KR102304705B1 - 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것으로, 상기 마이크로로봇은 를 포함함으로써 비수술적 방법으로 종양 또는 염증 등의 면역 치료, 화학적 치료와 함께 광열/광역학 치료가 동시에 가능하므로, 부작용을 최소화하고 치료 효율을 극대화하는 향상된 새로운 면역치료법을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

면역세포-기반 의료용 마이크로로봇{Immunocyte-based Microrobot for Medical use}
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것이다.
종양이나 염증 등의 치료에서 사용하는 생체 적합성 폴리머(Polymer) 등으로 약물을 코팅하여 전달하는 나노입자에 의한 약물 전달체는 혈관을 통해서만 이동이 가능하여, 혈관 생성이 미흡한 종양 조직의 중심부까지는 충분히 전달되지 않는다. 또한, 나노입자의 크기가 큰 경우에는 면역세포에 의해 탐식되거나, 크기가 작은 경우에는 신장에 의해 배설되는 등 나노입자의 크기에 따라 약물 전달의 효율이 달라지기 때문에, 약물의 병변부로의 전달이 제한적인 한계가 있다.
최근 들어, 이러한 한계를 극복하기 위하여 면역세포를 이용한 약물 전달체 개발에 관한 연구들이 진행되고 있다. 그 기본 원리는 암세포, 외부 침입 병원체 또는 염증 세포들에 대해 주화성을 갖는 면역세포를 이용, 자성 나노입자 또는 금나노입자를 내부에 포함시킨 후 세포의 침투능에 의해 병변부로 전달한 후 외부 광 자극을 이용해 면역세포의 온도를 상승시켜 면역세포와 함께 주변 병변 세포를 파괴시켜 치료하는 기술이다. 하지만, 이러한 면역세포를 이용한 약물 전달체는 세포 자체의 주화성에 의한 이동에 의존적이므로 전달 시간이 매우 오래 걸리고, 치료용 약물이 아닌 광-과민제 등을 포함하고 있어 직접적인 약물전달 및 치료 효과를 기대하기 힘들며, 외부의 광 자극이 도달하지 못하는 심부 장기의 경우 그 효과를 더욱 기대하기 어려운 문제가 있다.
이에, 면역 치료, 화학 치료, 광열/광역학 치료가 동시에 이루어지는 시스템에 대한 연구가 시급한 실정이다.
국내공개특허 제10-2018-0092493호
본 발명자들은 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료 효과를 동시에 갖는 약물 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 면역세포 내부에 자성 나노입자 및/또는 금 나노입자, 및 약물이 담지된 리포좀 나노 구조체를 탐식시켜 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료가 동시에 가능한 마이크로로봇을 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역세포(Immunocyte); 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노입자, 금 나노입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료 효과를 동시에 갖는 약물 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 면역세포 내부에 자성 나노입자 및/또는 금 나노입자, 및 약물이 담지된 리포좀 나노 구조체를 탐식시켜 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료가 동시에 가능한 마이크로로봇을 제조할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 면역세포(Immunocyte), 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체, 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노입자, 금 나노입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot), 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 면역세포(Immunocyte); 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노입자, 금 나노입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot)에 관한 것이다.
상기 면역세포는 생체 내에서 면역을 담당하는 세포를 총칭하는 것으로, 예를 들어 대식세포(Marcrophage), 말초혈관유래 단핵구(Monocyte), 과립구, 자연살해세포(NK cell), T세포 또는 B 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "탐식"은 면역세포가 세포 밖의 입자나 분자 등 물질을 세포 내로 받아들인 상태로, 세포 밖의 물질을 세포 안으로 유입시키는 세포내도입(Endocytosis)의 한 형태를 의미한다.
본 발명에서 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 지질 2중층 구조의 형태를 갖는 것을 의미하며, "리포좀 나노 구조체"는 리포좀 형태의 상기 생리활성 성분이 담지 될 수 있는 구조를 갖는 나노미터 크기의 구조체를 의미한다.
상기 리포좀 나노 구조체는 용매, 지질(인지질), 유화제(Emulsifier) 및/또는 콜레스테롤(Cholesterol)을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
상기 용매는 예를 들어 클로로폼(chloroform) 및/또는 메탄올(methanol) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인지질은 포스페이트기와 같은 극성이 높은 관능기와 다양한 사슬 구조를 갖는 지방산 2개가 결합한 물질로 포화 또는 불포화 타입 모두 사용 가능하며, 예를 들어 DPPC(Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유화제(Emulsifier)는 당 업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 DSPE-PEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 및/또는 DSPE-PEG2000-Folate(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 리포좀 나노 구조체는 인지질 70-80 중량%, 유화제 10-20 중량% 및 콜레스테롤 5-15 중량%를 포함할 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 리포좀 나노 구조체의 열-민감성(Thermosensitive)이 증대되는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 마이크로로봇은 상기 리포좀 나노 구조체를 포함함으로써, 근적외선(NIR) 조사에 반응하여 마이크로로봇 및 그 주변의 온도가 상승될 수 있다.
상기 리포좀 나노 구조체의 직경은 100-200nm 또는 150nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 세포 내로 담지되기가 용이(easy uptake by cells)한 효과가 있다.
상기 리포좀 나노 구조체는 하기에서 설명할 자성 나노입자, 금 나노입자 및 약물이 모두 담지된 것일 수도 있고, 그 중 일부만 담지된 것일 수도 있다.
상기 자성 나노입자는 내부에 자성체를 포함하여 자성 민감도를 가지는 다양한 물질의 나노입자를 의미하며, 상기 자성 나노입자는 자성 민감도를 갖는 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으나, 자성 물질 또는 자성 합금일 수 있다.
상기 자성 물질은 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'2O4 또는 MxOy(M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수 임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 또는 NiFeCo일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 자성 나노입자는 상기와 같은 자성 민감도를 나타냄으로써, 외부 자기장 시스템(자기장 발생 장치)에 의해 본 발명의 마이크로로봇을 병변부로 고속/고지향 이동시킬 수 있으며, MRT 조영제(MRI contrast)의 역할을 수행할 수 있다.
또한, 상기 자성 나노입자는 외부 자기장에 의한 NIR 반응제(NIR responsive agents) 역할을 수행할 수 있다.
상기 자성 나노입자를 포함함으로써, 본 발명의 마이크로로봇은 병변부에 대한 광열/광역학 치료가 가능하다.
상기 자성 나노입자 직경은 1-50nm, 1-40nm, 1-30nm, 1-20nm 또는 10nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 체내에 흡수되어도 안전(safe for body)하며, 체내에서 분해되기 쉬운(easy to degrade in the body) 효과가 있다.
상기 금 나노입자는 입자 크기가 나노미터인 금(Au) 입자를 의미하며, 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않는다.
상기 금 나노입자를 포함함으로써, 본 발명의 마이크로로봇은 병변부에 대한 광열/광역학 치료가 가능하다.
구체적으로는, 상기 금 나노입자는 근적외선(NIR) 빛에 노출 되었을 때 빛의 전자기장 진동에 의해 금 입자 내부 자유전자의 결맞음 진동을 일으켜 열을 방출함으로써, 열을 이용한 암세포 사멸에 사용될 수 있다.
상기 금 나노입자는 막대형(rod)일 수 있고, 그 직경 및 길이는 1-5nm x 20-35nm, 또는 7nm x 29nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 NIR의 높은 흡광도를 가지며(NIR absorbance peak in NIR window), 체내에 흡수되어도 안전(safe for body)하고, 체내에서 분해되기 쉬운(eay to degrade in the body) 효과가 있다.
상기 금 나노입자는 표면에 엽산이 부착된 것일 수 있다.
상기 금 나노입자는 상기와 같이 표면에 엽산이 부착됨으로써, 엽산 수용체가 과발현된 일부 세포종(예를 들어, 유방암 세포종 4T1, MCF7 등)의 세포에 대한 표적성을 높일 수 있다.
상기 약물은 단백질, 펩타이드, 비타민, 핵산, 합성 약물 또는 천연 추출물일 수 있다.
상기 합성 약물은 독소루비신(Doxorubicin), 도세탁셀(Docetaxel) 및/또는 파클리탁셀(Paclitaxel)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약물은 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된 형태로 외부 자극에 의해 본 발명의 마이크로로봇으로부터 방출될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 암은 간암, 유방암, 위암, 폐암, 전립선암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암 또는 갑상선암 등의 고형암(Solid tumor)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약제학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 마이크로로봇을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 암 치료방법은 상술한 본 발명의 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약학 조성물을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "개체"는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 마이크로로봇의 암 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot)의 제조방법에 관한 것이다.
자성 나노입자 및 금 나노입자를 각각 제조하는 나노입자 제조 단계;
상기 자성 나노입자, 금 나노입자 및 이의 조합 중 하나를 포함하는 리포좀 나노 구조체를 제조하는 리포좀 제조 단계;
상기 리포좀 나노 구조체에 약물을 담지하는 약물 담지 단계; 및
별도로 배양된 면역세포(Immunocyte)에 상기 리포좀 나노 구조체를 첨가하여 배양하는 탐식(Phagocytosis) 단계.
상기 리포좀 나노 구조체는 용매, 지질(인지질), 유화제(Emulsifier) 및 콜레스테롤(Cholesterol)을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
상기 리포좀을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기의 성분들을 함께 교반하여 제조할 수 있다. 상기 리포좀 나노 구조체의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다.
상기 마이크로로봇의 제조방법에 있어, 상기 마이크로로봇의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락한다.
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것으로, 상기 마이크로로봇은 를 포함함으로써 비수술적 방법으로 종양 또는 염증 등의 면역 치료, 화학적 치료와 함께 광열/광역학 치료가 동시에 가능하므로, 부작용을 최소화하고 치료 효율을 극대화하는 향상된 새로운 면역치료법을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노입자의 빛 흡수력 확인한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노입자의 제타 전위를 측정한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노입자의 자화값을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노입자의 근적외선(NIR) 조사에 따른 온도 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 온도 변화에 따른 약물 방출 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로로봇의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노입자/자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로로봇의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로로봇의 개요도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 금 나노입자의 제조
플라스크에 염화금산(HAuCl4) 5 mL, CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide) 25 mL 및 물 25 mL를 넣고 교반하였다. 그 다음, 올레산나트륨(Sodium Oleate) 2.5 mL, 질산은(AgNO3) 1.25 mL, 염산(HCl) 40 μL 및 아스코르브산(Ascorbic Acid) 350 μL를 추가한 후, 용액의 색깔이 투명해질 때까지 천천히 교반하였다. 투명해진 용액에 차가운 수소화붕소나트륨(NaBH4) 75 μL를 추가하고 35℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 원심분리(17,000rpm, 15분)하였다.
제작된 금 나노입자는 물로 세척하여 상층액(Solution)을 제거한 후, 물에 부유시켰다. 상기 금 나노입자(Pellet) 5 mL에 BSA(Bovine serum albumin) 0.25 mM이 포함된 인산완충생리식염수(PBS) 0.5 mL(pH 7.4)를 추가한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 금 나노입자와 BSA를 정전기로 부착하는(Electrostatic attachment) 반응이 일어나도록 한 후, 원심분리(6,000rpm, 5분)하여 금 나노입자와 결합되지 않은 BSA를 제거하였다.
제조예 2. 자성 나노입자의 제조
탈이온수(Deionized water; DI water) 190 mL이 포함된 플라스크에 FeCl3 및 FeCl2를 2:1의 비율(각 5.22 및 2.08 g)로 첨가하고, 80℃에서 30분 동안 1000rpm의 속도로 교반하면서 25%의 암모니아 용액 40 mL를 추가하였다. 상기 용액을 물로 수 회 세척하여 자성 나노입자 용액을 수득하였다.
수득된 자성 나노입자 용액에 PVA(polyvinyl alcohol) 용액 0.5 mg/mL를 넣고, 90℃로 1시간 동안 유지하여 자성 나노입자에 PVA를 코팅하였다. 코팅된 자성 나노입자는 실온에서 48 시간 동안 진공 건조하였다.
제조예 3. 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
클로로폼(chloroform) 및 메탄올(methanol)이 9:1의 비율(각 3.6 및 0.4 mL)로 포함된 50 mL 플라스크에 DPPC(Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 콜레스테롤(Cholesterol), DSPE-PEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 및 DSPE-PEG2000-Folate(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000])를 하기와 같은 비율로 첨가하였다:
- 표면에 엽산이 부착되지 않은 리포좀 나노 구조체의 경우 DPPC:콜레스테롤:DSPE-PEG2000을 80:20:5의 비율(각 60:8:12 mg)로 첨가.
- 표면에 엽산이 부착된 리포좀 나노 구조체의 경우 DPPC:콜레스테롤:DSPE-PEG2000:DSPE-PEG2000-Folate를 80:20:4.5:0.5의 비율(각 60:8:8:4 mg)로 첨가.
그 다음, 회전 농축기를 이용하여 용매(클로로폼 및 메탄올)를 증발시켜 박막을 제작하고, 박막이 든 플라스크의 진공상태를 밤새 유지시켜 남아 있는 용매를 완전히 제거하였다.
제작된 박막에 상기 제조예 1의 금 나노입자(BSA-결합된) 5 mg/mL가 포함된 황산암모늄 2 mL를 추가한 후, 50℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시켜 금 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체를 제작하였다. 제작된 금 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체는 초음파 처리(power 35%, 3 sec on, 3 sec off) 후, 압출기를 이용하여 폴리카보네이트(polycarbonate) 막(200 nm 공극)을 여러 번 통과시켜 200 nm 이하의 균일한 크기로 조절하였다.
그 다음, 상기 크기가 조절된 금 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체가 포함된 용액에 독소루비신 및 염산(2mg/mL)을 첨가하고 35℃ 항온수조에서 2시간 동안 배양하였다.
배양된 용액 2 mL를 Sephadex G25 배지가 포함된 PD-10 탈염 컬럼(desalting column)에 주입하고, PBS 0.5 mL을 통과시켜 금 나노입자 입자 및 독소루비신(DOX)이 담지된 리포좀 나노 구조체를 분리하였다. 최종적으로 얻어진 금 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체는 4℃에서 보관하였다.
제조예 4. 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
클로로폼 3.6 mL 및 메탄올 0.4 mL가 포함된 50 mL 플라스크에 DPPC 68 mg 및 MSPC(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 12 mg의 혼합물을 첨가한 후, 회전 농축기를 이용하여 용매(클로로폼 및 메탄올)를 증발시켜 박막을 제작하였다. 박막이 든 플라스크의 진공상태를 밤새 유지시켜 남아 있는 용매를 완전히 제거하였다.
제작된 박막에 상기 제조예 2의 자성 나노입자(PVA-코팅된) 5 mg/mL가 포함된 황산암모늄 2 mL를 추가한 후, 50℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시켜 자성 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체를 제작하였다. 제작된 자성 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체는 초음파 처리(power 35%, 3 sec on, 3 sec off) 후, 압출기를 이용하여 폴리카보네이트 막(200 nm 공극)을 여러 번 통과시켜 200 nm 이하의 균일한 크기로 조절하였다.
그 다음, 상기 크기가 조절된 자성 나노입자-담지 리포좀 나노 구조체가 포함된 용액에 독소루비신 및 염산(2mg/mL)을 첨가하고 35℃ 항온수조에서 2시간 동안 배양하였다.
배양된 용액 2 mL를 Sephadex G25 배지가 포함된 PD-10 탈염 컬럼(desalting column)에 주입하였다. 그 다음, PBS 0.5 mL을 통과시켜 자성 나노입자 입자 및 독소루비신(DOX)이 담지된 리포좀 나노 구조체를 분리하였다. 최종적으로 얻어진 자성 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체는 4℃에서 보관하였다.
실시예. 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로봇 제조
마우스 유래 면역세포인 대식세포(Raw 264.7 cell)를 10% FBS(Fetal bovine serum), 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 혼합된 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium; DMEM)에 부유시켜, 6-웰 플레이트에 웰당 2.5 x 106 세포씩 접종하였다. 그 다음, 세포가 웰 바닥에 80% 이상 증식할 때까지 배양하였다.
충분히 배양한 후, 세포 위의 배지를 버리고 별도로 새로운 DMEM 배지 2.5 mL에 부유시킨 상기 제조예 4의 자성 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체 2.5 mL(독소루비신 함량: 50 μg/mL)를 접종하고, CO2, 37℃에서 6시간 동안 추가로 배양하였다.
추가 배양 후, 탐식되지 않은 자성 나노입자/독소루비신-담지 나노 구조체는 PBS로 세척하여 제거하고, 세포 스크래퍼(Cell scraper)를 이용하여 플레이트 바닥에서 면역세포 내부에 자성 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체가 탐식된 면역세포 기반-마이크로로봇을 수득하였다.
비교예. 약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
상기 제조예 2의 자성 나노입자를 첨가하는 단계를 제외하고, 상기 제조예 4와 동일한 방법을 이용하여 약물-담지 리포좀 나노 구조체를 제조하였다.
실험예 1. 금 나노입자의 빛 흡수력 확인
상기 제조예 1의 금 나노입자를 포함하는 수용액 100 μL를 96-웰 플레이트에 접종한 후, 마이크로-플레이트 리더(micro-plate reader, Varioskan Flash, Thermo Scientific, Waltham, CA)를 이용하여 400-1000 nm의 파장대에서 흡광량을 측정하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 제조된 금 나노입자는 NIR 윈도우(window) 내부에 있는 798nm의 세로(방향)의 표면 플라즈마 공명 피크를 가지는 바, 빛 에너지를 열 에너지로 쉽게 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 자성 나노입자의 자기성 확인
상기 제조예 2의 방법으로 표면을 PVA로 코팅한 자성 나노입자 및 표면을 코팅하지 않은 자성 나노입자를 각각 제조하여 건조하였다. 탈이온수를 이용하여 건조시킨 자성 나노입자를 희석한 후 Zeta-PSA platform(ELS-8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 제타 전위를 측정하였다(각각 3 회 반복하여 측정).
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 표면을 코팅한 자성 나노입자(Coated Fe3O4 NPs) 및 코팅하지 않은 자성 나노입자(Uncoated Fe3O4 NPs) 모두 x-선 회절 스펙트럼에서 Fe3O4 나노입자의 표준 피크인 6개의 피크가 나타남을 알 수 있었다. 상기 각 나노입자의 피크 패턴의 차이가 없는 것으로 보아, 코팅 여부는 나노입자의 자성에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.
다음으로, 상기 건조된 표면을 PVA로 코팅한 자성 나노입자 및 표면을 코팅하지 않은 자성 나노입자에 대하여, 진동 시료 자화율측정기(Vibrating sample magnetometer; VSM, Lake Shore Cryotronics 7404, Westerville, OH, USA)를 이용하여 건조시킨 자성 나노입자(1-2 mg)의 자화값을 측정하였다.
도 2b에서 확인할 수 있듯이, 표면을 코팅한 자성 나노입자(Coated Fe3O4 NPs) 및 코팅하지 않은 자성 나노입자(Uncoated Fe3O4 NPs) 모두 자성을 띠고 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. 자성 나노입자의 광열 변환 효과 확인
상기 제조예 2의 자성 나노입자(PVA-코팅된) 1mg/mL를 포함하는 수용액 400uL, 및 PBS를 각각 큐벳에 넣어 근적외선(NIR) 레이저 빛(wavelength: 808, 1.5W)을 10분 동안 노출시킨 후, FLIR 열 이미지 카메라(E64501, FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA)를 사용하여 큐벳의 온도 변화를 측정하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, PBS의 온도는 실온(약 27℃)에서 약간 변화를 보였으나, 근적외선을 조사한 자성 나노입자 수용액에서 빠른 온도 상승을 보였다. 이로써, 자성 나노입자의 빠른 빛 에너지의 열 전환을 검증하였다.
실험예 4. 온도 변화에 따른 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 약물 방출 확인
상기 제조예 4의 자성 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체 0.5 mL를 pH 5.5 또는 7.4의 PBS, 및 pH 5.5 또는 7.4의 HBS(Hepes buffered saline) 용액에 각각 5 μg/mL 농도로 희석한 후, 37℃ 항온 수조에서 60분 동안 유지하였다.
실험 시작 직후 5 분 동안 근적외선 자극을 실시하고, 자극이 끝나면 즉시 항온 수조로 옮겨 37℃ 또는 43℃를 유지하였다. 자성 나노입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체로부터의 독소루비신 누적 방출량은 하기와 같은 계산식 1을 통해 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112019017611156-pat00001
- ft: 각 시간(t)별 형광량
- f0: 실험 시작 시점의 리포좀 나노 구조체의 형광량
- f100: Triton X-100에 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 녹인 후의 형광량
도 4에서 확인할 수 있듯이, 리포좀 나노 구조체는 43℃ 및 pH 5.5에서 향상된 약물 방출 속도 및 열-민감을 보이는 것을 알 수 있었다.
실험예 5. 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 항암 효과 확인
마우스-유래 유방암 세포주인 4T1 세포(4T1, Mus musculus (mouse), breast cancer, ATCC CRL-2539, ATCC) 100 만개가 부유된 PBS 용액 100 μL를 7 주령 BALB/c 마우스(BALB/c mouse, male, Orient Bio)(25 마리)의 오른쪽 옆구리 피하에 주입하였다. 10 일 동안 사육하여 종양 부피가 100 mm3 인 마우스 종양 모델을 제작하였다.
제작된 마우스 종양 모델을 무작위로 6개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 독소루비신 단독, 상기 제조예 3의 표면에 엽산이 부착되지 않은 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체, 상기 제조예 2의 표면에 엽산이 부착된 금 나노입자가 단독으로 포함된 리포좀 나노 구조체, 및 상기 제조예 3의 표면에 엽산이 부착된 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체(2개 군)를 미정맥(caudal vein)에 100 μL씩 주입하였다. 이때, 엽산이 부착된 리포좀 나노구조체 2개 군 중 1개 군은 주입 48시간 후에 808 nm 파장대의 근적외선 장치(Laser power supply(PSU-W-FC), Changchun new industries optoelectronics tech, co., LTD, China)를 이용하여 종양 형성 부위에 근적외선을 5분 동안 조사하였다.
상기 6개 군의 종양의 크기는 2-3 일마다 피부 두께 측정기(Calipers (SD500-200PRO), Sincon, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 하기와 같은 계산식 2를 통해 계산하였다.
[계산식 2]
Figure 112019017611156-pat00002
- L: 종양의 가장 긴 면
- W: 종양의 가장 짧은 면
도 5에서 확인할 수 있듯이, PBS를 주입한 대조군(Control), 독소루비신 단독 사용군(Free DOX), 금 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 군(AuNRs-DOX-LPs), 약물 없이 금 나노입자를 단독으로 담지하는 리포좀 나노 구조체에 근적외선을 조사한 군(FA@AuNRs-LPs+NIR) 및 근적외선 조사 없이 금 나노입자/약물-담지 및 엽산-부착 리포좀 나노 구조체를 주입한 군(FA@AuNRs-DOX-LPs)에 비하여, 금 나노입자/약물-담지 및 엽산-부착 리포좀 나노 구조체 주입 후 근적외선을 조사한 군(FA@AuNRs-DOX-LPs+NIR)의 종양의 성장률이 가장 낮게 나타났다.
상기 결과로부터 NIR 레이저를 사용하는 경우 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 증가됨을 알 수 있었다.
실험예 6. 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로봇의 항암 효과 확인
먼저, 상기 실험예 5의 마우스 종양 모델에 대하여, 제작된 마우스 종양 모델(총 25 마리)을 무작위로 5개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 상기 제조예 4의 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체, 면역세포 단독, 및 상기 제조예 5의 면역세포-기반 마이크로로봇(2개 군)을 미정맥에 100 μL씩 주입하였다. 이때, 면역세포-기반 마이크로로봇 2개 군 중 1개 군은 종양 부위에 영구자석(10mm x 1mm Disc shaped Neodymium Mgnet, NEOMAG)이 부착된 커버를 6시간 이상 부착하였다.
상기 5개 군의 종양의 크기는 2-3 일마다 피부 두께 측정기를 이용하여 측정하였으며, 상기 실험예 5의 계산식 2를 통해 계산하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, PBS를 주입한 대조군(Control), 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 군(Liposome) 및 면역세포 군(Marcrophage)에 비하여, 면역세포-기반 마이크로로봇을 주입한 2개 군(Robot w M 및 Robot w/o M)의 종양의 성장률이 가장 낮았다. 특히, 상기 마이크로로봇 2개 군 중에서도 종양 부위에 영구자석 커버를 부착한 군(Robot w M)에서 가장 낮은 종양 성장률을 보였다.
상기 결과로부터 영구자석을 이용하는 경우 영구자석으로부터 유도된 자기장에 의해 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 증가됨을 알 수 있었다.
상기 결과에 기초하여, 추가적으로 하기의 실험을 수행하였다.
상기 실험예 5의 마우스 종양 모델에 대하여, 제작된 마우스 종양 모델(총 45 마리)을 무작위로 9개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 면역세포 단독, 독소루비신 단독, 상기 비교예의 약물-담지 리포좀 나노 구조체, 상기 제조예 4의 자성 나노입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체(종양 부위에 영구자석이 부착된 커버를 12시간 이상 부착), 및 상기 실시예의 면역세포-기반 마이크로로봇(4개 군)을 미정맥에 100 μL씩 주입하였다. 이때, 면역세포-기반 마이크로로봇 4개 군 중 1개 군은 종양 부위에 영구자석(10mm x 1mm Disc shaped Neodymium Mgnet)이 부착된 커버를 12시간 이상 부착하였고, 다른 1개 군은 주입 48시간 후에 근적외선 장치(PSU-W-FC)를 이용하여 종양 형성 부위에 근적외선(1.5W)을 5분 동안 조사하였다. 또 다른 1개 군은 상기 영구자석 부착 및 근적외선 조사를 모두 실시하였다.
상기 9개 군의 종양의 크기는 2-3 일마다 피부 두께 측정기를 이용하여 측정하였으며, 상기 실험예 5의 계산식 2를 통해 계산하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, NIR 레이저 및 영구자석을 동시에 이용하는 경우 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 보다 증가됨을 알 수 있었다.

Claims (9)

  1. 면역세포(Immunocyte);
    상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및
    상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노입자 및 약물을 포함하고,
    상기 자성 나노입자는 종양부위에 부착된 영구자석에 의해 자기장을 부여받는 것인,
    면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역세포는 대식세포(Marcrophage), 말초혈관유래 단핵구(Monocyte), 과립구, 자연살해세포(NK cell), T세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로로봇.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 리포좀 나노 구조체는 인지질 70-80 중량%, 유화제 10-20 중량% 및 콜레스테롤 5-15 중량%를 포함하는 것인, 마이크로로봇.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, MxOy(M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수 임), CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로로봇.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 구조체의 직경은 100-200nm인 것인, 마이크로로봇.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 독소루비신(Doxorubicin), 도세탁셀(Docetaxel) 및 파클리탁셀(Paclitaxel)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로로봇.
  7. 제4항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 또는 NiFeCo인 것인, 마이크로로봇.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 자성 나노입자의 직경은 1-50nm인 것인, 마이크로로봇.
  9. 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약학 조성물에 있어서,
    상기 마이크로로봇은
    면역세포(Immunocyte), 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체, 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된 자성 나노입자 및 약물을 포함하고,
    상기 자성 나노입자는 종양부위에 부착된 영구자석에 의해 자기장을 부여받는 것인, 항암용 약학 조성물.
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