og med mer bemerkelsesverdig siden en terapeutisk forbindelse, f.eks. et camptotecinpromedikament, trenger enzymatisk aktivering, f.eks. ved effekt av endogen uspesifikk karboksylesterase, men er ifølge foreliggende oppfinnelse innkapslet hovedsakelig i det indre rommet av liposomet. På den annen side var toksisiteten til camptotecinpromedikament slik som CPT-11 i liposomal form (medikament/lipid masseforhold over 0,1, f.eks.0,2-0,6 eller mer) ifølge foreliggende oppfinnelse overraskende over to ganger, over 3 ganger og til og med over fire ganger lavere enn den til fritt (uinnkapslet) promedikament CPT-11. Videre ble en forlenget medikamentfrisetting fra CPT-11 liposomene oppnådd in vivo, med mer enn 50 % og til og med mer enn 70 % (79-86 %) av det opprinnelige medikamentinnholdet fortsatt tilbake i liposomene 24 timer etter administrering over i blodet, og med halv-frisettingstid på mer enn 24 timer, typisk på mer enn 48 timer. Forlenget remanens av medikamentet i liposomet in vivo ble assosiert med høyere antitumoreffekt. Overraskende ble den seneste in vivo CPT-11 frisettingen og høyeste antitumoraktiviteten observert i liposomene inneholdende lavmolekylært polyanionisert sukkerderivat (sukroseoktasulfat) i stedet for et polymert anion (polyfosfat) (Eksempel 15).
I henhold til en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffes som en farmasøytisk sammensetning inneholdende liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse og en bærer, f.eks. farmasøytisk akseptabel bærer.
Eksempler på farmasøytisk akseptable bærere er normalt saltløsning, isoton dekstrose, isoton sukrose, Ringers løsning og Hanks løsning. En buffersubstans kan tilsettes for å tilveiebringe pH optimal for lagringsstabilitet. For eksempel er pH mellom ca.6,0 og ca.7,5, mer foretrukket pH ca.6,5, optimal for stabiliteten til liposommembranlipider og sørger for utmerket retensjon av de omsluttede helhetene. Histidin, hydroksyetylpiperazin-etylsulfonat (HEPES), morfolipoetylsulfonat (MES), suksinat, tartrat og sitrat, typisk i 2-20 mM konsentrasjon, er eksempler på buffersubstanser. Andre egnede bærere omfatter f.eks. vann, bufret vandig løsning, 0,4 % NaCl, 0,3 % glysin og lignende. Protein, karbohydrat eller polymere stabiliseringsmidler og tonisitetsregulererende midler kan tilsettes, f.eks. gelatin, albumin, dekstran eller polyvinylpyrrolidon. Tonisiteten av sammensetningen kan justeres til fysiologisk nivå på 0,25-0,35 mol/kg med glukose eller en mer inert forbindelse slik som laktose, sukrose, mannitol eller dekstrin. Disse sammensetningene kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker, f.eks. ved filtrering. De resulterende vandige løsningene kan pakkes for anvendelse eller filtreres under aseptiske betingelser og frysetørkes, der den frysetørkede fremstillingen blir kombinert med et sterilt vandig medium før administrering.
De farmasøytiske liposomsammensetningene kan også inneholde andre farmasøytisk akseptable hjelpestoffer nødvendig for approksimative fysiologiske betingelser, slik som pH-justerende- og buffermidler, tonisitetsjusterende midler og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, osv. I tillegg kan liposomsuspensjonen omfatte lipidbeskyttende midler som beskytter lipider mot fri-radikale og lipid-peroksidative skader ved lagring. Lipofile fri-radikale ”quenchere”, slik som alfa-tokoferol og vannløselige jernspesifikke chelatorer, slik som ferrioksamin, er egnet.
Konsentrasjonen av liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse i de flytende farmasøytiske formuleringene kan variere mye, dvs. fra mindre enn ca.
0,05 %, vanligvis eller minst ca.2-10 %, til så mye som 30 til 50 vektprosent og vil primært bli valgt etter væskevolumer, viskositeter, osv., i henhold til den spesielle valgte administreringsmåten. For eksempel kan konsentrasjonen økes for å redusere væskemengden assosiert med behandling. Dette kan være spesielt ønskelig hos pasienter som har ateroskleroseassosiert kongestiv hjertesvikt eller alvorlig hypertensjon. Alternativt kan farmasøytiske liposomsammensetninger bestående av irriterende lipider fortynnes til lave konsentrasjoner for å redusere inflammasjon på administreringsstedet.
Mengden av administrert farmasøytisk liposomsammensetning vil avhenge av den spesielle terapeutiske helheten omsluttet inni liposomene, sykdomstilstanden som behandles, type liposomer som blir anvendt og legens vurdering. Generelt vil mengden av administrert farmasøytisk liposomsammensetning være tilstrekkelig for å levere en terapeutisk effektiv dose av den spesielle terapeutiske helheten.
Mengden av farmasøytisk liposomsammensetning nødvendig for å levere en terapeutisk effektiv dose kan bestemmes ved rutine metoder in vitro og in vivo, vanlig på området for medikamenttesting. Se for eksempel D. B. Budman, A. H. Calvert, E. K. Rowinsky (red.). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003. Terapeutisk effektive doseringer for ulike terapeutiske helheter er velkjent for fagfolk; og ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en terapeutisk helhet levert via den farmasøytiske liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse minst samme eller 2-fold, 4-fold eller 10-fold høyere aktivitet enn aktiviteten fremskaffet ved administrering av samme mengde av den terapeutiske helheten i dens ikke-liposom rutineformulering. Typisk er doseringene for den farmasøytiske liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse mellom ca. 0,005 og ca.500 mg av den terapeutiske helheten per kilogram kroppsvekt, oftest mellom ca.0,1 og ca.100 mg terapeutisk helhet/kg kroppsvekt.
Typisk blir den farmasøytiske liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt som en topisk eller en injiserbar, enten som en flytende løsning eller suspensjon. Imidlertid kan fast stoff egnet for løsning i eller suspensjon i flytende konstituenter før injeksjon også fremstilles.
Sammensetningen kan også formuleres til en enterodrasjert tablett eller gelkapsel i henhold til kjente metoder på området.
Liposomsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres på hvilken som helst måte som er medisinsk akseptabel som kan avhenge av tilstanden eller skaden som behandles. Mulige administreringsveier omfatter injeksjoner, ved parenterale veier slik som intramuskulært, subkutant, intravenøst, intraarterielt, intraperitonealt, intraartikulært, intraepiduralt, intratekalt eller andre, så vel som oralt, nasalt, oftalmisk, rektalt, vaginalt, topisk eller pulmonalt, f.eks. ved inhalasjon. For levering av liposomale medikamenter formulert i henhold til oppfinnelsen til tumorer i sentralnervesystemet, er en sakte, forlenget intrakranial infusjon av liposomene direkte inn i tumoren (en ”convectionenhanced delivery” eller CED) spesielt fordelaktig. Se Saito, et al., Cancer Research, vol.64, s.2572-2579, 2004; Mamot, et al., J. Neuro-Oncology, vol. 68, s. 1-9, 2004. Sammensetningene kan også påføres direkte til vevsoverflater.
Administrering med langsom frisetting, pH-avhengig frisetting eller annen spesifikk kjemisk eller miljømessig betingelsesmediert frisetting er også spesifikt omfattet i oppfinnelsen, f.eks. i form av depotinjeksjoner eller eroderbare implantater.
EKSEMPLER
De følgende eksemplene er ment å illustrere, men ikke å begrense, oppfinnelsen på noen som helst måte, form eller type, enten eksplisitt eller implisitt. Selv om de er typiske for de som kan anvendes, kan andre prosedyrer, metodologier eller teknikker kjent for fagfolk alternativt anvendes.
EKSEMPEL 1. Fremstilling av løsningene av substituerte ammoniumsalter.
Trialkylammonium- og dialkylammoniumsulfatløsninger nyttige for fylling av medikamenter (f.eks. doksorubicin) inn i liposomer ble fremstilt ved å fortynne svovelsyre med vann til en konsentrasjon på 0,25 M og deretter titrere svovelsyreløsningen med ett av mange aminer. De substituerte aminene anvendt i dette eksempelet var trietylamin, trimetylamin, dimetylamin, dietylamin eller dietanolamin. Etter tilsetningen av aminene, ble den sluttlige løsningen fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,2 M av det substituerte ammoniumsaltet.
Osmolalitet ble bestemt ved anvendelse av et doggpunktosmometer.
Egenskapene til resulterende substituerte alkylammoniumsulfatsaltløsninger er vist i Tabell 1 nedenfor.
Tabell 1. Egenskaper til flere dialkylammonium- og trialkylammoniumsulfatløsninger
Salt Osmolalitet, mmol/kg pH Dimetylammoniumsulfat 472 5,65 Dimetyletanolammoniumsulfat 509 5,72 Dietylammoniumsulfat 519 5,85 Trimetylammoniumsulfat 497 5,81 Trietylammoniumsulfat 559 5,33
EKSEMPEL 2. Fremstilling av liposomer med omsluttet dialkylammoniumog trialkylammoniumsalter og fylling av en substans inn i disse liposomene.
Distearoylfosfatidylkolin (DSPC), kolesterol (Kol) og N-(metoksypoly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-distearoylfosfatidyletanolamin (PEG-DSPE) (fremstilt fra poly(etylenglykol) med molekylvekt 2.000) ble oppløst sammen i kloroform i et molart forhold på 3:2:0,015, og kloroform ble fjernet ved 55-60 ºC ved rotasjonsfordampning. Den tørkede lipidfilmen ble deretter hydrert i en løsning av ett av hvert dialkyl- eller trialkylammoniumsulfater nevnt i Eksempel 1 ved 60 ºC i 30 min. Lipidsuspensjonen ble ekstrudert under trykk gjennom to stablede sporetsede polykarbonatmembranfiltre med porestørrelse på 0,1 μm (Corning Nuclepore). Liposomstørrelsen bestemt ved kvasielastisk lysspredning var ca. 110-120 nm. Uinnkapslede trialkylammonium- eller dialkylammoniumsalter ble fjernet fra det ytre mediet av liposomene ved gelfiltrering ved anvendelse av en kryssbundet dekstrangel (Sephadex G-75, Amersham Pharmacia Biotechnology) kolonne eluert med HEPES-bufret saltløsning, pH 7,2-7,4, og liposomene ble oppsamlet i en dødvolumfraksjon (”void volume fraction”) av kolonnen.
Doksorubicinhydroklorid USP (frysetørket pulver inneholdende 5 vektdeler laktose per 1 del doksorubicin) ble satt til liposomene i en konsentrasjon på 150 μg medikament/μmol liposomfosfolipid. Blandingen ble inkubert ved 55 ºC i 45 min, avkjølt på is i 10 min og uinnkapslet medikament ble fjernet ved gelfiltreringskromatografi ved anvendelse av en Sephadex G-75 kolonne eluert med HEPES-bufret saltløsning, pH 7,4. Tilstedeværelsen av fritt doksorubicin (karakterisert ved nærvær av et saktere bevegende rødfarget bånd) var ikke detekterbart visuelt. De rensede doksorubicinfylte liposomene ble analysert for fosfolipid og doksorubicin i henhold til henholdsvis Eksempel 70 og 71 (spektrofotometrisk fremgangsmåte). Resulterende medikamentfyllingseffektiviteter er vist i Tabell 2.
Tabell 2. Fylling av doksorubicin i liposomer med omsluttede løsninger av dialkyl- og trialkylammoniumsalter. Medikament/fosfolipid startforhold på 150 μg/μmol.
Liposomomsluttet salt: Medikament/fosfolipid Omslutningsforhold i liposomer (μg/μmol) effektivitet (%) Trimetylammoniumsulfat 140,74 ± 10,35 93,8 ± 5,7 Trietylammoniumsulfat 163,81 ± 16,41 109,2 ± 11,6 Dietylammoniumsulfat 158,16 ± 18,34 105,4 ± 7,8 Dimetyletanolammoniumsulfat 155,08 ± 8,51 103,4 ± 11,6
EKSEMPEL 3. Fremstilling av liposomer inneholdende flere dialkyl-, trialkylog heterosyklisk-substituerte ammoniumsulfatsalter og fylling av doksorubicin inn i disse liposomene.
De substituerte ammoniumsulfatsaltløsningene ble fremstilt som i Eksempel 1 ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige alkyl-substituerte, hydroksyalkylsubstituerte og heterosykliske aminer. Liposomer ble dannet som i Eksempel 1, bortsett fra i stedet for lipidfilmhydreringstrinnet, ble de rene lipidene løst i etanol (ca. 100 μl etanol for hver 50 μmol av fosfolipid) og blandet med den substituerte ammoniumsaltløsningen ved 60-65 ºC, slik at den resulterende lipiddispersjonen inneholdt ca.10 volumprosent etanol.
Doksorubicinfylling ble utført ved tilsetning av doksorubicinløsning (2 mg/ml i HEPES-bufret saltløsning pH 6,5) til liposomene ved et forhold på 155 μg medikament/μmol liposomfosfolipid (PL) og oppvarming ved 58 ºC i 45 min i et varmt vannbad. De resulterende liposomene ble separert fra hvilket som helst gjenværende uinnkapslet doksorubicin og analysert for medikament- og lipidinnhold som i Eksempel 1. Resultatene er vist i Tabell 3.
Tabell 3. Fylling av doksorubicin inn i liposomer med omsluttede sterisk hindrede substituerte alkyl-, dialkyl-, trialkyl- og heterosykliske
ammoniumsaltløsninger.
Amin anvendt til å Osmolalitet, Medikamentmengde, Fyllingsfremstille substituert mmol/kg mg/mmol fosfolipid effektivitet, % ammoniumsalt
Trimetylamin 497 149,4 ± 7,9 96,4 ± 4,9 Trietylamin 559 149,6 ± 6,9 96,5 ± 4,3 Dimetyletanolamin 509 163,1 ± 6,6 105,3 ± 4,5 Dimetylamin 472 158,6 ± 7,4 102,3 ± 4,9 Dietylamin 519 156,7 ± 13,0 101,1 ± 8,5 Diisopropylamin 533 159,9 ± 6,2 103,2 ± 4,1 Tris(hydroksymetyl)- 423 179,9 ± 15,3 116,1 ± 11,5 minometan
1-Piperidinetanol 506 153,5 ± 7,1 99,0 ± 4,5 4-Metylmorfolin 465 152,4 ± 9,8 98,3 ± 6,2 Piperidin 479 158,5 ± 12,5 102,3 ± 8,2 1-Metylpyrolidin 492 153,6 ± 12,3 99,1 ± 7,8 Dimetylpiperazin 378 158,0 ± 6,5 101,9 ± 4,3
EKSEMPEL 4. Fremstilling av trietylammoniumpolyfosfat (TEA-Pn) løsning.
Lineært natrium poly(fosfat) som har 13-18 fosfatenheter per molekyl (fosfatglass; CALGON®, fremskaffet fra Sigma Chemical Company) ble løst i vann til en konsentrasjon på ca.1,3 M fosfat. Løsningen ble ført gjennom en kolonne pakket med 120 ml sulfonert polystyren-divinylbenzen kopolymer kationebytterresinkuler (Dowex 50Wx8-200, Dow Chemical Co.) i hydrogenform. Kolonnen ble ekvilibrert på forhånd med vandig 3-3,6 M HCl for å bringe resinen til hydrogenform og vasket med avionisert vann til nøytral pH. Femten ml av natriumpolyfosfatløsningen ble påført kolonnen og eluert med avionisert H2O.
Kolonneelueringsmidlet ble monitorert ved anvendelse av en konduktivitetsdetektor. Outflow fra kolonnen som svarer til konduktivitetstoppen ble titrert med rent trietylamin til pH 5,5-6,0. Løsningen ble analysert for gjenværende natrium ved potensiometri ved anvendelse av en natriumsensitiv glasselektrode og for fosfatinnhold ved anvendelse av en uorganisk fosfattest som i Eksempel 1. Løsningen som har gjenværende natriuminnhold på mindre enn 1 % ble fortynnet til en endelig fosfatkonsentrasjon på 0,55 M. Løsningen har typisk en TEA-konsentrasjon på 0,52-0,55 M, pH på 5,5-6,0 og osmolalitet på 430-480 mmol/kg.
EKSEMPEL 5. Fjerning av ikke-omsluttede polyfosfatsalter fra liposomfremstillinger.
Liposomer (120 nm i størrelse) med omsluttet fluorescerende markør 8-hydroksypyrentrisulfonat ble fremstilt i henhold til Kirpotin, et al., Biochemistry 36:66-75, 1997, og blandet med løsningen av natriumpolyfosfat. Blandingen ble satt på størrelseseksklusjonskolonner inneholdende kryssbundne dekstrankuler (Sephadex G-75), 6 % agarosekuler (Sepharose 6B-CL) eller 4 % agarosekuler (Sepharose 4B-CL), alle fra Amersham Pharmacia, og eluert med MES-dekstrose buffer (pH 5,5). Effluentene ble undersøkt for fosfatinnhold ved anvendelse av fosfatanalysen til Bartlett (1959) og for liposominnholdet ved spektrofluorometri. Av de studerte gelkromatografibærerne ga Sepharose CL-6B fullstendig separering av polyfosfat fra liposomene ved forholdet prøve/kolonnepakkematerialets volum på 13.
EKSEMPEL 6. Fremstilling av løsning av trietylammonium sukroseoktasulfat (TEA-SOS).
Natriumsukroseoktasulfat (ekvivalent vekt 144,8) er natriumsaltet av sukrosederivat hvor alle hydroksylgrupper har dannet svovelsyreestere.
Sukroseoktasulfat (SOS) natriumsalt ble fremskaffet fra Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, p/n S699020. Seks gram natriumsukroseoktasulfat ble løst i 16,57 ml avionisert vann for å tilveiebringe en endelig konsentrasjon på ca. 2,5 N av sulfatgruppene. Løsningen ble behandlet ved ionebytting som i Eksempel 4. Løsningen av sukroseoktasvovelsyre fremskaffet som en ionebytterkolonneeffluent ble deretter titrert med rent trietylamin til pH 5,7 (nøytraliseringspunkt) og pH og osmolalitet på løsningen ble bestemt. Den resulterende løsningen hadde den beregnede trietylammoniumkonsentrasjonen på 0,643 M, pH 5,7 og osmolalitet på 530 mmol/kg. Tilstedeværelse av gjenværende natrium var ikke detekterbar ved potensiometri (mindre enn 0,1 %).
EKSEMPEL 7. Liposomer fylt med irinotecan (CPT-11) ved anvendelse av substituerte ammoniumsalter: fremstilling og in vitro-medikamentfrisetting i nærvær av blodplasma.
I dette eksempelet ble sulfat, sitrat, pyrofosfat, trifosfat og lineært polyfosfat (13-18 mer) studert som anioner i de liposomomsluttede substituerte ammoniumsaltløsningene. Fosfatpolymerer ble valgt pga. deres biodegraderbarhet og fordi polyfosfater er funnet naturlig i cellene, til forskjell fra andre syntetiske polymere anioner (polyakrylat, dekstransulfat og lignende).
Dessuten var viskositeten til løsninger av lavmolekylære polyfosfater lavere enn den til andre polymerer, hvilket gjør polyfosfater mer prosessvennlige.
De følgende materialene ble anvendt for fremstilling av saltløsninger.
1. Natriumpolyfosfat, NaO-[PO3Na]n-Na, n = 13-18, kjøpt fra Sigma (produktnr.
P-8510, ”Phosphate Glass, Practical Grade”, også kjent som natriumheksametafosfat eller ved merkenavnet CALGON);
2. Pentanatriumtripolyfosfat, Na5P3O10, kjøpt fra Sigma (produktnr. T-5883); 3. Tetranatriumpyrofosfatdekahydrat, Na4P2O7<.>10H2O, kjøpt fra Sigma (produktnr. P-9146).
4. Ionebytterresiner Dowex 50Wx4 (4 % kryssbundet sulfonert polystyrenresin, 100-200 mesh) kjøpt fra Sigma (produktnr.50X4-200) eller Dowex HCR-W2 (8 % kryssbundet sulfonert polystyrenresin 50-100 mesh) kjøpt fra Sigma (produktnr.1-8880) ble anvendt om hverandre. Resinene ble vasket ved dekantering i følgende rekkefølge: tre ganger med avionisert vann, to ganger med 1 N HCl (3x overskudd i forhold til resinen ved volum), tre ganger med vann, to ganger med 1 N NaOH, tre ganger med vann, tre ganger med 1 N HCl og tre ganger med vann. Etter dekanteringen var resinene i H<+>-form.
5. Trimetylamin (TMA), vandig løsning 40 %, fra Aldrich Chemical Co.
(produktnr. 43, 326-8). Konsentrasjonen ble stadfestet ved syretitrering til å være rundt 5,9 N.
6. Trietylamin (TEA), 99 %, HPLC-kvalitet, fra Fisher (produktnr.04884). Konsentrasjonen ved syretitrering var 6,9-7,1 N.
Vann ble renset ved revers osmose, ionebytting og organisk fjerning for å oppnå organisk fri ”16-18 MOhm” kvalitet.
Vandige løsninger av pyrofosfat, trifosfat og polyfosfatsalter ble fremstilt ved ionebyttingmetode. Løsninger av natriumpolyfosfat (3 g i 25 ml vann), pyrofosfat (4 g i 27 ml vann) eller polyfosfat (6,7 g i 30 ml vann) ble satt på kolonnen inneholdende 100 ml (pakkematerialevolum) av ionebytterresinen fremstilt som ovenfor. Kolonnen ble eluert med vann og fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjonene som hadde sur pH (pH<3) ble samlet. Triplikater på 0,5 ml delmengder av den samlede fraksjonen inneholdende fosfatsyren ble fortynnet med 20 ml vann og titrert med 0,100 N NaOH til endepunktet på pH 4,5-5,0 (Fisher analytisk løsning) for å bestemme normalitet. De samlede fraksjonene etter ionebytting ble titrert med trimetylamin (for å oppnå trimetylammoniumsalter) til pH 5,4-5,5. Etter titrering ble løsningene fortynnet, om nødvendig, for å oppnå en endelig konsentrasjon av trimetylammonium nær 0,5 N.
Trimetylammonium- og trietylammoniumsulfater ble fremstilt ved å fortynne 1,39 ml konsentrert (17,9 M) svovelsyre med 80 ml vann og titrere den fortynnede løsningen med rent trietylamin eller vandig trimetylamin under kontroll av et pH-meter til ekvivalenspunkt (pH 5,1-5,5). Volumet ble justert til 100 ml med vann.
Trimetylammoniumsitratløsning ble fremstilt ved å løse 1,572 g sitronsyremonohydrat ACS fra Sigma (produktnr. C-1909) i 20 ml vann og titrere løsningen med vandig trimetylamin til ekvivalenspunktet. Volumet ble justert til 25 ml med vann.
Løsningene ble filtrert gjennom et 0,2 μm celluloseacetatfilter ved anvendelse av positivt trykk. Osmolalitet og pH i løsningene ble målt ved anvendelse av henholdsvis et damptrykkosmometer og glass-kalomel elektrode pH-meter. Normaliteten av anionet i fosfatløsningene ble bestemt ved blå fosfomolybdat-spektrofotometrisk analyse (se Eksempel 70) etter syrehydrolyse (5 min. 100 ºC, 3 N H2SO4). Anionenormalitet tok bare i betraktning de sure funksjonelle gruppene som hovedsakelig er ionisert ved pH 5,5. Kationenormalitet ble bestemt på grunnlag av den tilsatte trialkylammoniumbasen. De fremskaffede løsningene hadde følgende egenskaper (Tabell 4):
Tabell 4. Egenskaper av substituerte ammoniumsaltløsninger for CPT-11 fylling inn i liposomer.
Salt Katione- Anione- pH Osmolalitet normalitet normalitet (mmol/kg) TMA-sitrat 0,58 0,60 5,1 791 TMA-sulfat 0,50 0,50 5,4 625 TMA-pyrofosfat 0,44 0,54 5,4 651 TMA-trifosfat 0,57 0,68 5,4 695 TMA-polyfosfat 0,49 0,58 5,5 336 TEA-sulfat 0,54 0,50 5,35 719
Kolesterol og DSPC ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA. PEG-DSPE (PEG molekylvekt 2.000) var fra Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA. DSPC, kolesterol og PEG-DSPE i vektforholdet 3:1:0,1 (molart forhold ca.
3:2:0,03) ble løst i kloroform (Fisher; Optima-kvalitet, stabilisert med amylen) ved 60 mg/ml av DSPC. Løsningen ble fordelt i Pyrex-rør ved 30 mg DSPC (0,5 ml) per rør og sakte inndampet ved redusert trykk ved anvendelse av rotasjonsfordamper ved 60 ºC. Lipidfilmene ble tørket under vakuum (100 mikron kvikksølv, oljepumpe) i 30-60 minutter ved romtemperatur.
Tørre lipidfilmer ble hydrert ved rolig risting i de ovenfor vandige saltløsningene ved 60 ºC i 15-20 minutter. Lipidene dannet en melkaktig suspensjon (multilamellære vesikler). Denne melkaktige suspensjonen ble gjenstand for fem sykluser av nedfrysing i blanding av tørris og isopropanol (-80 ºC, 3 minutter) og tining i et vannbad ved 60 ºC i 3 minutter. Deretter ble lipidsuspensjonen ekstrudert ti ganger (dobbeltslag) gjennom to stablede polykarbonatmembranfiltre (Nucleopore, Whatman, porestørrelse 0,1 μm) ved anvendelse av en manuelt betjent resiprok ekstruder (Avanti Polar Lipids) oppvarmet ved 60 ºC.
De ekstruderte liposomene ble holdt ved 60 ºC i fem minutter og quenchet i isvann (0-4 ºC) i fem minutter. Deretter ble liposomene separert fra den gradientdannende saltløsningen over i fyllingsbufferen MES-dekstrose (50 g/l dekstrose ACS, 0,975 g/l 2-(N-morfolino)-etansulfonsyre (MES) og tilstrekkelig mengde av 5 M NaOH for å bringe pH til 6,4) ved gelkromatografi på Sephadex G-75. Liposomer finnes i dødvolumfraksjonen (ca.30 % av kolonnepakkematerialets volum).
CPT-11 (irinotecanhydroklorid) fremstilling inneholdende 0,860 mg av CPT-11 basen per 1 mg av det faste stoffet ble løst i 0,001 N HCl for å lage en lagerløsning på 16,5 mg/ml CPT-11 base. Denne løsningen ble blandet med liposomene i MES-dekstrose buffer for å oppnå forholdet på 150 μg CPT-11 per 1 μmol liposomfosfolipider. Blandingen ble inkubert ved 55 ºC i et vannbad, med leilighetsvis rolig risting (ca. hvert femte minutt) i 30 minutter, deretter raskt avkjølt i isvann (0-4 ºC). Liposomene ble separert fra det uinnkapslede medikamentet ved gelkromatografi på Sephadex G-75, ved anvendelse av MES-dekstrose som elueringsmiddel. Det innkapslede medikamentet ble bestemt ved en spektrofotometrisk analyse (Eksempel 71), og fosfolipidene bestemt ved anvendelse av en ekstraksjonsanalyse (Eksempel 70).
In vitro-medikamentfrisetting fra slikt fremskaffede CPT-11-fylte liposomer i nærvær av 50 % humant plasma ble studert som følger. Frosset humant donorplasma ble tint ved 37 ºC, sentrifugert ved 14.500 g i 10 minutter og filtrert gjennom et 0,45 μm celluloseacetatsprøytefilter. Liposomfremstillingene med fylt CPT-11 ble sterilisert ved passering gjennom 0,2 μm overflateaktivt middel-fri celluloseacetat (SFCA) sterilt sprøytefilter. 0,5 ml av liposomene ble blandet med 0,5 ml plasma i sterile 1,5 ml kopolymer-Eppendorfrør, lukket og inkubert på en vuggende plattform ved 37 ºC i 24 timer. Negativ kontroll inneholdt 0,5 ml steril MES-dekstrose i stedet for liposomer. Liposomene ble isolert ved gelkromatografi på en kuleinneholdende kryssbundet 2 % agarosegel (Sepharose CL-2B, Pharmacia; 10 ml sengvolum) ved anvendelse av 144 mM NaCl, 5 mM HEPES-Na, pH 7,4 buffer (HBS-5). Liposomene fremkom i dødvolumfraksjonen, mens plasmaproteiner og frisatt medikament (hvis noe) ble forsinket av gelen.
Liposomfraksjonene ble undersøkt for CPT-11 og fosfolipider, og forholdet medikament/fosfolipider (sluttforhold) ble bestemt. Måletall for de negative kontrollene (kun plasma) ble subtrahert fra måletall av de liposominneholdende prøvene. Prosent medikamentet gjenværende i liposomene etter inkubasjonen ble bestemt ved å dividere medikament/lipid sluttforholdet med medikament/lipid startforholdet (medikament/lipid forhold før inkubasjon med plasma). Fyllings- og frisettingsdata er oppsummert i Tabell 5.
Tabell 5. Fylling av CPT-11 inn i liposomer med tertiære alkylammoniumsalter og in vitro-frisetting av medikamentet i nærvær av humant plasma.
Omsluttet Før inkubasjon med plasma Etter inkubasjon med plasma saltløsning
medikament/ innkapslings- medikament/ medikament som lipid forhold effektivitet (%) lipid forhold forblir innkapslet (%) TMA-sulfat 127,2 ± 5,6 84,8 ± 3,8 132,1 ± 6,9 103,8 ± 10,0 TMA-pyrofosfat 136,2 ± 9,0 90,8 ± 6,0 132,3 ± 5,0 97,1 ± 10,1 TMA-trifosfat 132,9 88,6 129,2 97,3 TMA-Pn 134,4 ± 9,3 89,6 ± 6,2 135,0 ± 7,4 100,4 ± 12,4 TEA-sulfat 131,1 ± 6,5 87,4 ± 4,4 125,2 ± 5,0 95,5 ± 8,6
EKSEMPEL 8. In vivo-stabilitet av liposomene fylt med CPT-11 ved anvendelse av pyrofosfat-, trifosfat-, polyfosfat-, sitrat- og sulfattrialkylammoniumsalter.
Selv om camptotecinliposomer kan ha akseptabel medikamentlekkasje i blodplasma in vitro, kan medikamentet lekke raskere ut i blodsirkulasjonen in vivo. Derfor ble et panel av CPT-11 liposomformuleringer screenet for medikamentstabilitet i blodsirkulasjonen in vivo ved å anvende en analyse av et enkelt tidspunkt i mus.
Liposomene ble fremstilt og fylt med CPT-11 som beskrevet i Eksempel 6, med følgende modifikasjoner. I stedet for å anvende PEG-DSPE fra Shearwater Polymers, anvendte vi lignende PEG-DSPE fra Avanti Polar Lipids. For å frembringe kvantifisering av liposomlipidmatriksen i blod-/vevsprøvene, ble en ikke-utbyttbar radioaktiv markør, [<3>H]-kolesterylheksadecyleter ([<3>H]-CHE;
(Amersham, USA) satt til kloroformløsningen av lipidene i mengde på 0,25 mCi/mmol fosfolipider. Lipidløsningene ble fordelt i Pyrex-rør ved 12 mg DSPC/rør, og lipidfilmer ble dannet ved rotasjonsfordampning/vakuumtørking. Lipidfilmer ble hydrert i 0,7 ml av de gradientdannende substituerte ammoniumsaltløsningene. Lipidkonsentrasjon i liposomene med omsluttede fosfatinneholdende salter ble bestemt ved scintillasjonstelling. Fremstillingene uten omsluttede fosfatinneholdende salter ble også analysert for fosfolipider uten ekstraksjon som beskrevet i Eksempel 70 og anvendt som lipidradioaktivitetsstandarder. Deler av liposom-medikament blandingene fremstilt for fylling ble spart og analysert for å bekrefte pre-fyllingsforholdet av tilsatt CPT-11 til liposomlipidet før fylling (”startforhold”). Volumgjennomsnitt og standardavvik av liposomstørrelsesfordelingen ble bestemt ved kvasielastisk lysspredning (QELS) ved anvendelse av gaussisk modell. Egenskapene til disse liposomene er oppsummert i Tabell 6.
Tabell 6. Karakterisering av CPT-11-fylling inn i [<3>H]-CHE-merkede liposomer for in vivo-stabilitetsstudie
Omsluttet Medikament/ Medikament/ Fyllings- Liposomstr., saltløsning lipid forhold lipid forhold effektivitet (gj.snitt ±SD) før fylling etter fylling (%) nm TMA-sitrat 159,2 ± 3,5 156,7 ± 3,6 98,5 ± 4,4 122,1 ± 25,3 TMA-sulfat 156,1 ± 2,5 156,1 ± 3,1 100,0 ± 3,6 122,2 ± 28,4 TMA-pyrofosfat 164,6 ± 5,8 156,6 ± 4,3 95,2 ± 6,0 121,1 ± 19,9 TMA-trifosfat 163,6 ± 5,7 156,0 ± 3,2 95,3 ± 5,3 122,4 ± 12,9 TMA-polyfosfat 170,5 ± 8,0 162,4 ± 4,0 95,3 ± 6,8 123,0 ± 12,7 TEA-sulfat 153. ± 3,3 154,9 ± 4,9 101,0 ± 5,3 121,1 ± 18,0
Seks uker gamle CD-1 hunnmus (Charles River) mottok haleveneinjeksjoner av disse liposomale CPT-11 formuleringene ved dose på 10 mg/kg (0,2 mg CPT11/mus) i duplikater. Åtte timer senere ble musene anestesert og avlivet ved åpen hjertepunktering. Blodet ble samlet opp i hepariniserte sprøyter (10-20 μl av 1000 U/ml heparin USP) og overført til veide rør inneholdende 0,4 ml av fosfatbufret fysiologisk saltvannsløsning (PBS) inneholdende 0,04 % EDTA (Gibco BRL), holdt på is. Rørene ble veid for å bestemme vekt av blodprøvene, blodceller ble separert ved sentrifugering ved 9.000 g i 5 minutter og supernatanter inneholdende PBS-fortynnet plasma ble spart for medikament- og liposomlipidanalyser. CPT-11 ble kvantifisert ved fluorometrisk analyse (Eksempel 71). Liposomlipid ble kvantifisert ved quenching-korrigert scintillasjonstelling.
Liposom- og fosfolipidradioaktivitetsstandardene ble telt parallelt med plasmaprøvene. Prosent medikament som forble innkapslet ble beregnet ved å dividere forholdet medikament/radioaktivitet i plasmaprøvene med medikament/radioaktivitet forholdet av de injiserte liposomene. På grunn av den raske elimineringen av fritt CPT-11 fra blodet (se Eksempel 69) og den kjente stabiliteten av [<3>H]-CHE mot lipidbytting, ble analysetallene betraktet som indikativiske for blodinnholdet av liposomalt CPT-11 og lipid. Prosent injisert lipiddose (% I.D.) gjenværende i sirkulasjonen ble beregnet ved å anta at 100 % av injisert bolus kom over i sirkulasjonen; der blodvolum er 6,3 % av musekroppsvekten og hematokritt på 45 %. Resultatene er oppsummert i Tabell 7.
Tabell 7. In vivo-stabilitet av CPT-11-innkapsling og sirkulasjonslevetid av CPT-11-fylte liposomer i mus på et enkelt tidspunkt (8 timer) etter injeksjon. % I.D., % av injisert dose.
Liposomomsluttet Medikament/lipid forhold, Liposomlipid,
salt % av pre-injeksjonsverdi % I.D. i blodet
TMA-sitrat 80,2 ± 7,8 18,8 ± 3,4
TMA-sulfat 70,1 ± 4,8 23,6 ± 1,8
TMA-pyrofosfat 67,3 ± 9,2 23,2 ± 3,1
TMA-trifosfat 70,6 ± 6,0 24,9 ± 8,2
TMA-polyfosfat 107,5 ± 8,9 24,3 ± 3,4
TEA-sulfat 76,6 ± 13,1 23,6 ± 0,1
Alle fremstillinger viste nivået for medikamentinnkapsling etter 8 timer i blodet in vivo på 70-80 % av pre-injeksjonsnivået, mens liposomene inneholdende polyfosfat var de mest stabile (medikamentinnkapsling forblir ca.100 %).
EKSEMPEL 9. Farmakokinetikk i blod av CPT-11 liposomer fremstilt ved anvendelse av rietylammoniumpolyfosfat.
Formulering av liposomalt CPT-11 ved anvendelse av trietylammoniumpolyfosfatsalt ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 3. Lipidene -DSPC, kolesterol og N-(metoksy-poly(etylenglykol) (molekylvekt 2000)-oksykarbonyl)-DSPE (PEG-DSPE) (alle fra Avanti Polar Lipids, Inc.) - ble kombinert som tørre pulvere i molart forhold på 3:2:0,015 og løst i 100 % etanol (USP-kvalitet, ca.0,15 ml/100 mg av lipidene) ved 62-65 ºC. For farmakokinetikkstudier ble <3>H-kolesterylheksadecyleter (<3>H-CHE, fremskaffet fra Amersham Pharmacia) satt til lipidene i mengde på 0,5 mCi/mmol av fosfolipider som en ikke-utbyttbar radioaktiv lipidmarkør. Den vandige løsningen av TEA-Pn (0,5 M trietylammonium, pH 5,7-6,2) ble fremstilt som i Eksempel 4. TEA-Pn løsning (10 ganger volumet av tilsatt etanol) ble blandet med lipidløsningen ved 60-65 ºC og rørt ved denne temperaturen inntil en homogen melkaktig suspensjon av multilamellære vesikler ble dannet. Denne suspensjonen ble ekstrudert 15 ganger gjennom to stablede sporetsede polykarbonatfiltre (Corning Nuclepore) med porestørrelse på 100 nm ved anvendelse av argontrykkekstruder (Lipex Biomembranes) ved 60-65 ºC, og resulterende unilamellære liposomer ble raskt avkjølt i is og fikk deretter oppnå omgivelsestemperatur. Etanol og uinkorporert polyfosfatsalt ble fjernet ved gelkromatografi på Sepharose CL-4B kolonne eluert med MES-dekstrose buffer (5 mM MES, 50 g/l dekstrose, pH justert til 6,5 med NaOH).
En lagerløsning av CPT-11 (irinotecanhydroklorid) inneholdende 20 mg/ml irinotecanbase i vann ble satt til liposomene ved et medikament/lipid forhold på 150-200 mg/mmol fosfolipider, og blandingen ble inkubert med tilfeldig agitasjon for 45-60 minutter ved 60-62 ºC. Inkubasjonsblandingen ble raskt avkjølt og inkubert i 10 minutter ved 0 ºC og fikk deretter oppnå omgivelsestemperatur.1/20 av volumet av 2,88 M NaCl ble tilsatt for å justere til fysiologisk ionestyrke og forbedre fjerning av membranbundet CPT-11 (til forskjell fra medikamentet innkapslet i liposomets indre). Uinnkapslet medikament ble fjernet ved gelkromatografi på Sephadex G-25 eller G-75 kolonne (Amersham Pharmacia) eluert med HBS-6,5 buffer (5 mM 2-(4-(2-hydroksyetyl)-piperazino)-etylsulfonsyre (HEPES), 144 mM NaCl, pH 6,5). Liposomfraksjoner eluert i dødvolumet ble kombinert, sterilisert ved 0,2 mikron filtrering og lagret ved 4-6 ºC før anvendelse. Liposomene ble karakterisert ved lipidkonsentrasjon, medikamentkonsentrasjon og partikkelstørrelse som i Eksempel 7. Liposomene hadde gjennomsnittsstørrelse på 108 nm og CPT-11 innhold på 139 ± 18 mg CPT-11 base per mmol av fosfolipider.
Levetiden til liposomlipidet og liposommedikamentet i blodet og karakteristikaene ved medikamentfrisetting fra liposomene in vivo ble studert i Sprague-Dawley hunnrotter (190-210 g) med innlagte sentralvenøse katetere. Rottene ble injisert med en 0,2-0,3 ml bolus av <3>H-CHE-merkede irinotecanliposomer (0,05 mmol fosfolipider eller 7-8 mg CPT-11 per kg kroppsvekt). Blodprøver (0,2-0,3 ml) ble tappet på ulike tidspunkter etter injeksjon ved anvendelse av heparinbehandlet sprøyte. Det tappede blodvolumet ble etterfylt ved anvendelse av fosfatbufret fysiologisk saltløsning. Blodprøvene ble fortynnet med 0,3 ml iskald PBS inneholdende 0,04 % EDTA, veid og blodcellene ble separert ved sentrifugering. Supernatantvæskene ble høstet og analysert for CPT-11 ved anvendelse av fluorometrisk prosedyre ifølge Eksempel 71 og for liposomlipidmarkøren ved scintillasjonstelling ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Liposomfremstillingene med kjent medikament og <3>H-CHE-lipidkonsentrasjon ble anvendt som standarder. Radioaktivitetsstandarder inneholder lik mengde av fortynnet rotteplasma for å gjøre regnskap for quenching. Mengden av CPT-11 og liposomlipidet i blodet ble beregnet ved å anta blodvolumet i ml som 6,5 % av kroppsvekten i gram og hematokrittet på 40 %. Totalmengden av lipidet og medikamentet i blodet ble uttrykt som % av injisert dose (% I.D., %ID) og plottet mot post-injeksjonstid. Prosent medikament gjenværende i liposomene ble beregnet ved å dividere medikament/lipid forhold i blodprøvene med medikament/lipid forhold av de injiserte liposomene (satt lik 100 %). Fordi grafene generelt viste godt samsvar med monoeksponentielle kinetikker (linearitet i semi-logaritmisk skala), ble blodhalveringstider av medikamentet, lipidet og av medikamentfrisettingen fra liposomene beregnet fra beste tilpasning av dataene til monoeksponentiell nedbrytningslikning ved anvendelse av TREND-opsjonen ifølge Microsoft EXCEL-dataprogrammet (Microsoft Corp., USA).
Resultatene er vist i Figur 1. Fra beste tilpasning-parametrene var blodhalveringstidene for lipid og medikament henholdsvis 16,4 timer og 6,61 timer. Under disse betingelsene fjernes fritt CPT-11 fra sirkulasjonen veldig raskt (se Eksempel 69).
Medikament/lipid forholdet i blod avslørte bifasisk karakter av CPT-11 frisettingen fra liposomene (Figur 2). I de første 24 timene var frisetting av medikament som fulgte lineær over tid (R=0,992) som gir holdepunkter for nullteorden frisettingskinetikker. Kun etter at ca.75 % av medikamentet var frisatt på 24 timers tidspunkt, ble videre frisetting ikke-lineær. I 24 timer frisatte liposomene medikamentet ved en konstant hastighet på ca.3,6 % av den opprinnelige mengden/time. Derfor ble 50 % av medikamentet frisatt over perioden på ca.14 timer. Nullte-orden frisetting av medikamentet er en attraktiv egenskap i formuleringer med sakte frisetting, siden hastigheten for medikamentfrisetting forblir konstant over tid.
EKSEMPEL 10. Antitumoreffektivitet av CPT-11 liposomer fremstilt ved anvendelse av trietylammoniumpolyfosfat mot brystkreftxenotransplantater i nakne mus
Antitumoreffektivitet av CPT-11 liposomer ble studert i modellen av humant brystkarsinom BT-474, et østrogenavhengig duktalt adenokarsinom som overuttrykker C-ErbB2 (HER2) reseptor. BT-474 celler ble fremskaffet fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). En cellelinje avledet fra BT-474 med høyere tumorveksthastighet ble etablert fra en raskt voksende xenotransplantattumornodul dyrket som beskrevet nedenfor. Cellene ble ekspandert in vitro i RPMI-1460 medium med 10 % føtalt kalveserum, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat og 100 U/ml penicillin G i T-150 flasker og splittet 1:3 hver uke. NCR nu/nu hunnmus (4-6 uker gamle; Taconic Farms) ble implantert subkutant (på halebasen) med 0,72 mg 17β-østradiolpelleter med 60 dagers sakte frisetting (Innovative Research of America, Inc.) og ble etter to dager inokulert subkutant i det øvre ryggområdet med 0,1 ml suspensjon inneholdende 2x10<7 >BT-474 celler i cellevekstmedium. Tumorprogresjonen ble monitorert ved palpasjon og krumpassermålinger av tumorene langs den største (lengde) og minste (bredde) aksen to ganger i uken. Tumorstørrelsene ble bestemt to ganger ukentlig fra krumpassermålingene ved anvendelse av formelen (Geran, R. I., et al., 1972 Cancer Chemother. Rep.3:1-88):
Tumorvolum = [(lengde) x (bredde)<2>] / 2
Ved dag 13 etter inokulasjon nådde tumoren en gjennomsnittlig størrelse på 200 mm<3 >og dyrene ble tilfeldig fordelt på tre grupper á 13-15 dyr.
Liposomalt CPT-11 ble fremstilt som i Eksempel 8 (medikament/fosfolipid forhold 192 mg/mmol; gjennomsnittlig liposomstørrelse 86,8 nm). Fritt og liposomalt CPT-11 ble fortynnet med MES-dekstrose konstituent til 5 mg/ml av CPT-11 base. Dyrene ble injisert via halevenen med fritt CPT-11, liposomalt CPT-11 eller bare konstituent på dag 14, 18, 21 og 25 etter tumorinokulasjon. De medikamentinneholdende formuleringene ble gitt ved dose på 50 mg CPT-11/kg per injeksjon, som er gjennomsnittet av dosene rapportert i litteraturen for CPT-11 studier i gnagertumormodeller.
For å vurdere behandlingsrelatert toksisitet, ble dyrene også veid to ganger ukentlig. Observasjonene ble gjort inntil dag 60 etter inokulasjon, på det tidspunktet østrogentilskuddpelleten var brukt opp. Gjennomsnittlige tumorvolumer på tvers av gruppene ble plottet sammen og sammenlignet over tid. Som vist i Figur 3, mens fritt CPT-11 reduserte hastigheten for tumorvekst, avtok tumorene dramatisk i gruppen som mottok liposomal behandling. Mens tumorene på dag 36 i kontrollgruppen nådde maksimalt tillatte størrelse med gjennomsnitt på 3.500 mm<3 >og tumorene på dag 46 i gruppen behandlet med fritt medikament var ca. 1.000 mm<3 >i gjennomsnitt, hadde ingen av dyrene i den liposombehandlede gruppen på samme tidspunkt en palpabel tumor.
Behandlingsrelatert toksisitet ble vurdert ved dynamikken av dyrenes kroppsvekt (Figur 4). Ingen gruppe viste noe signifikant toksisitet. Vekten av dyrene i kontrollgruppen var vedvarende økende. Det var en svak reduksjon i gjennomsnittlig kroppsvekt av dyrene som mottok liposomalt CPT-11, med ca.3,3 %, på dagen for den siste behandlingen. Dette vekttapet ble imidlertid reversert og dyrene nådde deres forventede vekt. Denne reduksjonen i gjennomsnittlig kroppsvekt var ikke statistisk signifikant ved Students t-test sammenlignet med vekt før behandling (p=0,274). Derfor ble alle behandlinger tolerert uten signifikant toksisitet.
Derfor viste liposomformuleringen av CPT-11, fremskaffet ved fylling av medikamentet via forhåndsomsluttet sterisk hindret substituert ammoniumsalt (trietylammonium) av en polyanionisk, biodegraderbar polymer (polyfosfat), forlenget levetid i blod, sakte frisettingskarakteristika og økt antitumoraktivitet i den studerte tumormodellen uten en merkbar økning i toksisitet.
EKSEMPEL 11. Komparativ vurdering av CPT-11-fylte liposomer fremstilt ved anvendelse av pre-omsluttede trietylammoniumsalter: effekt av liposomstørrelse, medikament/lipid forhold og type forhåndsomsluttet anion.
To prototypiske formuleringer av CPT-11-fylte liposomer ble fremstilt, én ved anvendelse av liposomene med forhåndsomsluttet TEA-Pn og den andre med forhåndsomsluttet TEA-SOS. Fremstilling av disse liposomene omfattet følgende produksjonstrinn.
1) Kombinere lipidene ved oppløsning sammen i etanol.
Lipidmatrikssammensetningen bestod av 1,2-distearoyl-SN-fosfatidylkolin (DSPC) (molekylvekt 790) 3 molare deler (59,8 molprosent); kolesterol (Kol) (molekylvekt 387) 2 molare deler (39,9 molprosent); og N-(omega-metoksy-poly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin (molekylvekt 2787) (PEG-DSPE) 0,015 molare deler (ca.0,3 molprosent). DSPC og PEG-DSPE ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama. Kolesterol (høyeste renhetskvalitet) ble kjøpt fra Calbiochem. Tørre lipider ble veid med nøyaktighet på ± 0,1 mg i en borsilikatglassbeholder og kombinert med absolutt etanol ved forholdet egnet for lipiddispersjonstrinnet nedenfor. På grunn av den høye transisjonstemperaturen til DSPC (55 ºC), ble oppløsningen typisk utført ved 55-60 ºC inntil klar løsning ble fremskaffet.
2) Fremstilling av TEA-Pn og TEA-SOS løsningene. Natriumpolyfosfat (n=13-18) var fra Sigma Chemical Co., p/n P 8510. Natriumsukroseoktasulfat ble kjøpt fra Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, p/n S699020. Saltene ble veid ned og løst i vann for å gi 1,2-2,5 N løsninger. Anionebyttere Dowex 50Wx8-200 eller Dowex HCR-W2 i H<+>-form (tilgjengelig fra Sigma) ble anvendt for å omdanne natriumsaltene til frie syrer. Før første anvendelse ble resinene vasket ved røring med 3 volumer av følgende løsninger, etterfulgt av dekantering: (1) 1,0-1,2 M vandig HCl to ganger; (2) vann to ganger; (3) 1,0-1,2 M vandig NaOH to ganger; (4) vann to ganger; (5) 1,0-1,2 M vandig HCl, to ganger. Suspensjonen av vasket resin i vann ble pakket under gravitasjonsgjennomstrømning i en egnet størrelseskromatografikolonne til å ha minst 8 ml av den pakkede resinen for hver ml av natriumsaltløsningene. Resinen ble videre ekvilibrert ved passering av to kolonnevolumer av 3,0-3,6 M vandig HCl, etterfulgt av fem kolonnevolumer av vann eller inntil konduktiviteten av eluatet falt under 1 mikro-S. Etter anvendelse ble kolonnene regenerert ved sekvensiell passering av:1.-1,2 M HCl - tre kolonnevolumer; 3,0-3,6 M HCl - to kolonnevolumer; vann - minst fem kolonnevolumer eller inntil konduktiviteten av eluatet falt under 1 μS og lagret under 0,2 μm filtrert vann ved romtemperatur. Pn- og SOS-natriumsaltløsningene ble satt til den drenerte overflaten av kolonnen (ca.1 ml for hver 4 ml av det pakkede resinvolumet) og fikk strømme under gravitasjon ved hastighet på ca.1-2 ml/min for resinpakkematerialets størrelse på 75-150 ml. Kolonnen ble eluert med vann. Eluatet ble testet for konduktivitet. Fraksjonene med 10 mS eller høyere konduktivitet ble høstet. Hvis mer konsentrerte løsninger av polysyrer er nødvendig, kan oppsamlingen begynne på 20-50 mS, men på bekostning av noe høyere tap av det gradientdannende saltet. I tilfellet av polyfosforsyre blir den oppsamlede løsningen holdt avkjølt (0-4 ºC) til amintitreringstrinnet pga. hydrolytisk ustabilitet av fosfodiesterbindingen ved lav pH. De oppsamlede eluatene vil ha en pH på mindre enn 0,7 (typisk ca.0,4) og konduktivitet på ca. 120-200 mS. Eventuelt blir amintitreringstrinnet utført uten forsinkelse pga. stabiliteten til polyfosfat ved lav pH. HPLC-kvalitet trietylamin (99,5 % renhet) fra Fisher, p/n 04884 ble anvendt til å titrere syreløsningene fremskaffet fra ionebytting. Normaliteten av rent TEA ble bestemt ved potensiometrisk titrering.
0,100 ml delmengder av TEA (0,100 ml) ble tatt over i 20 ml vann med tre paralleller. Delmengdene blir titrert med 0,1 N HCl standard løsning til pH-endepunktet (glasselektrode) på 5,5-6,0. Beregnet normalitet (7,07 N) var nær den teoretiske verdien på 7,17 N. Et målt volum av polyfosfor (Pn)-syre eller sukroseoktasvovel (SOS)-syreløsning ble titrert med rent TEA under kontroll av pH (glass) elektrode. Grundig røring var nødvendig for å dispergere aminet.
Titreringsendepunkt var pH 5,6-6,2. Volumet av tilsatt TEA ble nøyaktig målt. Volumet av titrert løsning ble målt, og konsentrasjonen av TEA ble beregnet på grunnlag av tilsatt TEA-volum og normalitet. Vann ble tilsatt etter behov for å justere TEA-konsentrasjonen til nødvendig 0,55 ± 0,05 N eller 0,65 ± 0,03 N, som angitt nedenfor. Mengden av gjenværende natrium i de fremskaffede TEA-Pn eller TEA-SOS løsningene ble bestemt ved potensiometri ved anvendelse av natriumselektiv glasselektrode (Corning). Én ml av løsningen ble fortynnet med 19 ml vann, og natriumkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av inkrementmetoden i henhold til elektrodeprodusentens manual. Mengden av gjenværende natrium var mindre enn 1 mM, typisk mindre enn 0,5 mM. De fremskaffede TEA-Pn eller TEA-SOS løsningene ble ført gjennom 0,2 μm sterilt celluloseacetatfilter ved anvendelse av positivt trykk. Endelig pH og osmolalitet til løsningene ble målt og notert. Vi anvender pH kalomel mikro-kombinasjon helglasselektrode for pH-målinger og damptrykk-/doggpunktosmometer for osmolalitetsmålinger. Løsningene ble lagret i kjøleskap inntil anvendelse.
3). Fremstilling av lipiddispersjon i den gradientdannende bufferen ved blanding av etanolløsning av lipidene med den gradientdannende bufferen.
Lipidene ble dispergert i den gradientdannende saltløsningen ved anvendelse av etanolblandingsmetode. Alle trinn ble utført ved 60-65 ºC. Lipidene ble løst i 100 % etanol USP i en konsentrasjon på ca.0,5-0,6 M DSPC i en kjemisk resistent, pæreformet glassflaske eller -rør. Den gradientdannende saltløsningen (TEA-Pn eller TEA-SOS) ble forvarmet til 60-65 ºC og satt til etanollipidløsningen på en gang, og komponentene ble grundig blandet ved røring og/eller vortexer. Endelig mengde av etanol var ca.10 volumprosent. For fremstillinger av skalaen som overgår 0,1 mmol fosfolipid, ble den resulterende suspensjonen plassert på en rotasjonsfordamper ved 60-65 ºC og vacuumert med rotasjon inntil utvikling av etanol stoppet, som manifestert ved slutt på skumdannelse. For skalaen på 0,1 mmol fosfolipid eller mindre, ble ikke etanol fjernet fra lipiddispersjonen på dette trinnet. De resulterende lipidsuspensjonene ble holdt ved 60-65 ºC og anvendt hurtig for ekstrusjonstrinnet.
4). Sekvensiell ekstrusjon av lipiddispersjonen gjennom definerte poremembraner. For lipidsuspensjonsvolumene opp til 1 ml anvendte vi en manuelt betjent resiprok ekstruder fremskaffet av Avanti Polar Lipids. Ekstruderen tilsettes 19 mm sporetsede filtermembraner og termostatert ved hjelp av en metalloppvarmende blokk. For volumene fra 1 til 10 ml anvendte vi en termostatert, gasstrykk-betjent ekstruder med enveis-flow fra Lipex Biomembranes. Ekstruderen tilsettes 25 mm filtermembraner. Lipidsuspensjonene ble gjentatte ganger ekstrudert ved 60-65 ºC ved anvendelse av manuelt trykk eller argongasstrykk, som passende, gjennom en serie av to stablede polykarbonatmembranfiltre (filtrene fra Corning-Nuclepore og Osmonics Corp. var like godt egnet) som har nominelle porestørrelser på 100 nm, 80 nm eller 50 nm. Der effekten av liposomstørrelse var av interesse, ble ekstrusjonen stoppet på 100 nm, 80 nm eller 50 nm trinn. Eksakt filtertype anvendt og antallet ekstrusjoner er angitt nedenfor for hvert forsøk. De ekstruderte liposomene ble holdt ved 60-65 ºC i ca.15 min og avkjølt raskt til 2-4 ºC i et isbad. Etter ca.15 min i isbadet, fikk liposomene nå romtemperatur.
5). Fjerning av ekstraliposomal gradientdannende buffer og overføring av liposomene til en medikamentfyllingsbuffer. Ikke-innkapslet gradientdannende salt ble fjernet, og liposomene ble overført til medikamentfyllingsbuffer ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Tangential flow-filtrering, hulfiberdialyse, av annet skalerbart trinn kan anvendes i oppskaleringsproduksjon. Det er fordelaktig å sikre fullstendig fjerning av det ekstraliposomale polyanionet ved behandling av liposomene med en anionebytterresin (f.eks. Dowex-1 eller Dowex-2 kvaternært ammonium kryssbundne polystyrenkuler).
Medikamentfyllingsbuffer inneholdt 50 g/l vannfri dekstrose USP og 5 mM vevskultursertifisert HEPES i vann, justert til pH 6,5 med NaOH. Bufferen ble vakuumfiltrert gjennom 0,2 mikron Nylon-filter (Whatman). De ekstruderte liposomene ble kromatografert på en kolonne med Sepharose CL-4B (Pharmacia) og eluert med medikamentfyllingsbufferen. Liposomene var til stede i dødvolumfraksjonen og ble oppsamlet, basert på eluatturbiditeten, i volumet på ca.
2x av det påført. De eluerte liposomene ble undersøkt for fosfolipidkonsentrasjon i henhold til Eksempel 70, partikkelstørrelse ved QELS og lagret ved 4-6 ºC.
6) Inkubasjon av liposomer med medikamentet. Lagerløsning av CPT-11 (irinotecanhydroklorid) ble fremstilt umiddelbart før blanding med liposomene ved oppløsning av irinotecanhydroklorid i vann for å oppnå konsentrasjon på 20 mg/ml medikamentbase. Løsningens pH var mellom 4,0 og 5,0. Medikamentløsningen ble filtrert gjennom sterilt 0,2 mikron polyetersulfon (PES) filter ved anvendelse av positivt trykk. Delmengder av liposomene i medikamentfyllingsbufferen dannet på trinn 5 ovenfor ble blandet ved romtemperatur med irinotecanlagerløsningen for å oppnå medikament/lipid startforholdet i området 0,15-0,55 g medikament for mmol liposomfosfolipid. Bestemte medikament/lipid startforhold er angitt nedenfor, der passende. pH i blandingene ble justert til 6,5 med 1 M NaOH, blandingene i glassrør ble inkubert på det termostaterte vannbadet ved 58-62 ºC med sakte agitasjon i 30-45 min, raskt avkjølt i isvannbad (0-2 ºC) og fikk stå ved denne temperaturen i 15 min. Deretter fikk liposomene varmes opp til romtemperatur for det neste trinnet (fjerning av uinnkapslet medikament og overføring til lagringsbufferen). Dette trinnet resulterte i innkapslingseffektivitet på mer enn 95 %, typisk 98-100 % i hele området av studerte medikament/lipid forhold.
7). Fjerning av uinnkapslet CPT-11, overføring av liposomene til lagringsbufferen, endelig filtrering og lagring. Uinnkapslet medikament ble fjernet og liposomene ble overført til lagringsbufferen ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi. Lagringsbufferen inneholdt 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5 (justert med NaOH) i vann, og ble 0,2-mikron vakuumfiltrert før anvendelse. Gelkromatografi på Sephadex G-75 (Amersham Pharmacia Biotech) ble utført i alt vesentlig som beskrevet i Trinn 2 ovenfor. CPT-11 liposomer eluert fra kolonnen (dødvolumfraksjon) ble undersøkt for liposomfosfolipid og CPT-11 (ved spektrofotometri, se Eksempel 70 og 71) og volumvektet gjennomsnittlig partikkelstørrelse ved QELS.
Medikamentkonsentrasjonen ble justert, om nødvendig, til å være i området 2,0-4,0 mg/ml. Liposomene ble filtrert gjennom 0,2 mikron sterile polyetersulfonfiltre og fordelt aseptisk i sterile polypropylenrør (Corning Cryo-Vials) eller PTFE-dekket skrukork borsilikat 4 ml glassrør til ca.70-80 % av rørvolumet. Rørene ble lukket aseptisk (i luft), merket og lagret ved 4-6 ºC.
EKSEMPEL 12. Effekt av medikament/lipid forhold på medikamentfyllingseffektiviteten og in vivo-medikamentretensjon av TEA-Pn-inneholdende liposomer
Liposomer med omsluttet vandig 0,65 N løsning av TEA-Pn, pH 6,1, osmolalitet 531 mmol/kg, ble fremstilt ved å følge prosedyren i Eksempel 11.
Lipiddispersjonen ble ekstrudert ti ganger gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 100 nm. Liposomlipidmatriks omfattet også [<3>H]-CHE ved 0,5 mCi/mmol fosfolipid. Liposomstørrelsen før medikamentfylling var 98,5 ± 34,3 nm. Liposomene ble fylt ved innledende medikament-til-fosfolipid forhold på 200, 300, 400 og 500 mg CPT-11/mmol fosfolipid. Medikament- og fosfolipidmengdene i liposomene ble bestemt ved henholdsvis spektrofotometri i henhold til Eksempel 71 og ved fosfolipid ekstraksjon-kutting-blå fosfomolybdat-analyse ifølge Eksempel 72.
For å evaluere in vivo-medikamentfrisettingshastighet, ble fremgangsmåten ifølge Eksempel 8 fulgt. Liposomene ble injisert via halevene i 6 uker gamle Swiss Webster-hunnmus (kroppsvekt 18-22 g) ved en dose på 5 mg CPT-11/kg. Ved 8 og 24 timer etter injeksjon, ble musene, i grupper på 3, anestesert og avlivet via åpen hjertepunktering. Blodet ble blandet med 0,4 ml iskald 0,04 % EDTA i PBS, blodcellene ble separert ved sentrifugering og plasmakonsentrasjonen av CPT-11 ble målt ved spektrofluorometri som beskrevet i Eksempel 71. Lipid ble bestemt ved å måle mengden av [<3>H]-CHE ved anvendelse av quenching-korrigert væskescintillasjonstelling, og mengden av medikament beholdt i liposomene ble beregnet ved å dividere det bestemte medikament/lipid forholdet med medikament/lipid forholdet i de injiserte liposomene. På grunn av rask blodclearance av fritt CPT-11, hvilket resulterer i lavt blodnivå, antok vi at alt undersøkt medikament var i liposomal form.
Resultatene er presentert i Tabell 8. Forskjellene i medikamentretensjon blant gruppene var ikke statistisk signifikante. Som et resultat av disse studiene, konkluderte vi at økning av medikamentmengden opp til 500 mg/mmol ikke vil affisere medikamentfylling eller in vivo-stabilitet ugunstig. Dette forholdet ble tilpasset videre studier.
Tabell 8. Effekt av medikament/lipid forhold på medikamentfylling og in vivomedikamentretensjon i irinotecan TEA-Pn liposomer (gjennomsnitt ± standardavvik).
Medikament/lipid forhold, Medikament som forblir i liposomene, mg/mmol fosfolipid % av pre-injeksjonsverdi
Start Slutt % fylt Etter 8 timer Etter 24 timer
200 208,4 104,2 54,6 ± 9,9 9,72 ± 2,23
300 286,3 95,4 85,2 ± 14,3 14,52 ± 2,51
400 348,8 87,2 81,5 ± 18,3 17,31 ± 6,14
500 518,9 103,8 66,8 ± 19,6 13,47 ± 1,44
EKSEMPEL 13. Medikamentfyllingseffektivitet av CPT-11-fylling inn i TEA-SOS-inneholdende liposomer: effekt av liposomstørrelse og in vivomedikamentretensjon i mus.
Liposomer med omsluttede løsninger inneholdende fremstilt som i Eksempel 11 ved anvendelse av gradientdannende løsning som har 0,643 N TEA-SOS, pH 5,7, osmolalitet 530 mmol/kg. Lipiddispersjon ble ekstrudert ti ganger gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 50 nm, 80 nm eller 100 nm.
Liposomlipidmatriks omfattet også [<3>H]-CHE ved 1,5 mCi/mmol liposomfosfolipid. Liposomstørrelsen ble bestemt ved dynamisk lysspredning. Liposomene ble fylt med CPT-11 ved innledende medikament-til-fosfolipid forhold på ca.550 mg irinotecan/mmol fosfolipid. De medikamentfylte liposomene ble størrelsesbestemt ved QELS og analysert som beskrevet i Eksempel 70 og 71.
Swiss Webster-hunnmus (8-10 uker gamle, gjennomsnittlig 27-30 gram) ble injisert via halevene med disse CPT-11 liposomformuleringene ved en medikamentdose på 10 mg/kg. Musene ble avlivet etter 24 timer og blodet ble tappet og undersøkt for CPT-11 og liposomlipider som i Eksempel 11. Resultatene er oppsummert i Tabell 9.
Tabell 9. Irinotecanfylling og in vivo-medikamentretensjon i TEA-SOS liposomer.
Ekstrusjons- Liposomstr., Medikamentfylling, Medikament gjenværende i membran- nm mg irinotecan/ liposomene etter 24 t i mus, porestr., nm gj.snitt SD mmol fosfolipid % av pre-injeksjonsverdi 50 87,6 ± 28,1 579,3 ± 24,2 79,2 ± 3,8
80 98,5 ± 15,1 571,1 ± 69,7 82,6 ± 2,1
100 110,8 ± 25,2 567,7 ± 37,7 86,2 ± 2,7
Overraskende fremskaffet liposomene med trietylammoniumsalt av sukroseoktasulfat, en ikke-polymer polyanionisert organisk hydroksylert organisk forbindelse (sukker), dramatisk bedre (4-5 ganger) in vivo-medikamentretensjon i liposomer sammenlignet med lignende liposomer med en polyanionisk polymer (polyfosfat).
EKSEMPEL 14. Farmakokinetikk i blod av CPT-11-fylte SOS-TEA liposomer i rotter.
Liposomer (100 nm ekstrusjonsmembranporestørrelse) ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 12. Liposomene ble administrert intravenøst ved en dose på 10 mg CPT-11/kg til to ni uker gamle Sprague Dawley-hunnrotter (Harlan) (kroppsvekt ca. 200 g) med innlagt sentralvenøst kateter ved en dose på 10 mg CPT-11/kg (17,6 μmol fosfolipider/kg). Blodprøver ble tatt på bestemte tidspunkter og analysert for medikament- og liposomlipidinnhold som i Eksempel 9. Dataene ble uttrykt som % injisert lipiddose/ml plasma og % medikament beholdt inni liposomet ved hvert tidspunkt, plottet mot post-injeksjonstid, og halveringstider for liposomlipid, så vel som halveringstider for medikamentfrisetting fra liposomene, ble beregnet ved beste tilpasning til en monoeksponentiell kinetikkmodell (Fig.5). Halveringstiden til medikamentfrisetting fra CPT-11-fylte TEA-SOS liposomer var 56,8 timer, mye lenger enn den til lignende TEA-Pn liposomer.
EKSEMPEL 15. Antitumoraktivitet til fritt CPT-11 og CPT-11 innkapslet i TEA-Pn- og TEA-SOS-inneholdende liposomer i nakne mus uten thymus som bærer subkutane xenotransplantater av humant kolonkarsinom (HT-29).
Liposomene ble fremstilt som i Eksempel 11 ved anvendelse av TEA-Pn løsning med 0,65 M TEA, pH 6,1 og osmolalitet 531 mmol/kg eller TEA-SOS løsning med 0,643 M TEA, pH 5,7 og osmolalitet 530 mmol/kg. Ekstrusjonen omfattet ti passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 100 nm. Resulterende TEA-Pn og TEA-SOS liposomer hadde størrelse på henholdsvis 112,3 ± 15,5 nm og 120,5 ± 42,5 nm (gjennomsnitt ± SD av størrelsesfordelingen). Liposomene ble fylt med CPT-11 ved medikament/fosfolipider startforholdet på 500 mg/mmol. De resulterende liposomene hadde medikamentinnhold på 465,6 ± 26,5 (93 % fyllingseffektivitet) og 499,9 ± 22,5 mg (100 % fyllingseffektivitet) av CPT-11/mmol fosfolipid for henholdsvis TEA-Pn og TEA-SOS formuleringene.
HT-29 celler ble fremskaffet fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, og ekspandert i DMEM-medium tilsatt 10 % føtalt kalveserum, 50 U/ml penicillin G og 50 μg/ml streptomycinsulfat ved 37 ºC, 5 % CO2 som anbefalt av leverandøren. NCR nu/nu homozygote nakne hannmus uten thymus (6 uker gamle, vekt minst 16 g) ble fremskaffet fra Charles River. Musene ble inokulert subkutant i den høyre flanken med 0,1 ml av suspensjonen inneholdende 5 x 10<6 >celler suspendert i vekstmediet uten antibiotika. Elleve dager senere ble dyrene som hadde tumorer med størrelse mellom 150 mm<3 >og 350 mm<3 >plassert i behandlingsgruppene i henhold til følgende fremgangsmåte. Dyrene ble rangert i henhold til tumorstørrelse og delt inn i seks kategorier med avtakende tumorstørrelse. Seks behandlingsgrupper med 11 dyr/gruppe ble dannet ved tilfeldig valg av ett dyr fra hver størrelseskategori, slik at alle tumorstørrelser var likt representert i hver behandlingsgruppe. Med start på dag 13 mottok dyrene fire haleveneinjeksjoner, med intervaller på 4 dager, av følgende fremstillinger: 1) Kontroll (HEPES-bufret saltløsning pH 6,5); 2) fritt CPT-1150 mg/kg, administrert som nyfremstilt 5 mg/ml løsning i ubufret fysiologisk saltløsning; 3) TEA-Pn liposomalt CPT-11 ved 25 mg/kg per injeksjon; 4) TEA-Pn liposomalt CPT-11 ved 50 mg/kg per injeksjon; 5) TEA-SOS liposomalt CPT-11 ved 25 mg/kg per injeksjon; 6) TEA-SOS liposomalt CPT-11 ved 50 mg/kg per injeksjon. Vekten av dyrene og tumorstørrelsen ble monitorert to ganger ukentlig som beskrevet i Eksempel 10. Tumorvekten ble subtrahert fra resultater for veing av dyrene for å oppnå kroppsvekt. Dyrene ble observert i 60 dager etter tumorinokulasjon. Når tumorene i gruppen nådde 20 % av musekroppsvekten, ble dyrene i gruppen gitt en lett og rolig død. Det var fullstendig tumorregresjon i noen grupper uten tegn på tumorgjenvekst på slutten av studien. Vevene fra tumorinokulasjonsområdet fra disse dyrene ble høstet og preservert for patologisk analyse for gjenværende tumorceller.
Resultatene fra denne studien er vist i Figur 6 og 7. Fritt CPT-11 hadde bare mindre effekt på tumorveksten. Alle liposomer hadde uttalt effekt resulterende i tumorregresjon senere fulgt av gjenvekst hos de fleste dyr. 50 mg/kg dose var mer effektiv enn 25 mg/kg dose i både TEA-Pn og TEA-SOS CPT-11 liposomer. Gjennomsnittlig tumordoblingstid beregnet fra tumorstørrelsesdataene (Fig.7) var: kontroll - 4,2 dager; fritt medikament, 50 mg/kg - 4,8 dager; TEA-Pn liposomalt medikament, 25 mg/mg - 43,6 dager; TEA-Pn liposomalt medikament, 50 mg/kg - 47,5 dager; TEA-SOS liposomalt medikament ved 25 mg/kg - 48,2 dager og TEA-SOS liposomalt medikament ved 50 mg/kg - over 56 dager (doblingstid ble ikke nådd). Derfor var liposomalt CPT-11 fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse minst ca.10-fold mer aktiv enn det frie medikamentet, gitt ved samme dose og plan. Uventet var TEA-SOS CPT-11 liposomer utpreget mer effektive til å redusere tumorvekst enn TEA-Pn CPT-11 liposomer administrert ved samme dose. Mens det i gruppene behandlet med fritt medikament og TES-Pn liposomalt medikament ved 50 mg/kg per injeksjon var ingen dyr uten tumorgjenvekst, var ett dyr (9,1 %) i gruppene som mottok 25 mg/kg av hver liposomale formulering tumorfri på slutten av studien, og i gruppen som mottok 50 mg/kg av TEA-SOS liposomal CPT-11 formulering var 4 dyr (36,4 %) på slutten av studien tumorfrie uten tegn på gjenvekst.
Medikamentet manifesterte noe toksisitet. Dyrene som mottok fritt CPT-11, men ikke liposomalt CPT-11, erfarte kortvarig sykelighet (tap av årvåkenhet, pukkelrygget holdning, pjusket pels, nedsatt bevegelighet) i ca. én time etter medikamentinjeksjon. Dyrene som mottok fritt CPT-11 led av permanent tap av ca.
6 % vekt i løpet av behandling og restituerte ikke. Dyrene som mottok begge liposomale CPT-11 formuleringer erfarte transient vekttap mellom andre og tredje injeksjon med gjennomsnitt på ca.5 % (ved 25 mg/kg) eller ca.9 % (ved 50 mg/kg) av forbehandlingsverdien og oppnådde til slutt normal vekt. Derfor var ikke toksisiteten til liposomalt medikament mer enn den til det frie (ikke-liposomale) medikamentet, mens effektiviteten til det liposomale medikamentet var vesentlig høyere. Vekttapet ble reversert når medikamentbehandlingen var ferdig, og alle dyrene fikk tilbake sin vekt uten terminal sykelighet eller toksiske dødsfall. Senere hadde dyrene vektøkning konkomitant med tumorregresjoner. I saltløsningskontrollgruppen erfarte dyr som utviklet store tumorer vekttap åpenbart pga. tumorrelatert sykelighet. Totalt sett viste liposommedikamentformuleringen der medikamentet var fylt inn i liposomene med forhåndsomsluttet polyanionisert sukker (sukroseoktasulfat) seg å være den mest effektive, mens den hadde mindre toksisitet enn det ikke-liposomale medikamentet.
EKSEMPEL 16. Toksisitet av fritt og liposomalt CPT-11 i mus.
Akutt toksisitet av fritt CPT-11 og liposominnkapslet CPT-11 fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet ved å bestemme maksimalt tolerert dose (MTD) etter enkel i.v. injeksjon i vanlige (immunkompetente) mus.
Følgende materialer ble anvendt:
1) CPT-11 (irinotecanhydroklorid) fremstilling som har irinotecanhydroklorid 98,9 % ved HPLC og fuktighet 7,6 %. I denne studien ble medikamentformuleringene fremstilt på ”som den er” basis, uten korrigering for fuktighets- eller irinotecanbaseinnholdet.
2) Liposomalt CPT-11 (Ls-CPT-11) ble fremstilt som i Eksempel 11, ved anvendelse av lipidmatriks av DSPC 200 molare deler, kolesterol 133 molare deler, PEG-DSPE 1 molar del; omsluttet løsning TEA-SOS som har 0,65 M TEA, pH 6,4; medikament fylt inn i liposomer i 5 mM HEPES-buffer, 5 % dekstrose, pH 6,5, ved 60 ºC i 30 min ved medikament/lipid startforholdet 500 mg medikament/mmol fosfolipid. Fyllingseffektivitet var >99 %. Liposomstørrelse (volumgjennomsnitt ± standardavvik ved QELS): 101 ± 37 nm. Liposomer ble formulert i konstituenten, 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl; pH 6,5.
Medikamentkonsentrasjoner i de injiserte formuleringene var som nevnt i tabellene nedenfor.
3) Fri CPT-11 løsning. Lagerløsning av fritt medikament ble fremstilt ved å løse irinotecanhydroklorid i 5 % vandig dekstrose ved 22 mg/ml og sterilisert ved 0,2 μm filtrering. Denne lagerløsningen ble fortynnet med steril 5 % dekstrose før injeksjon.
4) Dyr. Swiss Webster-hunnmus, 6-8 uker gamle, var fra Harlan, USA.
MTD-bestemmelse fulgte generelt protokollen tilpasset ved United States National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program. Protokollen omfattet følgende tre trinn:
Trinn 1): Områdesøkende trinn med doseeskaleringsfaktor på 1,8.
Gruppene på to dyr ble injisert i halevenen med økende doser av fritt eller liposomalt irinotecan, som startet med dosen ved 60 mg/kg og fortsatte med doseeskaleringsfaktor på 1,8, inntil akutt dødelighet eller terminal sykelighet (i løpet av >1 dag etter injeksjon) blir observert i hvilket som helst av dyrene. Dosen ett trinn under dødelighets-/terminal sykelighetsdosen blir registrert.
Trinn 2): Områdesøkende trinn med doseeskaleringsfaktor på 1,15.
Gruppene på to dyr ble injisert i halevenen med økende doser av fritt eller liposomalt irinotecan, som startet med dosen registrert på Trinn 1 og fortsatte med doseeskaleringsfaktor på 1,15, inntil akutt dødelighet eller terminal sykelighet (i løpet av >1 dag etter injeksjon) blir observert i hvilket som helst av dyrene. Dosen ett trinn under dødelighets-/terminal sykelighetsdosen blir registrert som tentativ MTD.
Trinn 3): Valideringstrinn. Gruppen på 5 dyr blir injisert i.v. (halevene) med fritt eller liposomalt irinotecan som tentativ MTD bestemt i Trinn 2. Dyrene blir fulgt i 7 dager, dyrenes kroppsvekt blir registrert to ganger ukentlig og sammenlignet med vekten før injeksjon. Generell helse hos dyrene blir observert (årvåkenhet, stelling, spising, ekskreter, hud, pels og slimhinnetilstander, ambulering, pusting, holdning). Hvis det i løpet av observasjonsperioden ikke er dødelighet, progressiv sykelighet eller vekttap som overgår 15 % av kroppsvekten før injeksjon, blir dosen betraktet å være validert som akutt enkel injeksjon MTD. Hvis noen av disse effektene forekommer, blir forsøket gjentatt ved neste lavere dose med en faktor 1,15.
For å oppnå videre statistikk for valideringstrinn, ble kroppsvektdynamikken til overlevende dyr fulgt i opp til 11 dager etter injeksjon. Dosen på mer enn 324 mg/kg av liposomalt irinotecan var umulig å administrere pga. konsentrasjons- og injeksjonsvolumsbegrensningene. Resultatene er presentert i Tabell 10.
Tabell 10. MTD-søkende studie av CPT-11 formuleringer i mus.
RESULTATER
Trinn 1. Øk dose med en faktor på 1,8
Kroppsvekt, ved dag etter injeksjon Medi Inj. dose Medika- Inj. Mus# 0 1 2 4 5 6 7 11 kament (mg/kg) mentkons. volum (g) (9) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
(mg/ml) (Ml)
Ls-CPT 11 60 8 150 1 19,2 18,0 nd 20,3 20,6 20.6 20,0 19,7
2 19,7 19,3 nd 20,6 20,4 19.6 19,7 20,7 100 12 165 1 19,5 18,6 nd 19,6 20,0 20.1 19,4 19,9
2 20,1 18,9 nd 20,2 21 ,5 22.2 21 ,8 22,5 180 22 165 1 19,4 18,4 nd 18,9 19,7 20,5 19,5 20,5
2 20,0 19,3 nd 19,6 20,6 21.4 21 ,6 21 ,7 324 30,6 210 1 21 ,8 21 ,2 21.2 nd 20,2 nd 20,2 nd 2 21 ,6 20,4 21.3 nd 20,8 nd 21 ,4 nd Fritt CPT11 60 8 150 1 20,6 20,4 nd 22,1 22,1 22,2 22,0 22,5
2 19,5 19,1 nd 20,2 20,3 20.4 20,5 21 ,1 100 12 165 1 19,3 døde 1- 2 min etter injeksjon
2 20,1 døde 1- 2 min etter injeksjon
3 19,9 døde 1- 2 min etter injeksjon
Etter injeksjon ble alle mus behandlet med fritt CPT1 1 syke, kortpustede i ca. 1 time og restituerte deretter.
Etter injeksjon var alle mus behandlet med Ls-CPT1 1 normale
Trinn 2. Øk dose med en faktor på 1,15
Kroppsvekt, ved dag etter injeksjon Medika- Inj. dose Medikament- Inj. Mus# 0 1 2 5 7 ment (mg/kg) kons. volum (g) (g) (g) (g) (g)
(mg/ml) (pl)
Fritt CPT1 1 60 8 150 3 19,9 20,0 20,9 19,9 21 ,3
4 19,5 18,7 19.4 18,8 18,9 70 8 175 5 20,9 20,0 20,6 19,3 20,4
6 22,3 21 ,8 22.4 22,4 22,8 80 8 200 7 20,6 19,9 20.1 19,9 20,9
8 20,6 20,8 21.1 20,7 21 ,4 90 12 150 9 22,3 døde 1 -2 min etter injeksjon 10 22,4 døde 1 -2 min etter injeksjon 8 225 11 20,6 døde 1 -2 min etter injeksjon Trinn 3. Validering
Kroppsvekt, ved dag etter injeksjon Medika- Inj. dose Medikament- Inj. Mus# 0 3 5 7 ment (mg/kg) kons. (mg/ml) volum (g) (g) (g) (g)
(μl)
Fritt CPT11 80 8 200 1 20,2 19,3 20,0 21,7
2 20,5 20,6 20,5 21,2 3 20,7 20,6 20,8 21,9 4 20,8 21,4 22,1 23,0 5 21,9 21,9 21,6 21,5 Ls-CPT11 324 365 180 6 21,0 20,0 20,1 20,2
7 20,4 20,4 20,2 19,2 8 20,4 19,8 20,3 20,7 9 20,9 19,9 20,5 21,5 10 20,7 19,5 19,8 20,2
Således, mens MTD av fritt CPT-11 var 80 mg/kg, ble MTD av liposomalt CPT-11 overraskende ikke nådd selv ved høyeste administrerte dose på 324 mg/kg. Derfor har liposominnkapsling av CPT-11 ifølge foreliggende oppfinnelse redusert medikamenttoksisitet minst 4-fold.
EKSEMPEL 17. Lagringsstabilitet av CPT-11-fylte TEA-SOS liposomer mot medikamentlekkasje.
Fem batcher av liposomalt CPT-11 ble fremstilt ved anvendelse av TEA-SOS metoden (Eksempel 11), ved medikament/lipid startforholdet på 500-550 mg/mmol fosfolipid. Liposomene ble fremstilt ved anvendelse av membranekstrusjon gjennom polykarbonatmembran med 80 nm eller 100 nm porestørrelse, som angitt i tabellen nedenfor. Liposomene ble 0,2 μm sterilfiltrert og lagret ved 3,4-14,5 mg/ml av CPT-11 i 135 mM NaCl, 20 mM HEPES-Na, pH 6,5 (lagringsbuffer), ved 4-8 ºC. Etter angitt lagringstid ble medikamentet som hadde lekket ut fjernet ved gelkromatografi på Sephadex G-75 ved anvendelse av lagringsbufferen som elueringsmiddel. Medikament- og fosfolipidkonsentrasjonene i liposomene før og etter gelkromatografi ble undersøkt ved anvendelse av henholdsvis spektrofotometrimetode og syrekutting-blå fosfomolybdat metode, som beskrevet i Eksempel 70 og 71. CPT-11 liposomer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse var veldig stabile. Lekkasje av CPT-11 fra disse liposomene under lagring var mindre enn 5 % over 6 måneder (Tabell 10).
Tabell 11. Innkapslingsstabilitet av CPT-11 liposomer i løpet av lagring (data er gjennomsnitt ± SE).
Liposom Ekstrusjons- CPT-11 kons., Lagringstid, % medikament som lot # porestørrelse, nm mg/ml måneder forblir innkapslet 1 80 3,44 ± 0,06 6 99,02 ± 3,77 2 80 7,88 ± 0,19 6 102,38 ± 4,78 3 100 4,57 ± 0,06 6 96,38 ± 4,69 4 100 4,62 ± 0,11 6 95,72 ± 4,36 5 80 14,52 ± 0,42 3 103,4 ± 5,92
EKSEMPEL 18. Liposomer fylt med topotecan.
Liposomer med omsluttet TEA-Pn løsning og TEA-SOS løsning ble fremstilt som i Eksempel 11. Lagerløsning av topotecanhydroklorid (GlaxoSmithKline, PA, USA) ble fremstilt umiddelbart før blanding med liposomene ved å løse topotecanhydroklorid i vann ved 15-20 mg/ml, ved å gjøre regning med det
faktiske innholdet av topotecan HCl. pH ble justert til 3,0 med 1 N HCl.
Medikamentløsningen ble filtrert gjennom sterilt 0,2 mikron polyetersulfon (PES) filter ved anvendelse av positivt trykk. Delmengder av TEA-Pn- eller TEA-SOS-inneholdende liposomer i medikamentfyllingsbufferen ble blandet ved romtemperatur med topotecan HCI-lagerløsningen for å oppnå medikament/lipid startforholdet i området på 0,15-0,45 g/mmol liposomfosfolipid. Foretrukket forhold var 0,35 g topotecan HCl for mmol liposomfosfolipid. Blandingene i glassbeholdere ble inkubert på det termostaterte vannbadet ved 55-62 ºC med sakte agitasjon i 30-60 min, raskt avkjølt i isvannbad (0-2 ºC) og fikk stå ved denne temperaturen i 5-15 min. Dette trinnet resulterte i innkapslingseffektivitet på 89-90 % (TEA-Pn gradient) eller 97-100 % (TEA-SOS gradient). Uinnkapslet topotecan ble fjernet, og liposomene ble overført til lagringsbufferen ved anvendelse av størrelseseksklusjonskolonnekromatografi. Før påføring til kolonnen, ble ionestyrken til liposomfremstillingen økt ved å blande med 1/20 vol. av 2,88 M vandig natriumklorid, og blandingen ble inkubert i ca.15 min. Vi fant uventet at justering av ionestyrken til liposommediet fra lav verdi i løpet av fylling (typisk ekvivalent til mindre enn 20 mM NaCl) til høyere verdi over 20 mM NaCl, og fortrinnsvis til 50 mM NaCl og over, forbedret fjerningen av uinnkapslet medikament og økte stabiliteten til topotecanfylte liposomer mot aggregering, muligens ved å lette fjerning av membranbundet topotecan, til forskjell fra medikamentet innkapslet i liposomets indre. Resten av prosedyren fulgte Eksempel 11, trinn 7. For resultater, se Tabell 12 nedenfor.
EKSEMPEL 19. Fremstilling av anti-HER2-immunliposomale formuleringer av topotecan.
Topotecanimmunliposomer som spesifikt kan internaliseres ved kreftceller overuttrykkende HER2 (C-ErbB-2) overflatereseptor-tyrosinkinaseonkoprotein ble fremstilt ved konjugering av topotecanliposomer til anti-HER2 enkeltkjede humant Fv-antistoffragment, F5, valgt fra fagdisplaybiblioteket for dets høye internalisering i HER2-overuttrykkende celler (Poul, et al., 2000, J. Molecular Biology, v.301, s.
1149-1161). F5 er et 27 KDa protein som binder til ekstracellulært domene av HER2-reseptor med affinitet på ca. 150 nM, hvilket forårsaker rask internalisering (Neve, et al., 2001, Biophys. Biochim. Res. Commun. v.280, s.274-279). For liposomkonjugering ble metoden ifølge U.S. pat. nr.6.210.707 og ifølge Nielsen, et al. (2002), Biochim. Biophys. Acta, v.1591, s.109-118, generelt fulgt. Et hydrofilt lipopolymerkonjugat av F5 ble først fremstilt. C-terminal av F5-aminosyrekjede hadde en tilsatt terminal cysteingruppe (F5Cys). F5Cys-konstruksjonen ble uttrykt i E. coli og isolert fra det bakterielle lysatet ved Protein A-kolonnekromatografi.
Protein A-eluerte fraksjoner ble adsorbert på anionebytterresin for å fjerne pyrogener og verts-DNA og behandlet med et tiolreduksjonsmiddel for å frigi tiolgruppen til det terminale cysteinet. Redusert F5Cys ble videre renset ved ionebytterkromatografi ved anvendelse av SP Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia). Det rensede proteinet ble konjugert til en tiolreaktiv lipidpoly(etylenglykol) linker, N-(3-(N-maleimido)propyonylamido)-poly(oksyetylen)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin (Mal-PEG-DSPE), et derivat av PEG med molekylvekt 2.000 (Figur 4,1), produsert kommersielt ved Avanti Polar Lipids, Inc., Alabama, USA. Proteinet og linkeren ble inkubert i vandig bufferløsning ved molart forhold på 1:4, og uomsatt linker ble quenchet med 1 mM cystein. I løpet av reaksjonen blir terminalt cystein av F5Cys bundet kovalent til maleimidogruppe til linkeren. Det resulterende F5-PEG-DSPE konjugatet var vannløselig i form av miceller som har høy åpenbar molekylvekt (500-850 KDa) og ble separert fra uomsatt protein (ca.25 %) ved størrelseseksklusjonskromatografi. Proteinmengden i det rensede konjugatet ble bestemt ved UV-spektrofotometri ved 280 nm, og mengde linker ble undersøkt ved anvendelse av en spektrofotometrisk metode identisk med den anvendt for fosfolipidkvantifisering (se Eksempel 70). Det rensede F5-PEG-DSPE konjugatet var stabilt i vann, fullstendig immunreaktivt og var stabilt mot denaturering og tap av reaktivitet i minst 1 time ved 65 ºC og minst 3 måneder ved 37 ºC.
For å fremstille anti-HER2 immunliposomalt topotecan, ble topotecanfylte liposomer ifølge Eksempel 18 blandet med F5-PEG-DSPE i den vandige saltløsningsbufferen ved forholdet på 15 mikrogram protein per 1 mikromol fosfolipid (ca.45 F5-kopier per liposom). Blandingen ble inkubert i 40 min ved 60 ºC, avkjølt på is og kromatografert på en kolonne med Sepharose CL-4B (kryssbundet 4 % agarosekuler, Amersham Pharmacia) for å fjerne gjenværende micellært konjugat, ukonjugert protein og ethvert spor av ekstraliposomalt medikament som kan ha blitt frisatt i løpet av inkubasjonen. Liposomene med membraninkorporert F5-PEG-DSPE ble eluert med 5 mM HEPES-144 mM NaClbuffer pH 7,4, oppsamlet i dødvolumet til kolonnen, sterilfiltrert og fordelt for lagring (4-6 ºC). Mengden av liposominkorporert F5 var typisk >80 % av det tilsatte konjugatet. Den ble bestemt ved SDS-PAGE av liposomene med kvantifisering av det Coomassie-fargede F5-båndet ved densitometri. Medikament- og lipidkonsentrasjoner i immunliposomfremstillingene ble bestemt på liknende måte som for ikke-målrettede liposomer. Egenskapene til topotecanliposomer og F5-immunliposomer (Eksempel 18-19) er oppsummert i Tabell 12.
Tabell 12. Egenskaper til topotecanliposomer og immunliposomer.
Liposom- F5 scFv- Medikament/lipid % inn- Liposomstr., omsluttet binding: forhold, g/mol fosfolipid kapsling gj.snitt ± SD, nm salt
Start Slutt
TEA-Pn Nei 173,6 155,2 ± 5,9 89,4 ± 3,4 % 96,4 ± 38,7 TEA-Pn Ja 173,6 156,2 ± 5,2 90,0 ± 3,0 % 96,2 ± 33,8 TEA-SOS Nei 347,2 340,8 ± 14,7 98,2 ± 4,2 % 99,1 ± 32,6
EKSEMPEL 20. Effekt av fyllingsbuffer-pH og medikament/lipid forhold på topotecanfylling inn i liposomer.
Liposomer (DSPC/Kol/PEG-DSPE, 3:2:0,015 molart forhold) med omsluttet 0,5 N TEA-Pn, pH 6,2, osmolalitet 413 mmol/kg, ble fremstilt ved anvendelse av etanolinjeksjonsmetoden (Eksempel 18), ekstrudert gjennom to stablede polykarbonatfiltre med 100 nm porestørrelse 5 ganger og med 50 nm porestørrelse 10 ganger. Fyllingsbufferen var 5 mM MES, 50 g/l dekstrose, justert til ulike pH-verdier i området 5,0-6,5. Liposomstørrelsen var 73,1 ± 21,3 nm ved QELS. Liposomene ble fylt ved å blande en topotecanlagerløsning (20 mg/ml) med liposomene i fyllingsbufferen ved medikament-til-fosfolipid startforhold på 100 mg/mmol, inkubere blandingen ved 60 ºC i 45 min, quenching på is i 15 min og fjerning av det uinnkapslede medikamentet ved anvendelse av en Sephadex G-75 kolonne eluert med 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5. Topotecan og fosfolipid ble kvantifisert ved spektrofotometri (Eksempel 70 og 71). Resultatene (Tabell 13) indikerte at topotecanfylling var nesten kvantitativ i området for pH 5,5-6,5.
Tabell 13. Effekt av fyllingsbuffer-pH på % av topotecaninnkapsling inn i liposomene med omsluttet TEA-Pn.
Fyllingsbuffer pH % innkapsling
5,0 50,1 ± 2,1
5,5 97,2 ± 8,1
6,0 115,5 ± 15,0
6,5 102,1 ± 8,1
Effekten av medikament til lipid forhold (0,15-0,45 mg/mmol fosfolipid) på fyllingseffektiviteten ble også studert. Liposomene med omsluttet TEA-Pn (0,5 M TEA, pH 5,8, osmolalitet 480 mmol/kg) ble fremstilt som ovenfor, bortsett fra at det siste ekstrusjonstrinnet var ti ganger gjennom to stablede 0,08 μm polykarbonatfiltre. Fylling var ved pH 6,5. Liposomstørrelsen var 93,1 ± 15,1 nm ved QELS. Resultatene (Tabell 14) viste at medikamentfyllingseffektivitet var over 85 % over hele området av medikament/lipid forhold studert.
Tabell 14. Effekt av medikament/lipid forhold på innkapslingseffektivitet av topotecan inn i liposomene inneholdende TEA-Pn.
Topotecan/fosfolipid forhold, mg/mmol % innkapsling (gjennomsnitt ± SE) Startforhold Sluttforhold (etter fylling)
168,2 166,9 ± 11,1 99,2 ± 6,6
224,4 232,5 ± 47,6 103,7 ± 21,2
280,3 253,5 ± 19,8 90,4 7,0
336,4 298,3 ± 18,0 88,7 ± 5,3
392,5 361,2 ± 36,8 92,0 ± 9,4
448,5 394,9 ± 29,5 88,0 ± 6,6
EKSEMPEL 21. Topotecanliposomstabilitet in vitro i nærvær av plasma.
Liposomer (DSPC/Kol/PEG-DSPE, molart forhold 3:2:0,015) med omsluttet 0,5 N TEA-Pn, pH 6,2, osmolalitet 413 mmol/kg, ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 18. Liposomer med størrelse på 96,4 ± 29,3 nm ble dannet ved ekstrusjon ti ganger gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 100 nm. For kvantifisering av liposomlipidet i plasma, ble [<3>H]-CHE inkludert i lipidløsningen ved 0,5 μCi/μmol DSPC. Topotecan ble fylt ved pH 6,0, 58 ºC i 45 min ved et medikament/fosfolipid forhold på 150 mg/mmol. Effektiviteten av fylling var 148,48 ± 10,26 μg topotecan/μmol fosfolipid (99,0 ± 6,8 %).
Liposomene ble inkubert med 50 % humant plasma i en multibrønners mikrodialyseanordning (Spectra-Por MicroDialyzer 10-well, Spectrum, USA). Humant donorplasma ble fortynnet med lignende volum av HEPES-bufret saltløsning (20 mM HEPES, 135 mM NaCI), pH 6,5, inneholdende 0,02 % natriumazid og fylt i det lavere reservoaret av dialysemaskinen (32 ml). Brønnene (0,4 ml) var separert fra reservoaret ved en polykarbonatmembran med 30 nm porestørrelse, for å sørge for fri passering av plasmaproteiner og små molekyler, men ikke liposomene. Liposomene ble blandet med beregnede mengder av plasma og HEPES-bufret saltløsning for å oppnå konsentrasjon på 2,5 mM fosfolipid og 50 volumprosent plasma. Anordningen ble inkubert ved 37 ºC og innholdet i reservoaret ble rørt sakte. Etter 8 timer med inkubasjon, ble innholdet i det lavere reservoaret byttet med fersk 50 % plasma. På de angitte tidspunktene (se nedenfor) ble delmengder på 50 μl tatt fra brønnene og kromatografert på kolonnene inneholdende 2,2-2,4 ml Sepharose CL-2B, elueringsmiddel HEPES-bufret saltløsning for å separere liposomene fra plasmaproteiner og fritt medikament. Liposomene ble høstet i dødvolumfraksjonene. Topotecan ble kvantifisert ved fluorometri ved anvendelse av eksitasjon ved 384 nm og emisjon ved 524 nm etter oppløsning av plasmaprøvene i 90 % vandig isopropanol-0,1 N HCl, og lipidet ble kvantifisert ved scintillasjonstelling av [<3>H]-CHE (quenchingkorrigert). Det bestemte medikament-til-lipid forholdet med tid ble sammenlignet med startforholdet før inkubasjon for å oppnå % topotecan som forble innkapslet på hvert tidspunkt. Etter 8 timer med inkubasjon, var medikamentmengden gjenværende i liposomet ca.55 % av dets opprinnelige verdi (Tabell 15).
Tabell 15. In vitro-frisetting av topotecan fra liposomene fylt ved TEA-Pn gradient i 50 % humant plasma ved 37 ºC.
Inkubasjonstid, timer % medikament som forblir innkapslet
1 95,5 ± 5,4
4 76,8 ± 7,3
8 55,9 ± 4,1
24 55,4 ± 16,8
EKSEMPEL 22. Topotecanliposomer med omsluttet TEA-Pn gradient ved ulike medikament/lipid forhold: in vivo-medikamentretensjon og sirkulasjonslevetid i mus.
Liposomene (DSPC/Kol/PEG-DSPE ved 3:2:0,015 molart forhold, inneholdende [<3>H]-CHE ved 0,5 mCi/mmol DSPC) med innkapslet gradientdannende saltløsning (0,5 N TEA-Pn, pH 6,2, osmolalitet 413 mmol/kg) ble fremstilt som i Eksempel 18 ved anvendelse av ekstrusjon 12 ganger gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 100 nm. Liposomstørrelsen var 107,7 ± 19,1 nm ved QELS. Liposomene i 5 mM HEPES, 50 g/l dekstrose, pH 6,5 ble blandet med den vandige lagerløsningen av topotecan (20 mg/ml) ved medikament/fosfolipid forhold i området 130-360 μg/μmol, fulgt av inkubering av blandingen ved 58 ºC i 45 min, plassering på is i 15 min og fjerning av uinnkapslet medikament ved Sephadex G-75 kromatografi. Tolv uker gamle FvB-hunnmus ble injisert med liposomene via halevenen ved en dose på 5 mg topotecan per kg kroppsvekt (ca.0,2 mg topotecan/dyr) med tre paralleller. Ved angitte tidspunkter, typisk 8 eller 24 timer etter injeksjon, ble musene anestesert, avlivet og blodprøvene ble undersøkt for medikamentet og liposomlipidet som i Eksempel 8. Resultatene er vist i Tabell 16. Etter 24 timer forble ca.6-32 % av den opprinnelige medikamentmengden innkapslet. Høyere mengder av medikamentet (>200 mg/mmol fosfolipid) resulterte i lenger medikamentretensjon.
Tabell 16. In vivo-medikamentretensjon og sirkulasjonslevetid av prototypiske topotecanliposomer fylt ved anvendelse av TEA-Pn gradientmetode til ulike medikament/lipid forhold.
Innkapslet Lipid gjenværende i Topotecan som forble medikament/fosfolipid, sirkulasjon, % injisert innkapslet, % av forhold, mg/mmol dose startmengde Etter 8 t Etter 24 t Etter 8 t Etter 24 t 127,2 ± 10,9 36,1 ± 2,0 18,7 ± 8,1 51,7 ± 7,1 6,72 ± 2,5 207,2 ± 21,6 32,1 ± 5,2 9,84 ± 1,88 75,6 ± 13,0 13,8 ± 3,5 301,3 ± 24,5 34,4 ± 3,2 8,04 ± 4,25 79,2 ± 4,2 25,6 ± 4,4 360,3 ± 35,6 33,6 ± 2,4 8,68 ± 4,96 73,5 ± 7,0 32,3 ± 9,8
EKSEMPEL 23. In vivo-medikamentretensjon og sirkulasjonslevetid av topotecanliposomer fylt ved anvendelse av ulike omsluttede ammonium- og trietylammoniumsalter.
Liposomene sammensatt av DSPE, kolesterol og PEG-DSPE (3:1:0,1 ved vekt), også inneholdende [<3>H]-CHE ved 0,22 mCi/mmol DSPE, ble fremstilt som i Eksempel 18, bortsett fra at ekstrusjonstrinnet omfattet ti passeringer gjennom to stablede 200 nm porefiltre, ti passeringer gjennom to stablede 100 nm porefiltre og 20 passeringer gjennom to stablede 50 nm porefiltre. Liposomene inneholdt følgende saltløsninger:
0,5 N ammoniumdekstransulfatløsning (A-DS) ble fremstilt fra natriumdekstransulfat (molekylvekt 5000), kjøpt fra Sigma og omdannet til ammoniumsalt ved ionebytterprosedyren lignende den ifølge Eksempel 4.
Løsningen av dekstransvovelsyre ble umiddelbart titrert med 12,4 M vandig ammoniakk. A-DS løsningen har pH 5,66, osmolalitet 208 mmol/kg.
0,48 N ammoniumsukroseoktasulfat (A-SOS) ble fremstilt lignende Eksempel 6, men ammoniumhydroksyd ble anvendt for titrering. Løsningen hadde pH 6,27, osmolalitet 258 mmol/kg.
0,47 M trietylammoniumsukroseoktasulfat (TEA-SOS) ble fremstilt som i Eksempel 6. Løsningen har pH 6,6, osmolalitet 297 mmol/kg.
Topotecan ble fylt inn i liposomene i den vandige løsningen av 10 mM MES-Na, 50 g/l dekstrose, pH 6,5, ved å inkubere liposomene med medikamentet ved 61-62 ºC og medikament/fosfolipid startforhold på 346 ± 1 mg/mmol, i 40 min, fulgt av inkubering på is i 10 min. Liposomene ble renset fra uinnkapslet medikament ved kromatografi på Sephadex G-25, elueringsmiddel - vandig 2 mM histidin, 144 mM NaCl, pH 6,6 (HCl).
Sju til ni uker gamle Swiss Webster-hunnmus ble injisert via halevenen med disse liposomale topotecanformuleringene ved dose på 5 mg topotecan per kg kroppsvekt (ca.0,2 mg topotecan/dyr) med tre paralleller. Etter 8 eller 24 timer etter injeksjon ble blodet tappet og analysert for topotecan og liposomlipid som i Eksempel 22.
Resultatene er presentert i Tabell 17 nedenfor. Mens alle tre liposomformuleringene demonstrerte veldig lik liposomsirkulasjonslevetid, ved å ha ca.23-28 % av den injiserte dosen gjenværende i blod 24 timer etter injeksjon, var medikamentretensjonen i TEA-SOS liposomer og i A-SOS liposomer uventet bedre enn i A-DS liposomer både i form av størrelsesorden (ca.2-fold forbedring i medikamentretensjon) og statistisk signifikans (statistisk signifikant ved 95 % konfidensnivå med 2-halet ikke-paret Students t-test henholdsvis p=0,0257 og p=0,00995; og ved Mann’s U-test var forskjellen signifikant med α=0,01).
Medikamentretensjon i TEA-SOS-inneholdende topotecanliposomer var bedre enn i A-SOS-inneholdende topotecanliposomer.
Tabell 17. Medikamentretensjon og sirkulasjonsvedvarenhet in vivo av topotecanliposomer fremstilt ved anvendelse av TEA-SOS, ammonium-SOS (A-SOS) og ammoniumdekstransulfat (A-DS).
Gradient Medikament/ Fyllings- Liposom- Lipid gjenværende i Topotecan som fosfolipid forhold, effektivitet, størrelse, sirkulasjon, % injisert forblir innkapslet, mg/mmol % nm dose % av startmengde Etter 8 t Etter 24 t Etter 8 t Etter 24 t A-DS 288,1 ± 20,6 83,3 ± 6,0 76,9 ± 22,7 43,7 ± 1,2 27,7 ± 1,5 43,6 ± 6,8 18,7 ± 1,5 A-SOS 346,2 ± 14,3 100,0 ± 4,1 99,7 ± 28,9 42,3 ± 2,2 23,4 ± 2,0 53,3 ± 0,8 31,3 ± 3,2 TEA-SOS 340,8 ± 14,7 98,5 ± 4,2 99,1 ± 32,6 42,1 ± 2,3 23,0 ± 2,9 57,0 ± 5,6 38,1 ± 6,1
EKSEMPEL 24. Medikament- og lipidplasmafarmakokinetikk av liposomalt topotecan i rotter
Sirkulasjonslevetid og topotecanfrisettingsparametre ble vurdert i rotter.
Liposomene (DSPC/kolesterol/PEG-DSPE molart forhold 3:2:0,015) ble fremstilt ved etanolblandings-/ekstrusjonsmetode og med topotecan ved anvendelse av TEA-Pn gradient eller TEA-sukroseoktasulfat (TEA-SOS) gradient som beskrevet i Eksempel 18 og fylt ved ulike medikament/lipid forhold (15-450 mg/mmol fosfolipid). For lipidmatrikskvantifisering inneholdt liposomlipidet [<3>H]-CHE ved 0,5-1,5 mCi/mmol DSPC. Sprague Dawley-hunnrotter (6-8 uker gamle; kroppsvekt ca.
200 g) med innlagte sentralvenøse katetere ble injisert i.v. (via kateteret) med topotecanliposomene ved dosen på 4-5 mg/kg kroppsvekt. Kateteret ble skylt med saltløsning. Ved valgte tidspunkter (opp til 48 timer etter injeksjon) ble blodprøvene (0,2-0,3 ml) tatt via kateteret inn i hepariniserte sprøyter, blandet med 0,4 ml kald, fosfatbufret saltløsning med 0,04 % EDTA, blodceller ble separert ved sentrifugering og supernatantene (PBS-fortynnet plasma) ble analysert for lipid ved <3>H-CHE radioaktivitetstelling (quenching-korrigert) og for topotecan ved fluorometri (Eksempel 71). Analyseresultatene ble korrigert for plasmafortynning, beregnet fra vekten av fremskaffet blodprøve og ved å anta en hematokritt på 40 %. Total bloddose av medikament og lipid ble estimert fra blodvolumet beregnet som 6,5 % av kroppsvekten. Prosent topotecan beholdt i liposomene ble beregnet ved sammenligning av medikament/lipid forholdet på et gitt tidspunkt til medikament/lipid forholdet av de injiserte liposomene. Tabell 18 nedenfor oppsummerer halveringstider i blod av lipidet, medikamentet og halveringstidene for medikamentfrisetting, så vel som andre egenskaper til liposomene.
Farmakokinetikk (PK) kurver er vist i Figur 8A (lipid) og 8B (medikament/lipid forhold). Kort fortalt passer blod PK-kurvene for både medikament og lipid bra til enkeleksponent-modell (R<2>0,984-0,999). Til tross for deres 90-100 nm størrelse og veldig liten mengde av PEGylert lipid (0,3 molprosent), viste liposomene uventet god sirkulasjonslevetid (halveringstider av lipidkomponenten i plasma var i området 11-16 timer). Den mest sakte frisettingen av topotecan (halveringstid 22,9 timer) ble observert med liposomene fylt ved anvendelse av TEA-SOS metoden.
Tabell 18. Sirkulasjonshalveringstid (t1/2) av lipid, medikament og halveringstid for medikamentfrisetting fra prototypiske topotecanliposomer i rotter.
Omsluttet Topotecan- Liposomstr., Injisert t1/2 t1/2 t1/2 av Ant. salt og mengde, nm dose, lipid, medi- medikament- dyr pr. kons. mg/mmol (gj.snitt ±SD) mg/kg timer kament, frisetting, gruppe fosfolipid timer timer
TEA-Pn 124,3 ± 9,7 92,3 ± 23,3 4 15,8 4,13 5,34 3 0,5 N
TEA-Pn 360,3 ± 35,6 107,7 ± 19,1 5 12,8 6,06 9,97 2 0,5 N
TEA-SOS 439,2 ± 15,9 108,8 ± 13,4 5 10,8 7,36 22,87 2 0,643N
EKSEMPEL 25. Medikamentstabilitet mot lekkasje under lagring av topotecanliposomer
Prøvene av flere prototypiske formuleringer fremstilt for de ovenfor beskrevne studiene ble lagret ved 4-6 ºC i ulike tidsrom for å vurdere lagringsstabiliteten til innkapslet topotecan mot medikamentlekkasje fra liposomene. Liposomprøvene ble ført gjennom Sephadex G-75 kolonner, eluert med 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5, for å fjerne ekstraliposomalt medikament og analysert for medikamentinnhold ved spektrofotometri og for lipid ved [3H]-CHE radioaktivitetstelling. Resultatene (Tabell 19) indikerer god retensjon av topotecan i liposomene under lagring.
Tabell 19. Medikamentretensjon i prototypiske topotecanliposomer under lagring.
Liposomgradient- Liposom- Opprinnelig Lagrings- Medikamentdannende salt størrelse, medikamentmengde, tid, mnd. mengde etter gj.snitt ± SD, mg medikament/ lagring som % av nm mmol fosfolipid opprinnelig TEA-Pn 0,500 N pH 6,2 96,4 ± 29,3 148,5 ± 10,3 8 101,6 ± 5,5 TEA-Pn 0,500 N pH 6,2 107,7 ± 19,1 127,2 ± 10,9 6 94,6 ± 6,2 TEA-Pn 0,500 N pH 6,2 107,7 ± 19,1 207,2 ± 21,6 6 113,9 ± 9,4 TEA-Pn 0,500 N pH 6,2 107,7 ± 19,1 301,3 ± 24,5 6 112,9 ± 9,3 TEA-SOS 0,643 N pH 5,6 108,8 ± 13,4 439,2 ± 15,9 2 97,8 ± 9,4
EKSEMPEL 26. In vitro-opptak av liposomalt og immunliposomalt topotecan ved HER2-overuttrykkende kreftceller.
Denne studien adresserte kapasiteten av topotecanfylte anti-HER2-immunliposomer fremstilt ifølge oppfinnelsen for å levere topotecan spesifikt inn i HER2-overuttrykkende celler i cellekultur. (Immun)liposomene ble fremstilt og fylt med topotecan ved anvendelse av TEA-Pn metode ifølge Eksempel 19. HER-2 overuttrykkende humane brystkarsinomceller (SKBr-3, ATCC) ble dyrket i modifisert McCoy 5A-medium (uten tricin) tilsatt 10 % føtalt kalveserum, 50 μg/ml streptomycinsulfat og 50 U/ml penicillin G (fullstendig vekstmedium) i T-75 flasker ved 37 ºC, 5 % CO2, til konfluens. Cellene ble høstet ved trypsinering, inokulert til 24-brønners cellekulturplater ved 150.000 celler/brønn i 0,5 ml av det fullstendige vekstmediet og fikk akklimatisere natten over. Mediet ble byttet ut med 0,5 ml fullstendig vekstmedium inneholdende topotecanformuleringer ved valgt konsentrasjon i området med 0,01-0,1 mM fosfolipid. Triplikate brønner ble anvendt for hver betingelse. Kontrollbrønner ble inkubert i fravær av medikament og/eller liposomer (for å oppnå bakgrunnsmålinger for medikamentanalyse).
Platene ble inkubert med sakte agitasjon ved 37 ºC, 5 % CO2 i 4-8 timer. Mediet ble aspirert og cellene ble skylt fire ganger med 1 ml porsjoner av kald Hanks balanserte saltløsning inneholdende Ca- og Mg-salter. Cellene ble solubilisert ved å tilsette 0,1 ml av 1 % Triton X-100 i vann, og mengden av medikament i cellelysatene ble bestemt ved fluorometri (Eksempel 71). Standardkurven ble fremskaffet i området av 10-2500 ng topotecan/brønn, og tilpasset andreordens polynom (for å gjøre regnskap for ”self-quenching” ved høyere medikamentkonsentrasjon) etter subtrahering av celleautofluorescensbakgrunnen. Når et mikroplatefluorometer ble anvendt, var filtervalget 400/30 nm for eksitasjon, 530/25 nm for emisjon. Både kuvette- og mikroplatefluorometere ga samme resultater.
Resultatene av to eksperimenter er oppsummert i Tabell 20 nedenfor. Det var utpreget cellulært opptak av HER2-målrettet liposomalt medikament (50-300 ganger høyere enn ikke-målrettet liposomalt topotecan). Opptak av fritt topotecan var interessant også signifikant lavere enn av HER2-målrettet immunliposomalt topotecan. Dette kan forklares ved rask hydrolyse av camptotecinlaktonringen til topotecanmolekyl i cellevekstmediet i nærvær av serum, hvilket genererer karboksylatformen av medikamentet som kan ha lavere cellepermeabilitet og lavere cytotoksisitet. Kort fortalt ble evnen cellemålrettede, internaliserbare, ligandkonjugerte immunliposomer har til å levere topotecan intracellulært
bekreftet.
Tabell 20. In vitro-cellulært opptak av topotecanliposomer og anti-HER2 immunliposomer inneholdende TEA-Pn (nd, ikke bestemt). For liposomkarakteristika, se Tabell 12.
Liposom- Topotecan- Eksponerings- Topotecanopptak ved SK-Br-3 celler, kons., kons. μg/ml tid, timer ng/100.000 celler
mM Ikke- F5- Fritt fosfolipid målrettede immunliposomer medikament liposomer
0,1 15,5 4 1,45 ± 0,09 163 ± 5,7 nd 0,01 1,55 4 0,185 ± 0,03 60,2 ± 2,0 nd 0,033 5,0 8 3,62 ± 2,03 169,6 ± 13,7 5,56 ± 0,91
EKSEMPEL 27. Cytotoksisitet av liposomalt og immunliposomalt topotecan mot HER2-overuttrykkende kreftceller in vitro.
Når kapasiteten til anti-HER2 topotecanimmunliposomer for intracellulær medikamentlevering inn i HER2-overuttrykkende kreftceller ble stadfestet (Eksempel 26), ble det viktig å sikre at de internaliserte liposomene kan frisette medikamentet i dets aktive form. For dette formålet ble in vitro-cytotoksisitet av fritt topotecan (dvs. topotecan formulert som en løsning), liposomalt topotecan og anti-HER2-immunliposomalt topotecan studert. De liposomale
topotecanformuleringene ble fremstilt og SKBr-3 celler ble dyrket og høstet som beskrevet i Eksempel 26. Cellene ble inokulert til 96-brønners cellekulturplater ved 5.000 celler i 0,1 ml av det fullstendige vekstmediet, med tre paralleller, og fikk stå og akklimatisere natten over. Rader og kolonner ytterst på platen fikk være
tomme. Sterile fremstillinger av topotecanliposomer, immunliposomer eller fritt medikament (nyfremstilt ved å fortynne topotecan 20 mg/ml lagerløsning, pH 3, i ubufret saltløsning til 2 mg/ml) ble fortynnet med fullstendig medikamentmedium
for å oppnå konsentrasjoner som begynner fra 90, 30 eller 10 μg/ml og seriefortynnet ned i mediet med faktor på 3. Mediene i brønnene ble byttet ut med 0,2 ml medikament/liposom fortynninger og inkubert ved 37 ºC, 5 % CO2, for spesifisert tidsrom (4-6 timer). Én brønn i hver rad ble inkubert med medikamentfritt medium for å tjene som en ikke-behandlet kontroll. De medikamentinneholdende mediene ble aspirert fra brønnene, cellene ble vasket med 0,2 ml medikamentfritt medium og 0,2 ml ferskt medikamentfritt medium ble satt til alle brønner. Platene ble inkubert i 4 dager ved 37 ºC, 5 % CO2. Uten mediumbytte ble 0,03 ml av 2 mg/ml løsningen av en tetrazoliumfarge (Thiazolyl Blue, MTT) (Sigma Chemical Co.) i serumfritt medium satt til hver brønn. Platene ble inkubert i ytterligere 2-3 timer ved 37 ºC, 5 % CO2. Mediene ble aspirert og brønnene ble fylt med 0,2 ml av 70 volumprosent vandig isopropanol, 0,075 N HCl og beveget forsiktig inntil formazanfargen løser opp (15-30 min). Optisk tetthet av formazanløsningene ble bestemt ved anvendelse av mikroplatefotometer ved 540 nm. Celleviabiliteten som % av ikke-behandlet kontroll ble beregnet som forholdet av optisk tetthet i de eksperimentelle brønnene til optisk tetthet i brønnene inneholdende ikke-behandlede celler, korrigert for bakgrunn. Dataene ble plottet mot medikamentkonsentrasjonen og IC50-dosen ble estimert grafisk fra skjæringspunktet til viabilitet-konsentrasjonskurven med 50 % viabilitetslinjen.
Resultatene er presentert i Figur 9. Medikamentdosen resulterende i 50 % veksthemming (IC50) for fritt topotecan eller ikke-målrettet liposomalt topotecan overstiger 30 μg/ml; for F5-immunliposomalt topotecan, 0,15 μg/ml. Disse resultatene er sammenfallende med dataene for målrettet medikamentopptak.
EKSEMPEL 28. Komparativ stabilitet og plasmafarmakokinetikk av liposomalt og F5-immunliposomalt topotecan i mus.
Topotecanliposomer inneholdende radioaktiv lipidmarkør [<3>H]-CHE ved 1,5 mCi/mmol fosfolipid ble fremstilt i henhold til Eksempel 11 og 19 ved anvendelse av en etanollipidløsningsblanding-ekstrusjon prosedyre under følgende betingelser: gradientdannende saltløsning: 0,643 N trietylammoniumsukroseoktasulfat; polykarbonatmembranekstrusjon: 15 passeringer gjennom to stablede PCTE-filtre, 80 nm porestørrelse; topotecanfylling: medikament/fosfolipid startforhold 350 mg/mmol (beregnet for topotecanfri base); F5 scFv-konjugering ble utført som beskrevet i Eksempel 19. Liposomene hadde følgende karakteristika:
Størrelse ved QELS: vektgjennomsnitt 101,2 nm; standardavvik, 20,1 nm. Medikamentinnkapsling: Topotecanliposomer (Topo-Ls) 359,3 ± 27,4 mg/mmol fosfolipid; topotecan F5scFv-immunliposomer (Topo-F5-ILs) 326,3 ± 15,9 mg/mmol fosfolipid.
Studien ble utført generelt som i Eksempel 22. Gruppene på ni Swiss Webster-hannmus (8-10 uker gamle, 24-27 g) ble injisert via halevene med Topo-Ls, Topo-F5ILs eller nyfremstilt topotecan 1 mg/ml i ubufret saltløsning, ved dosen på 5 mg topotecanbase per kg kroppsvekt (ekvivalent til lipiddosen på 14-16 μmol fosfolipid/kg kroppsvekt). Ved tidspunktene 1, 8 eller 24 timer etter injeksjon, ble 3 dyr per tidspunkt avlivet via åpen hjertepunktering under ketamin/xylazin anestesi, blodet ble samlet opp i rør inneholdende PBS-EDTA og undersøkt for topotecan (fluorometri) og liposomlipid (ved scintillasjonstelling). Mengdene av medikament og lipiddose gjenværende i blodet på gitte tidspunkter ble beregnet fra den administrerte dosen satt til 100 %, ved å anta blodmengden per dyr som 6,3 % av kroppsvekten og pakket blodcellefraksjon på 45 %. Mengde medikament som forble innkapslet i liposomene på hvert tidspunkt ble beregnet for hvert dyr individuelt ved sammenligning av medikament/lipid radioaktivitetsforhold av plasmaprøvene med det til de injiserte liposomene. Mengden av fritt topotecan i plasmaprøvene tatt 1 time etter injeksjon var mindre enn 1 % av den injiserte dosen (faktisk var de under deteksjonsgrensen for vår analysemetode); derfor ble ikke videre tidspunkter av fri topotecangruppe studert. På grunn av rask blodclearance og lave blodnivåer av fritt topotecan antok vi at hovedsakelig alt topotecan funnet i blodet på alle tidspunkter representerer liposomalt innkapslet topotecan.
Resultatene er oppsummert i Tabell 21 nedenfor. Bemerkelsesverdig beholdt liposomene fremstilt ifølge oppfinnelsen 79-85 % av den opprinnelige medikamentmengden selv 24 timer etter injeksjon i blodet til dyrene. Forskjellene mellom gjennomsnittlige plasmaverdier av lipidet eller medikamentet mellom liposom- og immunliposomgruppene var i området 1,8-13,6 % og var nær eller innenfor området for analysefeil. Sannsynlighet for nullhypotesen mellom liposomog immunliposomgruppen med hensyn til medikament- eller lipidverdier på hvert tidspunkt, beregnet ved anvendelse av Students t-test, var i området 0,543-0,938. Vi konkluderer at forskjellene i gjenværende blodnivåer av medikamentet eller lipidet mellom de to fremstillingene var neglisjerbare og statistisk utydelige.
Tabell 21. Mengdene av liposomlipid, topotecan og av topotecan som forble innkapslet i liposomene i plasmaet hos mus ved ulike tidspunkter etter i.v. injeksjon.
Tid etter Lipid, % av injisert Medikament, % av Medikament/lipid, % av injeksjon dose injisert dose pre-injeksjonsverdi F5-konjugert liposomalt topotecan (Topo-F5ILs):
1 time 57,58 ± 4,95 55,45 ± 7,23 96,14 ± 7,32 8 timer 35,37 ± 3,84 34,18 ± 5,87 96,31 ± 11,92 24 timer 15,51 ± 11,84 12,30 ± 9,02 79,36 ± 8,03
Liposomalt topotecan (ukonjugert) (Topo-Ls):
1 time 58,88 ± 9,51 57,63 ± 9,45 97,90 ± 5,29 8 timer 39,61 ± 1,99 38,82 ± 1,49 98,06 ± 4,44 24 timer 15,84 ± 3,85 13,45 ± 2,64 85,25 ± 7,03
EKSEMPEL 29. Antitumoreffektivitet av liposomalt og anti-HER2-immunliposomalt topotecan i BT-474 xenotransplantatmodell.
I denne studien anvendte vi de første prototypiske topotecanimmunliposomene som anvender trietylammoniumpolyfosfatgradient for medikamentomslutning.
Liposomene ble generelt fremstilt ved å følge fremgangsmåtene i Eksempel 11 og 19. Lipidmatrikskomponenter - DSPC (Avanti Polar Lipids; 3 molare deler), kolesterol (Calbiochem, 98,3 %; 2 molare deler) og metoksy-PEG(2000)-DSPE (Avanti Polar Lipids, 0,015 molare deler) - ble kombinert med 100 % etanol USP for å tilveiebringe løsningen inneholdende 0,5 mM fosfolipid ved 60 ºC.
Etanollipidløsningen ble fortynnet ved 60 ºC med vandig trietylammoniumpolyfosfatløsning (0,608 M trietylamin, 0,65 N fosfat, pH 6,1, osmolalitet 531 mmol/kg), blandet grundig og ekstrudert ti ganger gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 100 nm (Nuclepore, Corning) ved anvendelse av termostatert gasstrykkekstruder (Lipex Biomembranes) ved 60 ºC. De ekstruderte liposomene ble avkjølt på is, og uinnkapslet trietylammoniumpolyfosfat ble fjernet ved gelkromatografi på Sepharose CL-4B ved anvendelse av 5 % dextrose-5 mM HEPES-Na buffer, pH 6,5, som elueringsmiddel. Liposomstørrelsen var 103,8 ± 35,1 nm ved QELS. Liposomene i denne bufferen ble inkubert med topotecanhydroklorid ved 60 ºC i 30 min ved forholdet på 0,35 mg topotecanbase per μmol fosfolipid. På slutten av inkubasjonen ble liposomene avkjølt på is og kromatografert på Sephadex G-75, elueringsmiddel 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5, for å fjerne hvilket som helst uinnkapslet medikament. Medikamentinnholdet ble bestemt ved fluorometri og lipidinnholdet ved fosfatanalyse som tidligere rapportert. Liposomalt topotecan fremskaffet på denne måten har 365,4 ± 23,1 mg topotecanbase per mmol fosfolipid. For å fremstille HER2-målrettede topotecanimmunliposomer, ble en del av denne liposomale topotecanfremstillingen inkubert med det rensede konjugatet av anti-HER2 scFv F5 og maleimido-PEG-DSPE linker generelt som beskrevet i Eksempel 19. Kort fortalt ble F5-PEG-DSPE konjugat i vandig 10 % sukrose-10 mM Na-sitratløsning, pH 6,5, kombinert med topotecanliposomer ved forholdet på 15 mg protein per mmol liposomfosfolipid, og inkubert ved 60 ºC i 30 min.
Inkubasjonsblandingen ble avkjølt på is og kromatografert på Sepharose CL-4B, elueringsmiddel 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5, for å fjerne hvilket som helst uinkorporert scFv-konjugat. Medikament-til-lipid forholdet avtok med 14 % etter denne ekstra inkubasjonen.
Topotecanliposom- og immunliposomformuleringene inneholdende 1-2 mg/ml av topotecan ble ført gjennom 0,2 mikron sterilt sprøytefilter, fordelt aseptisk til polypropylenrør og lagret ved 4-6 ºC i opp til 1 måned før anvendelse.
Fritt topotecan ble nyfremstilt ved å løse topotecanhydrokloridpulver ved 2 mg/ml i 5 % dekstrose og sterilisert ved passering gjennom 0,2 mikron sprøytefilter.
En HER2-overuttrykkende BT-474 humant brystadenokarsinomxenotransplantatmodell ble etablert som beskrevet i Eksempel 10. Ved dag 13 etter tumorinokulasjon ble dyrene som hadde tumorer i området 120-350 kubikk mm valgt og randomisert til tre behandlings- og en kontrollgruppe med 12 dyr hver. Ved dag 14, 18 og 21 etter tumorinokulasjon ble musene behandlet med i.v. (halevene) injeksjoner av topotecanformuleringer per injeksjonsdose på 5 mg/kg kroppsvekt eller med like stort volum av fysiologisk saltløsning. Dyrenes generelle helse ble monitorert daglig. Tumorstørrelser og kroppsvekt ble monitorert to ganger ukentlig opp til dag 53 etter tumorinokulasjon. Dyrene hvis tumorer nådde 20 % av kroppsvekten eller de med progressivt vekttap som nådde 20 % eller mer, ble gitt en lett og rolig død.
Figur 11 og 12 viser henholdsvis tumorvekst- og kroppsvektsdata.
Liposomale topotecanformuleringer var mer aktive i tumorvekstsuppresjon enn det frie medikamentet, og F5-målrettet liposomal formulering var mer aktiv enn den ikke-målrettede formuleringen. Gjennomsnittlige tumorstørrelser på slutten av observasjonsperioden var signifikant forskjellig blant behandlingsgruppene (pverdier ved uparet to-halet Students t-test var 1,2x10<-6 >for fritt vs. immunliposomalt medikament, 0,000114 for fritt vs. liposomalt medikament og 0,00718 for liposomalt vs. immunliposomalt medikament). Derfor var liposomalt innkapslet topotecan mer aktivt enn det frie medikamentet, og anti-HER2 immunliposomalt topotecan var mer aktivt enn ikke-målrettet liposomalt medikament. I den liposomale og immunliposomale gruppen, etter begynnende regresjon, forekom tumorgjenvekst i løpet av 10 dager etter den siste behandlingen. Det var ingen tumorregresjon i gruppen med fritt medikament. Det ble registrert at de liposomale formuleringene av topotecan ved en gitt dose var mer toksisk enn det frie medikamentet. Det var mage/tarm toksisitet. Dyrene som mottok liposomalt topotecan utviklet diaré og hadde tap av kroppsvekt med gjennomsnitt på ca.14 % av dets maksimum. Mens dyrene i den ikke-målrettede liposomale gruppen restituerte, unntatt én (12,5 %) som hadde vedvarende 15 % vekttap på slutten av studien, utviklet fem dyr (41,6 %) i den F5-målrettede gruppen terminal morbiditet og døde; og ytterligere to (16,7 %) hadde vedvarende vekttap på ca.15 %. I kontrollgruppen og gruppen med fritt medikament var det ingen vekttap eller behandlingsrelatert morbiditet.
EKSEMPEL 30. Maksimalt tolerert dose (MTD) av fritt og liposomalt topotecan i mus gitt tre ukentlige i.v. injeksjoner.
Denne studien anvendte en topotecanliposomformulering fremstilt som i Eksempel 29, bortsett fra at trietylammoniumpolyfosfatløsningen ble byttet ut med trietylammoniumsukroseoktasulfatløsning som har 0,65 M trietylammonium, pH 6,2; og for ekstrusjon ble 80 nm polykarbonatmembranfiltre anvendt i stedet for 100 nm. Volumvektet liposomstørrelse bestemt ved kvasielastisk lysspredningsmetode i gaussisk approksimasjon (QELS) var 95,1 ± 19,6 nm (gjennomsnitt ± SD); medikament/lipid forhold var 369,1 ± 18,3 mg/mmol fosfolipid. Fem-seks uker gamle Swiss-Webster hunnmus (18-20 g) i gruppene på to mottok tre i.v. (halevene) injeksjoner av fritt eller liposomalt topotecan ifølge én-gang-iuken plan, som starter fra dosen på 2 mg/kg topotecanbase per injeksjon og som øker for hver påfølgende gruppe med faktor på 1,8 til dosen på 37,8 mg/kg.
Immunliposomalt topotecan var ikke inkludert i denne studien. Kroppsvekt og generell helse hos dyrene ble monitorert daglig. Progressivt vekttap på mer enn 20 % eller naturlig død på hvilket som helst tidspunkt i hvilket som helst av to dyr i en gruppe i løpet av perioden på ti dager siden behandlingsstart ble betraktet som indikativisk for den toksiske dosen. I henhold til dyredødelighet og vektdata ble MTD bestemt å falle innenfor området av 11,7-21 mg/kg for fritt topotecan og 2,0-3,6 mg/kg for liposomalt (prototyp 2) topotecan. I den andre studien mottok musene injeksjoner av fritt, liposomalt eller F5-immunliposomalt topotecan (fremstilt fra liposomalt topotecan ifølge dette eksempelet som beskrevet i Eksempel 29) med dosene fra 2,0 mg/kg (liposomalt/immunliposomalt topotecan) eller 12 mg/kg (fritt topotecan) og økt for hver påfølgende gruppe med faktor på 1,15 inntil dosen nærmest det øvre området av det stadfestede MTD-intervallet ble oppnådd. Den høyeste dosen som ikke resulterte i død eller terminal morbiditet i noen av dyrene ble betraktet som en MTD og ble funnet å være 18,4 mg/kg for fritt topotecan, 3,0 mg/kg for liposomalt topotecan og 3,0 mg/kg for immunliposomalt topotecan. Derfor viste liposomalt topotecan større toksisitet enn det frie medikamentet.
EKSEMPEL 31. Antitumoreffektivitet av liposomalt topotecan i BT-474 xenotransplantatmodell på området av 0,125-1,0xMTD
Topotecanliposomene og F5-immunliposomene ifølge Eksempel 30 ble anvendt i denne studien. BT-474 subkutane xenotransplantater fikk vokse i nakne mus som i Eksempel 29. Ved dag 18 etter tumorcelleinokulasjon ble dyrene med tumorer (105-345 kubikk mm, gjennomsnittlig ca.200 kubikk mm) randomisert inn i behandlingsgrupper med 6 dyr/gruppe og en kontrollgruppe med 8 dyr/gruppe. Dyrene mottok fritt eller liposomalt topotecan ved 1xMTD, 0,5xMTD, 0,25xMTD eller 0,125xMTD ved tre i.v. (halevene) injeksjoner på dag 19, 23 og 27 etter tumorinokulasjon. Kontrollgruppen mottok injeksjoner av fysiologisk saltløsning. Tumorstørrelser og kroppsvekter ble monitorert som i Eksempel 29. For å oppnå kroppsvektmålinger, ble tumorvekten (beregnet fra tumorstørrelsen ved å anta tumortetthet på 1,0) subtrahert fra vektmålingene av hele dyret. Alle medikamentformuleringer ved MTD viste antitumoraktivitet (Figur 13A-13D). Det var ingen signifikant forskjell i effektivitet mellom fritt og liposomalt medikament gitt ved deres respektive MTD eller ved identiske fraksjoner (1/2, 1/4 eller 1/8) derav. Derfor resulterte liposominnkapsling av medikamentet ved anvendelse av TEA-SOS gradient i ca.6-fold økning i antitumoraktivitet, men også i lignende økning i medikamenttoksisitet. Dynamikk av kroppsvekter viste at alle behandlinger var ikke-toksiske unntatt behandlingen med fritt topotecan ved MTD som viste transient reduksjon i kroppsvekt (ca.15 % av pre-behandlingsverdien) som senere bestemt (Figur 14).
EKSEMPEL 32. Fremstilling og målrettet in vitro-cytotoksisitet av topotecanliposomer fremstilt ved anvendelse av trietylammoniumsukrooktasulfat-omslutningsmetode.
Liposomalt topotecan ble fremstilt generelt ved å følge prosedyren i Eksempel 18, ved anvendelse av den omsluttede løsningen av TEA-SOS som har 643 mM TEA, pH 5,7, osmolalitet 530 mmol/kg og medikament/fosfolipid forhold på 170 mg/mmol. Liposomene hadde 155 mg medikament/mmol fosfolipid; 90 % fyllingseffektivitet og partikkelstørrelse 105 nm. Disse liposomene ble inkubert med den micellære løsningen av F5-PEG-DSPE konjugat ved ca.30 scFv per liposom (15 mg antistoff/mmol fosfolipid) ved 60 ºC i 1 time generelt som beskrevet i Eksempel 19. Antistoffkonjugerte liposomer ble separert ved SEC ved anvendelse av Sepharose CL-4B og formulert inn i HBS-6,5 HEPES-bufret saltløsning. Det var ingen detekterbar forandring i medikament/lipid forhold i løpet av binding av anti-HER2 scFv (F5).
Opptaket av topotecanformuleringer ved kreftceller ble bestemt som følger. HER2-overuttrykkende humane brystadenokarsinomceller (SK-Br-3, ATCC HTB-30) ble satt til 24-brønners cellekulturplater ved 150.000 celler/brønn og akklimatisert natten over. Cellene ble inkubert (med tre paralleller) med F5-målrettet- og ikke-målrettet liposomalt topotecan i fullstendig vekstmedium ved liposomkonsentrasjoner på 0,1 mM og 0,01 mM i 4 timer ved 37 ºC. Cellene ble vasket fire ganger med Hanks balanserte saltløsning, solubilisert i 0,1 % Triton X-100 - 70 % surgjort isopropanolblanding 1:10, og mengden av celleassosiert topotecan per brønn ble bestemt ved fluorometri. Resultatene (gjennomsnitt ± standardfeil) er oppsummert i Tabell 22. De målrettede liposomene leverte 100-300 ganger mer medikament inn i de målrettede celler enn ikke-målrettede liposomer.
Tabell 22. Opptak av liposomalt topotecan ved SK-Br-3 brystkarsinomceller.
Formulering Topotecanopptak ved Topotecanopptak ved 0,1 mM fosfolipid, 0,01 mM fosfolipid, ng/brønn ng/brønn Ikke-målrettet liposom 4,76 ± 0,24 0,607 ± 0,088 HER2-målrettet liposom 533,8 ± 13,7 197,0 ± 4,6 Forhold: Målrettet/ikke-målrettet 112,1 ± 8,6 324 ± 55
Cytotoksisitet av disse topotecanformuleringene mot SKBr-3 brystkreftceller ble bestemt som beskrevet i Eksempel 27. SKBr-3 celler ble inokulert til 96-brønners plater ved 5.000 celler/brønn, akklimatisert natten over og inkubert med økende konsentrasjoner (0,004-30 μg/ml) av fritt, liposomalt eller F5-immunliposomalt topotecan i cellevekstmedium i 4 timer ved 37 ºC. De medikamentinneholdende mediene ble fjernet og cellene fikk vokse i det medikamentfrie mediet i 72 timer. Mengde levende celler per brønn ble bestemt ved anvendelse av Thiazolyl Blue(MTT) tetrazoliumanalyse og uttrykt som % av den til kontroll (ikkebehandlede) celler. Resultatene er presentert i Figur 10.
Topotecanimmunliposomer var mer cytotoksiske (IC500,15-0,5 μg/ml) enn ikkemålrettede topotecanliposomer (IC50 ≥ 3,1 μg/ml) og fritt topotecan (IC50 ≥ 2,3 μg/ml).
EKSEMPEL 33. In vivo-stabilitet av topotecanliposomer av ulik størrelse.
Liposomene inneholdende TEA-Pn ble fremstilt som i Eksempel 22 ved anvendelse av ekstrusjon 12 ganger gjennom polykarbonatmembraner med porestørrelse på 100 nm eller i tillegg 12 ganger gjennom polykarbonatmembraner med porestørrelse på 50 nm. Topotecan (TPT) ble tilsatt ved et forhold på 150 μg/μmol fosfolipid. Fylling ble fullført ved 58 ºC i 45 min i et varmt vannbad, fulgt av quenching på is. Effektiviteten av fylling for 50 nm- og 100 nm-ekstrudert liposom var henholdsvis 126,80 ± 19,24 μg TPT/μmol PL (84,5 ± 12,8 %) og 148,48 ± 10,26 μg TPT/μmol PL (99,0 ± 6,8 %). Swiss Webster-hunnmus i gruppene på tre ble injisert intravenøst med én av de to formuleringene av Ls-TPT ved en dose på 5 mg TPT/kg. Musene ble avlivet etter 6 timer og blodet ble tappet. Plasma ble analysert for TPT og liposomlipid som beskrevet i Eksempel 22. Resultatene er presentert i Tabell 23.
Tabell 23. In vivo-stabilitet av Ls-TPT med ulike størrelser fylt ved anvendelse av TEA-Pn omslutningsmetode.
Liposomstr., nm Medikament i Liposomlipid i Medikament/lipid plasma, % av plasma, % av forhold, % av preinjisert dose injisert dose injeksjonsverdi 74,2 ± 21,6 32,93 ± 1,97 45,7 ± 2,2 72,06 ± 5,51 96,4 ± 29,3 33,26 ± 3,56 37,6 ± 5,3 88,41 ± 15,68
EKSEMPEL 34. Syntese og liposominnkapsling av 6-(3-aminopropyl)ellipticin (6-APE).
6-(3-aminopropyl)ellipticin ble fremstilt fra ellipticin i en to-trinns fremgangsmåte basert på prosedyren ifølge Werbel et al., J. Med. Chem.1986, v.29, s.1321-1322. 501,4 mg ellipticinbase (NSC 71795) (Aldrich Chemical Co.) ble rørt med ca. 100 mg natriumhydrid (Sigma; vasket med vannfri petroleumeter) i 5 ml tørt dimetylformamid (DMF) ved romtemperatur i 30 min. Til denne blandingen ble en løsning av 678 mg N-brompropylftalimid (Aldrich) i 2 ml tørt DMF tilsatt dråpevis. Den fiolettfargede reaksjonsblandingen ble rørt under argon natten over, behandlet med 1 ml vann og helt over i 60 ml vann. Blandingen ble ekstrahert to ganger med 25 ml metylenklorid, ekstraktet ble tørket over vannfritt natriumsulfat og ført gjennom et sjikt av nøytral alumina. Aluminasjiktet ble skylt to ganger med 10 ml metylenklorid, og det kombinerte filtratet og skyllingene ble tørket i vakuum. Produktet ble rørt natten over med 20 ml absolutt etanol og 2 ml vannfritt hydrazin ved romtemperatur. Fremskaffet slurry ble filtrert under vakuum, et gult filtrat ble fortynnet med 50 ml 0,2 N NaOH og ekstrahert med to porsjoner (75 ml og 50 ml) kloroform. Kloroformekstraktet ble tørket over Na2SO4 og tørket i vakuum.
Grovprodukt (utbytte 408 mg) ble kromatografert på silika 60-kolonne eluert isokratisk med kloroform-metanol blanding (7:3 ved volum), mettet med tørt trimetylamin. Fraksjonene eluert i et andre gulfarget bånd, etter uomsatt ellipticin, ble vist å inneholde den ønskede forbindelsen i ca.30 % utbytte. Strukturen ble bekreftet ved <1>H-NMR. TLC: Rf 0,29-0,31 (Silika 60; CHCl3-MeOH 7:3 ved volum, mettet med trimetylamin). Ellipticin, Rf 0,81-0,83. Den fremskaffede forbindelsen ble omdannet til dihydrokloridsalt ved å løse opp i vannfri etanol og titrere med 6 N HCl-løsning i tørr isopropanol. De oransje krystallene av 6-APE dihydroklorid (NSC 176328) ble filtrert ut, vasket med eter og tørket i vakuum. Utbytte av dihydroklorid 86 %.
Liposomene ble fremstilt ved hydrering av den rene lipidfilmen av DSPC, kolesterol og PEG(molekylvekt 2.000)-DSPE (3:2:0,015 molart forhold) i en løsning av trimetylammoniumpolyfosfat (TMA-Pn) ved 0,5 M TMA, pH 5,6, ved 60 ºC, fulgt av seks sykluser med rask nedfrysing (-78 ºC) og tining (60 ºC) og ekstrusjon ti ganger gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 50 nm. Uinnkapslet TMA-Pn ble fjernet ved anvendelse av en Sepharose CL-4B kolonne eluert med HEPES-dekstrose (5 mM HEPES, 5 % dekstrose, pH 5,5). Liposomstørrelsen var 85,7 ± 32,1 nm.
Konsentrert 6-APE løsning (10 mg/ml) ble satt til de TMA-Pn-inneholdende liposomene ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 100 μg APE/μmol fosfolipid, blandingen ble inkubert ved 58 ºC i 45 min og raskt avkjølt på is i 15 min.
Uinnkapslet medikament ble fjernet ved gelkromatografi på en Sephadex G-75 kolonne eluert med HEPES-dekstrose buffer (5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5). Liposomomsluttet APE ble deretter kvantifisert ved spektrofotometri som i Eksempel 71, og liposomfosfolipid ble bestemt ved anvendelse av ekstraksjonsanalysen i Eksempel 70. Medikamentinnkapslingen var praktisk talt kvantitativ.
EKSEMPEL 35. Fremstilling av HER2-målrettet immunliposomalt 6-APE og cytotoksisitet av 6-APE formuleringer mot HER2-overuttrykkende BT-474 brystkreftceller in vitro.
Liposomer med innkapslet 6-APE (Ls-APE) ble fremstilt som i Eksempel 34 ovenfor. Anti-HER2 immunliposomer med innkapslet 6-APE (F5-ILs-APE) ble fremstilt fra Ls-APE ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 19. En MTT-basert celleviabilitetsanalyse ifølge Eksempel 27 ble anvendt for å bestemme cytotoksisiteten av 6-APE levert som en løsning, Ls-APE eller som HER2-målrettet F5-ILs-APE mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinomceller (BT-474). Cellene ble eksponert for medikamentinneholdende medium i 6 timer og postinkubert i medikamentfritt medium i 3 dager. Resultatene er vist i Figur 15. IC50 for fritt APE er 0,26 μg APE/ml, for F5-ILs-APE var 0,756 μg APE/ml og for ikkemålrettet Ls-APE var 51,0 μg APE/ml. Det var en 67,5 fold forskjell i aktivitet mellom målrettet og ikke-målrettet liposomalt 6-APE, hvilket antyder en stor målrettet leveringseffekt.
EKSEMPEL 36. EGFR-målrettede immunliposomale formuleringer av 6-APE og cytotoksisitet mot kreftceller in vitro.
6-APE-fylte liposomer ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 34. EGFR-målrettede immunliposomer ble fremstilt ved binding av EGFR-spesifikke Fab’ antistoffragmenter som følger. Et EGFR-spesifikt IgG MAb C225 (cetuximab, ERBITUX ™, Imclone Systems) ble kuttet med pepsin for å gi (Fab’)2-fragmenter. Rensede (Fab’)2-fragmenter ble redusert ved behandling med 10-20 mM 2-merkaptoetylamin i 15 min ved 37 ºC, og Fab’-fragmenter ble renset ved gelfiltrering ved anvendelse av Sephadex G-25. Nærvær av reaktive tiolgrupper var typisk ca.0,9 tiolgrupper per proteinmolekyl (kvantifisert ved anvendelse av Ellmanns reagens). C225Fab’ ble konjugert kovalent til en amfifil linker Mal-PEG-DSPE (Avanti Polar Lipids, AL) i vandig løsning ved pH 6,2-6,5 og protein-linker molart forhold på 1:4 i 2-4 timer ved romtemperatur eller natten over ved 4-6 ºC, for å produsere C225Fab’-PEG-DSPE konjugat med utbyttet 30-50 % av proteinet. Dette micelledannende konjugatet ble separert fra uomsatt protein ved størrelseseksklusjonskolonnekromatografi på 3 % agarose - 4 % polyakrylamid gel med kuler (Ultrogel AcA34, fremskaffet fra Sigma Chemical Co.), eluert med HBS-6,5 buffer. Konjugatet ble gjenvunnet i dødvolumfraksjoner. Immunliposomalt 6-APE ble dannet ved å inkubere disse liposomene med C225 Fab’-PEG-DSPE med medikamentfylte liposomer ved forhold på 30 mg C225 protein/mmol liposomfosfolipid i 30 min ved 60 ºC, quenching på is i 15 min og rensing av immunliposomene ved gelkromatografi på en Sepharose CL-4B kolonne også eluert med HBS-6,5 buffer (liposomene foreligger i eller nær dødvolumet til kolonnen).
MDA-MB-468 EGFR-overuttrykkende humane brystkreftceller og humane MCF-7 brystkreftceller med lav EGFR-ekspresjon (ATCC, Rockville, MD) ble dyrket i deres leverandøranbefalte vekstmedier, og cytotoksisiteten av fritt, liposomalt og anti-EGFR-immunliposomalt 6-APE mot disse cellene ble studert i henhold til fremgangsmåten ifølge Eksempel 27. Cellene ble inkubert med medikamentinneholdende medier i 6 timer, fulgt av 3 dager post-inkubasjon i det medikamentfrie mediet. Resultatene er vist i Figur 16. I MDA-MB-468 celler var IC50 for fritt 6-APE ca.0,1 μg/ml og for C225-ILs-APE ca.0,9 μg/ml. I MCF-7 celler var IC50 ca.0,1 for fritt 6-APE var ca.0,5 μg/ml og for C225-ILs-APE ca.14 μg/ml. IC50 av Ls-APE i begge cellelinjer var >30 μg/ml. Derfor demonstrerte EGFR-målrettede 6-APE-fylte immunliposomer antigenspesifikk cytotoksisk aktivitet i EGFR-overuttrykkende MDA-MB-468 brystkreftceller, men ikke i MCF-7 brystkreftceller som ikke overuttrykker EGFR. I MCF-7 celler var de målrettede og ikke-målrettede 6-APE-liposomene like aktive.
EKSEMPEL 37. Farmakokinetikk av liposomalt 6-APE i rotter.
Liposomer med omsluttet TEA-Pn løsning (557 mM fosfatgrupper, 500 mM TEA, pH 5,8, osmolalitet 480 mmol/kg) og lipidsammensetning av DSPC, kolesterol og PEG-DSPE (molart forhold 3:2:0,015) ble fremstilt som i Eksempel 11 ovenfor. Etanolløsning av lipidene ble kombinert ved 60 ºC med ti volumer av den vandige TEA-Pn løsningen og ekstrudert ti ganger gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 80 nm. Uinnkapslet TEA-Pn ble fjernet ved anvendelse av en Sepharose CL-4B kolonne eluert med MES-dekstrose (5 mM MES-Na, 5 % dekstrose, pH 5,5). Liposomstørrelsen var 92,3 ± 23,3 nm ved QELS. En ikke-utbyttbar radioaktiv lipidmarkør [<3>H]-CHE ble inkludert i lipidmatriksen ved 0,5 mCi/mmol fosfolipid. Liposomene ble fylt med 6-APE som beskrevet i Eksempel 34.
Farmakokinetikkstudien fulgte protokollen i Eksempel 9. Sim Albinohunnrotter (9 uker, 200 g) ble injisert i.v. ved en dose på 10 mg 6-APE/kg. Blod ble tappet på bestemte tidspunkter og plasmaet ble analysert for 6-APE ved fluorometri. Plasmadelmengder (0,05-0,2 ml) ble blandet med 1-2 ml av 90 % vandig isopropanol-0,1 N HCl, og 6-APE ble kvantifisert ved fluorescens som i Eksempel 71. Lipidet ble kvantifisert ved [<3>H]-CHE scintillasjonstelling.
Resultatene er vist i Figur 17. Halveringstiden (t1/2) i blod av medikamentet var 13,7 timer og av liposomlipidet 16,6 timer (panel A). Halveringstiden av medikamentfrisetting fra liposomer var 77,9 timer, hvilket demonstrerer bemerkelsesverdig innkapslingsstabilitet (panel B).
EKSEMPEL 38. Syntese og liposomal innkapsling av 2-(2-(N,N-dietylamino)etyl)ellipticinium (2-DAE).
2-(2-(N,N-dietylamino)etyl-ellipticiniumklorid (NSC 359449) er et anti-kreft ellipticinderivat som blir fremstilt ved alkylering av ellipticin med 2-(N,N-dietylamino)etylklorid i metanol i nærvær av trietylamin (se Werbel, L. M., Angelo, M., Fry, D. M. og Worth, D. F. J. Med. Chem.1986, 29:1321-1322). Liposomer inneholdende omsluttet TEA-Pn ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 37.2DAE.2HCl ble inkubert med TEA-Pn liposomene i 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 7,4, ved et 2-DAE-til-fosfolipid forhold på 100 μg/μmol. Mengden av fylt medikament var 88,2 μg APE/μmol PL (effektivitet 88,2 %).
EKSEMPEL 39. Farmakokinetikk av liposomalt 2-DAE i rotter.
Farmakokinetikk i blod av liposomalt 2-DAE (Eksempel 38) ble studert i rotter som i Eksempel 37. t1/2 av 2-DAE var 17,8 t og av liposomlipidmatriksen 18,2 t (A). Halveringstiden av medikamentfrisetting fra liposomer i blodet var t1/2 = 677 t (B). Derfor var disse liposomene usedvanlig stabile mot medikamentlekkasje i blodet.
EKSEMPEL 40. Fylling av vinorelbin inn i liposomer ved anvendelse av TEA-Pn metode. Effekt av pH.
Liposomene ble fremstilt ved etanolinjeksjonsmetoden som i Eksempel 11 ved anvendelse av TEA-Pn løsning av 0,608 M TEA, 0,65 M fosfatgrupper, pH 6,1 og osmolalitet 531 mmol/kg og lipidsuspensjonsekstrusjon 15 ganger gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 100 nm. Resulterende liposomstørrelse var 108,3 ± 17,1 nm ved QELS. Vinorelbin (VRB) i form av lagerløsning av vinorelbinbitartrat 10 mg/ml USP ble satt til liposomene i vandig 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5, ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 350 μg/μmol, pH ble justert til den ønskede verdien ved anvendelse av 1-5 N NaOH og blandingen ble inkubert ved 58 ± 2 ºC i 30 min. Blandingen ble deretter avkjølt på is i 15 min, og uinnkapslet medikament ble fjernet ved Sephadex G-75 gelfiltreringskromatografi, ved å eluere med HBS-6,5 buffer (20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5). Delmengder av rensede liposomer ble deretter solubilisert i syreisopropanol og analysert for vinorelbin ved anvendelse av spektrofotometri ved 270 nm. Liposomfosfolipid ble kvantifisert ved anvendelse av fosfatanalysen ifølge Bartlett (1959) etter metanol-kloroform ekstraksjon.
De beregnede medikament-til-lipid forholdene etter fylling var som vist i Tabell 24. Vinorelbinfylling var kvantitativ (dvs. praktisk talt 100 %) og uavhengig av pH i det studerte området.
Tabell 24. Vinorelbinfylling inn i liposomer med omsluttet TEA-Pn ved ulike pH-verdier i ytre buffer
pH Medikament-til-fosfolipid forhold (μg/μmol) Fyllingseffektivitet (%) 4,5 351,2 ± 52,88 100,4 ± 15,2 5,0 347,6 ± 6,35 99,3 ± 1,8 5,75 355,2 ± 11,2 101,5 ± 3,2 6,25 377,0 ± 21,5 107,7 ± 6,6 7,0 374,3 ± 29,58 106,9 ± 9,0
EKSEMPEL 41. Liposomalt vinorelbin fremstilt ved TEA-Pn metode ved ulike medikament/lipid forhold: innkapslingseffektivitet og in vivo-stabilitet i mus.
Liposomer med omsluttet TEA-Pn løsning ble fremstilt i henhold til Eksempel 40, bortsett fra at [<3>H]-CHE ble inkludert i lipidmatriksen ved 1,5 mCi/mmol fosfolipid. Liposomstørrelsen var 98,5 ± 34,3 nm ved QELS. Liposomene ble blandet med vinorelbinbitartrat USP i vandig buffer av 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5 ved medikament-til-fosfolipid forhold på 150-450 mg VRB/mmol og inkubert ved 58 ± 2 ºC i 30 min. Ingen pH-justering ble gjort etter tilsetningen av medikamentet. De vinorelbinfylte liposomene (Ls-VRB) ble isolert og analysert for medikament og fosfolipid som i Eksempel 40.
Fem-seks uker gamle Swiss Webster-hunnmus (Harlan Bioresearch) i grupper på tre ble injisert intravenøst med Ls-VRB-Pn ved en dose på 5 mg VRB/kg. Lipiddosen varierte i henhold til graden av fylling og kan bestemmes fra de ovenfor beregnede medikament-til-lipid forholdene. Ved 8 eller 24 timer etter injeksjon ble dyrene anestesert, avlivet og blodet ble tappet på is over i veide rør inneholdende kjente mengder av PBS med 0,04 % EDTA. Blodcellene ble separert ved sentrifugering, og supernatantene ble analysert for liposomlipid ved [<3>H]-CHE scintillasjonstelling og for vinorelbin ved anvendelse av HPLC som følger. Prøvene ble tilsatt vinblastin (intern standard), ekstrahert med dietyleter, inndampet og restene ble løst i den mobile fasen bestående av vandig 50 mM trietylammoniumacetat (pH 5,5) og acetonitril (58:42 ved volum). Prøvene ble satt på en omvendt fase C18-silikakolonne (Supelco C-18 kolonne, 250 mm x 4 mm i.d., partikkelstørrelse på 5 μm) etter en C-18 forkolonne. Kolonnen ble eluert isokratisk med den mobile fasen ovenfor ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. VRB ble detektert ved anvendelse av en absorbansdetektor på 280 nm. Typiske retensjonstider for VRB og vinblastin (intern standard) var henholdsvis 9,1 min og 7,8 min.
Resultatene er vist i Tabell 25. Fyllingseffektivitet avtok med økning i medikament/lipid forhold, fra praktisk talt 100 % ved 150 mg/mmol til ca.66 % ved 450 mg/mmol. Det ble registrert at tilsetning av vinorelbinbitartrat ved forhold på over 250 mg vinorelbin per mmol fosfolipid forårsaket vesentlig surgjøring av liposomsuspensjonen (pH <4,0) som fører til redusert fyllingseffektivitet. Derfor ble behovet for pH-kontroll i løpet av medikamentfyllingstrinnet stadfestet. Mengder liposommatriks detektert i blodet etter 8 timer var i området 30,4 ± 6,6 % av injisert dose (%id) til 38,6 ± 5,2 %id uten åpenbar relasjon til den absolutte mengden av injisert lipid. Etter 24 timer var fortsatt fra 6,4 %ID til 14,8 %ID av lipidmatriksen detekterbar i blodet. Mengde medikament som forble innkapslet etter 8 timer varierte fra 37 % til 63 %.24 timer etter injeksjon falt imidlertid medikamentnivåene under deteksjonsgrensen for den anvendte analytiske metoden.
Tabell 25. Innkapslingseffektivitet og in vivo-medikamentretensjon av liposomalt vinorelbin fremstilt ved ulike medikament/lipid forhold ved anvendelse av TEA-Pn metode (uten fyllingsbuffer pH-justering).
Medikamentretensjonsdataene er gjennomsnitt ± SD (N=3).
Vinorelbin/fosfolipid forhold % medikament som forblir innkapslet 8 timer etter injeksjon Start, Slutt, Innkapslingsmg/mmol, mg/mmol, effektivitet,
beregnet målt %
150 156 104,0 36,6 ± 4,2
250 238 95,2 56,3 ± 1,3
350 260 74,3 65,9 ± 2,3
450 299 66,4 63,0 ± 4,1 EKSEMPEL 42. Vinorelbinfylling inn i liposomer ved anvendelse av TEA-SOS metode ved ulike medikament/lipid forhold.
TEA-SOS liposomer for medikamentfylling ble fremstilt som i Eksempel 40 bortsett fra at TEA-SOS løsningen med 0,65 M TEA, pH 5,4, osmolalitet 521 mmol/kg ble anvendt i stedet for TEA-Pn løsning, og liposomene ble ekstrudert gjennom polykarbonatmembraner med porestørrelse på 80 nm. Liposomstørrelsen var 86,6 ± 12,9 nm ved QELS. VRB ble satt til liposomene i vandig 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5, ved ulike medikament-til-fosfolipid forhold, og blandingen ble deretter inkubert ved 60 ºC i 30 min. De VRB-fylte liposomene ble deretter isolert og analysert som i Eksempel 40.
De beregnede medikament-til-lipid forholdene i VRB-liposomene er vist i Tabell 26. Bemerkelsesverdig, til forskjell fra polymer anioneassistert fylling, var vinorelbinfylling i liposomene med polyanionisert sukker (sukroseoktasulfat) praktisk talt kvantitativt uavhengig av medikament/lipid forholdet opp til 450 mg VRB/mmol fosfolipid, og bare noe mindre (88 %) ved 550 mg VRB/mmol fosfolipid.
Tabell 26. Avhengighet ved vinorelbinfylling inn i liposomer av medikamenttil-lipid forhold
Vinorelbin/fosfolipid forhold, mg/mmol Fyllingseffektivitet (%) Total Innkapslet inn i liposomer
150 159,9 ± 11,5 106,6 ± 8,1
250 255. ± 12,4 102,2 ± 5,1
350 381,8 ± 16,3 109,1 ± 5,1
450 456,1 ± 29,5 101,4 ± 6,6
550 486,2 ± 26,0 88,4 ± 4,2
EKSEMPEL 43. Fremstilling av HER2-målrettede immunliposomer fylt med vinorelbin ved TEA-Pn metode og komparativ farmakokinetikk i blod av HER2-målrettede og ikke-målrettede vinorelbinliposomer i rotter.
Anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE konjugat ble fremstilt som i Eksempel 19. HER2-målrettede vinorelbinimmunliposomer ble fremstilt ved inkubasjon av ikkemålrettede vinorelbinliposomer (Eksempel 41, fylt ved medikament/fosfolipid forhold ved 350 mg/mmol) med F5-PEG-DSPE konjugat (Eksempel 19) i vandig 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5 buffer ved protein/fosfolipid forhold på 15 mg/mmol ved 60 ºC i 30 min. Uinkorporert F5-konjugat ble fjernet ved gelkromatografi på en Sepharose 4B-kolonne eluert med samme buffer. Ikkemålrettede liposomer (Ls-Pn-VRB) og HER2-målrettede liposomer (F5-ILs-Pn-VRB) ble administrert i.v. til Albino-hunnrotter (8-9 uker gamle; 200 g) ved en dose på 5 mg VRB/kg. Ved ulike tidspunkter ble blod tappet som beskrevet i Eksempel 9 og analysert for VRB og liposomlipid som i Eksempel 41. Blodhalveringstid av liposomlipidene og 50 % medikamentfrisettingstid ble beregnet fra henholdsvis lipidkonsentrasjon-tid plott eller ved medikament/lipid forhold-tid plott, ved å finne beste tilpasning til monoeksponentielle kinetikker ved anvendelse av MICROSOFT EXCEL (Microsoft Corp.) regneark TREND-funksjon. Resultatene (Figur 18) indikerte at både målrettede og ikke-målrettede vinorelbinliposomer hadde identiske medikament- og lipidfarmakokinetikker med lipidhalveringstid på ca.12,1 time og 50 % medikamentfrisettingstid på ca.4,3 time.
EKSEMPEL 44. Fremstilling og komparativ in vivo-stabilitet av vinorelbinliposomer fremstilt ved anvendelse av ammonium og substituerte ammoniumsalter.
Ammoniumdekstransulfat (DS-A) løsning med pH 5,8, 0,65 M NH4<+>, osmolalitet på 390 mmol/kg og trietylammoniumdekstransulfatløsning (DS-TEA) med pH 6,0, 0,65 M NH4<+>, osmolalitet 465 mmol/kg, ble fremstilt fra dekstransulfat med molekylvekt 10.000 (Sigma Chemical Co.) i henhold til fremgangsmåten ifølge Eksempel 4, ved anvendelse av titrering med henholdsvis 12,4 M vandig ammoniakk eller rent trietylamin. Ammoniumsulfat (S-A) vandig løsning 325 mM, pH 5,1, osmolalitet 703 mmol/kg, ble fremstilt fra ammoniumsulfat med analytisk kvalitet. Alle tre løsninger inneholdt mindre enn 1 % Na<+ >av totalt kationeinnhold. Liposomer som omslutter disse løsningene ble fremstilt ved anvendelse av etanolblanding-ekstrusjon metoden ifølge Eksempel 41 (DSPC/kolesterol/PEGDSPE 3:2:0,015 molart forhold). Radioaktiv lipidmarkør [<3>H]-CHE ble inkludert i lipidmatriksen ved 1,5 mCi/mmol fosfolipid. Ekstrusjonstrinn bestod av ti passeringer gjennom to stablede 0,1 μm polykarbonatmembraner. VRB ble satt til liposomene i 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5, ved et medikament-tilfosfolipid forhold på 350 mg/mmol, pH ble justert til 6,5 ved anvendelse av 1 N NaOH, og blandingen ble inkubert ved 58-60 ºC i 30 min. Reaksjonen ble deretter avkjølt på is i 15 min, og uinnkapslet medikament ble fjernet ved anvendelse av Sephadex G-75 gelfiltreringskromatografi, eluert med vandig 20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5. De rensede, vinorelbinfylte liposomene ble analysert for VRB spektrofotometrisk og for fosfolipid ved anvendelse av fosfatanalysen ifølge Bartlett (1959) (se Eksempel 70, 71). Farmakokinetikk i blod av det liposomale lipidet og medikamentet ble studert i rotter som i Eksempel 43.
Resultatene er vist i Figurene 19-20 og i Tabell 27. Liposomer fylt med trietylammoniumdekstransulfat ble sammenlignet med de fylt ved anvendelse av ammoniumsalt av dekstransulfat. De fylt ved anvendelse av trietylammoniumsaltet ble uventet betydelig mer stabile enn de fylt ved anvendelse av ammoniumsalt.
Farmakokinetikk av selve den liposomale bæreren var lik med de tre ulike formuleringene og var således primært avhengig av lipidsammensetningen anvendt. Lekkasje av vinorelbin fra Ls-VRB fylt ved anvendelse av trietylammoniumdekstransulfat var ca. tre ganger saktere enn fra de fylt ved anvendelse av ammoniumdekstransulfat. Liposomene fylt ved anvendelse av ammoniumsulfat hadde den raskeste medikamentlekkasjehastigheten.
Tabell 27. Komparativ in vivo-stabilitet av medikamentinnkapsling inn i liposomer ved anvendelse av omsluttet ammonium og substituert ammoniumsalt.
Formulering, Liposomstr., nm, Halveringstid i Tid før 50 % liposomomsluttet gj.snitt ± SD blod av lipid- medikamentfrisetting salt (ved QELS) matriksen, timer i blodet, timer DS-TEA 120,8 ± 28,5 9,5 ± 3,3 66,3 ± 13,4 DS-A 107,8 ± 15,4 11,2 ± 0,6 22,9 ± 1,7 S-A 114,5 ± 15,6 10,7 ± 0,2 1,77 ± 0,16 EKSEMPEL 45. Fremstilling og in vivo-stabilitet av vinorelbinfylte liposomer av ulik størrelse.
[<3>H]-CHE-merkede liposomer (1,5 mCi/mmol fosfolipid) med omsluttet løsning av trietylammoniumsukroseoktasulfat (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalitet 502 mmol/kg) ble fremstilt ved etanolblanding-ekstrusjon metoden ifølge Eksempel 11.
Ekstrusjonstrinnet inneholdt 15 passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 0,05, 0,08 eller 0,1 μm.
Vinorelbinfylling, isolering av vinorelbinliposomer og liposomkarakterisering fulgte fremgangsmåten ifølge Eksempel 40. Albino-hunnrotter (8-9 uker gamle; 200 g) ble anvendt for å studere liposomstabilitet in vivo. Liposomlipid- og medikamentfarmakokinetikk ble studert i rotter som i Eksempel 43.
Resultatene er vist i Figur 21, 22 og i Tabell 28 nedenfor. Liposomer ekstrudert gjennom 0,05, 0,08 og 0,1 μm polykarbonatfiltre ble sammenlignet og vist å ha lignende medikament- og liposomal bærerfarmakokinetikk, så vel som et lignende omfang av innholdslekkasje. Medikamentfrisettingen fra liposomene i blod ble karakterisert ved 50 % frisettingstider i området av ca. 40-80 timer, godt over 24 timer.
Tabell 28. Karakterisering av vinorelbinliposomer.
Liposomstr., Medikament- Fyllings- Halveringstid i Tid før 50 % nm, gj.snitt ± SD mengde, mg/mmol effektivitet, blod av lipid- medikamentfrisett-(ved QELS) fosfolipid % matriksen, timer ing i blodet, timer 87,6 ± 28,1 352,4 ± 13,9 100,7 ± 4,0 14,6 ± 0,7 39,7 ± 3,1 98,5 ± 15,1 322,6 ± 22,7 92,2 ± 6,5 13,0 ± 0,2 47,9 ± 3,8 109,6 ± 24,6 357,0 ± 10,5 102,0 ± 3,0 14,3 ± 0,3 78,0 ± 1,4
EKSEMPEL 46. Fremstilling av HER2-målrettede vinorelbinliposomer ved anvendelse av TEA-SOS omslutningsmetode og farmakokinetikk av HER2 scFv-målrettet og ikke-målrettet immunliposomalt vinorelbin i rotter.
Liposomer ble fremstilt, fylt med vinorelbin ved 350 mg/mmol medikamentfosfolipid forhold og analysert som beskrevet i Eksempel 43, bortsett fra at TEA-SOS løsning ifølge Eksempel 45 ble substituert for TEA-Pn løsning.
Ekstrusjonstrinn omfattet 15 passeringer gjennom polykarbonatfiltre med porestørrelse på 0,08 μm. Liposomstørrelsen var 95,0 ± 26,0 nm ved QELS.
F5scFv-koblede anti-HER2 vinorelbinimmunliposomer ble fremstilt fra disse vinorelbinliposomene, og farmakokinetikk i blod av det liposomale lipidet og medikamentet av HER2-målrettet og ikke-målrettet vinorelbinliposom ble studert i rotter som beskrevet i Eksempel 43. Sirkulasjonshalveringstid av liposomlipidet var 11,4 timer og 10,3 timer, og 50 % medikamentfrisettingstid var 30,9 timer og 30,3 timer for henholdsvis F5-ILs-VRB og Ls-VRB. Derfor var lipid- og medikamentfarmakokinetikk av Ls-VRB og F5-ILs-VRB veldig like, hvilket antyder at innføring av scFv-PEG-DSPE konjugatet verken affiserte clearance av selve bæreren eller resulterte i økt lekkasje av medikamentet fra bæreren mens i sirkulasjon (Figur 23, 24).
EKSEMPEL 47. Fremstilling og farmakokinetiske egenskaper til vinorelbinliposomer omfattende ikke-ioniske lipidderivater av poly(etylenglykol).
Metoksy-PEG (molekylvekt 2.000)-derivat av syntetisk C20-ceramid (PEG-ceramid) ble fremskaffet fra Northern Lipids, Inc., Canada. Metoksy-PEG(molekylvekt 2.000)-distearoylglyserol (PEG-DSG) (SUNBRIGHT GS20) var fra NOF Corp., Japan.
Liposomer som har lipidsammensetning av DSPC, kolesterol og PEG-lipid (PEG-ceramid eller PEG-DSG) i molart forhold på 3:2:0,3 og omsluttet TEA-SOS løsning (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalitet 502 mmol/kg) ble fremstilt ved etanolblanding/ekstrusjon metoden ifølge Eksempel 11. Ekstrusjonstrinnet omfattet to passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembranfiltre to ganger ved anvendelse av porestørrelse 0,2 μm og ti ganger ved anvendelse av 0,08 μm porestørrelse. Liposomene ble fylt med vinorelbin ved medikament/fosfolipid forholdet på 350 mg/mmol, karakterisert ved størrelse, medikament og lipidkonsentrasjon, og deres farmakokinetikk ble studert i rotter som i Eksempel 46. Begge formuleringer viste forlenget sirkulasjonstid av lipidmatriksen og sakte frisetting av medikamentet in vivo, der minst 50 % av medikamentet forble innkapslet etter 24 timer i blodet in vivo, som vist i Tabell 29 nedenfor.
Tabell 29. Karakterisering av vinorelbinliposomer med ulike PEG-lipider.
PEG-lipid Liposomstr., Medikament- Fyllings- Halveringstid i Tid før 50 % nm, gj.snitt ± mengde, effektivitet, blod av lipid- medikament-SD (ved mg/mmol % matriksen, timer frisetting i QELS) fosfolipid blodet, timer PEG-ceramid 103,3 ± 30,9 291,4 ± 18,0 83,26 ± 5,14 14,0 102,7 PEG-DSG 101,3 ± 20,1 359,3 ± 7,2 102,7 ± 2,1 15,1 24,6
Bemerkelsesverdig hadde den økte PEGyleringen av disse liposomene (PEG-lipidinnhold ca.5,7 molprosent av totalt lipid) praktisk talt ingen effekt på liposomlevetiden i blodsirkulasjonen sammenlignet med lignende, størrelsesmatchede liposomer som har lav PEGylering på ca.0,3 molprosent av totalt lipid (Eksempel 45, 109,6 nm, t1/2=14,3 timer; 98,5 nm, t1/2=13,0 timer).
EKSEMPEL 48. Fremstilling av HER2-målrettet liposomalt vinorelbin og cytotoksisitet av fritt, HER2-målrettet og ikke-målrettet liposomalt vinorelbin mot MDA-MB-453 celler in vitro.
Vinorelbinfylte liposomer (Ls-VRB) ble fremstilt som i Eksempel 42 (uten [<3>H]-CHE) ved anvendelse av medikamentfylling ved pH 6,0 og 350 μg vinorelbin/μmol fosfolipid. Anti-HER2 immunliposomalt vinorelbin (F5-ILs-VRB) ble dannet ved å inkubere disse liposomene med F5-PEG-DSPE konjugat som beskrevet i Eksempel 19 og 42 ovenfor, bortsett fra at [<3>H]-CHE ikke var tilsatt. ”Fritt” vinorelbin ble fremstilt ved fortynning av 10 mg/ml vinorelbinbitartratløsning USP i celledyrkningsmediet.
MDA-MB-453 er humane brystadenokarsinomceller (American Type Culture Collection, Rockville, MD) som overuttrykker HER2-reseptor (ca.3x10<4 >til 1x10<5 >kopier/celle) moderat. Cytotoksisitet av VRB levert som det frie medikamentet, som ikke-målrettet liposomalt vinorelbin eller som HER2-målrettet (F5)immunliposomalt vinorelbin mot MDA-MB-453 celler ble bestemt som beskrevet i Eksempel 27, bortsett fra at cellene ble platet i 96-brønners mikrotiterplater under leverandøranbefalte vekstbetingelser (Leibowitz L-15 med 10 % føtalt kalveserum, ingen CO2-tilskudd) ved en tetthet på 10.000 celler/brønn, og medikamentformuleringene ble tilsatt i en serie av 1:3 trinnvise fortynninger som starter med 0,03-0,1 mg/ml. Celleviabilitetsdata ble plottet mot medikamentkonsentrasjon (Figur 25) og medikamentkonsentrasjoner nødvendig for å redusere celleviabiliteten til 50 % (IC50) ble estimert fra grafene. IC50 av F5-målrettet vinorelbinliposom (0,06 μg/ml) var nær den til det frie medikamentet (0,07 μg/ml) og vesentlig lavere enn den til ikke-målrettede liposomer (2,2 μg/ml). Dette representerer en 37-fold økning i aktivitet som et resultat av kreftcellespesifikk målrettet levering av medikamentet.
EKSEMPEL 49. Cytotoksisitet av fritt, HER2-målrettet og ikke-målrettet liposomalt vinorelbin mot CaLu-3 celler in vitro.
Liposomene og fremgangsmåtene ifølge det tidligere eksemplet (Eksempel 48) ble anvendt for å studere cytotoksisitet av fritt vinorelbin, Ls-VRB og F5-ILs-VRB i HER2-overuttrykkende humane ikke-småcellede lungekarsinomceller CaLu-3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Cellene ble dyrket i RPMI-1460 medium med 10 % føtalt kalveserum i nærvær av 5 % CO2. Resultatene er vist i Figur 26. IC50 for fritt VRB var 1,2 μg/ml, 10 μg/ml for F5-ILs-VRB og 50 μg/ml for ikke-målrettet Ls-VRB. Dette representerer en 5-fold forsterkning i liposominnkapslet medikamentaktivitet som en funksjon av målrettet levering til cellene.
EKSEMPEL 50. Cytotoksisitet av fritt, HER2-målrettet og ikke-målrettet liposomalt vinorelbin mot SKBr-3 celler in vitro.
Liposomene og fremgangsmåtene ifølge Eksempel 48 og det ble anvendt for å studere cytotoksisitet av fritt vinorelbin, Ls-VRB og F5-ILs-VRB i HER2-overuttrykkende humane brystkarsinomceller SKBr-3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD), bortsett fra at cellene ble dyrket i det modifiserte McCoy 5A-mediet med 10 % føtalt kalveserum i nærvær av 5 % CO2, tilsatt ved en tetthet på 5.000 celler/brønn, og medikamentet ble inkubert med cellene i 6 timer.
Resultatene er vist i Figur 27. IC50 for fritt VRB var 0,28 μg/ml, 0,17 μg/ml for F5-ILs-VRB og 0,8 μg/ml for ikke-målrettet Ls-VRB. Dette representerer en 4,7-fold forsterkning i medikamentaktivitet som en funksjon av målrettet levering.
EKSEMPEL 51. In vivo-antitumoreffektivitet av liposomalt vinorelbin i HT29 humane kolonkreftxenotransplantater i mus.
Små unilamellære vesikkelliposomer (93,2 ± 26,4 nm ved QELS) ble fremstilt fra distearoylfosfatidylkolin, kolesterol og PEG-DSPE (3:2:0,045 molart forhold) ved hydrering fra en konsentrert etanolløsning i en vandig løsning av trietylammoniumsukroseoktasulfat (0,6 M trietylammonium, pH 5,7-6,2), fulgt av repetert ekstrusjon gjennom polykarbonatmembraner (100 nm porestørrelse), fjerning av ekstraliposomalt polyanionisk salt og fylling med vinorelbin ved inkubasjon med liposomene i isoosmotisk buffer pH 6,5, medikament/lipid forhold på 325 mg VRB/mmol fosfolipid, ved 60 ºC som beskrevet i Eksempel 42.
BALB/c homozygote nakne hunnmus (6-8 uker, som veier 17-20 g) ble injisert subkutant i flankeområdet med 1x10<6 >av HT-29 humane kolonkarsinomceller (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Med start på dag 16 etter tumorinokulasjon, når gjennomsnittlig tumordiameter nådde 5-8 mm, ble musene tilfeldig fordelt inn i tre grupper med seks dyr hver og behandlet med fritt eller liposomalt vinorelbin ved en dose på 5 mg/kg gjennom halevenen hver tredje dag i totalt fire injeksjoner. For kontrollgruppen ble mus behandlet med et like stort volum av saltløsning. Tumorstørrelsen til hver mus ble målt ved anvendelse av en krumpasser og tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen: (tumorlengde) x (tumorbredde)<2>/2. For å vurdere behandlingsrelatert toksisitet, ble dyrene også veid to ganger ukentlig. Liposomalt vinorelbin ble vist å være betydelig mer effektiv i suppresjon av veksten av HT-29 tumorer enn fritt vinorelbin og forårsaker tilbakegang av tumorer, mens tumorene i gruppen med fritt medikament alltid fortsatte å vokse (Figur 28). Det var liten forandring i dyrenes kroppsvekt i løpet av behandlingsforløpet, hvilket antyder at behandlingen ble godt tolerert og at liposomalisering ikke økte medikamenttoksisiteten (Figur 29).
EKSEMPEL 52. In vivo-antitumoreffektivitet av liposomalt vinorelbin mot C-26 syngene murine kolonkrefttumorer.
Liposomalt vinorelbin og fritt vinorelbin ble fremstilt som i Eksempel 48. BALB/c hannmus (6-8 uker, som veier 17-20 g) ble inokulert subkutant med 2x10<5 >av C-26 murine kolonkarsinomceller. Ved dag 17 etter inokulasjon, når gjennomsnittlig tumordiameter nådde 5-8 mm, ble mus tilfeldig fordelt inn i seks behandlingsgrupper på fem dyr/gruppe. De tumorbærende musene ble injisert gjennom halevenen med fritt vinorelbin ved 6 mg/kg, 8 mg/kg eller 12 mg/kg og med liposomalt vinorelbin ved 4 mg/kg eller 6 mg/kg hver tredje dag i totalt fire injeksjoner. For kontrollgruppen ble mus injisert med like stort volum av normal saltløsning. Tumorstørrelser og kroppsvekter ble fulgt som i Eksempel 51.
Liposomalt vinorelbin, selv ved 4 mg/kg, var betydelig mer effektiv til å redusere tumorveksten enn fritt medikament ved 12 mg/kg (Figur 30). Kroppsvekter i behandlingsforløpet viste liten forandring (<10 % reduksjon), hvilket antyder at toksisiteten til liposomalt vinorelbin ikke var økt sammenlignet med den til fritt medikament (Figur 31).
EKSEMPEL 53. In vivo-antitumoreffektivitet av HER2-målrettet liposomalt vinorelbin mot BT-474 humane brystkreftxenotransplantattumorer i mus: effekt av fylling av motion.
VRB-fylte liposomer 99,5 ± 10,2 nm i størrelse ble fremstilt henholdsvis ved TEA-Pn metoden ifølge Eksempel 41 og TEA-SOS metoden ifølge Eksempel 42, bortsett fra at [<3>H]-CHE ikke ble tilsatt. VRB ble fylt ved medikament/fosfolipid forholdet på 350 mg/mmol. HER2-målrettet liposomalt vinorelbin ble dannet ved å inkubere disse liposomene med F5-PEG-DSPE konjugat (se Eksempel 19) som beskrevet i Eksempel 43. Humane BT-474 HER2-overuttrykkende brystkarsinomxenotransplantater fikk vokse i homozygote nakne mus som i Eksempel 10. Ved dag 25 etter tumorcelleinokulasjon, når tumorene nådde ca.
200 mm<3 >i størrelse (område 144-309 mm<3>), ble musene randomisert til fire grupper med åtte dyr/gruppe og behandlet i.v. med 5 mg/kg av fritt VRB, F5-ILs-VRB med Pn som et motion eller F5-ILs-VRB med SOS som et motion, ved en dose på 5 mg/kg ukentlig i totalt tre injeksjoner. Kontrollgruppen mottok like stort volum av normal saltløsning. Tumorer og kroppsvekter ble monitorert som i Eksempel 10. HER2-målrettet liposomalt vinorelbin fylt ved anvendelse av sukroseoktasulfat var bemerkelsesverdig mer effektiv til å redusere tumorvekst enn samme målrettede konstruksjon fylt ved anvendelse av poly(fosfat), og begge immunliposomale fremstillinger var betydelig mer effektive enn fritt vinorelbin når administrert ved en dose på 5 mg VRB/kg (Figur 32). De medikamentbehandlede musene demonstrerte liten forandring i vekt, hvilket antyder at behandlingen ble godt tolerert (Figur 33).
EKSEMPEL 54. In vivo-antitumoreffektivitet av HER2-målrettet liposomalt vinorelbin mot BT-474 humane brystkreftxenotransplantattumorer i mus: effekt av PEGylering.
Liposomene av DSPC og kolesterol i molart forhold 3:2 ble fremstilt i henhold til Eksempel 48 ved hydrering av lipidmatriksen av DSPC, kolesterol og PEG-distearoylglyserol med PEG-molekylvekt 2.000 (GS-20, NOF Corp., Japan) ved et molart forhold 3:2:0,015 (”0,5%PEG”) eller 3:2:0,3 (”10%PEG”) via etanolløsningmetode i et vandig trietylammoniumsukroseoktasulfat, fulgt av membranekstrusjon i henhold til Eksempel 48. VRB ble fylt inn i liposomene ved medikament/fosfolipid forholdet på 350 mg/mmol. F5 immunliposomalt vinorelbin ble dannet ved å inkubere disse liposomene med F5-PEG-DSPE konjugat (Eksempel 19) som beskrevet i Eksempel 43. Nakne mus med BT-474 xenotransplantater ble fremskaffet og behandlet i.v. med fritt VRB, F5-ILs-VRB-”0,5%PEG” eller F5-ILs-VRB-”10%PEG” ved 5 mg/kg som i Eksempel 53. Som vist i Figur 34, var F5-ILs-VRB med høyere PEGylering fremskaffet med et ikkeionisk PEG-lipid derivat PEG-DSG bemerkelsesverdig mer effektiv til å redusere tumorvekst enn F5-ILs-VRB med lavere mengde av PEG-DSG, mens begge fremstillinger var mer aktive enn det frie medikamentet.
EKSEMPEL 55. In vivo-antitumoreffektivitet av EGFR-målrettet liposomalt vinorelbin mot humane U87-hjernekreftxenotransplantattumorer i mus.
Liposomene (86,6 ± 12,9 nm i størrelse ved QELS) med innkapslet 0,65 M TEA-SOS løsning ble fremstilt og fylt med VRB i henhold til Eksempel 42. Anti-EGFR-immunliposomalt VRB (C225Fab’-ILs-VRB) ble fremstilt ved inkubasjon av VRB-liposomer med PEG-DSPE konjugatet av et anti-EGFR antistoff Fab’-fragmenter som beskrevet i Eksempel 36.
NCR nu/nu hannmus (5-6 uker, som veier 17-20 g) ble injisert subkutant i flankeområdet med 1x10<7 >av humane U87-glioblastomceller (ATCC) suspendert i vekstmediet i et totalvolum på 150 μl. Når tumoren nådde en gjennomsnittsstørrelse på 250 mm<3>, ble musene tilfeldig fordelt inn i fire grupper på 10-12 dyr. Musene ble behandlet med tre ukentlige i.v. injeksjoner av ”fritt” VRB, ikke-målrettet Ls-VRB eller C225Fab’-ILs-VRB ved en dose på 5 mg VRB/kg. Kontrollgruppen mottok et like stort volum av saltløsning. Tumorstørrelser og kroppsvekter ble monitorert som i Eksempel 10. C225-Fab’-ILs-VRB var bemerkelsesverdig mer effektiv til å undertrykke veksten av EGFR-overuttrykkende humane hjernekreftxenotransplantattumorer enn ikke-målrettet liposomalt vinorelbin eller fritt vinorelbin ved en lik dose (Figur 35).
EKSEMPEL 56. Fremstilling og farmakokinetikk av doksorubicin innkapslet i liposomene ved anvendelse av trietylammoniumsulfatmetode.
Liposomer med ulik lipidmatrikssammensetning (som angitt i tabellen nedenfor) ble dannet som beskrevet i Eksempel 2. N-Glutaryl-DSPE (Glu-DSPE) var fra Avanti Polar Lipids, AL, USA. En ren lipidfilm ble dannet fra lipidløsningen i kloroform ved anvendelse av rotasjonsfordampning, spor av volatiler ble fjernet under vakuum (90 μm Hg, 2 timer), lipidfilmen ble hydrert i en trietylammoniumsulfat (TEA-SO4)-løsning (0,65 N TEA), underkastet seks sykluser med rask frysing og tining og ekstrudert gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 0,1 μm ti ganger og gjennom to stablede polykarbonatfiltre med porestørrelse på 0,05 μm ti ganger. For lipidmatrikskvantifisering i blodprøvene ble [<3>H]-CHE inkludert i lipidmatriksen ved 0,5-1,5 mCi/mmol fosfolipid. Liposomene med omsluttet TEA-SO4 løsning ble fylt med doksorubicin i henhold til Eksempel 2. Liposomene i HEPES-bufret saltløsning (20 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5) ble inkubert med doksorubicinhydroklorid (medikament/fosfolipid forhold på 140-170 mg/mmol) ved 60 ºC i 45 min fulgt av quenching på is og fjerning av uinnkapslet doksorubicin ved gelkromatografi.
Doksorubicin ble analysert ved spektrofotometri (Eksempel 71) og fosfolipid ble analysert ved Bartlett-metode (Eksempel 70). Egenskapene til resulterende liposomer er oppsummert i Tabell 30 nedenfor.
Tabell 30. Egenskaper av liposomalt doksorubicin ved ulike lipidsammensetninger.
Lipidsammensetning Liposomstørrelse, nm medikament/fosfolipid (molart forhold) (gj.snitt ± SD ved QELS) (mg/mmol) DSPC/Kol/PEG-DSPE 81,8 ± 27,3 163,6 ± 4,4 (3:2:0,015)
DSPC/Kol 79,1 ± 27,9 137,0 ± 17,5 (3:2)
DSPC/Kol/Glu-DSPE 83,6 ± 27,2 141,7 ± 10,4 (2,85:2:0,15)
DSPC/Kol/PEG-DSPE 83,7 ± 23,1 175,0 ± 6,8 (2,7:2:0,3)
Farmakokinetikk i blod av disse doksorubicininneholdende liposomene som har lipidsammensetning av DSPC/Kol/PEG-DSPE 2,7:2:0,3 ble studert i rotter ved en enkel i.v. dose på 5 mg doksorubicin/kg som beskrevet i Eksempel 9. Liposomene sirkulerte lenge (halveringstid på ca.28 timer) (Figur 36). Det stabile doksorubicintil-fosfolipid forholdet indikerte at formuleringen var påfallende stabil mot medikamentlekkasje i sirkulasjonen, ved å miste mindre enn 25 % av medikamentet over en 48-timers tidsperiode.
EKSEMPEL 57. Doksorubicinfylte liposomer og anti-HER2 immunliposomer fremstilt ved TEA-sulfat metode: fremstilling og in vivo-antitumoreffektivitet mot HER2-overuttrykkende humane brystkreftxenotransplantater.
Doksorubicinfylte liposomer som har ulike lipidsammensetninger og egenskaper (nevnt i tabellen nedenfor) ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 56.
Doksorubicinfylte anti-HER2 immunliposomer ble fremstilt fra doksorubicinfylte liposomer ved saminkubering med anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE konjugat (ca.
30 scFv/liposom) som beskrevet i Eksempel 19. NCR nu/nu mus som bærer det subkutane humane brysttumorxenotransplantatet (BT-474) ble fremskaffet, behandlet (i grupper på 10-12 dyr) med liposomalt eller anti-HER2 immunliposomalt doksorubicin ved en dose på 5 mg/kg én gang ukentlig i totalt tre uker når tumorene nådde en gjennomsnittlig størrelse på 200 mm<3>, og tumorprogresjon og kroppsvekter ble monitorert som beskrevet i Eksempel 29. For ikke-målrettede doksorubicinliposomformuleringer ble lipidsammensetningene inneholdende ingen PEG-DSPE, 0,5 molprosent PEG-DSPE eller 10 molprosent PEG-DSPE studert; for F5-immunliposomalt doksorubicin ble formuleringene med 0,5 molprosent PEG-DSPE og 10 molprosent PEG-DSPE studert (her er mengden av PEG-DSPE uttrykt som molprosent av liposomfosfolipid). Resultatene (Figur 37, Tabell 31) demonstrerte at alle doksorubicinbehandlinger var effektive til å bremse tumorveksten. På grunnlag av tumorstørrelser på dag 53 etter inokulasjon var ikke forskjellene i tumorveksthemning mellom alle tre ikke-målrettede liposomgrupper statistisk signifikante (ANOVA p=0,081), men doksorubicinimmunliposom var signifikant mer effektiv enn ikke-målrettet liposomalt doksorubicin (ANOVA p=5,5x10<-10>), der ”10%PEG-DSPE” formuleringen er mer effektiv enn ”0,5%PEG-DSPE” (Students t-test, p=0,027). I ”10%PEG-DSPE” F5-ILs gruppen avtok tumorene til 1 mm<3 >eller mindre i 67 % av dyrene, mens i ”0,5%PEG-DSPE” F5-ILs gruppen bare i 9 %. I kontrollgruppen (saltløsningsbehandling) passerte tumorene det akseptable størrelsesnivået på 15 % kroppsvekt ved dag 38-43.
Tabell 31. Antitumoreffektivitetsstudie av liposomalt doksorubicin in vivo: liposomkarakteristika og behandlingsresultater.
Lipidsammensetning Liposom- Medikament/ Gjennomsnittlig størrelse, nm fosfolipid forhold, tumorstr. (gj.snitt ± SD) mg/mmol på dag 58, mm<3>
(gj.snitt ± SD) (gj.snitt ± SEM) DSPC/Kol/PEG-DSPE 83,4 ± 23,3 136,7 ± 6,7 490 ± 74 (3:2:0,015)
DSPC/Kol 80,5 ± 26,6 151,2 ± 1,9 587 ± 61 (3:2)
DSPC/Kol/PEG-DSPE 81,0 ± 24,7 140,1 ± 4,2 365 ± 60 (2,7:2:0,3)
DSPC/Kol/PEG-DSPE ikke målt 140,7 ± 2,8 119 ± 39 (3:2:0,015)
+ F5 scFv-PEG-DSPE
DSPC/Kol/PEG-DSPE ikke målt 132,9 ± 2,2 15,5 ± 7,6 (2,7:2:0,3)
+ F5 scFv-PEG-DSPE
EKSEMPEL 58. Fremstilling av liposomalt vinblastin og farmakokinetikk i blod av liposomalt vinblastin i rotter.
Liposomer med omsluttet vandig TEA-SOS løsning (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalitet 502 mmol/kg) og størrelse 99,5 ± 10,2 nm (gjennomsnitt ± SD ved QELS) ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 11 ved anvendelse av ekstrusjon to ganger gjennom to stablede 0,2 μm polykarbonatmembraner og ti ganger gjennom to stablede 0,08 μm polykarbonatmembraner. Vinblastin (VBL) i form av vinblastinsulfat USP ble tilsatt ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 150 mg/mmol. pH til medikament-liposom blandingen ble justert til 6,5 ved anvendelse av 1 N NaOH, og blandingen ble deretter inkubert ved 60 ºC i 30 min. Reaksjonen ble så avkjølt på is i 15 min, og uinnkapslet medikament fjernet ved anvendelse av Sephadex G-75 gelfiltreringskromatografi, eluert med 5 mM HEPES-Na, 135 mM NaCl, pH 6,5. De rensede liposomene ble deretter analysert for VBL spektrofotometrisk og for fosfolipid ved Bartlett-metode som i Eksempel 70 og 71. [<3>H]-CHE ble inkludert i formuleringen ved et forhold på 1,5 mCi/mmol fosfolipid. Liposomalt vinblastin hadde 152,4 ± 12,0 mg VBL/mmol fosfolipid (kvantitativ innkapsling).
Farmakokinetikk i blod av liposomalt vinblastin i Albino-hunnrotter (8-9 uker gamle; 200 g) ved en dose på 5 mg VBL/kg ble studert som beskrevet i Eksempel 9. Vinblastin ble kvantifisert i blodplasmaprøver som beskrevet i Eksempel 41 (ved anvendelse av vinorelbin som intern standard). Vinblastinliposomer viste god sirkulasjonslevetid (plasmahalveringstid av lipidkomponenten 12,8 ± 0,04 timer) (Figur 38) og veldig god stabilitet mot medikamentlekkasje fra liposomene med mer enn 70 % av den opprinnelige vinblastinmengden som forble innkapslet etter 24 timer (Figur 39). Post-injeksjonstiden for å oppnå frisetting av 50 % av det innkapslede medikamentet ble funnet å være 40,6 ± 1,2 timer.
EKSEMPEL 59. Fremstilling av liposomer fylt med vinkristin ved anvendelse av TEA-SOS metode og effekt av pH på fyllingseffektiviteten.
Liposomer med størrelse på 86,6 ± 12,9 nm (ved QELS), lipidsammensetning av DSPC/Kol/PEG-DSPE i molart forhold på 3:2:0,015 og omsluttet vandig TEA-SOS løsning (0,65 M TEA, pH 5,4, osmolalitet 521 mmol/kg) ble fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 11 ved anvendelse av ekstrusjonstrinn på 15 passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 0,08 μm. Vinkristin (VCR) ble satt til liposomene i 5 mM HEPES-Na, vandig 5 % dekstrosebuffer, pH 6,5, som vinkristinsulfat ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 350 μg vinkristin/μmol fosfolipid, pH ble justert til det angitte forholdet ved anvendelse av 1 N NaOH, blandingen ble inkubert ved 60 ºC i 30 min, avkjølt på is i 15 min og liposomene ble separert fra uinnkapslet medikament ved anvendelse av Sephadex G-75 gelfiltreringskromatografi, eluert med HBS-6,5 (20 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 6,5). De rensede liposomene ble deretter analysert for vinkristin ved spektrofotometri ved anvendelse av absorbans ved 265 nm etter solubilisering i syreisopropanol og for fosfolipidinnhold ved anvendelse av fosfatanalysen ifølge Bartlett (1959).
Resultatene er vist nedenfor i Tabell 32. Medikamentfyllingen overgikk 90 % i området av pH 4,5-7,5 og var praktisk talt kvantitativ ved pH 5,0-7,5. Ved pH 3,5, som er pH observert i liposomblandingen etter tilsetning av medikamentet, men uten pH-justering, var fyllingen betydelig lavere.
Tabell 32. pH-avhengighet av vinkristinfylling inn i liposomer med omsluttet TEA-SOS.
pH Medikament/fosfolipid forhold, μg/μmol Fyllingseffektivitet (%) 3,5 39,7 ± 4,9 11,3 ± 0,2
4,5 327,2 ± 20,6 93,5 ± 5,4
5,0 360,6 ± 5,8 103,0 ± 1,7
5,5 371,2 ± 30,2 106,1 ± 9,1
6,0 347,7 ± 20,4 99,3 ± 5,8
6,5 347,7 ± 20,9 99,4 ± 5,9
7,0 377,3 ± 22,2 107,8 ± 6,8
7,5 371,5 ± 24,9 106,1 ± 7,6
EKSEMPEL 60. Fremstilling av liposomer fylt med vinkristin ved anvendelse av TEA-SOS metode: effekt av medikament/lipid forholdet på fyllingseffektiviteten.
SOS-TEA-inneholdende liposomer ble fremstilt som i Eksempel 59 og fylt med vinkristinsulfat ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 150-550 μg vinkristin/μmol fosfolipid ved pH 6,5 i henhold til prosedyren ifølge Eksempel 59. Liposomene renset fra uinnkapslet medikament ble deretter analysert for VCR ved spektrofotometri og for liposomfosfolipidet ved anvendelse av analysen ifølge Bartlett (1959). Medikamentfyllingseffektiviteten overgikk 90 % over hele det studerte området av medikament/lipid forhold og var praktisk talt kvantitativ mellom 150-450 μg vinkristin/μmol fosfolipid (Tabell 33).
Tabell 33. Vinkristinfylling inn i liposomer inneholdende TEA-SOS ved ulike medikament-til-lipid forhold.
Start medikament-til- Innkapslet medikament- Fyllingseffektivitet fosfolipid (μg/μmol) til-fosfolipid (μg/μmol) (%)
150 163,6 ± 6,6 109,0 ± 4,8 250 251,1 ± 17,0 100,5 ± 6,8
350 347,7 ± 20,9 99,4 ± 5,9
450 452,0 ± 18,8 100,4 ± 4,2
550 521,6 ± 24,9 94,8 ± 4,3
EKSEMPEL 61. Fremstilling av immunliposomalt vinkristin og cytotoksisitet av liposomalt og immunliposomalt vinkristin mot kreftceller in vitro.
Liposomalt vinkristin (Ls-VCR) ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 59 ved anvendelse av medikament/fosfolipid forholdet på 350 mg/mmol. HER2-spesifikt F5-immunliposomalt vinkristin (F5-ILs-VCR) ble fremstilt fra liposomalt vinkristin ved saminkubering med anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE konjugat som beskrevet i Eksempel 19. Løsning av ”fritt” vinkristin (VCR) ble fremstilt ved fortynning av vinkristinsulfat USP i vann, fulgt av sterilfiltrering. Cytotoksisitet av VCR, Ls-VCR og F5-ILs-VCR mot HER2-overuttrykkende humane brystkarsinomceller SKBr-3 (ATCC) ble bestemt ved MTT-basert celleviabilitetsanalyse ved anvendelse av prosedyren ifølge Eksempel 27, der cellene ble inokulert til 96-brønners mikrotiterplater ved 5.000 celler/brønn, akklimatisert natten over og inkubert med de medikamentinneholdende mediene i 4 timer, fulgt av post-inkubasjon i et medikamentfritt medium i 3 dager. Resultatene er vist i Figur 40. IC50 var 75 ng/ml for fritt VCR, 11 ng/ml for F5-ILs-VCR og 3 μg/ml for Ls-VCR. Målrettet liposomalt vinkristin fremstilt ifølge oppfinnelsen var 6,8 ganger mer aktiv enn det frie medikamentet og 273 ganger mer aktiv enn ikke-målrettet liposomalt medikament, hvilket viser vesentlig økning i antikreftaktivitet som en funksjon av cellespesifikk medikamentlevering.
EKSEMPEL 62. Farmakokinetikk i blod av Ls-VCR i rotter.
Liposomer med omsluttet SOS-TEA løsning (0,65 M TEA, pH 5,8, osmolalitet 530 mmol/kg) og lipidsammensetning av DSPC/Kol/PEG-DSPE (molart forhold 3:2:0,015), også inneholdende [<3>H]-CHE ved 1,5 mCi/mmol fosfolipid, ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 11 ved anvendelse av ekstrusjonstrinn på ti passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 80 nm eller 100 nm. Liposomene ble fylt med VCR ved pH 6,5, medikament/fosfolipid forhold på 350 mg/mmol, som beskrevet i Eksempel 59. De VCR-fylte liposomene ble administrert i.v. til albino-hunnrotter (180-220 g) ved en dose på 5 mg VCR/kg, og farmakokinetikk i blodet av medikamentet og liposomlipidet ble studert som beskrevet i Eksempel 9. VCR-mengden i blodprøvene ble kvantifisert ved HPLC som beskrevet i Eksempel 41, bortsett fra at volumforholdet av vandig trietylammoniumacetat (pH 5,5) og acetonitril i den mobile fasen var 65:35. Typisk retensjonstid for VCR var 8,8 min. Resultatene er vist i Figur 41 og Tabell 34. Begge fremstillinger hadde omfattende sirkulasjonslevetid (blodhalveringstider på 12-17 timer). Liposomalt vinkristin var påfallende stabil mot medikamentlekkasje i begge fremstillinger (halv-frisettingstid over 120 timer) (Figur 42).
Tabell 34. Egenskaper til liposomer fylt med vinkristin ved 350 mg/mmol fosfolipid ved anvendelse av TEA-SOS metode.
Ekstrusjons- Liposom- Medikament- t1/2β lipid, t1/2β VCR, t1/2 VCR-porestørrelse, størrelse, nm mengde, timer timer frisetting, nm (gj.snitt ± SD) mg/mmol timer fosfolipid
80 101,2 ± 20,2 347,7 ± 20,93 17,5 ± 1,5 16,0 ± 2,0 >120 100 125,6 ± 32,0 366,8 ± 18,11 12,1 ± 0,7 12,0 ± 0,8 Ikke detekterbar
EKSEMPEL 63. Farmakokinetikk i blod av Ls-VCR i rotter ved ulike medikament/lipid forhold.
Liposomer med omsluttet SOS-TEA løsning (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalitet 485 mmol/kg) og lipidsammensetning av DSPC/Kol/PEG-DSPE (molart forhold
3:2:0,015), også inneholdende [<3>H]-CHE ved 1,5 mCi/mmol fosfolipid, ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 11 ved anvendelse av ekstrusjonstrinn på ti passeringer gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på
50 nm eller 80 nm. Liposomene ble fylt med VCR ved pH 6,5 som beskrevet i Eksempel 59 ved å tilsette en 20 mg/ml vandig VCR-sulfatlagerløsning ved de beregnede medikament/lipid forholdene på 100, 200 eller 350 mg/mmol fosfolipid.
Effektiviteten av medikamentfylling var over 96 % for alle fremstillinger. De VCR-fylte liposomene ble administrert i.v. til albino-hunnrotter (8-9 uker gamle, 190-220 g) ved en dose på 5 mg VCR/kg, og farmakokinetikk i blod av medikamentet og liposomlipidet ble studert som beskrevet i Eksempel 62. Resultatene er vist i
Tabell 35. Liposomalt vinkristin hadde god sirkulasjonslevetid (blodhalveringstid av medikamentet ca.20-30 timer) og var ualminnelig stabil ved alle studerte
størrelser og medikament-til-lipid forhold (halveringstid på medikamentfrisetting
over 93 timer).
Tabell 35. Egenskaper av liposomer fylt med vinkristin ved anvendelse av
TEA-SOS metode ved ulike medikament/lipid forhold.
Ekstrusjons- Liposom- VCR, mg/mmol t1/2 lipid, t1/2 VCR, t1/2 porestørrelse, størrelse, nm fosfolipid timer timer medikamentnm (gj.snitt ± SD) frisetting, timer tilsatt innkapslet
50 76,8 ± 27,2 100 96,1 ± 3,0 35,6 ± 2,7 30,3 ± 4,0 227 ± 96
200 193,3 ± 3,9 20,8 ± 2,2 18,4 ± 0,7 244 ± 130 350 375,2 ± 10,0 24,8 ± 0,9 19,6 ± 0,9 93,2 ± 6,7 80 101,6 ± 25,3 100 104,5 ± 2,1 33,0 ± 7,6 26,8 ± 4,8 153 ± 10
EKSEMPEL 64. Fremstilling av HER2-målrettet liposomalt vinkristin og antitumoreffektivitet av ikke-målrettet og HER2-målrettet liposomalt
vinkristin mot HER2-overuttrykkende humane brystkreftxenotransplantater i mus.
Vinkristinfylte liposomer (Ls-VCR-SOS) ved anvendelse av TEA-SOS metode ble fremstilt i henhold til Eksempel 63 (med utelatelse av [<3>H]-CHE komponent) ved anvendelse av 50 nm porestørrelse-membranekstrusjon og medikamentfylling ved medikament/fosfolipid forhold på 100 mg/mmol. F5 immunliposomalt vinkristin (F5-ILs-VCR) ble dannet ved å inkubere Ls-VCR-SOS med anti-HER2 scFv F5-PEG-DSPE konjugat (Eksempel 19) som beskrevet i Eksempel 43. Vinkristinfylte liposomer ved anvendelse av TEA-sitrat (Ls-VCR-Cit) ble fremstilt på liknende måte som Ls-VCR-SOS liposomer, bortsett fra at trietylammoniumsitratløsning (fremstilt ved å titrere vandig sitronsyre med rent trietylamin til pH 5,1 og justere konsentrasjonen til 0,65 M trietylamin) ble substituert for TEA-SOS løsning.
Studiedesign for behandlingen fulgte fremgangsmåten ifølge Eksempel 10.
Subkutane xenotransplantattumorer av BT-474 humant brystkarsinom ble fremskaffet i nakne mus, og når tumorene nådde størrelsen på 250 mm<3 >(område 144-309 mm<3>), ble musene i grupper på åtte til ni behandlet med fritt VCR, Ls-VCR eller F5-ILs-VCR ved en ukentlig i.v. dose på 2 mg VCR/kg i totalt tre uker, som begynner på dag 19 etter tumorinokulasjon. Tumorstørrelser og kroppsvekter ble monitorert som beskrevet i Eksempel 10. For kontrollgruppen ble musene behandlet med et like stort volum av saltløsning. Forskjellene i tumorstørrelser mellom behandlingsgruppene ble vurdert statistisk på dag 63 etter tumorinokulasjon ved anvendelse av Mann-Whitney test. Dynamikk av gjennomsnittlig tumorstørrelse i gruppene er vist i Figur 43. F5-ILs-VCR demonstrerte maksimal effektivitet sammenlignet med enten Ls-VCR eller fritt VCR, som på dag 63 førte til fullstendig tumorregresjon i seks av åtte dyr (75 %). Ls-VCR-Cit var også effektiv, hvilket forårsaket fullstendig tumorregresjon fortsatt observert på dag 63 i to av ni dyr (22 %), den var imidlertid mindre effektiv enn F5-ILs-VCR (p<0,005). Ls-VCR-SOS og fritt VCR var like effektive (p>0,2) og mindre effektive enn F5-ILs-VCR eller Ls-VCR-Cit. Med cellemålrettet levering var derfor et liposomalt medikament innkapslet ved anvendelse av et polyvalent anion ifølge foreliggende oppfinnelse overraskende mer effektivt enn medikamentet innkapslet liposomalt via ikke-bindende anion. Kroppsvektdynamikk viste at alle liposomale VCR-fremstillinger var mindre toksiske enn fritt VCR, som førte til mindre kroppsvekttap i løpet av behandling (Figur 44).
EKSEMPEL 65. Fremstilling av EGFR-målrettet liposomalt vinkristin og antitumoreffektivitet av ikke-målrettet og EGFR-målrettet liposomalt vinkristin mot EGFR-overuttrykkende humane hjernekreftxenotransplantater i mus.
Vinkristinfylte liposomer (Ls-VCR) ble fremstilt ved anvendelse av TEA-SOS metode som i Eksempel 64. EGFR-målrettet immunliposomalt vinkristin ble fremstilt ved saminkubering av liposomene med anti-HER2 Fab’ C225Fab-PEG-DSPE konjugat som beskrevet i Eksempel 36.
NCR nu/nu hannmus (5-6 uker gamle, som veier 17-20 g) ble injisert subkutant i flankeområdet med 0,15 ml av cellevekstmediet inneholdende 1x10<7 >humane U87-glioblastomceller som stabilt uttrykker epidermal vekstfaktorreseptor (HER1) mutant EGFRvIII. På dag 11, når gjennomsnittlig tumorstørrelse nådde 300-400 mm<3>, ble musene tilfeldig fordelt inn i fire grupper med 10-12 dyr/gruppe. Behandlinger med fritt VCR (vinkristinsulfat 1 mg/ml i saltløsning), Ls-VCR eller C225Fab-ILs-VCR ved i.v. dose på 1,5 mg/kg ble administrert på dag 11, 18 og 25 etter tumorinokulasjon. Mus i kontrollgruppen ble injisert på liknende måte med et like stort volum av normal saltløsning. Tumorstørrelser og kroppsvekter ble monitorert som i Eksempel 10. Resultatene er vist i Figur 45. Alle dyrene behandlet med VCR-formuleringer viste retardasjon i tumorvekst sammenlignet med kontrolldyr. Det var ingen signifikant forskjell mellom gruppene behandlet med fritt VCR og Ls-VCR. EGFR-målrettet C225Fab-ILs-VCR var mer effektiv enn fritt eller ikke-målrettet liposomalt VCR.
EKSEMPEL 66. Fremstilling av liposomer med omsluttet trietylammoniuminositolheksafosfat (TEA-IHP) løsning.
En polyanionisert polyol, inositolheksafosfat (IHP) dodekanatriumsalt, ble fremskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). Vandig løsning inneholdende 0,65 M trietylammonium og 0,681 M av fosfatgrupper, pH 6,5 og osmolalitet på 718 mmol/kg, ble fremstilt ved ionebytting på Dowex 50Wx8-200 kryssbundet sulfonert polystyrenresin fulgt av titrering med rent TEA og fortynning med vann i henhold til prosedyren ifølge Eksempel 4. Det gjenværende natriuminnholdet var mindre enn 1 % av summen av kationer. Tørre lipider (150 μmol DSPC, 100 μmol Kol, 0,75 μmol PEG-DSPE) ble løst i 0,5 ml 100 % etanol USP ved 60 ºC og blandet med 4,5 ml trietylammonium-inositolheksafosfat løsning forvarmet til samme temperatur. Etanol ble delvis fjernet ved rotasjonsfordampning ved 30-40 mm Hg og 40-45 ºC inntil blandingen ikke viste bobler. Lipidsuspensjonen ble deretter ekstrudert ved 60-65 ºC 15 ganger gjennom to stablede polykarbonatmembraner med porestørrelse på 0,1 μm. De resulterende liposomene var 104,3 ± 39,0 nm i størrelse ved QELS. Uinnkapslet trietylammonium IHP ble fjernet ved gelkromatografi på en Sepharose 4B-kolonne, eluert med 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5 buffer, og liposomene ble kvantifisert ved fosfolipidkonsentrasjon ved anvendelse av Bartletts metode med ekstraksjon i henhold til Eksempel 70.
EKSEMPEL 67. Fylling av medikamenter inn i liposomer med omsluttet TEA-IHP løsning.
Liposomene ifølge Eksempel 67 ble fylt med CPT11 eller vinorelbin. Vinorelbin ble fylt ved et medikament-til-fosfolipid forhold på 175 eller 350 g/mol og CPT11 ved et forhold på 250 eller 500 g/mol. Medikamentene ble satt til liposomene i HEPES-dekstrose buffer (Eksempel 67) ved medikament/fosfolipid startforholdene, angitt nedenfor (se Tabell 36). Hvis nødvendig, ble pH justert til 6,5-6,8 ved anvendelse av 1 N NaOH. Blandingene ble inkubert ved 60 ºC i 30 min, avkjølt på is i 15 min og kromatografert på en Sephadex G-25 gelfiltreringskolonne, eluert med 5 mM HEPES-Na, 145 mM NaCl, pH 6,5. Delmengder av de rensede liposomene ble solubilisert i surgjort metanol og analysert ved spektrofotometri (Eksempel 71). Fosfolipid ble kvantifisert ved fremgangsmåten til Bartlett (1959) med ekstraksjon (Eksempel 70). Begge medikamenter fylte kvantitativt (dvs. praktisk talt 100 %) inn i liposomene, som vist nedenfor i Tabell 36.
Tabell 36. Egenskaper til medikamenter fylt inn i liposomer med omsluttet inositolheksafosfat.
Medikament Medikament/lipid Innkapslet medikament/ Fyllingseffektivitet, % startforhold, lipid forhold, g/mol
g/mol fosfolipid fosfolipid
Vinorelbin 175 175,3 ± 8,0 100,2 ± 4,5 Vinorelbin 350 352,3 ± 11,8 100,6 ± 3,3 CPT-11 250 265,1 ± 11,2 106,1 ± 4,7 CPT-11 500 518,7 ± 27,8 103,7 ± 5,8
EKSEMPEL 68. Kjemisk stabilitet av fritt eller liposomalt CPT-11 i nærvær av museplasma in vitro.
I kroppen gjennomgår CPT-11, som er et promedikament, kjemisk omdannelse for å danne en aktiv medikamentmetabolitt kjent som SN-38. Både SN-38 og CPT-11 blir også omdannet fra deres aktive laktonformer til et inaktivt produkt kjent som
SN-38- eller CPT-11 karboksylater. I dette eksempelet ble effekten av liposomalisering av CPT-11 ifølge foreliggende oppfinnelse på CPT-11 kjemisk omdannelse til disse produktene i nærvær av blodplasma studert. Liposomer med omsluttet trietylammoniumsukroseoktasulfat (0,65 M TEA, pH 6,4, osmolalitet 485 mmol/kg) og lipidsammensetning av DSPC, kolesterol og PEG-DSPE i et molart forhold på 3:2:0,015 ble fremstilt i henhold til Eksempel 11, ved anvendelse av ekstrusjon ti ganger gjennom to stablede 0,08 μm polykarbonatfiltre. Liposomene var 87,4 ± 19,2 nm i størrelse ved QELS. CPT-11 ble fylt ved ca.500 mg CPT-11 base/mmol liposomfosfolipid ved inkubasjon i en vandig 5 mM HEPES-Na, 5 % dekstrose, pH 6,5, ved 60 ºC i 30 min, fulgt av quenching på is i 15 min. De CPT-11-fylte liposomene ble deretter renset på en Sephadex G-75 kolonne eluert med HEPES-bufret saltløsning (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH 6,5). De resulterende CPT-11 liposomene hadde 536,5 ± 20,1 mg CPT-11/mmol fosfolipid. Fri CPT-11 løsning ble fremstilt ved ny oppløsning av irinotecanhydroklorid USP ved 1 mg/ml i 144 mM vandig NaCl, surgjort til pH 3 med fortynnet HCl. Delmengder på 10 μl av fritt eller liposomalt CPT-11 eller fritt CPT-11 ble blandet med 90 μl heparinstabilisert museplasma (Harlan Bioproducts, USA) og inkubert ved 37 ºC i et ristende vannbad. Ved et gitt tidspunkt ble liposomprøver, med tre paralleller, kromatografert på Sepharose CL-4B størrelseseksklusjonskolonner (2 ml pakkematerialevolum) eluert med HBS-6,5, og de medikamentinneholdende fraksjonene ble detektert ved fluorescens. Første (dødvolum) og andre (”trailing”) medikamentinneholdende topper ble høstet og betraktet som fraksjoner av liposomalt innkapslet og frisatt medikament. Prøvene ble ekstrahert med 400 μl iskald metanol ved anvendelse av vortexer i 10 sek fulgt av sentrifugering ved 14.100xg i 5 min. Supernatantene ble analysert for CPT-11 og dets omdannelsesprodukter ved HPLC ved anvendelse av modifikasjon av en fremgangsmåte ifølge Warner og Burke, J Chromatogr., Ser. B Biomed. Sci. Appl.
1997, vol.691, s.161-71. Den mobile fasen bestod av 3 % trietylammoniumacetat pH 5,5 (løsning A) og acetonitril (løsning B) levert ved 1,0 ml/min i en lineær gradient på 20 volumprosent B til 50 volumprosent B i 14 min. De eluerte produktene ble detektert ved fluorescens med en eksitasjon på 375 nm og emisjon på 500 nm. Retensjonstidene var 5,3 min (CPT-11 karboksylat), 6,8 min (SN-38 karboksylat), 9,3 min (CPT-11) og 11,0 min (SN-38). Resultatene (Tabell 37) indikerte at mens fritt CPT-11 og CPT-11 frisatt fra liposomene gjenomgikk omdannelse, var intraliposomalt CPT-11 ganske stabil.
Tabell 37. Omdannelse av fritt og liposomalt CPT-11 til SN-38 og karboksylatformer i museplasma in vitro.
Prøve Tid, timer CPT-11, % SN-38, %
lakton karboksylat lakton karboksylat Fritt CPT-11 2 1,9 ± 0,4 35,2 ± 1,9 4,4 ± 0,1 58,4 ± 2,1
12 <0,1 11,5 ± 0,9 9,9 ± 0,8 78,6 ± 1,3 24 <0,1 <0,1 22,5 ± 9,8 77,5 ± 9,8 Ls-CPT-11 12 97,7 ± 0,1 <0,1 2,3 ± 0,1 <0,1 (innkapslet) 24 97,7 ± 0,1 <0,1 2,3 ± 0,1 <0,1 Ls-CPT-11 12 60,5 ± 10,4 25,0 ± 7,1 5,0 ± 0,3 9,5 ± 3,0 (frisatt) 24 78,3 ± 6,7 14,0 ± 5,2 6,5 ± 0,5 1,2 ± 1,7 EKSEMPEL 69. In vivo kjemisk stabilitet av fritt eller liposomalt CPT-11 i rotter.
Liposomalt CPT-11 ble fremstilt som i Eksempel 68 ved anvendelse av trietylammoniumsukroseoktasulfat som har 0,65 M TEA, pH 6,4 og osmolalitet 502 mmol/kg. Liposomstørrelsen var 98,5 ± 18,4 nm, og CPT-11 innkapsling var 510,1 ± 16,5 mg CPT-11/mmol fosfolipid. Liposomalt og fritt CPT-11 ble administrert intravenøst ved dosen på 25 mg/kg til albino-hunnrotter (180-220 g) med innlagte sentralvenøse katetere, og blodprøvene ble tatt ved intervaller over tidsrommet på 48 timer. Blodprøvene ble blandet med iskald PBS inneholdende 0,04 % EDTA og sentrifugert raskt for å fjerne blodceller. Delmengder av supernatantvæskene ble analysert for CPT-11, SN-38 og deres karboksylatformer ved HPLC som i Eksempel 68 ovenfor. Resultatene er vist i Figur 46 og 47. Mens fritt CPT-11 ble fjernet veldig raskt, og ikke var detekterbart etter 30 min, var liposomalt CPT-11 til stede i sirkulasjonen (t1/215,2 timer) med 37,8 % av medikamentet i blodet ved 24 timer, og ca.10 % av medikamentet fortsatt i sirkulasjonen etter 48 timer. Det var ingen detekterbar omdannelse av den liposomale formen av CPT-11 til verken SN-38 eller karboksylatformen av CPT-11. Fritt CPT-11, dvs. administrert som en løsning, ble fjernet fra sirkulasjonen ganske raskt (halveringstid på ca.16 min), og det var vesentlig omdannelse til karboksylatformen av medikamentet.
EKSEMPEL 70. Kvantifisering av liposomfosfolipidet.
Modifisert syrekutting – blå fosfomolybdat metode I. Denne metoden er modifisert etter Bartlett (1959). Delmengder av liposomer på 10-20 ml blir plassert i varmeresistente glassrør, kuttet ved oppvarming med 0,5 ml av 10 N svovelsyre i 2 timer ved 110-130 ºC, mineralisert ved tilsetning av 50 ml 9 % hydrogenperoksid, og varmet i ytterligere 30 min inntil ikke noe hydrogenperoksid blir detektert med en indikatorpapirremse. De kuttede prøvene ved omgivelsestemperatur blir fortynnet med 1 ml 0,2 % vandig ammoniummolydbat, blandet med 0,1 ml 5 % vandig askorbinsyre og inkubert på et kokende vannbad i 10 min. Absorbansen til redusert fosfomolybdatkompleks blir målt ved 800 nm og sammenlignet med en standardkurve produsert samtidig ved anvendelse av uorganisk fosfat-standardløsninger.
Modifisert syrekutting – blå fosfomolybdat metode II. Denne metoden er en modifikasjon av metoden til Morrison (1964).5 μl delmengder av liposomer som har 1-10 mM fosfolipid blir blandet med 60 μl konsentrert svovelsyre og 10 μl av 30 % hydrogenperoksid i varmeresistente glassrør. Blandingene blir varmet ved 200-220 ºC i 10 min, fortynnet med 0,7 μl avionisert vann, blandet med 10 μl av 10 % vandig natriumsulfitt, inkubert på et kokende vannbad i 5 min og kjølt ned til omgivelsestemperatur. 200 μl av 2 % vandig ammoniummolybdat og 10 μl av 10 % vandig askorbinsyre blir tilsatt, og prøvene blir inkubert på et kokende vannbad i 10 min. Prøver blir raskt avkjølt til omgivelsestemperatur, og absorbansen til redusert fosfomolybdatkompleks blir bestemt ved 825 nm mot den negative kontrollen. Mengden av fosfolipid blir bestemt fra standardkurven oppnådd i samme kjøring ved anvendelse av standardløsninger som har 2, 4, 6, 8 og 10 mM kaliumdihydrogenfosfat.
Ekstraksjonsmetode. 25-100 μl delmengder av liposomer blir ekstrahert tre ganger med 200 μl porsjoner av metanol-kloroform blanding (1:2 ved volum). De organiske fasene blir samlet i et varmeresistent glassrør, og løsningsmidlene blir fjernet i vakuum. Restene blir behandlet med 10 N svovelsyre og videre analysert for fosfor i henhold til metode I ovenfor.
Med mindre noe annet er angitt, er de analytiske dataene presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av tre parallelle kjøringer.
EKSEMPEL 71. Kvantifisering av medikamenter i liposomene.
Spektrofotometrisk kvantifisering. Delmengder av liposomer (10-50 μl) blir blandet med 1 ml av 70 volumprosent vandig isopropanol inneholdende 0,075-0,1 N HCl, og absorbansen mot den negative kontrollen blir målt ved følgende bølgelengder: doksorubicin, 485 nm; CPT-11 og topotecan, 372 nm; ellipticiner, 306 nm, vinorelbin, 270 nm; vinkristin og vinblastin, 265 nm. Mengde medikament blir bestemt ved sammenligning med en samtidig kjørt standardkurve.
Fluorometrisk kvantifisering. Delmengder av liposominneholdende prøver (f.eks. blodplasma) blir fortynnet med surgjort isopropanol (0,02-0,1 ml delmengder: 1 ml av 70 % isopropanol-0,075 N HCl; >0,1 ml delmengder: 90 % isopropanol-0,1 N HCl til 1 ml). Hvis proteinutfelling forekommer, blir prøvene inkubert på is 1-2 timer og klaret opp ved sentrifugering 10 min ved 12.100xg. Fluorescensen av supernatantene blir målt ved følgende bølgelengder: CPT-11, eksitasjon 370 nm, emisjon 423-425 nm; topotecan, eksitasjon 380-385 nm, eksitasjon 520-525 nm; ellipticiner, eksitasjon 306 nm, emisjon 520 nm. Mengde medikament blir beregnet fra samtidig kjørte standardkurver etter subtraksjon av fluorescensen til negativ kontroll.
EKSEMPEL 72. Effekt av lipopolymerer på fyllingseffektiviteten av vinorelbin inn i liposomer.
Liposomer sammensatt av DSPC 200 molare deler, kolesterol 133 molare deler og poly(etylenglykol) (mol. vekt 2.000)-derivatiserte lipider PEG-DSPE (1-20 molare deler) eller PEG-DSG (20 molare deler) og inneholdende innkapslet 0,65 M TEA-SOS løsning ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge Eksempel 11, ved anvendelse av membran med porestørrelse på 80 nm for ekstrusjonstrinn.
Liposomene ble fylt med vinorelbin ved medikament/fosfolipid forholdet på 350 mg/mmol og renset fra uinnkapslet medikament i henhold til fremgangsmåten ifølge Eksempel 40. Liposomene ble analysert for medikament- og lipidinnhold som beskrevet i Eksempel 70 og 71 og for liposomstørrelse ved QELS ved anvendelse av volumvektet gaussisk approksimasjon. Resultatene (Tabell 38) indikerte at mens anionisk PEG-derivat, PEG-DSPE, ved mengden på mer enn 1 molprosent av liposomfosfolipidet (0,3 molprosent av totalt lipid), hadde negativ effekt på medikamentfyllingseffektiviteten, affiserte det nøytrale derivatet, PEG-DSG, overraskende ikke fyllingseffektiviteten selv ved 9,1 molprosent av liposomfosfolipidet (5,7 molprosent av totalt lipid).
Tabell 38. Egenskaper til vinorelbinliposomer fremstilt ved TEA-SOS metode ved ulike mengder av PEG-lipidderivater.
PEG-lipid PEG-lipid mengde, Liposom- Medikament- Fyllingsmolprosent av str., nm mengde, mg/mmol effektivitet, % totalt lipid (gj.snitt SD) fosfolipid innkapsling PEG-DSPE 0,3 108 ± 32 359,5 ± 17,8 102,7 ± 5,2 PEG-DSPE 0,6 110 ± 18 346,6 ± 14,5 99,0 ± 4,1 PEG-DSPE 1,8 104 ± 35 332,0 ± 14,0 94,9 ± 3,8 PEG-DSPE 2,9 94 ± 33 259,8 ± 9,5 74,2 ± 2,0 PEG-DSPE 4,0 100 ± 36 155,4 ± 7,0 44,4 ± 0,9 PEG-DSPE 5,7 103 ± 31 61,2 ± 5,2 17,5 ± 0,3 PEG-DSG 5,7 97 ± 36 362,7 ± 14,2 103,6 ± 4,2
EKSEMPEL 73. Effekt av intraliposomalt medikamentfangingsmiddel på levetiden i blod av CPT-11 i mus.
Liposomer med omsluttet 0,65 N løsninger av trietylammonium (TEA) eller trietanolammonium (TEOA) salter av inositolheksafosfat (IHP, fytinsyre) eller sukroseoktasulfat ble fremstilt og fylt med CPT-11 ved 500 g/mol fosfolipid ifølge generell prosedyre i Eksempel 66. Liposomene ble administrert intravenøst til Swiss-Webster mus i dose på 5 mg CPT-11/kg kroppsvekt. Tjuefire timer senere ble musene anestesert og avlivet via åpen hjertepunktering. Blodet ble samlet opp, analysert for CPT-11 innhold i blodplasma ved HPLC som beskrevet i Eksempel 68 og medikamentmengden ble uttrykt som % av injisert dose gjenværende i blodet (%ID). TEOA-IHP var mindre effektiv i forbedring av levetiden i blod av medikamentet enn TEA-IHP, TEOA-SOAS og TEA-SOS (Tabell 39).
Tabell 39. CPT-11 remanens i blodet 24 timer etter intravenøs administrering av CPT-11 liposomer i mus.
Intraliposomalt medikamentfangingsmiddel %ID gjenværende i blod TEOA-IHP 2,74 ± 0,54
TEA-IHP 5,86 ± 0,20 TEOA-SOS 7,03 ± 0,17
TEA-SOS 11,32 ± 0,46
EKSEMPEL 74. Medikamentfylling inn i liposomer inneholdende 1,05 N dietylammoniumsukroseoktasulfat
Vandig løsning av 1,05 N dietylammoniumsukroseoktasulfat (DEA-SOS) pH 6,0, osmolaritet 727 mmol/kg, ble fremstilt ved anvendelse av ionebytting/titreringsmetode ifølge Eksempel 6 ved anvendelse av rent dietylamin (99,5 % renhet). Lipidmatriksen av 3 molare deler DSPC, 2 molare deler kolesterol og 0,015 molare deler PEG2000-DSPE ble formulert inn i liposomer (volumvektet gjennomsnittsstørrelse 92,4 nm) i nærvær av DEA-SOS løsning, og CPT-11 ble fylt i liposomene med ulike medikament/lipid startforhold ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge Eksempel 11. Ikke-innkapslet medikament ble fjernet ved gelkromatografi, og mengden av innkapslet medikament per lipidenhet (medikament/lipid sluttforhold) ble bestemt. Innkapslingseffektivitet ble beregnet som % av medikament/lipid sluttforhold i forhold til startforhold. Resultatene er vist i Tabell 40. Fylling nådde sitt maksimumnivå på ca.1,76 mol medikament per mol fosfolipid (1,67-1,70 mol medikament/g totalt lipid), som er i godt samsvar med mengden (1,78 mol dietylammonium/mol fosfolipid) basert på dietylammoniuminnholdet i liposomene, som antar støkiometrisk utveksling av intraliposomale dietylammoniumioner for medikamentmolekylene og estimert intraliposomalt omsluttet volum på ca.1,7 l/mol fosfolipid.
Tabell 40. Fylling av CPT-11 i DSPC/Kol/PEG-DSPE liposomer inneholdende 1,05 N DEA-SOS.
Medikament/lipid Medikament/lipid Innkapslingsstartforhold, mol/g sluttforhold, mol/g effektivitet, %
1,25 1,247 ± 0,038 99,8 ± 3,0
1,50 1,534 ± 0,052 102,3 ± 3,5
1,80 1,669 ± 0,043 92,7 ± 2,4
2,06 1,690 ± 0,054 82,0 ± 2,6
2,20 1,704 ± 0,062 77,5 ± 2,8
2,42 1,685 ± 0,103 69,6 ± 4,3
Hvis ikke noe annet er angitt, er de analytiske resultatene presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av tre paralleller. Farmakokinetikkdata i rotteplasma er gjennomsnitt ± standardfeil av to paralleller.
Selv om oppfinnelsen er beskrevet med henvisning til den nåværende foretrukne utførelsesformen, bør det forstås at ulike modifikasjoner kan gjøres uten å avvike fra ånden ifølge oppfinnelsen. Følgelig bør omfanget av foreliggende oppfinnelse bestemmes ved henvisning til de vedlagte kravene, sammen med hele omfanget av ekvivalenter som slike krav er benevnt til.

Claims (6)

PATENTKRAV
1. Sammensetning omfattende et liposom i et medium, hvor liposomet omfatter 1,2-distearoyl-SN-fosfatidylkolin, kolesterol og N-(omega-metoksypoly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin i et molart forhold på 3:2:0,015, og irinotecan og sukroseoktasulfat er innsluttet i liposomet.
2. Sammensetning ifølge krav 1, hvor trietylammonium også er innsluttet i liposomet.
3. Farmasøytisk sammensetning omfattende en liposomsammensetning ifølge krav 1, en farmasøytisk akseptabel bærer og en buffersubstans.
4. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 3, hvor pH er mellom 6,0 og 7,5.
5. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 3 eller krav 4, hvor den farmasøytiske sammensetningen er fremstilt som en injiserbar sammensetning.
6. Sammensetning ifølge krav 1, eller farmasøytisk sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 3-5, hvor N-(omega-metoksy-poly(etylenglykol)-oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolaminet er N-(omega-metoksypoly(etylenglykol)(molekylvekt 2000)- oksykarbonyl)-1,2-distearoylfosfatidyletanolamin.
NO20065532A 2004-05-03 2006-11-30 Sammensetning og farmasøytisk sammensetning omfattende et liposom NO345218B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56792104P 2004-05-03 2004-05-03
PCT/US2005/015349 WO2005107712A1 (en) 2004-05-03 2005-05-02 Liposomes useful for drug delivery

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20065532L NO20065532L (no) 2006-12-13
NO345218B1 true NO345218B1 (no) 2020-11-09

Family

ID=35320018

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20065532A NO345218B1 (no) 2004-05-03 2006-11-30 Sammensetning og farmasøytisk sammensetning omfattende et liposom
NO2021004C NO2021004I1 (no) 2004-05-03 2021-01-22 Irinotekan sukrosofatsalt

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2021004C NO2021004I1 (no) 2004-05-03 2021-01-22 Irinotekan sukrosofatsalt

Country Status (20)

Country Link
US (22) US8147867B2 (no)
EP (3) EP1746976B1 (no)
JP (3) JP4971142B2 (no)
KR (4) KR101376895B1 (no)
CN (3) CN1980637B (no)
AU (1) AU2005240131C1 (no)
CA (4) CA2821167C (no)
DK (1) DK1746976T3 (no)
ES (2) ES2967961T3 (no)
FR (1) FR17C1027I2 (no)
HK (2) HK1200694A1 (no)
LU (1) LUC00026I2 (no)
NL (1) NL300885I2 (no)
NO (2) NO345218B1 (no)
PL (1) PL1746976T3 (no)
PT (1) PT1746976T (no)
RU (3) RU2424792C2 (no)
TW (1) TWI359029B (no)
UA (1) UA86063C2 (no)
WO (1) WO2005107712A1 (no)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101376895B1 (ko) * 2004-05-03 2014-03-25 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
JP4885715B2 (ja) * 2004-06-01 2012-02-29 テルモ株式会社 イリノテカン製剤
WO2006032136A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 British Columbia Cancer Agency Branch Free or liposomal gemcitabine alone or in combination with free or liposomal idarubicin
CA2584279C (en) * 2004-11-05 2015-01-27 Index Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for stabilizing liposomal drug formulations
US8349359B2 (en) * 2004-11-07 2013-01-08 Your Energy Systems, LLC Liposomal formulation for oral administration of glutathione (reduced)
EP1976485A4 (en) * 2005-12-22 2011-10-26 Celator Pharmaceuticals Inc LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SECONDARY AND TERTIARY AMINES AND METHODS FOR THE PREPARATION OF SAID FORMULATIONS
DE102006015271A1 (de) * 2006-04-01 2007-10-11 Lohmann & Rauscher Gmbh & Co. Kg Biguanidhaltige Liposomen
US8343539B2 (en) * 2006-07-14 2013-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Compounds that bind α5β1 integrin and methods of use
US20080118500A1 (en) * 2006-11-16 2008-05-22 Taiwan Liposome Company Sustained releasing composition via local injection for treating eye diseases
FR2910812B1 (fr) * 2006-12-29 2009-03-20 Pierre Fabre Medicament Sa Compositions pharmaceutiques injectables lyophilisees de derives hemi-synthetiques d'alcaloide de vinca stables a temperature ambiante
CN101209243B (zh) * 2006-12-29 2010-12-08 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种脂质体药物及其制备方法
WO2008088037A1 (ja) * 2007-01-18 2008-07-24 National University Corporation Chiba University 微粒子製剤
CA2681302C (en) * 2007-03-19 2013-07-23 Dhiraj Khattar Proliposomal and liposomal compositions of poorly water-soluble compounds
US20100173014A1 (en) * 2007-05-24 2010-07-08 Nanosolutions, Llc Methods of making and using nano scale particles
US20080305157A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 University Of Maryland Office Of Technology Commercialization Encapsulation and separation of charged organic solutes inside catanionic vesicles
EP2200613B1 (en) 2007-09-21 2018-09-05 The Johns Hopkins University Phenazine derivatives and uses thereof
WO2009088959A1 (en) * 2008-01-04 2009-07-16 Brian Charles Keller Enhanced delivery of antifungal agents
CN101536981B (zh) * 2008-03-19 2010-11-17 上海医药工业研究院 一种盐酸可乐定多囊脂质体及其制备方法
WO2009138806A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Dendrigen S.A. Novel liposome cocktail formulations containing doxorubicin and the potent multidrug resistance inhibitor amiodarone
EP2123258A1 (en) 2008-05-23 2009-11-25 Liplasome Pharma A/S Liposomes for drug delivery
KR101659457B1 (ko) * 2008-05-23 2016-09-23 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 리포좀 나노입자에 사용하기 위한 변형된 약물
ES2464729T3 (es) 2008-08-21 2014-06-03 The Johns Hopkins University Procedimientos y composiciones para la administración de 3-halopiruvato y compuestos relacionados para el tratamiento del cáncer
CN101565384B (zh) * 2008-12-23 2012-12-26 南开大学 环糊精修饰单层石墨及其超分子复合物和制备方法及用途
EP2601934A1 (en) * 2009-01-22 2013-06-12 Ludwig-Maximilians-Universität München Vesicular phospholipid gels comprising proteinaceous substances
JP5588619B2 (ja) * 2009-03-11 2014-09-10 一丸ファルコス株式会社 ｐＨ応答性リポソーム
PL2415470T3 (pl) * 2009-03-30 2016-12-30 Kompozycja liposomowa
JP5622719B2 (ja) * 2009-03-30 2014-11-12 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 リポソーム組成物の製造方法
JP5392707B2 (ja) * 2009-03-31 2014-01-22 株式会社Ｎｔｔドコモ 膜小胞分裂システム
WO2010135468A1 (en) * 2009-05-19 2010-11-25 Vivia Biotech S.L. Methods for providing personalized medicine tests ex vivo for hematological neoplasms
DK177532B1 (en) 2009-09-17 2013-09-08 Bio Bedst Aps Medical use of sPLA2 hydrolysable liposomes
CN102271659B (zh) * 2009-12-03 2013-09-18 江苏恒瑞医药股份有限公司 伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法
KR101000358B1 (ko) 2010-04-29 2010-12-13 서울대학교산학협력단 인테그린 αⅤβ３ 결합성 지질 유도체 및 그를 포함하는 지질 나노입자
CN103189073B (zh) 2010-05-04 2015-08-12 梅里麦克制药股份有限公司 抗表皮生长因子受体(egfr)的抗体及其用途
CN107261110A (zh) * 2010-06-19 2017-10-20 健康科学西部大学 Peg化脂质体包封的糖肽抗生素的新制剂
CN103313671B (zh) 2010-10-25 2017-06-06 美敦力Af卢森堡有限责任公司 用于神经调节治疗的估算及反馈的装置、系统及方法
JP2014503582A (ja) * 2011-01-28 2014-02-13 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 親水性プロドラッグの局所放出用担体
BR112013027413A2 (pt) * 2011-04-26 2019-09-24 Cedars Sinai Medical Center vancomicina lipossomal para o tratamento de infecções de sarm.
WO2012154942A2 (en) 2011-05-10 2012-11-15 The Penn State Research Foundation Ceramide anionic liposome compositions
US8691231B2 (en) 2011-06-03 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of tumors expressing predominantly high affinity EGFR ligands or tumors expressing predominantly low affinity EGFR ligands with monoclonal and oligoclonal anti-EGFR antibodies
CN102805729A (zh) * 2011-06-03 2012-12-05 齐鲁制药有限公司 一种长春氟宁脂质体制剂及其制备方法
CA2852672C (en) * 2011-10-17 2021-07-20 Massachusetts Institute Of Technology A microfluidic system and method for delivering a payload into a cell by causing perturbations in a cell membrane of the cell
IN2014DN09098A (no) 2012-04-02 2015-05-22 Merrimack Pharmaceuticals Inc
WO2013158803A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-invasive imaging
AU2013202947B2 (en) 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
US9717724B2 (en) 2012-06-13 2017-08-01 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies
KR101949125B1 (ko) 2012-07-04 2019-02-18 고려대학교 산학협력단 ｐＨ 민감성 형광 발광의 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 포함하는 약물 전달체
SG10201701063WA (en) * 2012-08-10 2017-04-27 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Stable oxaliplatin-encapsulating liposome aqueous dispersion and method for stabilizing same
EP3470061A1 (en) 2012-11-20 2019-04-17 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Improved method for the preparation of a dosage of liposome encapsulated vincristine for therapeutic use
RU2514000C1 (ru) * 2012-12-14 2014-04-27 Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий" Липосомальная композиция и способ ее получения
KR102310786B1 (ko) 2013-02-01 2021-10-12 존원 파마, 인코포레이티드 리포좀 내로 난수용성 약물의 원격 부하
EP4378461A3 (en) 2013-03-05 2024-09-11 The Regents of University of California Lipid bilayer coated mesoporous silica nanoparticles with a high loading capacity for one or more anticancer agents
US9993427B2 (en) * 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
US10220095B2 (en) * 2013-03-15 2019-03-05 Taiwan Liposome Company, Ltd Controlled drug release liposome compositions and methods thereof
CN109350600B (zh) * 2013-03-15 2021-10-29 台湾微脂体股份有限公司 设计脂质体水相和非水相部分的组成来控制药物的释放趋势
GB2516138C (en) * 2013-04-09 2015-12-09 Cresset Biomolecular Discovery Ltd The treatment of inflammatory disorders
JP2016518140A (ja) 2013-05-03 2016-06-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｉ型インターフェロンの環状ジヌクレオチド誘導法
JP7021410B2 (ja) 2013-09-11 2022-02-17 エイム・ターゲティッド・セラピーズ・インコーポレイテッド 高張性抗微生物治療用組成物
WO2015061592A1 (en) * 2013-10-23 2015-04-30 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes for non-invasive imaging and drug delivery
US9592198B2 (en) * 2013-10-28 2017-03-14 University Of Maryland, College Park Microfluidic liposome synthesis, purification and active drug loading
CA2939916A1 (en) 2014-02-18 2015-08-27 Glenn Abrahmsohn Compositions and methods for pain relief without numbness
WO2015166987A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物及びその製造方法
RS61273B1 (sr) * 2014-04-30 2021-01-29 Fujifilm Corp Lipozomska kompozicija i postupak za njeno dobijanje
EP3138557B1 (en) * 2014-04-30 2023-06-07 FUJIFILM Corporation Liposome composition and method for producing same
MA39599A (fr) 2014-05-14 2016-10-05 Merrimack Pharmaceuticals Inc Dosage et administration d'agents thérapeutiques anti-egfr
US10004759B2 (en) 2014-08-04 2018-06-26 Zoneone Pharma, Inc. Remote loading of sparingly water-soluble drugs into lipid vesicles
WO2016048242A1 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 Nanyang Technological University Sustained timolol maleate delivery from liposomes for glaucoma therapy and ocular hypertension
AU2015360761B2 (en) 2014-12-09 2021-05-20 Ipsen Biopharm Ltd. Treatment of breast cancer with liposomal irinotecan
US11318131B2 (en) 2015-05-18 2022-05-03 Ipsen Biopharm Ltd. Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
EP4212148A1 (en) * 2015-05-26 2023-07-19 Plumb Pharmaceuticals, Inc. Liposome loading
US9855216B2 (en) * 2015-05-27 2018-01-02 Ghasem Amoabediny Targeted nano-liposome co-entrapping anti-cancer drugs
TWI678213B (zh) 2015-07-22 2019-12-01 美商史倍壯製藥公司 用於長春新鹼硫酸鹽脂質體注射之即可使用的調配物
EP3337467B1 (en) 2015-08-20 2020-12-09 Ipsen Biopharm Ltd. Combination therapy using liposomal irinotecan and a parp inhibitor for cancer treatment
US11260126B2 (en) * 2015-08-21 2022-03-01 University Of Otago Acoustic driven drug delivery systems
IL257149B1 (en) 2015-08-21 2024-07-01 Ipsen Biopharm Ltd Methods for treating pancreatic cancer metastases using combined treatments including liposomal irinotecan and oxaliplatin
US11613759B2 (en) 2015-09-04 2023-03-28 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
JP2018527377A (ja) 2015-09-16 2018-09-20 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 癌の処置におけるトポイソメラーゼ−ｉ阻害剤と免疫療法との組み合わせ
CN105153339B (zh) * 2015-10-13 2017-10-24 浙江大学 一种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物、制备方法和应用
JP6924431B2 (ja) * 2015-10-13 2021-08-25 株式会社ケーナインラボ ヒトを除く哺乳動物への薬剤の投与方法
CA3001467A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions
US20170319573A1 (en) * 2015-10-16 2017-11-09 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing Camptothecin Pharmaceutical Compositions
CN111632030B (zh) 2015-11-02 2023-01-17 富士胶片株式会社 包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法
JP6564873B2 (ja) * 2015-11-02 2019-08-21 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物およびその製造方法
US10751306B2 (en) 2015-11-06 2020-08-25 The Johns Hopkins University Methods of treating liver fibrosis by administering 3-bromopyruvate
WO2017083403A1 (en) 2015-11-10 2017-05-18 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Echinomycin formulation, method of making and method of use thereof
CN105287264B (zh) * 2015-11-25 2018-06-19 上海赢嘉实业有限公司 一种包封芳香油复合物的脂质体的制备方法和用途
US20180271998A1 (en) 2015-12-04 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
CN105496992A (zh) * 2015-12-08 2016-04-20 青岛正大海尔制药有限公司 氨溴索沙丁胺醇脂质固体分散体
AU2017206077B2 (en) * 2016-01-08 2021-11-18 The Regents Of The University Of California Mesoporous silica nanoparticles with lipid bilayer coating for cargo delivery
JP2019501225A (ja) * 2016-01-11 2019-01-17 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド Ｂ細胞リンパ腫２（ｂｃｌ−２）及び関連タンパク質の阻害
EP3936153B1 (en) 2016-01-11 2024-08-21 Celator Pharmaceuticals, Inc. Inhibiting ataxia telangiectasia and rad3-related protein (atr)
JP2019504864A (ja) * 2016-02-15 2019-02-21 ケミン、インダストリーズ、インコーポレーテッドＫｅｍｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． 水溶性親油性材料
WO2017142876A1 (en) * 2016-02-15 2017-08-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. lPA-3-LOADED LIPOSOMES AND METHODS OF USE THEREOF
CN109310782A (zh) 2016-03-16 2019-02-05 梅里麦克制药股份有限公司 肝配蛋白受体A2(EphA2)靶向性的多西他赛生成纳米脂质体组合物
CA3016383A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc Treating ephrin receptor a2 (epha2) positive cancer with targeted docetaxel-generating nano-liposome compositions
WO2017188350A1 (ja) 2016-04-28 2017-11-02 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 腫瘍の成長を抑制する方法
EP3458059A1 (en) * 2016-05-18 2019-03-27 Ipsen Biopharm Limited Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
US9655847B1 (en) * 2016-07-18 2017-05-23 National Guard Health Affairs Therapeutic liposome and method of treating a subject having cancer
US10583083B1 (en) * 2016-08-10 2020-03-10 Verily Life Sciences Llc ROS-responsive multilamellar liposomal vesicles for targeting inflammatory macrophages
US10517823B1 (en) 2016-08-10 2019-12-31 Verily Life Sciences Llc ROS—responsive liposomes for specific targeting
CA3033083A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Polyglutamated antifolates and uses thereof
WO2018031968A1 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha and gamma-d polyglutamated antifolates and uses thereof
CN109661265A (zh) * 2016-08-31 2019-04-19 丘比株式会社 蛋黄磷脂组合物及其制造方法、以及使用该蛋黄磷脂组合物的脂肪乳剂及脂解制剂
EP3509605A4 (en) * 2016-09-09 2020-05-27 Irisys, Inc. LIPOSOMAL ANTI-CANCER COMPOSITIONS
BR112019007844A2 (pt) 2016-11-02 2019-07-16 Ipsen Biopharm Ltd tratamento de câncer gástrico usando terapias de combinação compreendendo irinotecano lipossômico, oxaliplatina, 5-fluoroacila (e leucovorina)
US10800817B2 (en) * 2016-12-19 2020-10-13 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release
AU2017258901A1 (en) 2016-12-30 2018-07-19 Allarity Therapeutics Europe ApS Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients
RU2765736C2 (ru) * 2017-01-18 2022-02-02 Темасек Лайф Сайенсиз Лаборатори Лимитед Гиперстабилизированные липосомы, повышающие направленное таргетирование митотических клеток
US11510872B2 (en) * 2017-05-24 2022-11-29 Northwestern University Nanoparticle-lipid composite carriers and uses thereof
CN108926719B (zh) * 2017-05-25 2020-09-01 北京格瑞特森生物医药科技有限公司 用c(RGD-ACP-K)修饰的长循环脂质体
JP7245012B2 (ja) * 2017-09-12 2023-03-23 オルガノ株式会社 電解液の精製装置および精製方法
WO2019054220A1 (ja) * 2017-09-12 2019-03-21 オルガノ株式会社 電解液の精製装置および精製方法
CN108047494B (zh) * 2017-11-15 2019-11-08 四川大学 植酸铵盐阻燃剂及其制备方法和用以制备的阻燃增韧聚乳酸材料
CN109364025A (zh) * 2017-11-17 2019-02-22 和龙 脂质体组合物、其制备方法及其应用
CA3090483A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated pemetrexed and uses thereof
EP3749312A4 (en) * 2018-02-07 2022-02-23 L.E.A.F Holdings Group LLC ALPHA-POLYGLUTAMATED LOMETREXOLE AND USES THEREOF
CN111954531A (zh) 2018-02-07 2020-11-17 L.E.A.F.控股集团公司 α聚谷氨酸化培美曲塞及其用途
CA3090384A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated aminopterin and uses thereof
CN111867593A (zh) 2018-02-07 2020-10-30 L.E.A.F.控股集团公司 α聚谷氨酸化抗叶酸剂及其用途
CA3090509A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated methotrexate and uses thereof
US11730738B2 (en) 2018-02-07 2023-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated pralatrexate and uses thereof
CA3090875A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated lometrexol and uses thereof
CA3090992A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated tetrahydrofolates and uses thereof
US20210154196A1 (en) * 2018-02-14 2021-05-27 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated methotrexate and uses thereof
WO2019160736A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated pralatrexate and uses thereof
TW202015658A (zh) * 2018-06-20 2020-05-01 日商富士軟片股份有限公司 包含內含藥物之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑之組合醫藥
WO2020023436A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Campbell Robert B Cell membrane lipid-extracted nanoparticles (clens) for selective targeting, image analysis and cancer therapy
WO2020028475A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Taiwan Liposome Co., Ltd. Sustained-release compositions comprising a therapeutic agent for treating depression or anxiety and uses thereof
CN112543630B (zh) * 2018-08-08 2023-07-18 台湾微脂体股份有限公司 含有抗精神病药物的缓释药物组合物及其用途
EP3861987A4 (en) * 2018-10-01 2021-09-15 FUJIFILM Corporation COMBINATION DRUG CONTAINING A LIPOSOME COMPOSITION ENCAPSULATING A DRUG AND A PLATINUM PREPARATION
TWI767149B (zh) * 2018-10-17 2022-06-11 台灣微脂體股份有限公司 含有免疫調節劑的緩釋藥物組合物及其用途
CN109528654B (zh) * 2018-12-14 2021-04-23 沈阳药科大学 一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法
CN109528655A (zh) * 2018-12-18 2019-03-29 沈阳药科大学 一种双载药脂质体及其制备和应用
SG11202109333SA (en) 2019-02-28 2021-09-29 Sqz Biotechnologies Co Delivery of biomolecules to pbmcs to modify an immune response
CA3136296A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Sqz Biotechnologies Company Cartridge for use in a system for delivery of a payload into a cell
US20220296515A1 (en) * 2019-05-28 2022-09-22 Nevakar Injectables Inc. Vancomycin Liposome Compositions and Methods
EP3753549A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-23 InnoMedica Holding AG Liposomal doxorubicin formulation, method for producing a liposomal doxorubicin formulation and use of a liposomal doxorubicin formulation as a medicament
JP2022540680A (ja) * 2019-07-16 2022-09-16 コアスター セラピューティクス インク． 膜脂質被覆ナノ粒子の製造プロセス
US12036204B2 (en) 2019-07-26 2024-07-16 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating tumor
US11083705B2 (en) 2019-07-26 2021-08-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating tumor
US20230139328A1 (en) * 2020-03-12 2023-05-04 Aphios Corporation Dosage forms for improving organ transplantation, graft versus host disease and stem cells transplants
MX2022016063A (es) 2020-06-18 2023-04-11 Akagera Medicines Inc Compuestos de oxazolidinona, composiciones de liposomas que comprenden compuestos de oxazolidinona y metodos de uso de los mismos.
CN112190715B (zh) * 2020-10-21 2022-09-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 纳米药物、其制备方法及医药应用
US11058637B1 (en) * 2020-11-25 2021-07-13 King Abdulaziz University Surface-modified emulsomes for intranasal delivery of drugs
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
WO2022153211A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Sun Pharma Advanced Research Company Limited Liposomal composition of a camptothecin derivative
WO2022171777A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for prognosis and treating a patient suffering from cancer
EP4370099A1 (en) * 2021-07-16 2024-05-22 Celator Pharmaceuticals, Inc. Methods for preparing liposomal formulations
WO2023029041A1 (zh) * 2021-09-06 2023-03-09 北京茵诺医药科技有限公司 靶向动脉粥样硬化脂质体纳米载体递送系统及其制备方法
TW202317070A (zh) * 2021-09-30 2023-05-01 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司 酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用
EP4169928A1 (en) * 2021-10-25 2023-04-26 Sandoz Ag Process for the preparation of sucrose octasulfate octakistriethylammonium salt (tasos) powder and uses thereof
CN114099691A (zh) * 2021-11-22 2022-03-01 京东方科技集团股份有限公司 一种人造细胞及其制备方法
EP4448101A1 (en) 2021-12-15 2024-10-23 Immunyx Pharma Ltd. Neutrophil exocytosis inhibitors
CN114306243B (zh) * 2022-01-07 2023-03-28 中国人民解放军空军军医大学 一种靶向梭型柔性脂质体水凝胶及其制备方法和应用
US12064479B2 (en) 2022-05-25 2024-08-20 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof
WO2024199424A1 (zh) * 2023-03-30 2024-10-03 上海济煜医药科技有限公司 一种磷脂组合物及其制备方法及含氮化合物的应用
CN116602923A (zh) * 2023-07-20 2023-08-18 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种用于关节炎治疗的靶向仿生纳米治疗载体系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998017256A1 (en) * 1996-10-22 1998-04-30 Dmitri Kirpotin Compound-loaded liposomes and methods for their preparation
US5785987A (en) * 1995-02-27 1998-07-28 The University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES473087A1 (es) * 1977-09-06 1979-04-16 Studiengesellschaft Kohle Mbh Procedimiento para la preparacion de eritrocitos intactos modificados.
US4192869A (en) 1977-09-06 1980-03-11 Studiengesellschaft Kohle Mbh. Controlled improvement of the O2 release by intact erythrocytes with lipid vesicles
DE2740053A1 (de) * 1977-09-06 1979-05-03 Klaus Prof Dr Med Gersonde Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten
US4397846A (en) 1981-05-15 1983-08-09 Murray Weiner Storage-stable lipid vesicles and method of preparation
US5059591B1 (en) 1983-05-26 2000-04-25 Liposome Co Inc Drug preparations of reduced toxicity
JPS6019790A (ja) 1983-07-14 1985-01-31 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体
IL72420A (en) 1983-07-22 1987-10-30 Hoffmann La Roche Aqueous vitamin e solutions and their manufacture
US5736155A (en) 1984-08-08 1998-04-07 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US5077056A (en) 1984-08-08 1991-12-31 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US4755388A (en) 1984-11-09 1988-07-05 The Regents Of The University Of California Liposome-encapsulated 5-fluoropyrimidines and methods for their use
DE3634392A1 (de) 1986-10-09 1988-04-14 Knoll Ag Verwendung polysulfatierter niedermolekularer dextransulfate
MX9203808A (es) 1987-03-05 1992-07-01 Liposome Co Inc Formulaciones de alto contenido de medicamento: lipido, de agentes liposomicos-antineoplasticos.
JPH0720857B2 (ja) 1988-08-11 1995-03-08 テルモ株式会社 リポソームおよびその製法
IL91664A (en) * 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
US5043165A (en) 1988-12-14 1991-08-27 Liposome Technology, Inc. Novel liposome composition for sustained release of steroidal drugs
US5043164A (en) 1989-01-17 1991-08-27 The University Of Tennessee Research Corporation Blood-stable, cholesterol-free liposomes
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
US5618798A (en) * 1989-04-20 1997-04-08 Bar-Shalom; Daniel Use of sucralfate to treat baldness
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
PL296382A1 (en) * 1991-02-02 1993-11-02 Nika Health Products Ltd Li Li Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system
US5498420A (en) 1991-04-12 1996-03-12 Merz & Co. Gmbh & Co. Stable small particle liposome preparations, their production and use in topical cosmetic, and pharmaceutical compositions
EP0592446B1 (en) 1991-07-03 1995-10-04 NeXstar Pharmaceuticals, Inc. Loading technique for preparing drug containing liposomes
US5281237A (en) 1992-09-25 1994-01-25 Gimpelson Richard J Surgical stitching device and method of use
US5552156A (en) 1992-10-23 1996-09-03 Ohio State University Liposomal and micellular stabilization of camptothecin drugs
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
DE4320597A1 (de) 1993-06-22 1995-01-05 Heinz C Prof Dr Dr Schroeder Verwendung von Polyphosphaten zur antiviralen Therapie und als Immunmodulatoren
US6743917B2 (en) 1993-06-30 2004-06-01 University Of Pittsburgh Camptothecin analogs and methods of preparation thereof
US5716981A (en) 1993-07-19 1998-02-10 Angiogenesis Technologies, Inc. Anti-angiogenic compositions and methods of use
US5534241A (en) 1993-07-23 1996-07-09 Torchilin; Vladimir P. Amphipathic polychelating compounds and methods of use
US5538954A (en) * 1994-06-24 1996-07-23 A/S Dumex (Dumex Ltd.) Salts of tetracyclines
GB9323588D0 (en) 1993-11-16 1994-01-05 Cortecs Ltd Hydrophobic preparation
JP3203358B2 (ja) 1994-02-04 2001-08-27 リポコーア・ホールディング・アクチエボラーグ 二重層製剤
US6312719B1 (en) 1994-03-04 2001-11-06 The University Of British Columbia Liposome compositions and methods for the treatment of atherosclerosis
US6110481A (en) * 1994-03-04 2000-08-29 Trustees Of The Stevens Institute Of Technology Controlled release device based on aqueous-organic partitioning in porous membranes
US5783568A (en) 1994-06-10 1998-07-21 Sugen, Inc. Methods for treating cancer and other cell proliferative diseases
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
GB9424902D0 (en) 1994-12-09 1995-02-08 Cortecs Ltd Solubilisation Aids
WO1996025147A1 (en) 1995-02-14 1996-08-22 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome composition and method for administering liposome-loadable drugs
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
DE19605024A1 (de) * 1996-01-31 1997-08-07 Schering Ag Neue selektive Taxane, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung
DE69700887T2 (de) 1996-01-31 2000-06-29 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Isoprenderivate
US6441025B2 (en) 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
AU2284697A (en) 1996-04-11 1997-10-29 University Of British Columbia, The Fusogenic liposomes
US5997899A (en) 1996-10-01 1999-12-07 Skyepharma Inc. Method for producing liposomes with increased percent of compound encapsulated
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6210707B1 (en) 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
ATE318515T1 (de) 1996-11-19 2006-03-15 Univ Georgetown Methode zur inhibierung von heregulin und seines rezeptors sowie verwendung zur inhibierung von krebszellen
US5827533A (en) 1997-02-06 1998-10-27 Duke University Liposomes containing active agents aggregated with lipid surfactants
CA2289531C (en) * 1997-05-15 2009-09-29 University Of Washington Composition and methods for treating alzheimer's disease and other amyloidoses
CN1261791A (zh) 1997-07-02 2000-08-02 Sdg有限公司 诊断或治疗用途的靶向脂质体构建物
US6316612B1 (en) 1997-08-22 2001-11-13 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Xylofuranosly-containing nucleoside phosphoramidites and polynucleotides
US6083923A (en) 1997-10-31 2000-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Liposomal oligonucleotide compositions for modulating RAS gene expression
US6787132B1 (en) 1997-12-04 2004-09-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Combined chemo-immunotherapy with liposomal drugs and cytokines
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
RU2130771C1 (ru) * 1998-06-01 1999-05-27 Автушенко Сергей Сергеевич Способ получения липосомальных препаратов
GB9813100D0 (en) 1998-06-18 1998-08-19 Secr Defence Method of forming liposomes
US6200598B1 (en) 1998-06-18 2001-03-13 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
US6726925B1 (en) 1998-06-18 2004-04-27 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
WO2000009071A2 (en) 1998-08-11 2000-02-24 All India Institute Of Medical Sciences A novel liposomal formulation useful in treatment of cancer and other proliferation diseases
DE69935435T2 (de) 1998-08-12 2007-12-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Mittels Ammoniumsulfatgradient hergestellte liposomale analgetische Zusammensetzungen
ATE238039T1 (de) 1998-09-16 2003-05-15 Alza Corp In liposomen eingeschlossene topoisomerase inhibitoren
US6291676B1 (en) 1999-03-03 2001-09-18 University Of Kentucky Research Foundation Water-soluble derivatives of camptothecin/homocamptothecin
US7311924B2 (en) 1999-04-01 2007-12-25 Hana Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer
EP1176962B1 (en) 1999-04-29 2004-02-11 Alza Corporation Liposome compositions for improved drug retention
US6720001B2 (en) 1999-10-18 2004-04-13 Lipocine, Inc. Emulsion compositions for polyfunctional active ingredients
US6511676B1 (en) * 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US20020049176A1 (en) 1999-11-10 2002-04-25 Anderson Christen M. Modulation of mitochondrial mass and function for the treatment of diseases and for target and drug discovery
ES2272496T3 (es) * 2000-02-04 2007-05-01 Lipoxen Technologies Limited Procedimiento de deshidratacion/rehidritacion para la preparacion de lipososmas.
US6545010B2 (en) 2000-03-17 2003-04-08 Aventis Pharma S.A. Composition comprising camptothecin or a camptothecin derivative and a platin derivative for the treatment of cancer
AU6147301A (en) 2000-05-15 2001-11-26 Celgene Corp Compositions and methods for the treatment of colorectal cancer
ES2253398T3 (es) 2000-06-30 2006-06-01 Inex Pharmaceuticals Corp. Camptotecinas liposomales mejoradas y sus usos.
US6486320B2 (en) 2000-09-15 2002-11-26 Aventis Pharma S.A. Preparation of camptothecin and of its derivatives
WO2002036073A2 (en) 2000-11-02 2002-05-10 Smithkline Beecham Corporation Receptor antagonist-lipid conjugates and delivery vehicles containing same
EP1230917A1 (de) 2001-02-08 2002-08-14 Vectron Therapeutics AG Invasomen zur Therapie von Erkrankungen, ihre Herstellung und Verwendung
CN1294991C (zh) * 2001-03-26 2007-01-17 阿尔扎公司 用于改善治疗物质的细胞内传递的脂质体组合物
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
WO2003030864A1 (en) * 2001-05-29 2003-04-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of irinotecan
US7850990B2 (en) 2001-10-03 2010-12-14 Celator Pharmaceuticals, Inc. Compositions for delivery of drug combinations
DE60237162D1 (de) 2001-10-03 2010-09-09 Celator Pharmaceuticals Inc Liposomenladung mit metallionen
ITBO20010610A1 (it) * 2001-10-05 2003-04-05 Haworth S P A Dispositivo per la connessione di gambe ad elementi di arredamento, ed elemento di arredamento comprendente tale dispositivo
US20030129224A1 (en) 2001-11-13 2003-07-10 Paul Tardi Lipid carrier compositions and methods for improved drug retention
JP4555569B2 (ja) 2001-11-13 2010-10-06 セレーター ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 増強された血中安定性を有する脂質キャリア組成物
US20030220284A1 (en) 2002-02-22 2003-11-27 Patricia Yotnda Delivery of adenoviral DNA in a liposomal formulation for treatment of disease
AU2003231157C1 (en) 2002-04-29 2009-02-26 Normoxys, Inc. Inositol pyrophosphates, and methods of use thereof
CA2486007C (en) 2002-05-15 2011-11-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
EP2823809B1 (en) 2002-06-28 2016-11-02 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
US20040243101A1 (en) 2002-07-02 2004-12-02 Gillis Edward M. Minimally invasive drug delivery catheter
AU2003296897A1 (en) 2002-08-20 2004-05-04 Neopharm, Inc. Pharmaceutical formulations of camptothecine derivatives
AR036316A1 (es) 2002-08-29 2004-08-25 Monte Verde S A Una composicion farmaceutica de liposomas de tamano pequeno y metodo de preparacion
DE10242367A1 (de) 2002-09-12 2004-03-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Thermolabiles Liposom mit geregelter Freigabetemperatur
AU2003293140A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Gilead Sciences, Inc. Method of drug loading in liposomes by gradient
EP1643972A4 (en) * 2003-06-27 2010-01-20 Smithkline Beecham Corp STABILIZED LIPOSOMAL TOPOTECAN COMPOSITION AND METHOD
EP2338525A3 (en) 2003-07-09 2011-08-03 California Pacific Medical Center Remote detection of substance delivery to cells
KR20070057701A (ko) 2004-03-17 2007-06-07 토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템 면역응답 시스템을 이용한 약물전달 시스템
KR101376895B1 (ko) 2004-05-03 2014-03-25 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
JP4885715B2 (ja) 2004-06-01 2012-02-29 テルモ株式会社 イリノテカン製剤
WO2006002050A1 (en) 2004-06-15 2006-01-05 Encore Therapeutics, Inc. Phospholipid compositions and methods for their preparation and use
MX2007003850A (es) 2004-10-05 2007-11-21 Genzyme Corp Canula escalonada.
US20060129126A1 (en) 2004-11-19 2006-06-15 Kaplitt Michael G Infusion device and method for infusing material into the brain of a patient
US20060127467A1 (en) 2004-12-14 2006-06-15 Watkin Kenneth L Nanoparticles for delivery of therapeutic agents using ultrasound and associated methods
DK1827480T3 (en) 2004-12-21 2017-01-09 Musc Found For Res Dev FORMATIONS AND PROCESSES FOR PROMOTING WOUND HEALING AND tissue regeneration
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
US7842676B2 (en) 2005-10-25 2010-11-30 Celator Pharmaceuticals, Inc. Fixed ratio drug combination treatments for solid tumors
EP1976485A4 (en) 2005-12-22 2011-10-26 Celator Pharmaceuticals Inc LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SECONDARY AND TERTIARY AMINES AND METHODS FOR THE PREPARATION OF SAID FORMULATIONS
WO2007124465A2 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Amgen Inc. Stable emulsion formulations
GB0614835D0 (en) 2006-07-26 2006-09-06 Isis Innovation Formation of bilayers of amphipathic molecules
SG178789A1 (en) 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
EP2187869B1 (en) 2007-08-17 2015-10-14 Celator Pharmaceuticals, Inc. Improved platinum drug formulations
CA2700810A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Universitatsspital Basel Immunoliposomes for treatment of cancer
WO2009059449A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Celsion Corporation Novel thermosensitive liposomes containing therapeutic agents
US8067432B2 (en) 2008-03-31 2011-11-29 University Of Kentucky Research Foundation Liposomal, ring-opened camptothecins with prolonged, site-specific delivery of active drug to solid tumors
US8852630B2 (en) 2008-05-13 2014-10-07 Yale University Chimeric small molecules for the recruitment of antibodies to cancer cells
AU2013202947B2 (en) * 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
WO2016168451A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions for improving the pharmacokinetics and therapeutic index of cancer treatment
EP3337467B1 (en) 2015-08-20 2020-12-09 Ipsen Biopharm Ltd. Combination therapy using liposomal irinotecan and a parp inhibitor for cancer treatment
US20180110771A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Ipsen Biopharm Ltd. Liposomal Irinotecan Preparations
CA3001467A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions
US20170202840A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Treatment of pancreatic cancer with liposomal irinotecan
US20170333421A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Ipsen Biopharm Ltd. Population Pharmacokinetics of Liposomal Irinotecan
BR112019007844A2 (pt) * 2016-11-02 2019-07-16 Ipsen Biopharm Ltd tratamento de câncer gástrico usando terapias de combinação compreendendo irinotecano lipossômico, oxaliplatina, 5-fluoroacila (e leucovorina)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5785987A (en) * 1995-02-27 1998-07-28 The University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles
WO1998017256A1 (en) * 1996-10-22 1998-04-30 Dmitri Kirpotin Compound-loaded liposomes and methods for their preparation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TZUNG-HAN CHOU "Effect of Composition on the Stability of liposomal Irinotecan Prepared by pH Gradient Method", Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003, vol. 95, nr.4, s. 405-408, Dated: 01.01.0001 *
YUN-LONG TZENG "Sterically Stabilized anti-idiotype immunoliposomes improve the therapeutic efficacy of doxorubicin in a murine B-cell lymphoma model", Int. J. Cancer, 1999, vol. 80, side 723-730, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170079912A1 (en) 2017-03-23
US20120171283A1 (en) 2012-07-05
US9724303B2 (en) 2017-08-08
US20160339014A1 (en) 2016-11-24
US20160095852A1 (en) 2016-04-07
EP3173073A1 (en) 2017-05-31
CA2821167A1 (en) 2005-11-17
RU2011112461A (ru) 2012-10-10
US20160030342A1 (en) 2016-02-04
CN103948545B (zh) 2017-10-03
US20140154298A1 (en) 2014-06-05
NL300885I1 (no) 2017-07-19
US9782349B2 (en) 2017-10-10
KR101462825B1 (ko) 2014-11-21
RU2424792C2 (ru) 2011-07-27
US10350201B2 (en) 2019-07-16
FR17C1027I2 (fr) 2020-09-04
KR20130032401A (ko) 2013-04-01
KR101223366B1 (ko) 2013-01-16
NO20065532L (no) 2006-12-13
TW200605908A (en) 2006-02-16
LUC00026I1 (no) 2017-07-11
KR20120082039A (ko) 2012-07-20
US20170079914A1 (en) 2017-03-23
US9717723B2 (en) 2017-08-01
RU2574926C9 (ru) 2020-06-16
US20170079913A1 (en) 2017-03-23
EP1746976A4 (en) 2010-09-29
JP2014055172A (ja) 2014-03-27
US8992970B2 (en) 2015-03-31
EP4218730A1 (en) 2023-08-02
CN103948545A (zh) 2014-07-30
CA2821167C (en) 2016-06-28
JP4971142B2 (ja) 2012-07-11
US9730891B2 (en) 2017-08-15
PT1746976T (pt) 2017-04-24
WO2005107712A1 (en) 2005-11-17
EP1746976A1 (en) 2007-01-31
LUC00026I2 (no) 2017-09-08
AU2005240131A1 (en) 2005-11-17
US8703181B2 (en) 2014-04-22
FR17C1027I1 (no) 2017-09-08
JP5502842B2 (ja) 2014-05-28
CA3006109A1 (en) 2005-11-17
EP4218730B1 (en) 2023-11-01
DK1746976T3 (en) 2017-04-10
HK1252167A1 (zh) 2019-05-17
TWI359029B (en) 2012-03-01
US20170340624A1 (en) 2017-11-30
JP2007536247A (ja) 2007-12-13
US20160106672A1 (en) 2016-04-21
US20230181567A1 (en) 2023-06-15
KR20070036055A (ko) 2007-04-02
EP1746976B1 (en) 2017-01-11
RU2015155368A (ru) 2017-06-28
US20160030341A1 (en) 2016-02-04
HK1200694A1 (en) 2015-08-14
US10722508B2 (en) 2020-07-28
US20150182460A1 (en) 2015-07-02
US20210137914A1 (en) 2021-05-13
US20160081928A1 (en) 2016-03-24
CN107811971A (zh) 2018-03-20
US8329213B2 (en) 2012-12-11
KR101376895B1 (ko) 2014-03-25
NO2021004I1 (no) 2021-01-22
US20130122081A1 (en) 2013-05-16
US8147867B2 (en) 2012-04-03
US20160338956A1 (en) 2016-11-24
JP2012092119A (ja) 2012-05-17
US20160095817A1 (en) 2016-04-07
KR101462819B1 (ko) 2014-11-21
US10413510B2 (en) 2019-09-17
US20180235954A1 (en) 2018-08-23
KR20140000348A (ko) 2014-01-02
RU2015155368A3 (no) 2019-08-19
CA2566007C (en) 2013-09-24
UA86063C2 (ru) 2009-03-25
CN107811971B (zh) 2021-10-29
PL1746976T3 (pl) 2017-09-29
ES2616047T3 (es) 2017-06-09
US20070116753A1 (en) 2007-05-24
CA2566007A1 (en) 2005-11-17
US11052079B2 (en) 2021-07-06
US20170071858A1 (en) 2017-03-16
US20180169014A1 (en) 2018-06-21
JP5665950B2 (ja) 2015-02-04
RU2757110C2 (ru) 2021-10-11
RU2006142766A (ru) 2008-06-20
CN1980637A (zh) 2007-06-13
NL300885I2 (nl) 2022-02-24
AU2005240131B2 (en) 2011-03-03
CN1980637B (zh) 2014-02-19
CA2928387A1 (en) 2005-11-17
AU2005240131C1 (en) 2014-05-08
ES2967961T3 (es) 2024-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210137914A1 (en) Liposomes Useful for Drug Delivery
AU2016203354B2 (en) Liposomes useful for drug delivery
RU2574926C2 (ru) Липосомные композиции, используемые для доставки лекарственных средств

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: IPSEN BIOPHARM LTD., GB

SPCF Filing of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: IRINOTECAN SUKROSOFATSALT; REG. NO/DATE: EU/1/16/1130 20161104

Spc suppl protection certif: 2021004

Filing date: 20210122

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: IRINOTEKAN SUKROSOFATSALT; REG. NO/DATE: EU/1/16/1130 20161104

Spc suppl protection certif: 2021004

Filing date: 20210122

Extension date: 20300502