BR112019020406A2 - composição lipossômica e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição lipossômica e uma composição farmacêutica, que exibam uma alta auc. são fornecidas uma composição lipossômica que inclui uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais; e uma composição farmacêutica incluindo a composição lipossômica.

Description

“COMPOSIÇÃO LIPOSSÔMICA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”

CAMPO DA TÉCNICA [001 ]A presente invenção refere-se a uma composição lipossômica e a uma composição farmacêutica, que exibem alta retenção no sangue.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]É frequentemente estudado que um fármaco é acumulado em um sítio de doença, tal como câncer, e exposto a ele por um longo período de tempo por meio de uma composição lipossômica. Em uma composição lipossômica como uma composição farmacêutica, um fármaco é encapsulado em um lipossoma constituído por uma membrana lipídica.

[003]O documento US7060828B2 e [AACR-EORTC International Conference, São Francisco, Califórnia, 22 a 26 de outubro de 2007, # C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Shingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni e outros] descrevem urn lipossoma no qual ο topotecano é encapsulado em urn lipossoma contendo esfingomielina e colesterol.

[004]O documento US7811602B2 descreve urn lipossoma no qual ο topotecano é encapsulado em urn lipossoma contendo dihidroesfingomielina e colesterol.

[005]O documento JP2008-519045A descreve uma formulação lipossômica de camptotecina adaptada para melhorar a estabilidade da camptotecina, incluindo (a) camptotecina encapsulada em um lipossoma, (b) primeira solução que é externa ao lipossoma e com um pH de 4,5 ou menor que 4,5, e (c) segunda solução que é interna ao lipossoma. É também descrito que o lipossoma contém dihidroesfingomielina e colesterol.

[006]O documento JP1990-196713A (JP-H02-196713A) descreve um sistema para carregar efetivamente um fármaco anfifílico em um lipossoma, incluindo ajustar uma suspensão de lipossomas na presença de um composto de amônio ou sal de

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2/57 amônio, diluir a suspensão com um tampão ou sal, e fornecer um gradiente de amônio de dentro para fora entre uma fase aquosa interna e uma fase aquosa externa e um gradiente de pH, de modo que o pH do interior do lipossoma seja mais ácido do que o pH do exterior do lipossoma.

[007]0 documento US6355268B2 descreve um lipossoma no qual o topotecano é encapsulado na presença de sulfato de amônio em um lipossoma contendo fosfolípido de soja hidrogenado purificado ou esfingomielina, colesterol e um lipídio derivado de polímero hidrofílico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008]Os documentos mencionados acima US7060828B2, US7811602B2, JP2008-519045A e [AACR-EORTC International Conference, São Francisco, Califórnia, 22-26 de outubro de 2007, # C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Shingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni e outros] descrevem que a eficácia do fármaco é melhorada ao encapsular o topotecano em um lipossoma contendo esfingomielina ou dihidroesfingomielina para suprimir o vazamento de topotecano no sangue e melhorar a área sob a curva (AUC) de concentração-tempo no sangue. No entanto, uma vez que a composição de lipídios que constituem o lipossoma e a composição de sais que precipitam o topotecano não foram otimizadas, a melhora na AUC não é suficiente e, portanto, é necessária uma melhora adicional para a AUC.

[009][Além disso, em um caso em que o topotecano vaza da fase aquosa interna do lipossoma para a fase aquosa externa e é então exposto a condições neutras, o topotecano se torna análogo ao mesmo. Especificamente, um aducto N-N bis com solubilidade extremamente baixa (dímero de topotecano amina) ou similar pode ser precipitado como cristais. Por fim, muitas partículas insolúveis que estão fora dos padrões de segurança e qualidade definidos pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA, pela Pharmaceutical and Medical Device Agency (PMDA) do Japão

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3/57 e pela Europena Medicines Agency (EMEA) são formadas, o que não é desejável. De modo a suprimir a formação de tais partículas insolúveis, o pH da fase aquosa externa é definido como uma condição ácida no documento JP2008-519045A. No entanto, em um caso em que a fase aquosa externa está na condição ácida, é promovida a decomposição dos lipídios que constituem o lipossoma, o que é desvantajoso para a estabilização do lipossoma. No lipossoma de JP2008-519045A, uma vez que é necessário acidificar a fase aquosa externa, é difícil adicionar diacilfosfatidiletanolamina modificada com metoxipolietileno glicol hidrolisável para melhorar a retenção no sangue.

[010]Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição lipossômica e uma composição farmacêutica que exibam uma alta AUC.

[011]Como um resultado de extensos estudos para alcançar o objetivo acima, os presentes inventores concluíram que é possível fornecer uma composição lipossômica que atinja o objetivo acima por meio de uma configuração em que uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina e colesteróis são usados como componentes de uma membrana lipossômica, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é definida como 0,36 ou mais. A presente invenção foi completada com base nessas conclusões.

Ou seja, a presente invenção fornece o seguinte.

[1] Composição lipossômica que compreende: uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico; uma dihidroesfingomielina; e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é 0,36 ou mais.

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4/57 [2] A composição lipossômica de acordo com [1], na qual o fármaco é topotecano ou um sal do mesmo, doxorrubicina ou um sal do mesmo, irinotecano ou um sal do mesmo, ou sunitinibe ou um sal do mesmo.

[3] A composição lipossômica de acordo com [1] ou [2], na qual a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é de 0,6 ou mais e 1,8 ou menos.

[4] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1 ] a [3], na qual a diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico é uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polietileno glicol ou metóxi polietileno glicol.

[5] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1 ] a [4], na qual a porcentagem de diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico nos componentes da membrana lipossômica é de 2 a 10 mol%.

[6] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1 ] a [5], na qual a porcentagem de colesteróis nos componentes da membrana lipossômica é de 35 a 43 mol%.

[7] A composição lipossômica, de acordo com qualquer um de [1] a [6], que tem um tamanho de partícula de 150 nm ou menos.

[8] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1 ] a [7], na qual a fase aquosa externa tem um pH de 5,5 a 8,5.

[9] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1 ] a [8], na qual a dihidroesfingomielina é uma dihidroesfingomielina contendo um grupo alquila de cadeia longa tendo 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa tendo 18 átomos de carbono, e o fármaco encapsulado é topotecano ou um sal do mesmo.

[10] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1] a [9], na qual a porcentagem de íons sulfato contida na fase aquosa interna do lipossoma para os íons sulfato na composição lipossômica inteira é de ao menos 80%, e a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco

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5/57 na composição lipossômica inteira é de ao menos 80%.

[11] A composição lipossômica de acordo com [9], na qual uma taxa de liberação de fármaco a partir do lipossoma no plasma tendo uma concentração de amônio de 1 mmoL / L ou menos é de 20% / 24 horas ou menos a 37° C, e a taxa de liberação de fármaco a partir do lipossoma no plasma tendo uma concentração de amônio de 4 a 6 mmoL / L é de 60% / 24 horas ou mais a 37° C.

[12] A composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1] a [11], na qual o número de partículas acima de 10 pm contidas em 1 pmol de lipídio da composição lipossômica após armazenamento por 1 mês a 5^o C é de 150 ou menos, e o número de partículas com mais de 25 pm contidas em 1 pmol de lipídio da composição lipossômica é de 15 ou menos.

[13] Uma composição farmacêutica compreendendo:

a composição lipossômica de acordo com qualquer um de [1] a [12], [14] A composição farmacêutica de acordo com [13], que é um agente anticâncer.

[15] Uma composição lipossômica compreendendo: uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico; uma dihidroesfingomielina; e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna contém sulfato de amônio, e a dihidroesfingomielina é uma dihidroesfingomielina contendo um grupo alquila de cadeia longa tendo 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa grupo tendo 18 átomos de carbono.

[A] Um método para tratar uma doença, compreendendo administrar a um indivíduo uma composição lipossômica compreendendo uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase

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6/57 aquosa interna do mesmo contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais.

[B] Uma composição lipossômica para uso no tratamento de uma doença (preferencialmente, câncer), compreendendo uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma a fase aquosa interna contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais.

[C] Uso de uma composição lipossômica para a produzir uma composição farmacêutica, compreendendo uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis, nos quais a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais.

[012]A composição lipossômica e a composição farmacêutica da presente invenção podem exibir uma alta AUC.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [013]A Figura 1 mostra os resultados da medição do peso corporal em um teste de eficácia de fármaco usando um modelo de camundongo para transplante subcutâneo A549.

[014]A Figura 2 mostra os resultados da medição do peso corporal em um teste de eficácia de fármaco usando um modelo de camundongo para transplante subcutâneo A549.

[015]A Figura 3 mostra os resultados da medição do volume do tumor em um teste de eficácia de fármaco usando um modelo de camundongo para transplante

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7/57 subcutâneo A549.

[016]A Figura 4 mostra os resultados da medição do volume do tumor em um teste de eficácia de fármaco usando um modelo de camundongo para transplante subcutâneo A549.

[017]A Figura 5 mostra o valor da AUC para cada quantidade de colesterol.

[018]A Figura 6 mostra os resultados da medição da dependência do íon amônio na taxa de liberação.

DESCRIÇÃO DETALHADA [019]O intervalo numérico indicado pelo uso de “a” na presente especificação significa um intervalo que inclui os valores numéricos descritos antes e depois de “a” como o valor mínimo e o valor máximo, respectivamente.

[020]Em relação a um teor de um componente em uma composição, em um caso em que existem várias substâncias correspondentes a um componente na composição, o teor significa, a menos que especificado de outra forma, a quantidade total das várias substâncias existentes na composição.

[021 ]O termo “retenção no sangue” significa uma propriedade na qual um fármaco em um estado encapsulado em um lipossoma está presente no sangue em um indivíduo ao qual uma composição lipossômica foi administrada.

[022]O “tamanho médio de partícula do lipossoma” significa um tamanho médio cumulativo de partícula medido usando um método dinâmico de espalhamento de luz, a menos que especificado de outra forma. Exemplos de dispositivos de medição disponíveis comercialmente usando a dispersão dinâmica de luz incluem um analisador de partículas de sistema concentrado FPAR-1000 (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.), um NANOTRAC UPA (fabricado por Nikkiso Co., Ltd.), e um NANOSIZER (fabricado por Malvern Panalytical Ltd.). Também é possível calcular um tamanho médio volumétrico de partícula e um tamanho médio numérico de partícula do lipossoma pela equação de conversão específica para o dispositivo de medição de

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8/57 cada fabricante.

[023]De modo a medir partículas na vizinhança de 100 nm, a distribuição de partículas não pode ser capturada com precisão por um método estático de dispersão de luz ou similar, e é preferencial a medição pelo método dinâmico de dispersão de luz.

[024]O termo “partículas insolúveis” é um item definido pelas autoridades reguladoras, tal como PMDA, FDA e EMEA, como padrões de segurança e qualidade em composições medicinais para administração sistêmica, tal como formulações de injeção intravenosa. Por exemplo, em um caso de avaliação de uma composição farmacêutica pelo primeiro método (método de contagem de partículas de proteção contra luz) de Insoluble Particulate Teste Method of the Japanese Pharmacopeia <6.07> Injections in Japan, é necessário que o número de partículas insolúveis tenham um tamanho de partícula igual ou superior a 10 pm contido em um frasco de fármaco de um produto com um volume de exibição inferior a 100 mL é de 6.000 ou menos e o número de partículas insolúveis com tamanho de partícula igual ou superior a 25 pm é de 600 ou menos. Além disso, em um caso de avaliação de uma composição farmacêutica pelo segundo método (método microscópico de contagem de partículas), é necessário que o número de partículas insolúveis tendo um tamanho de partícula igual ou superior a 10 pm seja de 6.000 ou menos e o número de partículas insolúveis tendo um tamanho de partícula igual ou superior a 25 pm é de 600 ou menos.

[025]As partículas insolúveis são definidas apenas pelo tamanho das partículas, independentemente dos componentes das partículas. Por exemplo, na composição lipossômica, as partículas insolúveis podem ser agregadas dos próprios lipossomas, agregadas e precipitadas dos componentes de fármaco vazados a partir do interior dos lipossomas, ou agregadas e precipitadas de componentes da fase aquosa externa do lipossoma. Em particular, de acordo com a descrição de JP2008

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519045A e similares, sabe-se que o lipossoma encapsulado com topotecano na presente invenção é um precipitado que é gerado através do vazamento do topotecano encapsulado para o exterior do lipossoma, seguido por decomposição em um degradante menos solúvel.

[026]Como um método de medir as partículas insolúveis, existe, por exemplo, um método de contagem de partículas de proteção contra luz que realiza a detecção óptica de partículas insolúveis (é utilizado um contador de partículas, por exemplo, HIAC 9703+ de Beckman Coulter, Inc. ou Accusizer A2000 USP de Particle Sizing Systems, Inc.), e um método microscópico de contagem de partículas que observa visualmente uma imagem ampliada com um microscópio e conta as partículas insolúveis.

[027]No caso de uma composição farmacêutica de lipossoma, particularmente no caso de uma formulação injetável, é preferencial que, conforme definido em Insoluble Particulate Test Method of the Japanese Pharmacopeia <6.07> Injections, o número de partículas tendo um tamanho de partícula maior que 10 pm, que estão contidas na composição farmacêutica no momento do uso, é de 6000 ou menos e o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 25 pm é de 600 ou menos.

[028]Na formulação injetável da composição farmacêutica de lipossoma, a causa da formação de partículas insolúveis é considerada atribuída principalmente à agregação, coalescência e degradação dos componentes das partículas de lipossomas que ocorrem durante o armazenamento, mas não está limitada a essas. As partículas insolúveis tendem a ser geradas dependendo da quantidade de lipídio que é um material principal que constitui o lipossoma. Por exemplo, em um caso de considerar uma composição farmacêutica contendo 2 mL de uma composição lipossômica tendo uma concentração lipídica de 20 mmol / L e, em seguida, em um caso em que o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 10 pm

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10/57 é de 150 ou menos e o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 25 pm é de 15 ou menos por 1 pmol de lipídio, é possível satisfazer a condição de que o número de partículas com um tamanho de partícula superior a 10 pm, que estão contidas em a composição farmacêutica, é de 6000 ou menos e o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 25 pm é de 600 ou menos, que é o padrão definido em Insoluble Particulate Test Method of the Japanese Pharmacopeia <6.07> Injections.

[029]Também na composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção, é preferencial que o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 10 pm seja de 150 ou menos e o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 25 pm seja de 15 ou menos por 1 pmol de lipídio após armazenamento por 1 mês a 5^o C. É mais preferencial que o número de partículas tendo um tamanho de partícula superior a 10 pm seja igual ou inferior a 75 e o número de partículas com um tamanho de partícula superior a 25 pm seja de 7,5 ou menos por 1 pmol de lipídio após armazenamento por 1 mês a 5^o C. É ainda mais preferencial que o número de partículas com um tamanho de partícula superior a 10 pm seja de 25 ou menos e o número de partículas com um tamanho de partícula superior a 25 pm seja de 2,5 ou menos por 1 pmol de lipídio após armazenamento por 1 mês a 5^o C.

[030]Além disso, partículas grossas com um tamanho de partícula superior a 10 pm geralmente aumentam devido à deterioração com o tempo durante o armazenamento, e é preferencial satisfazer o número acima de partículas mesmo após o armazenamento por 3 meses e é mais preferencial satisfazer o número de partículas acima mesmo após armazenamento por 1 ano.

[031 ]O “indivíduo” é um mamífero, tal como um humano, um rato, um macaco ou um animal doméstico em necessidade de prevenção ou tratamento de uma doença ou similar e, de preferência, um humano em necessidade de prevenção ou tratamento

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11/57 de uma doença ou similar.

[032]A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.

[033]A composição lipossômica de acordo com a primeira modalidade da presente invenção é uma composição lipossômica que inclui uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais.

[034]Além disso, a composição lipossômica de acordo com a segunda modalidade da presente invenção é uma composição lipossômica que inclui uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, na qual a composição lipossômica encapsula um fármaco, fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e a dihidroesfingomielina é uma dihidroesfingomielina contendo um grupo alquila de cadeia longa tendo 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa tendo 18 átomos de carbono.

[035]Na presente invenção, a retenção do lipossoma no sangue é melhorada usando uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes da membrana lipossômica. Além disso, a inclusão de sulfato de amônio na fase aquosa interna suprime o vazamento do fármaco a partir do lipossoma no sangue e, portanto, melhora a AUC. Além disso, ao definir a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira como sendo 0,36 ou mais, o vazamento do fármaco a partir do lipossoma no sangue é suprimido ainda mais e, portanto, é alcançada uma AUC mais alta.

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12/57 [036]Como um resultado do exposto acima, o vazamento do fármaco a partir da fase aquosa interna para a fase aquosa externa pode ser suprimido mesmo durante o armazenamento a frio, e a geração de partículas insolúveis pode ser suprimida mesmo em condições neutras. Ou seja, na composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção, o pH da fase aquosa externa pode ser ajustado para próximo da neutralidade (pH 7,4), e tornou-se possível usar a “diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico” hidrolisando sob condições ácidas para melhorar a retenção de lipossomas no sangue.

(Lipossoma) [037]O lipossoma é um corpo vesicular fechado formado por uma membrana bicamada de lipídio usando lipídios, e tem uma fase aquosa (fase aquosa interna) dentro do espaço da vesícula fechada. A fase aquosa interna contém água e similares. O lipossoma geralmente está presente em um estado de ser disperso em uma solução aquosa (fase aquosa externa) fora da vesícula fechada. O lipossoma pode ser lamelar único (que também é conhecido como lamelar monocamada ou unilamelar, e é uma estrutura com uma única membrana de bicamada) ou lamelar multicamada (que também é conhecido como multilamelar e é uma estrutura similar a uma cebola tendo múltiplas membranas de bicamada onde camadas individuais são compartimentadas por camadas aquosas). Na presente invenção, um único lipossoma lamelar é preferencial a partir do ponto de vista de segurança e estabilidade em aplicações farmacêuticas.

[038]O lipossoma não está particularmente limitado em termos de forma, desde que seja um lipossoma capaz de encapsular um fármaco. O “encapsulamento” significa assumir uma forma na qual um fármaco está contido em uma fase aquosa interna e uma própria membrana em relação ao lipossoma. Por exemplo, o lipossoma pode ser uma forma em que um fármaco é encapsulado dentro de um espaço fechado formado por uma membrana, uma forma em que um fármaco é encapsulado na

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13/57 própria membrana, ou uma combinação dos mesmos.

[039]O tamanho médio de partícula do lipossoma é geralmente de 10 nm a 1000 nm, preferencialmente de 20 nm a 500 nm, mais preferencialmente de 30 a 300 nm, ainda mais preferencialmente de 30 nm a 200 nm, ainda mais preferencialmente de 150 nm ou menos, por exemplo, 30 nm a 150 nm, e particularmente preferencialmente 70 a 150 nm.

[040]O lipossoma tem preferencialmente uma forma esférica ou uma morfologia próxima a essa.

[041 ]Os componentes que compõem a bicamada lipídica do lipossoma são selecionados a partir de lipídios. Como os lipídios, podem ser usados aqueles que podem ser dissolvidos em um solvente misto de um solvente orgânico solúvel em água e um solvente orgânico à base de éster.

[042]O lipossoma na presente invenção contém uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, dihidroesfingomielina, e colesteróis como componentes da membrana lipossômica.

[043]O lipossoma é um corpo vesicular fechado formado por uma membrana de bicamada lipídica usando os lipídios como descrito acima e, em geral, os lipídios como um material de base para formar a membrana de bicamada lipídica incluem fosfolipídios tendo duas cadeias acila, por exemplo, ou fosfolipídios naturais ou sintéticos tais como fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidil glicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, esfingomielina e cardiolipina e produtos hidrogenados dos mesmos (por exemplo, fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC)).

[044]Na presente invenção, a dihidroesfingomielina, que é um fosfolipídio tendo duas cadeias acila, é usada como um lipídio para ser um material de base para formar uma membrana de bicamada lipídica.

[045]Ao usar a dihidroesfingomielina, a retenção de lipossomas no sangue

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14/57 pode ser melhorada.

[046]Ao usar a dihidroesfingomielina como um material de base da membrana lipossômica, é possível melhorar as propriedades de partição da membrana lipossômica para evitar o vazamento do fármaco encapsulado. Especula-se que isso ocorre porque as ligações amida da dihidroesfingomielina têm forte capacidade de ligação hidrogênio e podem formar uma membrana forte e altamente particionável, interagindo fortemente entre si. Além disso, as ligações amida da dihidroesfingomielina interagem fortemente com os grupos hidroxila do colesterol usados simultaneamente na presente invenção, onde uma membrana com altas propriedades de partição pode ser formada. Esta é uma função que não pode ser alcançada com lipídios comumente usados, tal como HSPC e lecitina tendo ligações éster.

[047]Além disso, uma vez que a dihidroesfingomielina completamente saturada tem um ponto de fusão mais alto e uma mobilidade menor da membrana formada em relação à esfingomielina com ligações amida, mas com ligações insaturadas na cadeia acila, especula-se que a dihidroesfingomielina pode formar uma membrana com propriedades de partição mais altas em relação à esfingomielina.

[048]A dihidroesfingomielina tem geralmente dois grupos alquila de cadeia longa na molécula e exemplos de dihidroesfingomielina tendo dois grupos alquila de cadeia longa incluem dihidroesfingomielina com dois grupos alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono, dihidroesfingomielina tendo grupos alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 18 átomos de carbono e dihidroesfingomielina tendo um grupo alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 20 a 24 átomos de carbono.

[049]Como a dihidroesfingomielina, é preferencial usar o seguinte composto tendo um grupo alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila

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15/57 de cadeia longa com 18 átomos de carbono, em termos de prevenção de vazamento de fármacos a partir de lipossomas. Isso ocorre porque o ponto de fusão se torna mais alto à medida que o número de átomos de carbono é maior e, portanto, uma membrana lipossômica com altas propriedades de partição pode ser formada.

[050]Como a dihidroesfingomielina, por exemplo, dihidroesfingomielina obtida pela redução da esfingomielina de ocorrência natural por um método geral pode ser usada, ou dihidroesfingomielina obtida por síntese pode ser usada.

[051]Geralmente, como a maioria das dihidroesfingomielinas derivadas de produtos naturais, como ovos de galinha, geralmente tem dois grupos alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono, é preferencial usar a dihidroesfingomielina obtida por síntese química, a partir do ponto de vista de que a dihidroesfingomielina tendo um grupo alquila de cadeia longa tendo 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 18 átomos de carbono podem ser obtidos com alta pureza.

[052]A porcentagem de dihidroesfingomielina nos componentes da membrana lipossômica (lipídios totais que constituem o lipossoma) é preferencialmente de 30 a 80 mol%, mais preferencialmente 40 a 70 mol%, e ainda mais preferencialmente 50 a 60 mol%.

[053]Exemplos do polímero hidrofílico na diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico incluem polietileno glicóis, poliglicerinas, polipropileno glicóis, polivinil álcoois, copolímeros alternados de estireno - anidrido de ácido maleico, copolímeros alternados de estireno - anidrido de ácido maleico, polivinil pirrolidonas e poliaminoácidos sintéticos. Os polímeros hidrofílicos mencionados acima podem ser utilizados sozinhos ou em combinação de dois ou mais destes.

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16/57 [054]Entre estes, a partir do ponto de vista da retenção no sangue de uma composição, são preferenciais os polietileno glicóis, poliglicerinas e polipropileno glicóis, e polietileno glicol (PEG), poliglicerina (PG), polipropileno glicol (PPG) e derivados dos mesmos são mais preferenciais.

[055]O polietileno glicol (PEG) e seus derivados são ainda mais preferenciais a partir do ponto de vista da versatilidade e retenção no sangue.

[056]Exemplos de derivados de polietileno glicol (PEG) incluem metóxi polietileno glicóis sem limitação particular.

[057]O peso molecular dos polietileno glicóis não está particularmente limitado, mas é de 500 a 10.000 daltons, preferencialmente 1.000 a 7.000 daltons, e mais preferencialmente 2.000 a 5.000 daltons.

[058]O número de átomos de carbono na porção acila da diacilfosfatidiletanolamina é preferencialmente de 16 ou mais, por exemplo, preferencialmente de 16 ou mais e de 30 ou menos, mais preferencialmente de 16 ou mais e de 24 ou menos e ainda mais preferencialmente 20.

[059]Exemplos de diacilfosfatidiletanolamina modificada com polietileno glicol incluem 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina polietileno glicóis tal como 1,2-distearoil3-fosfatidiletanolamina-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG5000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), e distearoil glicerol-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.).

[060]A porcentagem da diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico nos componentes da membrana lipossômica (o lipídios totais que constituem o lipossoma) é preferencialmente de 1 a 15 mol% e mais preferencialmente 2 a 10 mol%.

[061]Exemplos de colesteróis incluem colesterol que contém ciclopentahidrofenantreno como um esqueleto básico e no qual os átomos de carbono são parcial ou completamente hidrogenados e seus derivados. Por exemplo, o colesterol

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17/57 é preferencial. No caso em que o tamanho médio de partícula do lipossoma diminui para 100 nm ou menos, a curvatura da membrana lipídica se torna mais alta. A deformação da membrana disposta no lipossoma também se torna maior. É eficaz adicionar colesterol ou similar para preencher a deformação da membrana causada por lipídio (efeito estabilizador da membrana).

[062]Em conjunto com o lipossoma, espera-se que a adição de colesterol diminua a fluidez da membrana do lipossoma, por exemplo, preenchendo os espaços na membrana do lipossoma.

[063]A porcentagem de colesterol nos componentes da membrana lipossômica (lipídios que constituem o lipossoma) é preferencialmente de 20 mol% a 50 mol%, mais preferencialmente 30 mol% a 45 mol% e ainda mais preferencialmente 35 mol% a 43 mol%.

[064]Além dos componentes anteriores, um polímero hidrofílico ou similar para melhorar a retenção no sangue, ácido graxo, diacetil fosfato ou similar como um estabilizador da estrutura da membrana, ou α-tocoferol ou similar como um antioxidante pode ser adicionado ao lipossoma. Na presente invenção, é preferencial não usar um aditivo como um auxiliar de dispersão que não seja reconhecido para uso em injeção intravenosa em uso médico, por exemplo, um tensoativo.

(Fármaco) [065]A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção contém um fármaco.

[066]O tipo de fármaco não está particularmente limitado, mas os agentes anticâncer exemplificados abaixo podem ser usados. Exemplos específicos do agente anticâncer incluem:

agentes anticâncer à base de antraciclina, tal como doxorrubicina, daunorrubicina, e epirrubicina;

agentes anticâncer à base de cisplatina, tal como cisplatina e oxaliplatina;

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18/57 agentes anticâncer à base de taxano, tal como paclitaxel e docetaxel;

agentes anticâncer à base de alcalóides da vinca, tal como vincristina e vinblastina;

agentes anticâncer à base de bleomicina, tal como bleomicina;

agentes anticâncer à base de sirolimus, tal como sirolimus;

agentes anticâncer à base de camptotecina, tal orno topotecano (também conhecido como nogitecano), irinotecano, karenitecin (marca registrada) (também conhecida como BNP1350), exatecano, lurtotecano, gimatecano (também conhecido como ST1481), e verotecano (também conhecido como CKD602);

agentes anticâncer à base de alcalóides da vinca, tal como a vincristina;

antagonistas metabólicos, tal como metotrexato, fluorouracila, gencitabina, citarabina e pemetrexed; e fármacos molecularmente direcionados tal como imatinibe (Gleevec (marca registrada)), everolimus (Afinitol (R)), erlotinibe (Tarceva (marca registrada)), gefitinibe (Iressa (marca registrada)), sunitinibe (Sutent (marca registrada)), sorafenibe (Nexavar (marca registrada)), dasatinibe (Splicel (marca registrada)), tamivaroteno (Amnolake (marca registrada)), tretinoína (Besanoid (marca registrada)), bortezomibe (Velcade (marca registrada)), e lapatinibe (Tykerb (marca registrada)).

[067]Dentre os fármacos anteriores, o topotecano (também conhecido como nogitecano), doxorrubicina, irinotecano ou sunitinibe é preferencial e o topotecano é mais preferencial.

[068]O fármaco pode ser utilizado na forma de um sal.

[069]Exemplos do sal do fármaco incluem sais em um grupo básico, tal como grupo amino, um grupo hidroxila e um grupo ácido tal como o grupo carboxila, que são comumente conhecidos na técnica.

[070]Exemplos de sal em um grupo básico incluem sais com ácidos minerais tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido nítrico

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19/57 e ácido sulfúrico; sais com ácidos carboxílicos orgânicos tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido sucínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido aspártico, ácido tricloroacético e ácido trifluoroacético; e sais com ácidos sulfônicos tais como ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido mesitilenossulfônico e ácido naftalenossulfônico.

[071]Exemplos de sal em um grupo ácido incluem sais com metais alcalinos tais como sódio e potássio; sais com metais alcalinoterrosos tal como cálcio e magnésio; sais de amônio; e sais com bases orgânicas contendo nitrogênio tal como trimetilamina, trietilamina, tributilamina, piridina, Ν,Ν-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolino, dietilamina, diciclo-hexilamina, procaína, dibenzilamina, N-benzil-βfenetilamina, 1-efenaminae N,N’-dibenziletilenodiamina.

[072]O teor do fármaco na composição lipossômica não está particularmente limitado, mas é preferencialmente de 0,025 a 20 mg / ml e mais preferencialmente de 0,25 a 10 mg / ml em relação à composição lipossômica.

[073]A quantidade de fármaco encapsulado em lipossoma em relação ao lipídio formador de membrana lipossômica está em uma razão molar de preferência de 0,1 a 1,5 e mais preferencialmente de 0,2 a 0,3 a partir do ponto de vista da taxa de liberação do lipossoma, a pressão osmótica dentro do lipossoma, e a forma do lipossoma pelo fármaco precipitado.

[074]Em um caso em que a razão molar da quantidade de fármaco para o lipídio é muito baixa, a área da membrana lipossômica em relação à quantidade unitária de fármaco é aumentada, a taxa de liberação do fármaco a partir do lipossoma é aumentada, e, portanto, a função de melhorar a retenção no sangue é prejudicada. Por outro lado, em um caso em que a razão molar da quantidade de fármaco para lipídio é muito alta, a pressão osmótica dentro do lipossoma é aumentada com uma quantidade aumentada do fármaco dissolvida, resultando na destruição do lipossoma,

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20/57 ou em um caso em que o fármaco é precipitado dentro do lipossoma, o sólido precipitado aumenta de tamanho, resultando assim na deformação da forma do lipossoma.

(Sulfato de Amônio na Fase Aquosa Interna) [075]A fase aquosa interna do lipossoma na presente invenção contém sulfato de amônio. Na composição lipossômica que é a primeira modalidade da presente invenção, a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais e, de preferência, de 0,4 ou mais. A razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é mais preferencialmente de 0,4 ou mais e 1,8 ou menos e ainda mais preferencialmente de 0,6 ou mais e 1,8 ou menos. Ao definir a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira como descrito acima, é possível suprimir o vazamento do fármaco a partir do lipossoma no sangue. Em um caso em que a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é muito baixa, isso leva à formação incompleta de um sólido do fármaco devido ao sulfato, uma concentração aumentada do fármaco em estado dissolvido, que resulta em aumento da permeabilidade da membrana lipossômica no lipossoma, e vazamento fácil do fármaco a partir do lipossoma, de modo que o efeito de melhorar a retenção no sangue é prejudicado. Além disso, em um caso em que a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é muito alta, a pressão osmótica dentro do lipossoma será alta, resultando na destruição da estrutura do lipossoma, de modo que é provável que o fármaco vaze para fora do lipossoma e, portanto, o efeito de melhorar a retenção no sangue é prejudicado.

[076]Além disso, na presente invenção, a porcentagem de íons sulfato contidos na fase aquosa interna do lipossoma para íons sulfato na composição lipossômica inteira (razão de íons sulfato na fase aquosa interna) é preferencialmente de ao menos 80% e mais preferencialmente 90% ou mais, e simultaneamente a

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21/57 porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira (razão de fármaco na fase aquosa interna) é preferencialmente de ao menos 80% e mais preferencialmente de 90% ou mais.

[077]A concentração do fármaco no lipossoma pode ser medida, por exemplo, por cromatografia líquida / detecção de absorbância no ultravioleta visível. Além disso, a concentração de íons sulfato na fase aquosa interna do lipossoma pode ser medida, por exemplo, por cromatografia iônica.

(pH da Fase Aquosa Externa) [078]A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção pode incluir um lipossoma que encapsula um fármaco, e um solvente aquoso (fase aquosa externa) no qual o lipossoma é disperso. A fase aquosa externa tem preferencialmente um pH neutro e especificamente um pH de cerca de 5,5 a 8,5.

[079]Em um caso em que o vazamento de fármaco é extremamente suprimido, o vazamento de fármaco na área afetada, particularmente no sítio do tumor, também pode ser suprimido e, portanto, a eficácia desejada pode não ser obtida.

[080]A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção tem um mecanismo surpreendente de suprimir o vazamento de fármaco no sangue, fornecer uma quantidade suficiente de fármaco ao sítio do tumor, e liberar rapidamente o fármaco no sítio do tumor.

[081 ]O sítio do tumor tem a propriedade de que sua concentração de amônio é maior do que outros órgãos tal como o sangue (artigo citado: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841 a 1850). A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção exibe liberação de fármaco muito aumentada em um ambiente no qual a degradação de glutamina é aprimorada e, portanto, uma concentração de amônio é alta (5 mmol / L), como um tumor.

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22/57 [082]A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção tem uma taxa de liberação de fármaco de 20% / 24 horas ou menos a 37° C a partir de lipossomas no plasma, tendo uma concentração de amônio de 1 mmol / L ou menos e uma taxa de liberação de fármaco de 60 % ou mais a 37° C a partir de lipossomas no plasma tendo uma concentração de amônio de 4 a 6 mmol / L; e mais preferencialmente uma taxa de liberação de fármaco de 15% / 24 horas ou menos a 37° C a partir de lipossomas no plasma com uma concentração de amônio de 1 mmol / L ou menos e uma taxa de liberação de fármaco de 70% ou mais a 37° C a partir de lipossomas no plasma com uma concentração de amônio de 4 a 6 mmol / L.

(Método para Produzir a Composição Lipossômica) [083]O método para produzir a composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção não está particularmente limitado. Por exemplo, a composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção pode ser produzida pelas seguintes etapas:

(a) preparação de uma fase oleosa;

(b) preparação de uma fase aquosa;

(c) formação de partículas de lipossomas por emulsificação;

(d) regulação do tamanho de partícula por extrusora;

(e) substituição do líquido da fase aquosa externa do lipossoma por diálise;

(f) encapsulamento do fármaco em partículas de lipossomas por carregamento remoto; e (g) remoção do fármaco na fase aquosa externa por diálise.

A regulação do tamanho de partícula pela extrusora (d) pode ou não ser realizada.

< (a) Preparação da Fase Oleosa >

(a) Na preparação de uma fase oleosa, componentes individuais (diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, dihidroesfingomielina

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23/57 e colesteróis) que constituem o lipossoma e um solvente orgânico são misturados, e a mistura é aquecida para dissolver os componentes mencionados acima, através dos quais uma fase oleosa pode ser produzida.

[084]Embora o solvente orgânico usado na fase oleosa não seja particularmente limitado, por exemplo, um solvente orgânico solúvel em água que é opcionalmente misturado com água pode ser usado.

[085]Exemplos de solvente orgânico solúvel em água incluem álcoois tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol e t-butanol; glicóis tal como glicerina, etileno glicol e propileno glicol; e polialquileno glicóis tal como polietileno glicol. Dentre estes, os álcoois são preferenciais. O álcool é preferencialmente ao menos um selecionado a partir de etanol, metanol, 2-propanol ou t-butanol, mais preferencialmente ao menos um selecionado a partir de etanol, 2propanol ou t-butanol, e ainda mais preferencialmente etanol.

[086]A concentração de cada componente que constitui o lipossoma não está particularmente limitada e pode ser ajustada adequadamente.

< (b) Preparação da Fase Aquosa >

[087]Água (água destilada, água para injeção ou similar), solução salina fisiológica, várias soluções tampão ou soluções aquosas de açúcares (sacarose ou similares), ou suas misturas (solvente aquoso) podem ser usadas como a fase aquosa. Na presente invenção, é preferencial usar uma solução aquosa de sulfato de amônio como a fase aquosa, em um caso em que um fármaco é encapsulado em partículas de lipossomas por carregamento remoto que será descrito posteriormente.

[088]A solução tampão não está limitada a soluções tampão orgânicas e inorgânicas, e uma solução tampão com uma ação tampão na vizinhança de um pH próximo ao do fluido corporal é adequadamente utilizada e exemplos da mesma incluem uma solução tampão de fosfato, um solução tampão Tris, solução tampão de citrato, solução tampão de acetato e solução tampão de Good. A fase aquosa interna

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24/57 do lipossoma pode ser uma solução aquosa na qual os lipossomas são dispersos no caso de produzir lipossomas, ou pode ser água, solução salina fisiológica, uma solução aquosa de várias soluções tampão ou açúcares, ou uma mistura dos mesmos que é recentemente adicionada. A água usada como uma fase aquosa externa ou uma fase aquosa interna é preferencialmente livre de impurezas (poeira, produtos químicos ou similares).

[089]A solução salina fisiológica refere-se a uma solução de sal inorgânico ajustada para ser isotônica com o fluido corporal humano, e pode ainda ter uma função de tamponamento. Exemplos da solução salina fisiológica incluem solução salina contendo 0,9% % peso / volume (% em massa / volume) de cloreto de sódio, PBS, solução salina fisiológica tamponada com Tris.

[090]Na presente invenção, a fase aquosa inclui tanto uma fase aquosa externa quanto uma fase aquosa interna.

[091 ]A fase aquosa externa na presente invenção significa uma solução aquosa na qual os lipossomas são dispersos. Por exemplo, no caso de uma injeção, uma solução que ocupa a parte externa do lipossoma de um líquido de dispersão lipossômicas empacotados e armazenados em um frasco ou seringa pré-preenchida se torna uma fase aquosa externa. Também, similarmente para que um líquido seja disperso no momento do uso em um caso de ser administrado por meio de uma solução de dispersão anexada ou de outras soluções, uma solução ocupando o exterior do lipossoma de um líquido de dispersão lipossômicas se torna uma fase aquosa externa.

[092]A fase aquosa interna na presente invenção refere-se a uma fase aquosa em vesículas fechadas separadas por membranas de bicamada lipídica dos lipossomas.

< (c) Formação de Partículas de Lipossomas por Emulsificação >

[093]Na etapa de emulsificação, uma fase oleosa e uma fase aquosa são

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25/57 misturadas para preparar uma solução aquosa contendo lipídios, que pode ser então emulsificada com agitação. Uma fase oleosa em que o lipídio foi dissolvido em um solvente orgânico e uma fase aquosa são misturadas, agitadas e emulsificadas para preparar uma emulsão, em que a fase oleosa e a fase aquosa são emulsificadas em um tipo O / W (tipo óleo em água). Após a misturação, os lipossomas são formados removendo uma parte ou todo o solvente orgânico derivado da fase oleosa por evaporação. Alternativamente, uma parte ou todo o solvente orgânico na fase oleosa é evaporada no decorrer da emulsificação por agitação para formar lipossomas.

[094]Como um método de agitação, ondas ultrassônicas ou força de cisalhamento mecânica são usadas para miniaturização de partículas. Além disso, o processamento por extrusora ou processamento por microfluidizador, que permite passar através de um filtro com um certo tamanho de poro, pode ser realizado para uniformizar o tamanho das partículas. O uso de uma extrusora ou similar pode resultar na decomposição de lipossomas multivesiculares formados secundariamente em lipossomas univesiculares.

[095]A etapa de emulsificar não está limitada desde que seja uma etapa de emulsificação, mas é preferencialmente uma etapa de aplicação de um alto cisalhamento e executar microparticulação com uma etapa de emulsificação incluindo um solvente orgânico. A alta taxa de cisalhamento é definida em termos de velocidade periférica de uma lâmina de agitação de uma máquina de emulsificação e é preferencialmente de 5 m / s a 32 m / s e particularmente preferencialmente 20 m / s a 30 m / s. Se necessário, a evaporação (dessolvatação) do solvente orgânico utilizado na etapa de emulsificação pode ser realizada para formar lipossomas.

[096]A temperatura do líquido na etapa de emulsificação em um caso de produção de lipossomas pode ser ajustada adequadamente, mas a temperatura do líquido no momento da mistura de uma fase oleosa e de uma fase aquosa é preferencialmente maior ou igual a uma temperatura de transição de fase do lipídio a

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26/57 ser usado. Por exemplo, em um caso em que um lipídio com uma temperatura de transição de fase de 35° C a 40° C é usado, a temperatura do líquido é preferencialmente ajustada de 35° C a 70° C.

[097]Na etapa de emulsificação, o solvente orgânico e a água podem ser evaporados a partir da solução aquosa contendo lipossomas. Quanto à evaporação mencionada neste documento, uma parte ou todo o solvente orgânico derivado da fase oleosa e a água derivada da fase aquosa podem ser removidos à força como uma etapa de evaporação, ou uma parte ou todo o solvente orgânico derivado da fase oleosa e a água derivada da fase aquosa podem evaporar-se naturalmente durante o decorrer da agitação - emulsificação.

[098]Q método de evaporação não está particularmente limitado. Por exemplo, ao menos uma de uma etapa de aquecimento para evaporar um solvente orgânico e água, uma etapa de continuação em repouso ou agitação lenta após a emulsificação, ou uma etapa de realizar desgaseificação a vácuo pode ser realizada.

< (d) Regulação do Tamanho de Partícula por Extrusora >

[099]Qs lipossomas obtidos podem ter o tamanho de partícula uniforme usando diálise, filtração, processamento de extrusão, ou similares.

[0100]Q processamento de extrusão significa uma etapa de passar os lipossomas através de um filtro tendo um poro fino para aplicar uma força de cisalhamento física, realizando assim a microparticulação dos lipossomas. No caso em que os lipossomas são passados através do filtro, uma microparticulação rápida pode ser alcançada incubando o líquido de dispersão lipossômica e o filtro a uma temperatura maior ou igual à temperatura de transição de fase da membrana que constitui o lipossoma.

[0101]Além disso, a regulação do tamanho de partícula por uma extrusora pode ou não ser realizada.

< (e) Substituição do Líquido da Fase Aquosa Externa do Lipossoma por

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Diálise >

[0102]Na presente invenção, em um caso em que o fármaco é encapsulado nas partículas de lipossoma por carregamento remoto, o líquido da fase aquosa externa do lipossoma pode ser substituído por diálise. Uma solução aquosa de 0,05% a 5% em massa de NaCI pode ser usada como um líquido de diálise que não está particularmente limitado. A diálise do líquido lipossômico usando o líquido de diálise mencionado acima pode fornecer lipossomas nos quais o sulfato de amônio presente na fase aquosa externa é removido e a fase aquosa externa é substituída pelo líquido de diálise.

< (f) Encapsulamento do Fármaco em Partículas de Lipossomas pelo Método de Carregamento Remoto >

[0103]Na presente invenção, é preferencial encapsular um fármaco em partículas de lipossomas por um método de carregamento remoto.

[0104]Na presente invenção, o método de carregamento remoto refere-se a um método de produzir um lipossoma vazio no qual um fármaco não é encapsulado e, em seguida, adicionar o fármaco ao líquido externo do lipossoma para introduzir o fármaco no lipossoma. O método de carregamento remoto não está particularmente limitado, mas é preferencial um método que utiliza um sal de amônio e um método que utiliza sulfato de amônio.

[0105]No método de carregamento remoto, o fármaco adicionado ao líquido externo é transferido ativamente para os lipossomas e incorporado nos lipossomas. Um gradiente de solubilidade, um gradiente de íons, um gradiente de pH ou similar é usado como força de acionamento. Por exemplo, existe um método para introduzir um fármaco nos lipossomas usando um gradiente de íons formado através de uma membrana lipossômica. Por exemplo, existe uma técnica de adição de um fármaco aos lipossomas que são preformados pelo método de carregamento remoto usando um gradiente de concentração de Na⁺ / K⁺.

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28/57 [0106]Dentre os gradientes de ions, geralmente é usado um gradiente de concentração de prótons. Por exemplo, há um aspecto em que o pH interno (fase aquosa interna) da membrana lipossômica tem um gradiente de pH menor do que o pH externo (fase aquosa externa). O gradiente de pH pode ser formado especificamente por um gradiente de concentração de íon amônio ou similar.

< (g) Remoção do Fármaco da Fase Aquosa Externa por Diálise >

[0107]0 líquido lipossômico encapsulado ao fármaco pode ser submetido à diálise para remover o fármaco não contido nos lipossomas. Por exemplo, ao submeter o líquido lipossômico encapsulado ao fármaco à diálise, usando uma concentração predeterminada de tampão de sacarose / histidina como um líquido de diálise, o fármaco presente na fase aquosa externa pode ser removido para obter uma composição lipossômica na qual a fase aquosa externa é substituída pelo líquido de diálise.

< Filtração Estéril >

[0108]A composição lipossômica obtida acima é de preferência submetida à filtração estéril. Em relação ao método de filtração, é possível remover materiais indesejados de uma solução aquosa contendo lipossomas usando uma membrana de fibra oca, uma membrana de osmose reversa, um filtro de membrana ou similar. Na presente invenção, é preferencial filtrar a composição lipossômica através de um filtro tendo um tamanho de poro esterilizável (preferencialmente um filtro de esterilização por filtração de 0,2 pm).

[0109]Para evitar um efeito de deformação dos lipossomas no tamanho médio de partículas, a etapa de filtração estéril e a etapa de enchimento asséptico descrita abaixo são preferencialmente realizadas a uma temperatura menor ou igual à temperatura de transição de fase do lipídio que constitui o lipossoma. Por exemplo, em um caso em que a temperatura de transição de fase do lipídio está em torno de 50° C, a etapa de filtração estéril e a etapa de enchimento asséptico descrita abaixo

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29/57 são realizadas a uma temperatura preferencialmente de cerca de 0^o C a 40° C e mais especificamente cerca de 5^Q C a 30^Q C.

< Enchimento Asséptico >

[0110]A composição lipossômica obtida após filtração estéril é preferencialmente preenchida assepticamente para aplicações médicas. Métodos conhecidos podem ser aplicados para enchimento asséptico. Uma composição lipossômica adequada para aplicações médicas pode ser preparada enchendo assepticamente a composição lipossômica em um recipiente.

(Composição Farmacêutica) [0111]Em conjunto com a via de administração, a composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção também pode conter ao menos um dentre um agente de tonicidade, um estabilizador, um antioxidante ou um agente ajustador de pH que é farmaceuticamente aceitável. Ou seja, a composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção pode ser fornecida como uma composição farmacêutica.

[0112]0 agente de tonicidade não está particularmente limitado e exemplos do mesmo incluem sais inorgânicos tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, hidrogenofosfato de sódio, dihidrogenofosfato de sódio e dihidrogenofosfato de potássio; poliois tal como glicerol, manitol e sorbitol; e açúcares tal como glicose, frutose, lactose e sacarose.

[0113]O estabilizador não está particularmente limitado e exemplos do mesmo incluem açúcares tal como glicerol, manitol, sorbitol, lactose e sacarose.

[0114]O antioxidante não está particularmente limitado e exemplos do mesmo incluem ácido ascórbico, ácido úrico, homólogos de tocoferol (por exemplo, vitamina E, quatro isômeros de tocoferol α, β, γ e δ), cisteína e ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA). Estabilizadores e antioxidantes podem ser utilizados respectivamente isoladamente ou em combinação de dois ou mais dos mesmos.

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30/57 [0115]Exemplos do agente ajustador de pH incluem hidróxido de sódio, ácido cítrico, ácido acético, trietanolamina, hidrogenofosfato de sódio, dihidrogenofosfato de sódio e dihidrogenofosfato de potássio.

[0116]A composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção pode conter um solvente orgânico, colágeno, polivinil álcool, polivinil pirrolidona, um polímero de carboxivinil, carboximetil celulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextrano solúvel em água, carboximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma-arábica, caseína, gelatina, ágar, diglicerol, propileno glicol, polietileno glicol, vaselina, parafina, estearil álcool, ácido esteárico, albumina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactose, solução salina tamponada com fosfato (PBS), cloreto de sódio, açúcares, um polímero biodegradável, um meio isento de soro, cada um dos quais é farmaceuticamente aceitável, ou um aditivo que é aceitável como um aditivo farmacêutico.

[0117]O recipiente no qual a composição lipossômica de acordo com a modalidade da presente invenção é enchida não está particularmente limitado e é de preferência feito de um material com baixa permeabilidade ao oxigênio. Exemplos do recipiente incluem um recipiente plástico, um recipiente de vidro, e um saco feito de um filme laminado tendo uma folha de alumínio, um filme depositado em alumínio, um filme depositado em óxido de alumínio, um filme depositado em óxido de silício, um polivinil álcool, um copolímero de etileno - vinil álcool, um tereftalato de polietileno, um naftalato de polietileno, um cloreto de polivinilideno, ou simlares como uma camada de barreira ao gás. Se necessário, a luz pode ser protegida adotando-se um saco ou similar usando um vidro colorido, uma folha de alumínio, um filme depositado em alumínio ou similar.

[0118]No recipiente em que a composição lipossômica é enchida, a fim de evitar a oxidação pelo oxigênio presente no espaço do recipiente, é preferencial substituir os gases no espaço do recipiente e a solução de fármaco por gases inertes,

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31/57 tal como o nitrogênio. Por exemplo, uma solução de injeção é borbulhada com nitrogênio, onde o enchimento da solução de injeção em um recipiente pode ser realizado sob uma atmosfera de nitrogênio.

[0119]A via de administração da composição farmacêutica de acordo com a modalidade da presente invenção é preferencialmente a administração parentérica. Exemplos da administração parentérica incluem injeção intravenosa, tal como gotejamento intravenoso, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, injeção intraocular e injeção intratecal. O método de administração da composição farmacêutica pode ser, por exemplo, administração por seringa ou gotejamento intravenoso.

[0120]A dosagem e a frequência de administração da composição farmacêutica de acordo com a modalidade da presente invenção podem ser ajustadas adequadamente, dependendo do tipo de fármaco, da condição do paciente e similares. A dose da composição farmacêutica pode ser geralmente definida na faixa de 0,01 mg/kg / dia a 100 mg / kg / dia em termos da massa de fármaco que é um ingrediente ativo. A dose da composição farmacêutica pode ser ajustada na faixa de 2 mg a 10 mg por dose em termos da massa de fármaco que é um ingrediente ativo, mas não está limitada a essas dosagens.

[0121 ]A composição farmacêutica de acordo com a modalidade da presente invenção pode ser preferencialmente usada como um agente anticâncer.

[0122]O tipo de câncer ao qual a composição farmacêutica de acordo com a modalidade da presente invenção é aplicada não está particularmente limitado e seus exemplos incluem câncer de pulmão (especialmente câncer de pulmão de pequenas células), câncer de ovário, tumor sólido pediátrico, câncer de colo do útero, câncer de mama, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer gástrico (adenocarcinoma gástrico), câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pâncreas, carcinoma cervical de células escamosas, câncer de esôfago, câncer de bexiga, melanoma,

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32/57 câncer de cólon, câncer de células renais, linfoma não Hodgkin, câncer urotelial, mieloma múltiplo, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica aguda, leucemia de células T adultas, câncer metastático de medula óssea, sarcoma, tumor de tecidos moles, leucemia mielomonocítica crônica, linfoma de Hodgkin e linfoma de células T cutâneas.

Exemplos [0123]A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, a presente invenção não está limitada aos mesmos.

[0124]SM representa esfingomielina (COATSOME NM-10, fabricado por NOF Corporation).

[0125]O DHSM derivado de ovo de galinha representa dihidroesfingomielina obtida por hidrogenação de SM derivada de ovo de galinha (produto sintético obtido por hidrogenação de COATSOME NM-10 (fabricado por NOF Corporation)). Esto DHSM derivado de ovo de galinha é uma mistura que contém DHSM com duas cadeias alquila com 16 átomos de carbono, o que representa 70% a 80% de um total do DHSM derivado de ovo de galinha e DHSM com diferentes comprimentos de cadeia alquila, que é o restante.

[0126]O DHSM totalmente sintético representa dihidroesfingomielina produzida por síntese química, de modo a conter 98% ou mais do seguinte composto tendo um grupo alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 18 átomos de carbono.

[0127]SUNBRIGHT DSPE-020CN (em seguida chamado de DSPE-PEG, fabricado pora NOF Corporation) foi usado como fosfolípido de PEG (indicado como PEG na tabela).

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33/57 [0128]O colesterol HP (fabricado por Nippon Fine Chemical Co., Ltd.) fol usado como colesterol (indicado como Col na tabela).

< Exemplos Comparativos 1 a 10 >

a) Preparação da Fase Oleosa [0129]Para o Exemplo Comparativo 1,11,52 g de SM, 4,32 g de fosfolípido de PEG e 4,32 g de colesterol foram pesados, respectivamente. Para os Exemplos Comparativos 2 a 10, as quantidades de DHSM derivado de ovo de galinha, fosfolipídio de PEG e colesterol foram alteradas para as relações descritas na Tabela 1. O lipídio foi misturado com 381 mL de etanol e dissolvido a 65° C para preparar uma fase oleosa.

(b1) Preparação da Fase Aquosa 1

25,2 g de sulfato de amônio foram dissolvidos em 1118,5 g de água para preparar a fase aquosa 1.

(b2) Preparação da Fase Aquosa 2

5,04 g de sulfato de amônio foram dissolvidos em 223,7 g de água para preparar a fase aquosa 2.

(c) Formação de Partículas de Lipossomas por Emulsificação [0130]A fase aquosa 1 preparada em (b1) foi aquecida a 65° C, toda a fase oleosa preparada em (a) foi adicionada a essa e, em seguida, essas fases foram misturadas com um dispersor de emulsificação de precisão a uma velocidade periférica de 26 m / s por 60 minutos. Subsequentemente, a fase aquosa 2 em temperatura ambiente foi adicionada a essa, seguida pela continuação da agitação a uma velocidade periférica de 0,1 m / s enquanto aquecida a 65° C para evaporar o solvente orgânico e a água. No caso em que o líquido foi concentrado para 600 mL, o aquecimento e a agitação foram interrompidos e, portanto, a evaporação foi encerrada.

(e) Substituição do Líquido da Fase Aquosa Externa do Lipossoma por Diálise

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34/57 [0131 ]Uma solução aquosa de 3,15% em massa de NaCI foi usada como urn líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (c) foi submetido à filtração de fluxo cruzado em temperatura ambiente para remover o sulfato de amônio presente na fase aquosa externa para obter lipossomas nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

(f) Encapsulamento do Topotecano em Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto [0132]Foi adicionada água para injeção ao cloridrato de topotecano (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o topotecano. Os lipossomas foram adicionados à solução de topotecano resultante na relação em volume de 1/1, seguida de aquecimento a 60° C por 60 minutos.

(g) Remoção do Topotecano da Fase Aquosa Externa por Diálise [0133]Um tampão de sacarose / histidina consistindo de 9,4% em massa de sacarose e 10 mmol / L de histidina foi preparado como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (f) foi submetido à filtração de fluxo cruzado em temperatura ambiente para remover o topotecano presente na fase aquosa externa para obter lipossomas contendo topotecano nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

Exemplos Comparativos 11 e 12

a) Preparação da Fase Oleosa [0134]Para o Exemplo Comparativo 11,0,517 g de DHSM derivado de ovo de galinha e 0,233 g de colesterol foram respectivamente pesados. Para o Exemplo Comparativo 12, as quantidades de SM e colesterol foram alteradas para as relações descritas na Tabela 1. De modo a marcar lipossomas com Dil (perclorato de 1,1’dioctadecil-3,3,3’,3’-tetrametilindocarbocianina), uma quantidade de Dil, que era de

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0,2 mol% em relação aos lipídios totais, foi pesada e dissolvida em etanol. Etanol foi adicionado à solução de Dil etanol para produzir um volume total de 1,5 mL. O lípido pesado e este solvente orgânico foram misturados e aquecidos a 65° C para dissolver o lípido, preparando assim uma fase oleosa.

(b) Preparação da Fase Aquosa

0,9 g de sulfato de amônio e 2,16 g de sacarose foram dissolvidos em 13,5 g de água para preparar uma fase aquosa.

(c) Formação de Partículas de Lipossomas Misturando a Fase Oleosa e a Fase Aquosa [0135]A fase aquosa preparada em (b) foi aquecida a 65° C e agitada com um agitador magnético (3000 rpm). A fase oleosa inteira preparada em (a) foi aquecida a 65° C com uma placa quente, e a fase oleosa inteira foi sugada com uma seringa e aquecida por 5 minutos com uma placa quente. A fase oleosa foi adicionada gota a gota ao longo de 30 segundos à fase aquosa aquecida.

(d) Regulação de Tamanho de Partícula por Extrusora [0136]O líquido obtido em (c) foi submetido à regulação de tamanho de partícula passando-o sequencialmente através de um filtro usando uma extrusora (Mini Extrusora, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) sob aquecimento a 70° C.

(e) Substituição do Líquido da Fase Aquosa Externa do Lipossoma por Diálise [0137]Uma solução aquosa de 0,09% em massa de NaCI foi usada como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (c) ou (d) foi submetido à diálise em temperatura ambiente para remover o sulfato de amônio presente na fase aquosa externa para obter lipossomas nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

(f) Encapsulamento de Topotecano em Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto [0138]Água para injeção foi adicionada ao cloridrato de topotecano (fabricado

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36/57 por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o topotecano. Os lipossomas foram adicionados à solução de topotecano resultante a uma relação em volume de 1/1, seguida de aquecimento a 60° C por 120 minutos.

(g) Remoção do Topotecano da Fase Aquosa Externa por Diálise [0139]Um tampão de sacarose / histidina consistindo de 9,4% em massa de sacarose e 10 mmol / L de histidina foi preparado como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (f) foi submetido à diálise em temperatura ambiente para remover o topotecano presente na fase aquosa externa para obter lipossomas contendo topotecano nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

< Exemplos 1 a 8 >

a) Preparação da Fase Oleosa [0140]Para o Exemplo 1, 11,52 g de DHSM derivado de ovo de galinha, 4,32 g de fosfolípido de PEG (SUNBRIGHT DSPE-020CN, fabricado por NOF Corporation, em seguida chamado de DSPE-PEG), e 4,32 g de colesterol foram respectivamente pesados. Nos Exemplos 2 a 8, as quantidades de DHSM, DSPE-PEG e colesterol foram alteradas para as relações descritas na Tabela 2. O lipídio foi misturado com 381 mL de etanol e dissolvido a 65° C para preparar uma fase oleosa.

(b1) Preparação da Fase Aquosa 1

25,2 g de sulfato de amônio foram dissolvidos em 1118,5 g de água para preparar a fase aquosa 1.

(b2) Preparação da Fase Aquosa 2

5,04 g de sulfato de amônio foram dissolvidos em 223,7 g de água para preparar a fase aquosa 2.

(c) Formação de Partículas de Lipossomas por Emulsificação

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37/57 [0141 ]A fase aquosa 1 preparada em (b1) foi aquecida a 65° C, toda a fase oleosa preparada em (a) foi adicionada e, em seguida, essas fases foram misturadas com um dispersor de emulsificação de precisão a uma velocidade periférica de 26 m / s por 60 minutos. Subsequentemente, a fase aquosa 2 foi adicionada em temperatura ambiente, seguida de agitação contínua a uma velocidade periférica de 0,1 m / s enquanto aquecida a 65° C para evaporar o solvente orgânico e a água. O aquecimento e a agitação foram interrompidos em um caso em que o líquido foi concentrado para 600 mL e, portanto, a evaporação foi interrompida.

(e) Substituição do Líquido da Fase Aquosa Externa do Lipossoma por Diálise [0142]Uma solução aquosa de 3,15% em massa de NaCI foi usada como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (c) foi submetido à filtração de fluxo cruzado em temperatura ambiente para remover o sulfato de amônio presente na fase aquosa externa para obter lipossomas nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

(f) Encapsulamento de Topotecano em Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto [0143]Água para injeção foi adicionada ao cloridrato de topotecano (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o topotecano. Os lipossomas foram adicionados à solução de topotecano resultante na relação em volume de 1/1, seguida de aquecimento a 60° C por 60 minutos.

(g) Remoção de Topotecano da Fase Aquosa Externa por Diálise [0144]Um tampão de sacarose / histidina consistindo de 9,4% em massa de sacarose e 10 mmol / L de histidina foi preparado como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (f) foi submetido à filtração de fluxo cruzado em temperatura ambiente para remover o topotecano presente na fase

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38/57 aquosa externa para obter lipossomas contendo topotecano nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

< Exemplos 9 e 10 >

a) Preparação da Fase Oleosa [0145]No Exemplo 9, 0,412 g de DHSM derivado de ovo de galinha, 0,153 g de DSPE-PEG e 0,153 g de colesterol foram respectivamente pesados. No Exemplo 10, as quantidades de DHSM derivado de ovo de galinha, DSPE-PEG e colesterol foram alteradas para as relações descritas na Tabela 2. Para marcar os lipossomas com Dil, uma quantidade de Dil, que foi de 0,2 mol% em relação a lipídios totais, foi pesada e dissolvida em etanol. Foi adicionado etanol à solução Dil etanol resultante para produzir um volume total de 11,25 mL, e 3,75 mL de etil acetato foram adicionados a ela. O lípido pesado e este solvente orgânico foram misturados e aquecidos a 60° C para dissolver o lípido, preparando assim uma fase oleosa.

(b) Preparação da Fase Aquosa

0,9 g de sulfato de amônio foram dissolvidos em 40 g de água para preparar uma fase aquosa.

(c) Formação de Partículas de Lipossomas por Emulsificação [0146]A fase aquosa preparada em (b) foi aquecida a 70° C, toda a fase oleosa preparada em (a) foi adicionada a ela (relação em volume: fase aquosa / fase oleosa = 8/3) e, em seguida, essas fases foram misturadas usando uma máquina de emulsificação (homogeneizador Excel Auto ED-3, fabricado por Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) a 3000 rpm (rotação por minuto: 1 / 60s^-1) por 30 minutos. Isto foi seguido continuando a agitação a 300 rpm enquanto aquecendo a 65° C para evaporar o solvente orgânico e a água. No caso em que o líquido foi concentrado até 15 g, o aquecimento e a agitação foram interrompidos e, portanto, a evaporação foi terminada.

(d) Regulação de Tamanho de Partícula por Extrusora

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39/57 [0147]O líquido obtido em (c) foi submetido à regulação de tamanho de partícula passando-o sequencialmente através de um filtro usando uma extrusora (Mini Extrusora, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) sob aquecimento a 70° C.

(e) Substituição do Líquido da Fase Aquosa Externa do Lipossoma por Diálise [0148]Uma solução aquosa de 0,09% em massa de NaCI foi usada como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (c) ou (d) foi submetido à diálise em temperatura ambiente para remover o sulfato de amônio presente na fase aquosa externa para obter lipossomas nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

(f) Encapsulamento de Topotecano em Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto [0149]Água para injeção foi adicionada ao cloridrato de topotecano (fabricado por Biocompounds Pharmaceutical Inc.) a 5 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o topotecano. Os lipossomas foram adicionados à solução de topotecano resultante a uma relação em volume de 1/1, seguida de aquecimento a 60° C por 120 minutos.

(g) Remoção de Topotecano da Fase Aquosa Externa por Diálise [0150]Um tampão de sacarose / histidina consistindo de 9,4% em massa de sacarose e 10 mmol / L de histidina foi preparado como um líquido de diálise. Utilizando este líquido de diálise, o líquido obtido em (f) foi submetido à diálise em temperatura ambiente para remover o topotecano presente na fase aquosa externa para obter lipossomas contendo topotecano nos quais a fase aquosa externa foi substituída pelo líquido de diálise.

[Medição e Avaliação das Propriedades Físicas] < Tamanho Médio de Partícula >

[0151]Na presente invenção, o tamanho médio de partícula refere-se a um

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40/57 tamanho médio cumulativo de partícula medido por um método dinâmico de espalhamento de luz. O tamanho médio de partícula em cada um dos Exemplos e Exemplos Comparativos descritos na tabela é um tamanho médio cumulativo de partículas medido por um método dinâmico de espalhamento de luz usando um analisador de tamanho de partículas concentrado do sistema FPAR-1000AS (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.) com um amostrador automático.

[0152]Os resultados da medição são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

< Medição da Concentração de Topotecano >

[0153]A amostra foi medida com um aparelho de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) Nexera-i LC-2040C (fabricado por Shimadzu Corporation) para quantificar a concentração de topotecano. Os resultados são mostrados nas Tabelas 1 e 2. O método de medição específico é como segue.

[0154]Nos lipossomas das Tabelas 1 e 2, a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira foi de ao menos 95%, exceto no Exemplo Comparativo 10, no qual a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira foi de 59%.

[0155]Medição da Quantidade de Topotecano na Formulação Lipossômica [0156]O líquido lipossômico preparado foi dissolvido em metanol e filtrado para obter uma solução de amostra. O cloridrato de topotecano foi diluído para preparar uma solução padrão de curva de calibração. Utilizando a solução de amostra e a solução padrão de curva de calibração assim preparada, a quantidade de topotecano na formulação lipossômica foi medida por cromatografia líquida / detecção por absorbância no ultravioleta visível.

[0157]A concentração de topotecano na fase aquosa interna foi calculada subtraindo-se a concentração de topotecano na fase aquosa externa da concentração de topotecano na fase aquosa inteira. A concentração de topotecano em cada fase

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41/57 aquosa foi medida como segue.

(Concentração de Topotecano na Fase Aquosa Inteira) pL do líquido de dispersão lipossômica foram medidos e foram adicionados 950 pL de metanol, seguidos de agitação com vórtice por 1 minuto. Foram medidos 100 pL do líquido e foram adicionados a eles 900 pL de água Milli-Q, seguido de agitação com vórtice por 1 minuto para preparar uma amostra de análise por HPLC.

(Concentração de Topotecano na Fase Aquosa Externa) pL do líquido de dispersão lipossômica foram medidos e depois diluídos adicionando-se 450 pl de uma solução aquosa de 9,4% em peso de sacarose /10 mM de histidina. 200 pL de PBS foram adicionados a 100 μΙ_ do líquido diluído que foi então misturado por inversão. O líquido de dispersão foi ultracentrifugado (200.000 g, 20° C, 60 minutos) e o sobrenadante foi usado como uma amostra de análise por HPLC. A ultracentrifugação foi realizada usando Hitachi himac CP80WX.

a) Preparação da Solução Padrão de Curva de Calibração [0158]Cerca de 20 mg de cloridrato de topotecano foram pesados e dissolvidos em 20 mL de 10% em massa de solução aquosa de metanol. Água MilliQ foi adicionada a este líquido para preparar uma solução com uma concentração de cloridrato de topotecano de 0,1,1,0, 5,0,10,0, 20,0, 50,0 ou 100,0 ppm, que foi usada como solução padrão de curva de calibração.

b) Preparação da Solução de Amostra (1) Cerca de 50 pL de uma amostra (solução de formulação lipossômica) foram pesados por MICROMAN (marca registrada) e cerca de 950 pL de metanol pesados por MICROMAN foram adicionados a eles. Depois de ter sido agitada por cerca de 1 minuto, a solução foi confirmada visualmente como clara.

(2) 100 pL da solução acima (1) foram pesados por MICROMAN, e foram adicionados cerca de 900 pL de água Milli-Q pesada por uma micropipeta. Este líquido foi agitado por cerca de 1 minuto, sonicado por cerca de 1 minuto e agitado novamente

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42/57 por cerca de 10 segundos.

(3) A solução obtida filtrando a solução acima (2) através de um filtro DISMIC (marca registrada) (diâmetro do poro: 0,45 pm) foi usada como uma solução de amostra.

c) Medição [0159]A medição foi realizada nas seguintes condições por cromatografia líquida / detecção de absorbância UV-vis.

[0160]Comprimento de onda de medição: 382 nm, coluna: Shiseido CAPCELLPAK C18 ACR 3pm_3,0 mm * 75 mm [0161]Temperatura da coluna: temperatura constante de cerca de 40° C [0162]Ambas as fases móveis A e B são uma mistura de água / metanol / ácido trifluoroacético, e a alimentação das fases móveis foi realizada alterando a taxa de misturação das fases móveis A e B para controlar um gradiente de concentração.

[0163]Taxa de fluxo: 1,0 mL / minuto, volume de injeção: 10 pL, temperatura do amostrador automático: temperatura constante de cerca de 25° C.

< Medição da Concentração de íons Sulfato >

[0164]A amostra foi medida com um aparelho de cromatografia iônica 883 Basic IC plus (fabricado por Metrohm AG) para quantificar a concentração de íons sulfato. Os resultados da medição da razão molar de íons sulfato para topotecano são mostrados nas Tabelas 1 e 2. Nos lipossomas das Tabelas 1 e 2, a porcentagem de íons sulfato contidos na fase aquosa interna do lipossoma para íons sulfato na composição lipossômica inteira foi de ao menos 90%.

[0165]A concentração de íons sulfato na fase aquosa interna foi calculada subtraindo-se a concentração de íons sulfato na fase aquosa externa da concentração de íons sulfato na fase aquosa inteira.

[0166]A concentração de íons sulfato em cada fase aquosa foi medida como segue.

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43/57 (Concentração de íons Sulfato na Fase Aquosa Inteira) [0167]50 μΙ_ do líquido de dispersão lipossômica foram medidos e 950 pl_ de metanol foram adicionados a eles, seguidos por misturação com ultrassonicação por 15 segundos. 90 μΙ_ do líquido foram medidos e 810 pL de água para injeção (fabricada por Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) adicionados a esses, seguidos de misturação com ultrassonicação por 30 segundos. Foram adicionados 900 pL de etil acetato à solução resultante, que foi bem agitada para extrair lipídios na fase de etil acetato. Uma quantidade apropriada do líquido da fase aquosa foi medida e usada para análise por cromatografia de íons.

(Concentração de íons Sulfato na Fase Aquosa Externa) [0168]100 pL do líquido de dispersão lipossômica foram medidos e depois diluídos adicionando-se 900 pL de solução de glicose a 5% (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). 450 pL do líquido resultante foram tratados por ultrafiltração, e o filtrado foi usado como uma amostra de análise por cromatografia de íons.

[0169]As condições de centrifugação foram 7400 g, 5^o C e 30 minutos. A centrífuga usada foi Hitachi himac CF15RXII.

< Medição de AUC >

[0170]0s camundongos aos quais foram administrados os lipossomas preparados com topotecano (dose: 1 mg/kg em termos da quantidade de fármaco) foram sangrados às 0,25, 2, 6 e 24 horas após a administração. O sangue foi centrifugado a 800 χ g por 10 minutos para recuperar o plasma. A concentração de topotecano foi quantificada para o plasma coletado por cromatografia líquida / espectrometria de massas / espectrometria de massas (LC / MS / MS). Utilizando o software de análise farmacocinética WinNonlin (marca registrada) (disponível a partir de Certara, L.P.), a área sob a curva (AUC) de concentração de sangue - tempo até o tempo infinito após administração única foi calculada a partir da transição da

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44/57 concentração de topotecano assim obtida. A unidade de AUC é o tempo χ ng / mL (expressa como h * ng / mL na tabela). Além disso, a AUC do lipossoma descrita em [AACR-EORTC International Conference, São Francisco, Califórnia, 22 a 26 de outubro de 2007, # C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Shingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in

Rats, William C. Zamboni e outros] é calculada em 68152 horas χ ng / mL.

Tabela 1

	Tamanho médio de partícula	Concentração de topotecano na fase aquosa inteira	SO42' na fase aquosa interna / topotecano na fase aquosa inteira	Razão molar de componentes da membrana lipossômica	Dose	AUC	Porcentagem de topotecano na fase aquosa interna	Porcentagem de SOá2' na fase aquosa interna
	nm	PPm	mol/mol	PEG	Col	DHSM	SM	mg/kg	h*ng/mL	%	%
Exemplo Comparativo 1	101,7	2419	0,70	4,7%	37%	0%	58%	1,0	120189	99	100
Exemplo Comparativo 2	96,3	2605	0,75	4,8%	42%	0%	53%	1,0	136669	100	100
Exemplo Comparativo 3	90,2	2993	1,57	4,5%	42%	0%	54%	1,0	140108	100	98
Exemplo Comparativo 4	105,2	2889	1,58	4,6%	47%	0%	48%	1,0	137082	100	98
Exemplo Comparativo 5	91,1	2946	1,01	4,9%	47%	0%	48%	1,0	157878	100	96
Exemplo Comparativo 6	99,3	2994	1,01	4,7%	39%	0%	56%	1,0	143615	100	100
Exemplo Comparativo 7	101,2	3080	0,96	4,7%	39%	0%	56%	1,0	119518	100	98
Exemplo Comparativo 8	100,8	2437	1,14	4,7%	39%	0%	57%	1,0	173179	100	98
Exemplo Comparativo 9	90,8	1191	0,32	5,0%	38%	57%	0%	1,0	140277	100	100
Exemplo Comparativo 10	131,2	1328	0,3	4,4%	36%	59%	0%	1,0	174087	59	100

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45/57

Exemplo Comparativo 11	106	1876	-	0%	43%	57%	0%	1,0	182694	99	-
Exemplo Comparativo 12	111,2	2437	-	0%	45%	0%	55%	1,0	134591	100	-

Tabela 2

	Tamanho médio de partícula	Concentração de topotecano na fase aquosa inteira	SO42' na fase aquosa interna / topotecano na fase aquosa inteira	Razão molar de componentes da membrana lipossômica	Dose	AUC	Porcentagem de topotecano na fase aquosa interna	Porcentagem de SO42· na fase aquosa interna
	nm	□pm	mol/mol	PEG	Col	DHSM	SM	mg/kg	h*ng/mL	%	%
Exemplo 1	100	2160	0,66	5,6%	40%	54%	0%	1,0	227895	99	97
Exemplo 2	122	2347	1,38	5,3%	39%	56%	0%	1,0	201264	100	100
Exemplo 3	88	2353	1,16	5,4%	38%	56%	0%	1,0	270579	99	100
Exemplo 4	111,3	2167	1,05	5,2%	38%	57%	0%	1,0	295476	99	98
Exemplo 5	115,9	2659	0,8	5,1%	35%	60%	0%	1,0	330913	100	100
Exemplo 6	125,2	1349	0,9	4,4%	36%	60%	0%	1,0	261345	99	100
Exemplo 7	120,3	3984	0,6	5,0%	43%	52%	0%	1,0	278684	98	98
Exemplo 8	116,8	2254	1,1	5,1%	43%	52%	0%	1,0	307412	99	98
Exemplo 9	101	1561	0,73	10,0%	40%	50%	0%	1,0	245450	100	100
Exemplo 10	104	1758	0,68	5,1%	40%	55%	0%	1,0	270294	100	92

[0171]Como pode ser visto a partir dos resultados das Tabelas 1 e 2, nos Exemplos 1 a 10 da composição lipossômica, incluindo uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, uma dihidroesfingomielina, e colesterol como componentes de uma membrana lipossômica, na qual uma fase aquosa interna contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna

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46/57 para o fármaco na fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais, foi demonstrado que o valor medido da AUC é 200.000 ou mais e, portanto, é possível obter alta retenção no sangue. Por outro lado, nos Exemplos Comparativos 1 a 8, nos quais a dihidroesfingomielina não é usada, Exemplos Comparativos 9 e 10, nos quais a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é menor do que 0,36, e nos Exemplos comparativos 11 e 12, nos quais não é utilizada diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico, foi mostrado que o valor medido da AUC é menor do que 200.000, o que é inferior aos Exemplos 1 a 10.

< Teste de Eficácia de Fármacos Usando Modelo de Camundongo para Transplante Subcutâneo A549 >

[0172]1 x 10⁷ células A549, uma linhagem de células de câncer de pulmão humano, foram transplantadas subcutaneamente no flanco direito dos camundongos Balb/c/nu/nu (fêmea, 6 semanas de idade). A partir do dia 15 após o transplante, os animais receberam os lipossomas contendo topotecano preparados no Exemplo 10 (4 mg / kg e 2 mg / kg em termos de quantidade de fármaco, duas vezes por semana) e os lipossomas contendo topotecano preparados no Exemplo Comparativo 12 (4 mg / kg e 2 mg / kg em termos da quantidade de fármaco, duas vezes por semana). Além disso, os animais receberam solução salina fisiológica como controle negativo. Em adição, aos animais foi administrada uma solução aquosa de topotecano (2 mg / kg em termos da quantidade de fármaco) como controle comparativo. O peso corporal e o volume do tumor dos animais foram medidos duas vezes por semana desde o início da administração. Os resultados da medição do peso corporal são mostrados nas Figuras 1 e 2, e os resultados da medição do volume do tumor são mostrados nas Figuras 3 e 4.

[0173]A partir dos resultados das Figuras 3 e 4, foi demonstrado que o lipossoma contendo topotecano preparado no Exemplo 10 exibe maior eficácia de fármaco em comparação com a solução de topotecano preparada no Exemplo

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Comparativo 12, e o efeito é dose-dependente.

< Exemplos 11 a 16 e Exemplos Comparativos 13 a 16 >

[0174]Os lipossomas contendo topotecano foram preparados da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que, para os Exemplos 11 a 16, as quantidades de DHSM, DSPE-PEG e colesterol foram alteradas, de modo que a quantidade de colesterol adicionada e a quantidade de adição de DHSM derivado de ovo de galinha no ajuste da fase oleosa se tornam as razões descritas na Tabela 3. Por exemplo, para o Exemplo 11, lipossomas contendo topotecano foram produzidos da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que a quantidade de adição de colesterol e a quantidade de adição de DHSM derivado de ovo de galinha no ajuste da fase oleosa foram alteradas para 3,6 g de colesterol e 12,9 g de DHSM derivado de ovo de galinha.

[0175]Para os Exemplos Comparativos 13 a 16, as quantidades de SM, DSPE-PEG e colesterol foram alteradas para as razões descritas na Tabela 3.

[0176]Da mesma forma, os resultados da medição do tamanho de partícula, concentração de topotecano na fase aquosa inteira, concentração de íons sulfato na fase aquosa interna e AUC são mostrados na Tabela 3. Além disso, o valor da AUC para cada quantidade de colesterol é mostrado na Figura 5.

[0177]Nos lipossomas da Tabela 3, a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira foi de ao menos 98%, exceto no Exemplo Comparativo 13, no qual a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira foi de 68%.

[0178]Nos lipossomas da Tabela 3, a porcentagem de íons sulfato contidos na fase aquosa interna do lipossoma para os íons sulfato na composição lipossômica inteira foi de ao menos 90%, exceto no Exemplo Comparativo 13, em que a porcentagem de íons sulfato contida na fase aquosa interna do lipossoma para os íons sulfato na composição lipossômica inteira foi de 71%.

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Tabela 3

	Tamanho médio de partícula	Concentração de topotecano na fase aquosa inteira	SOA na fase aquosa interna / topotecano na fase aquosa inteira	Razão molar de componentes da membrana lipossômica	Dose	AUC	Porcentagem de topotecano na fase aquosa interna	Porcentagem de SOA na fase aquosa interna
	nm	PPm	mol/mol	PEG	Col	DHSM	SM	mg/kg	h*ng/mL	%	%
Exemplo 11	97	2516	0,76	5,0	32,0	63,0	0	1	194404	99	93
Exemplo 12	111	2167	1,05	5,2	37,6	57,1	0	1	295476	99	98
Exemplo 13	n.d.	2533	0,78	5,0	40,0	55,0	0	1	262734	99	100
Exemplo 14	118	2240	0,89	5,1	42,4	52,5	0	1	294694	100	100
Exemplo 15	96	2163	0,38	5,0	48,0	47,0	0	1	163010	100	100
Exemplo 16	102	2559	0,50	4,0	57,0	39,0	0	1	162607	100	100
Exemplo Comparativo 13	119,5	720	0,81	4,7	27,0	0	68,3	1	5940	68	71
Exemplo Comparativo 14	112	2311	0,80	4,7	37,1	0	58,2	1	120189	100	100
Exemplo Comparativo 15	105	2746	1,28	4,6	58,5	0	36,9	1	125814	99	97
Exemplo Comparativo 16	106	2529	1,28	4,8	68,3	0	26,9	1	116623	99	97

[0179]A partir dos resultados dos Exemplos 11 a 16 e dos Exemplos Comparativos 1,2, 4, 7 e 13 a 16, pode-se observar que a presente invenção atinge uma AUC satisfatória para lipossomas com DHSM derivado de ovo de galinha em uma porcentagem de carregamento mais ampla de colesterol do que lipossomas SM. Além disso, no lipossomo DHSM derivado de ovo de galinha da presente invenção, pode ser visto que a AUC é mais satisfatória, em particular, em um caso em que a porcentagem de colesterol está na faixa de 35 a 43 mol%.

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49/57 < Exemplos 17 a 24 e Exemplos Comparativos 17 a 24 >

< Preparação da Dispersão Lipossômica >

[0180]0s lipossomas contendo topotecano foram preparados da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que, para os Exemplos 17 a 24 e Exemplos Comparativos 17 a 24, a quantidade de adição de cada lipídio no ajuste da fase oleosa foi definida como mostrado na Tabela 4, o fármaco a ser encapsulado nas partículas de lipossomas por carregamento remoto foi definido como mostrado na Tabela 4, e os fármacos que não o topotecano foram encapsulados pelo método descrito na seção < Encapsulamento de Cada Fármaco Anticâncer nas Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto > descrita abaixo. Além disso, a relação da composição lipídica em cada um dos Exemplos 17 a 24 e Exemplos Comparativos 17 a 24 é mostrada na Tabela 5.

Tabela 4

	DHSM totalmente sintético Zg	DHSM de ovo de galinha / g	Col / g	PEG/g	Tipo de fármaco
Exemplo 17	11,52	-	4,32	4,32	Topotecano
Exemplo 18	-	11,52	4,32	4,32	Topotecano
Exemplo 19	11,52	-	4,32	4,32	Doxorrubicina
Exemplo 20	-	11,52	4,32	4,32	Doxorrubicina
Exemplo 21	11,52	-	4,32	4,32	Sunitinibe
Exemplo 22	-	11,52	4,32	4,32	Sunitinibe
Exemplo 23	11,52	-	4,32	4,32	Irinotecano
Exemplo 24	-	11,52	4,32	4,32	Irinotecano
Exemplo Comparativo 17	11,52	-	4,32	4,32	Topotecano
Exemplo Comparativo 18	-	12,98	4,26	4,20	Topotecano
Exemplo Comparativo 19	11,52	-	4,32	4,32	Doxorrubicina
Exemplo Comparativo 20	-	12,98	4,26	4,20	Doxorrubicina
Exemplo Comparativo 21	11,52	-	4,32	4,32	Sunitinibe

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Exemplo Comparativo 22	-	12,98	4,26	4,20	Sunitinibe
Exemplo Comparativo 23	11,52	-	4,32	4,32	Irinotecano
Exemplo Comparativo 24	-	12,98	4,26	4,20	Irinotecano

Tabe	a5
Razão molar
PEG	Col	DHSM	SM	DHSM totalmente sintético	HSPC
Exemplo 17	5%	39%	0%	0%	56%	0%
Exemplo 18	5%	39%	56%	0%	0%	0%
Exemplo 19	5%	39%	0%	0%	56%	0%
Exemplo 20	5%	39%	56%	0%	0%	0%
Exemplo 21	5%	39%	0%	0%	56%	0%
Exemplo 22	5%	39%	56%	0%	0%	0%
Exemplo 23	5%	38%	0%	0%	56%	0%
Exemplo 24	5%	38%	57%	0%	0%	0%
Exemplo Comparativo 17	5%	37%	0%	58%	0%	0%
Exemplo Comparativo 18	5%	41%	0%	0%	0%	54%
Exemplo Comparativo 19	5%	36%	0%	59%	0%	0%
Exemplo Comparativo 20	5%	41%	0%	0%	0%	54%
Exemplo Comparativo 21	5%	37%	0%	59%	0%	0%
Exemplo Comparativo 22	5%	41%	0%	0%	0%	53%
Exemplo Comparativo 23	4%	37%	0%	59%	0%	0%
Exemplo Comparativo 24	5%	41%	0%	0%	0%	54%

< Encapsulamento de Cada Agente Anticâncer em Partículas de Lipossomas por Carregamento Remoto >

[0181]Encapsulamento de doxorrubicina (Exemplos 19 e 20 e Exemplos Comparativos 19 e 20): Água para injeção foi adicionada ao cloridrato de doxorrubicina (fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a 4 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi

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51/57 adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o cloridrato de doxorrubicina. Os lipossomas foram adicionados à solução resultante de doxorrubicina a uma relação em volume de 1/1 e, em seguida, o líquido de dispersão ajustado para pH 7,0 foi aquecido a 62° C por 60 minutos.

[0182]Encapsulamento de sunitinibe (Exemplos 21 e 22 e Exemplos comparativos 21 e 22): Água para injeção foi adicionada ao malato de sunitinibe (fabricado por Toronto Research Chemicals Inc.) a 5 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o malato de sunitinibe. Os lipossomas foram adicionados à solução resultante de sunitinibe na relação em volume de 1/1, seguido de aquecimento a 62° C por 60 minutos.

[0183]Encapsulamento de irinotecano (Exemplos 23 e 24 e Exemplos Comparativos 23 e 24): Água para injeção foi adicionada ao cloridrato de irinotecano (fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a 4 mg / mL. Além disso, enquanto agitando o poço de líquido, uma solução de HCI a 8 mol / L foi adicionada para ajustar o pH para cerca de 3 para dissolver o cloridrato de irinotecano. Os lipossomas foram adicionados à solução de irinotecano resultante na relação em volume de 1/1, seguido de aquecimento a 62° C por 60 minutos.

[0184]A AUC nos Exemplos 17 a 22 e nos Exemplos Comparativos 17 a 22 foi medida da mesma maneira que a descrita acima nos presentes Exemplos. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6

	Fármaco	Lipídio	AUC
			h*ng/mL
Exemplo 17	Topotecano	DHSM totalmente sintético	227177
Exemplo 18	Topotecano	DHSM derivado de ovo de galinha	201266
Exemplo Comparativo 17	Topotecano	SM	164034

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Exemplo Comparativo 18	Topotecano	HSPC	86692
Exemplo 19	Doxorrubicina	DHSM totalmente sintético	506246
Exemplo 20	Doxorrubicina	DHSM derivado de ovo de galinha	539688
Exemplo Comparativo 19	Doxorrubicina	SM	481802
Exemplo Comparativo 20	Doxorrubicina	HSPC	433691
Exemplo 21	Sunitinibe	DHSM totalmente sintético	37661
Exemplo 22	Sunitinibe	DHSM derivado de ovo de galinha	26421
Exemplo Comparativo 21	Sunitinibe	SM	19904
Exemplo Comparativo 22	Sunitinibe	HSPC	6453

[0185]A partir dos resultados dos Exemplos 17 a 22 e Exemplos Comparativos 17 a 22, mesmo em um caso em que foi utilizado fármaco topotecano ou sunitinibe, os lipossomas usando DHSM exibiram retenção melhorada no sangue em comparação com lipossomas SM e lipossomas HSPC. Além disso, verificou-se que lipossomas que usam DHSM totalmente sintético com uma pureza de 98% ou mais de DHSM com uma cadeia alquila com 16 átomos de carbono e uma cadeia alquila com 18 átomos de carbono como DHSM são capazes de melhorar a retenção no sangue em comparação com lipossomas usando DHSM derivado de ovo de galinha.

[0186]O tamanho das partículas, a concentração de topotecano, a concentração de íons sulfato e a taxa de liberação nos Exemplos 17 a 24 e nos Exemplos Comparativos 17 a 18 e 21 a 24 foram medidos. Os resultados são mostrados na Tabela 7. O tamanho das partículas, a concentração de topotecano e a concentração de íons sulfato foram medidos da mesma maneira que a descrita acima nos presentes Exemplos.

[0187]Nos lipossomas da Tabela 7, a porcentagem do fármaco contido na fase

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53/57 aquosa interna dos lipossomas para o fármaco da composição lipossômica inteira foi de ao menos 95%.

[0188]Nos lipossomas da Tabela 7, a porcentagem de íons sulfato contidos na fase aquosa interna do lipossoma para os íons sulfato na composição lipossômica inteira foi de ao menos 95%.

[0189]A formulação de lipossomas foi diluída 20 vezes em cada concentração de tampão PBS contendo cloreto de amônio, e a sua taxa de liberação foi medida após incubação durante 4 horas. A taxa de liberação é definida como a porcentagem da concentração de API vazada para a fase aquosa externa, dividida pela concentração inicial de API na fase aquosa inteira.

[0190]Para cada concentração de tampão PBS contendo cloreto de amônio, nos Exemplos 17 e 18 e nos Exemplos Comparativos 17 e 18 (avaliação de lipossomas encapsulados em topotecano), foi utilizado um tampão PBS no qual foram dissolvidos 4,8 mmol / L de cloreto de amônio, nos Exemplos 19 e 20 e nos Exemplos Comparativos 19 e 20 (avaliação de lipossomas encapsulados em doxorrubicina), foi utilizado um tampão PBS no qual foram dissolvidos 200 mmol / L de cloreto de amônio, nos Exemplos 21 e 22 e nos Exemplos Comparativos 21 e 22 (avaliação de lipossomas encapsulados em sunitinibe), foi usado um tampão PBS no qual foram dissolvidos 100 mmol / L de cloreto de amônio, e nos Exemplos 23 e 24 e nos Exemplos Comparativos 23 e 24 (avaliação de lipossomas encapsulados em irinotecano), foi utilizado um tampão PBS no qual foram dissolvidos 4,8 mmol / L de cloreto de amônio.

Tabela 7

Fármaco

Lipídio

Concentração de fármaco na fase aquosa inteira

SOA na fase aquosa interna / fármaco na fase aquosa inteira

Taxa de liberação

Porcentagem de fármaco na fase aquosa interna

Porcentagem de SOA na fase aquosa interna

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54/57

			ppm	mol/mol	%	%	%
Exemplo 17	Topotecano	DHSM totalmente sintético	2160	1,25	18	99	99
Exemplo 18	Topotecano	DHSM de ovo de galinha	2813	1,53	33	100	99
Exemplo Comparativo 17	Topotecano	SM	2341	1,55	59	99	99
Exemplo Comparativo 18	Topotecano	HSPC	2308	0,98	62	99	97
Exemplo 19	Doxorrubicina	DHSM totalmente sintético	1924	1,90	1	100	98
Exemplo 20	Doxorrubicina	DHSM de ovo de galinha	2138	2,39	2	100	98
Exemplo 23	Irinotecano	DHSM totalmente sintético	2373	1,72	5	100	99
Exemplo 24	Irinotecano	DHSM de ovo de galinha	2827	2,19	13	100	99
Exemplo Comparativo 23	Irinotecano	SM	2512	2,13	27	99	99
Exemplo Comparativo 24	Irinotecano	HSPC	2486	1,31	36	99	97
Exemplo 21	Sunitinibe	DHSM totalmente sintético	2022	1,39	7	100	99
Exemplo 22	Sunitinibe	DHSM de ovo de galinha	2263	1,92	5	100	98
Exemplo Comparativo 21	Sunitinibe	SM	2206	1,67	8	100	100
Exemplo Comparativo 22	Sunitinibe	HSPC	2203	0,96	8	100	98

[0191]De acordo com os resultados dos Exemplos 17 a 24 e Exemplos Comparativos 17,18 e 21 a 24, a taxa de liberação dos lipossomas que utilizam DHSM é menor do que a dos lipossomas SM e dos lipossomas HSPC, independentemente de qual agente é usado, a partir do qual pode-se esperar uma melhora da retenção no sangue. Além disso, em um caso em que DHSM é um DHSM totalmente sintético com pureza de 98% ou mais com uma cadeia alquila com 16 átomos de carbono e

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55/57 uma cadeia alquila com 18 átomos de carbono, a taxa de liberação é bastante reduzida no lipossoma encapsulado em topotecano, lipossoma encapsulado em doxorrubicina e lipossoma encapsulado em irinotecano e, portanto, verificou-se que o uso desso DHSM totalmente sintético é mais preferencial na supressão do vazamento do fármaco no sangue.

< Medição de Partículas Insolúveis >

[0192]Para cada um dos Exemplos 2, 3 e 4, as amostras um mês após o armazenamento a 5^o C foram medidas em um contador de partículas submersas (HACH ULTRA), e o número de partículas com mais de 10 pm e o número de partículas com mais de 25 pm contidos por formulação de frasco (2 mL) foram medidos mais (a seguir, a menos que especificado de outra forma, partículas com mais de 10 pm se referem a partículas com tamanho de partícula maior do que 10 pm, e partículas com mais de 25 pm se referem a partículas com tamanho de partícula maior do que 25 pm). A concentração de lipídios nos Exemplos 2, 3 e 4 foi de 23 mmol / L, e o número de partículas por 1 pmol de lipídio para partículas com mais de 10 pm foi de 0,7 no Exemplo 2, 1,1 no Exemplo 3, e 0,3 no Exemplo 4. Além disso, o número de partículas por 1 pmol de lipídio para partículas com mais de 25 pm foi de 0,09 para o Exemplo 2, 0,5 para o Exemplo 3, e 0 para o Exemplo 4. Sabe-se que lipossomas encapsulados em topotecano se quebram em dímeros fracamente solúveis em um caso de vazamento e exposição a um ambiente neutro, tornando-se assim partículas insolúveis. Este é um resultado surpreendente de que a geração de partículas insolúveis também foi reduzida porque o vazamento é extremamente bem suprimido pela presente invenção.

[0193]Para o Exemplo Comparativo 8, as partículas insolúveis na formulação em frasco 1 (2 mL) foram medidas também na amostra um mês após 5^o C. Em termos do número de partículas por 1 pmol de lipídio, o número de partículas com mais de 10 pm foi 251, excedendo muito 150, e o número de partículas com mais de 25 pm foi

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17, excedendo muito 15.

< Dependência do íon Amônio na Taxa de Liberação >

[0194]A taxa de liberação foi calculada como a porcentagem da concentração do fármaco vazado (concentração do fármaco na fase aquosa externa) para a concentração do fármaco na fase aquosa inteira. Para lipossomas DHSM encapsulados em topotecano preparados no Exemplo 17 e lipossomas HSPC encapsulados em doxorrubicina (Doxil (marca registrada) 20MG, disponível a partir de Janssen Pharma, Inc.), a taxa de liberação dos lipossomas foi medida no plasma sem adição de cloreto de amônio (fabricado por LAMPIRE Biological Laboratories, Inc., plasma de camundongo, nome do produto: Plasma de camundongo de controle e doador em Na Hep, No. de catálogo 7315511) e plasma no qual foram dissolvidos 5 mmol IL de cloreto de amônio. Os resultados são mostrados na Figura 6. No ambiente do tumor, a degradação de glutamina é aumentada e, como um resultado, uma grande quantidade de amônio é gerada, para a qual foi relatada a ocorrência de aproximadamente 5 mmol / L de amônio (artigo citado: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841-1850).

[0195]Doxil (marca registrada) 20MG é um lipossoma encapsulado em doxorrubicina composto por HSPC. Doxil (marca registrada) exibe muito pouco vazamento em um ambiente que simula o sangue, mas verificou-se que praticamente não libera, mesmo em um ambiente com alto teor de amônio que simula o ambiente do tumor.

[0196]Por outro lado, o lipossoma contendo topotecano, descrito no Exemplo 17 da presente invenção, exibe vazamento muito baixo em um ambiente que simula o sangue, resultando em alta retenção no sangue, enquanto exibe alta liberação de 86% em um ambiente com alto teor de amônio que imita o ambiente do tumor e não vaza no sangue, resultando assim em uma expectativa de que uma alta quantidade do fármaco seja entregue ao tumor pelo lipossoma e que o fármaco transportado pelo

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57/57 lipossoma seja liberado em grandes quantidades no tumor. Os resultados são mostrados na Figura 6.

[0197]Além disso, um tumor obtido realmente transplantando uma linhagem de células de câncer de ovário humano ES-2 por via subcutânea em um camundongo BALB / c nu foi coletado e colocado em um filtro de centrífuga de 5 pm de tamanho de poro, seguido de centrifugação a 400 g por 10 minutos para obter um fluido intersticial tumoral. Os lipossomas em topotecano (30 ng em termos da quantidade de fármaco) da presente invenção preparados no Exemplo 17 e os lipossomas HSPC encapsulados em doxorrubicina (Doxil (marca registrada) 20MG, disponível a partir de Janssen Pharma, Inc.) (30 ng em termos da quantidade de fármaco) foram adicionados respectivamente a 30 pL do fluido intersticial tumoral, seguido por incubação. A taxa de liberação em um caso de incubação a 37^Q C por 24 horas foi de 85% no Exemplo 17 e 6% nos lipossomas HSPC encapsulados em doxorrubicina, mostrando assim que uma diferença na liberação foi observada como esperado no fluido intersticial tumoral coletado a partir do ambiente de tumor real.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição lipossômica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico;

uma dihidroesfingomielina; e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, em que a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e uma razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco em uma fase aquosa inteira é de 0,36 ou mais.

2/3 com polímero hidrofílico é uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polietileno glicol ou metóxi polietileno glicol.

2. Composição lipossômica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o fármaco é um fármaco anticâncer.

3/3

CARACTERIZADA pelo fato de que uma taxa de liberação de fármaco a partir do lipossoma no plasma tendo uma concentração de amônio de 1 mmol / L ou menos é de 20% / 24 horas ou menos a 37° C, e a taxa de liberação de fármaco a partir do lipossoma no plasma com uma concentração de amônio de 4 a 6 mmol / L é de 60% / 24 horas ou mais a 37° C.

3. Composição lipossômica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o fármaco é um agente anticâncer a base de antraciclina, um agente anticâncer a base de cisplatina, um agente anticâncer a base de taxano, um agente anticancer a base de alcalóides da vinca, um agente anticâncer a base de bleomicina, um agente anticâncer a base de sirolimus, um agente anticâncer a base de camptotecina, um antagonista metabolico ou um fármaco direcionado molecularmente.

4. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o fármaco é topotecano ou um sal do mesmo, doxorrubicina ou um sal da mesma, irinotecano ou um sal do mesmo, ou sunitinibe ou um sal do mesmo.

5. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar de íons sulfato na fase aquosa interna para o fármaco na fase aquosa inteira é de 0,6 ou mais e 1,8 ou menos.

6. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a diacilfosfatidiletanolamina modificada

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7. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a porcentagem de diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico nos componentes da membrana lipossômica é de 2 a 10 mol%.

8. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a porcentagem de colesteróis nos componentes da membrana lipossômica é de 35 a 43 mol%.

9. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o tamanho de partícula é de 150 nm ou menos.

10. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a fase aquosa externa tem um pH de 5,5 a 8,5.

11. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a dihidroesfingomielina é uma dihidroesfingomielina contendo um grupo alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 18 átomos de carbono, e o fármaco encapsulado é topotecano ou um sal do mesmo.

12. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a porcentagem dos íons sulfato contidos na fase aquosa interna do lipossoma para os íons sulfato na composição lipossômica inteira é de ao menos 80% e a porcentagem do fármaco contido na fase aquosa interna do lipossoma para o fármaco na composição lipossômica inteira é de ao menos 80%.

13. Composição lipossômica, de acordo com a reivindicação 11,

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14. Composição lipossômica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o número de partículas com mais de 10 pm contidas em 1 pmol de lipídio da composição lipossômica após armazenamento por 1 mês a 5^o C é de 150 ou menos, e o número de partículas com mais de 25 pm contidas em 1 pmol de lipídios da composição lipossômica é de 15 ou menos.

15. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

a composição lipossômica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que é um agente anticâncer.

17. Composição lipossômica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

uma diacilfosfatidiletanolamina modificada com polímero hidrofílico;

uma dihidroesfingomielina; e colesteróis como componentes de uma membrana lipossômica, em que a composição lipossômica encapsula um fármaco, uma fase aquosa interna da mesma contém sulfato de amônio, e a dihidroesfingomielina é uma dihidroesfingomielina contendo um grupo alquila de cadeia longa com 16 átomos de carbono e um grupo alquila de cadeia longa com 18 átomos de carbono.