WO2020171439A1 - 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 - Google Patents
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- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
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- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
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- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
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- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
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- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
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- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5115—Inorganic compounds
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- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
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- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
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- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/02—Radiation therapy using microwaves
- A61N5/022—Apparatus adapted for a specific treatment
- A61N5/025—Warming the body, e.g. hyperthermia treatment
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
Definitions
- the present invention was made by the project number HI19C0642 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research management institution of the project is the Korea Health Industry Development Institute, the name of the research project is “Development of technology for practical use of micro medical robots”, and the name of the research project is "Common commercialization of micro medical robots.
- Base Technology Development Center the host institution is Korea Micro Medical Robot Research Institute, and the research period is from June 12 to 2022. December 31.
- the present invention relates to an immune cell-based medical microrobot.
- the drug delivery system by nanoparticles coated with a drug can move only through blood vessels, so it is not sufficiently delivered to the center of the tumor tissue where blood vessel generation is insufficient. Does not.
- a drug such as a biocompatible polymer used in the treatment of tumors or inflammation, etc.
- the basic principle is to use immune cells that have chemotaxis against cancer cells, external invading pathogens, or inflammatory cells, include magnetic nanoparticles or gold nanoparticles inside, and deliver them to the lesion area by the penetration of the cells, and then stimulate external light. It is a technology that increases the temperature of immune cells and destroys the surrounding lesion cells along with the immune cells.
- the drug delivery system using these immune cells depends on the movement by the chemotaxis of the cell itself, the delivery time is very long, and it contains light-sensitive agents, not therapeutic drugs, so direct drug delivery and therapeutic effects are expected. It is difficult to do, and in the case of deep organs that cannot be reached by external light stimulation, there is a problem that it is difficult to expect the effect.
- the present inventors have tried to develop a drug delivery system having both immunotherapy, chemotherapy and photothermal/photodynamic therapy effects. As a result, it is possible to manufacture a microrobot capable of simultaneous immunotherapy, chemotherapy and photothermal/photodynamic therapy by phagocytosis of magnetic nanoparticles and/or gold nanoparticles, and liposome nanostructures loaded with drugs inside immune cells. By finding out, the present invention has been completed.
- an object of the present invention is an immune cell (Immunocyte); Liposomal nanostructures phagocytized in the immune cells (Phagocytosis); And any one or more selected from the group consisting of magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and drugs supported on the liposome nanostructure. It is to provide an immune cell-based medical microrobot (Microrobot).
- Another object of the present invention is to provide a method of manufacturing an immune cell-based medical microrobot (Microrobot).
- the present inventors have tried to develop a drug delivery system having both immunotherapy, chemotherapy and photothermal/photodynamic therapy effects. As a result, it is possible to manufacture a microrobot capable of simultaneous immunotherapy, chemotherapy and photothermal/photodynamic therapy by phagocytosis of magnetic nanoparticles and/or gold nanoparticles, and liposome nanostructures loaded with drugs inside immune cells. Confirmed.
- the present invention includes any one or more selected from the group consisting of immune cells (Immunocytes), liposome nanostructures phagocytosis in the immune cells, and magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and drugs carried on the liposome nanostructure. It relates to an immune cell-based medical microrobot (Microrobot), and a manufacturing method thereof.
- One aspect of the present invention is an immune cell (Immunocyte); Liposomal nanostructures phagocytized in the immune cells; And any one or more selected from the group consisting of magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and drugs carried on the liposome nanostructure. It relates to an immune cell-based medical microrobot (Microrobot).
- the immune cells are collectively referred to as cells responsible for immunity in vivo, for example, macrophages, peripheral blood-derived monocytes, granulocytes, natural killer cells (NK cells), T cells or B cells. May be, but is not limited thereto.
- probe refers to a form of endocytosis in which an immune cell receives substances such as particles or molecules outside the cell into the cell, and introduces substances outside the cell into the cell.
- liposome refers to having the form of a lipid bilayer structure used to stably deliver physiologically active ingredients and maximize the penetration effect in the fields of pharmaceuticals, cosmetics and food.
- liposome nanostructure refers to a nanometer-sized structure having a structure in which the physiologically active component in the form of a liposome can be supported.
- the liposome nanostructure may be prepared by a mixture containing a solvent, a lipid (phospholipid), an emulsifier and/or cholesterol (Cholesterol).
- the solvent may be chloroform and/or methanol, but is not limited thereto.
- the phospholipid is a material in which two fatty acids having a high polarity functional group such as a phosphate group and various chain structures are combined, and can be used in both saturated or unsaturated types, for example, DPPC (Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). Can be used, but is not limited thereto.
- DPPC Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
- the emulsifier may be any known in the art, for example, DSPE-PEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol) -2000]) and/or DSPE-PEG2000-Folate (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]), etc., but are not limited thereto. .
- DSPE-PEG2000 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol) -2000]
- DSPE-PEG2000-Folate 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]
- the liposome nanostructure may contain 70 to 80% by weight of a phospholipid.
- the liposome nanostructure may contain 10 to 20% by weight of an emulsifier.
- the liposome nanostructure may contain 5 to 15% by weight of cholesterol.
- the liposome nanostructure may include 70 to 80% by weight of a phospholipid, 10 to 20% by weight of an emulsifier, and 5 to 15% by weight of cholesterol.
- a phospholipid 10 to 20% by weight of an emulsifier
- a cholesterol ester 10 to 20% by weight of cholesterol
- a emulsifier 10 to 20% by weight of an emulsifier
- a cholesterol ester 5 to 15% by weight of cholesterol.
- the microrobot of the present invention includes the liposomal nanostructure, so that the temperature of the microrobot and its surroundings may be increased in response to near-infrared (NIR) irradiation.
- NIR near-infrared
- the diameter of the liposome nanostructure is 100 to 200 nm, 100 to 190 nm, 100 to 180 nm, 100 to 170 nm, 100 to 160 nm, 110 to 200 nm, 110 to 190 nm, 110 to 180 nm, 110 to 170 nm, 110 to 160 nm, 120 to 200 nm, 120 to 190 nm, 120 to 180 nm, 120 to 170 nm, 120 to 160 nm, 130 to 200 nm, 130 to 190 nm, 130 to 180 nm, 130 to 170 nm, 130 to 160 nm, 140 to 200 nm, 140 to 190 nm, 140 to 180 nm, 140 to 170 nm, 140 to 160 nm, for example, may be 150 nm. When used in the above range, there is an effect of easy uptake by cells.
- the liposome nanostructure may be a magnetic nanoparticle, a gold nanoparticle, and a drug to be described below, or may be partially supported.
- the magnetic nanoparticles refer to nanoparticles of various materials having magnetic sensitivity including a magnetic material therein, and if the magnetic nanoparticles are particles having magnetic sensitivity, the specific type is not particularly limited, for example , May be a magnetic material or a magnetic alloy.
- the magnetic material may be Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM' 2 O 4 or M x O y , but is not limited thereto.
- M and M' are each independently Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd or Cr, and x is an integer of 1 to 3 , y may be an integer of 1 to 5, but is not limited thereto.
- the magnetic alloy may be CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe or NiFeCo, but is not limited thereto.
- the magnetic nanoparticles of the present invention exhibit magnetic sensitivity, so that the microrobot of the present invention can be moved to the lesion at high speed/high direction by an external magnetic field system (magnetic field generator), and performs the role of an MRT contrast agent (MRI contrast). can do.
- an external magnetic field system magnetic field generator
- MRI contrast agent MRI contrast
- the magnetic nanoparticles of the present invention may serve as NIR responsive agents by an external magnetic field.
- the liposomal nanostructure of the present invention includes the magnetic nanoparticles
- the microrobot of the present invention is capable of photothermal/photodynamic treatment of the lesion.
- the magnetic nanoparticle diameter is 1 to 50 nm, 1 to 40 nm, 1 to 30 nm, 1 to 20 nm, 1 to 10 nm, 5 to 50 nm, 5 to 40 nm, 5 to 30 nm, 5 To 20 nm, 5 to 10 nm, for example, 10 nm.
- it is safe for body absorption and has an effect of easy to degrade in the body.
- gold nanoparticles refer to gold (Au) particles having a nanometer particle size, and the specific type is not particularly limited.
- the liposomal nanostructure of the present invention includes the gold nanoparticles
- the microrobot of the present invention is capable of photothermal/photodynamic treatment of the lesion.
- the gold nanoparticles of the present invention When the gold nanoparticles of the present invention are exposed to near-infrared (NIR) light, they generate coherent vibrations of free electrons inside the gold particles by the vibration of the electromagnetic field of the light, thereby releasing heat, and thus can be used for killing cancer cells using heat.
- NIR near-infrared
- the gold nanoparticles may have a rod shape.
- the diameter when the gold nanoparticles are rod-shaped, the diameter may be 1 to 7 nm, 2 to 7 nm, 3 to 7 nm, 4 to 7 nm, for example, 5 to 7 nm, but is limited thereto. It is not.
- the length is 20 to 35 nm, 22 to 35 nm, 24 to 35 nm, 26 to 35 nm, 28 to 35 nm, 20 to 33 nm, 22 to 33 nm , 24 to 33 nm, 26 to 33 nm, 28 to 33 nm, 20 to 31 nm, 22 to 31 nm, 24 to 31 nm, 26 to 31 nm, 28 to 31 nm, for example, 29 nm. have.
- the diameter and length may be 1-7mm x 20-35nm, for example, 7nm x 29nm.
- NIR NIR absorbance peak in NIR window
- the gold nanoparticles may have folic acid attached to the surface, but are not limited thereto.
- folic acid By attaching folic acid to the surface of the gold nanoparticles, targeting to cells of some cell types (eg, breast cancer cell tumors 4T1, MCF7, etc.) over-expressing the folate receptor can be increased.
- the drug may be a protein, peptide, vitamin, nucleic acid, synthetic drug or natural extract, but is not limited thereto.
- the synthetic drug may be Doxorubicin, Docetaxel, and/or Paclitaxel, but is not limited thereto.
- the drug may be released from the microrobot of the present invention by an external stimulus in a form supported on the liposome nanostructure.
- Another aspect of the present invention relates to an anticancer pharmaceutical composition comprising the microrobot.
- the cancer may be a solid tumor such as liver cancer, breast cancer, gastric cancer, lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, or thyroid cancer. It is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
- the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, and lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline Sex cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
- solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, and lactose in the pharmaceutical composition. , Gelatin, etc. may be mixed and formulated, but is not limited thereto. Further, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.
- liquid formulations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients, such as humectants, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. Can be included.
- Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized agents, suppositories, and the like.
- Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyloleate.
- injectables may contain conventional additives such as solubilizing agents, isotonic agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizing agents, and preservatives.
- a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient, Usually, the skilled practitioner can readily determine and prescribe the dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
- the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.001 to 10000 mg/kg.
- the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container.
- the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
- Another aspect of the present invention relates to a method for treating cancer comprising administering the microrobot to an individual in need thereof.
- the cancer treatment method of the present invention is to use the anticancer pharmaceutical composition comprising the microrobot of the present invention described above, and descriptions of the contents in common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
- administration means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is oral or parenteral through all general routes as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally.
- the composition of the present invention may be administered using any device capable of delivering an active ingredient to target cells.
- the "individual” is not particularly limited, but includes, for example, a human, a monkey, a cow, a horse, a sheep, a pig, a chicken, a turkey, a quail, a cat, a dog, a mouse, a mouse, a rabbit, or a guinea pig do.
- Another aspect of the present invention relates to the use of the microrobot for cancer treatment.
- Another aspect of the present invention relates to a method of manufacturing an immune cell-based medical microrobot (Microrobot) comprising the following steps:
- Liposomal nanostructures can be prepared by a mixture comprising a solvent, lipid (phospholipid), emulsifier and cholesterol (Cholesterol).
- a method of preparing a liposome is not particularly limited, but may be preferably prepared by stirring the above components together.
- the preparation of the liposome nanostructure of the present invention has the advantage that it can be carried out under various conditions (eg, pressure, number of times, etc.) depending on the desired particle size.
- the present invention relates to an immune cell-based medical microrobot, wherein the microrobot is a non-surgical method for immune treatment such as tumor or inflammation, and photothermal/photodynamic treatment together with chemical treatment, thus minimizing side effects and treatment efficiency It is expected to be able to implement an improved new immunotherapy method that maximizes.
- 2A is a result of measuring the zeta potential of magnetic nanoparticles prepared according to an embodiment of the present invention.
- 2B is a result of measuring a magnetization value of magnetic nanoparticles prepared according to an embodiment of the present invention.
- NIR near-infrared
- FIG. 8 is a schematic diagram of a microrobot according to an embodiment of the present invention.
- Immune cells (Immunocyte); Liposomal nanostructures phagocytized in the immune cells; And any one or more selected from the group consisting of magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and drugs carried on the liposome nanostructure; containing an immune cell-based medical microrobot (Microrobot).
- Immune cells Liposomal nanostructures phagocytized in the immune cells; And any one or more selected from the group consisting of magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and drugs carried on the liposome nanostructure; containing an immune cell-based medical microrobot (Microrobot).
- the prepared gold nanoparticles were washed with water to remove the supernatant (Solution), and then suspended in water.
- 0.5 mL (pH 7.4) of phosphate buffered physiological saline (PBS) containing 0.25 mM of BSA (Bovine serum albumin) was added to 5 mL of the gold nanoparticles (Pellet), and then stirred at room temperature overnight.
- centrifugation 6,000rpm, 5 minutes was performed to remove the BSA that was not bound to the gold nanoparticles.
- DPPC Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
- cholesterol Cholesterol
- DSPE- Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
- cholesterol Cholesterol
- DSPE-PEG2000-Folate 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[folate(polyethylene glycol)-2000]
- DPPC cholesterol: DSPE-PEG2000 was added at a ratio of 80:20:5 (60:8:12 mg each).
- DPPC:Cholesterol:DSPE-PEG2000:DSPE-PEG2000-Folate was added in a ratio of 80:20:4.5:0.5 (60:8:8:4 mg each).
- the solvent chloroform and methanol
- the flask containing the thin film was kept in a vacuum overnight to completely remove the remaining solvent.
- the gold nanoparticles-supported liposome were reacted in a 50° C. constant temperature water bath for 30 minutes. The nanostructure was fabricated.
- the prepared gold nanoparticle-supported liposome nanostructure was subjected to ultrasonic treatment (power 35%, 3 sec on, 3 sec off), and then passed through a polycarbonate film (200 nm pore) several times using an extruder to obtain 200 nm. It was adjusted to the following uniform size. Then, doxorubicin and hydrochloric acid (2mg/mL) were added to the solution containing the size-controlled gold nanoparticle-supported liposome nanostructure, and incubated in a 35° C. constant temperature water bath for 2 hours.
- the magnetic nanoparticles-supported liposome were reacted for 30 minutes in a 50°C constant temperature water bath
- the nanostructure was fabricated.
- the fabricated magnetic nanoparticle-supported liposome nanostructure is subjected to ultrasonic treatment (power 35%, 3 sec on, 3 sec off), and then passed through a polycarbonate membrane (200 nm pore) several times using an extruder to achieve uniformity of 200 nm or less. Adjusted to one size.
- doxorubicin and hydrochloric acid (2 mg/mL) were added to the solution containing the size-controlled magnetic nanoparticle-supported liposome nanostructure, followed by incubation in a 35° C. constant temperature water bath for 2 hours.
- 2 mL of the cultured solution was injected into a PD-10 desalting column containing Sephadex G25 medium.
- 0.5 mL of PBS was passed to separate the magnetic nanoparticle particles and the liposome nanostructure carrying doxorubicin (DOX).
- DOX doxorubicin
- Mouse-derived immune cells (Raw 264.7 cells) were mixed with Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin, and streptomycin; DMEM), 2.5 x 10 6 per well in a 6-well plate Cells were inoculated. Then, the cells were cultured until 80% or more proliferated at the bottom of the well.
- a drug-carrying liposome nanostructure was prepared using the same method as in Preparation Example 4, except for the step of adding the magnetic nanoparticles of Preparation Example 2.
- the prepared gold nanoparticles had a vertical (direction) surface plasma resonance peak of 798 nm in the NIR window, and it was found that light energy can be easily transferred as thermal energy. .
- both the surface-coated magnetic nanoparticles (Coated Fe 3 O 4 NPs) and uncoated magnetic nanoparticles (Uncoated Fe 3 O 4 NPs) Fe 3 O 4 nanoparticles in the x-ray diffraction spectrum It can be seen that 6 peaks, which are standard peaks, appear. As there was no difference in the peak pattern of each of the nanoparticles, it was found that coating or not did not affect the magnetism of the nanoparticles.
- Magnetic nanoparticles coated with PVA on the dried surface and magnetic nanoparticles without surface coating were dried using a vibrating sample magnetometer (VSM, Lake Shore Cryotronics 7404, Westerville, OH, USA). The magnetization values of the magnetic nanoparticles (1 to 2 mg) were measured, and the results are shown in FIG. 2B.
- VSM vibrating sample magnetometer
- the temperature of PBS showed a slight change at room temperature (about 27° C., but showed a rapid increase in temperature in the magnetic nanoparticle aqueous solution irradiated with near-infrared rays. Thereby, the rapid light energy of the magnetic nanoparticles Thermal conversion was verified.
- a mouse-derived breast cancer cell line 4T1 cells (4T1, Mus musculus (mouse), breast cancer, ATCC CRL-2539, ATCC) 100 uL of PBS solution in which 1 million cells were suspended was added to 7-week-old BALB/c mice (BALB/c mouse, male , Orient Bio) (25 animals) was injected subcutaneously in the right flank. By breeding for 10 days, a mouse tumor model with a tumor volume of 100 mm 3 was produced.
- the prepared mouse tumor model was randomly divided into 6 groups, each group was divided into PBS, doxorubicin alone, gold nanoparticles/drug-supported liposome nanostructures with no folic acid attached to the surface of Preparation Example 3, and folic acid on the surface of Preparation Example 2.
- Liposomal nanostructures containing the attached gold nanoparticles alone, and gold nanoparticles/drug-supported liposome nanostructures (groups of 2) with folic acid attached to the surface of Preparation Example 3 were 100 in the caudal vein. Each uL was injected.
- one of the two groups of folic acid-attached liposomal nanostructures is a near-infrared device (Laser power supply (PSU-W-FC), Changchun new industries optoelectronics tech, co., LTD, 48 hours after injection) in the 808 nm wavelength range. China) was used to irradiate the tumor formation site with near-infrared rays for 5 minutes.
- the size of the tumors in the six groups was measured every 2 to 3 days using a skin thickness meter (Calipers (SD500-200PRO), Sincon, Korea), and calculated through the following calculation formula 2, and the results are shown in FIG. And Tables 6 to 8.
- Tumor size (%) (LX (W 2 / 2)) X 100 (%)
- the produced mouse tumor model (a total of 25 mice) was randomly divided into 5 groups, and PBS, magnetic nanoparticles/drug-carrying liposome nanostructures of Preparation Example 4, and immune cells Alone, and the immune cell-based microrobots of Preparation Example 5 (2 groups) were injected into the caudal vein by 100 uL.
- one of the two groups of immune cell-based microrobots attached a cover with a permanent magnet (10 mm x 1 mm Disc shaped Neodymium Mgnet, NEOMAG) attached to the tumor site for more than 6 hours.
- the sizes of the tumors of the five groups were measured every 2 to 3 days using a skin thickness meter, and calculated through the calculation formula 2 of Experimental Example 5, and the results are shown in FIGS. 6 and 9.
- mice the produced mouse tumor model (a total of 45 mice) was randomly divided into 9 groups, and PBS, immune cells alone, doxorubicin alone, and drug-carrying liposome nanostructures of the Comparative Example,
- the magnetic nanoparticles/drug-carrying liposome nanostructure of Preparation Example 4 (a cover with a permanent magnet attached to the tumor site is attached for 12 hours or more), and the immune cell-based microrobot (4 groups) of the Example in the caudal vein. Each uL was injected.
- one of the four immune cell-based microrobot groups attached a cover with a permanent magnet (10mm x 1mm Disc shaped Neodymium Mgnet) attached to the tumor site for 12 hours or longer, and the other group 48 hours after injection.
- a permanent magnet (10mm x 1mm Disc shaped Neodymium Mgnet)
- N-infrared 1.5W
- PSU-W-FC near-infrared device
- Another group was subjected to both the permanent magnet attachment and near-infrared irradiation.
- the size of the tumors of the nine groups was measured every 2 to 3 days using a skin thickness meter, and calculated through the calculation formula 2 of Experimental Example 5, and the results are shown in FIGS. 7 and 10.
- the present invention relates to an immune cell-based medical microrobot.
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Abstract
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것으로, 상기 마이크로로봇은 비수술적 방법으로 종양 또는 염증 등의 면역 치료, 화학적 치료와 함께 광열/광역학 치료가 동시에 가능하므로, 부작용을 최소화하고 치료 효율을 극대화하는 향상된 새로운 면역치료법을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI19C0642에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 "마이크로의료로봇실용화기술개발", 연구과제명은 "마이크로의료로봇 실용화 공통기반 기술개발 센터", 주관기관은 한국마이크로의료로봇연구원, 연구기간은 2019.06.12 ~ 2022.12.31이다.
본 특허출원은 2019년 02월 19일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2019-0019444호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것이다.
종양이나 염증 등의 치료에서 사용하는 생체 적합성 폴리머 (Polymer) 등으로 약물을 코팅하여 전달하는 나노 입자에 의한 약물 전달체는 혈관을 통해서만 이동이 가능하여, 혈관 생성이 미흡한 종양 조직의 중심부까지는 충분히 전달되지 않는다. 또한, 나노 입자의 크기가 큰 경우에는 면역세포에 의해 탐식되고, 크기가 작은 경우에는 신장에 의해 배설되는 등 나노 입자의 크기에 따라 약물 전달의 효율이 달라지기 때문에, 약물의 병변부로의 전달이 제한적인 한계가 있다.
최근 들어, 이러한 한계를 극복하기 위하여 면역세포를 이용한 약물 전달체 개발에 관한 연구들이 진행되고 있다. 그 기본 원리는 암세포, 외부 침입 병원체 또는 염증 세포들에 대해 주화성을 갖는 면역세포를 이용, 자성 나노 입자 또는 금나노 입자를 내부에 포함시킨 후, 세포의 침투능에 의해 병변부로 전달한 후 외부 광 자극을 이용해 면역세포의 온도를 상승시켜 면역세포와 함께 주변 병변 세포를 파괴시켜 치료하는 기술이다.
하지만, 이러한 면역세포를 이용한 약물 전달체는 세포 자체의 주화성에 의한 이동에 의존적이므로 전달 시간이 매우 오래 걸리고, 치료용 약물이 아닌 광-과민제 등을 포함하고 있어 직접적인 약물전달 및 치료 효과를 기대하기 힘들며, 외부의 광 자극이 도달하지 못하는 심부 장기의 경우 그 효과를 더욱 기대하기 어려운 문제가 있다.
이에, 면역 치료, 화학 치료, 광열/광역학 치료가 동시에 이루어지는 시스템에 대한 연구가 시급한 실정이다.
본 발명자들은 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료 효과를 동시에 갖는 약물 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 면역세포 내부에 자성 나노 입자 및/또는 금 나노 입자, 및 약물이 담지된 리포좀 나노 구조체를 탐식시켜 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료가 동시에 가능한 마이크로로봇을 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역세포 (Immunocyte); 상기 면역세포에 탐식 (Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료 효과를 동시에 갖는 약물 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 면역세포 내부에 자성 나노 입자 및/또는 금 나노 입자, 및 약물이 담지된 리포좀 나노 구조체를 탐식시켜 면역 치료, 화학 치료 및 광열/광역학 치료가 동시에 가능한 마이크로로봇을 제조할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 면역세포 (Immunocyte), 상기 면역세포에 탐식 (Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체, 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot), 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 면역세포 (Immunocyte); 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot)에 관한 것이다.
상기 면역세포는 생체 내에서 면역을 담당하는 세포를 총칭하는 것으로, 예를 들어, 대식세포 (Marcrophage), 말초혈관유래 단핵구 (Monocyte), 과립구, 자연살해세포 (NK cell), T세포 또는 B 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "탐식"은 면역세포가 세포 밖의 입자나 분자 등 물질을 세포 내로 받아들인 상태로, 세포 밖의 물질을 세포 안으로 유입시키는 세포내도입 (Endocytosis)의 한 형태를 의미한다.
본 발명에서 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 지질 2중층 구조의 형태를 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 "리포좀 나노 구조체"는 리포좀 형태의 상기 생리활성 성분이 담지 될 수 있는 구조를 갖는 나노미터 크기의 구조체를 의미한다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체는 용매, 지질(인지질), 유화제(Emulsifier) 및/또는 콜레스테롤(Cholesterol)을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서 용매는 클로로폼 (chloroform) 및/또는 메탄올 (methanol)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인지질은 포스페이트기와 같은 극성이 높은 관능기와 다양한 사슬 구조를 갖는 지방산 2개가 결합한 물질로 포화 또는 불포화 타입 모두 사용 가능하며, 예를 들어 DPPC (Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 유화제 (Emulsifier)는 당 업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, DSPE-PEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 및/또는 DSPE-PEG2000-Folate (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체는 인지질 70 내지 80 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체는 유화제 10 내지 20 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체는 콜레스테롤 5 내지 15 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 리포좀 나노 구조체는 인지질 70 내지 80 중량%, 유화제 10 내지 20 중량% 및 콜레스테롤 5 내지 15 중량%를 포함할 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 리포좀 나노 구조체의 열-민감성 (Thermosensitive)이 증대되는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 마이크로로봇은 상기 리포좀 나노 구조체를 포함함으로써, 근적외선 (NIR) 조사에 반응하여 마이크로로봇 및 그 주변의 온도가 상승될 수 있다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체의 직경은 100 내지 200 nm, 100 내지 190 nm, 100 내지 180 nm, 100 내지 170 nm, 100 내지 160 nm, 110 내지 200 nm, 110 내지 190 nm, 110 내지 180 nm, 110 내지 170 nm, 110 내지 160 nm, 120 내지 200 nm, 120 내지 190 nm, 120 내지 180 nm, 120 내지 170 nm, 120 내지 160 nm, 130 내지 200 nm, 130 내지 190 nm, 130 내지 180 nm, 130 내지 170 nm, 130 내지 160 nm, 140 내지 200 nm, 140 내지 190 nm, 140 내지 180 nm, 140 내지 170 nm, 140 내지 160 nm, 예를 들어, 150 nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 세포 내로의 담지가 용이 (easy uptake by cells)한 효과가 있다.
본 발명에 있어서 리포좀 나노 구조체는 하기에서 설명할 자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 약물이 모두 담지된 것일 수도 있고, 그 중 일부만 담지된 것일 수도 있다.
본 발명에 있어서 자성 나노 입자는 내부에 자성체를 포함하여 자성 민감도를 가지는 다양한 물질의 나노 입자를 의미하며, 상기 자성 나노 입자는 자성 민감도를 갖는 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 자성 물질 또는 자성 합금일 수 있다.
본 발명에 있어서 자성 물질은 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'2O4 또는 MxOy 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 자성 물질이 MM'2O4 또는 MxOy인 경우에는 M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 또는 NiFeCo일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 자성 나노 입자는 자성 민감도를 나타냄으로써, 외부 자기장 시스템 (자기장 발생 장치)에 의해 본 발명의 마이크로로봇을 병변부로 고속/고지향 이동시킬 수 있으며, MRT 조영제 (MRI contrast)의 역할을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 자성 나노 입자는 외부 자기장에 의한 NIR 반응제 (NIR responsive agents) 역할을 수행할 수 있다.
본 발명의 리포좀 나노 구조체가 상기 자성 나노 입자를 포함함으로써, 본 발명의 마이크로로봇은 병변부에 대한 광열/광역학 치료가 가능하다.
본 발명에 있어서 자성 나노 입자 직경은 1 내지 50 nm, 1 내지 40 nm, 1 내지 30 nm, 1 내지 20 nm, 1 내지 10 nm, 5 내지 50 nm, 5 내지 40 nm, 5 내지 30 nm, 5 내지 20 nm, 5 내지 10 nm, 예를 들어, 10 nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 체내에 흡수되어도 안전 (safe for body)하며, 체내에서 분해되기 쉬운 (easy to degrade in the body) 효과가 있다.
본 발명에 있어서 금 나노 입자는 입자 크기가 나노미터인 금(Au) 입자를 의미하며, 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 리포좀 나노 구조체가 상기 금 나노 입자를 포함함으로써, 본 발명의 마이크로로봇은 병변부에 대한 광열/광역학 치료가 가능하다.
본 발명의 금 나노 입자는 근적외선 (NIR) 빛에 노출 되었을 때 빛의 전자기장 진동에 의해 금 입자 내부 자유전자의 결맞음 진동을 일으켜 열을 방출함으로써, 열을 이용한 암세포 사멸에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 금 나노 입자는 막대형 (rod)일 수 있다.
본 발명에 있어서 금 나노 입자가 막대형인 경우, 직경은 1 내지 7 nm, 2 내지 7 nm, 3 내지 7 nm, 4 내지 7 nm, 예를 들어, 5 내지 7 nm인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 금 나노 입자가 막대형인 경우, 길이는 20 내지 35 nm, 22 내지 35 nm, 24 내지 35 nm, 26 내지 35 nm, 28 내지 35 nm, 20 내지 33 nm, 22 내지 33 nm, 24 내지 33 nm, 26 내지 33 nm, 28 내지 33 nm, 20 내지 31 nm, 22 내지 31 nm, 24 내지 31 nm, 26 내지 31 nm, 28 내지 31 nm, 예를 들어, 29 nm인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 금 나노 입자가 막대형인 경우, 그 직경 및 길이는 1-7mm x 20-35nm, 예를 들어, 7nm x 29nm 일 수 있다. 상기 범위로 사용되는 경우 NIR의 높은 흡광도를 가지며 (NIR absorbance peak in NIR window), 체내에 흡수되어도 안전 (safe for body)하고, 체내에서 분해되기 쉬운 (eay to degrade in the body) 효과가 있다.
본 발명에 있어서 금 나노 입자는 표면에 엽산이 부착된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 금 나노 입자 표면에 엽산이 부착됨으로써, 엽산 수용체가 과발현된 일부 세포종 (예를 들어, 유방암 세포종 4T1, MCF7 등)의 세포에 대한 표적성을 높일 수 있다.
본 발명에 있어서 약물은 단백질, 펩타이드, 비타민, 핵산, 합성 약물 또는 천연 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 합성 약물은 독소루비신 (Doxorubicin), 도세탁셀 (Docetaxel) 및/또는 파클리탁셀 (Paclitaxel)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약물은 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된 형태로 외부 자극에 의해 본 발명의 마이크로로봇으로부터 방출될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 상기 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 암은 간암, 유방암, 위암, 폐암, 전립선암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암 또는 갑상선암 등의 고형암 (Solid tumor)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약제학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 10000 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 마이크로로봇을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 암 치료방법은 상술한 본 발명의 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "개체"는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 마이크로로봇의 암 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 하기 단계를 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot)의 제조방법에 관한 것이다:
자성 나노 입자 및 금 나노 입자를 각각 제조하는 나노 입자 제조 단계;
자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 이의 조합 중 하나를 포함하는 리포좀 나노 구조체를 제조하는 리포좀 제조 단계;
리포좀 나노 구조체에 약물을 담지하는 약물 담지 단계; 및
별도로 배양된 면역세포 (Immunocyte)에 리포좀 나노 구조체를 첨가하여 배양하는 탐식 (Phagocytosis) 단계.
리포좀 나노 구조체는 용매, 지질 (인지질), 유화제 (Emulsifier) 및 콜레스테롤 (Cholesterol)을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서 리포좀을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기의 성분들을 함께 교반하여 제조할 수 있다.
본 발명의 리포좀 나노 구조체의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예를 들어, 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 마이크로로봇의 제조방법에 있어서 마이크로로봇의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것으로, 상기 마이크로로봇은 비수술적 방법으로 종양 또는 염증 등의 면역 치료, 화학적 치료와 함께 광열/광역학 치료가 동시에 가능하므로, 부작용을 최소화하고 치료 효율을 극대화하는 향상된 새로운 면역치료법을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노 입자의 빛 흡수력 확인한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노 입자의 제타 전위를 측정한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노 입자의 자화값을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노 입자의 근적외선(NIR) 조사에 따른 온도 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 온도 변화에 따른 약물 방출 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로로봇의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 금 나노 입자/자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로로봇의 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로로봇의 개요도이다.
면역세포(Immunocyte); 상기 면역세포에 탐식(Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및 상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노입자, 금 나노입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇(Microrobot).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 금 나노 입자의 제조
플라스크에 염화금산 (HAuCl4) 5 mL, CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) 25 mL 및 물 25 mL를 넣고 교반하였다. 그 다음, 올레산나트륨 (Sodium Oleate) 2.5 mL, 질산은 (AgNO3) 1.25 mL, 염산 (HCl) 40 uL 및 아스코르브산 (Ascorbic Acid) 350 uL를 추가한 후, 용액의 색깔이 투명해질 때까지 천천히 교반하였다. 투명해진 용액에 차가운 수소화붕소나트륨 (NaBH4) 75 uL를 추가하고 35 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 원심분리 (17,000rpm, 15분)하였다.
제작된 금 나노 입자는 물로 세척하여 상층액 (Solution)을 제거한 후, 물에 부유시켰다. 상기 금 나노 입자 (Pellet) 5 mL에 BSA (Bovine serum albumin) 0.25 mM이 포함된 인산완충생리식염수 (PBS) 0.5 mL (pH 7.4)를 추가한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 금 나노 입자와 BSA를 정전기로 부착하는 (Electrostatic attachment) 반응이 일어나도록 한 후, 원심분리 (6,000rpm, 5분)하여 금 나노 입자와 결합되지 않은 BSA를 제거하였다.
제조예 2. 자성 나노 입자의 제조
탈이온수 (Deionized water; DI water) 190 mL이 포함된 플라스크에 FeCl3 및 FeCl2를 2:1의 비율 (각 5.22 및 2.08 g)로 첨가하고, 80 ℃에서 30분 동안 1,000 rpm의 속도로 교반하면서 25%의 암모니아 용액 40 mL를 추가하였다. 상기 용액을 물로 수 회 세척하여 자성 나노 입자 용액을 수득하였다. 수득된 자성 나노 입자 용액에 PVA (polyvinyl alcohol) 용액 0.5 mg/mL를 넣고, 90 ℃로 1시간 동안 유지하여 자성 나노 입자에 PVA를 코팅하였다. 코팅된 자성 나노 입자는 실온에서 48 시간 동안 진공 건조하였다.
제조예 3. 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
클로로폼 (chloroform) 및 메탄올 (methanol)이 9:1의 비율 (각 3.6 및 0.4 mL)로 포함된 50 mL 플라스크에 DPPC (Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 콜레스테롤 (Cholesterol), DSPE-PEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 및 DSPE-PEG2000-Folate (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000])를 하기와 같은 비율로 첨가하였다:
- 표면에 엽산이 부착되지 않은 리포좀 나노 구조체의 경우 DPPC:콜레스테롤:DSPE-PEG2000을 80:20:5의 비율 (각 60:8:12 mg)로 첨가.
- 표면에 엽산이 부착된 리포좀 나노 구조체의 경우 DPPC:콜레스테롤:DSPE-PEG2000:DSPE-PEG2000-Folate를 80:20:4.5:0.5의 비율(각 60:8:8:4 mg)로 첨가.
그 다음, 회전 농축기를 이용하여 용매 (클로로폼 및 메탄올)를 증발시켜 박막을 제작하고, 박막이 든 플라스크의 진공상태를 밤새 유지시켜 남아 있는 용매를 완전히 제거하였다. 제작된 박막에 상기 제조예 1의 금 나노 입자 (BSA-결합된) 5 mg/mL가 포함된 황산암모늄 2 mL를 추가한 후, 50 ℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시켜 금 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체를 제작하였다. 제작된 금 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체는 초음파 처리 (power 35%, 3 sec on, 3 sec off) 후, 압출기를 이용하여 폴리카보네이트 (polycarbonate) 막 (200 nm 공극)을 여러 번 통과시켜 200 nm 이하의 균일한 크기로 조절하였다. 그 다음, 상기 크기가 조절된 금 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체가 포함된 용액에 독소루비신 및 염산 (2mg/mL)을 첨가하고 35 ℃ 항온수조에서 2시간 동안 배양하였다. 배양된 용액 2 mL를 Sephadex G25 배지가 포함된 PD-10 탈염 컬럼 (desalting column)에 주입하고, PBS 0.5 mL을 통과시켜 금 나노 입자 입자 및 독소루비신 (DOX)이 담지된 리포좀 나노 구조체를 분리하였다. 최종적으로 얻어진 금 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체는 4 ℃에서 보관하였다.
제조예 4. 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
클로로폼 3.6 mL 및 메탄올 0.4 mL가 포함된 50 mL 플라스크에 DPPC 68 mg 및 MSPC (1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 12 mg의 혼합물을 첨가한 후, 회전 농축기를 이용하여 용매(클로로폼 및 메탄올)를 증발시켜 박막을 제작하였다. 박막이 든 플라스크의 진공상태를 밤새 유지시켜 남아 있는 용매를 완전히 제거하였다. 제작된 박막에 상기 제조예 2의 자성 나노 입자 (PVA-코팅된) 5 mg/mL가 포함된 황산암모늄 2 mL를 추가한 후, 50 ℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시켜 자성 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체를 제작하였다. 제작된 자성 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체는 초음파 처리 (power 35%, 3 sec on, 3 sec off) 후, 압출기를 이용하여 폴리카보네이트 막 (200 nm 공극)을 여러 번 통과시켜 200 nm 이하의 균일한 크기로 조절하였다. 그 다음, 상기 크기가 조절된 자성 나노 입자-담지 리포좀 나노 구조체가 포함된 용액에 독소루비신 및 염산 (2 mg/mL)을 첨가하고 35 ℃ 항온수조에서 2시간 동안 배양하였다. 배양된 용액 2 mL를 Sephadex G25 배지가 포함된 PD-10 탈염 컬럼 (desalting column)에 주입하였다. 그 다음, PBS 0.5 mL을 통과시켜 자성 나노 입자 입자 및 독소루비신 (DOX)이 담지된 리포좀 나노 구조체를 분리하였다. 최종적으로 얻어진 자성 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체는 4 ℃에서 보관하였다.
실시예. 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로봇 제조
마우스 유래 면역세포인 대식세포 (Raw 264.7 cell)를 10% FBS (Fetal bovine serum), 1% 페니실린 (penicillin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)이 혼합된 둘베코수정이글배지 (Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium; DMEM)에 부유시켜, 6-웰 플레이트에 웰당 2.5 x 106
세포씩 접종하였다. 그 다음, 세포가 웰 바닥에 80% 이상 증식할 때까지 배양하였다. 충분히 배양한 후, 세포 위의 배지를 버리고 별도로 새로운 DMEM 배지 2.5 mL에 부유시킨 상기 제조예 4의 자성 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체 2.5 mL (독소루비신 함량: 50 ug/mL)를 접종하고, CO2, 37 ℃에서 6시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 탐식되지 않은 자성 나노 입자/독소루비신-담지 나노 구조체는 PBS로 세척하여 제거하고, 세포 스크래퍼(Cell scraper)를 이용하여 플레이트 바닥에서 면역세포 내부에 자성 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체가 탐식된 면역세포 기반-마이크로로봇을 수득하였다.
비교예. 약물-담지 리포좀 나노 구조체의 제조
상기 제조예 2의 자성 나노 입자를 첨가하는 단계를 제외하고, 상기 제조예 4와 동일한 방법을 이용하여 약물-담지 리포좀 나노 구조체를 제조하였다.
실험예 1. 금 나노 입자의 빛 흡수력 확인
제조예 1의 금 나노 입자를 포함하는 수용액 100 uL를 96-웰 플레이트에 접종한 후, 마이크로-플레이트 리더 (micro-plate reader, Varioskan Flash, Thermo Scientific, Waltham, CA)를 이용하여 400-1000 nm의 파장대에서 흡광량을 측정하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 제조된 금 나노 입자는 NIR 윈도우 (window) 내부에 있는 798nm의 세로 (방향)의 표면 플라즈마 공명 피크를 가지는 바, 빛 에너지를 열 에너지로 쉽게 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 자성 나노 입자의 자기성 확인
2-1. 제타 전위 측정
제조예 2의 방법으로 표면을 PVA로 코팅한 자성 나노 입자 및 표면을 코팅하지 않은 자성 나노 입자를 각각 제조하여 건조하였다. 탈이온수를 이용하여 건조시킨 자성 나노 입자를 희석한 후 Zeta-PSA platform (ELS-8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 제타 전위를 각각 3 회 반복 측정하여, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 표면을 코팅한 자성 나노 입자 (Coated Fe3O4 NPs) 및 코팅하지 않은 자성 나노 입자 (Uncoated Fe3O4 NPs) 모두 x-선 회절 스펙트럼에서 Fe3O4 나노 입자의 표준 피크인 6개의 피크가 나타남을 알 수 있었다. 상기 각 나노 입자의 피크 패턴의 차이가 없는 것으로 보아, 코팅 여부는 나노 입자의 자성에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.
2-2. 자화 값 측정
건조된 표면을 PVA로 코팅한 자성 나노 입자 및 표면을 코팅하지 않은 자성 나노 입자에 대하여, 진동 시료 자화율측정기 (Vibrating sample magnetometer; VSM, Lake Shore Cryotronics 7404, Westerville, OH, USA)를 이용하여 건조시킨 자성 나노 입자 (1 내지 2 mg)의 자화 값을 측정하여, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2b에서 확인할 수 있듯이, 표면을 코팅한 자성 나노 입자 (Coated Fe3O4 NPs) 및 코팅하지 않은 자성 나노 입자 (Uncoated Fe3O4 NPs) 모두 자성을 띠고 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. 자성 나노 입자의 광열 변환 효과 확인
제조예 2의 자성 나노 입자 (PVA-코팅된) 1 mg/mL를 포함하는 수용액 400 uL, 및 PBS를 각각 큐벳에 넣어 근적외선 (NIR) 레이저 빛 (wavelength: 808, 1.5W)을 10분 동안 노출시킨 후, FLIR 열 이미지 카메라 (E64501, FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA)를 사용하여 큐벳의 온도 변화를 측정하여, 그 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다.
| Time (min) | Temperature (℃) | |
| PBS | MNPs | |
| 0 | 27 | 27 |
| 1 | 27.1 | 34.8 |
| 2 | 27.6 | 40.3 |
| 3 | 27 | 43.5 |
| 4 | 27.1 | 45.2 |
| 5 | 27.2 | 46.8 |
| 6 | 27.3 | 47.3 |
| 7 | 27.5 | 47.7 |
| 8 | 27.6 | 47.7 |
| 9 | 27.6 | 47.9 |
| 10 | 27.6 | 47.9 |
도 3 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, PBS의 온도는 실온 (약 27 ℃에서 약간 변화를 보였으나, 근적외선을 조사한 자성 나노 입자 수용액에서 빠른 온도 상승을 보였다. 이로써, 자성 나노 입자의 빠른 빛 에너지의 열 전환을 검증하였다.
실험예 4. 온도 변화에 따른 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 약물 방출 확인
제조예 4의 자성 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체 0.5 mL를 pH 5.5 또는 7.4의 PBS, 및 pH 5.5 또는 7.4의 HBS (Hepes buffered saline) 용액에 각각 5 ug/mL 농도로 희석한 후, 37 ℃ 항온 수조에서 60분 동안 유지하였다. 실험 시작 직후 5 분 동안 근적외선 자극을 실시하고, 자극이 끝나면 즉시 항온 수조로 옮겨 37 ℃ 또는 43 ℃를 유지하였다. 자성 나노 입자/독소루비신-담지 리포좀 나노 구조체로부터의 독소루비신 누적 방출량은 하기와 같은 계산식 1을 통해 계산하여, 그 결과를 도 4a 내지 도 4d 및 표 2 내지 표 5에 나타내었다.
[계산식 1]
누적 방출량 (%) = (ft - f0) / (f100 - f0)
ft: 각 시간(t)별 형광량
f0: 실험 시작 시점의 리포좀 나노 구조체의 형광량
f100: Triton X-100에 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 녹인 후의 형광량
| PBS 37 ℃ | Mean | STD | Mean | STD |
| PBS (pH=7.4) | PBS (pH=5.5) | |||
| 15 | 2.77 | 1.18 | 5.77 | 2.17 |
| 30 | 5.77 | 2.01 | 6.49 | 0.63 |
| 60 | 5.83 | 1.94 | 7.92 | 1.8 |
| PBS 43 ℃ | Mean | STD | Mean | STD |
| PBS (pH=7.4) | PBS (pH=5.5) | |||
| 15 | 12.43 | 0.43 | 53.87 | 2.4 |
| 30 | 12.42 | 0.97 | 56.73 | 2.6 |
| 60 | 10.79 | 0.8 | 58.77 | 2.46 |
| HBS 37 ℃ | Mean | STD | Mean | STD |
| HBS (pH=7.4) | HBS (pH=5.5) | |||
| 15 | 2.77 | 1.18 | 8.18 | 1.74 |
| 30 | 5.77 | 2.01 | 6.12 | 1.35 |
| 60 | 5.83 | 1.94 | 13.93 | 1.3 |
| HBS 43 ℃ | Mean | STD | Mean | STD |
| HBS (pH=7.4) | HBS (pH=5.5) | |||
| 15 | 11.15 | 1.05 | 58.07 | 4.22 |
| 30 | 13.38 | 1.21 | 59.19 | 2.95 |
| 60 | 18.73 | 1.71 | 65.72 | 0.74 |
도 4a 내지 도 4d 및 표 2 내지 표 5에서 확인할 수 있듯이, 리포좀 나노 구조체는 43 ℃ 및 pH 5.5에서 향상된 약물 방출 속도 및 열-민감을 보이는 것을 알 수 있었다.
실험예 5. 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체의 항암 효과 확인
마우스-유래 유방암 세포주인 4T1 세포 (4T1, Mus musculus (mouse), breast cancer, ATCC CRL-2539, ATCC) 100 만개가 부유된 PBS 용액 100 uL를 7 주령 BALB/c 마우스 (BALB/c mouse, male, Orient Bio)(25 마리)의 오른쪽 옆구리 피하에 주입하였다. 10 일 동안 사육하여 종양 부피가 100 mm3 인 마우스 종양 모델을 제작하였다. 제작된 마우스 종양 모델을 무작위로 6개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 독소루비신 단독, 제조예 3의 표면에 엽산이 부착되지 않은 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체, 제조예 2의 표면에 엽산이 부착된 금 나노 입자가 단독으로 포함된 리포좀 나노 구조체, 및 제조예 3의 표면에 엽산이 부착된 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 (2개 군)를 미정맥 (caudal vein)에 100 uL씩 주입하였다. 이때, 엽산이 부착된 리포좀 나노구조체 2개 군 중 1개 군은 주입 48시간 후에 808 nm 파장대의 근적외선 장치 (Laser power supply(PSU-W-FC), Changchun new industries optoelectronics tech, co., LTD, China)를 이용하여 종양 형성 부위에 근적외선을 5분 동안 조사하였다. 상기 6개 군의 종양의 크기는 2 내지 3 일마다 피부 두께 측정기 (Calipers (SD500-200PRO), Sincon, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 하기와 같은 계산식 2를 통해 계산하여, 그 결과를 도 5 및 표 6 내지 표 8에 나타내었다.
[계산식 2]
종양의 크기 (%) = (L X (W2 / 2)) X 100 (%)
- L: 종양의 가장 긴 면
- W: 종양의 가장 짧은 면
| Time(day) | PBS | Free DOX | AuNRs-DOX-LPs | FA@AuNRs-DOX-LPs | ||||
| Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |||
| 3 | 183.59 | 51.69 | 173.27 | 67.17 | 136.06 | 37.26 | 121.15 | 23.93 |
| 5 | 257.06 | 45.93 | 204.04 | 102.3 | 198.79 | 87.03 | 111.71 | 33.59 |
| 7 | 298.69 | 62.44 | 220.78 | 95.66 | 216.96 | 112.16 | 116.32 | 33.59 |
| 10 | 344.3 | 66.9 | 294.06 | 196.52 | 361.75 | 53.97 | 147.4 | 45.5 |
| 12 | 435.96 | 97.08 | 335.39 | 83.64 | 422.69 | 203.16 | 161.1 | 47.31 |
| 14 | 542.74 | 145.84 | 368.47 | 209.41 | 451.36 | 199.21 | 186.73 | 55.53 |
| FA@AuNRs | FA@AuNRs-DOX-LPs+NIR | ||
| Mean | STD | Mean | STD |
| 100 | 100 | ||
| 178.79 | 90.67 | 149.28 | 32.88 |
| 201.84 | 149.91 | 86.86 | 40.19 |
| 298.13 | 34.27 | 85.4 | 38.88 |
| 308.3 | 80.56 | 86.09 | 40.09 |
| 360.36 | 70.47 | 92.47 | 55.9 |
| 443.55 | 49.7 | 92.9 | 53.61 |
| Time (day) | PBS | Free DOX | AuNRs-DOX-LPs | FA@AuNRs-DOX-LPs | FA@AuNRs | FA@AuNRs-DOX-LPs+NIR | ||||||
| Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |||||
| 3 | 183.59 | 51.69 | 173.27 | 67.17 | 136.06 | 37.26 | 121.15 | 23.93 | 178.79 | 90.67 | 149.28 | 32.88 |
| 5 | 257.06 | 45.93 | 204.04 | 102.3 | 198.79 | 87.03 | 111.71 | 33.59 | 201.84 | 149.91 | 86.86 | 40.19 |
| 7 | 298.69 | 62.44 | 220.78 | 95.66 | 216.96 | 112.16 | 116.32 | 33.59 | 298.13 | 34.27 | 85.4 | 38.88 |
| 10 | 344.3 | 66.9 | 294.06 | 196.52 | 361.75 | 53.97 | 147.4 | 45.5 | 308.3 | 80.56 | 86.09 | 40.09 |
| 12 | 435.96 | 97.08 | 335.39 | 83.64 | 422.69 | 203.16 | 161.1 | 47.31 | 360.36 | 70.47 | 92.47 | 55.9 |
| 14 | 542.74 | 145.84 | 368.47 | 209.41 | 451.36 | 199.21 | 186.73 | 55.53 | 443.55 | 49.7 | 92.9 | 53.61 |
도 5 및 표 6 내지 표 8에서 확인할 수 있듯이, PBS를 주입한 대조군 (Control), 독소루비신 단독 사용군 (Free DOX), 금 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 군 (AuNRs-DOX-LPs), 약물 없이 금 나노 입자를 단독으로 담지하는 리포좀 나노 구조체에 근적외선을 조사한 군 (FA@AuNRs-LPs+NIR) 및 근적외선 조사 없이 금 나노 입자/약물-담지 및 엽산-부착 리포좀 나노 구조체를 주입한 군 (FA@AuNRs-DOX-LPs)에 비하여, 금 나노 입자/약물-담지 및 엽산-부착 리포좀 나노 구조체 주입 후 근적외선을 조사한 군 (FA@AuNRs-DOX-LPs+NIR)의 종양의 성장률이 가장 낮게 나타났다. 상기 결과로부터 NIR 레이저를 사용하는 경우 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 증가됨을 알 수 있었다.
실험예 6. 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체를 포함하는 면역세포-기반 마이크로로봇의 항암 효과 확인
실험예 5의 마우스 종양 모델에 대하여, 제작된 마우스 종양 모델 (총 25 마리)을 무작위로 5개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 제조예 4의 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체, 면역세포 단독, 및 제조예 5의 면역세포-기반 마이크로로봇 (2개 군)을 미정맥에 100 uL씩 주입하였다. 이때, 면역세포-기반 마이크로로봇 2개 군 중 1개 군은 종양 부위에 영구자석 (10 mm x 1 mm Disc shaped Neodymium Mgnet, NEOMAG)이 부착된 커버를 6시간 이상 부착하였다. 5개 군의 종양의 크기는 2 내지 3 일마다 피부 두께 측정기를 이용하여 측정하였으며, 상기 실험예 5의 계산식 2를 통해 계산하여, 그 결과를 도 6 및 표 9에 나타내었다.
| Control | Liposome | Macrophage | Robot w M | Robot w/o M | ||||||
| Time (days) | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD |
| 0 | 100 | 100 | 100 | |||||||
| 3 | 126.6 | 73.96 | 160.07 | 30.15 | 153.65 | 19.58 | 155.72 | 41.94 | 159.8 | 23.77 |
| 5 | 225.06 | 34.82 | 196.9 | 59.63 | 203.41 | 24.29 | 189.14 | 31.78 | 195.9 | 37.11 |
| 7 | 247.24 | 23.37 | 252.54 | 80.95 | 233.66 | 24.98 | 213.38 | 61.55 | 241.03 | 53.44 |
| 10 | 319.18 | 21.4 | 302.94 | 107.51 | 290.17 | 34.29 | 260.27 | 40.81 | 261.92 | 56.94 |
| 14 | 464.94 | 65.14 | 441.16 | 74.79 | 412.32 | 68.94 | 334 | 52.67 | 357.02 | 72.64 |
| 17 | 620 | 126.96 | 548.65 | 132.93 | 492.92 | 82.03 | 437.79 | 71.45 | 440.94 | 77.67 |
| 20 | 790.6 | 91.21 | 709.05 | 126.6 | 606 | 75.9 | 539.24 | 92.38 | 585.14 | 156.01 |
| 23 | 989.42 | 131.83 | 830.74 | 144.4 | 676.44 | 105 | 598.48 | 69.98 | 668.62 | 194.23 |
| 25 | 1075.14 | 183.16 | 914.49 | 198.97 | 819.06 | 242.41 | 598.97 | 110.19 | 697.72 | 218.77 |
| 28 | 1291.14 | 132.51 | 991.47 | 187.03 | 918.94 | 231.75 | 713.1 | 67.31 | 785.89 | 202.01 |
도 6 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, PBS를 주입한 대조군 (Control), 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 군 (Liposome) 및 면역세포 군 (Marcrophage)에 비하여, 면역세포-기반 마이크로로봇을 주입한 2개 군 (Robot w M 및 Robot w/o M)의 종양의 성장률이 가장 낮았다. 특히, 상기 마이크로로봇 2개 군 중에서도 종양 부위에 영구자석 커버를 부착한 군 (Robot w M)에서 가장 낮은 종양 성장률을 보였다. 상기 결과로부터 영구자석을 이용하는 경우 영구자석으로부터 유도된 자기장에 의해 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 증가됨을 알 수 있었다.
상기 결과에 기초하여, 추가적으로 하기의 실험을 수행하였다.
실험예 5의 마우스 종양 모델에 대하여, 제작된 마우스 종양 모델 (총 45 마리)을 무작위로 9개 군으로 나누고 각 군에 PBS, 면역세포 단독, 독소루비신 단독, 상기 비교예의 약물-담지 리포좀 나노 구조체, 제조예 4의 자성 나노 입자/약물-담지 리포좀 나노 구조체 (종양 부위에 영구자석이 부착된 커버를 12시간 이상 부착), 및 실시예의 면역세포-기반 마이크로로봇 (4개 군)을 미정맥에 100 uL씩 주입하였다. 이때, 면역세포-기반 마이크로로봇 4개 군 중 1개 군은 종양 부위에 영구자석 (10mm x 1mm Disc shaped Neodymium Mgnet)이 부착된 커버를 12시간 이상 부착하였고, 다른 1개 군은 주입 48시간 후에 근적외선 장치(PSU-W-FC)를 이용하여 종양 형성 부위에 근적외선 (1.5W)을 5분 동안 조사하였다. 또 다른 1개 군은 상기 영구자석 부착 및 근적외선 조사를 모두 실시하였다. 상기 9개 군의 종양의 크기는 2 내지 3 일마다 피부 두께 측정기를 이용하여 측정하였으며, 상기 실험예 5의 계산식 2를 통해 계산하여, 그 결과를 도 7 및 표 10에 나타내었다.
| Time (days) | PBS | Macrophages | Free DOX | DOX-LPs | MNPs-DOX-LPs+Magnet | |||||
| Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | |
| 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | 100 | 0 |
| 2 | 167.63 | 39.83 | 135.08 | 19.88 | 152.83 | 31.74 | 119.64 | 6.27 | 130.08 | 34.69 |
| 5 | 236.87 | 65.5 | 191.34 | 21.22 | 179.44 | 29.76 | 167.01 | 54.63 | 175.3 | 69.09 |
| 7 | 320.72 | 91.81 | 243.97 | 27.31 | 267.34 | 75.84 | 243.35 | 27.14 | 239.98 | 51.55 |
| 9 | 340.38 | 88.44 | 278.82 | 46.86 | 304.61 | 82.44 | 255.15 | 28.75 | 273.87 | 44.74 |
| 12 | 374.05 | 99.92 | 385.55 | 53.68 | 397.24 | 143.83 | 364.21 | 56.99 | 387.09 | 107.72 |
| 14 | 482.45 | 159.08 | 455.64 | 61.08 | 486.06 | 137.29 | 447.44 | 116.52 | 425.09 | 141.6 |
| Microrobots | Microrobots+Magnet | Microrobots+NIR | Microrobots+Magnet+NIR | |||||||
| Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | Mean | STD | |||
| 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | 100 | 0 | ||
| 2 | 140.18 | 25.94 | 138.07 | 6.48 | 134.85 | 30.18 | 116.37 | 33.86 | ||
| 5 | 205.33 | 45.31 | 175.18 | 14.95 | 149.36 | 15.89 | 103.53 | 57.3 | ||
| 7 | 250.9 | 18.71 | 228.6 | 30.21 | 149.18 | 67.91 | 120.31 | 85.85 | ||
| 9 | 306.63 | 40.74 | 257.92 | 34.12 | 158.68 | 81.21 | 125.1 | 109.46 | ||
| 12 | 312.13 | 87.3 | 283.38 | 70.89 | 209.11 | 113.51 | 168.75 | 108.62 | ||
| 14 | 369.51 | 76.97 | 316.76 | 77.72 | 220.61 | 126.36 | 145.33 | 120.08 | ||
도 7 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, NIR 레이저 및 영구자석을 동시에 이용하는 경우 종양-표적화 종양 성장 억제 효과가 보다 증가됨을 알 수 있었다.
본 발명은 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇에 관한 것이다.
Claims (9)
- 면역세포 (Immunocyte);상기 면역세포에 탐식 (Phagocytosis)된 리포좀 나노 구조체; 및상기 리포좀 나노 구조체에 담지된, 자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상;을 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot).
- 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 대식세포 (Marcrophage), 말초혈관유래 단핵구 (Monocyte), 과립구, 자연살해세포 (NK cell), T세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로로봇.
- 제1항에 있어서, 상기 리포좀 나노 구조체는 인지질 70 내지 80 중량%, 유화제 10 내지 20 중량% 및 콜레스테롤 5 내지 15 중량%를 포함하는 것인, 마이크로로봇.
- 제1항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, MxOy(M 및 M'은 각각 독립적으로 Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr이고, x는 1 내지 3의 정수, y는 1 내지 5의 정수 임), CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 마이크로로봇.
- 제1항에 있어서, 상기 금 나노 입자는 표면에 엽산이 부착된 것인, 마이크로로봇.
- 제1항에 있어서, 상기 약물은 독소루비신 (Doxorubicin), 도세탁셀 (Docetaxel) 및 파클리탁셀 (Paclitaxel)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로로봇.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 마이크로로봇을 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
- 하기의 단계를 포함하는 면역세포-기반 의료용 마이크로로봇 (Microrobot)의 제조방법:자성 나노 입자 및 금 나노 입자를 각각 제조하는 나노 입자 제조 단계;자성 나노 입자, 금 나노 입자 및 이의 조합 중 하나를 포함하는 리포좀 나노 구조체를 제조하는 리포좀 제조 단계;리포좀 나노 구조체에 약물을 담지하는 약물 담지 단계; 및별도로 배양된 면역세포 (Immunocyte)에 리포좀 나노 구조체를 첨가하여 배양하는 탐식 (Phagocytosis) 단계.
- 제8항에 있어서, 상기 리포좀 나노 구조체는 인지질 70 내지 80 중량%, 유화제 10 내지 20 중량% 및 콜레스테롤 5 내지 15 중량%를 포함하는 것인, 방법.
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