KR20220057883A - 면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및 면역세포;를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체에 관한 것으로, 본 발명의 면역세포-나노리포좀 복합체는 종양 세포와 결합할 수 있는 항암 제제를 포함하여 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 후 항암 제제를 종양 세포에 침투시킴으로써, 고형 종양 세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있다.

Description

면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법 {IMMUNOCYTE-NANOLIPOSOME COMPLEX AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 2종 이상의 인지질류, 콜레스테롤, 및 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및 면역세포;를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
종양 치료를 위해 외과적 수술, 방사선 치료 및 화학적 요법 등의 다양한 치료법이 발전해 왔다. 그러나, 종양에 따라 치료 방법이 상이하고 종양이 빈번하게 재발하는 등 다양한 문제가 여전히 존재한다. 종양 치료법 중 화학적 요법으로는 1세대 (화학적 항암 제제), 2세대 (표적 항암 제제), 3세대 (면역 항암 제제 및 세포 치료제) 및 4세대 (대사 항암 제제) 등 다양한 항암 제제가 연구ㆍ개발되어 왔다.
1세대 항암 제제는 가장 전통적으로 사용된 항암 제제다. 그러나, 정상 세포에 대하여 독성을 나타내어, 골수기능저하, 위장장애 또는 탈모증 등 다양한 부작용을 낳았다. 게다가, 종양 세포가 항암 제제에 대하여 내성을 갖는 등 많은 부작용이 보고되어 1세대 및 2세대 항암 제제만을 이용하는 종양 치료법은 한계가 있다.
또한, 2세대 항암 제제는 특이적으로 표적 종양 세포에 도달하는 항암 제제다. 그러나, 표적의 수와 종류가 제한적이고, 1세대 항암 제제와 마찬가지로, 종양 세포가 항암 제제에 대하여 내성을 가질 수 있는 부작용이 있다.
또한, 3세대 항암 제제는 환자의 면역 기능을 이용하기 때문에 면역 항암 제제 또는 세포 치료제라고 하며, 이를 이용하여 혈액암종을 치료할 수 있음이 밝혀져 많은 연구가 진행되었다. 그러나, 3세대 치료제는 면역교란과 같은 새로운 문제점이 있고, 게다가 혈액암종이 아닌 고형암에 대하여는 그 효과가 미미하다는 문제점이 있다.
또한, 제4세대 항암 제제는 종양 세포 특이적 미토콘드리아의 대사 경로 차단, 종양 세포의 자가포식 (autophagy) 과정 억제, 또는 거대 음세포 작용을 억제시켜 종양 세포의 증식을 저지하는 방법을 연구 중이다.
현재 진행 중인 연구 중 일부는 키메라 항원 수용체-T 세포 (Chimeric antigen receptor-T cell, CAR-T)를 이용하여 치료 효율을 높인 항암 제제에 관한 것이나, 여전히 고형 암종에 대하여 유의미한 치료 효과를 나타낸 항암 제제는 보고된 바 없다.
현재 진행 중인 다른 연구 중 일부는 1세대 또는 2세대 항암 제제를 담지 또는 결합한 나노 입자에 관한 것이나, 항암 제제에 의한 전신 약물 반응과 같은 부작용이 나타날 가능성이 여전히 높다는 문제점이 있다.
따라서, 고형 암종에 대한 투여 효율이 높으면서도, 전신 약물 반응과 같은 세포독성과 같은 부작용이 없고, 항암 제제를 종양 세포까지 효율적으로 전달하는 새로운 치료제의 개발이 시급하다.
이에 본 발명자들은 종양 세포에 특이적으로 결합하는 세포 치료제로서, 항암 제제의 종양 세포에 대한 침투 효율이 높아서 고형 암종 (고형 종양 세포)에 대하여도 항암 제제를 효율적으로 침투시킬 수 있는 치료제를 만들기 위하여 노력하였다.
그 결과, 2종 이상의 인지질류, 콜레스테롤, 및 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및 면역세포;를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체는 종양 세포와 특이적으로 결합하여 항암 제제를 침투시킴으로써, 종양 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 면역세포-나노리포좀 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역세포-나노리포좀 복합체를 포함하는 암 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및 면역세포;를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체에 관한 것으로, 구체적으로, 인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물, 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물, 및 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체가 면역세포의 표면에 부착된 면역세포-나노리포좀 복합체에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 나노리포좀 구조체가 면역세포 (Immunocyte)의 표면에 부착된 면역세포-나노리포좀 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 나노리포좀 구조체는 인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물, 및 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 나노리포좀 구조체는 이중층 구조의 미셀 (Micelle)을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인지질은 수소화된 달걀 포스파티딜콜린 (Hydrogenated egg phosphatidylcholine, HEPC), 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (Hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (Dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린 (Distearoyl phosphatidylcholine, DSPC), 디아라키도일 포스파티딜콜린 (Diarachidoyl phosphatidylcholine, DAPC), 다이미리스토일 포스파티딜콜린 (Dimyristoyl phosphatidylcholine, DMPC), 달걀 포스파티딜콜린 (Egg phosphatidylcholine, EPC), 콩 포스파티딜콜린 (Soy phosphatidylcholine, SPC), 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린 (Palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine, POPC), 디올레오일 포스파티딜콜린 (Dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC), 디라우로일 포스파티딜콜린 (Dilauroyl phosphatidylcholine, DLPC), 디운데카노일 포스파티딜콜린 (Diundecanoyl phosphatidylcholine), 디데카노일 포스파티딜콜린 (Didecanoyl phosphatidylcholine) 및 디노나노일 포스파티딜콜린 (Dinonanoyl phosphatidylcholine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인지질과 나노리포좀 구조체의 몰비 (molar ratio)는 16:1 내지 20:1, 16:1 내지 19:1, 17:1 내지 20:1, 17:1 내지 19:1, 18:1 내지 20:1 또는 18:1 내지 19:1일 수 있으며, 예를 들어, 18:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 콜레스테롤은 인지질, 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물, 및 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물 사이에 위치함으로써 이중층 구조의 미셀을 형성한 나노리포좀 구조체의 안정화하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 콜레스테롤과 나노리포좀 구조체의 몰비는 6:1 내지 10:1, 6:1 내지 9:1, 7:1 내지 10:1, 7:1 내지 9:1, 8:1 내지 10:1 또는 8:1 내지 9:1일 수 있으며, 예를 들어, 8:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물은 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 [1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt), MPB-PE]일 수 있다.
본 발명에 있어서 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 (MPB-PE)과 나노리포좀 구조체의 몰비는 1:1 내지 3:1 또는 2:1 내지 3:1일 수 있으며, 예를 들어, 2:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 (MPB-PE)은 리포좀 제조 시 인지질 사이에 삽입되고, 면역세포의 세포막에 존재하는 -SH (thiol group)기와 반응함으로써, 나노리포좀 구조체와 면역세포가 연결되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물은 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG-carboxylic acid, DSPE-PEG2000-COOH)일 수 있다.
본 발명에 있어서 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)과 나노리포좀 구조체의 몰비는 1:1 내지 3:1 또는 2:1 내지 3:1일 수 있으며, 예를 들어, 2:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)은 리포좀과 3차 항암 제제를 연결하는 것일 수 있다.
예를 들어, 아벨루맙 (avelumab)과 같은 3차 항암 제제는 항체 형태의 단백질이며 -NH2 (amine group)기를 가지고 있다. 리포좀과 3차 항암 제제의 결합은 DSPE-PEG2000-COOH의 -COOH기가 EDC/NHS coupling을 통하여 불안정한 중간 결합체를 이루고, 이 후 3차 항암 제제의 -NH2 기와 반응함으로써 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 디스테아로일포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)의 카복시기 (-COOH)는 친수성이어서 나노리포좀 구조체의 표면으로부터 돌출되도록 배치되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC), 콜레스테롤, 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 (MPB-PE) 및 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)과 나노리포좀 구조체의 몰비는 18:8:2:2:1인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 나노리포좀 구조체는 항암 제제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 항암 제제는 아벨루맙 (Avelumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 올라파립 (Olaparib), 펨브로리주맙 (Pembrolizumab), 리투시맙 (Rituximab), 수니티닙 (Sunitinib), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 라파티닙 (Lapatinib), 더발루맙 (durvalumab) 및 이필리무맙 (Ipilimumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 아벨루맙일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항암 제제는 이에 상응하는 암세포의 항원 단백질을 인식하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 아벨루맙은 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)의 카복시기 (-COOH)에 결합되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 나노리포좀 구조체의 직경은 100 내지 300 nm, 100 내지 280 nm, 100 내지 260 nm, 100 내지 240 nm, 110 내지 300 nm, 110 내지 280 nm, 110 내지 260 nm, 110 내지 240 nm, 120 내지 300 nm, 120 내지 280 nm, 120 내지 260 nm 또는 120 내지 240 nm일 수 있으며, 예를 들어 120 내지 240 nm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 면역 세포는 자연살해세포 (Natural killer cell, NK cell), 세포독성 T세포 (Cytotoxic T cell), 종양 침윤 림프구 (Tumor infiltrating lymphocyte, TIL), 수지상세포 (Dendritic cell) 및 대식세포 (Macrophage)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 자연살해세포인 것일 수 있다.
자연살해세포는 세포 독성 (cytotoxicity)을 가지므로, 고형암에 대한 살해 효과 (killing effect)를 나타내고, 종양 미세 환경 (microenvironment)으로 인해 억제된 면역반응을 강화하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 나노리포좀 구조체와 면역세포의 중량비는 500:1 내지 4,500:1, 500:1 내지 4,300:1, 500:1 내지 4,000:1, 500:1 내지 3,800:1, 500:1 내지 3,500:1, 500:1 내지 3,300:1, 500:1 내지 3,000:1, 500:1 내지 2,500, 500:1 내지 2,000:1, 1,000:1 내지 4,500:1, 1,000:1 내지 4,300:1, 1,000:1 내지 4,000:1, 1,000:1 내지 3,800:1, 1,000:1 내지 3,500:1, 1,000:1 내지 3,300:1, 1,000:1 내지 3,000:1, 1,000:1 내지 2,500, 1,000:1 내지 2,000:1, 인 것일 수 있으며, 예를 들어, 1,000:1 내지 2,000:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 면역세포-나노리포좀 복합체를 포함하는 암 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암 및 악성흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 암 예방, 개선 및 치료용 조성물은 유효성분인 면역세포-나노리포좀 복합체 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
유효성분이란 암 예방, 개선 및 치료용 조성물의 주성분이 면역세포-나노리포좀 복합체인 것을 의미할 수 있다. 즉, 면역세포-나노리포좀 복합체가 암 예방, 개선 및 치료용 조성물의 암 예방, 개선 및 치료 기능을 직접 또는 간접적으로 발현시키는 성분임을 의미할 수 있다.
본 발명의 암 예방, 개선 및 치료용 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 암 예방, 개선 및 치료용 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 암 예방, 개선 및 치료용 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 조성물은 혈전 형성을 수반하는 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조 방법에 관한 것이다:
인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물 및 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물을 용매에 혼합하여 나노리포좀 구조체를 제조하는 구조체 제조 단계; 및
면역세포와 상기 나노리포좀 구조체를 혼합하여 면역세포-나노리포좀 복합체를 제조하는 복합체 제조 단계.
본 발명에 있어서 구조체 제조 단계는 1 내지 5시간, 1 내지 4시간, 1 내지 3시간, 2 내지 5시간, 2 내지 4시간 또는 2 내지 3시간 동안 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 2시간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 구조체 제조 단계는 나노리포좀 구조체를 막에 여과시키는 여과 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 막은 폴리카보네이트로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 막의 공극 크기는 150 내지 250 nm, 150 내지 230 nm, 150 내지 210 nm, 170 내지 250 nm, 170 내지 230 nm, 170 내지 210 nm, 190 내지 250 nm, 190 내지 230 nm 또는 190 내지 210 nm인 것일 수 있으며, 예를 들어, 200 nm인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 여과 단계의 수행 회수는 15회 이상, 17회 이상, 19회 이상 또는 21회 이상 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 21회 이상 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 복합체 제조 단계는 면역세포와 나노리포좀 구조체의 개수비를 1:500 내지 1:2,000, 1:500 내지 1:1,500, 1:500 내지 1:1,300, 1:800 내지 1:2000, 1:800 내지 1:1,500 또는 1:800 내지 1:1,300으로 하여 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1:1000으로 하여 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 복합체 제조 단계는 불활성화 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 불활성화 단계는 면역세포-나노리포좀 복합체를 PEG Thiol (Polyethylene glycol methyl ether thiol)이 포함된 RPMI-1640 배지와 반응시킴으로써, 나노리포좀 구조체에 존재하는 면역세포와 반응하지 않은 말레이미드 잔기를 불활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 면역세포-나노리포좀 복합체는 종양 세포와 특이적으로 결합할 수 있는 항암 제제를 포함함으로써, 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 후 항암 제제를 종양 세포에 침투시킬 수 있으므로, 종양 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 또한, 면역세포를 이용함으로써 침투력이 증가하므로, 항암 제제를 침투시키기 어려운 고형 종양 세포에도 항암 제제를 침투시켜 사멸시킬 수 있다.
도 1은 나노리포좀 구조체가 면역세포의 세포막에 존재하는 -SH기 (thiol group)와 반응하여 형성한 면역세포-나노리포좀 복합체의 결합 관계를 나타낸 모식도이다.
도 2는 나노리포좀 구조체의 구조와 구성 성분을 나타내고, 항체류와 같은 항암 제제가 나노리포좀 구조체의 DSPE-PEG2000-COOH의 -COOH기 (carboxyl group)와 반응하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3a는 나노리포좀 구조체의 직경 (Particle size)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3b는 나노리포좀 구조체의 제타 전위 (Zeta potential)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 항체가 부착된 나노리포좀 구조체 및 항체가 부착되지 않은 나노리포좀 구조체에 대하여 Human IgG 항체를 첨가한 후 그 농도를 측정한 그래프이다.
도 5는 나노리포좀 구조체와 자연살해세포의 혼합 비율에 따른 NK cell당 이에 결합하는 나노리포좀 구조체의 개수를 측정한 그래프이다.
도 6은 나노리포좀 구조체와 면역세포-나노리포좀 복합체를 유세포 분석기로 분석하여 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 나노리포좀 구조체와 면역세포-나노리포좀 복합체를 공초점 현미경으로 분석하여 비교한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 면역세포-나노리포좀 복합체의 세포독성 (Apoptosis assay)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 암세포 인위적 유발 모델 마우스에 대하여 면역세포-나노리포좀 복합체의 암세포 치료 과정을 전체적으로 나타낸 개략도이다.
도 10은 PBS-model 마우스에 대하여 면역세포-나노리포좀 복합체의 투여에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 나노리포좀 구조체의 제조
클로로폼 (choloroform) 및 메탄올 (methanol)이 9:1의 비율 (총 2 mL)인 용매가 든 플라스크에 HSPC (Hydro soy PC), 콜레스테롤 (C8667, sigma, CAS no. 57-88-5, cholesterol), 18:1 MPB-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl) butyramide] 및 DSPE-PEG2000-COOH (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG-carboxylic acid)를 18:8:2:2의 몰비로 첨가하였다.
첨가된 성분을 완전히 녹인 후, 회전 농축기를 이용하여 65 ℃의 온도 조건을 유지하는 항온 수조 내에서 용매를 완전히 증발시켜 제거하였다. 박막이 생성된 플라스크는 2 mL의 PBS (Phosphate-bufferd saline)를 첨가 후, 항온 수조에서 2시간 동안 반응하여 리포좀 구조체를 제조하였다.
리포좀 구조체의 크기를 균일하게 제어하기 위하여, 두 개의 주사기가 맞닿고, 주사기 사이에 폴리카보네이트 막 (polycarbonate, 공극 크기: 200 nm)이 배치된 여과장치를 이용하여 나노리포좀 구조체를 여과하였다. 나노리포좀 구조체가 용해된 PBS (Phosphate-bufferd saline)는 하나의 주사기에 충전되고, 맞닿는 주사기를 흡입하여 여과하는 방식으로, 총 21회 여과하여 나노리포좀 구조체가 균일한 크기를 갖도록 제어한 후, 4 ℃의 온도 조건에서 보관하였다.
제조된 리포좀 구조체에 항암 제제인 아벨루맙 (Avelumab)을 결합하기 위하여, 리포좀 10 umol을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (1-Ethyl-3-(3-[(1-ethyl-3-(3-dimethylamino) propyl carbodiimide hydrochloride, EDC] 2 mg, 히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt, Sulfo-NHS) 3 mg이 포함된 용매와 함께 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이 후, 아벨루맙 (Avelumab)을 리포좀과 1:1,000 (antibody:phospholipid) 몰비로 첨가한 후, 상온에서 밤새 반응하였다. 반응하지 않은 EDC, Sulfo-NHS 및 아벨루맙을 투석 튜브 (dialysis membrane tubing, 300Kda)와 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline, PBS)를 이용하여 제거하였다.
제조예 2. 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조
자연살해세포는 인체의 혈액의 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 percoll을 이용하여 밀도 기울기 (density gradient) 방법으로 분리하였다. 분리된 PBMC는 NK isolation Kit (밀테니 바이오텍) 및 MACS (magnetic cell separation, AutoMACS, 밀테니 바이오텍)를 이용하여 자연살해세포만을 분리하였으며 그 순도는 90% 이상이었다. 이후, NK Macs Medium (밀테니 바이오텍)에 5% Human AB serum 및 IL-2 20 ug/mL (밀테니 바이오텍)를 첨가한 배지로 자연살해세포를 배양하였다. 배양된 자연살해세포는 2주 이내에 사용되었다.
면역세포-나노리포좀 복합체는 RPMI-1640 배지에서 자연살해세포(NK cell)와 상기 제조예 1에서 제조된 나노리포좀 구조체의 개수비를 1:1,000 (NK cell:liposome)으로 하여 혼합하였고, 30분 동안 37℃의 온도 조건에서 인큐베이터 내에서 반응시켰다. 자연살해세포와 결합되지 않은 리포좀은 PBS를 이용해 2회 washing 하여 제거하였다. 그 후, 나노리포좀 구조체에 존재하는 면역세포와 반응하지 않은 말레이미드 잔기를 비활성시키기 위하여, PEG Thiol (Polyethylene glycol methyl ether thiol)이 1 mg/mL의 농도로 포함된 RPMI-1640 배지와 30분 동안 반응시키고, washing을 통해 반응하지 않은 PEG Thiol을 제거함으로써, 도 1 및 도 2에 나타낸 면역세포-나노리포좀 복합체를 제조하였다.
실험예 1. 나노리포좀 구조체의 물성 확인
1-1. 나노리포좀 구조체의 직경
제조예 1에서 제조한 리포좀의 구조체의 직경 (Particle size)은 나노 입도 분석기 (Zetasizer nano ZS Malvern panalytical)를 이용하여 측정하여 도 2에 나타내었고, 도 3a에서 확인할 수 있듯이, 제조된 나노리포좀의 직경은 평균 176.5 ± 58.7 nm로 측정되었다.
1-2. 나노리포좀 구조체의 제타 전위
제조예 1에서 제조한 리포좀의 구조체의 제타 전위 (Zeta potential)는 나노 입도 분석기 (Zetasizer nano ZS Malvern panalytical)를 이용하여 측정하여 도 3에 나타내었고, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 제조된 나노리포좀의 제타 전위는 평균 0.145 ± 0.1 nm로 측정되었다.
실험예 2. 나노리포좀의 항체 담지 (loading) 효율 확인
나노리포좀의 표면에 부착된 항체의 농도를 확인하기 위하여, Human IgG 항체를 이용해 알아보았다. 이는 아벨루맙의 종류가 Human IgG1 이기 때문에 확인이 간접적으로 가능할 것으로 판단하였기 때문이다.
상기 제조예 2의 과정 중에서, 아벨루맙 (Avelumab)을 대체하여 Human IgG 항체 (Human IgG Isotype Control, 인비트로젠)를 나노리포좀에 부착하였다. 다음으로, ELISA 키트 (Human IgG Total ELISA Kits, 레이바이오텍)를 이용하여, 항체가 부착된 나노리포좀과 항체가 부착되지 않은 나노리포좀의 농도를 확인하여 도 4 및 표 1에 나타내었다.
Drug load Antibody on liposome
Human IgG Conc. (ug/mL) 750 222.9 ± 9.57
도 4 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 750 ug/mL의 Human IgG를 처리하면 1 x 107 개의 나노리포좀을 기준으로 Human IgG의 농도는 222.9 ± 9.57 ug/mL으로 측정되었다. 즉, 나노리포좀 구조체의 약물 담지 효율은 약 29.72%인 것으로 측정되었다. 또한 항체를 부착하지 않은 나노리포좀에서 IgG 농도는 탐지되지 않음을 통해 나노리포좀의 비특이적인 반응은 없음을 확인하였다.
실험예 3. NK cell당 나노리포좀의 개수 측정
자연살해세포에 부착되는 나노리포좀의 개수를 확인하기 위하여, 형광을 발현하는 친유성의 카르보시아닌 (carbocyanine)인 DID (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine)와 상기 제조예 1에서 제조한 나노리포좀 구조체를 0.01:1의 몰비로 혼합하여 형광체-나노리포좀 복합체를 제조하였다.
상기 제조예 2의 방법으로 나노리포좀 및 자연살해세포를 4,000:1 내지 250:1 등의 다양한 중량비로 결합하여 면역세포-나노리포좀 복합체를 제조한 후, 마이크로플레이트 리더기(Varioskan Flash, 써모 피셔 사이언티픽)를 이용하여 자연살해세포당 결합된 나노리포좀의 개수를 확인하여 그 결과를 도 5 및 표 2에 나타내었다.
Conjugation ratio (NPs:NK Cell) 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
4,000:1 2,000:1 1,000:1 500:1 250:1
Numbers of NPs per NK cell 99.5±0.5 105.3±0.7 84.6±1.2 66.6±1.5 15.7±0.5
도 5 및 표 2로부터 확인할 수 있듯이, 나노리포좀 구조체의 중량비를 증가시킴에 따라 자연살해세포에 결합되는 나노리포좀 구조체의 개수 (Numbers of NPs per NK cell)는 증가하였으며, 나노리포좀 구조체와 면역세포의 비율 (NPs:NK Cell)이 1,000:1인 경우, 하나의 자연살해세포에 약 84개, 2,000:1인 경우에는 약 105개, 4,000:1인 경우, 약 99개의 나노리포좀이 결합한것으로 측정되었다. 즉, 1,000:1 내지 4,000:1의 중량비 범위에서 자연살해세포 하나에 약 100여 개의 나노리포좀이 결합한 것으로 측정되었으며, 1,000:1 내지 2,000:1의 중량비 범위에서 자연살해세포에 나노리포좀의 결합 효율이 우수한 것으로 판단하였다.
실험예 4. 면역세포-나노리포좀 복합체의 결합 분석
면역세포-나노리포좀 복합체의 결합을 확인하고자 유세포분석을 실시하였다. 상기 실험예 4의 DID가 표지된 나노리포좀에 아벨루맙을 대체하여 Human IgG(Alexa flour 488)을 결합시킨 후, 상기 제조예 2와 같이 자연살해세포와 결합시켰다.
유세포분석기(MACSQuant cytometer, 밀테니 바이오텍)를 통해 분석한 결과를 도 6에 나타내었으며, 도 6으로부터 확인할 수 있듯이, DID로 인하여 APC의 파장을 가지는 나노리포좀과, APC의 파장 및 Alexa-488 항체로 인하여 FITC의 파장을 가지는 나노리포좀이 뚜렷이 구분되었다. 이로써 나노리포좀은 전체 자연살해세포에 잘 분포하고 있음을 확인할 수 있었다.
상기의 결과를 교차 확인하기 위하여 동일한 방법으로 면역세포-나노리포좀의 복합체를 제조한 후, 이를 공초점 레이저 주사 현미경 (Zeiss LSM 880, Carl Zeiss)으로 확인한 결과를 도 7에 나타내었으며, 도 7로부터 확인할 수 있듯이, 자연살해세포의 막에 리포좀 및 항체가 결합되어 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 면역세포-나노리포좀 복합체의 세포독성 확인
자연살해세포-나노리포좀 구조체 (NK@Lipo)와 일반 자연살해세포 (Control)의 세포독성능을 평가하기 위하여, LDH (lactodehydrogenase) 세포독성능 검사를 수행하였다. 효과기 세포(Effector cell) 와 표적세포(Target cell)로써 자연살해세포 및 자연살해세포-나노리포좀 복합체를 사용하였고, 표적세포로써 PD-L1을 발현하는 것으로 알려진 A549 세포주를 사용하였다. 효과기세포 및 표적세포의 비율(E:T ratio)을 1:1, 5:1 및 10:1로 혼합한 후, 37 ℃ 및 5% CO2 조건으로 4시간 배양하였다.
원심분리 후, 50 uL 의 상층액을 새로운 96 well plate로 옮긴 후, 50 uL의 substrate mixture (CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay Kit, 인비트로젠)와 30분 동안 반응시켰다. 마이크로 플레이트 리더기 (490nm absorbance)로 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8로부터 확인할 수 있듯이, 자연살해세포-나노리포좀 구조체의 세포독성능은 대조군인 자연살해세포의 세포독성능과 비슷한 수준인 것으로 측정되었다.
실험예 6. 면역세포-나노리포좀 복합체의 고형암 치료능 확인
상기 제조예에서 제조된 면역세포-나노리포좀 복합체의 고형암 치료능력을 확인하기 위하여 생후 6주령의 BALB/c nude 마우스를 이용하였다. 실험예 7의 개략적인 진행도는 도 9에 나타내었다.
고형 암을 유도하기 위하여 5 x 106 의 A549 세포를 피하에 주입한 후, 암세포를 주입한 날로부터 일주일 후 대조군 및 실험군에 정맥 투여 (I.V.)를 수행하였다. 각 실험군에서 투여한 자연살해세포 및 면역세포-나노리포좀 복합체수는 5 x 106 이고, 3일의 간격을 두고 2회 투여하였다. 또한 양성 대조군으로써 처리된 Avelumab은 마우스당 200 ug을 투여하였다. 시간에 따른 고형 암의 크기 (tumor volume) 변화는 도 10 및 표 3에 나타내었다.
tumor volume (mm3) weeks
0 1 2 3 4 5
PBS 0 25.6 21.3 79.9 138.4 336.6
NK 0 15.0 7.2 124 39.0 88.4
NK+avelumab 0 90.9 16.8 52.2 140.0 255.4
NK+avelumab(liposome complex) 0 29.8 7.4 5.0 5.6 14.6
도 10 및 표 3으로부터 확인할 수 있듯이, 면역세포-나노리포좀 복합체가 투여된 실험군에서 가장 높은 항암효과를 나타내었다.
면역세포-나노리포좀 복합체를 투여한 경우, 5주 경과시 종양 크기 (Tumor volume)가 14.6 mm3 인 것으로 측정되었다. 양성 대조군인 자연살해세포 단독투여의 경우, 5주 경과시 종양 크기는 88.4 mm3이고, 자연살해세포와 Avelumab을 병용투여한 경우, 255.4 mm3인 것으로 측정된 것에 비하여, 우수한 항암 효과를 나타내었기 때문에, 면역세포-나노리포좀 복합체의 항암 치료능에 대한 잠재적인 가능성이 있는 것으로 판단하였다.
따라서, 본 발명의 면역세포-나노리포좀 복합체는 종양 세포와 결합할 수 있는 항암 제제를 포함하여 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 후 항암 제제를 종양 세포에 침투시킴으로써, 종양 세포, 나아가 고형 종양 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims (17)

  1. 인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물, 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물, 및 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및
    면역세포 (Immunocyte);를 포함하고,
    상기 인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 제1화합물 및 제2화합물은 이중층 구조의 미셀 (Micelle)을 형성하고,
    제2화합물의 카복실기 (-COOH)는 상기 미셀의 표면으로부터 돌출되도록 위치하고, 상기 항암 제제는 상기 카복실기 (-COOH)를 통하여 제2화합물과 결합하고,
    상기 나노리포좀 구조체는 제1화합물을 통하여 면역세포에 부착되는 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 수소화된 달걀 포스파티딜콜린 (HEPC), 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 디아라키도일 포스파티딜콜린 (DAPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC), 달걀 포스파티딜콜린 (EPC), 콩 포스파티딜콜린 (SPC), 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린 (POPC), 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC), 디라우로일 포스파티딜콜린 (DLPC), 디운데카노일 포스파티딜콜린, 디데카노일 포스파티딜콜린 및 디노나노일 포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인지질과 나노리포좀 구조체의 몰비 (molar ratio)는 16:1 내지 20:1인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콜레스테롤과 나노리포좀 구조체의 몰비 (molar ratio)는 6:1 내지 10:1인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물 은 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 [1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt), MPB-PE], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 콜레스테롤, 콜레스테롤 올레에이트, 디헥사데실 포스페이트, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(숙시닐), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](소듐 염), 및 트리에틸암모늄 2,3-디아세톡시프로필 2-(5-((3aS,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)에틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물과 나노리포좀 구조체의 몰비 (molar ratio)는 1:1 내지 3:1인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물은 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물과 화합물과 나노리포좀 구조체의 몰비 (molar ratio)는 1:1 내지 3:1인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노리포좀 구조체의 직경은 100 내지 300 nm인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해세포 (Natural killer cell, NK cell), 세포독성 T세포 (Cytotoxic T cell), 종양 침윤 림프구 (Tumor infiltrating lymphocyte, TIL), 수지상세포 (Dendritic cell) 및 대식세포 (Macrophage)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 나노리포좀 구조체와 면역세포의 중량비는 500:1 내지 4500:1인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항암 제제는 아벨루맙 (Avelumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 올라파립 (Olaparib), 펨브로리주맙 (Pembrolizumab), 리투시맙 (Rituximab), 수니티닙 (Sunitinib), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 라파티닙 (Lapatinib), 더발루맙 (durvalumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체.
  13. 인지질, 콜레스테롤 (Cholesterol), 말레이미드기 (maleimide group)를 포함하는 제1화합물, 카복실기 (carboxyl group)를 포함하는 제2화합물, 및 항암 제제를 포함하는 나노리포좀 구조체; 및
    면역세포 (Immunocyte);를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체를 포함하는 암 예방, 개선 및 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암 및 악성흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  15. 다음의 단계를 포함하는 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조 방법:
    수소화된 콩 포스파티딜콜린 (Hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC), 콜레스테롤 (Cholesterol), 디팔미토일 글리세로 포스포에탄올아민 (MPB-PE), 디스테아로일글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜 카복시산 (DSPE-PEG2000-COOH)를 용매에 혼합하여 나노리포좀 구조체를 제조하는 구조체 제조 단계; 및
    면역세포와 상기 나노리포좀 구조체를 혼합하여 면역세포-나노리포좀 복합체를 제조하는 복합체 제조 단계.
  16. 제15항에 있어서, 상기 구조체 제조 단계는 나노리포좀 구조체를 막에 여과시키는 여과 단계를 더 포함하는 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 복합체 제조 단계는 불활성화 단계를 더 포함하는 것인, 면역세포-나노리포좀 복합체의 제조 방법.
KR1020200142986A 2020-10-30 2020-10-30 면역세포-나노리포좀 복합체 및 이의 제조 방법 KR102540728B1 (ko)

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