CN103153285B - 脂质体组合物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种脂质体组合物，其可以以高包封量导入药物、临床上具有维持充分的有效浓度的缓释性、适于皮下给药等。本发明的脂质体组合物具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜，所述脂质体组合物具有由该第二脂质体的外膜界定的第二脂质体内部区域，并且至少该第二脂质体内部区域与前述第一脂质体的外部之间形成有离子梯度。

Description

脂质体组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及包含药物等有效成分的缓释性脂质体组合物。
背景技术
需要频繁给药的药剂带来的频繁往返医院、穿刺等痛苦对患者而言是很大的负担。另外，伴随着吞咽困难的患者难以经口服用药物，因此寻求口服给药以外的给药方法。对于认知功能障碍患者、脑病、帕金森病等需要监护者的患者而言，难以管理其自行服药，因此寻求口服给药以外的给药方法、不需要频繁给药的治疗方法的可选项。进而，对于自主神经失调等一旦药效消失就会立即对日常生活造成障碍的患者而言，也寻求药效不会在短时间内消失、可以长期维持效果的治疗方法。或者，关于手术后的疼痛，由于药效消失后就会立即感受到无法忍受的疼痛，因此可能会影响康复、成为推迟出院的原因。因此，可以认为如果手术后5～7天内能够持续发挥药效来抑制疼痛，则可促进手术后的恢复，及早出院。
由此，能够长期持续发挥药效的缓释制剂在所有疾病领域中均作为提高患者的生活质量(QOL)的制剂而备受期待。
目前为止所研究的缓释制剂的大部分为使用了聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的微球。例如，研究了使用已知作为阿尔茨海默氏认知功能障碍治疗剂的Aricept(注册商标，Eisai Co.,Ltd.)的有效成分即盐酸多奈哌齐的PLGA微球，其能够得到持续的释放性(非专利文献1)。然而，使用PLGA时，特别是难以高浓度且高效率地包封水溶性药物，为了得到高药物包封量，还有未完成的课题。另外，使用PLGA时，在制备工序中使用有机溶剂，因此必须去除有机溶剂这一点(例如专利文献1、2)、随着分解而使局部酸性增强从而引起炎症这一点也成为大的问题。
另外，还研究了使用布比卡因等局部麻醉药的缓释制剂的给药途径，但是能够在手术后、尽可能缓解连续5～7天的疼痛的充分时间内的持续性依旧是研究课题(非专利文献2)。另外，多囊脂质体(MVL)是作为用于向局部或者全身送达药物的脂质基的缓释性药物载体而开发(专利文献1、2)的，对于此，药物包封量、缓释时间还不能说是充分的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2001－505224号公报
专利文献2：日本特表2001－522870号公报
非专利文献
非专利文献1：Biomaterials28(2007)1882－1888
非专利文献2：Anesthesiology101(2004)133－137
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种通过使药物沿离子梯度从外部向内部转移而能够以高效且高包封量地导入药物，进而在临床上维持充分有效浓度的、具有缓释性的脂质体组合物及其制造方法。
用于解决问题的方案
上述课题可由本发明得以解决。
(1)一种脂质体组合物，其具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜，所述脂质体组合物具有由该第二脂质体的外膜界定的第二脂质体内部区域，并且至少该第二脂质体内部区域与前述第一脂质体的外部之间形成有离子梯度。
(2)根据上述(1)所述的脂质体组合物，其中，前述离子梯度为质子浓度梯度，前述第二脂质体内部区域的pH、或者前述第二脂质体内部区域以及前述第一脂质体的内部区域的pH比前述第一脂质体的外部的pH低。
(3)根据上述(1)或(2)所述的脂质体组合物，其中，前述第一脂质体具有1～20μm范围内的平均粒径。
(4)根据上述(1)～(3)的任一项所述的脂质体组合物，其中，前述第二脂质体内部区域、或者前述第二脂质体以及前述第一脂质体的内部区域中含有药物。
(5)根据上述(4)所述的脂质体组合物，其中，含有相对于总脂质以摩尔比(mol/mol)计为0.05以上的前述药物。
(6)根据上述(1)～(5)的任一项所述的脂质体组合物，其中，前述第一脂质体以及前述第二脂质体的脂质膜由包含磷脂和胆固醇的脂质构成。
(7)根据上述(6)所述的脂质体组合物，其中，前述磷脂为饱和磷脂。
(8)一种脂质体组合物的制造方法，其为在外膜的内部与外部之间形成有离子梯度的脂质体组合物的制造方法，其包括：相对于包含脂质的水混溶性溶剂，混合以体积比计为0.7～2.5的、包含用于形成该离子梯度的化合物的第一内水相溶液来制备第一乳液的工序；相对于该第一乳液，混合以体积比计为0.7以上的第二内水相溶液来制备第二乳液的工序；通过用于形成该离子梯度的化合物的浓度低于该第一内水相溶液的水溶液来置换该第二乳液的外水相的工序。
(9)根据前述(8)所述的脂质体组合物的制造方法，其中，所述离子梯度为质子浓度梯度。
(10)根据上述(8)或(9)所述的脂质体组合物的制造方法，其中，前述第一内水相溶液为包含硫酸盐的水溶液。
(11)根据上述(10)所述的脂质体组合物的制造方法，其中，前述硫酸盐为硫酸铵。
(12)根据上述(8)～(11)的任一项所述的脂质体组合物的制造方法，其还包括：利用前述离子梯度的驱动力将药物导入前述脂质体组合物内部的工序。
发明的效果
本发明为一种脂质体组合物，其具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜，所述脂质体组合物具有由该第二脂质体的外膜界定的第二脂质体内部区域，并且至少该第二脂质体内部区域与前述第一脂质体的外部之间形成有离子梯度。本发明的脂质体组合物能高效率地包封药物，并且实现药物的长期缓释。
根据本发明的脂质体组合物的制造方法，可以得到高效率地包封药物并且实现药物的长期缓释的脂质体组合物。
附图说明
图1为用透射型电子显微镜(TEM)观察本申请实施例的制备例2中制造的、导入药物后的脂质体组合物的截面的照片(倍率：32000倍)。
图2为表示利用挤出法－1制备的多奈哌齐脂质体(比较例2)等的经时血液动力学结果的图表。
图3为表示利用本发明的制备例2、3、4得到的脂质体组合物等的经时血液动力学结果的图表。
图4为表示利用本发明的制备例5、6得到的脂质体组合物等的经时血液动力学结果的图表。
图5为表示利用本发明的制备例12制备的脂质体组合物的药物动力学结果的图表。
具体实施方式
＜磷脂＞
构成本发明的脂质体组合物的脂双层(以下，也可以简单地称为脂质膜、或者脂质体膜)的主要的脂质即磷脂为生物膜的主要构成成分，通常为分子内具有由长链烷基构成的疏水基和由磷酸基构成的亲水基的两亲性物质。作为磷脂，优选磷脂酰胆碱(=卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等甘油磷酸；神经鞘磷脂(SM)等鞘磷脂；心磷脂等天然或者合成的双磷脂酰磷脂以及它们的衍生物；它们的氢化物例如氢化大豆卵磷脂(HSPC)、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂。磷脂可以单独使用或者组合多种使用。
＜磷脂以外的添加物＞
本发明的脂质体组合物可以在包含上述主要构成成分的同时包含其它膜成分，例如，可以根据需要包含例如磷脂以外的脂质或者其衍生物、膜稳定剂、抗氧化剂等。磷脂以外的脂质是指分子内具有长链烷基等疏水基且分子内不含有磷酸基的脂质，没有特别的限定，可以列举出甘油糖脂、神经鞘糖脂、胆固醇等甾醇衍生物以及它们的氢化物等衍生物。作为胆固醇衍生物，可列举出具有环戊烷多氢菲(cyclopentanohydrophenanthrene)的甾醇类。其中，本发明的脂质体组合物优选含有胆固醇。作为抗氧化剂，可列举出例如抗坏血酸、尿酸或者生育酚同系物即维生素E等。生育酚中存在有α、β、γ、δ四种异构体，本发明中可以使用任意一种。
需要说明的是，本发明的脂质体组合物的脂双层组成优选为磷脂100～50mol%以及胆固醇0～50mol%，更优选为磷脂70～50mol%以及胆固醇30～50mol%。
本发明的脂质体组合物具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜，所述脂质体组合物具有由该第二脂质体的外膜界定的第二脂质体内部区域。
本发明的脂质体组合物的形态包含：内部未包封药物的空脂质体以及内部包封有药物的脂质体。
从缓释性优异以及即便是细针也能容易给药的观点出发，第一脂质体的外径优选为1～20μm，更优选为3～10μm。另外，对第二脂质体的外径没有特别的限定，从药物包封量以及缓释性优异的观点出发，优选为100～800nm。
本发明中，多个第二脂质体分别独立存在于第一脂质体中，对其数目没有特别的限定。
本发明的脂质体组合物至少在该第二脂质体内部区域与前述第一脂质体的外部之间形成有离子梯度。以下，简称为“离子”时意味着形成该离子梯度的离子。本发明中，第二脂质体内部区域与第一脂质体的外部之间形成有离子梯度是指以下情况中的任意一项：(1)隔着第二脂质体具有的外膜，第二脂质体内部区域与第一脂质体内部区域、第一脂质体的外部之间存在离子浓度差；(2)隔着第一脂质体具有的外膜，第二脂质体内部区域、第一脂质体内部区域与第一脂质体的外部之间存在离子浓度差；(3)隔着第二脂质体具有的外膜，第二脂质体内部区域与第一脂质体内部区域之间存在离子浓度差，并且隔着第一脂质体具有的外膜，第一脂质体内部区域与第一脂质体的外部之间存在离子浓度差(此时，第一脂质体内部区域的离子浓度是第二脂质体内部区域的离子浓度与第一脂质体的外部的离子浓度之间的值)。
本发明中，从大量导入药剂的观点出发，离子梯度优选第二脂质体内部区域的离子浓度最高。另外，可以设为第二脂质体内部区域的离子浓度≥第一脂质体内部区域的离子浓度＞第一脂质体的外部的离子浓度。另外，可以设为第二脂质体内部区域的离子浓度＞第一脂质体内部区域的离子浓度≥第一脂质体的外部的离子浓度。另外，可以设为第二脂质体内部区域的离子浓度＞第一脂质体内部区域的离子浓度＞第一脂质体的外部的离子浓度。本申请中不包括第二脂质体内部区域的离子浓度＝第一脂质体内部区域的离子浓度＝第一脂质体的外部的离子浓度的情况。使用质子梯度(pH梯度)作为离子梯度时，离子浓度(质子浓度)高对应着pH低。即，此时，优选第二脂质体内部区域的pH最低。
对空脂质体导入药物的前后，第一脂质体的形状以及外径、第二脂质体的形状以及外径几乎相同。导入有药物的脂质体中，第一脂质体的外径、第二脂质体的外径与内部未包封药物的空脂质体是同样的。
本发明的脂质体组合物内包药物时，这样的脂质体组合物的前述第二脂质体内部区域或者前述第二脂质体以及前述第一脂质体的内部区域可以含有药物。
对脂质体组合物中含有的药物的量没有特别的限定，能够根据用途适宜调整，相对于脂质体组合物具有的总脂质(制造脂质体组合物时使用的总脂质)，以摩尔比[药剂(mol)/总脂质(mol)]计优选为0.05以上，可以设为0.06～0.14。
＜离子梯度法＞
离子梯度法是通过在脂质体膜的内侧/外侧形成离子梯度，使添加在外部的药物随该离子梯度透过脂质体膜，从而将药物包封至脂质体内部的方法，优选质子梯度(pH梯度)作为离子梯度。离子梯度法中，通过制造内部未包封药物的空脂质体，并在空脂质体的外液中添加药物，可以将药物导入至脂质体中。
本发明为用于通过离子梯度法包封药物的脂质体组合物、以及通过离子梯度法包封了药物的脂质体组合物。其中，使用pH梯度作为离子梯度的pH梯度法是最优选适用的。
作为形成pH梯度的方法，使用酸性pH的缓冲液(例如pH2～3的柠檬酸溶液)作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体，接着，将第一脂质体的外部pH调整至中性左右(例如pH6.5～7.5的缓冲液)，从而可以设为形成第二脂质体以及第一脂质体的内部pH低、第一脂质体的外部pH高的pH梯度的形态。
另外，还可以介由铵离子梯度形成pH梯度。此时，例如，使用硫酸铵溶液作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体，接着，去除第一脂质体的外部水相中的硫酸铵或者进行稀释，从而至少在第二脂质体的内侧、第一脂质体的内侧与第一脂质体的外侧形成铵离子的梯度。这样，利用生成的铵离子梯度，从第一脂质体以及第二脂质体的内水相向第一脂质体的外水相产生氨的流出，结果内水相中氨所残留的质子蓄积，从而形成pH梯度，第一脂质体以及第二脂质体的内水相相比于第一脂质体的外水相呈现酸性。
＜包封的药物＞
本发明的脂质体组合物中包封的药物只要是能采用离子梯度法包封至脂质体内的药物，就可以没有特别限定地使用。这样的药物优选为能够离子化的两亲性药物，进一步优选为两亲性弱碱性药物。另外，从效果的角度出发，优选局部给药时寻求缓释性的药物，特别优选脑血管疾病、帕金森病、认知功能障碍等的治疗药物、镇痛药物、局部麻醉药物、抗癌药物。作为这些药物，可列举出多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、毒扁豆碱、庚基毒扁豆碱、苯胺基甲酸酯毒扁豆酚碱(phenserine)、tolserine、cymserine、thiatolserine、thiacymserine、新斯的明、石杉碱、塔克林、美曲膦脂、米诺环素、盐酸法舒地尔、nimodine、吗啡、布比卡因、罗哌卡因、左旋布比卡因、曲马多、利多卡因、阿霉素等。另外可列举出多巴胺、L-DOPA、血清素、肾上腺素、可待因、哌替啶、美沙酮、吗啡、阿托品、decyclomine、美噻吨、丙胺太林、丙咪嗪、阿米替林、多虑平、地昔帕明、奎尼定、萘异丙仲胺、氯丙嗪、异丙嗪、羟哌氯丙嗪等。
＜脂质体第一内水相溶液＞
本发明的脂质体组合物的制造方法中，制备第一乳液的工序中使用的第一内水相溶液包含用于形成离子梯度的化合物。
作为形成离子梯度的离子，优选如上所述的质子。另外，作为用于形成离子梯度(pH梯度)的化合物，可列举出例如电离会产生质子、铵离子、质子化氨基的化合物。具体而言，可列举出例如硫酸铵、葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素这样的硫酸盐；氢氧化物；磷酸、葡糖醛酸、柠檬酸、碳酸、碳酸氢盐、硝酸、氰酸、乙酸、苯甲酸、这些酸的盐；溴化物、氯化物这样的卤化物；无机或有机阴离子类；阴离子性聚合物。
通过pH梯度法将弱碱性药物(例如上述列举的药物)包封至本发明的脂质体组合物的内水相(至少第二内水相)中时，药物通过内水相中存在的质子而质子化，从而带有电荷。结果，妨碍药物扩散至脂质体外，药物被保存至脂质体内水相中。
另外，用于形成离子梯度的化合物电离时，产生质子等形成离子梯度的离子(阳离子)并且产生硫酸根离子等阴离子，该阴离子与被质子化的弱碱性药物形成盐或者复合物时，可以进一步将药物稳定地保持在内水相中。即，用于形成离子梯度的化合物可以设为通过电离产生可以与碱性药物形成盐或者复合物的、碱性药物的抗衡离子(阴离子)的化合物。这样的抗衡离子只要是药学上容许的阴离子，就没有特别的限定，最优选硫酸根离子。作为生成硫酸根离子的化合物，一般为硫酸铵，另外也可以从葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素等中选择。另外，作为其它抗衡离子，可列举出氢氧化物、磷酸盐、葡糖醛酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、氰酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、氯化物以及其它无机或有机阴离子类、或者由阴离子性聚合物等电离产生的阴离子。
本发明中，用于形成第一内水相溶液中的离子梯度的化合物的浓度优选为50～500mM，进一步优选为100～300mM。
本发明的脂质体组合物的制造方法中，制备第一乳液的工序中，制备包含脂质的溶液时使用的溶剂为水混溶性溶剂。水混溶性溶剂是指能够溶解用于制造本发明的脂质体组合物的磷脂以及其它膜成分、并且能与水混溶的溶剂。作为水混溶性溶剂，可列举出例如乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇。
不与水混溶的溶剂(也称为水不混溶性溶剂。例如可列举出氯仿这样的水不混溶性的有机溶剂。)不用于本发明。制备第一乳液的工序中使用水不混溶性溶剂时，得到的脂质体不能形成在大脂质体中收容多个小脂质体以及第一内水相的形态，只能简单地形成如泡沫塑料的、单个脂质体集合而成的形态[所谓的多囊脂质体(MVL)]。
作为脂质体原料的脂质的量(磷脂及其它脂质的总计量)优选为水混溶性溶剂的20～100质量%，更优选为20～60质量%。
第一乳液(包含脂质的水混溶性溶剂和包含离子的第一内水相溶液的混合物)中，能够构成脂双层的成分以外的成分可以填满构成本发明的脂质体组合物的第二脂质体的内部区域。第二脂质体的内部区域中也可以混合其它后述的第二内水相溶液的一部分。
对制备第一乳液的方法没有特别的限定，可以使用以往公知的方法。
使用pH梯度法时，可以适宜调整内水相(第一和/或第二脂质体内部区域)的pH。例如，在第一内水相溶液中，使用柠檬酸作为用于形成离子梯度的化合物时，需要预先形成内水相(第二脂质体内部区域)和外水相(第一脂质体内部区域和/或第一脂质体的外部)的pH梯度，此时优选内水相与外水相的pH差为3以上。
另外，使用硫酸铵时，通过化学平衡来形成pH梯度，因此不需要预先调整内水相溶液的pH。此时，第二内水相中使用与外水相相同的溶液时，从第二乳液形成时开始形成离子梯度，通过外液置换来进一步形成梯度。可以认为第二内水相中使用与第一内水相相同的硫酸铵溶液时，在外液置换时已经形成离子梯度。
本发明的脂质体组合物的制备中，包含脂质的水混溶性溶剂与其中加入的第一内水相溶液以体积比(第一内水相溶液/水混溶性溶剂)计可以设为0.7～2.5，优选为1.0～2.0。
＜脂质体第二内水相溶液＞
本发明中，在向包含脂质的水混溶性溶剂中加入第一内水相溶液制备第一乳液后，进而向该第一乳液中加入第二内水相溶液的工序中，对第二内水相溶液没有特别的限定。可列举出例如与第一内水相相同的溶液、HEPES溶液、NaCl溶液、葡萄糖或蔗糖等糖类的水溶液，优选为与第一内水相相同的溶液。另外，第一内水相以及第二内水相均最优选为硫酸铵水溶液。第一乳液与其中加入的第二内水相溶液以体积比[第二内水相溶液/(第一乳液＝第一内水相溶液+水混溶性溶剂)]计可以设为0.7以上，优选为0.7～2.5，特别优选为1.0～1.5。
第二乳液中，能够构成脂双层的成分以外的成分可以填满构成本发明的脂质体组合物的第一脂质体的内部区域(其中不包括第二脂质体)。第一脂质体的内部区域(其中不包括第二脂质体)也可以包含第一乳液的一部分。
对制备第二乳液的方法没有特别的限定，可以使用以往公知的方法。
＜脂质体外水相溶液＞
本发明的脂质体组合物的制造方法包括：通过用于形成该离子梯度的化合物的浓度低于该第一内水相溶液的水溶液来置换该第二乳液的外水相的工序。
通过用于形成离子梯度的化合物的浓度至少低于该第一内水相溶液的水溶液从脂质体第二内水相溶液或者包含脂质体第一内水相溶液以及脂质体第二内水相溶液的混合液中置换制备第二乳液后的第一脂质体的外水相，至少在第二脂质体内部区域和第一脂质体的外部之间形成离子梯度，并且，从脂质体组合物体系内去除水混溶性溶剂，从而可以对所得脂质体赋予本发明的脂质体组合物所具有的形态。
作为本发明的脂质体组合物的制造方法中使用的、用于置换的外水相，使用用于形成离子梯度的化合物的浓度至少低于该第一内水相溶液的水溶液，具体而言，可以使用HEPES溶液、NaCl溶液、葡萄糖或蔗糖等糖类的水溶液。对于外水相的pH，优选利用缓冲剂调节，考虑到脂质的分解以及生物体内给药时的pH差别，期望调整为pH5.5～8.5的范围，更优选pH为6.5～7.5的范围。对于脂质体的内水相和外水相的浸透压，只要将两者的浸透压差调整为脂质体不被破坏的范围的浸透压，就没有特别的限定，考虑到脂质体的物理稳定性，该浸透压差越小越好。
用于置换的外水相是用于形成离子梯度的化合物的浓度低于第一内水相溶液以及第二内水相溶液的水溶液时，可作为优选形态之一而列举出。
本发明的脂质体组合物的制造方法还可包括：利用前述离子梯度的驱动力将药物导入前述脂质体组合物内部的工序。在利用离子梯度的驱动力将药物导入前述脂质体组合物内部的工序中，例如将前述药物溶解于例如水等中，将所得药物溶液加入至脂质体外水相已被脂质体外水相溶液置换后的脂质体混合物中，将其混合，加热至脂质体膜的相变温度以上并搅拌，从而可以制造包封了药物的脂质体。
＜给药方法＞
对本发明的脂质体组合物的给药方法没有特别的限定，优选非口服且局部给药。例如可以选择皮下、肌肉内、腹腔内、髓腔内、硬膜外、脑室内，可根据症状选择适宜的给药方法。作为具体的给药方法，可以利用注射器、喷雾器来给药脂质体组合物。另外，也可以将导管插入体内、例如管腔内、例如血管内，通过该导管进行给药。
实施例
接着，列举实施例来进一步详细说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
按照以下的方法求出各例中制备的包封有药物的脂质体的各浓度以及粒径。
磷脂浓度(mg/mL)：使用高效液相色谱或者磷脂定量而定量的脂质体混悬液中的磷脂浓度。
胆固醇浓度(mg/mL)：使用高效液相色谱定量的脂质体混悬液中的胆固醇浓度。
总脂质浓度(mol/L)：由上述磷脂浓度以及胆固醇浓度算出的作为膜构成成分的脂质的总计摩尔浓度(mM)。
药物浓度(mg/mL)：将上述所得的脂质体组合物用RO水(反渗透膜纯净水)稀释，以使制剂中的总脂质浓度达到约20～30mg/mL，然后将其进一步用甲醇稀释20倍，使脂质体崩解。在该溶液中，使用紫外分光光度计采用高效液相色谱对315nm的吸光度进行定量。用药剂量(mg)/制剂总量(mL)来表示内部包封的盐酸多奈哌齐的浓度。
载药量(药物/总脂质的摩尔比)：脂质体内部包封的盐酸多奈哌齐浓度用上述药剂浓度与上述总脂质浓度的比、药剂/总脂质的摩尔比来表示。
血浆中盐酸多奈哌齐浓度(mg/mL)：处理采集的血浆，最终离心分离得到上清，使用荧光光度计采用高效液相色谱在激发波长(Ex)322nm、检测波长(Em)385nm的荧光下对所述上清进行定量。
粒径(μm)：采用光散射衍射型粒度分布计Beckman CoulterLS230测定的第一脂质体的平均粒径。
以下显示所使用的各成分的简称以及分子量。
HSPC：氢化大豆卵磷脂(分子量790、Lipoid GmbH制造SPC3)
SPC：大豆卵磷脂(分子量779，日油株式会社)
DMPC：二肉豆蔻酰卵磷脂(分子量677.9，日油株式会社)
Chol：胆固醇(分子量388.66，Solvay Chemicals,Inc.制造)
PEG5000‐DSPE：聚乙二醇(分子量5000)－磷脂酰乙醇胺(分子量6081、日油株式会社)
盐酸多奈哌齐(分子量415.95，UINAN CHENGHUI－SHUANFDA Chemical Co.Itd)
＜利用不同内水相进行制备＞
(制备例1～4)
(1)空脂质体的制备
为了使HSPC/Chol＝54/46(摩尔比。以下同样)，分别秤量1.41g的HSPC和0.59g的胆固醇，添加无水乙醇4mL，加温溶解。在溶解的脂质乙醇溶液中添加与乙醇同量(4mL)的加温至约70℃的100mM(制备例1)、150mM(制备例2)、250mM(制备例3)的硫酸铵水溶液或者300mM的柠檬酸水溶液(pH3.0)(制备例4)，加温搅拌约10分钟形成乳液。进而，在该乳液中加入加温至约70℃的20mM HEPES/0.9%氯化钠(pH7.5)10mL，接着加温搅拌约10分钟。将加温结束后的脂质体迅速地用冰冷却。
(2)pH梯度的形成
在上述所得脂质体中加入20mM HEPES/0.9%氯化钠(pH7.5)并分散，以3500rpm离心分离15分钟，使脂质体沉淀。之后去除上清，接着添加pH7.5的20mM HEPES/0.9%氯化钠并分散，同样地离心分离。重复操作3次之后，在pH7.5的20mMHEPES/0.9%氯化钠中再分散，形成pH梯度。
(3)利用pH梯度导入药物
对形成离子梯度后的脂质体中的HSPC以及胆固醇进行定量，求出总脂质浓度。以算出的总脂质浓度为基准，算出使盐酸多奈哌齐(DNP，分子量415.95)/总脂质(mol/mol)比达到0.16的盐酸多奈哌齐量，秤量必要量的DNP后，用RO水制备20mg/mL的DNP溶液(药物溶液)。在65℃下加温的脂质体溶液中以规定量加入预先加温至65℃的DNP溶液之后，接着在65℃下加温搅拌60分钟，从而进行药物的导入。将导入药物后的脂质体迅速地用冰冷却。
(4)未包封药物的去除
在导入药物后的脂质体中添加20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5)，使之分散，以3500rpm离心分离15分钟，使脂质体沉淀。之后去除上清，接着添加20mM HEPES/0.9%氯化钠(pH7.5)，使之分散，同样地离心分离。通过重复操作3次来去除未包封的药物。
对于上述利用本发明的制造方法得到的制备例1～4的脂质体组合物，将第一内水相、膜组成比、载药量(药剂/总脂质摩尔比)以及粒径示于表1中。电子显微镜观察的结果，利用本发明的脂质体组合物如图1所示那样，各脂质体(第一脂质体)中存在有多个囊泡(第二脂质体)，并且各个脂质体外膜由多层脂双层形成。此外，尽管像这样具有厚的多层脂双层且内部包含同样具有多层脂双层的多个囊泡，但仍然可以在形成脂质体后在内部与外部之间形成对药物导入而言为充分的pH梯度，可以随着该pH梯度高效率地包封药物。
图1为用透射型电子显微镜(TEM)观察本申请实施例的制备例2中制造的、导入药物后的脂质体的截面的照片。倍率为3万2千倍。图1中所示的脂质体基本在脂质体的中央处被分割。图1中所示的脂质体组合物具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜。图1中，第一脂质体的外径为约4μm，第二脂质体的外径为100～800nm。
另外可知，对于上述利用本发明的制造方法得到的制备例1～4的脂质体组合物，药物的包封量随内水相的硫酸铵浓度的增加而提高。可以认为这是因为，药物的保持能力随内水相中残留的质子量而提高。因此，可以认为为了得到更高的药物包封量，150mM以上的硫酸铵浓度是优选的。另外，内水相使用pH3.0的柠檬酸溶液来代替硫酸铵时，同样也可以得到高药物包封量的脂质体。
[表1]
＜不同的内水相容量的研究＞
(制备例5)
为了使HSPC/Chol＝54/46，分别秤量1.41g的HSPC和0.59g的胆固醇，溶解于乙醇溶液4mL。溶解后，对该脂质乙醇溶液加入2倍量(8mL)的150mM硫酸铵水溶液，加温搅拌约10分钟。之后，加入19mL的150mM硫酸铵水溶液，接着加温搅拌约10分钟。之后，与制备例1～4同样地形成pH梯度、导入药物以及去除未包封的药物。结果，如表1所示那样，与制备例1～4同样地可以得到高药物包封量。
(制备例6)
使用烷基链长度较短的DMPC作为磷脂。为了使DMPC/Chol＝54/46，分别秤量2.70g的DMPC和1.30g的胆固醇，溶解于4mL的乙醇溶液中。之后，加入4mL的150mM硫酸铵水溶液，加温搅拌约10分钟。之后，加入10mL的150mM硫酸铵水溶液，接着加温搅拌约10分钟。之后，与制备例1～4同样地形成pH梯度、导入药物以及去除未包封的药物。
结果可知，如表1所示，磷脂的烷基链长度较短时，与制备例1～4同样地可以得到高药物包封量。
＜利用离子梯度法以外的方法(被动法)进行DNP脂质体的制备＞
(比较例1)
在药物的导入中，使用作为现有方法的被动法来代替离子梯度法。被动法是指预先在内水相中溶解药物来制备脂质体的方法。在第一内水相溶液的生理盐水中预先溶解规定量的盐酸多奈哌齐，之后与制备例1～4同样地制备脂质体。另外，外水相中也使用生理盐水。
结果可知，如表2所示，与利用本发明的方法的脂质体比较，被动法的包封效率以及药物包封量显著低。进而，采用体外(invitro)评价体系对比较例1和利用本发明的脂质体组合物的药物释放性进行比较，结果可知，比较例1比本发明显著地快速释放。
由以上可知，临床上为了确保充分的药物包封量且得到长期缓释性，采用离子梯度法、特别是pH梯度法导入药物是重要的，并且通过采用离子梯度法、特别是pH梯度法进行导入，由于药物在内部被质子化且脂质体具有如图1所示的层状结构，因而可以得到更长期的缓释性。
[表2]
＜利用不同制造方法进行多奈哌齐脂质体的制备＞
(比较例2)挤出法－1(粒径300nm左右)
为了使HSPC/Chol＝54/46，分别秤量0.71g的HSPC和0.29g的胆固醇，添加无水乙醇1mL，加温溶解。在所得脂质乙醇溶液1mL中添加加温至约70℃的250mM硫酸铵水溶液(内水相)9mL，边加温边置于超声波装置中搅拌，制备粗脂质体混悬液。使该粗脂质体混悬液依次通过加温至约70℃的挤出机(TheExtruder T.10、Lipexbiomembranes Inc.)上安装的过滤器(孔径0.4μm×5次Whatman公司)，制备300nm左右的空脂质体。接着，将脂质体维持在加温状态，以相对于总脂质达到0.75mol%的方式直接添加PEG5000－DSPE的水溶液(37.7mg/mL)，加温搅拌，从而用PEG修饰脂质体的膜表面(外表面)。将加温结束后的脂质体迅速地用冰冷却。使用用外水相溶液(20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5))充分置换过的凝胶过滤上述用冰冷却的PEG修饰后的脂质体，进行外液置换。之后，以相对于总脂质的药物/总脂质(mol/mol)＝0.16的方式进行药物导入。接着，使用用20mM HEPES/0.9%氯化钠溶液(pH7.5)充分置换过的凝胶过滤，去除未包封的药物。
(比较例3)挤出法－2(粒径1～2μm左右)
与比较例2同样地使用挤出机进行制备，挤出机中使用孔径2μm的过滤器，通过该过滤器5次，得到空脂质体。药物的导入以及去除未包封的药物与比较例2同样地进行，得到1～2μm左右的多层脂质体。
(比较例4)脂质膜导入法
在溶解有HSPC以及多奈哌齐的乙醇溶液中加入pH6.5的柠檬酸盐酸水溶液作为第一内水相溶液，在脂质膜内部包封盐酸多奈哌齐。除此以外，与比较例1同样地制备，得到多奈哌齐脂质体。
比较例2～4中得到的多奈哌齐脂质体的第一内水相、膜组成比、载药量(药剂/总脂质摩尔比)以及粒径示于表3中。
结果，采用挤出法制备的粒径小的脂质体组合物(比较例2以及3)可以得到高药物包封量。另一方面，在脂质膜内部包封药物的制剂(比较例4)的药物/总脂质比较低，包封效率为33%左右。
[表3]
＜多奈哌齐脂质体的药物动力学1＞
对制备例2、3、4以及比较例2、3、4中制备的多奈哌齐脂质体组合物以及多奈哌齐单体进行药物动力学试验。以表4中所示的容量作为盐酸多奈哌齐量对大鼠背部皮下给药多奈哌齐脂质体组合物。另外，盐酸多奈哌齐单体中，也进行皮下给药以及静脉内给药。给药后，经过1、4、8、24、48、72、96、168、192、216、240、264、336小时后，由尾静脉取血，离心分离(6000rpm，10分钟，4℃)，分取血浆。处理得到的血浆，采用高效液相色谱对血浆在激发波长(Ex)322nm、检测波长(Em)385nm下的荧光强度进行定量，求出各血浆中的盐酸多奈哌齐的浓度。将结果示于图2以及图3中。
[表4]
如图2所示，静脉内给药或者皮下给药盐酸多奈哌齐单体时，血浆中盐酸多奈哌齐浓度在给药后急剧减少，分别仅能在给药后8小时内以及48小时内检测出。可以确认比较例2中制备的300nm左右的脂质体组合物与多奈哌齐单体相比，没有突释(initial burst)、缓释至48小时，但是给药48小时后已经下降10ng/mL。由于可以预想到也许粒径小至约300nm时，易于在给药部位扩散、脂质体整个转移至淋巴结、血液，因此可以认为脂质体的形态会迅速消失，得不到期待的缓释性。另外，对于脂质膜中包封了药物的比较例4，初期的释放量多，之后，血药浓度急剧地降低，得不到持续的缓释性。可以认为也许是由于盐酸多奈哌齐的脂质膜透过性高，因此包封至膜中时不能保持稳定，结果显示出快速释放性。
另一方面，如图3所示，可以确认由本发明的制备例2、3、4得到的脂质体组合物也没有突释、缓释时间显著延长，可以得到约2周的缓释性。本发明的脂质体组合物如图1所示，各脂质体内含有多个囊泡，而且该脂质体被具有数层层状结构的厚脂质膜所覆盖，因此可以认为药物的脂质膜透过性因这些结构而受到抑制，进而通过pH梯度法来保持药物，因此释放性被进一步抑制，结果可以得到显著的长期缓释性。特别是，由于内水相中存在硫酸根离子(制备例2、3)，缓释时间进一步延长，因此暗示了优选在内水相溶液中使用硫酸铵。可以认为这是因为内水相中质子化的药物与硫酸根离子相互作用，因而使释放速度进一步被抑制，可以实现长期缓释性。
由以上可知，为了抑制突释、实现更长期的缓释性，重要的是，脂质体具有图1那样的形态，并且采用pH梯度法包封药物，更优选内水相中存在硫酸根离子。
另外，比较例3的挤出机制备的约1.7μm的脂质体组合物的高血药浓度维持了4天，之后急剧地降低。
＜多奈哌齐脂质体的药物动力学2＞
利用本发明的脂质体组合物由于可以得到高药物包封量，因此可以提高皮下给药的药物给药量。因而，对于制备例5、6制备的多奈哌齐脂质体组合物，以50mg/kg的盐酸多奈哌齐量对大鼠背部皮下给药多奈哌齐脂质体组合物。进而，作为比较，对大鼠背部皮下给药5mg/kg的多奈哌齐单体。对于多奈哌齐单体，在给药后、经过0.5、1、5、10、30、120、480、1440、2880分钟后由尾静脉取血。另一方面，对于脂质体组合物，在给药后、经过1、3、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、264、288、312、336小时后由尾静脉取血。取血后，与＜多奈哌齐脂质体的药物动力学1＞同样地处理，求出各血浆中的盐酸多奈哌齐浓度。将结果示于图4。
[表5]
如图4所示那样，多奈哌齐单体在给药后0.5小时显示出最大血药浓度，之后急剧地减少。48小时后已经在检测限以下。
另一方面，制备例5、6中制备的利用本发明的脂质体组合物也没有突释，临床上可以将充分的有效浓度持续14天。特别是，制备例5可以将血药浓度20～30ng/mL稳定地保持14天。进而，由于显示出还可以期待14天以上的缓释性的分布图(profile)，因此可知其作为持续缓释制剂是优异的制剂。
＜第一内水相/乙醇比率以及第二内水相/(第一内水相+乙醇)比率的研究＞
(制备例7～11以及比较例5～7)
为了使HSPC/Chol＝54/46，分别秤量1.41g的HSPC和0.59g的胆固醇，添加无水乙醇4mL，加温溶解。溶解后，对该脂质乙醇溶液以表1所示的比率分别添加加温至约70℃的150mM硫酸铵水溶液(第一内水相)，加温搅拌约10分钟。接着，以相对于(第一内水相+乙醇)的容量为表1所示的比率分别添加第二内水相(20mM HEPES/0.9%氯化钠缓冲液(pH7.5))，进而，加温搅拌约10分钟。之后，与制备例1、2同样地形成pH梯度、药物的导入以及去除未包封的药物。
表1示出制备例7～11以及比较例5～7中制备的脂质体组合物的第一内水相/乙醇比率以及第二内水相/(第一内水相+乙醇)比率、载药量(药剂/总脂质摩尔比)以及粒径。
另外，表6对于制备例2、5、7～11以及比较例5～7的载药量进行比较。
结果可知，制备例7～11可以得到与制备例2、5同等的载药量，可以得到比较高的药物包封量。另外，体外的释放性也显示出几乎相同的性能。
另一方面，比较例5的药物包封量显著低。可以认为由于第一内水相/乙醇的比率低，因此第一乳液不能分明地形成，由该影响而形成脂质团(脂质的聚集体)样的物质。另外，对于比较例6以及7，可以认为由于第一内水相/乙醇比率高，因此此时形成稳定的1个大脂质体样的物质，第二内水相难以对这些结构产生影响。进而，可观察到这些比较例5、6、7的体外释放性与制备例2、5、7～11比较存在初期的释放速度高的倾向。由这些结果推定，比较例5、6、7不能成为内水相分明地形成的结构，结果由于无法稳定地将充分量的药物包封至内水相中，药物包封量略降低、初期的释放迅速。另一方面，可以认为比较例3虽然具有多层膜，但是由于内侧为具有1个大内水相的结构，因此脂质膜的层非常薄。结果，可以认为药物包封量非常高，且释放也非常高。
[表6]
＜本发明的盐酸布比卡因脂质体的制备＞
(制备例12、13)
与制备例1～4同样地，为了使HSPC/Chol＝54/46，分别秤量4.23g的HSPC和1.76g的胆固醇，溶解于乙醇溶液24mL。溶解后，对该脂质乙醇溶液加入等量(24mL)的150mM或者250mM硫酸铵水溶液，加温搅拌约10分钟。然后，加入76.8mL的150mM或者250mM硫酸铵水溶液，加温搅拌约10分钟之后，迅速地用冰冷却。接着，采用离心分离，将外水相变更为pH6.5的10mM柠檬酸/0.9%氯化钠，形成离子梯度。
之后，与制备例1～4同样地进行药物的导入。使用盐酸布比卡因作为药物。秤量必要量的盐酸布比卡因(BPV)后，采用RO水制备10mg/mL的BPV溶液(药物溶液)，在65℃下加温搅拌60分钟，进行药物的导入。药物导入后的脂质体迅速地用冰冷却。接着，未包封药物的去除也与制备例1～4同样地进行。
结果可知，如表1所示，使用盐酸布比卡因时也与多奈哌齐脂质体同样地，可以得到比较高的药物包封量。由此可知，具有图1的结构的脂质体也可以采用pH梯度法导入盐酸布比卡因。
＜盐酸布比卡因脂质体的药物动力学＞
进行制备例12中制备的盐酸布比卡因脂质体以及盐酸布比卡因单体的药物动力学试验。关于给药量，以表7所示容量的盐酸布比卡因量对大鼠背部皮下进行给药。盐酸布比卡因脂质体组合物在给药后、经过1、24、72、120、168小时后，采集给药部位的背部皮下组织并进行匀浆处理，另一方面，盐酸布比卡因单体在给药后、经过0.5、4、24小时后，采集给药部位的背部皮下组织并进行匀浆处理。接着处理匀浆溶液，采用高效液相色谱对所得试样溶液进行定量(紫外可见分光光度计，测定波长210nm)，求出给药部位的背部皮下组织中残存的盐酸布比卡因浓度。将结果示于图5。盐酸布比卡因单体的给药部位残留率在给药4小时后下降至1%。由此可知盐酸布比卡因单体在数小时内从给药部位消失，暗示了难以得到持续的血药浓度。另一方面，盐酸布比卡因脂质体可以得到从给药部位持续地消失的分布图，在给药后的第7天残存有约35%的盐酸布比卡因。由此暗示了给药的脂质体在给药部位持续地释放盐酸布比卡因。由以上可知，本发明中得到的盐酸布比卡因脂质体具有1周以上的长期缓释能。
[表7]
＜利用本发明的盐酸罗哌卡因脂质体的制备＞
(制备例14)
除了使用盐酸罗哌卡因作为药物之外，与制备例2同样地制备脂质体组合物，得到盐酸罗哌卡因脂质体。
由结果可知，如表1所示那样，使用盐酸罗哌卡因时也可以同样地采用pH梯度法进行导入，可以得到具有较高药物包封量的脂质体组合物。另外，由于显示了与体外释放性显示出持续缓释性的盐酸多奈哌齐脂质体以及盐酸布比卡因脂质体同等的释放分布图，因此暗示了同样地具有缓释性。
＜利用本发明的盐酸曲马多脂质体的制备＞
(制备例15)
除了使用盐酸曲马多作为药物之外，与制备例3同样地制备脂质体组合物，得到盐酸曲马多脂质体。
结果可知，如表1所示，使用盐酸曲马多时也可以同样地采用pH梯度法进行导入，可以得到具有较高药物包封量的脂质体组合物。

Claims (9)

1.一种脂质体组合物，其具有第一脂质体和多个第二脂质体，所述第一脂质体具有由多层脂双层形成的外膜；所述第二脂质体收容在由该外膜界定的第一脂质体内部区域中、并具有由多层脂双层形成的外膜，所述脂质体组合物具有由该第二脂质体的外膜界定的第二脂质体内部区域，并且至少该第二脂质体内部区域与所述第一脂质体的外部之间形成有离子梯度，
脂质体组合物的脂双层组成为磷脂以及胆固醇，所述磷脂为氢化大豆卵磷脂即HSPC，或者所述磷脂为二肉豆蔻酰卵磷脂即DMPC，所述HSPC/胆固醇以摩尔比计为54/46，所述DMPC/胆固醇以摩尔比计为54/46，
所述离子梯度为质子浓度梯度，所述第二脂质体内部区域的pH、或者所述第二脂质体内部区域以及所述第一脂质体的内部区域的pH比所述第一脂质体的外部的pH低，
所述脂质体组合物是通过包括如下工序的制造方法而得到的：
相对于包含脂质的水混溶性溶剂，混合以体积比计为0.7～2.5的、包含用于形成该离子梯度的化合物的第一内水相溶液来制备第一乳液的工序；
相对于该第一乳液，混合以体积比计为0.7～2.5的第二内水相溶液来制备第二乳液的工序；
通过用于形成该离子梯度的化合物的浓度低于该第一内水相溶液的水溶液来置换该第二乳液的外水相的工序，
使用酸性pH的缓冲液作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体，
或者，使用硫酸铵溶液作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体。
2.根据权利要求1所述的脂质体组合物，其中，在第一内水相和/或第二内水相中，使用柠檬酸作为用于形成离子梯度的化合物。
3.根据权利要求1所述的脂质体组合物，其中，所述第一脂质体具有1～20μm范围内的平均粒径。
4.根据权利要求1或3所述的脂质体组合物，其中，所述第二脂质体内部区域、或者所述第二脂质体以及所述第一脂质体的内部区域中含有药物。
5.根据权利要求4所述的脂质体组合物，其中，含有相对于总脂质以摩尔比(mol/mol)计为0.05以上的所述药物。
6.一种脂质体组合物的制造方法，其为在外膜的内部与外部之间形成有离子梯度的脂质体组合物的制造方法，其包括：
相对于包含脂质的水混溶性溶剂，混合以体积比计为0.7～2.5的、包含用于形成该离子梯度的化合物的第一内水相溶液来制备第一乳液的工序；
相对于该第一乳液，混合以体积比计为0.7～2.5的第二内水相溶液来制备第二乳液的工序；
通过用于形成该离子梯度的化合物的浓度低于该第一内水相溶液的水溶液来置换该第二乳液的外水相的工序，
所述脂质体组合物的脂双层组成为磷脂以及胆固醇，所述磷脂为氢化大豆卵磷脂即HSPC，或者所述磷脂为二肉豆蔻酰卵磷脂即DMPC，所述HSPC/胆固醇以摩尔比计为54/46，所述DMPC/胆固醇以摩尔比计为54/46，
使用酸性pH的缓冲液作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体，
或者，使用硫酸铵溶液作为第一内水相和/或第二内水相来形成脂质体。
7.根据权利要求6所述的脂质体组合物的制造方法，其中，所述离子梯度为质子浓度梯度。
8.根据权利要求6或7所述的脂质体组合物的制造方法，其还包括：利用所述离子梯度的驱动力将药物导入所述脂质体组合物内部的工序。
9.根据权利要求6所述的脂质体组合物的制造方法，其中，第一内水相溶液/水混溶性溶剂以体积比计为0.7～2.5、第二内水相溶液/(第一内水相溶液+水混溶性溶剂)以体积比计为0.7～2.5。
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