TW202317070A

TW202317070A - 酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用

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Publication number: TW202317070A
Application number: TW111137421A
Authority: TW
Inventors: 堯志淩; 李太行; 梅進; 張兆利; 林一峯; 增榮李
Original assignee: 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-05-01
Also published as: WO2023051799A1; CN117750944A

Abstract

本發明公開了一種酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用。本發明的脂質體原料組合物包含1-8.3份的長春瑞濱鹽、2-12份的磷脂、0.1-0.8份的長循環膜材、0.7-4.0份的膽固醇和載藥鹽。本發明的脂質體具有良好的製劑學特點，應用前景較好。

Description

酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用

本發明涉及一種酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用。

本申請要求申請日為2021/9/30的中國專利申請2021111625656的優先權以及申請日為2022/9/27的中國專利申請2022111852813的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。

長春瑞濱是一種半合成長春鹼半合成衍生物，以酒石酸鹽的形式市售，屬細胞週期特異性藥物，主要作用於腫瘤細胞的DNA合成後期，阻止微管蛋白聚合形成微管，同時誘導微管解聚，使腫瘤細胞的有絲分裂增殖停止於有絲分裂的中期，達到抗腫瘤目的。目前市售產品是1989年法國皮爾法伯製藥公司（Pierre Fabre Medicament Production）研發的酒石酸長春瑞濱注射液（商品名：Navelbine 諾維本）上市，獲批的適應症為非小細胞肺癌，1991年獲批轉移乳腺癌適應症，至今仍為FDA用於非小細胞肺癌一線用藥。中國國內豪森藥業的酒石酸長春瑞濱注射液（商品名：蓋諾）1998年中國國內上市，該產品屬於2002年新品種，2012年凍乾粉FDA批准上市。另外，市售製劑產品中還有法國皮爾法伯製藥公司開發的酒石酸長春瑞濱軟膠囊。但這些市售產品中注射劑臨床使用時易出現靜脈炎，骨髓抑制等副作用明顯，口服製劑生物利用度低。

脂質體作為較為成熟奈米藥物遞送系統的一種藥物載體被研究學者和企業所認知，其主要特點可以保護被包封藥物，增加藥物的穩定性，降低臨床使用時的血管刺激性，改變藥物在體內的分佈行為，可攜載包裹藥物被動或主動靶向到病灶部位，進而提高藥物有效利用率和降低對正常細胞組織的傷害，增強臨床藥物療效。

鑒於脂質體作為藥物遞送系統的特點和酒石酸長春瑞濱製劑臨床缺點，不同企業設計不同的處方和載藥方式開發長春瑞濱脂質體。齊魯[CN101933904]開發的酒石酸長春瑞濱脂質體，因製劑體系不穩定，需分裝成空白脂質體、磷酸鈉溶液、酒石酸長春瑞濱三個獨立單元，臨床使用前將三個分裝單元混合並進行適當加熱載藥後方可靜脈注射，這給臨床使用帶來極大不便。中國臺灣微脂體公司[US6465008B2]開發的酒石酸長春瑞濱脂質體採用的是硫酸銨和葡聚糖硫酸酯鈉的混合鹽進行載藥，製得的酒石酸長春瑞濱脂質體半衰期較長＞30h，存在一定的皮膚毒性（20%左右）。而石藥集團[EP2494960A1]開發的酒石酸長春瑞濱脂質體採用的是磺丁基醚環糊精進行載藥，製得的酒石酸長春瑞濱脂質體體內半衰期短約為5.4h，載藥包封率低於80%。

因此要解決上述問題，製備出滿足臨床應用及工業化生產要求的酒石酸長春瑞濱脂質體，必須找到合適的載藥鹽及生產工藝。

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中長春瑞濱脂質體的穩定性差、使用不方便、半衰期短或皮膚毒性高等缺陷，為此，而提供了一種酒石酸長春瑞濱脂質體及其原料組合物、製備方法和應用。本發明的脂質體具有穩定性好、合適的釋藥速率、毒副作用小、皮膚毒性低、藥物代謝動力學好和使用方便的優點，且本發明的製備工藝簡單，適合工業化生產。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的。

本發明第一方面提供了一種脂質體原料組合物，以重量份計，其包含1-8.3份的長春瑞濱鹽、2-12份的磷脂、0.1-0.8份的長循環膜材、0.7-4.0份的膽固醇和載藥鹽；所述的載藥鹽為蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的蔗糖八硫酸酯鹽的濃度為1-75mM，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的硫酸銨的濃度為100-500mM。

本發明中，所述的長春瑞濱鹽優選為酒石酸長春瑞濱。

本發明中，所述的長春瑞濱鹽的份數優選為2-3份，例如2.77份。

本發明中，所述的磷脂的份數優選為2-3份，例如2.8份。

本發明中，所述的磷脂的種類可以為形成脂質體常規的磷脂，還可以為大豆磷脂、氫化大豆磷脂（HSPC）、二硬質醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）和二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）中一種或多種，例如氫化大豆磷脂和/或二硬質醯磷脂醯膽鹼。

本發明中，所述的長循環膜材的份數優選為0.1-0.5份，例如0.34份。

本發明中，所述長循環膜材的種類可為脂質體中常規的長循環膜材，優選為聚乙二醇衍生化磷脂，優選聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（mPEG-DPPE）和/或聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（mPEG-DSPE），例如mPEG2000-DSPE。所述的聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺中的聚乙二醇和所述的聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量優選為500-5000Da，例如2000。

本發明中，所述的膽固醇的份數優選為0.7-2.5份。

本發明中，所述的脂質體原料組合物中，以重量份計，其優選包含1.4-8.3份（例如2.77份或5.53份）的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.15-0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇。其中，所述的長春瑞濱鹽的份數優選為1.4-2.8份。其中，所述的脂質體原料組合物中，以重量份計，其更優選包含如下組1-5中任一組原料：組1：2.77份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組2：1.38份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組3：5.53份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇。組4：8.31份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組5：2.77份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.15份的長循環膜材和2.53份的膽固醇。

本發明中，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的硫酸銨的濃度優選為200-400，例如300 mM。

本發明中，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的蔗糖八硫酸酯鹽優選為蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽、蔗糖八硫酸酯鹼土金屬鹽、蔗糖八硫酸酯銨和蔗糖八硫酸酯有機胺鹽中的一種或多種，例如蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽（例如蔗糖八硫酸酯鉀或蔗糖八硫酸酯鈉）。其中，所述的蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽優選為蔗糖八硫酸酯鋰、蔗糖八硫酸酯鈉和蔗糖八硫酸酯鉀中的一種或多種，例如蔗糖八硫酸酯鉀。其中，所述的蔗糖八硫酸酯鹼土金屬鹽優選為蔗糖八硫酸酯鈣和/或蔗糖八硫酸酯鎂。其中，所述的蔗糖八硫酸酯有機胺鹽優選為蔗糖八硫酸酯三甲胺、蔗糖八硫酸酯二乙胺和蔗糖八硫酸酯三乙胺中的一種或多種。

本發明中，所述蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液為1.5-30mM蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽和200-400 mM硫酸銨的水溶液（即蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液中蔗糖八硫酸酯鉀的濃度為1.5-30 mM，硫酸銨的濃度優選為300 mM），例如15 mM蔗糖八硫酸酯鉀和300 mM硫酸銨的水溶液。

本發明中，所述的脂質體的原料組合物還可以根據本領域在製備脂質體時的常規需求添加其他原料，例如超濾介質，所述的超濾介質可以為9.0%（W/W）蔗糖溶液作為超濾介質。

本發明第二方面還提供了一種脂質體的製備方法，採用上述的原料組合物製得，其包括如下步驟：採用硫酸銨梯度法進行載藥得到所述的脂質體，即可。

本發明中，所述的載藥的條件和操作可以為本領域常規的條件和操作，本發明優選如下條件：其中，所述的載藥的溫度優選為42-52℃。其中，所述的載藥的時間優選為5-30min。其中，所述的載藥後還可包括冷卻步驟，例如將得到的脂質體在0-5℃的冰水浴中快速降溫至20℃以下。

本發明中，所述的載藥優選為將長春瑞濱鹽和空白脂質體進行載藥得到所述的脂質體；所述的空白脂質體包含脂質體膜和脂質體膜內的內水相；所述的脂質體膜包括如下以重量份計的組分：2-12份的磷脂、0.7-4.0份的膽固醇、0.1 -0.8份的長循環膜材；所述的內水相為蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液，所述的蔗糖八硫酸酯鹽的濃度為1-75mM，所述的硫酸銨的濃度為100-500mM。所述的空白脂質體更優選通過如下方法製得；所述的空白脂質的製備方法包括如下步驟：步驟1：將所述的磷脂、所述的膽固醇、所述的長循環膜材和乙醇進行混合得到油相溶液；步驟2：採用乙醇注入法，將步驟1得到的油相溶液注入所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液得到脂質體初乳溶液；步驟3：將步驟2得到脂質體初乳溶液通過用擠出法得到混合物；步驟4：以等滲溶液為介質，將步驟3混合物進行超濾，得到空白脂質體。步驟1中，所述的混合的溫度可為55-70℃。步驟2中，所述的乙醇注入法中的孵化的溫度可為55-65℃。步驟3中，所述的擠出法中的溫度可為55-65℃。步驟3中，所述的擠出法中的擠出的孔徑依次可為100nm和80nm。步驟4中，所述的等滲溶液優選為氯化鈉水溶液和/或蔗糖水溶液，例如0.9%（W/W）氯化鈉和9.0%蔗糖的水溶液（W/W）。

本發明中，所述的載藥後，還可進一步包括超濾步驟，例如採用9.0%（W/W）蔗糖溶液作為超濾介質進行超濾。

本發明第三方面提供了一種脂質體，所述的脂質體採用上述的脂質體原料組合物製得。

本發明中，所述的脂質體優選按照上述的脂質體的製備方法製得。

本發明中，所述的脂質體優選用於抑制癌細胞生長。

本發明第四方面提供了一種脂質體，其包含脂質體膜和脂質體膜內水相；所述的脂質體膜內水相包含以重量份計的1-8.3份的藥物實體，所述的藥物實體含有蔗糖八硫酸酯陰離子、硫酸根陰離子和長春瑞濱陽離子；所述的脂質體膜包含如下以重量份計的組分：2-12份的磷脂、0.7-4份的膽固醇和0.1-0.8份的長循環膜材。

本發明中，所述的藥物實體的份數優選為2-3份。

本發明中，所述的藥物實體優選通過如下方法得到：在蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液存在下，將長春瑞濱鹽通過硫酸銨梯度法進行載藥得到藥物實體；所述的長春瑞濱鹽（包括種類和份數）和所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液（包括種類和濃度）均同前所述。其中，所述的載藥的條件和操作均可同前所述。

本發明中，所述的磷脂（包括磷脂的種類和份數）、所述的膽固醇的份數和所述的長循環膜材（包括長循環膜材的種類和份數）均可同前所述。

本發明中，所述的脂質體膜內水相還可包括水。

本發明中，所述的脂質體還可包括脂質體膜外水相，所述的脂質體膜外水相為等滲溶液。所述的等滲溶液優選為氯化鈉水溶液和/或蔗糖水溶液，例如0.9%（W/W）氯化鈉和9.0%蔗糖的水溶液（W/W）。

本發明中，所述的脂質體優選用於抑制癌細胞生長。

本發明第五方面提供了一種藥物組合物，其包括上述的脂質體和輔料，所述的輔料為上述的等滲溶液和/或藥學可接受的緩衝液。所述的藥物組合物中，所述的藥學可接受的緩衝液的濃度優選為0.01-1mM，pH優選為5.5-8.0。所述的藥物組合物中，所述的藥學可接受的緩衝液優選為4-羥乙基哌𠯤乙磺酸（HEPES）、組胺酸溶液和磷酸鹽溶液中的一種或多種，例如組胺酸緩衝液（例如pH=6.5，用量為處方量）。

本發明還提供了一種物質 A在製備用於抑制癌細胞生長的藥物中的應用；所述的物質 A為上述的脂質體、通過上述的脂質體的製備方法得到的脂質體或上述的藥物組合物。

在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

本發明所用試劑和原料均市售可得。

本發明的積極進步效果在於：本發明的脂質體具有包封率高、穩定性好、藥物活性高、合適的釋藥速率、毒副作用小、藥物代謝動力學好和使用方便的優點，且本發明的製備工藝簡單，適合工業化生產。

下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。

包封率的測定方法：量取100ul脂質體，使用Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠分離脂質體和游離藥部分，加入6ml0.9%NaCl溶液洗脫脂質體部分，再加入7ml0.9%NaCl溶液洗脫游離藥物部分，使用液相層析法分別測定游離藥物和脂質體部分的含量，按公式包封率=脂質體部分/（脂質體部分+游離藥物部分）*100%，計算包封率。

體外釋放方法：0.005M氯化銨/0.3M葡萄糖/0.01M L-組胺酸作為釋放液，將1.6ml樣品與2.4ml釋放液混合轉移到透析袋中，透析袋置於37℃、90rpm轉速的恆溫水浴振盪器內孵育，分別在1.0h、2.0h、3.0h、4.5h取樣測定釋放率。按公式體外釋放率%＝初始包封率%－釋放試驗後的包封率%，計算體外釋放率。

實施例1藥物與載藥鹽結合實驗配製60mg/ml酒石酸長春瑞濱水溶液與不同濃度的載藥鹽溶液按照體積比為1：2充分攪拌混合後，離心處理得上清液，檢測酒石酸長春瑞濱含量，計算酒石酸長春瑞濱與載藥鹽的結合效率。數據下表1所示：沉澱百分率計算公式：沉澱百分比=100%-C ₁/ C ₂，其中C ₁為離心後上層清液API濃度，C ₂為上述混合溶液中API的理論濃度，即20mg/ml。表1不同載藥鹽溶液濃度與酒石酸長春瑞濱沉澱結合試驗

載藥鹽編號	硫酸銨（AS）溶液濃度(mM)	蔗糖八硫酸酯鉀（SOSK）溶液(mM)	沉澱百分率%
1	300	/	0
2	300	1.5	12.5
3	300	8	72.7
4	300	15	92.2
5	300	30	91.1
6	300	50	89.9
7	300	75	88.7
8	/	75	85.1
9	200	15	92.5
10	250	15	92.3
11	350	15	91.5
12	400	15	90.9
13	/	15	95.9

結果：硫酸銨與酒石酸長春瑞濱不能形成沉澱，這表明硫酸銨不適合單獨作為載藥鹽。蔗糖八硫酸酯金屬鹽（例如Li鹽、Na鹽、K鹽、Ca鹽、Mg鹽或者Al鹽）可與酒石酸長春瑞濱形成穩定的沉澱，但因其不能為脂質體內外水相提供有效的銨梯度，也無法單獨作為載藥鹽。將硫酸銨與蔗糖八硫酸酯鉀混合，利用硫酸銨提供銨梯度，蔗糖八硫酸酯鉀結合藥物，可實現有效的藥物裝載，同時改變硫酸銨、蔗糖八硫酸酯鉀濃度，可調節載藥鹽與酒石酸長春瑞濱（API）的結合率。

實施例2 （1）油相配製：根據下表2的配方將氫化大豆磷脂醯膽鹼、膽固醇、培化磷脂醯乙醇胺（mPEG2000-DSPE）與無水乙醇在55-70℃下混合溶解，得到油相溶液。（2）水相配製：根據配方將硫酸銨，蔗糖八硫酸酯鉀鹽與水在55-65℃下混合溶解，得到硫酸銨濃度為300mM和蔗糖八硫酸酯鉀濃度為15mM的水相溶液。（3）將步驟（1）得到的油相溶液注入到步驟（2）得到水相溶液中，在55-65℃下完成孵化，得到脂質體初乳溶液。（4）將步驟（3）得到的脂質體初乳溶液，在55-65℃條件下經100nm和80nm聚碳酸酯膜完成擠出得到合適粒徑。使用0.9%（W/W）氯化鈉溶液和蔗糖溶液9.0%（W/W）做為超濾介質對脂質體溶液進行超濾，以便除掉脂質體外水相中的硫酸銨和蔗糖八硫酸酯鉀，水相中的乙醇，從而構建脂質體內外水相鹽梯度，得到空白脂質體溶液。（5）將步驟（4）得到的空白脂質體溶液，與完全溶解的酒石酸長春瑞濱溶液混合後在42-52℃條件下孵化保持5-30min，將熱混合液置於0-5℃的冰水浴中快速降溫至20℃以下，進而完成載藥。（6）使用蔗糖溶液9.0%（W/W）對步驟（5）完成載藥的脂質體樣品進行二次超濾，除去游離藥物並加入處方量的組胺酸緩衝液（pH=6.5）進行定容。表2

序號	原料	酒石酸長春瑞濱脂質體（Vinorelbine Tartrate Liposome、5ml/瓶）
1	酒石酸長春瑞濱（API）	13.85mg
2	培化磷脂醯乙醇胺（mPEG2000-DSPE）	2.45mg
3	HSPC（氫化大豆磷脂醯膽鹼）或DSPC（二硬脂醯基磷脂醯膽鹼,）	38.0mg
4	膽固醇	12.65mg
5	硫酸銨	108.9mg
6	蔗糖八硫酸酯鉀	5.31-53.1mg
7	組胺酸	7.75mg
8	蔗糖	450mg
9	無水乙醇	0
10	鹽酸	調節製劑pH至5-8
11	氯化鈉	0

參比脂質體1 1）水相配製：將蔗糖八硫酸酯三乙胺與水在55-65℃下混合溶解，得到濃度為75mM的蔗糖八硫酸酯三乙胺（SOSTEA）水相溶液。其他步驟同與上述的步驟一致。

參比脂質體2 1）水相配製：將硫酸銨，葡聚糖硫酸酯鈉與水在55-65℃下混合溶解，得到硫酸銨濃度為300mM和葡聚糖硫酸酯鈉（DS）濃度為3mM的水相溶液。其他步驟與上述的步驟一致。

參比脂質體3 1）水相配製：將硫酸銨與水在55-65℃下混合溶解，得到濃度為300mM的水相溶液。其他步驟與上述的步驟一致。

將實施例2脂質體和參比脂質體1-3進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表3和圖1。表3：不同載藥鹽種類對製劑包封率、體外釋放影響

脂質體	載藥鹽種類	載藥後包封率	體外釋放
1h	2h	3h	4.5h
實施例2	15mM SOSK/ 300mM AS	97.8%	9.2%	17.7%	28.0%	35.9%
參比脂質體1	75mM SOSTEA	98.1%	-0.04%	0.4%	1.5%	2.5%
參比脂質體2	3mM DS/ 300mM AS	89.5%	12.1%	20.4%	30.3%	36.7%
參比脂質體3	300mM AS	97.3%	13.0%	28.7%	54.1%	77.3%

結果與討論：載藥鹽為3mM DS/300mM AS的長春瑞濱脂質體（參比脂質體1），載藥後包封率小於90%，包封率偏低會影響製劑安全性及有效性。載藥鹽為75mM SOSTEA的長春瑞濱脂質體（參比脂質體2），釋藥速率過慢，這將導致脂質體包裹的藥物在正常組織大量累積，對人體產生嚴重的毒副作用。載藥鹽為300mM AS的長春瑞濱脂質體（參比脂質體3），釋藥速率過快，這將導致藥物在血液循環過程中大量釋放，藥物在腫瘤部位暴露量不足，藥效無法達到預期效果。載藥鹽為15mM SOSK/300mM AS的長春瑞濱脂質體（實施例2），具有高包封率、合適的釋藥速率，這使得其能在最佳抗癌功效與最小毒副作用之間達到平衡。

實施例3-4 1）水相配製：在55-65℃溫度下，分別配製8、30mM的蔗糖八硫酸酯鉀鹽/300mM硫酸銨水溶液。其他步驟同實施例2一致，得到實施例3和4脂質體。

將實施例3和4脂質體進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表4。表4：不同載藥鹽濃度對製劑包封率、體外釋放影響

實施例	不同SOSK 濃度處方	載藥後包封率	體外釋放
1h	2h	3h	4.5h
實施例3	8mM SOSK/ 300mM AS	97.5%	7.3%	26.8%	40.0%	47.3%
實施例4	30mM SOSK/ 300mM AS	95.6%	1.5%	11.7%	19.8%	21.9%

結果與討論：不同載藥鹽濃度的長春瑞濱脂質體，均有較高的包封率（≥90%），通過改變載藥鹽SOSK濃度，可對製劑釋藥行為進行調控。

實施例5 按照實施例2 中步驟（3）得到的脂質體初乳溶液，在55-65℃溫度下，採用不同模組合、擠壓遍數，製備不同粒徑的空白脂質體。其他步驟同實施例2一致，得到不同粒徑脂質體。

將不同粒徑的脂質體進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表5。表5：不同粒徑脂質體的對製劑包封率、體外釋放影響

樣品編號	產品粒徑（nm）	產品包封率	體外釋放
1h	2h	3h	4.5h
試驗樣品1	135	97.4%	10.6%	20.3%	27.4%	36.1%
試驗樣品2	90	99.2%	11.4%	24.3%	33.1%	42.2%

結果：採用不同擠壓遍數和膜組合，可製備得到不同粒徑的酒石酸長春瑞濱脂質體。酒石酸長春瑞濱脂質體粒徑在90-135nm範圍內變化，均具有較高的包封率（≥90%）、合適的體外釋放速率。

實施例6-8 1）將實施例2中步驟（4）得到的空白脂質體溶液，分別與6.93mg（藥脂比為1.40：7.59）、27.7mg（藥脂比為5.54：7.59）和41.58mg（藥脂比為8.31：7.59）的酒石酸長春瑞濱溶液混合後在55-65℃條件下孵化保持20-40min，將熱混合液置於0-5℃的冰水浴中快速降溫至20℃以下，進而完成載藥。其他步驟同實施例2一致，得到不同藥脂比的脂質體。

將不同藥脂比的脂質體（實施例2、實施例6、實施例7、實施例8）進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表6和圖2。表6：藥脂比對製劑包封率及體外釋放影響

實施例	藥脂比（API/磷脂）	載藥後包封率	產品包封率	體外釋放
1h	2h	3h	4.5h
實施例6	1.40：7.59	97.3%	97.0%	6.3%	11.5%	16.2%	26.5%
實施例7	5.54：7.59	81.1%	99.5%	17.4%	40.4%	51.7%	57.8%
實施例8	8.31：7.59	63.8%	99.3%	18.1%	37.8%	49.5%	58.5%

備註：「載藥後包封率」是指載藥完成後樣品測得的包封率。載藥完成後會對樣品進行二次超濾除去游離藥物。「產品包封率」是指經二次超濾、定重後獲得的樣品包封率。

結果與討論：隨著藥脂比提高，載藥後包封率呈下降、體外釋放呈上升趨勢。通過改變藥脂比，可對製劑釋藥行為進行調控，但藥脂比過高，SOS不足以鎖定所有藥物，會導致製劑包封率下降。藥脂比調整到2.77：7.59（即實施例2），製劑具有較高的包封率及合適的釋藥速率。

實施例9 1）油相配製：根據配方將二硬脂酸磷脂醯膽鹼（DSPC），膽固醇，培化磷脂醯乙醇胺與無水乙醇在55-70℃下混合溶解，得到油相溶液。其他步驟與同實施例2一致。

將不同磷脂種類的脂質體進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表。表7磷脂種類對製劑包封率、體外釋放影響

實施例	磷脂種類	載藥後包封率	體外釋放
1h	2h	3h	4.5h
實施例9	DSPC	94.4%	10.6%	19.6%	31.0%	39.6%

結果與討論：結合上述資料及實施例2可知：採用不同磷脂（HSPC、DSPC）製備的酒石酸長春瑞濱脂質體，載藥後包封率均≥90%，且體外釋放無明顯差異。這表明HSPC、DSPC兩者具有可替代性。

實施例10-11 1）油相配製：根據配方將氫化大豆磷脂醯膽鹼，膽固醇，與不同量0.74mg（即0.15份）、12.25mg（即2.45份）、的培化磷脂醯乙醇胺（mPEG2000-DSPE）與無水乙醇在55-70℃下混合溶解，得到油相溶液。其他步驟與同實施例2一致，得到不同mPEG2000-DSPE的脂質體。

將不同藥脂比的脂質體進行包封率和體外釋放測試，其結果見下表8。表8：mPEG2000-DSPE含量對製劑包封率、體外釋放影響

實施例	mPEG2000- DSPE 份量	載藥後包封率	產品包封率	體外釋放
2h	3h	4h	5h
實施例10	0.15份	89.2%	98.9%	20.9%	27.3%	35.2%	41.3%
實施例11	2.45份	78.4%	99.5%	14.5%	20.6%	30.5%	35.1%

結果與討論： mPEG2000-DSPE投料量增加，會降低載藥後包封率及體外釋放速率，但若不加入或加入量過少，脂質體將無法逃避網狀內皮系統吞噬，延長體內循環時間，增強腫瘤靶向性。依據上述實驗結果，mPEG2000-DSPE合適的投料量為0.49份。

實施例12：對不同載藥鹽長春瑞濱脂質體的毒副作用和骨髓抑制作用的對比研究

1、毒副作用的研究採用雌性BALB/c 裸小鼠，對不同載藥鹽長春瑞濱脂質體進行毒副作用對比研究，實驗設計如下表8：表9

組別	動物數目	載藥鹽	劑量(mg/kg)	給藥容積	給藥途徑	給藥頻次
1	6	空白對照	0	10 µL/g	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
2	6	實施例2	7.5	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
3	6	10	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
4	6	參比脂質體1	7.5	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
5	6	10	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
6	6	參比脂質體2	7.5	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
7	6	10	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
8	6	參比脂質體3	7.5	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20
9	6	10	按實際體重換算	IV	Q3D x 4次，觀察至D20

研究期間對下表10中的項目進行觀察：表10

檢測項目	檢測方法	檢測頻率
臨床觀察	常規動物異常和死亡觀察	每日上下午各一次
體重	每日固定時間段秤量體重，連續2天下降≥20%即進行安樂死處理	每日一次
皮膚毒性	每日固定時間對皮膚紅斑及壞死點評分	每日一次
血液毒性	血細胞計數	Last dose 96h，D20終點

其中皮膚毒性評分標準如下表11：表11

等級	病症及嚴重度
皮膚乾燥	皮膚紅斑
0	無	無
1	輕微	輕微
2	中等	中等
3	嚴重	嚴重
4	極嚴重	極嚴重

體重變化結果如表12以及圖3和4所示。表12

組別	劑量	平均體重變化最大值%（天）	進行安樂死處理小鼠
生理鹽水組	N/A	-0.5%（1天）	0
實施例2	7.5mg/kg	-9.6%（6天）	0
10mg/kg	-11.5%（12天）	1只小鼠第14天安樂死處理
參比脂質體1	7.5mg/kg	-15.6%（12天）	1只小鼠第13天安樂死處理 2只小鼠第14天安樂死處理 1只小鼠第16天安樂死處理
10mg/kg	-22.5%（11天）	2只小鼠第11天安樂死處理 2只小鼠第12天安樂死處理 1只小鼠第13天安樂死處理
參比脂質體2	7.5mg/kg	-5.8%（14天）	0
10mg/kg	-8.5%（12天）	0
參比脂質體3	7.5mg/kg	-4.7%（6天）	0
10mg/kg	-4.1%（6天）	0

在7.5mg/kg、10mg/kg給藥劑量下，參比脂質體1的小鼠最大平均體重變化超過15%，且實驗過程中有多隻小鼠被處以安樂死。實施例2（自製處方）、參比脂質體2、參比脂質體3最大體重變化均小於15%。停止給藥後，各組別小鼠體重出現緩慢恢復，給藥第20天，所有小鼠體重均恢復到正常水準。

皮膚毒性結果如表13以及圖5和6所示。表13

組別	劑量	皮膚毒性評分最大值%（天）	t檢驗P值
生理鹽水組	N/A	0	/
實施例2	7.5mg/kg	3（7天）	/
10mg/kg	8（10天）	/
參比脂質體1	7.5mg/kg	25（12天）	P值（0.001）＜0.05 （與實施例17.5mg/kg對比）
10mg/kg	17（10天）	P值(0.0003)＜0.05 （與實施例110mg/kg對比）
參比脂質體2	7.5mg/kg	5（10天）	P值(0.024)＜0.05 （與實施例17.5mg/kg對比）
10mg/kg	11（13天）	P值(0.00001)＜0.05 （與實施例110mg/kg對比）
參比脂質體3	7.5mg/kg	5（10天）	P值(1.00)＞0.05 （與實施例17.5mg/kg對比）
10mg/kg	4（10天）	P值(0.001)＜0.05 （與實施例110mg/kg對比）

7.5mg/kg、10mg/kg給藥劑量下，實施例2皮膚毒性顯著小於參比脂質體1、參比脂質體2。7.5mg/kg給藥劑量下實施例2與參比脂質體3皮膚毒性評分在統計學上無顯著差異，10mg/kg給藥劑量下參比脂質體3皮膚毒性評分略優於實施例2。

2、骨髓抑制的研究最後1次給藥96h後血常規結果見表14：表14

組別	給藥劑量 / mg/kg	RBC （10^6/uL）	HGB (g/dL)	HCT (%)	MCV(fL)	MCH(pg)	MCHC (g/dL)	PLT (10^3/uL)	MPV (fL)	PDW (%)	PCT (%)	Large Plt (10^3/uL)
紅血球	血紅蛋白	血球容積比	平均紅血球體積	平均紅血球血紅蛋白量	平均血紅蛋白濃度	血小板計數	平均血小板體積	血小板分佈寬度	血小板容積比	大型血小板計數
空白對照	/	9.90	15.9	51.5	52.0	16.1	30.9	1615	11.3	63.8	1.83	151
實施例2	7.5	7.61	11.8	38.1	50.1	15.5	31.0	1633	11.2	59.6	1.83	142
參比脂質體1	7.69	11.9	39.6	51.3	15.6	30.5	872	13.0	63.9	0.99	72
參比脂質體2	7.20	11.3	36.9	51.4	15.8	30.7	1667	11.4	57.3	1.88	137
參比脂質體3	6.67	10.5	34.7	52.1	15.7	30.1	2015	11.4	54.9	2.29	167
實施例2	10	7.35	11.6	37.1	50.5	15.8	31.3	1596	11.5	58.8	1.8	131
參比脂質體1	6.46	9.9	32.5	50.3	15.3	30.3	292	11.4	68.1	0.33	24
參比脂質體2	6.60	10.3	33.6	50.9	15.7	30.8	1294	11.6	60.2	1.45	102
參比脂質體3	7.14	11.1	36.5	51.1	15.5	30.3	1760	11.3	57.1	2.01	152

從血常規結果可以看出，骨髓抑制具有劑量相關性，所有處方10mg/kg給藥劑量的骨髓抑制程度均高於7.5mg/kg。

在7.5mg/kg、10mg/kg給藥劑量下，參比脂質體1小鼠的紅血球、血紅蛋白、血小板計數均出現明顯下降，SOSTEA作為載藥鹽會引起嚴重的骨髓抑制。

在7.5mg/ kg給藥劑量下，實施例2、參比脂質體2、參比脂質體3三種載藥鹽對小鼠骨髓抑制相當，紅血球、血紅蛋白、血小板計數均出現一定程度下降。

在10mg/kg給藥劑量下，參比脂質體2紅血球、血紅蛋白、血小板計數出現明顯下降，骨髓抑制程度大於實施例2（自製處方）、參比脂質體3。

第一次給藥至第20天血常規結果表15：表15：

組別	給藥劑量 / mg/kg	RBC (10^6/uL)	HGB (g/dL)	HCT(%)	MCV (fL)	MCH (pg)	MCHC (g/dL)	PLT (10^3/uL)	MPV(fL)	PDW(%)	PCT(%)	Large Plt (10^3/uL)
紅血球	血紅蛋白	血球容積比	平均紅血球體積	平均紅血球血紅蛋白量	平均血紅蛋白濃度	血小板計數	平均血小板體積	血小板分佈寬度	血小板容積比	大型血小板計數
空白對照	/	9.64	15.4	53.5	55.5	16.0	28.8	1267	12.0	64.5	1.52	148
實施例2	7.5	9.04	14.6	52.0	57.6	16.1	28.0	2831	11.7	57.7	3.32	282
參比脂質體1	7.69	12.5	45.0	58.5	16.2	27.7	3584	11.6	54.2	4.13	321
參比脂質體2	8.60	14.2	51.8	60.4	16.6	27.5	3530	11.9	55.1	4.21	366
參比脂質體3	8.94	14.8	52.5	58.8	16.5	28.1	2618	11.4	58.4	2.96	231
實施例2	10	8.80	14.5	51.4	58.4	16.4	28.2	3467	10.8	56.0	3.69	226
參比脂質體1	6.53	10.5	41.6	63.8	16.1	25.2	4220	10.8	50.8	4.54	224
參比脂質體2	8.44	13.5	50.9	60.3	15.9	26.4	5119	11.6	53.5	5.97	447
參比脂質體3	9.02	15.0	53.4	59.2	16.6	28.1	3375	11.7	56.9	3.94	326

給藥後第20天，實施例2、參比脂質體2、參比脂質體3血小板計數迅速恢復到正常水準，紅血球、血紅蛋白也出現緩慢恢復跡象。參比脂質體1血小板計數迅速恢復到正常水準，但紅血球未出現任何恢復進展。結論見表16：表16

組別	實施例2	參比脂質體1	參比脂質體2	參比脂質體3
載藥鹽	SOSK/AS	SOSTEA	DS/AS	AS
給藥劑量	7.5 mg/kg、10mg/kg
平均體重變化	實施例2、參比脂質體2-3小鼠體重變化均小於15%，實施例2小鼠體重變化大於15%。
皮膚毒性評分	實施例2皮膚毒性評分與參比脂質體3相當，優於參比脂質體1-2。
骨髓抑制	實施例2骨髓抑制與參比脂質體3相當，優於參比脂質體1-2。

實施例13：藥物代謝動力學實驗對比研究採用大鼠對不同載藥鹽長春瑞濱脂質體進行PK對比研究，實驗設計如下： 1、酒石酸長春瑞濱脂質體動物PK實驗基本資訊如表17 表17

組別	製劑	雄性動物數	劑量 (mg/kg)	體積 (mL/kg)	濃度 (mg/mL)	給藥途徑	給藥次數
A	酒石酸長春瑞濱注射液	3	7.5	10	0.75	靜脈推注	單次
B	參比脂質體1	3	7.5	10	0.75	靜脈推注	單次
C	參比脂質體3	3	7.5	10	0.75	靜脈推注	單次
D	參比脂質體2	3	7.5	10	0.75	靜脈推注	單次
E	實施例2	3	7.5	10	0.75	靜脈推注	單次

2、酒石酸長春瑞濱脂質體動物PK實驗樣品採集資訊如表18所示：

3、酒石酸長春瑞濱脂質體動物PK實驗血樣檢測結果如表19所示以及圖7所示：表19

樣品	酒石酸長春瑞濱注射液	參比脂質體1	參比脂質體3	參比脂質體2	實施例2
Cmax（ng/mL）	823	190667	203667	181667	182667
Tmax（h）	0.08	0.08	0.08	0.14	0.08
AUCINF_obs （h*ng/mL）	3897	2677044	570748	1146108	857559
t _1/2（h）	17.17	15.44	10.28	9.06	9.89

結果與討論：酒石酸長春瑞濱注射液進入大鼠體內，被快速消除；不同載藥鹽酒石酸長春瑞濱脂質體在體內均存在緩慢釋藥行為。

藥物在血液循環過程中釋放過快，將導致藥物在腫瘤部位暴露量不足，藥效無法達到預期效果；藥物釋放過慢，藥物在正常組織大量累積如皮膚，將產生嚴重的毒副作用如手足綜合症，從上述PK結果可知，參比脂質體1釋放過慢，參比脂質體3釋放過快，本發明的脂質體（實施例2）具有合適的釋藥速率，可滿足理想的酒石酸長春瑞濱脂質體製備要求。

實施例13：自製酒石酸長春瑞濱脂質體與酒石酸長春瑞濱注射液對接種結腸癌細胞HT-29小鼠的藥效對比試驗方法：每1×10 ⁷個細胞用100 ul含50% Matrigel的培養基重懸，接種於小鼠右側腋下。當腫瘤體積均值達到約139 mm ³時（腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a×b ²，a和b分別表示腫瘤的長和寬），根據腫瘤大小和體重通過Excel進行隨機分組，按組進行Q3D*4靜脈給藥，單次給藥劑量為7.5mg/kg。給藥後動物正常飼養，使用測量瘤徑的方法，動態觀察受試藥的抗瘤作用，腫瘤體積的計算公式為V = 0.5a×b ²，其中a和b分別表示腫瘤的長和寬，實驗結果採用GraphPad Prism 5進行分析。

藥效試驗結果：自製酒石酸長春瑞濱脂質體與酒石酸長春瑞濱注射液對接種結腸癌細胞HT-29小鼠的藥效對比結果見表19 表19

Days	腫瘤體積(mm ³), 均值 ± 標準誤
生理鹽水	酒石酸長春瑞濱脂質體注射液（7.5mg/kg）	酒石酸長春瑞濱注射液（7.5mg/kg）
0	140±10	139±9	139±12
3	295±17	205±7	202±12
6	368±18	138±9	161±6
8	458±28	92±11	131±7
12	585±46	66±12	87±8
15	721±68	29±10	67±6
19	940±90	13±8	77±9
22	1149±91	4±3	113±15
26	1369±103	1±1	144±18
29	1649±171	1±1	184±26
33	1924±164	14±13	297±56
35	2106±218	22±17	376±55

結論：由藥效試驗結果可見，與空白組相比，酒石酸長春瑞濱脂質體、酒石酸長春瑞濱注射液均有抑瘤作用。酒石酸長春瑞濱脂質體比酒石酸長春瑞濱注射液對HT-29腫瘤生長的抑制更強。

實施例14：自製酒石酸長春瑞濱脂質體與酒石酸長春瑞濱注射液對接種纖維肉瘤細胞HT-1080小鼠的藥效對比試驗方法：每5×10 ⁶個細胞用100 ul含50% Matrigel的培養基重懸，接種於小鼠右側腋下。當腫瘤體積均值達到約144 mm ³時（腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a×b ²，a和b分別表示腫瘤的長和寬），根據腫瘤大小和體重通過Excel進行隨機分組，按組進行Q4D*2靜脈給藥，單次給藥劑量為10.0mg/kg。給藥後動物正常飼養，使用測量瘤徑的方法，動態觀察受試藥的抗瘤作用，腫瘤體積的計算公式為V = 0.5a×b ²，其中a和b分別表示腫瘤的長和寬,實驗結果採用GraphPad Prism 5進行分析。

藥效試驗結果：自製酒石酸長春瑞濱脂質體與酒石酸長春瑞濱注射液對接種纖維肉瘤HT-1080小鼠的藥效對比結果見表20。表20

Days	腫瘤體積(mm3), 均值 ± 標準誤
生理鹽水	酒石酸長春瑞脂質體注射液（10.0mg/kg）	酒石酸長春瑞濱注射液（10.0mg/kg）
0	144±11	144±7	144±10
3	379±30	164±9	194±14
6	716±58	93±9	100±11
8	1063±94	77±14	76±16
11	1496±128	56±15	58±12
13	1805±197	40±15	51±11
15	-n=0	29±15	49±10
19	-n=0	19±12	77±16
22	-n=0	14±12	136±30
26	-n=0	8±7	272±74
29	-n=0	11±8	440±100
33	-n=0	25±16	650±182
35	-n=0	33±22	811±212

結論：由藥效試驗結果可見，與空白組相比，酒石酸長春瑞濱脂質體、酒石酸長春瑞濱注射液均有抑瘤作用。酒石酸長春瑞濱脂質體比酒石酸長春瑞濱注射液對HT-1080腫瘤生長的抑制更強。

本領域均知，理想的酒石酸長春瑞濱脂質體應具備以下幾個特徵：1）較高的藥物裝載效率；2）合適的體內半衰期，以實現最佳抑瘤效果與最小毒副作用之間平衡；3）存儲過程中相對穩定，不發生藥物洩漏；4）製備工藝簡單，適合工業化生產。

本發明的發明人通過對載藥鹽及製備工藝進行深入廣泛的研究，最終得到本發明的脂質體具有包封率高、穩定性好、毒副作用小、藥效優越以及臨床使用方便的優點。

無

圖1為不同載藥鹽種類對製劑體外釋放影響的曲線圖。圖2為藥脂比對製劑體外釋放影響的曲線圖。圖3為7.5mg/kg給藥劑量下，給藥不同載藥鹽的酒石酸長春瑞濱脂質體的小鼠體重變化對比圖。圖4為10.0mg/kg給藥劑量下，給藥不同載藥鹽酒石酸長春瑞濱脂質體的小鼠體重變化對比圖。圖5為7.5mg/kg給藥劑量下，給藥不同載藥鹽酒石酸長春瑞濱脂質體的皮膚毒性評分對比圖。圖6為10.0mg/kg給藥劑量下，給藥不同載藥鹽酒石酸長春瑞濱脂質體的皮膚毒性評分對比圖。圖7為7.5mg/kg給藥劑量下，給藥不同載藥鹽酒石酸長春瑞濱脂質體在大鼠中的血藥濃度對比圖。

Claims

一種脂質體原料組合物，其中，以重量份計，其包含1-8.3份的長春瑞濱鹽、2-12份的磷脂、0.1-0.8份的長循環膜材、0.7-4.0份的膽固醇和載藥鹽；所述的載藥鹽為蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的蔗糖八硫酸酯鹽的濃度為1-75mM，所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的硫酸銨的濃度為100-500mM。
如請求項1所述的脂質體原料組合物，其中，所述的脂質體原料組合物滿足如下1個或多個條件：（1）所述的長春瑞濱鹽為酒石酸長春瑞濱，例如2.77份；（2）所述的磷脂的份數為2-3份，例如2.8份；（3）所述的磷脂的種類為大豆磷脂、氫化大豆磷脂、二硬質醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼和二油醯磷脂醯膽鹼中一種或多種，例如氫化大豆磷脂和/或二硬質醯磷脂醯膽鹼；（4）所述的長循環膜材的份數為0.1-0.5份，例如0.34份；（5）所述長循環膜材的種類為聚乙二醇衍生化磷脂，優選聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺和/或聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺，例如mPEG2000-DSPE；（6）所述的膽固醇的份數為0.7-2.5份；（7）所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的蔗糖八硫酸酯鹽的濃度為1-50 mM，例如30 mM；（8）所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的硫酸銨的濃度為200-400，例如300mM；（9）所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨中的蔗糖八硫酸酯鹽為蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽、蔗糖八硫酸酯鹼土金屬鹽、蔗糖八硫酸酯銨和蔗糖八硫酸酯有機胺鹽中的一種或多種，例如蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽。
如請求項2所述的脂質體原料組合物，其中，所述蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液為1.5-30mM蔗糖八硫酸酯鹼金屬鹽和200-400 mM硫酸銨的水溶液，例如15 mM蔗糖八硫酸酯鉀和300 mM硫酸銨的水溶液；和/或，所述的脂質體原料組合物中，以重量份計，其包含1.4-8.3份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.15-0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；所述的長春瑞濱鹽的份數優選為1.4-2.8份。
如請求項3所述的脂質體原料組合物，其中，所述的脂質體原料組合物中，以重量份計，其選包含如下組1-5中任一組原料：組1：2.77份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組2：1.38份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組3：5.53份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組4：8.31份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.49份的長循環膜材和2.53份的膽固醇；組5：2.77份的長春瑞濱鹽、7.59份的磷脂、0.15份的長循環膜材和2.53份的膽固醇。
一種脂質體的製備方法，其中，採用如請求項1-4中任一項的脂質體原料組合物製得，其包括如下步驟：採用硫酸銨梯度法進行載藥得到所述的脂質體，即可。
如請求項5所述的脂質體的製備方法，其中，（1）所述的載藥的溫度為42-52℃；（2）所述的載藥的時間為5-30min；（3）所述的載藥後，還進一步包括超濾步驟，例如採用9.0%蔗糖溶液作為超濾介質進行超濾；（4）所述的載藥為將長春瑞濱鹽和空白脂質體進行載藥得到所述的脂質體；所述的空白脂質體包含脂質體膜和脂質體膜內的內水相；所述的脂質體膜包括如下以重量份計的組分：2-12份的磷脂、0.7-4.0份的膽固醇、0.1 -0.8份的長循環膜材；所述的內水相為蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液，所述的蔗糖八硫酸酯鹽的濃度為1-75mM，所述的硫酸銨的濃度為100-500mM；優選通過選通過如下方法製得；所述的空白脂質的製備方法包括如下步驟：步驟1：將所述的磷脂、所述的膽固醇、所述的長循環膜材和乙醇進行混合得到油相溶液；步驟2：採用乙醇注入法，將步驟1得到的油相溶液注入所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液得到脂質體初乳溶液；步驟3：將步驟2得到脂質體初乳溶液通過用擠出法得到混合物；步驟4：以等滲溶液為介質，將步驟3混合物進行超濾，得到空白脂質體。
如請求項6所述的脂質體的製備方法，其中，（1）所述的空白脂質的製備方法中的步驟1中，所述的混合的溫度為55-70℃；（2）步驟2中，所述的乙醇注入法中的孵化的溫度為55-65℃；（3）步驟3中，所述的擠出法中的溫度為55-65℃；（4）步驟3中，所述的擠出法中的擠出的孔徑依次為100nm和80nm；（5）步驟4中，所述的等滲溶液為氯化鈉水溶液和/或蔗糖水溶液，例如0.9%氯化鈉和9.0%蔗糖的水溶液。
一種脂質體，其中，所述的脂質體採用如請求項1-4中的任一項所述的脂質體原料組合物製得。
如請求項8所述的脂質體，其中，所述的脂質體按照如請求項5-8中任一項所述的脂質體的製備方法製得；和/或，所述的脂質體用於抑制癌細胞生長。
一種脂質體，其中，其包含脂質體膜和脂質體膜內水相；所述的脂質體膜內水相包含以重量份計的1-8.3份的藥物實體，所述的藥物實體含有蔗糖八硫酸酯陰離子、硫酸根陰離子和長春瑞濱陽離子；所述的脂質體膜包含如下以重量份計的組分：2-12份的磷脂、0.7-4份的膽固醇和0.1-0.8份的長循環膜材。
如請求項10所述的脂質體，其中，所述的脂質體滿足如下1個或多個條件：（1）所述的藥物實體的份數為2-3份；（2）所述的藥物實體通過如下方法得到：在蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液存在下，將長春瑞濱鹽通過硫酸銨梯度法進行載藥得到藥物實體；所述的長春瑞濱鹽和所述的蔗糖八硫酸酯鹽-硫酸銨的水溶液均如請求項1-4中任一項所述；所述的載藥的條件和操作均如請求項6或7所述；（3）所述的磷脂、所述的膽固醇的份數和所述的長循環膜材均如請求項1-4中任一項所述；（4）所述的脂質體膜內水相還包括水；（5）所述的脂質體還包括脂質體膜外水相，所述的脂質體膜外水相為等滲溶液；所述的等滲溶液優選為氯化鈉水溶液和/或蔗糖水溶液，例如0.9%氯化鈉和9.0%蔗糖的水溶液；（6）所述的脂質體用於抑制癌細胞生長。
一種藥物組合物，其包括如請求項8-11中任一項所述的脂質體和輔料，所述的輔料為等滲溶液和/或藥學可接受的緩衝液，所述的等滲溶液如請求項7所述；所述的藥學可接受的緩衝液的濃度優選為0.01-1mM，pH優選為5.5-8.0；所述的藥學可接受的緩衝液優選為4-羥乙基哌𠯤乙磺酸、組胺酸溶液和磷酸鹽溶液中的一種或多種，例如組胺酸緩衝液。
一種物質 A在製備用於抑制癌細胞生長的藥物中的應用；所述的物質 A為如請求項8-11中任一項所述的脂質體或如請求項12所述的藥物組合物。