JP3270478B2 - 強化されたドラッグ・デリバリーのためのスフィンゴソーム - Google Patents

強化されたドラッグ・デリバリーのためのスフィンゴソーム

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JP3270478B2 JP50143496A JP50143496A JP3270478B2 JP 3270478 B2 JP3270478 B2 JP 3270478B2 JP 50143496 A JP50143496 A JP 50143496A JP 50143496 A JP50143496 A JP 50143496A JP 3270478 B2 JP3270478 B2 JP 3270478B2
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    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は、引用により本明細書中に取り込む、1994年
６月20日に出願された米国逐次番号第08/263,603号の一
部継続である。
本発明の背景 治療的に活性な薬物のリポソーム配合品は、遊離形態
において注射される薬物を超えるかなりの利点をもつ。
Weinstein,Liposomes:From Biophysics to Therapeutic
s,（Ostro,M.J.,ed.）,Marcel Dekker,Inc.,NY,pp.277
−338,（1987）。例えば、抗癌アルカロイド、ビンクリ
スチン（vincristine）のリポソーム配合品は、遊離の
ビングリスチンがもつよりも、L1210白血病細胞に対し
て大きな効果をもち、そして減少された側枝毒性をも
つ。Mayer et al.,Cancer Chemother,Pharmacol.33:17
−24（1993）及びMayer et al.,Cancer Res.50:575−57
9（1990）。臨床及び／又は医薬的効力をもつ治療剤の
リポソーム配合品の開発は、生物学的効力と長期間を化
学的安定性の両方を有するリポソーム／薬物の組合せに
依存する。一般に、リポソーム剤の効力は、そのリポソ
ームの循環寿命とそのリポソームが封入された薬物を保
持する能力の両方を増加させることにより改善されるこ
とができる。Mayer、同じ箇所に、及びBoman et al.,Ca
ncer Res.54:2830−2833（1994）。それ故、多くの努力
が、延長された循環時間と強化された薬物保持の両方を
もつ治療用化合物のリポソーム配合品の開発に集中して
きた。
多種多様の治療剤が、トランスメンブランpH勾配を使
用することにより100％に達する封入効率をもつリポソ
ーム内に充填されることができる。Mayer et al.,Bioch
im.Biophys.Acta 1025:143−151（1990）及びMadden et
al.,Chem.Phys.Lipids 53:37−46（1990）。これらの
配合品の化学的安定性、すなわち、インビボにおける循
環の間の、そのリポソーム内での充填薬物の有効な保持
は、しばしば、そのリポソーム内pHが、pH2.0〜4.0の間
のレンジにあることを要求する。しかしながら、このpH
レンジ内では、リポソームのアシル成分の酸加水分解
は、そのリポソーム膜を不安定にし、そしてその薬物の
未成熟な漏れをもたらすことができる。
例えば、ビンクリスチンは、4.0のリポソーム内pHを
使用するpH勾配依存性封入手順によりリポソーム内に効
率よく充填されることができる。Mayer et al.,Biochi
m.Biophys.Acta 1025:143−151（1990）及びMayer et a
l.,Cancer Res.50:575−579（1990）。リポソーム・ビ
ンクリスチンに関する研究は、ホスファチジルコリン
（PC）、通常、卵PC又はジステアロイル−PC、及びコレ
ステロールを含む小胞に基づくものであった。Mayer et
al.,1993、上掲。リポソーム・ビンクリスチンの増加
された抗−腫瘍効力は、そのリポソーム内でのビンクリ
スチンのインビボ保持が100倍大きなトランスメンブラ
ンpH勾配（すなわち、リポソーム内pH＝2.0）を使用し
て増加されるときに、生じる。Boman et al.,上掲。し
かしながら、このpHにおいては、このリポソームのPC成
分の酸加水分解は、かなりの速度で生じ、そしてそのリ
ポソームの化学的安定性を極めて限定する。特に、Sn−
１とSn−２位における脂肪酸のカルボン酸エステルは、
特に酸加水分解を受け易く、リゾ−PC及び遊離の脂肪酸
を作り出す。Grit et al.,Chem.Phys.Lipids 64:3−18
（1993）。かなりの割合のリゾ−PCを含むリポソーム
は、溶質に対しより透過性であり、そしてそれ故、ドラ
ッグ・デリバリー媒体として好適でないであろう。
スフィンゴミエリンがリポソームの循環寿命における
増加を付与することが報告されている。Allen et al.,B
iochim.Biophys.Acta 981:27−35（1989）及びAllen et
al.,FEBS Lett.223:42−46（1987）。しかしながら、
これらの研究は、リポソーム分布についてのマーカーと
して捕獲された水性溶質（125I−チラミニルイヌリン（
125I−tyraminylinulin））を使用し、そしてスフィン
ゴミエリンの存在中でのリポソーム寿命における見かけ
の増加は、スフィンゴミエリンによる増加された溶質保
持から少なくとも部分的に生じたのかもしれない。スフ
ィンゴミエリン含有リポソームがPC−含有リポソームよ
りもより毒性であるといういくつかの報告もある。Weer
eratne et al.,Brit.J.Exp.Pathol.64:670−676（198
3）,Allen et al.,J.Pharmacol.Exp.Jherap.229:267−2
75（1984）、及びAllen et al.,Res.Commun.Chem.Patho
l.Pharmacol.50:281−290（1985）。より多くの結論的
な研究は利用することができないけれども、その認知
（理解）は、スフィンゴミエリン含有リポソームが、増
加された毒性リスクに関連するということである。
増加された生物学的及び化学的安定性をもつ治療用化
合物のリポソーム配合品が、本分野において必要とされ
る。リポソーム剤の効力は、そのリポソーム循環時間及
びそのリポソームが封入された薬物を保持する能を増加
させることにより、改善されることができるので、これ
らの特性をもつリポソーム配合品の開発は、臨床的な処
置養生法に対する価値のある付加であるであろう。きわ
めて驚くべきことに、本発明は上記の及び他の関連した
必要性を満たす。
本発明の要約 本発明は、哺乳類宿主への治療用化合物のデリバリー
のためのリポソーム組成物を提供する。本組成物は、ス
フィンゴミエリン及びコレステロールを含んで成る１以
上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム外部のpHより
も低いpHをもつリポソーム内部、及びその宿主へのデリ
バリーのためにそのリポソーム内に包含された治療用化
合物、を含んで成る。スフィンゴミエリンとコレステロ
ールは、典型的には、それぞれ、75/25モル％／モル％
から、30/50モル％／モル％までのモル比で存在し、そ
して、好ましい例においては、それぞれ、約55/45モル
％／モル％の比にある。親油性治療用化合物は、アルカ
ロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ス
ワインゾニン（swainsonine）又はエトポジド（etoposi
de）又はそれらのプロドラッグであることができる。薬
物、例えば、ビンクリスチンは、約0.01/1.0〜0.2/1.0
（重量／重量）の、薬物対脂質比で存在することができ
る。スワインゾニンは、0.01:1.1〜0.5:1.0（モル：モ
ル）の、薬物対脂質比で存在することができる。標的化
リガンドと他の脂質は、それらがその薬物及びリポソー
ムの安定性に悪影響を及ぼさない限り、そのリポソーム
の成分として存在することもできる。これらのリポソー
ムは、単ラメラ又は多ラメラであることができ、そして
典型的には、約0.05ミクロン〜0.45ミクロンの、そして
より好ましくは、約0.05ミクロン〜0.2ミクロンの平均
直径をもつであろう。リポソームの内部は、典型的に
は、約pH2〜pH5のpHをもち、例えば、pH約４においてク
エン酸塩バッファーを含むであろう。
他の態様においては、本発明は、pH2よりも大きな酸
性pHをもつ第１緩衝液化水溶液中にスフィンゴミエリン
とコレステロールを含む混合物から作られた、治療用化
合物のデリバリーのためのリポソームを提供する。次に
このリポソームは、上記第１緩衝液化水溶液のpHよりも
大きなpHをもつ第２緩衝液化水溶液中に懸濁され、それ
により、そのリポソームへの上記治療用化合物の輸送を
容易にするトランスメンブランpH勾配を作成する。いく
つかの態様においては、低いリポソーム内pHにおける薬
物捕獲の他の受動的手段を、本工程において使用するこ
ともできる。これらの他工程は、典型的には、薬物のよ
り効率の低い薬物捕獲に関連し、そしてそれ故、遊離の
薬物を含む第２バッファーからそのリポソームを分離す
る追加の段階が必要かもしれない。
本発明は、治療のための、宿主への親油性治療用化合
物、例えば、アルカロイドの強化されたデリバリーのた
めの方法をも提供する。治療の必要な宿主、例えば、腫
瘍を患う患者に、スフィンゴミエリンとコレステロール
を含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソ
ーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及び
その宿主へのデリバリーのためにそのリポソーム内に包
含された治療用化合物又は医薬として許容されるその塩
を含んで成る、リポソーム組成物が投与される。そのpH
勾配は、メチルアンモニウム又はエタノールアンモニウ
ム濃度勾配により生成されることができる。典型的に
は、コレステロールは、30％〜50％の合計モル比におい
てリポソーム組成物中に存在するであろう。そしてより
好ましくは、スフィンゴミエリンとコレステロールは、
それぞれ約75/25モル％／モル％〜それぞれ30/50モル％
／モル％の比において存在する。アルカロイド化合物、
例えば、ビンクリスチン又はスワインゾニンのデリバリ
ーは、上記の方法において特に好適である。ビンクリス
チンとスワインゾニンは、それぞれ、約0.01/1.0〜0.2/
1.0（重量／重量）、そしてそれぞれ、0.01/1.0〜0.5/
1.0（モル／モル）の、薬物対脂質比において存在する
ことができる。いずれの場合においても、上記薬物を含
むリポソーム組成物は、その疾患、例えば、腫瘍を抑制
又は治療するために十分な薬物の濃度であるが、その宿
主に対して許容できない毒性を引き起こす量未満である
ものを維持するように、その宿主に繰り返して投与され
ることができる。投与はさまざまな経路によるものであ
ることができるが、アルカロイド類は、好ましくは、静
脈内又は非経口的に与えられる。スワインゾニンは、便
利には、経口投与される。宿主に投与されるリポソーム
は、0.05〜0.45ミクロンの、より好ましくは0.05〜0.2
ミクロンの平均直径をもつ単ラメラであることができ
る。
本発明は、宿主にリポソーム組成物中のアルカロイド
免疫調節化合物をデリバリーするための方法をも提供す
る。宿主は、化学療法により誘発された免疫抑制を患う
ものであることができ、そして例えば、スワインゾニン
のリポソーム組成物により治療されることができる。リ
ポソーム組成物は、スフィンゴミエリンとコレステロー
ルを含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポ
ソーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及
びその宿主へのデリバリーのためのそのリポソーム内に
包含された治療用化合物又は医薬として許容されるその
塩を含んで成る。好ましくは、スワインゾニンは、経
口、静脈内、又は非経口で与えられる。
図面の簡単な説明 図１は、0.3Mシトレート、pH2.0,37℃における、DSPC
/Chol（55/45,mol/mol）（○）,SM/Chol（55/45,mol/mo
l）（●）の大きな単ラメラ・リポソームの加水分解を
示す。
図2Aと図2Bは、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）（○）,S
M/Chol（55/45,mol/mol）（●）又はSM/Chol/PEG−PE
（55/40/5,mol/mol/mol）（■）の大きな単ラメラ・リ
ポソームを注射されたBDF1マウスにおける循環中内に残
存する脂質の量を示す。注射されるリポソームは、空で
あるか（図2A）又は約0.1の薬物／脂質化においてビン
クリスチンを充填されていた（図2B）。注射された脂質
投与量は、約430μｇの脂質の合計注射に対応して、20m
g/kgであった。
図３は、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）（○）,SM/Chol
（55/45,mol/mol）（●）又はSM/Chol/PEG−PE（55/40/
5,mol/mol/mol）（■）の大きな単ラメラ・リポソーム
の注射後の各時間におけるBDF1マウスの血漿中のビンク
リスチン／脂質比を示す。マウスに、20mg/kgの脂質投
与量及び2.0mg/kgのビンクリスチン投与量に対応する、
約0.1のビンクリスチン／脂質比において、リポソーム
を注射した。注射された合計量は、約430μｇの脂質及
び43μｇのビンクリスチンであった。
図４は、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）（○）,SM/Chol
（55/45,mol/mol）（●）又はSM/Chol/PEG−PE（55/40/
5,mol/mol/mol）（■）の大きな単ラメラ・リポソーム
の注射後の各時間におけるBDF1マウスの血漿中に残存す
る合計ビンクリスチンを示す。マウスに、20mg/kgの脂
質投与量及び2.0mg/kgのビンクリスチン投与量に対応し
て、約0.1のビンクリスチン／脂質比において、リポソ
ームを注射した。注射された合計量は、約430μｇの脂
質及び43μｇのビンクリスチンであった。
図５は、腹膜マクロファージによる、SM/Chol（55/4
5,mol/mol）及びDSPC/Chol（55/45,mol/mol）の大きな
単ラメラ・リポソームの取り込みを示す。非交換性及び
非代謝性放射標識14C−CHDEを含むリポソームを、非経
口で100mg/kgにおいて注射した。４時間後、マクロファ
ージを洗浄により回収し、そして細胞と脂質を、それぞ
れ、血球計と液体シンチレーション・カウンティングに
より測定した。
図６は、P388腫瘍中へのビンクリスチンのローディン
グを示す。0.1（重量／重量）の薬物／脂質比において
ビンクリスチンを含む、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）
（○）,SM/Chol（55/45,mol/mol）（●）又はSM/Chol/P
EG−PE（55/40/5,mol/mol/mol）（■）の大きな単ラメ
ラ・リポソームの静脈内注射後のBDF1マウスにおける腹
膜P388腫瘍へのビンクリスチンのデリバリー。ビンクリ
スチンを20mg/kgの脂質投与量を表す、2.0mg/kgの投与
量において注射した。
図7A−7Cは、ビンクリスチンのリポソーム配合品の抗
腫瘍効力を集合的に示す。P388腫瘍を含むBDF1マウス
に、0.1（重量／重量）の薬物／脂質比においてビンク
リスチンを含む、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）（▽）,S
M/Chol（55/45,mol/mol）（□）又はSM/Chol/PEG−PE
（55/40/5,mol/mol/mol）（△）の大きな単ラメラ・リ
ポソームを注射した。注射に先立ってリポソーム濃度
を、1.0（図7A）,2.0（図7B）及び4.0（図7C）mg/kgの
ビンクリスチン投薬を達成するように調整した。
図８は、リポソーム配合品（Ｌ−Im）又は遊離薬物の
水溶液（Ｆ−Im）のいずれかとして投与されたBalb/cマ
ウスにおける放射標識されたスワインゾニンの血中レベ
ルを示す。配合品を、胃管栄養法による経口（p.o.）、
腹腔内（i.p.）、又は静脈内（i.v.）により、投与し
た。血液を、上記投薬の１時間、３時間、６時間、及び
24時間後に採取した。
図９は、C57BL/6マウスへの化学療法薬投与の14日後
の骨髄細胞質に対するGM−CSF及びスワインゾニンの効
果を示す。
図10Aと10Bは、化学療法薬処置の14日後にC57BL/6マ
ウスから採取された、それぞれ、LPS刺激脾臓細胞から
のTNF生産、及びConA刺激脾臓細胞からのIL−２生産を
示す。
図11Aと11Bは、A431腫瘍担持SCIDマウスにおける遊離
ビンクリスチン及びリポソーム・ビンクリスチンの投与
後の（Ａ）血漿及び（Ｂ）腫瘍中のビンクリスチン・レ
ベルを示す。２つのA431腫瘍担持SCIDマウスに、遊離の
ビンクリスチン（□）を、又は0.1（重量／重量）の薬
物／脂質比においてビンクリスチンを含むDSPC/Chol
（○）又はSM/Chol（●）の大きな単ラメラ・リポソー
ムを、静脈内注射した。ビンクリスチンを、20mg/kgの
投与量の脂質を表す、2.0mg/kgの投与量において注射し
た。データは、３匹のマウス（６腫瘍）の平均（±標準
誤差）を表す；図中、標準誤差のバーは見えない。それ
らは、その記号のサイズよりも小さい。
図12は、A431腫瘍を担持するSCIDマウスにおける遊離
ビンクリスチン及びリポソーム・ビンクリスチンの抗腫
瘍効果を示す。２つのA431腫瘍を担持するSCIDマウス
は、処置を受けず（■）又は、遊離ビンクリスチン
（□）を、又は0.1（重量／重量）の薬物／脂質比にお
いてビンクリスチンを含むDSPC/Chol（○）又はSM/Chol
（●）の大きな単ラメラ・リポソームを静脈内注射され
た。ビンクリスチンは、20mg/kgの投与量の脂質を表
す、2.0mg/kgの投与量において注射された。データは、
（処置直前の腫瘍重量のパーセントとして表された）A4
31腫瘍の重量を表し、そして４〜５匹のマウスにおける
８〜10腫瘍の平均（±標準誤差）である。
図13は、pH2で37℃においてインキュベートされたリ
ポソーム内のスワインゾニンの時間にわたるパーセント
保持を示す。スワインゾニンは、0.3Mシトレート、pH4
を使用して0.2/1.0（mol/mol）の薬物対脂質比において
リポソーム内に充填された（pH2におけるSM/Cholを除
く。）。EPC、卵ホスファチジル・コリン;EPC/Chol、卵
ホスファチジル・コリン／コレステロール（55％/45
％）（mol/mol）;SM/Chol、スフィンゴミエリン／コレ
ステロール（55％/45％）（mol/mol）。
図14は、HEPES緩衝液化生理食塩水（HBS）,pH7.5中38
℃においてインキュベートされたリポソーム内のスワイ
ンゾニンの時間にわたるパーセント保持を示す。
図15は、正常マウス血清中37℃においてインキュベー
トされたリポソーム内のスワインゾニンの時間にわたる
パーセント保持を示す。
特定の態様の説明 本発明は、宿主への治療化合物の強化されたデリバリ
ーのための組成物及び方法を提供する。本発明のリポソ
ーム配合品は、延長された循環寿命及び／又は強化され
た薬物保持をもつ。“スフィンゴソーム（sphingosome
s）”ともいわれるリポソームは、スフィンゴミエリン
とコレステロールから成り、そして酸性のリポソーム内
pHをもつ。スフィンゴミエリンとコレステロールに基づ
くリポソーム配合品は、他の配合品と比較するときいく
つかの利点をもつ。スフィンゴミエリン／コレステロー
ルの組合せは、酸加水分解に対しかなり高い安定性をも
ち、有意に良好な薬物保持特性をもち、腫瘍その他内へ
の良好なローディング特性をもち、そしてテストされた
他のリポソーム配合品よりも有意に良好な抗腫瘍効果を
示す、リポソームを作り出す。
“リポソーム（Liposome）”、“小胞（vesicle）”
及び“リポソーム小胞（liposome vesicle）”は、水性
内部を含む脂質含有膜をもつ構造を示すと理解されるで
あろう。これらの構造は、別段の定めなき場合、１以上
の脂質膜をもつことができる。但し、一般には、上記リ
ポソームは、唯一の膜をもつであろう。このような単一
層リポソームを、本明細書中“単ラメラ（unilamella
r）”という。多層リポソームを、本明細書中“多ラメ
ラ（multilamellar）”という。
本発明のリポソーム組成物は、スフィンゴミエリンと
コレステロールから構成される。本リポソーム中に存在
するスフィンゴミエリン対コレステロールの比は、変動
してもよいが、一般には、75/25mol％/mol％スフィンゴ
ミエリン／コレステロール〜30/50mol％/mol％スフィン
ゴミエリン／コレステロール、より好ましくは約70/30m
ol％/mol％スフィンゴミエリン／コレステロール〜40/4
5mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレステロールのレ
ンジ内にあり、そして最も好ましくは、約55/45mol％/m
ol％スフィンゴミエリン／コレステロールである。他の
脂質は、脂質酸化を防止し、又はそのリポソーム表面上
にリガンドを付着させるように、適宜、その配合品中に
存在することができる。一般に、他の脂質の包含は、そ
のスフィンゴミエリン／コレステロール比における減少
をもたらすであろう。
多種多様な治療用化合物が、本発明のリポソーム及び
方法によりデリバリーされることができる。“治療用化
合物（Therapeutic compound）”は、例えば、核酸、タ
ンパク質、ペプチド、癌溶解薬、抗感染薬、抗不安薬、
向精神薬、免疫モジュレーター、イオン誘起物質（iono
tropes）、毒素、例えば、ゲロニン（gelonin）及び真
核タンパク質合成のインヒビターを含むことを意味す
る。
本発明のリポソーム内への捕獲のための治療用化合物
の中で好ましいのは、親油性カチオンであるものであ
る。これらの中には、そのリポソームの脂質２重層の相
中に分配することができ、そしてそれ故、膜形態におい
てそのリポソームと会合することができる親油性分子の
クラスの治療剤がある。代表的な薬物は、プロスタグラ
ンジン、アンフォテリシンＢ、メトトレキセート、シス
−プラチン及び誘導体、ビンクリスチン、ビンブラスチ
ン、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオー
ル、ドクソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン
（beclomethasone）及びエステル、ビタミンＥ、コルチ
ゾン、デキサメタゾン及びエステル、吉草酸ベタメタゾ
ン、並びに他のステロイド、等を含む。
本発明における使用のために特に好ましい治療用化合
物は、アルカロイド化合物及びそれらの誘導体である。
これらの中には、スワインゾニン並びにビンカ・アルカ
ロイド（vinca alkaloids）のメンバー及びそれらの半
合成誘導体、例えば、ビンブラスチン（vinblastin
e）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンデジン（vi
ndesin）、エトホジド（etoposide）、リン酸エトポジ
ド（etoposide phosphate）、及びテニポジド（tenipos
ide）が在る。この群内では、ビンブラスチン及びビン
クリスチン、並びにスワインゾニン（swainsonine）が
特に好ましい。スワインゾニン（Creaven and Mihich,S
emin.Oncol.4:147（1977））は、骨髄増殖を刺激する能
力をもつ（White and Olden,Cancer Commun.3:83（199
1））。スワインゾニンは、IL−1,IL−2,TNF,GM−CSF及
びインターフェロンを含む多くのサイトカインの生産を
も刺激する（Newton,Cancer Commun.1:373（1989）;Old
en,K.,J.Natl.Cancer Inst.,83:1149（1991））。それ
は、報告によると、Ｂ−及びＴ−細胞免疫性、インビト
ロにおける腫瘍細胞のナチュラル・キラーＴ−細胞及び
マクロファージ誘導破壊をも引き起こし、そしてインタ
ーフェロンと併合されるとき、インビボにおける結腸癌
及び黒色腫癌に対して直接的な抗腫瘍活性をもつ（Denn
is,J.,Cancer Res.,50:1867（1990）;Olden,K.,Pharm.T
her.44:85（1989）;White and Olden,Anticancer Res.,
10:1515（1990））。本発明において有用な他のアルカ
ロイドは、パクリタキセル（タキソール）（paclitaxel
（taxol））及びそれらの合成誘導体を含む。
本発明のリポソームを製造するための代表的な方法を
これから説明する。但し、その手順は、その結果に影響
を及ぼさずにさまざまな側面において修正を受けること
ができる。以下、実験セクション中により十二分に説明
するように、トランスメンブランpH勾配に応答して親油
性カチオン薬物を捕獲することができ、未だそのリポソ
ームが循環内での薬物の漏れに対して耐性であるリポソ
ームを、調製する。最初に、スフィンゴミエリンとコレ
ステロールを含むリポソームを、スフィンゴミエリンと
コレステロールの所望のモル比、例えば、それぞれ、55
/45モル／モルに従って、調製する。リポソームの形成
のため、そしてそれ故、そのリポソームの内部の形成の
ために適切なバッファーは、生理学的に許容され、そし
て酸性pH、典型的には、約pH2〜約pH6、より好ましく
は、約pH3〜pH5、そして最も好ましくは、約pH4をもつ
ものである。適当な捕獲バッファーの例は、約pH4に調
整されたシトレート・バッファーである。
他の脂質も、リポソーム調製において含まれることが
できる。これらの脂質は、リン脂質、例えば、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及び
ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチド酸、カルジオリピン、及びホスファチジル
イノシトール、であって脂肪アシル組成の変動を伴い、
そして天然及び／又は（半）合成起源をもつもの、並び
にリン酸ジセチルを含む。セラミド及びさまざまなグリ
コリピド、例えば、セレブロシド又はガングリオシド
も、添加されることができる。カチオン性脂質も添加さ
れることができる。本発明のリポソーム中での使用のた
めに好適であることができる追加の脂質は、当業者によ
く知られている。
一旦、リポソームが、捕獲された酸性バッファーを用
いて調製されれば、リポソームは、所望のサイズ・レン
ジにサイジングされることができる。リポソームは、一
般に、サイズ約1.0ミクロン未満、好ましくは、約0.05
〜0.45ミクロン、より好ましくは、約0.05〜0.2ミクロ
ンでなければならず、これは、そのリポソーム懸濁液が
濾過により滅菌されることを許容する。リポソームをサ
イジングするために、リポソーム懸濁液は、サイズ約0.
05ミクロン未満の小さな小胞まで、浴又はプローブのい
ずれかにより音波処理されることができる。ホモ・ジェ
ナイゼーションは、大きなリポソームをより小さなもの
に断片化するために使用されることもできる。両方法に
おいて、その粒子サイズ分布は、慣用のレーザー−光線
粒子サイズ分別その他によりモニターされることができ
る。
細孔ポリカーボネート膜又は不斉セラミック膜を通し
てのエクストルージョンは、リポソーム・サイズを、比
較的よく規定されたサイズ分布に減少させるための有効
な方法である。典型的には、懸濁液は、所望のリポソー
ム・サイズ分布が達成されるまで１回以上上記膜を通し
て循環される。リポソームは、リポソーム・サイズにお
ける漸進的な減少を達成するように連続的により小さな
細孔の膜を通して、エクストルードされることができ
る。
サイジングの前後において、リポソーム調製物の外部
pHは、好適なバッファー、例えば、0.5M Na2HPO4の添加
により、約pH7.0〜7.5に増加される。次に、選定した薬
物（単数又は複数）を、適当な濃度、例えば、0.01/1.0
〜0.2/1.0（重量／重量）のビンクリスチン／脂質比に
おいて、その薬物のトランスメンブラン取込みを許容す
るために十分な時間にわたり及び条件下で、例えば、約
５〜30分以上にわたり、そして約45〜65℃において（例
えば、以下の実施例中に記載するリポソーム・ビンクリ
スチン調製物の場合においては、60℃において10分
間）、リポソームと混合される。但し、当業者は、それ
らの条件が調整され、そしてそれに従って取り込みがモ
ニターされることができることを理解するであろう。リ
ポソームと治療用化合物（単数又は複数）の配合品は、
一般に、サイズ及び薬物−脂質比の点で、比較的均一な
小胞集団からなるものでなければならない。
pHトランスメンブラン勾配の直接的形成以外の薬物の
受動的捕獲のための手順を使用することができる。１の
態様においては、内部／外部濃度勾配は、電荷をもつア
ミン：メチルアンモニウム又はエタノールアンモニウム
を使用して形成される。リポソームは、電荷をもつアミ
ンの水溶液の存在中で形成される。いずれかの数の医薬
として許容される電荷をもつアミン、例えば、非限定的
には、フルオリド、クロライド、シトレート、スルフェ
ート、ホスフェート、ブロマイド、ヨージド、又はアセ
テートを、上記溶液を調製するために使用することがで
きる。リポソームの形成後、外部の電荷をもつアミン
を、例えば、希釈、濾過、透析又はゲル排除により、希
釈又は除去する。それにより、内部／外部pH勾配は、電
荷をもたないアミンがそのリポソームの内部を去り、そ
してプロトンを置き去るときに生成される。pH勾配の大
きさは、形成される濃度勾配の大きさに正比例するであ
ろう。pH勾配は、本明細書中に開示する方法に従って、
薬物、例えば、スワインゾニンをリポソームに充填する
ために使用される。
追加の成分が、特異的な細胞のタイプにリポソームを
標的化するために、それらに添加されることができる。
例えば、リポソームは、特異的な細胞タイプ、例えば、
癌関連抗原上にだけ存在するエピトープに結合するモノ
クローナル抗体又はそれらの結合性断片に結合されるこ
とができ、これらは、全身投与後にそれらリポソームを
標的化するための手段を提供する。あるいは、標的細胞
タイプの表面レセプターに結合するリガンドも、リポソ
ームに結合されることができる。リポソームを標的化す
る他の手段を、本発明において使用することもできる。
リポソームを含む媒質から遊離の薬物を除去するため
に必要であることができるような分離段階の後に、リポ
ソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞への投与のために医
薬として許容される担体中で所望の濃度にもっていかれ
る。多くの医薬として許容される担体が、本発明の組成
物及び方法において使用されることができる。さまざま
な水性担体、例えば、水、緩衝液化水、0.4％生理食塩
水、0.3％グリシンその他が、使用されることができ、
そして強化された安定性のための糖タンパク質、例え
ば、アルブミン、リポプロテイン、グロブリン等を含む
ことができる。一般に、正常な緩衝液化生理食塩水（13
5〜150mM NaCl）が、医薬として許容される担体として
使用されるであろうが、他の好適な担体も十分なもので
あろう。これらの組成物は、慣用のリポソーム滅菌技
術、例えば、濾過により、滅菌されることができる。本
組成物は、生理学的条件を真似るために適宜、医薬とし
て許容される補助的物質、例えば、pH調整及び緩衝液化
剤、浸透圧調整剤その他、例えば、酢酸ナトリウム、乳
酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、等を含むことができる。これらの組成物は、
先に述べた技術により滅菌され又は滅菌条件下で製造さ
れることができる。得られた水溶液は、使用のために包
装され又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され
ることができ、その凍結乾燥された調製物は、投与に先
立って無菌水溶液と併合される。
担体中のリポソームの濃度は、変化してもよい。一般
に、その濃度は、約20−200mg/ml、通常、約50−150mg/
ml、そして最も普通には、約75−125mg/ml、例えば、約
100mg/mlであろう。当業者は、異なるリポソーム成分に
よる又は特定の患者のための処置を最適化するために、
これらの濃度を変えることができる。例えば、この濃度
を、処置に関連した液体負荷を低下させるために、増加
することができる。
本発明は、宿主の細胞内に治療用化合物を導入するた
めの方法をも提供する。本法は、一般に、宿主に、治療
用化合物を含むリポソームであって、スフィンゴミエリ
ンとコレステロール、及び場合により、他の脂質から成
る膜、並びに生理学的pHよりも実質的に低いpH、例えば
pH3〜約５における水性内部、並びに着目の治療用化合
物をもつリポソームを、投与することを特徴とする。宿
主は、ヒト、非ヒト霊長類、トリ種、ウマ種、ウシ種、
ブタ種、ウサギ目、げっ歯類、その他を含むさまざまな
動物であることができる。
宿主の細胞は、通常、本配合品のインビボ投与により
本発明のリポソーム調製物に晒されるが、リポソームに
その細胞をエクス・ビボにおいて晒すことも、実行可能
である。インビボにより晒すことは、宿主へのリポソー
ムの投与により得られる。リポソームは、多くの方法で
投与されることができる。これらは、非経口的な投与系
路、例えば、静脈内、筋中、皮下、及び動脈内を含む。
一般に、リポソームは、静脈内に又はいくつかの場合に
は吸入を介して投与されるであろう。しばしば、リポソ
ームは、高濃度溶液が大容量かつ、大流量の血管内に投
与されることを許容するように、大きな中央の静脈、例
えば、上大静脈又は下大静脈内に投与されるであろう。
リポソームは、罹患血管に直接的に高濃度をデリバリー
するための血管手順に従って動脈内に投与されることが
できる。いくつかの場合、リポソームは、経口的又は経
皮的に投与されることができる。但し、本発明の利点
は、非経口投与により最良に具現化される。例えば、ス
ワインゾニンは、便利には、経口投与されるが、非経口
的に又は静脈内に投与されることができる。リポソーム
は、設置後の長く継続する放出のための移植可能なデバ
イス内に取り込まれることもできる。
上記のように、リポソームは、一般に、本発明の方法
において、静脈内に又は吸入を介して投与されるであろ
う。しばしば、複数の処置が患者に与えられるであろ
う。これらの処置の投薬スケジュールは、その疾患及び
その患者の症状により決められるであろう。本分野にお
いてよく知られた治療用化合物による標準的な処置は、
治療用化合物を含むリポソームによる処置へのガイドと
して役立つことができる。処置の継続時間及びスケジュ
ールは、当業者によく知られた方法により変えられるこ
とができるが、増加された循環時間及びリポソーム漏れ
における減少は、一般に、その投与量を従来使用された
投与量より低い方に調節せしめるであろう。本発明のリ
ポソームの投与量は、処置を受ける動物又は患者の臨床
的症状及び大きさに依存して変動することができる。封
入されないときの治療用化合物の標準的な投与量は、リ
ポソーム封入された化合物の投与量へのガイドとして役
立つことができる。この投与量は、典型的には、処置の
経過にわたり一定であろう。但し、いくつかの場合、そ
の投与量は変化することができる。本発明のリポソーム
の投与量を変更するために使用されることができる標準
的な生理学的パラメーターは、処置の間に評価されるこ
とができる。
以下の実施例を、限定のためでなく説明のために提供
する。
実施例Ｉ DSPC/Chol対SM/Cholリポソームの酸安定性 本実施例は、ジステアロイルホスファチジルコリンと
コレステロールにより調製されたリポソームに比較して
の、酸加水分解に対するスフィンゴミエリンとコレステ
ロールにより調製されたリポソームの安定性を立証す
る。
リポソーム調製のために、ジステアロイルホスファチ
ジルコリン（DSPC）と卵スフィンゴミエリン（SM）を、
Avanti Polar Lipidsから得て、さらに精製せずに使用
した。コレステロールをSigma Chemical Companyから得
て、そしてPEG−PEを、Parr et al.により提出されたBi
ochim.Biophys.Acta（1994）に従って合成した。脂質
を、CHCl3、又は微量のCH3OHを含むCHCl3中に溶解し、
次に以下に示すようなモル比で混合し、そして過剰の溶
媒を窒素気流下で除去した。残溶媒を、３〜16時間にわ
たり高真空下でその脂質膜から除去した。脂質を、0.3M
シトレート・バッファー（pH4.0又は2.0）の添加により
分散させて、50又は100mg/mlのいずれかの最終脂質濃度
を達成した。脂質の水和を、撹拌及び65℃への加熱によ
り容易にした。リポソームの内部と外部の間の溶質の平
衡を、Mayer et al.,Biochim.Biophys.Acta 817:193−1
96（1985）（引用により本明細書中に取り込む）中に概
説されるように−196゜〜60℃の間の５回の冷凍／解凍
サイクルにより達成した。大きな単ラメラ小胞を、Them
obarrel Extruder（Lipex Biomembrane,Vancouver,Cana
da）内に60−65℃に保持された２又は３層の0.1μｍフ
ィルターを通してのその多ラメラ・リポソームの繰り返
してのエクストルージョンにより、作り出した。リポソ
ーム・サイズ分布を、Nicomp Model 270 Submicron Par
ticle Sizerを使用した擬弾性光散乱により確認した；
これらの調製物は典型的には、130〜150nmの平均直径を
もっていた。
DSPC/Chol又はSM/Cholの大きな単ラメラ・リポソーム
を、pH2.0における0.3Mシトレート・バッファー中で上
記のように調製し、そして次に3.2mg/mlの脂質まで希釈
した。これらのリポソームを、各時間にわたり37℃にお
いてインキュベートし、次に脂質加水分解の測定前に冷
凍した。脂質分散体を解凍し、次にその脂質をCHCl3/CH
3OH中に抽出し、そして窒素気流下で濃縮した。既知量
の脂質を、K6F薄層クロマトグラフィー・プレート上に
スポットし、そしてCHCl3/CH3OH/H2O/NH4OH（65/25/4/
0.3、容量比）中で発色させた。脂質をヨウ素蒸気中で
可視化し、次にそのプレートの適当な領域を回収し、そ
して引用により本明細書中に取り込むBartlett,J.Biol.
Chem.234:466−468（1959）に従ってリンについて分析
した。DSPCの全加水分解を、サンプル中に存在するMSPC
の量から決定し、そして次に全加水分解に補正した；ス
フィンゴミエリンの加水分解を、クロマトグラフィーに
かけられた脂質の量と非加水分解スフィンゴミエリンと
して回収された量との間の差異から計算した。換算曲線
を、DSPC,MSPC及びスフィンゴミエリンの各々について
決定した。
図１に示すように、SM/Chol（55/45,mol/mol）から成
るリポソームは、DSPC/Chol（55/45,mol/mol）から成る
リポソームよりも酸加水分解を有意に受けにくかった。
すなわち、37℃及びpH2.0における加水分解の速度は、D
SPC/Cholリポソーム内よりもSM/Cholリポソーム内で約1
00倍遅かった。同様の結果が、pH4.0及び４℃〜37℃間
の各温度におけるリポソームのインキュベーションの間
に観察された。
これらの結果は、SM/Cholから成るリポソームがDSPC/
Cholから成る同一リポソームよりも酸加水分解に対して
有意により安定性であることを示している（図１）。DS
PC/Cholリポソームにおける主な分解産物は、リゾ−PC
（MSPC）であるので、SM/Cholリポソームは、カルボキ
シル−エステル化脂肪酸を含む脂質に基づくいずれの配
合品（すなわち、いずれかのリン脂質−ベースの配合
品）よりも安定性である可能性がひじょうに高い。
実施例II 脂質及び薬物の薬理動態 大きな単ラメラ・リポソーム内へのビンクリスチンの
取り込みは、引用により本明細書中に取り込むMayer et
al.,Cancer Chemother.Pharmacol.33:17−24（1993）
により記載されたpH勾配依存手順を使用して達成され
た。簡単に言えば、硫酸ビンクリスチン（Oncovin ,El
i Lilly,Indianapolis,IN）の溶液を、0.1/1（重量／重
量）の薬物／脂質比においてリポソームに添加し、そし
て５〜10分間60℃において平衡にした。トランスメンブ
ランpH勾配に応答するビンクリスチンの取り込みは、そ
の外部pHを7.2−7.6にもっていく0.5M Na2HPO4の添加に
より開始された。取り込みは60℃において10分間進行に
供され、そして典型的には、約95％の捕獲効率をもって
いた（Mayer et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.33:1
7−24（1993））。
非交換性及び非代謝性放射標識14C−CHDE（New Engla
nd Nuclearから得られ、先に示したような、3H又は14C
により放射標識されたコレステリル−４−ヘキサデシル
・エーテル）を含む、DSPC/Chol（55/45）,SM/Chol（55
/45）又はSM/Chol/PEG−PE（55/40/5）のリポソームを
調製した。空のリポソーム又は3H−ビンクリスチン（Am
ershaw）を充填されたリポソームを、HBSにより所定の
濃度に希釈し、次に2mg/kgのビンクリスチン投与量（20
mg/kgの脂質投与量）においてBDF1マウス（８−10週齢;
Charles River）に静脈内注射した。リポソーム注射後
の各時間において、血液を、心臓穿刺から得て、そして
肝臓、脾臓及び筋肉を回収した。全ケースにおいて、脂
質とビンクリスチン分布を、既知容量の血漿及び組織の
10％ホモジェネートの液体シンチレーション・カウンテ
ィングにより測定した。
DSPC/CholとSM/Cholの空リポソームのクリアランス
を、図2Aに示す。SM/Cholから成るリポソームは、DSPC/
Cholリポソームよりも僅かに遅い速度で循環から除去さ
れた。DSPC/CholリポソームとSM/Cholリポソームの間の
クリアランス速度におけるこの差異は、図2Bに示すよう
に、ビンクリスチンを含む配合品においても観察され
た。但し、総クリアランス速度は、RES活性に対するそ
の薬物の効果のためにビンクリスチンの存在中より遅か
った。循環内に残存するSM/Cholの量は、典型的には、D
SPC/Cholリポソームについてのものよりも30−50％高か
った。循環内の脂質の量におけるさらなる増加が、SM/C
hol混合物への5mol％PEG−PEの添加により達成された；
静脈内注射の24時間後、SM/Chol/PEG−PEリポソームに
ついて200μｇ脂質/ml血漿が循環中に残存し、これに対
し、SM/Cholリポソームについて100μg/ml血漿、そして
DSPC/Cholリポソームについて65μg/ml血漿であった
（図2B）。
リポソームの薬物保持特性は、この小胞の脂質組成に
おける変化によりかなり変更された。DSPC/Cholリポソ
ームからのビンクリスチンの漏れはひじょうに速く、図
３に示すように、元々封入されたビンクリスチンのたっ
た50％が循環内で４時間後に残存した。これに反し、SM
/Cholリポソームからのビンクリスチンの漏れは、ひじ
ょうに遅く、封入された薬物の60％以上が、注射24時間
後にそのリポソーム内に残存した（図３）。さらに、SM
/Cholリポソーム内でのビンクリスチンの保持における
追加の増加は、２倍大きなトランスメンブランpH勾配
（すなわち、pHi＝2.0）の存在中観察されなかった。SM
/Cholリポソーム内での5mol％PEG−PEの存在は、ビンク
リスチンの透過性におけるかなりの増加を引き起こし
た；図３に示すように、封入されたビンクリスチンの約
30％が、循環内で24時間後にそのリポソーム内に残存し
た。
リポソーム・ビンクリスチンの抗−腫瘍効果は、循環
内に残存する薬物の量の関数であり、そしてそれ故、循
環内でのリポソームの寿命とそのリポソーム内での薬物
保持の両方の結果である。循環内に残存するビンクリス
チンの合計量は、図４に示すように、リポソームSM/Cho
l又はSM/Chol/PEG−PE配合品のいずれにおけるよりも、
リポソームDSPC/Chol配合品において有意に低かった。
両スフィンゴミエリン−ベースのリポソーム配合品は、
同一量の、循環内に残存するビンクリスチンをもってい
た。これは、SM/Chol/PEG−PEにおけるよりも高い、SM/
Cholにおけるビンクリスチン／脂質比（図３）、及びSM
/Chol/PEG−PEにおけるよりも低い、SM/Cholにおける循
環内に残存する脂質の量（図2B）、の結果であった。
SM/Cholリポソームの延長された循環寿命が、マクロ
ファージによるSM/Cholリポソームの減少された取り込
みの結果であったかどうかを決めるために、腹膜マクロ
ファージによるリポソームの取り込みを計測した。14C
−CHDEを含む空DSPC/Chol及びSM/Cholリポソームを、上
記のように調製し、そしてその外部pHを、0.5M Na2HPO4
により7.2〜7.6にもっていった。リポソームを、0.5ml
の容量において100mg脂質/kgでCD1マウス（８−10週
齢）に腹腔内注射した。４時間後、腹膜マクロファージ
を、洗浄により回収し、繰り返しの遠心分離により精製
し、そして次にマクロファージを血球計によりカウント
し、そしてそのマクロファージにより取り込まれた脂質
の量を、液体シンチレーション・カウンティングにより
測定した。
血清タンパク質結合性検定のために、14C−CHDEによ
り標識されたDSPC/Chol又はSM/Cholリポソームのいずれ
か10mgを、7.2−7.6の外部pHにもっていき、次にHBSに
より20mg/mlに希釈した。リポソームを、37℃において3
0分間、500μの胎児ウシ血清（ICN Biomedicals）
（0.22μｍフィルターを通して事前に濾過されたもの）
と共にインキュベートした。リポソームに結合しなかっ
た血清タンパク質を、35ml/時において（HBS中）1cm
（内径）×18cm BioGel A−15mカラム（Bio−Red Labor
atories）にサンプルを通過させことにより除去した。
各画分（1mol）を、タンパク質について検定し（Sigma
ビシンコニン酸（bicinchoninic acid）タンパク質アッ
セイ・キット）、そして脂質（LSC）と吸着されたタン
パク質を、同時溶出された血清タンパク質についての補
正後に計算した。
マクロファージ内への腹腔内注射されたSM/Cholリポ
ソームの取り込みは、図５に示すように、DSPC/Cholの
取り込みよりも50％低かった。マクロファージによるSM
/Cholリポソームの減少された取り込み及びそれらの延
長された循環寿命は、DSPC/Cholリポソームに対するよ
りも、SM/Cholリポソームの表面に対する低下されたタ
ンパク質オプソニン作用の結果であったようである。SM
/CholとDSPC/Cholリポソームへの胎児ウシ血清タンパク
質の吸着の計測は、そのDSPC/Cholリポソームが13.7μ
ｇタンパク質/mg脂質を吸着したことを示した。これに
反し、SM/Cholリポソームへの胎児ウシ血清タンパク質
の有意な吸着は検出されなかった。
従って、本実施例から、SM/Cholから成るリポソーム
が、封入されたビンクリスチンの存在又は非存在中の両
方において、同様のDSPC/Cholリポソームよりも僅かに
長い循環寿命をもっていたことが理解される（図２）。
SM/Cholリポソームは、トランスメンブランpH勾配法を
使用して封入されていたビンクリスチンの保持において
DSPC/Cholリポソームよりも劇的に良好なものであった
（図４）。SM/CholリポソームへのPEG−PEの添加は、そ
のリポソームの循環寿命を有意に増加させたが、PEG−P
Eは、そのリポソームからのビンクリスチンの漏れにお
ける有意な増加をも引き起こした。SM/CholとSM/Chol/P
EG−PEリポソーム配合品における、循環内に残存するビ
ンクリスチンの増加されたレベルが（図４）、SM−含有
リポソーム内での改善された薬物保持（図３）とSM/Cho
l/PEG−PEリポソームの増加された循環寿命（図2b）の
両方の結果であった。しかしながら、SM/Chol/PEG−PE
リポソームの増加された循環寿命は、PEG−PEを含むリ
ポソームによるより低い薬物保持によりバランスされて
いた。それ故、ビンクリスチンのSM−ベースのリポソー
ム配合品においては、脂質PEG−DSPEの添加によるビン
クリスチン循環寿命における改善が全く存在しなかった
（図４）。さらに、pHi＝2.0の使用によるインビボにお
けるビンクリスチン保持における改善が全く存在しなか
ったので、循環における最適なビンクリスチン保持が、
スフィンゴミエリン、コレステロール及びシトレート・
バッファー（pH4.0）だけから成る比較的単純なリポソ
ーム配合品を用いて達成された。
実施例III リポソーム・ビンクリスチンの腫瘍ローディング 図４に示すような、循環内での増加されたビンクリス
チンの寿命が、腫瘍への増加された薬物デリバリーをも
たらしたかどうかを決めるために、P388腫瘍中へのリポ
ソーム・ビンクリスチンのローディングについて調べ
た。腫瘍ローディング実験のために、BDF1マウスに、リ
ポソーム注射の24時間前に、（BDF1マウス内で１週間継
代した）（National Cancer Institute,Bethesda,MDか
ら得た）106 P388細胞を、腹腔内注射した。リポソーム
注射後の各時間において、その腫瘍を、腹腔洗浄により
回収した。全ケースにおいて、脂質とビンクリスチン分
布を、既知量の洗浄液の液体シンチレーション・カウン
ティングにより測定した。
図６に示すように、P388腫瘍中のDSPC/Cholリポソー
ムからのビンクリスチンの蓄積は、リポソーム注射４時
間後において初期ピークをもっており、そしてその後に
おいてかなり低いものであった。これに反し、SM/Chol
とSM/Chol/PEG−PEの両方の配合品からのビンクリスチ
ンは、リポソーム注射の24〜48時間後までの間に、ビン
クリスチンの接続したデリバリーを示した。すなわち、
ビンクリスチンのSM/CholとSM/Chol/PEG−PE配合品は、
DSPC/Cholリポソームよりも、P388腫瘍に少なくとも30
多くのビンクリスチンをデリバリーした。
SM−ベースのリポソーム配合品を使用する血漿中の循
環内に残存するビンクリスチンの増加したレベル（図
４）は、P388腫瘍にロードされたより多量のビンクリス
チン（図６）を反映していた。この関係は、BDF1マウス
におけるP388腫瘍について、DSPC,SM及び／又はPEG−PE
を含むリポソームが、循環から上記腹膜腫瘍まで遊出す
る（extravasate）それらの能力において有意に差異が
ないことを示唆する。
実施例IV P388腫瘍に対するリポソーム・ビンクリスチンのインビ
ボにおける効果 実施例III中に示すように、SM/CholとSM/Chol/PEG−P
EリポソームによるP388腫瘍へのビンクリスチンの増加
されたデリバリーが、増加した抗腫瘍活性をもたらした
どうかを決めるために、ビンクリスチンのリポソーム配
合品の効果を測定した。
P388腫瘍を担持するBDF1マウスを、0.1（重量／重
量）の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含むDSPC
/Chol（55/45,mol/mol）、SM/Chol（55/45,mol/mol）又
はSM/Chol/PEG−PE（55/40/5,mol/mol/mol）のリポソー
ム配合品により処置した。
DSPC/Chol（55/45）,SM/Chol（55/45）及びSM/Chol/P
EG−PE（50/40/5）の大きな単ラメラ・リポソームを、
上記のように調製し、そしてそれに、0.1/1（重量／重
量）のビンクリスチン／脂質比においてビンクリスチン
をロードした。リポソーム・ビンクリスチンを、106 P3
88細胞の腹腔内注射により24時間前に投与されていたBD
F1マウスに静脈内注射した。リポソーム濃度を、1.0,2.
0と4.0mg/kgのビンクリスチン投薬を達成するように調
整し、次に、動物の体重及び生存を、その後60日間追跡
した。60日間生存した動物に、106 P388細胞を再注射し
て、長期間生存の免疫成分について評価した。
図７に示すように、リポソーム・ビンクリスチンの注
射を全く受けなかった対照マウスは、P388腫瘍の投与後
10−11日間生存した。1mg/kgのビンクリスチン投薬にお
けるDSPC/Chol又はSM/Chol/PEG−PE配合品のいずれかに
よる処置は、それぞれ、17と19日間その生存を増加させ
た。同−ビンクリスチン投薬におけるSM/Chol配合品に
よる処置は、23日間の、生存における僅かな改善を与え
た。
2mg/kgのビンクリスチン投薬において、DSPC/CholとS
M/Chol/PEG−PE配合品の両方が、30−31日間に生存を増
加させた。これに反し、このビンクリスチン投薬におい
ては、SM/Chol配合品は、有意により有効であり；その
マウスの60％が、P388腫瘍の投与後60日目において生存
していた（図７）。4mg/kgのビンクリスチン投薬におい
ては、DSPC/CholとSM/Chol/PEG−PE配合品の両方が、P3
88腫瘍注射後60日目において生存していた、上記マウス
の40％を与えた。SM/Cholの配合品は、有意により有効
であり;1のビンクリスチン毒性死を除き、60日目におけ
る残存マウスの生存は100％であった（図７）。
従って、SM/Cholリポソームの抗腫瘍効果は、SM/Chol
/PEG−PEリポソームのものよりも有意に良好であった
（図７）。但し、P388腫瘍へのビンクリスチンのローデ
ィングは、これらの２つのリポソーム配合品において同
一であったことが観察された（図６）。この結果は、SM
/Chol/PEG−PEリポソームに比較して循環内でのSM/Chol
リポソームのよりよいビンクリスチン保持（図３）が、
その腹腔内でも生じ、そしてP388腫瘍細胞による改善さ
れたビンクリスチンをもたらすことを示唆する。SM/Cho
lの配合品は、DSPC/Chol又はSM/Chol/PEG−PEのいずれ
かに基づく配合品よりも約２倍有効であった。すなわ
ち、2.0mg/kgのビンクリスチン投薬におけるDSPC/Chol
とSM/Chol/PEG−PE配合品により達成された生存は、1.0
mg/kgの投薬におけるSM/Cholにより達成された。同様
に、4.0mg/kgのビンクリスチンの投与量におけるDSPC/C
holとSM/Chol/PEG−PEにより得られる生存は、2.0mg/kg
におけるSM/Chol配合により達成されたものにひじょう
に類似していた。
実施例Ｖ リポソーム・スワインゾニンの生物学的利用能 ５−６週齢の雌Balb/cマウスを、標準条件下で飼養し
た。これらの動物は、実験操作前の１週間の順化期間後
その実験の全体にわたり食物と水の両方への自由なアク
セスを受けた。スワインゾニン（Tornto Res.Chem.）
を、トリチウムにより放射標識した。トリチル化スワイ
ンゾニンを、脂質ベースの配合品（Ｌ−Im）として、そ
して遊離の薬物を含む水性配合品として投与した。トリ
チル化スワインゾニンを、0.2:1（mol/mol）の薬物対脂
質化におけるシトレート・バッファー、pH2勾配を使用
して、及び80％のローディングの効果を用いて、スフィ
ンゴミエリン／コレステロール（Avanti Polar Labs）
スフィンゴソーム内に、ロードした。200μの上記脂
質と水性スワインゾニン配合品を、胃管栄養による経口
により（p.o.）、腹膜内に（i.p.）、又は静脈内に（i.
v.）与えた。50マイクロリッターの血液サンプルを、投
与1,3,6、及び24時間後に、眼窩後採血により集めた。
この血液サンプルを、漂白し、そして次にシンチレーシ
ョン・カウンター内でカウントした。結果を、投与後各
時間点においてその血液中に投与された量のパーセンテ
ージとして表した。
図８に示すように、スワインゾニンのリポソーム配合
品（Ｌ−Im）は、優れた生物学的利用能をもち、そして
その遊離の水性配合品（Ｆ−Im）に比較したとき、より
高い血中レベルを達成する。スワインゾニンの経口の生
物学的利用能は、静脈内に投与されたスワインゾニンに
比較したとき約60−65％である。
実施例VI スワインゾニン及びGM−CSFの効力 雌C57BL/6マウス（平均体重15.03g）を使用し、そし
て標準的な条件下で飼養した。これらの動物は、実験操
作に先立つ１週間の順化期間の後その実験の全体にわた
り食物と水の両方への自由なアクセスを受けた。それら
のマウスは、本実験の開始時６週齢であり、そして群当
り５マウスの12群内にランダムに入れられた。40マウス
に、メトトレキセート（Mtx,410mg/kg）（Sigma Chemic
al Co.）又はドクソルビシン（Dox,14.9mg/kg）（Adria
Laboratories）のいずれかの単一ボーラスの（腹腔
内）注射を与えた。化学療法の２日後、スワインゾニン
（2mg/kg腹腔内又は経口）、組換えネズミGM−CSF（顆
粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）（１μg/マウ
ス／日、腹腔内、５×104U/μｇ活性）（R ＆ D System
s）又はホスフェート緩衝液化生理食塩水（PBS）（200
μ腹腔内）の投与を、（１日に１回）10日間連続して
提供した。死亡数を、14日間の観察期間にわたり各処置
群について記録した。
表Ｉ（以下）中の結果は、スワインゾニンが、化学療
法薬（Mtx又はDox）のLD50投与の後10日間投与されると
き、スワインゾニンを静脈内に又は腹腔内に投与された
動物の全てが、その細胞毒性障害をつかみ、そして化学
療法後２週間を超えて生存した。Mtxにより処置された
動物の半分及びDoxにより処置された動物の半分が、化
学療法後２〜３日以内に死亡した。10日間、組換えネズ
ミGM−CSFの腹腔内投与により処置された動物は、スワ
インゾニンによるのと同様ではなく;Mtxにより処置され
た動物の約半分が、その10日間の投薬期間の開始後２〜
３日以内に脂肪した。動物は、Doxを投与され、そして1
0日間のGM−CSFは、２週間の回復期間を生存させた。ス
ワインゾニンは、化学療法処置された動物に10日間経口
投与され、そして（Mtx処置群において）１を除く全て
の動物が、その細胞毒性処置を生き延びた。
表Ｉ テスト剤 投 与 生存（％） 1. PBS 腹腔内 100 2. MTX 〃 40 3. DOX 〃 60 4. L−SW 〃 100 5. MTX/L−SW 〃 100 6. DOX/L−SW 〃 100 7. GM−CSF 〃 100 8. MTX/GX−CSF 〃 60 9. DOX/GM−CSF 〃 100 10. L−SW 経 口 100 11. MTX/L−SW 〃 80 12. DOX/L−SW 〃 100 実施例VII 化学療法薬誘導白血球減少症からの回復 最初の化学療法薬投薬後15日目に、免疫調節試験（実
施例６）の各群からの４マウスを、ランダムに殺し、そ
して1mlまでの血液を、心臓穿刺により得た。循環末梢W
BCsをカウントし、（好中球カウントのための）血液ス
ミアを作り、そして血漿サンプルを採取し、そしてサイ
トカイン生産（IL−1,IL−2,TNF）についてテストし
た。血液サイトカイン・レベル（TNF,IL−1,及びIL−
２）を、商業的に入手可能なアッセイ・キットにより検
定した。脾臓、胸腺及び骨髄を取り出し、そして単一細
胞懸濁液を調製した。これのリンパ腫臓器の細胞質を、
トリパン・ブルー排除テストにより評価した。図９は、
化学療法薬物投与後14日目における骨髄細胞質に対する
GM−CSFとスワインゾニンの効果を表す。図示するよう
に、経口又は腹腔内投与により与えられたスワインゾニ
ンは、連続して10日間にわたり腹腔内により与えられた
GM−CSFと同程度に有効に機能した。
脾臓、胸腺及び骨髄からの細胞を、異なるマイトジェ
ン:ConA（1,2.5及び５μg/ml）（Sigma）、フィトヘマ
グルチニン（PHH）（１、及び2.5μg/ml）（Sigma）及
びLPS（2.5及び５μg/ml）（Difco）からの刺激に応答
するそれらの能力についてテストした。刺激の72時間
後、増幅応答を、Cell Titer 96（Promega）を使用して
計測した。同時に、マイトジェン刺激された脾臓細胞
は、ConA（2.5μg/ml）及びリポ多糖（LPS）（2.5μg/m
l）刺激後のサイトカイン生産について設定された。そ
の上清を、24時間及び48時間後に集め、そして直接ELIS
A法を使用して腫瘍壊死因子−α（TNF−α）及びインタ
ーロイキン−２（IL−２）についてテストした。非刺激
細胞からの上清は、対照として役立つ。結果を、pg/ml
のINF−α（このアッセイの感度あ＜25pg/mlである。）
又はIL−２（このアッセイの感度は＜3pg/mlである。）
として表す。それぞれ、図10Aと10Bに示すように、ConA
とLPS刺激脾臓細胞におけるTNFとIL−２レベルは、化学
療法処置及びPBS（非処置）対照に比較してスワインゾ
ニン処置動物において有意に高められた。
投与の経口経路についての利点を確立するために、ス
ワインゾニンを、各時間期間（1,2,4,24,48と72時間）
にわたり擬似胃内容物中でインビトロにおいてインキュ
ベートし、そしてスワインゾニンの“経口安定性”を測
定した。スワインゾニンを、主要胃消化酵素、ペプシン
を含む塩酸（pH2）中でもインキュベートした。このイ
ンビトロ安定性テストは、72時間までにわたる上記の激
しい条件下でスワインゾニンが安定であることを示し
た。
実施例VIII A431腫瘍を担持するSCIDマウスにおける薬理動態、腫瘍
ローディング及び療法 ビンクリスチンのDSPC/CholとSM/Cholリポソーム配合
品の腫瘍ローディング及び抗腫瘍効力特性を、固形ヒト
A431扁平上皮細胞異種移植片腫瘍を担持するマウスにお
いて、測定した。これらの実験は、ネズミ腹水P388腫瘍
モデルにおいて観察された陽性結果が、他の腫瘍タイプ
を代表するものであったことを確認するために企図され
た。100−200mg固形ヒトA431腫瘍を担持するSCIDマウス
に、遊離のビンクリスチンを、又はビンクリスチンを含
有するDSPC/Chol又はSM/Cholのいずれかのリポソーム
を、静脈内注射した。ビンクリスチン封入DSPC/CholとS
M/Cholリポソームを実施例IIにおけるように調製した。
DSPC/Chol及びSM/Cholリポソーム内のビンクリスチンの
封入は、遊離ビンクリスチンに比較して、それぞれ、28
倍と87倍程投与後24時間目に循環内に残存するビンクリ
スチンの量を増加させた（図11A）。P388腫瘍担持BDF1
マウスにおいて観察されるように、注射24時間後におけ
るSM/Cholリポソーム中循環内に存在するビンクリスチ
ンの量は、DSPC/Cholリポソーム内に封入されたビンク
リスチンについてよりも約３倍大きかった（図11A）。
改善されたビンクリスチン循環寿命は、A431腫瘍中へ
のビンクリスチンのローディングにける増加に相関した
（図11A）。特に、A431腫瘍中の遊離のビンクリスチン
・レベルは、注射0.5時間後において再考（0.856mg/g腫
瘍）であり、そして24時間後に0.32mg/g腫瘍に減少した
（図11B）。DSPC/Cholリポソーム内へのビンクリスチン
の封入は、それぞれ、1.35−1.55mg/g腫瘍への投与の４
〜48時間後において、A431腫瘍中のビンクリスチンの量
を増加させた（図11B）。SM/Cholリポソーム内へのビン
クリスチンの封入は、DSPC/Cholリポソームを用いて得
られたデリバリーにおいて２倍の増加を示す、2.8−3.2
mg/g腫瘍への注射後２〜48時間目においてA431腫瘍への
ビンクリスチン・デリバリーにおけるさらなる増加をも
たらした。ネズミ腹水腫瘍モデルにおいて観察されたよ
うに、固形ヒトA431腫瘍中に観察されたビンクリスチン
／脂質は、血漿中で観察されたものとひじょうに類似し
ていた。すなわち、DSPC/Cholリポソーム内に封入され
たビンクリスチンについては、注射後24時間目における
ビンクリスチン／脂質（重量／重量）比は、血漿中で0.
022、そして腫瘍中で0.029であり、一方、SM/Cholリポ
ソーム内に封入されたビンクリスチン／脂質比は、血漿
中で0.055、そして腫瘍中で0.050であった。
A431に対する遊離とリポソーム・ビンクリスチンの抗
腫瘍効果は、その腫瘍部位におけるビンクリスチン蓄積
と密に相関していた（図12）。処置を全く受けなかった
A431腫瘍を担持するSCIDマウスは、処置が開始された後
４−５日以内に腫瘍重量における100％増加を示し、そ
してその腫瘍がその全体重の10％を超えたとき10日以内
に死んだ。2.0mg/kgにおける遊離のビンクリスチンによ
り処置された腫瘍担持SCIDマウスは、腫瘍成長における
短い遅れをもったが（腫瘍重量における100％増加が６
−８日以内に達成されたが）、10−12日の間に死亡し
た。これに反し、DSPC/Cholリポソーム内に封入された
ビンクリスチンによる処置は、腫瘍成長における有意な
遅れをもたらした（15−20日目における腫瘍重量の100
％増加、処置後21日目における死亡）。この療法は、SM
/Cholリポソーム内に封入されたビンクリスチンの単一
処置によりさらに強化された。この処置群においては、
腫瘍サイズにおける小さいが一貫した減少が観察され
た。注射後15日目に、いくつかの腫瘍が触診可能である
が測定不可であり、そして処置後33日目までに、いくつ
かの腫瘍は触診可能ではなかった。SM/Cholリポソーム
・ビンクリスチンにより処置された５匹のマウス（全部
で10腫瘍）の中で、１匹の動物が、腫瘍成長のためでな
く、腫瘍潰瘍のために初期に死んだ。リポソーム注射後
40日目に残った腫瘍の中で、組織学的分析は、全８つの
腫瘍が、物理的検査により検出できない質量の活性に分
裂する扁平上皮細胞癌腫細胞であったことを示した。そ
れ故、SM/Cholリポソーム・ビンクリスチンによる処置
は、腫瘍成長における有意な減少に効果がある。但し、
元の腫瘍のいずれも治癒されなかった。
要約すれば、本発明は、スフィンゴミエリン／コレス
テロール小胞に基づくビンクリスチン及び他のアルカロ
イドリポソーム配合品が、DSPC/コレステロール小胞に
基づく配合品を上廻るいくつかの有意な利点をもつこと
を立証する。特に、スフィンゴミエリン／コレステロー
ルに基づく配合品は：（１）酸加水分解に対してひじょ
うに安定であり、（２）有意に良好な薬物保持特性をも
ち、（３）より良好な腫瘍ローディング特性をもち、そ
して（４）DSPC/Chol又はSM/Chol/PEG−PEから成る匹敵
するリポソームよりも有意に良好な抗腫瘍効果を示す。
本明細書中に挙げた全ての刊行物及び特許を、あたか
も個々の刊行物又は特許が特別に、そして個々に引用に
より本明細書中に取り込まれることを意図されるのと同
程度に、ここで、引用により本明細書中に取り込む。
これまで本発明を理解の明確さの目的をもって図示及
び実施例によりいくぶん詳細に説明してきたが、添付の
請求範囲内で特定の変更及び修正を行うことができるこ
とは自明であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バリー，マーセル ビー. カナダ国，ブリティッシュ コロンビア ブイ０エヌ １ジー０，ボウェン ア イランド，ハーディング ロード 11, エス．ピー．シー. (72)発明者 メイヤー，ローレンス ディー. カナダ国，ブリティッシュ コロンビア ブイ７ジェイ ３エム４，ノース バ ンクーバー，カーマリア コート 2416 (72)発明者 ミラー，ジェームズ エム. カナダ国，ブリティッシュ コロンビア ブイ６エス １ワイ８，バンクーバ ー，ウェスト サーティセカンド アベ ニュ 3391 (72)発明者 タルディ，ポール ジー. カナダ国，ブリティッシュ コロンビア ブイ７イー ３エス５，リッチモン ド，スプリングマウント ドライブ ７ −10900 (56)参考文献 特開 昭52−114015（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502590（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−502458（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500101（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，ｖｏｌ. 1025（1990）ｐｐ．14 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 47/24 A61K 47/28

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】スフィンゴミエリンとコレステロールを含
    んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム
    外部のpHよりも低い酸性pHをもつリポソーム内部、及び
    その宿主へのデリバリーのためにそのリポソーム内に閉
    じ込められた親油性治療用化合物を、含んで成る哺乳類
    宿主に治療用化合物をデリバリーするためのリポソーム
    組成物。
  2. 【請求項２】前記スフィンゴミエリンとコレステロール
    が、75/25mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレステロ
    ールから30/50mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレス
    テロールまでのモル比で存在する、請求項１に記載のリ
    ポソーム組成物。
  3. 【請求項３】前記スフィンゴミエリンとコレステロール
    が、70/30mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレステロ
    ールから40/45mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレス
    テロールまでのモル比で存在する、請求項２に記載のリ
    ポソーム組成物。
  4. 【請求項４】前記スフィンゴミエリンとコレステロール
    が、約55/45mol％/mol％スフィンゴミエリン／コレステ
    ロールの比で存在する、請求項３に記載のリポソーム組
    成物。
  5. 【請求項５】前記親油性治療用化合物がアルカロイドで
    ある、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  6. 【請求項６】前記アルカロイドが、ビンクリスチン、ビ
    ンブラスチン、又はエトポジドあるいはそれらのプロド
    ラッグから選ばれる、請求項５に記載のリポソーム組成
    物。
  7. 【請求項７】前記アルカロイドがビンクリスチンであ
    る、請求項５に記載のリポソーム組成物。
  8. 【請求項８】前記ビンクリスチンが、約0.01/1.0〜0.2/
    1.0の薬物対脂質比で存在する、請求項７に記載のリポ
    ソーム組成物。
  9. 【請求項９】ホスファチジルコリン、ホスファチジルエ
    タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
    ルグリセロール、ホスファチド酸、カルジオリピン、ホ
    スファチジルイノシトール、セラミド、セレブロシド及
    びガングリオシドから選ばれた少なくとも１種の脂質を
    さらに含む、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  10. 【請求項１０】前記リポソームが単層である、請求項１
    に記載のリポソーム組成物。
  11. 【請求項１１】前記リポソームが、約0.05ミクロン〜0.
    45ミクロンの平均直径をもつ、請求項１に記載のリポソ
    ーム組成物。
  12. 【請求項１２】前記リポソームが、約0.05ミクロン〜0.
    2ミクロンの平均直径をもつ、請求項１に記載のリポソ
    ーム組成物。
  13. 【請求項１３】前記内部が、約pH4.0におけるシトレー
    ト・バッファーを含む、請求項１に記載のリポソーム組
    成物。
  14. 【請求項１４】以下の工程： pH2よりも高い酸性pHをもつ第１緩衝液化水溶液中、ス
    フィンゴミエリンとコレステロールを含む混合物からリ
    ポソームを形成する工程；及び 上記第１緩衝液化水溶液のpHよりも高いpHをもつ第２緩
    衝液化溶液中に上記リポソームを懸濁させ、それによ
    り、そのリポソームへの治療用化合物の輸送を容易にす
    るトランスメンブランpH勾配を作り、ここで、上記治療
    用化合物を含有するリポソーム内部がpH2からpH6までに
    ある工程、 により製造された、親油性治療用化合物のデリバリーの
    ためのリポソーム。
  15. 【請求項１５】前記工程が、前記リポソームにより封入
    されていない治療用化合物を含有する第２バッファーか
    ら、その治療用化合物を含有するリポソームを分離する
    工程をさらに含む、請求項14に記載の工程により製造さ
    れたリポソーム。
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