RU2765736C2

RU2765736C2 - Гиперстабилизированные липосомы, повышающие направленное таргетирование митотических клеток

Info

Publication number: RU2765736C2
Application number: RU2019125724A
Authority: RU
Inventors: Чан Чжи Адриан НГ; Шень-И Айан ЧЕОНГ
Original assignee: Темасек Лайф Сайенсиз Лаборатори Лимитед
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2022-02-02
Also published as: IL268099B2; SG11201906539YA; EP3570818A4; JP7232530B2; RU2019125724A; US11331272B2; CO2019008876A2; MA47319A; CL2019002002A1; EP3570818B1; EP3570818A1; BR112019014718A2; WO2018136002A1; CA3050686A1; SG10202107836SA; TW201828925A; PH12019501650A1; MX2019008533A; IL268099A; AU2018210748A1

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к гиперстабильной липосоме для лечения рака, содержащей внутреннюю среду, отделенную от внешней среды мембраной, где внутренняя среда содержит противомитозное лекарственное средство, два катиона, заключенные во внутреннюю среду, где противомитозным лекарственным средством является ингибитор polo-подобной киназы, где мембрана содержит 1,2-дистеароил-sn-глицерин-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (ДСФЭ-ПЭГ2000), гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин (ГЯФХ), и холестерин (Хол), где молярное соотношение ГЯФХ:Хол:ДСФЭ-ПЭГ2000 составляет 50:45:5, где два аниона представляют собой цитрат и фосфат, цитрат и ацетат или ацетат и фосфат в молярном соотношении 1:3 или 1:4, и где заключенное противомитозное лекарственное средство имеет медленную скорость выделения из гиперстабильной липосомы, которая количественно составляет менее 0,6% за 12 часов или менее 5% за 8 дней, где гиперстабильные липосомы суспендированы в 600 мМ сахарозе, также относится к липосомальной композиции для лечения рака, содержащей гиперстабильную липосому в водной среде и к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей гиперстабильную липосому и фармацевтически приемлемый эксципиент, также относится к гиперстабильной липосоме для применения в качестве лекарственного средства для лечения рака у субъекта. Группа изобретений обеспечивает создание липосом, которые максимизируют временное воздействие агента, ингибирующего митоз для того, чтобы увеличить долю делящихся раковых клеток, на которую может воздействовать агент, ингибирующий митоз. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 ил., 5 пр.

Description

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области лечения рака. Более конкретно, изобретение относится к гиперстабильным липосомам, применяемым для лечения рака и к способам лечения рака с применением гиперстабильных липосом.

Публикации и другие материалы, применяемые здесь для освещения области техники изобретения или получения дополнительных подробностей относительно практики, включены сюда в качестве ссылки, и для удобства соответственно перечислены в Библиографии.

Если рак в основном является состоянием чрезмерного деления клеток, то ферменты, регулирующие митоз, должны стать отличными противораковыми лекарственными мишенями. Действительно, именно успех агентов, целенаправленно воздействующих на микротрубочки (АЦВМ), как класса лекарств, побудил к поиску более специфических способов ингибирования митоза, что позволило избежать периферической невропатии, связанной с АЦВМ [1-3]. Ферментные регуляторы, которые играют ключевую роль в митозе, такие как Polo-подобные киназы (PLK) [4,5], кинезин-веретенообразный белок (KSP) [6,7] и аврора-киназы [8,9] сразу же стали высокоприоритетными лекарственными мишенями. Однако, несмотря на более 10 миллиардов долларов США, потраченных на разработку 25 митоз-специфических агентов, эффективность была низкой и клиническая эффективность не сообщалась [10,11].

Однако регулирующие митоз ферменты могут быть по своей природе плохими лекарственными мишенями, потому что только ограниченная часть опухолевых клеток фактически делится в любой момент времени. Как кратко указано у Komlodi-Pasztor et al [10], «для того, чтобы таргетная терапия была эффективной, мишень должна присутствовать». Этот аргумент подразумевает, однако, что ферменты, регулирующие митоз, возможно, все еще могут быть эффективными, если биодоступность опухоли может временно поддерживаться. Тот факт, что доклиническое тестирование ингибитора PLK BI 2536 только показало уменьшение опухоли при введении два раза в неделю [4], подтверждает идею о том, что устойчивая биодоступность увеличивает вероятность захвата опухолевой клетки в процессе деления клетки.

Липосомы являются хорошо известными коллоидными частицами, которые применяют для доставки лекарственных средств. Хорошо известно, что малые молекулы, включая лекарственные средства, могут быть ʺудаленно загруженыʺ в липосомы созданием физико-химического дифференциала между внутренней и внешней окружающей средой липосомы [16-18]. Важно отметить, что лекарственное средство должно обладать способностью проникать через мембрану во внешнюю среду, но становиться заряженным и, следовательно, захватываться при диффузии во внутреннюю среду. Если лекарство является слабым основанием, одним из способов создания этого дифференциала является инкапсулирование буферных анионов во внутреннюю часть липосомы, что создает низкий рН относительно внешней среды.

Известно, что липосомы используют порозность эндотелия опухоли для доступа и выживания в опухолевых тканях [12,13]. Это явление, называемое эффект Улучшенной проницаемости и удержания (УПУ), впервые было продемонстрировано с доксорубицином, что дало липосомальное противораковое лекарственное средство Doxil™ [14,15]. Оказалось, что стабильность липосомального инкапсулирования является обоюдоострым мечом, как продемонстрировал Doxil™. С одной стороны, снижается воздействие лекарственного средства на здоровую ткань. С другой стороны, медленное вытекание доксорубицина из липосом тормозит эффективность, потому что большинству противораковых препаратов для эффективности необходимы высокие опухолевые концентрации.

В отличие от доксорубицина, BI 2536 является эффективным при 1000-й концентрации доксорубицина, подразумевая, что длительное воздействие, а не максимальная концентрация должны значительно повысить эффективность.

Желательно разработать системы, которые бы максимизировали временное воздействие агента, ингибирующего митоз, чтобы увеличить долю делящихся раковых клеток, на которую может воздействовать агент, ингибирующий митоз.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, в одном аспекте, данное изобретение относится к гиперстабильным липосомам, инкапсулирующим противомитозное лекарственное средство. В некоторых вариантах, противомитозным лекарственным средством является BI 2536, Испинесиб (SB 715992), MK 0457 (VX 680), AZD 1152, PHA 680632, PHA 739358, MLN8054, MLN8237, R763, AT9283, SNS 314, SU 6668, ENMD 2076, BI 811283, CYC116, ENMD 981693, MKC 1693, ON01910, GSK 461364, HMN 214, BI 6727, SB 743921, MK 0731 или ARRY 520. В некоторых вариантах, любая подходящая липосомальная составляющая может применяться для получения гиперстабильных липосом. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы пространственно стабилизированы. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы получают из жировой смеси, содержащей ГЯФХ:Хол:DSPE-PEG2000 (ГЯФХ: гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин; Chol: холестерин; DSPE-PEG-2000: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] в молярном отношении 50:45:5. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы содержат внутреннюю среду, имеющую один или более анионов, предпочтительно, два или более анионов, которая предназначена для медленного выделения противомитозного агента из гиперстабильных липосом. В некоторых вариантах, один или более анионов, предпочтительно, два или более анионов, могут быть такие, как описаны здесь. В некоторых вариантах, внутренняя среда содержит один или более катионов. В некоторых вариантах, один или более катионов могут быть такими, как описаны здесь. Наилучшее сочетание анионов и катионов может быть легко определено для данного противомитозного лекарственного средства с помощью описанных здесь методов.

В некоторых вариантах, представлена фармацевтическая композиция, которая содержит гиперстабильные липосомы, описанные здесь, с или без по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого эксципиента и/или носителя. Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты и носители хорошо известны в данной области техники.

Во втором аспекте, в данном изобретении представлен способ лечения рака с применением гиперстабильных липосом, описанных здесь. Согласно этому способу, терапевтически эффективное количество гиперстабильных липосом вводят пациенту, например, человеку, нуждающемуся в лечении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана методика изучения способности BI 2536 отделяться из различных солевых растворов в гексанол.

На фиг. 2 показана относительная флуоресценция BI 2536, экстрагированного в гексанол из различных растворов одноанионных солей с применением методики, описанной на фиг. 1. Разделение BI 2536 в гексанол и солевой раствор зависит от идентификации и концентрации аниона соли. Применяемые аббревиатуры означают цитрат (C), ацетат (A), фосфат (P), 2-(N-морфолино)этансульфонат (M) и хлористоводородную кислоту (H). Все солевые растворы имеют концентрацию 0,8M и доводят до pH 3 натрием в качестве катиона. Столбики ошибок представляют стандартные ошибки.

На фиг.3 показана относительная флуоресценция BI 2536, экстрагированного в гексанол из различных парных сочетаний анионов с применением методики, описанной на фиг. 1. Настройка молярных соотношений парных сочетаний анионов может повлиять на отделение BI 2536 в гексанол. Все соли имеют концентрацию 0,8 M и доводят до pH 3 натрием в качестве катиона. Отдельные соли имеют концентрацию 0,8 M. Число перед аббревиатурой означает концентрацию, отличную от 0,8 M от общей концентрации соли.

На фиг. 4 показаны скорости выделения, увязанные с EC₅₀ для липосомального BI2536, но не липосомального Доксорубицина. Непрерывное множество скоростей высвобождения лекарственного средства было создано с использованием одиночных и парных сочетаний следующих анионов для выполнения градиентной нагрузки: цитрат (C), ацетат (A), фосфат (P), 2-(N-морфолино)этансульфонат (M) и хлористоводородная кислота (H). Аббревиатуры из двойных букв означают парные сочетания анионов, каждая в половину от общей концентрации. Графики рассеяния цитотоксичности (EC₅₀) к скоростям выделения для BI 2536 (верх) и Доксорубицина (низ) показаны для гипотонических (водных) и гипертонических условий (сахароза). Столбчатая диаграмма показывает EC₅₀ к композициям, ранжированным по скоростям выделения для тех же данных. Пунктирные линии для всех графиков показывают EC₅₀ не инкапсулированного лекарственного средства. Скорости выделения основаны на количестве лекарственного средства, выделившегося через 12 часов инкубации. Представлены ранговая корреляция Спирмана (r _s) и соответствующие p-значения.

На фиг. 5A и 5B показана эффективность липосомального BI 2536, скорректированная на настройку соотношения цитрат:фосфат. На фиг. 5A: показаны графики рассеяния EC₅₀ к скорости выделения, измеренной в 3 и 8 дни для разных соотношений цитрат:фосфат (C:P). На фиг. 5B: мышей с ксенотрансплантатом HCT116 клеток рака прямой и ободочной кишки лечат одной дозой липосомального BI 2536, составленной при различных соотношениях C:P. 3 мышей применяют в каждом экспериментальном направлении. Представлены объемы и массы опухолей. Столбики ошибок представляют стандартные ошибки.

На фиг. 6A и 6B показана in vivo эффективность и токсичность липосомального BI 2536 у мышей с ксенотрансплантатами HCT116. Объемы и массы опухолей и кривые выживания Каплана-Мейера показаны для лечения одной дозой в 0 день (фиг. 6A) или двумя дозами в 0 и 7 дни (фиг. 6B). Все лечения липосомальным BI 2536 составлены с различными соотношениями цитрат:фосфат (C:P), как указано, и введены в дозе 340 мг/кг после учета эффективности инкапсулирования. Свободный BI2536 вводят в максимально переносимой дозе 100 мг/кг. Столбики ошибок представляют стандартные ошибки. Объемы опухолей значительно отличаются (p <0,05) для гиперстабильных липосом (C:P=1:3)) и других групп начиная с 9 дня для одной дозы, и начиная с 14 дня для двух доз. Мыши, леченные C:P(1:3), выживали значительно дольше (p <0,05), чем другие группы. Кривая Каплана-Мейера показывает процент выживания в течение времени. Галочки означают смертельные случаи. Разница между BI-L2C6P и всеми другими лечениями была значительной, Log-ранговые p-значения Мантеля-Кокса представлены для кривых выживания, показывая, что мыши, леченные C:P(1:3) выживали значительно дольше и для одной (p=0,0164) и для двух (p=0,0349) доз.

На фиг. 7A-7D показано фармакокинетическое распределение и биодоступность BI 2536 после лечения гиперстабильным липсомным BI 2536. (Фиг. 7A): мышей, имеющих ксенотрансплантат HCT116, лечат BI 2536, инкапсулированным с применением различных соотношений цитрат:фосфат. Каждая единица данных включает 3 мышей. BI 2536 экстрагируют из тканей в различные моменты времени, количественно определенные флуорометрией. Единицы данных и столбики ошибок представляют средние и стандартные ошибки, соответственно. Значительные различия (p <0,05) между гиперстабильными липосомами (C:P=1:3) и другими группами показаны звездочками. (Фиг. 7B): показано воздействие на ткань BI 2536, измеренное площадью под кривой. (Фиг. 7C): показан процент митотически подавленные клетки через 1,5 и 5,5 дней после лечения. Каждый столбик получают из 6 отдельных визуальных полей 2 не соседних H&E окрашенных секций. Столбики ошибок представляют стандартные ошибки. (Фиг. 7D): типовые H&E изображения показаны для различных способов лечения. Стрелки указывают на примеры митотически подавленных клеток. Масштаб 10 мкм.

На фиг. 8A и 8B показана in vivo эффективность липосомального BI 2536 у мышей с ксенотрансплантатом HCT116. Объемы опухолей показаны для лечения одной дозой на 0 день (фиг. 8A) липосомами, составленными в разными соотношениями цитрат:ацетат и (фиг. 8B) липосомами, составленными с разными соотношениями цитрат:ацетат, но с замещением катиона натрия аммонием. Все составы вводят в дозе 340 мг/кг BI 2536. Столбики ошибок представляют стандартные ошибки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области лечения рака. Более конкретно, изобретение относится к гиперстабильным липосомам, применяемым для лечения рака, и к способам лечения рака с применением гиперстабильных липосом. Было обнаружено, что экстремальное продление выделения ингибирующего митоз лекарственного средства из гиперстабильных липосом улучшает эффективность лечения рака через повышение доли поражаемых раковых клеток. Медленное выделение ингибирующего митоз лекарственного средства из гиперстабильных липосом коррелированно с in vitro и in vivo уничтожением раковых клеток. В одном примере у мышей с ксенотрансплантатом, леченных одной дозой гиперстабильного липосомального BI 2536, наблюдается снижение объемов опухолей, длящееся 12 дней, и полные реакции у 20% леченных мышей. Лечение двумя дозами с интервалом в неделю увеличивает частоту ответа до 75% леченных мышей.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение.

Термин «около» или «приблизительно» означает в пределах статистически значимого диапазона значения. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 50%, более предпочтительно в пределах 20%, еще более предпочтительно в пределах 10% и еще более предпочтительно в пределах 5% от заданного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое терминами «около» или «приблизительно», зависит от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценено специалистом в данной области техники.

Используемый здесь термин «рак» относится к группе заболеваний, связанных с аномальным ростом клеток, которые могут проникать или распространяться в другие части тела. Рак включает карциномы, такие как глиома, рак головы и шеи, почек, легких, медуллобластома, меланома, карцинома Меркеля, мезотелиома, нейробластома, рак пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, яичек, щитовидной железы; лейкозы, такие как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфобластный Т-клеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз, В-клеточный лейкоз; лимфомы, такие как анапластическая крупноклеточная лимфома, В-клеточная лимфома, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина; и миеломы.

Термин ʺлекарственное средство, ингибирующее митозʺ означает лекарственное средство, которое нацелено на ферменты, регулирующие митоз, такие как ферменты, регулирующие микротрубочки, Polo-подобные киназы (PLK), кинезин-веретенообразный белок (KSP), аврора-киназы и подобные. Термин ʺпротивомитозное лекарственное средствоʺ или ʺантимитозное лекарственное средствоʺ могут применяться взаимозаменяемо с ʺлекарственным средством, ингибирующим митоз.ʺ

В данном описании, ʺгиперстабильная липосомаʺ относится к инкапсулированному в липосому лекарственному средству, имеющему медленное выделение лекарственного средства благодаря, частично, анионам и катионам, присутствующим во внутренней среде липосомы. Наиболее медленная скорость выделения для гиперстабильных липосом тесно связана с уничтожением раковых клеток.

Термин ʺмедленное выделение лекарственного средстваʺ относится к количественно подсчитанному выделению лекарственного средства из инкапсулированного в липосому лекарственного средства, составляющему менее 0,6% за 12 часов или менее 5% за 8 дней, когда липосомы суспендированы в 600 мМ сахарозы.

В одном аспекте, в данном изобретении представлены гиперстабильные липосомы, инкапсулирующие противомитозное лекарственное средство. В некоторых вариантах, противомитозным лекарственным средством является ингибитор polo-подобной киназы, такой как BI 2536, ON01910, GSK 461364, HMN 214 или BI 6727. В других вариантах, противомитозным лекарственным средством является ингибитор кинезин-веретенообразного белка, такой как Испинесиб (SB 715992), SB 743921, MK 0731 или ARRY 520. В некоторых вариантах, противомитозным агентом является ингибитор аврора-киназы, такой как MK 0457 (VX 680), AZD 1152, PHA 680632, PHA 739358, MLN8054, MLN8237, R763, AT9283, SNS 314, SU 6668, ENMD 2076, BI 811283, CYC116, ENMD 981693 или MKC 1693. В некоторых вариантах, противомитозным агентом является BI 2536 или Испинесиб.

В некоторых вариантах, любая подходящая липосомальная составляющая может применяться для получения гиперстабильных липосом. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы пространственно стабилизированы. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы получают из жировой смеси, содержащей ГЯФХ:Хол:DSPE-PEG2000 (ГЯФХ: гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин; Chol: холестерин; DSPE-PEG-2000: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] в молярном отношении 50:45:5.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы содержат внутреннюю среду, имеющую один или более анионов, предпочтительно, два или более анионов, которые обеспечивают медленное выделение противомитозного агента из гиперстабильных липосом. В некоторых вариантах, одним или более анионами или, предпочтительно, двумя или более анионами могут быть цитрат, ацетат, фосфат, 2-(N-морфолино)этансульфонат, хлорид, цитрат и ацетат, цитрат и 2-(N-морфолино)этансульфонат, цитрат и хлорид, ацетат и фосфат, ацетат и 2-(N-морфолино)этансульфонат, ацетат и хлорид, фосфат и 2-(N-морфолино)этансульфонат, фосфат и хлорид, 2-(N-морфолино)этансульфонат и хлорид. В некоторых вариантах, хлорид находится в форме HCl. В некоторых вариантах, соотношение двух анионов может быть от около 1:7 до около 7:1. В других вариантах, соотношение двух анионов может быть от около 1:3 до около 3:1. В некоторых вариантах, анионами являются цитрат:фосфат в соотношении от около 1:3 до около 1:7, предпочтительно, около 1:3. В некоторых вариантах, анионами являются цитрат:ацетат в соотношении от около 1:3 до около 3:1, предпочтительно, около 1:3. В некоторых вариантах, внутренняя среда содержит один или более катионов. В некоторых вариантах, одним или более катионами могут быть натрий, аммоний, триэтиламмоний, медь, магний, цинк или железо. Наилучшие сочетания и соотношения анионов и катионов могут быть легко определены для данного противомитозного лекарственного средства экспериментально на мышах, например, с применением описанных здесь методик.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением могут содержать один или более анионов в соответствии с данным изобретением в любой подходящей форме, например, в форме кислоты или соли, содержащей полианион и катион, предпочтительно, в виде соли. Количество аниона может быть стехиометрически эквивалентным или отличаться от количества катиона. В некоторых вариантах, гиперстабильная липосома в соответствии с данным изобретением содержит одну или более анионных солей катиона, где имеется градиент концентрации катиона или градиент pH через мембрану липосомы. В другом варианте, гиперстабильная липосома в соответствии с данным изобретением содержит одну или более аммониевых анионных солей в соответствии с данным изобретением. В еще одном варианте, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением содержат анионы внутри гиперстабильных липосом, а анионы в среде, содержащей гиперстабильные липосомы частично или по существу удаляют любыми подходящими средствами, известными специалисту в данной области техники, например, разбавлением, ионообменной хроматографией, эксклюзионной хроматографией, диализом, ультрафильтрацией, абсорбцией, осаждением и т.д. В некоторых вариантах, гиперстабильная липосома с заключенным анионом(ами) также имеет трансмембранный градиент, эффективный для удерживания веществ в гиперстабильной липосоме. Примеры таких трансмембранных градиентов включают pH градиент, градиент электрохимического потенциала, катионный ионный градиент или градиент растворимости. Способы создания трансмембранных градиентов известны в области липосом.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы проникают в целевые клетки, используя порозность эндотелия опухоли. В других вариантах, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением также могут быть направленными липосомами, например, липосомами, содержащими одну или более направленную группу или модификаторы биораспределения на поверхности липосом. Направленной группой может быть любой агент, который способен специфически связываться или взаимодействовать с желаемым агентом. В некоторых вариантах, направленной группой является лиганд. В некоторых вариантах, лиганд преимущественно связывается с поглощается клеткой, в которой заключенное в липосому вещество оказывает желаемое действие (целевой клеткой). Лиганд обычно является членом связывающей пары, где второй член присутствует на или в целевых клетках или в ткани, содержащей целевую клетку. См., например, патент США № 8,922,970, включенный сюда в качестве ссылки.

Липосомы в соответствии с данным изобретением могут быть получены любым подходящим способом, известным или позднее обнаруженным специалистом в данной области техники. См., например, Gregoriadis [25], патент США № 8,992,970 и патент США № 9,023,384, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Липосомы обычно производят с применением различных методов, в которых водорастворимые (гидрофильные) материалы заключены с применением водного раствора этих материалов в виде гидрирующей жидкости или добавлением лекарственного средства/раствора лекарственного средства на некоторой стадии во время производства липосом. Жирорастворимые (липофильные) материалы солюбилизируют в органическом растворе составляющей жидкости и затем выпарены до сухого лекарственного средства, содержащего жировую пленку после его гидратации. Эти способы включают загрузку заключенных агентов до или во время производства (пассивная загрузка). Однако, определенный тип соединений с ионизируемыми группами, и такие, которые демонстрируют растворимость и в жире и в воде, могут быть введены в липосомы после образования неизменных везикул (удаленная или активная загрузка).

При получении липосом со смешанной жировой композицией, жиры сначала растворяют и смешивают в органическом растворителе для получения гомогенной смеси жиров. В некоторых вариантах, органическим растворителем является хлороформ или смеси хлороформ:метанол. Как только жиры тщательно смешаны в органическом растворителе, растворитель удаляют с получением жировой пленки. В некоторых вариантах, органический растворитель удаляют роторным испарением при пониженном давлении с получением тонкой жировой пленки на сторонах круглодонной колбы. Жировую пленку обычно тщательно сушат в течение ночи в высоком вакууме для удаления остаточного органического растворителя. Гидратацию сухой жировой пленки осуществляют добавлением водного буферного раствора в контейнер с сухим жиром и перемешиванием при температуры выше температуры перехода жира. Этот способ дает популяцию мультиламеллярных липосом (МЛЛ), гетерогенных и по размеру, и по форме (например, 1-5 мкм в диаметре). Методики снижения размера липосомы, такие как обработка ультразвуком для образования одиночных моноламеллярных везикул (ОМВ) или экструзия через поликарбонатные фильтры с образованием больших моноламеллярных везикул (БМВ). Дополнительные подробности и другие способы получения липосом с инкапсулированными лекарственными средствами могут быть найдены у Fritze et al. [16], Dua et al. [20], Laouini et a. [21], патенте США № 8,992,970 и патенте США № 9,023,384, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением составлены в наноразмере с применением насыщенного фосфатидилхолина, сопряженного с высоким содержанием холестерина для снижения проницаемости мембраны. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы далее составляют с применением ПЭГилирования или другого конъюгирования для пространственной стабилизации. В других вариантах, насыщенный фосфатидилхолин может быть заменен другими фосфолипидами, образующими мембрану. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы получают с применением обычных методик или описанных здесь. В некоторых вариантах, фосфолипидами, образующими мембрану, являются насыщенный фосфатидилхолин (ФХ), любой синтетический фосфатидилхолин (ФХ) с конечными насыщенными жирными кислотами, или жиры, образующие мембрану. В некоторых вариантах, синтетическим ФХ может быть димиристоил-фосфатидилхолин, дипальмитоил-фосфатидилхолин или дистеароил-фосфатидилхолин. В некоторых вариантах, насыщенным фосфатидилхолином (ФХ) является фосфатидилхолин гидрированного яичного желтка (ФГЯЖ). В других вариантах, жиром, образующим мембрану, является насыщенный сфингомиелин, насыщенный фосфатидилэтаноламин, насыщенный фосфатидилглицерин, насыщенный фосфатидилинозит или насыщенный фосфатидилсерин.

В некоторых вариантах, конъюгатом может быть полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полибутиленгликоль или сополимер полиалкиленгликолей, такой как блок-сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля), декстран, пуллулан, фикол, поливиниловый спирт, чередующиеся сополимеры стирола и малеинового ангидрида, чередующиеся сополимеры дивинилового эфира и малеинового ангидрида, амилоза, амилопектин, хитозан, маннан, циклодекстрин, пектин или каррагинан. В некоторых вариантах, полиэтиленгликоль (ПЭГ) применяют в качестве конъюгата (К-ПЭГ). В некоторых вариантах, ПЭГ имеет молекулярную массу от около 500 до около 10000, предпочтительно, от около 1000 до около 5000, более предпочтительно, около 2000.

В некоторых вариантах, ПЭГ или другой конъюгат конъюгируют с дистеароилфосфатидилэтаноламином (ДСФЭ), дипальмитоилфосфатидилэтаноламином (ДПФЭ), димиристоилфосфатидилэтаноламином (ДМФЭ), дистеароилглицерином (ДСГ), димиристоилглицерином (ДМГ), холестерилированным конъюгатом, конъюгатом стеарила (СТР), конъюгатом C8 церамида или конъюгатом C16 церамида. В некоторых вариантах, конъюгатом является ПЭГ2000 и конъюгатом является ДСФЭ-ПЭГ2000, ДПФЭ-ПЭГ2000, ДМФЭ-ПЭГ2000, ДСГ-ПЭГ2000, ДМГ-ПЭГ2000, холестерированный-ПЭГ2000, СТР-ПЭГ2000, C8 церамид-ПЭГ2000 или C16 церамид-ПЭГ2000.

В некоторых вариантах, пространственно стабилизированные липосомы получают из препаративной смеси ФХ:холестерин:C-ПЭГ, в котором молярное соотношение ФХ:холестерин обычно составляет 2:1-1:1 с C-ПЭГ, обычно присутствующем в количестве 5% (моль/моль). В некоторых вариантах, препаративная смесь ФХ:холестерин:C-ПЭГ имеет молярное соотношение 50:45:5. В некоторых вариантах, препаративной смесью является ГЯФХ:холестерин:ДСФЭ-ПЭГ2000. В некоторых вариантах, препаративная смесь ГЯФХ:холестерин:ДСФЭ-ПЭГ2000 имеет молярное соотношение 50:45:5.

В некоторых вариантах, липосомы получают солюбилизацией препаративной смеси, описанной здесь, в хлороформе. Этот раствор сушат до тонкой пленки роторным испарением и затем в вакууме в течение ночи. Пленку гидратируют гидратационным буфером, содержащим желаемый солевой раствор, такой как описано здесь, в качестве внутренней среды липосомы и погружают в соникатор с водяной баней. Смесь липосом сначала обрабатывают ультразвуком и затем экструдируют с получением ОМВ. В некоторых вариантах, ОМВ диализируют против сахарозы для изменения внешней среды липосом.

В некоторых вариантах, ингибирующее митоз лекарственное средство активно загружают в липосомы через способ pH градиента, хорошо известный в данной области техники. В некоторых вариантах, ингибирующее митоз лекарственное средство сначала покрывают тонкой пленкой в подходящем сосуде и затем сушат. В некоторых вариантах, липосомы загружают в 3:1 концентрации жир:лекарственное средство и разбавляют до этой желаемой концентрации водой. Смесь затем инкубируют на высокотемпературной водяной бане для усиления загрузки и затем диализируют в сахарозе для удаления не инкапсулированного лекарственного средства.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением получают следующим образом. Жировую смесь ГЯФХ:Хол:ДСФЭ-ПЭГ2000 в молярном соотношении 50:45:5 растворяют в хлороформе. Смесь сушат до тонкой жировой пленки в круглодонной колбе роторным испарением и затем сушат в высоком вакууме в течение ночи, затем гидрируют с желаемым солевым раствором в качестве внутренней среды липосомы. Полученную 100 мМ жировую суспензию обрабатывают ультразвуком на соникаторе на бане в течение 1 часа и затем экструдируют десять раз с применением экструдера Lipex Thermobarrel Extruder через сложенные вдвое 100 нм фильтры Nuclepore с получением одинарных моноламеллярных везикул (ОМВ). Эти ОМВ диализируют в 300 мМ сахарозе при 4°C с тремя переменами раствора свежей сахарозы в течение 24 часов для замены внешней среды липосом. Липосомы хранят в стеклянных трубках при 4°C до предполагаемого применения.

В одном примере, ингибирующее митоз лекарственное средство BI 2536 активно загружают в липосомы через pH градиентный способ. BI 2536 сначала покрывают в виде тонкой пленки в сцинтилляционной пробирке растворением в этаноле, и затем сушат роторным испарением. Пленку BI 2536 затем сушат в вакууме в течение по меньшей мере 24 ч. Липосомы загружают в 3:1 концентрации жир:лекарственное средство и разбавляют до конечной концентрации от около 50 до около 70 мМ жиров водой. Смесь затем инкубируют на 70°C водяной бане для усиления загрузки и затем диализируют в 300 мМ сахарозе в течение по меньшей мере 36 ч для удаления не инкапсулированного BI 2536. После диализа липосомы хранят в стеклянных трубках до применения.

В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением достаточно стабильны при хранении, например, как измерено по проценту заключенного вещества, выделившегося за пределы гиперстабильных липосом или все еще сохраняемого внутри гиперстабильных липосом после определенного периода времени от начальной загрузки вещества внутрь гиперстабильных липосом в соответствии с данным изобретением. Например, композиция гиперстабильной липосомы в соответствии с данным изобретением стабильна при 4°C в течение по меньшей мере 6 месяцев.

Предпочтительно для заключенного в липосому противомитозного агента оставаться инкапсулированным в липосоме, пока гиперстабильная липосома не достигнет места предполагаемого действия, например, в случае введения липосомального противомитозного лекарственного средства вводимого пациенту, опухоли. Гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением демонстрируют неожиданную стабильность против выделения (утечки) заключенного противомитозного лекарственного средства в условиях in vivo, например, в крови млекопитающего. Примечательно, что гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением, имея такую низкую in vivo скорость выделения лекарственного средства в кровотоке, показали значительную in vitro противоопухолевую активность. Гиперстабильные липосомы в соответствии с данным изобретением обеспечивают неожиданное сочетание высокой эффективности заключенных противомитозных лекарственных средств и низкой токсичности.

В некоторых вариантах, представлена липосомальная композиция, которая содержит гиперстабильные липосомы, описанные здесь, в водной среде. В некоторых вариантах, гиперстабильные липосомы имеют внутреннее водное пространство, отделенное от водной среды мембраной. В некоторых вариантах, мембрана содержит 1,2-дистеароил-sn-глицерин-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000], гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин и холестерин. В некоторых вариантах, внутрь гиперстабильных липосом заключены противомитозное лекарственное средство, анион(ы) и катион(ы), в которых противомитозное лекарственное средство, заключенное внутрь гиперстабильных липосом, имеет концентрацию, превышающую концентрацию противомитозного лекарственного средства в водной среде.

В некоторых вариантах, представлена фармацевтическая композиция, которая содержит гиперстабильные липосомы, описанные здесь, с или без по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого эксципиента и/или носителя. В некоторых вариантах, фармацевтически приемлемыми носителями являются обычный физиологический раствор, изотоническая декстроза, изотоническая сахароза, раствор Рингера и раствор Хэнкса. Буферное вещество может быть добавлено для получения оптимального для стабильности при хранении pH. Например, pH от около 6,0 до около 7,5, более предпочтительно, pH около 6,5 является оптимальным для стабильности жиров мембраны липосомы, и обеспечивает превосходное удерживание заключенных веществ. Гистидин, гидроксиэтилпиперазинэтилсульфонат (HEPES), морфолипоэтилсульфонат (MES), сукцинат, тартрат и цитрат, обычно в концентрации 2-20 мМ, являются типовыми буферными веществами. Другие подходящие носители включают, например, воду, буферный водный раствор, 0,4% NaCl, 0,3% глицин и подобные. Могут быть добавлены белок, углевод или полимерные стабилизаторы и корректоры тоничости, например, желатин, альбумин или поливинилпирролидон. Тоничность композиции может быть скорректирована до физиологического уровня 0,25-0,35 моль/кг глюкозой или более инертным соединением, таким как лактоза, сахароза, маннит или декстрин. Эти композиции могут быть стерилизованы обычными хорошо известными методами стерилизации, например, фильтрацией. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения или фильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат объединяют со стерильной водной средой до введения.

В некоторых вариантах, фармацевтически приемлемые эксципиенты могут применяться по требованию до приблизительно физиологических условий, такие как pH корректоры и буферные агенты, агенты для корректировки тоничности и подобные, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д. Дополнительно, суспензия гиперстабильной липосомы может включать жирозащитные агенты, которые защищают жиры от свободнорадикальных и жироокислительных повреждений при хранении. Подходят липофильные свободнорадикальные гасители, такие как альфа-токоферол и водорастворимые железо-специфические хелаторы, такие как ферриоксамин.

Концентрация гиперстабильных липосом в соответствии с данным изобретением в фармацевтических композициях может широко варьироваться, т.е. от менее около 0,05% обычно или по меньшей мере около 2-10% до не менее 30-50% массовых, и ее выбирают преимущественно по объему жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть повышена для снижения жидкой нагрузки, связанной с лечением. Это может быть особенно желательно у пациентов, имеющих связанную с атеросклерозом застойную сердечную недостаточность или тяжелую гипертонию. Альтернативно, фармацевтические композиции, состоящие из раздражающих жиров, могут быть разбавлены до низких концентраций для снижения воспаления в месте введения.

Во втором аспекте, в данном изобретении представлен способ лечения рака с применением гиперстабильных липосом, описанных здесь. В некоторых вариантах, количество вводимой фармацевтической композиции гиперстабильных липосом зависит от конкретного противомитозного лекарственного средства, заключенного внутрь гиперстабильных липосом, лечимого рака, типа применяемых гиперстабильных липосом и мнения лечащего врача. В общем, количество вводимой фармацевтической композиции гиперстабильной липосомы должно быть достаточным для доставки терапевтически эффективной дозы конкретного противомитозного лекарственного средства.

Количество фармацевтической композиции гиперстабильной липосомы, необходимое для доставки терапевтически эффективной дозы, может быть определено обычными in vitro и in vivo способами, известными в области тестирования лекарственного средства. См., например, Budman et al. [22]. Терапевтически эффективные дозы различных противомитозных лекарственных средств хорошо известны специалисту в данной области техники; и в соответствии с данным изобретением, противомитозное лекарственное средство, доставляемое через фармацевтическую композицию в соответствии с данным изобретением, обеспечивает по меньшей мере такую же или 2-кратную, 4-кратную или 10-кратную активность по сравнению с активностью, полученной при введении того же количества противомитозного лекарственного средства в обычно, не липосомальной композиции. Обычно дозы фармацевтической композиции гиперстабильной липосомы в соответствии с данным изобретением варьируется от около 0,005 до около 500 мг терапевтического вещества на килограмм массы тела, наиболее часто, от около 0,1 до около 100 мг терапевтического вещества/кг массы тела.

Обычно фармацевтическую композицию в соответствии с данным изобретением получают в виде местной или для инъекций, либо в жидком растворе, либо в суспензии. Однако также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения в или суспендирования в жидких носителях до инъекции. Композиция также может быть составлена в виде таблетки с энтеросолюбильной оболочкой или гелевой капсулы известными в данной области техники способами.

Композиция гиперстабильной липосомы в соответствии с данным изобретением может вводиться любым путем, который медицински приемлем, который может зависеть от лечимого рака. Возможные пути введения включают инъекции, парентеральные пути, такие как внутримышечный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, внутрисуставный, эпидуральный, и интратекальный или другие, а также пероральный, назальный, глазной, ректальный, вагинальный, местный или легочный, например, ингаляции. Для доставки противомитозных лекарственных средств, составленных в липосомах в соответствии с данным изобретением, в опухоли центральной нервной системы, особенно предпочтительно медленная, длительная внутричерепная инфузия липосом непосредственно в опухоль (конвекционная доставка или КД). См. Saito et al. [23] и Mamot et al. [24]. Композиции также могут непосредственно наноситься на поверхность тканей. Введение с замедленным выделением, pH-зависимым выделением или другим специфическим, медиированным химически или условиями окружающей среды, выделением также специально включено в изобретение, например, такие способы как депо инъекции или эродируемые импланты.

Как показано в следующих примерах, описан подход с применением комбинаторного анионного многообразия для идентификации медленно выделяющих гиперстабильных липосомальных составов. Хотя примеры сфокусированы на анионной паре цитрат:фосфат, другие гиперстабильные анионные пары, найденные в скрининге (фиг. 4) также дают подобные результаты для BI 2536. Если пару цитрат:фосфат меняют на цитрат:ацетат, мыши, леченные одной дозой такой альтернативной липосомальной версией, демонстрируют такую же эффективность при соотношении цитрата:ацетата 1:3, давая наибольшее снижение опухоли (фиг. 8A). Естественным средством добавления еще большего разнообразия является изменение катионной идентичности. Например, замена катиона натрия аммонием для пары цитрат:ацетат значительно повышает скорость регрессии опухоли (фиг. 8B).

Гиперстабильные липосомы решают две концептуальные проблемы. Продление временной доступности позволяет противомитозным лекарственным средствам захватывать больше опухолевых клеток в процессе репликации. Кроме того, низкая концентрация остающегося лекарственного средства, достигаемая гиперстабильными липосомами, с меньшей вероятностью вызывает митотическое проскальзывание [19]. Это означает, что меньшее количество опухолевых клеток должно избежать предполагаемого воздействия препарата. Этот подход может применяться к любым противомитозным лекарственным средствам, а не только к BI 2536. Следовательно, гиперстабильное инкапсулирование потенциально способно возродить клиническую полезность 24 препаратов, которые подпадают в этот класс. Одним из преимуществ гиперстабильных липосом является продление биодоступности в двухнедельном временном интервале для однократного приема, что позволит клиницистам достичь более высокой эффективности при менее частых дозировках. Другим преимуществом является отсутствие необратимой невропатии после лечения гиперстабильными липосомами по сравнению с другими классами лекарств, что является привлекательной особенностью ингибиторов митоза с точки зрения токсичности. Описание общего способа реактивации неудачных ингибиторов митоза открывает двери для многих возможностей и демонстрирует, что идея ингибирования митоза не является несостоятельной; имеет значение доставка.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, которые предлагаются в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом. Были использованы стандартные методики, хорошо известные в данной области техники, или методики, конкретно описанные ниже.

ПРИМЕР 1

Материалы и методы

Получение липосом: 1,2-Дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (ДСФЭ-ПЭГ2000) и гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин (ГЯФХ) покупают у Lipoid, и холестерин (Хол) покупают у Sigma-Aldrich. Жировую смесь ГЯФХ:Хол:ДСФЭ-ПЭГ2000 в молярном соотношении 50:45:5 растворяют в хлороформе (Takara). Смесь сушат до тонкой жировой пленки в круглодонной колбе при роторном испарении (Eyela NVC-2200/N-1100) и затем сушат в высоком вакууме в течение ночи, затем гидрируют желаемым солевым раствором в качестве внутренней среды липосомы. Полученную 100 мМ жировую суспензию обрабатывают ультразвуком соникатором на бане (S30H Elmasonic) в течение 1 часа и затем экструдируют десять раз с применением экструдера Lipex Thermobarrel Extruder (Northern Lipids) через сложенные вдвое 100 нм фильтры Nuclepore (Whatman) с получением одинарных моноламеллярных везикул (ОМВ). Эти ОМВ диализируют в 300 мМ сахарозе (Sigma) при 4°C с тремя переменами свежего раствора сахарозы в течение 24 часов для обмена внешней среды липосом. Липосомы хранят в стеклянных трубках при 4°C до предполагаемого применения.

Загрузка BI2536 в липосомы: BI 2536 (Axon) активно загружают в липосомы pH градиентным способом. Требуемый BI 2536 сначала покрывают тонкой пленкой в сцинтилляционной пробирке растворением в этаноле и последующей сушкой роторным испарением. Пленку BI 2536 затем сушат в вакууме в течение по меньшей мере 24 ч. Липосомы загружают в 3:1 концентрации жир:лекарственное средство и разбавляют до конечной концентрации 50-75 мМ жиров водой. Смесь затем инкубируют на 70°C водяной бане для ускорения загрузки и затем диализируют в 300 мМ сахарозе в течение по меньшей мере 36 ч для удаления не инкапсулированного BI 2536. После диализа липосомы хранят в стеклянных трубках до применения, и часть сахарозного диализата хранят при 4°C для последующего определения эффективности инкапсулирования.

Определение инкапсулирования BI2536: количество BI 2536, загруженного в липосомы, определяют прямым расчетом (in vitro исследования) или обратным расчетом (для исследований на животных). Для прямого расчета 1 мкл липосом разбавляют 20 мкл этанола и считывают через флуорометрическое измерение с применением 360 нм возбуждения и 470 нм испускания (Tecan Infinite M200). Количество BI2536 определяют сравнением со стандартной кривой. Для обратного расчета 100 мкл 1-нонанола (Merck) применяют для экстрагирования инкапсулированного BI 2536 из 1,5 мл диализата перемешивают на вортексе в течение 1 ч. Фазы нонанола и сахарозы разделяют коротким центрифугированием, и 20 мкл слоя нонанола измеряют на флуорометрическую интенсивность с применением 330 нм возбуждения и 370 нм испускания (Tecan Infinite M200). Концентрацию BI 2536 в диализатах определяют сравнением со стандартной кривой, и эффективность инкапсулирования затем рассчитывают по формуле

где A=[BI 2536 в диализате]_{без загруженного лекарственного средства} и B=[BI 2536 в диализате]_{образца}.

Клеточная культура: HCT116 (CCL-247, карцинома прямой и ободочной кишки человека) покупают у American Type Culture Collection (ATCC) и культивируют с применением среды McCoy's 5A Medium (Life Technology) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific). Клетки инкубируют при 37°C с 5% CO₂ и пересевают каждые 2-3 дня, когда конфлюэнтность достигает ~80%.

Определение EC₅₀: приблизительно 7×10³ HCT116 клеток засевают в 96-луночные планшеты, достигая конфлюэнтности ~50% после инкубирования в течение ночи. Среду в лунках заменяют свежей средой с добавлением либо свободного BI 2536, либо липосомального BI 2536. Концентрации применяемого BI 2536 создают серийным разведением 1 мкМ BI 2536. Лунки, содержащие только среду, используют в качестве контроля. По меньшей мере 3 повтора проводят для каждого состава. SYBR Green I (Life Technologies) применяют для количественного анализа ДНК как показателя выживаемости клеток. Его проводят сначала инкубированием клеток с 50 мкл 0,2% додецилсульфата натрия при 37°C в течение 2 ч для их разрушения. 150 мкл раствора SYBR Green (1:750 разведение в воде) затем добавляют в каждую лунку и измеряют интенсивность флуоресценции (возб: 497 нм/исп: 520 нм) с применением планшетного ридера Tecan. Значения интенсивности флуоресценции вводят в GraphPad Prism V5. Логистические регрессионные кривые и EC₅₀ определяют установкой наибольшего значения флуоресценции как 100% выживаемости, и наименьшего значения флуоресценции как 0% выживаемости.

Исследования на животных: Все эксперименты на животных одобрены Institutional Animal Care and Use Committee of Temasek Life Sciences Laboratory and National University of Singapore (NUS). Самок голых мышей NCr (возраст 5-8 недель) покупают у (Singapore/InVivos) и им подкожно вводят ксенотрансплантат клеток HCT116. Клетки HCT116 выращивают, как описано выше, в 600 см² чашках (Corning), и каждую чашку применяют для трансплантации 5 мышам, когда конфлюэнтность достигает ~80%.

Исследования эффективности: свободный BI 2536 (растворенный в 0,1 N HCl, физиологическом растворе) или указанные липосомальные составы BI 2536 вводят медленной инъекцией в хвостовую вену через 7 дней после трансплантации HCT116. Объемы опухолей были по меньшей мере 150 мм³ и их рассчитывают как длина×ширина²×0,5. Все измерения проводят с применением штангенциркуля с нониусом и мышей взвешивают через день. Мышей подкожно гидратируют 1 мл раствора Хартманна ежедневно в течение 5 дней после лечения, чтобы удостовериться, что мыши полностью гидратированы.

Фармакокинетическое исследование: мышей, имеющих ксенотрансплантаты HCT116, обрабатывают указанным свободным BI 2536 или липосомальными составами BI 2536, и в указанные моменты времени после лечения умерщвляют для сбора сердца, опухоли, мышц, почек, печени и селезенки. Органы взвешивают и хранят при -80°C до обработки ткани. Ткани обрабатывают погружением в хаотропную 8M мочевину (Vivantis) и гомогенизацией в гомогенизаторе Bertin Homogenizer с применением циркониевых шариков диаметром 0,5 мм (Biospec). Гомогенизированные ткани центрифугируют на максимальной скорости на настольной центрифуге в течение часа, и 800 мкл надосадочной жидкости собирают для экстракции BI 2536 с применением 100 мкл нонанола и осторожного вращения в течение 1 часа. Фазы нонанола и сахарозы разделяют быстрым центрифугированием, и 20 мкл слоя нонанола считывают флуорометрическим измерением (возб: 330 нм/исп: 370 нм) с применением планшетного ридера Tecan. BI2536 количественно оценивают сравнением со стандартной кривой и затем нормализуют к массе ткани.

Гистология: Мышей умерщвляют для сбора ткани опухоли в указанные дни после лечения. Ткани опухоли замораживают в среде OCT (Sakura Finetek) и хранят при -80°C до изготовления срезов. 10 мкм срезы ткани опухоли получают с применением криостата CM3050S (Leica). Срезы тканей закрепляют в метаноле и сразу же окрашивают Гематоксилином и Эозином (H&E). Для проведения окрашивания H&E срезы опухоли сначала избыточно окрашивают фильтрованным раствором Харриса (Sigma), промывают проточной водопроводной водой, погружают в кислоту-спирт (1% хлористоводородной кислоты, 70% этанола) и затем промывают водопроводной водой. Затем срезы ткани погружают в 0,2% аммиачную воду (Sigma) до посинения. После промывания водопроводной водой в течение 10 минут срезы ткани окрашивают эозином-флоксином (Sigma и Merck, соответственно) и погружают в 95% этанол для вымывания избыточного красителя. Срезы ткани сушат в течение ночи, затем оборудуют Permount (Fisher). Все H&E окрашенные срезы рассматривают и получают светлопольные изображения с применением микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Inc), оборудованного камерой DXM 1200F (Nikon) и объективом 63X.

Получение BI2536 в буферах: BI 2536 сначала растворяют в этаноле и затем покрывают в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках сушкой вращением. Покрытые BI 2636 пробирки затем дополнительно сушат в течение ночи в высоком вакууме, затем ресуспендируют в указанных солевых растворах с получением конечной концентрации 500 мкМ. Для того чтобы полностью растворить покрытый BI2536, пробирки быстро перемешивают на вортексе и подвергают обработке ультразвуком на бане в течение 1 минуты, затем применяют для исследования.

Экстракция гексанолом: BI 2536 из 1 мл указанного буфера экстрагируют 100 мкл 1-гексанолом (Merck) быстрым встряхиванием в течение 1 часа. Гексанол и буферные слои разделяют быстрым центрифугированием, и 20 мкл слоя гексанола анализируют на интенсивность флуоресценции с применением планшетного ридера Tecan (возб: 330 нм, исп: 370 нм).

Анализ стабильности липосом: дегашение флуоресценции вытекшего BI 2536 применяют как показатель нестабильности липосом. Все считывания флуоресценции проводят с применением планшетного ридера Tecan (возб: 280 нм, исп: 385 нм). Triton-X100 (sigma) добавляют для достижения конечной концентрации 0,2% для полного выделения BI2536 из липосом и снова проводят считывание флуоресценции. Для расчета доли выделенного BI 2536 данные флуоресценции до добавления triton делят на данные флуоресценции после добавления triton. Для проведения измерений стабильности, лиипосомные составы разводят 50× либо водой, либо 600 мМ раствором сахарозы, и флуоресценцию измеряют с применением планшетного ридера Tecan в начале и через 12 часов инкубирования при 37°C с применением планшетного ридера Tecan. Для определения долговременно й стабильности, липосомы хранят в 37°C инкубаторе после разведения в воде или 600 мМ сахарозе, и считывание флуоресценции проводят так же в указанные дни.

ПРИМЕР 2

Скорости выделения липосомального BI 2536 обратно коррелируют с уничтожением опухолевой клетки

Степень, в которой вид аниона и концентрация может влиять на физико-химические свойства BI 2536 изучают с применением следующих растворов, доведенных до pH 3: цитрат натрия (C), ацетат натрия (A), фосфат натрия (P), 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (M) и хлористоводородная кислота (H). Тенденцию BI 2536 к выделению в гексанол из этих растворов измеряют в разных концентрациях (фиг. 1). Было обнаружено, что вид аниона влияет на эффективность экстракции гексанолом, а также что эта эффективность либо повышается (P, A), либо понижается (M, C, H) в зависимой от концентрации аниона манере (фиг. 2). Также было обнаружено, что разнообразие этих кривых эффективности экстракции гексанолом может быть дополнительно увеличено путем использования парных комбинаций этих анионов (фиг. 3). Исходя из этих результатов, было сделано заключение, что эти анионы могут быть использованы комбинаторным образом для создания библиотеки липосомальных составов с различными скоростями высвобождения.

Для идентификации гиперстабильных форм с медленным выделением липосомального BI 2536, были получены инкапсулированные в липосомы варианты всех 15 одинарных и двойных сочетаний анионов и BI 2536 удаленно загрузили в их внутреннюю часть. Флуоресценция BI 2536 гасится при инкапсулировании в высоких концентрациях в липосому. Следовательно, выделение BI 2536 из липосом может быть измерено повышением флуоресценции из-за дегашения. С применением этого способа утечку BI 2536 для каждого состава измеряют в гипертонических (600 мМ сахарозы) и гипотонических (чистая вода) условиях во времени (фиг. 4). Как ожидалось, наблюдается интервал скоростей выделения от быстрой (A, H, AH) до медленной (все сочетания с цитратом). Порядок ранжирования этих скоростей высвобождения не отличается заметно между гипертонической и гипотонической средами, указывая на то, что именно липосомальная внутренняя среда определяет скорости высвобождения лекарственного средства для липосомального BI 2536, а не внешний осмотический стресс. Для исследования того, коррелируют ли гиперстабильные медленно выделяющие липосомы с уничтожением раковых клеток, клетки рака прямой и ободочной кишки HCT116 инкубируют с серийными разведениями различных липосомальных составов, и их значения EC₅₀ рассчитывают как показатель эффективности. В соответствии с гипотезой, что гиперстабильность коррелирует с цитотоксичностью, была обнаружена высокая корреляция между скоростями высвобождения и EC₅₀. Наоборот, было обнаружено, что нет аналогичной корреляции, когда тот же эксперимент проводят с использованием доксорубицина (фиг. 4). Это открытие согласуется с идеей о том, что, хотя митотические ингибиторы могут выиграть от гиперстабильности, обратное будет справедливо для других классов лекарств, где медленное высвобождение не будет преимуществом.

ПРИМЕР 3

Настройка скорости выделения и эффективности in vivo через соотношения анионов

Так как двумя анионами с наименьшей скоростью выделения были чистый цитрат и сочетание цитрата и фосфата (фиг. 4), исследуют изменение соотношения цитрат:фосфат для определения того, оказывает ли это существенное влияние на эффективность. Составы, имеющие соотношения 0:1, 1:3, 1:1, 3:1 и 1:0, тестируют по методике, описанной выше, на скорости выделения и EC₅₀. Постоянно наблюдалась та же тенденция со скоростями выделения и EC₅₀, независимо от того, были ли эти переменные измерены на 3 или 8 день анализа клеточной цитотоксичности (фиг. 5A). Интересно отметить, что самое медленное выделение достигалось при соотношении цитрат:фосфат 1:3, показывая, что это комбинаторное соотношение было синергетическим, а не только усредненным результатом чистого цитрата и чистого фосфата. Этот результат также позволяет предположить, что важно идентифицировать оптимальное соотношение цитрат:фосфат для того, чтобы максимизировать in vivo эффективность в действительных солидных опухолях. Для идентификации этого соотношения, мышей с установленными ксенотрансплантатамирака прямой и ободочной кишки человека лечат липосомами, имеющими соотношения цитрат:фосфат 1:7, 1:4, 1:3, 1:2 и 1:0,5. В соответствии с ранее полученным соотношением 1: 3, наилучшая эффективность in vivo наблюдалась при соотношениях цитрат:фосфат 1:3 и 1:4 (фиг. 5B). Важно отметить, что уменьшение объемов опухолей для этих соотношений продолжалось в течение двух недель, и это наблюдение согласуется с ожидаемым медленным выделением из этих гиперстабильных липосом. Хотя соотношение 1:4 давало противоопухолевый эффект больший, чем соотношение 1:3, оно также дает большую потерю веса. Следовательно, 1:3 принимают как оптимальное соотношение для последующих экспериментов. BI 2536, инкапсулированный таким образом, называют ʺгиперстабильныйʺ.

ПРИМЕР 4

Гиперстабильный липосомальный BI 2536 вызывает полный ответ у мышей

Голых мышей, имеющих ксенотрансплантаты опухолей HCT116, лечат одной внутривенной инъекцией гиперстабильного липосомального BI 2536 либо с только цитратом, либо только с фосфатом в качестве аниона. Свободный не инкапсулированный BI 2536 применяют в качестве контроля. Ксенотрансплантаты лечат гиперстабильным липосомами в пониженном объеме в течение 12 дней, повторяя пролонгированное терапевтическое действие, наблюдаемое в наших предыдущих экспериментах на животных (фиг. 6A). Для сравнения, липосомы, использующие только цитрат или фосфат, были неотличимы от свободного лекарственного средства, демонстрируя, что комбинация анионов дает синергетический эффект, который отсутствует для каждого чистого аниона. У мышей, леченных гиперстабильным BI 2536, имелась более высокие масса тела после лечения, и эта тенденция согласуется с более низкой токсичностью, которую можно ожидать при пролонгированном выделении лекарственного средства. Важно отметить, что гиперстабильный BI 2536 значительно улучшал выживаемость мышей с полными ответами, наблюдаемыми у двух из десяти мышей (таблица 1). Никаких полных ответов не наблюдалось в других экспериментальных группах.

ТАБЛИЦА 1

Таблица полных ответов для различных типов лечения

Лечение	Полные ответы
Лечение	Одна доза	Две дозы
Свободное лекарственное средство	0/10	0/8
Ц:Ф (1:0)	0/10	1/8
Ц:Ф (0:1)	0/10	0/10
Ц:Ф (1:3)	2/10	6/8

Когда тот же эксперимент повторяют с двумя дозами лечения с интервалом в 7 дней вместо одной дозы гиперстабильных липосомам, терапевтический эффект продлевается еще на более длительный период (рис. 6В) и вызывает полные ответы у 75% мышей (таблица 1). Наоборот, не было никаких полных ответов в других экспериментальных группах. Гиперстабильные липосомы были не только более эффективными, но и хорошо переносимыми, в то время как все другие экспериментальные группы проявляли токсичность после лечения.

ПРИМЕР 5

Гиперстабильные липосомы продлевают присутствие в опухоли и эффективность BI 2536

Разумное объяснение улучшенной эффективности, наблюдаемой с гиперстабильными липосомами, заключается в том, что период полувыведения препарата улучшается по сравнению с обычными ПЭГилированными липосомами. Голые мыши, леченные одной дозой гиперстабильных липосом, показали значительно более высокие концентрации в опухоли BI 2536 по сравнению с контрольными липосомами, содержащими либо чистый цитрат, либо чистый фосфат (фиг. 7A; таблица 2). Эта тенденция сохранялась в течение всего 9,5-дневного периода измерения, после чего уменьшение объемов опухоли делало обработку ткани нецелесообразной. Воздействие гиперстабильного липосомального BI 2536 на опухоль (измеренное по площади под кривой) было в 5 раз выше по сравнению с цитратными липосомами и в 3 раза выше по сравнению с фосфатными липосомами. Концентрации лекарственного средства в здоровых тканях (селезенка, мышцы, почки, сердце и печень) были также повышены для гиперстабильных липосом, хотя эта тенденция не была статистически значимой через 10 часов (фиг. 7A; таблица 2). Несмотря на эти более высокие концентрации в тканях, гиперстабильные липосомы были менее токсичными, чем контрольные липосомы, что позволяет предположить, что большая часть BI 2536 в гиперстабильной липосоме остается безопасно инкапсулированной при прохождении в крови через здоровые ткани. Взятые вместе с общим увеличением площади под кривой, данные позволяют предположить, что гиперстабильное инкапсулирование увеличивает период полувыведения из кровотока BI 2536, увеличивая, как следствие, перфузию и удержание BI 2536 в опухолевом отделении (фиг. 7B). Отличительной чертой BI 2536 (или любой антимитотической химиотерапии) является его способность ингибировать митотическое деление в опухолях. Для изучения вопроса о том, может ли более высокая биодоступность BI 2536 объяснять разницу между гиперстабильными липосомами и контролями, был проведен гистологический анализ образцов опухолей на ксенотрансплантатах через 1,5 и 5,5 дней после одной дозы лечения (фиг. 7C и 7D). На 1,5-й день все липосомальные составы BI 2536 и инкапсулированный свободный BI 2536 ассоциировались с митотическими фигурами, наблюдаемыми примерно у 25% ядер опухоли в гистологических срезах. Однако к 5,5 дню гиперстабильный липосомальный BI 2536 был связан со значительно более высокой долей митотически остановленных клеток по сравнению с контрольными липосомами и свободным лекарственным средством. Считается, что эта расширенная временная биодоступность объясняет повышение эффективности гиперстабильно инкапсулированного BI 2536.

ТАБЛИЦА 2

p-значения (двусторонний критерий неравномерной дисперсии) сравнения концентраций в ткани BI 2536 после лечения гиперстабильными липосомами (Ц:Ф=1:3) и других способов лечения (Ц:Ф=1:0 и Ц:Ф=0:1)

Время (ч)	p значения (двусторонний критерий неравномерной дисперсии) в отношении лечения Lip_Ц:Ф(1:3)
	Опухоль		Селезенка		Мышцы		Почки		Сердце		Печень
	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)	Ц:Ф(1:0)	Ц:Ф(0:1)
4	0,0457	0,0874	0,0034	0,0019	0,0148	0,0584	0,0016	0,0075	0,0309	0,0345	0,0043	0,0384
8	0,0173	0,0147	0,0308	0,0521	0,0036	0,0844	0,0009	0,0021	0,0236	0,0237	0,0320	0,0477
16	0,1075	0,1362	0,2486	0,2225	0,2282	0,2219	0,2510	0,2443	0,2611	0,2526	0,2780	0,2600
32	0,1401	0,1876	0,3107	0,3687	0,5529	0,2917	0,2772	0,3765	0,2992	0,3080	0,9983	0,5652
84	0,0028	0,0132	0,2116	0,3501	0,1480	0,2395	0,2550	0,2903	0,3188	0,1696	0,0565	0,1395
132	0,2336	0,2621	0,6901	0,9838	0,2165	0,1886	0,2886	0,3148	0,0878	0,0374	0,5497	0,3018
180	0,0179	0,0220	0,8185	0,0990	0,1551	0,1585	0,3312	0,4393	0,0053	0,0166	0,0455	0,8493
228	0,1084	0,1148	0,4010	0,8696	0,8303	0,8053	0,8389	0,8251	0,0651	0,7096	0,3052	0,4443

Использование терминов «а» и «an» и «the» и аналогичных ссылок в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если только иначе не указано здесь или явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует истолковывать как открытые термины (т. е. означающие «включающий, но не ограниченный ими»), если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если не указано иное, и каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно указано здесь. Все способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или примерных формулировок (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Ни один язык в описании не должен истолковываться как указывающий на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практической реализации изобретения.

Варианты осуществления этого изобретения описаны в данном документе, включая лучший способ, известный изобретателям для осуществления изобретения. Изменения этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы изобретения предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано здесь. Следовательно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты объекта, указанного в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено применимым законодательством. Более того, любое сочетание вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охватывается изобретением, если иное не указано здесь или иное явно не противоречит контексту.

БИБИЛИОГРАФИЯ

1. Dumontet, C. & Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

2. Jordan, M. A. & Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat. Rev. Cancer 4, 253-265 (2004).

3. Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J. Cell Sci. 122, 2579-2585 (2009).

4. Steegmaier, M. et al. BI 2536, a Potent and Selective Inhibitor of Polo-like Kinase 1, Inhibits Tumor Growth In Vivo. Curr. Biol. 17, 316-322 (2007).

5. Strebhardt, K. & Ullrich, A. Targeting polo-like kinase 1 for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 6, 321-330 (2006).

6. Sarli, V. & Giannis, A. Targeting the kinesin spindle protein: basic principles and clinical implications. Clin. Cancer Res. 14, 7583-7587 (2008).

7. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M. & Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat. Rev. Cancer 7, 107-117 (2007).

8. Keen, N. & Taylor, S. Aurora-kinase inhibitors as anticancer agents. Nat. Rev. Cancer 4, 927-936 (2004).

9. Gautschi, O. et al. Aurora kinases as anticancer drug targets. Clin. Cancer Res. 14, 1639-1648 (2008).

10. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L. & Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin. Cancer Res. 18, 51-63 (2012).

11. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J. & Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 244-250 (2011).

12. Maeda, H. Toward a full understanding of the EPR effect in primary and metastatic tumors as well as issues related to its heterogeneity. Adv. Drug Deliv. Rev. 91, 3-6 (2015).

13. Matsumura, Y. & Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).

14. Barenholz, Y. (chezy). Doxil® - The first FDA-approved nano-drug: Lessons learned. J. Control. Release 160, 117-134 (2012).

15. Papahadjopoulos, D. et al. Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 11460-11464 (1991).

16. Fritze, A., Hens, F., Kimpfler, A., Schubert, R. & Peschka-Süss, R. Remote loading of doxorubicin into liposomes driven by a transmembrane phosphate gradient. Biochim. Biophys. Acta 1758, 1633-1640 (2006).

17. Cern, A. et al. Quantitative structure - property relationship modeling of remote liposome loading of drugs. J. Control. Release 160, 147-157 (2012).

18. Cheong, I. et al. A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs. Science 314, 1308-1311 (2006).

19. Raab, M. et al. Mitotic arrest and slippage induced by pharmacological inhibition of Polo-like kinase 1. Mol. Oncol. 9, 140-154 (2015).

20. Dua, J.S. et. Liposome: methods of preparation and applications. Int'l J Pharmaceut Studies Res III (II):14-20 (2012).

21. Laouini, A et al. Preparation, characterization and applications of liposomes: state of the art. J Colloid Sci Biotechnol 1:147-168 (2012).

22. Budman, D.B. et at. (editors). Handbook of Anticancer Drug Development, LippincottWilliams & Wilkins (2003).

23. Saito, R. et al. Distribution of Liposomes into Brain and Rat Brain Tumor Models by Convection-Enhanced Delivery Monitored with Magnetic Resonance Imaging Cancer Research 64:2572-2579 (2004).

24. Mamot, C. et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. J Neuro-Oncology 68:1-9 (2004).

25. Gregoriadis, G. (editor), Liposome Technology, vol. 1-3, 1st edition, 1983; 2nd edition, 1993, CRC Press, Boca Raton, Fla.

Claims

1. Гиперстабильная липосома для лечения рака, содержащая внутреннюю среду, отделенную от внешней среды мембраной, где внутренняя среда содержит противомитозное лекарственное средство, два катиона, заключенные во внутреннюю среду,

где противомитозным лекарственным средством является ингибитор polo-подобной киназы, где мембрана содержит 1,2-дистеароил-sn-глицерин-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (ДСФЭ-ПЭГ2000), гидрированный яичный L-α-фосфатидилхолин (ГЯФХ), и холестерин (Хол), где молярное соотношение ГЯФХ:Хол:ДСФЭ-ПЭГ2000 составляет 50:45:5,

где два аниона представляют собой цитрат и фосфат, цитрат и ацетат или ацетат и фосфат в молярном соотношении 1:3 или 1:4, и

где заключенное противомитозное лекарственное средство имеет медленную скорость выделения из гиперстабильной липосомы, которая количественно составляет менее 0,6% за 12 часов или менее 5% за 8 дней, где гиперстабильные липосомы суспендированы в 600 мМ сахарозы.

2. Гиперстабильная липосома по п.1, где двумя анионами являются цитрат и фосфат или цитрат и ацетат.

3. Гиперстабильная липосома по п.1, где двумя анионами являются цитрат и фосфат.

4. Гиперстабильная липосома по п.1, 2 или 3, где два аниона представлены в молярном соотношении 1:3.

5. Гиперстабильная липосома по п.1, 2 или 3, где два аниона представлены в молярном соотношении 1:4.

6. Гиперстабильная липосома по любому из пп. 1-5, где одним или боле катионов являются натрий, аммоний, триэтиламмоний, медь, магний, цинк или железо.

7. Гиперстабильная липосома по любому из пп. 1-6, где противомитозным лекарственным средством является BI 2536, ON 01910, GSK 461364, HMN 214 или BI 6727.

8. Гиперстабильная липосома по п.7, где противомитозным лекарственным средством является BI 2536.

9. Гиперстабильная липосома по п.1, где противомитозным лекарственным средством является BI 2536 и где двумя анионами являются цитрат и фосфат в молярном соотношении 1:3.

10. Липосомальная композиция для лечения рака, содержащая гиперстабильную липосому по любому из пп. 1-9 в водной среде.

11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая гиперстабильную липосому по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

12. Фармацевтическая композиция для лечения рака по п.11, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

13. Гиперстабильная липосома по любому из пп. 1-9 для применения в качестве лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

14. Применение гиперстабильной липосомы по любому из пп. 1-9 в приготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

15. Гиперстабильная липосома по любому из пп. 1-9 или липосомальная композиция по п.10 или фармацевтическая композиция по п.11 или 12 для применения в способе лечения рака у субъекта.