CN117643580A - 基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法 - Google Patents

基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及肿瘤化疗与免疫联合治疗、DNA纳米自组装体、仿生膜涂层纳米技术和药物递送系统，特别是指基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法。所述化疗免疫制剂包括DNA立方体、包裹DNA立方体的同源癌细胞膜和大肠杆菌外膜囊泡、肿瘤抗原分子及化疗药物。本发明分别靶向同源癌细胞和免疫细胞；增加癌细胞对化疗药的摄取和抗原呈递细胞对肿瘤抗原分子的摄取；同时减少癌细胞对肿瘤抗原分子的摄取，和抗原呈递细胞对化疗药的摄取；进而增强肿瘤抗原分子对抗原呈递细胞的激活作用和化疗药对肿瘤的杀伤作用，并降低化疗药对抗原呈递细胞的毒性和肿瘤抗原分子对癌细胞的干扰，增效化疗与免疫联合治疗卵巢癌。

Description

基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及肿瘤化疗与免疫联合治疗、DNA纳米自组装体、仿生膜涂层纳米技术和药物递送系统，特别是指基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，通过免疫疗法激活免疫系统，诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞在卵巢癌治疗中至关重要。然而由于单一疗法的局限性，加上卵巢癌细胞易转移和易耐药的特点，治疗效果并不理想。因此寻求多种治疗手段联合治疗，以获得持久的临床效果，提高卵巢癌患者总生存期，是治疗卵巢癌的关键。
化疗一直是癌症治疗的重要手段，在临床治疗和研究中广泛应用，但面临毒性强、易耐药等缺陷。许多研究将化疗药物和免疫调节剂联合用于抗肿瘤，一方面通过化疗药物直接快速杀死肿瘤细胞，另一方面通过免疫激活剂激活免疫反应持续杀伤肿瘤细胞，这种化疗免疫联合治疗方式能发挥良好的抗肿瘤效果。化疗免疫联合疗法的应用弥补了单一疗法的局限性，提高了抗肿瘤效果。为进一步提高疗效，常采用药物递送系统共递送化疗药和免疫激活剂，提高其肿瘤靶向性和在肿瘤组织中的浓度，然而，目前对化疗免疫疗法的递送策略多为共包封、共递送策略，难以将化疗药物和免疫激活剂分别精准递送至肿瘤中的不同靶细胞，一方面降低了两种药物在其靶细胞中的浓度，另一方面干扰非靶细胞执行其功能，难以高效治疗肿瘤。本课题组前期公开的专利CN115990247A中将化疗与免疫治疗联合起来的DNA纳米药物，可通过在细胞膜上开孔，加快化疗药进入肿瘤细胞，并以抗原分子标记肿瘤细胞膜，增强了肿瘤细胞的免疫原性，增效免疫化疗联合治疗；但是该DNA纳米药物并无肿瘤细胞靶向性和特异性，为避免对正常组织和器官的副作用，只能在肿瘤部位注射应用，且其共载化疗药和免疫激活剂，不能使其分别递送至肿瘤细胞和免疫细胞，限制了其抗肿瘤疗效。
因此，如何设计和制备分别靶向的递送系统，将化疗药物和免疫激活剂分别精准递送至癌细胞和免疫细胞，是进一步提高化疗免疫联合治疗效果的一种有效途径。
发明内容
本发明提出一种基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物及其制备方法，通过两种膜的分别靶向作用，将化疗药物和免疫激活剂分别递送至同源癌细胞和免疫细胞，从而增强化疗免疫联合抗卵巢癌的治疗效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，所述纳米药物包括A组分和B组分，A组分由卵巢癌细胞膜、DNA立方体和化疗药物组成；B组分由大肠杆菌外膜囊泡、DNA立方体和肿瘤抗原分子组成。
优选的，纳米药物中A组分和B组分的质量比为1:1。
优选的，所述DNA立方体由长链1AB、2BA、3AB、4BA和短链B14自组装制备得到；其中1AB的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2BA的碱基序列如SEQ ID No.2所示，3AB的碱基序列如SEQ ID No.3所示，4BA的碱基序列如SEQ ID No.4所示；B14的碱基序列如SEQ ID No.5所示，其5’端修饰有氨基。
优选的，所述肿瘤抗原分子与DNA短链B14经交联剂4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）连接后再与DNA立方体相连。
优选的，所述化疗药物均匀嵌入DNA立方体的碱基对之间。
进一步，所述卵巢癌细胞膜包裹在载有化疗药物的DNA立方体的外周，大肠杆菌外膜囊泡包裹在连接有肿瘤抗原分子的DNA立方体的外周。
优选的，卵巢癌细胞膜包裹载有模型化疗药-阿霉素（DOX）的DNA立方体，大肠杆菌外膜囊泡包裹连接有模型肿瘤抗原分子-鸡卵清蛋白表位序列（OVA257-264）的DNA立方体。
上述的基于仿生膜的精准靶向策略增效化疗免疫联合治疗卵巢癌的纳米药物，制备步骤为：
（1）将DNA链1AB、2BA、3AB、4BA与B14按1:1:1:1:4的摩尔比混合，程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃，得DNA立方体；
（2）将步骤（1）的DNA立方体（cube）与化疗药物以化疗药物过量的比例恒温震荡反应后，经离心弃上清，得cube-化疗药物；
（3）将氨基修饰NH2-短链B14与交联剂sulfo-SMCC室温搅拌反应2小时，经超滤除去多余交联剂后，再与肿瘤抗原分子室温搅拌反应过夜，经超滤除去多余的肿瘤抗原分子，即得B14-肿瘤抗原分子。将步骤（1）的DNA立方体与B14肿瘤抗原分子按1:4的摩尔比混匀后，以升温至40 ℃然后30分钟内匀速降温至4℃为单次循环，共循环进行4次，得DNA立方体-肿瘤抗原分子；
（4）将卵巢癌细胞破碎，通过离心去除细胞器等杂质沉淀，再经高速离心后得到癌细胞膜沉淀（IM）。将大肠杆菌菌液经离心后去除菌体，取上清经浓缩后进行超速离心，沉淀即为大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）。
（5）将步骤（2）的DNA立方体-化疗药物与步骤（4）获得的IM以适当比例混合，超声3分钟，得卵巢癌细胞膜包裹的DNA立方体-化疗药物这一纳米制剂，为终制剂的A组分；再将步骤（3）的DNA立方体-肿瘤抗原分子与步骤（4）获得的OMVs以适当比例混合，超声3分钟，得大肠杆菌外膜囊泡包裹的DNA立方体-肿瘤抗原分子这一纳米制剂，为终制剂的B组分。
进一步以阿霉素和卵清蛋白表位多肽为例，实际中不限于阿霉素和卵清蛋白多肽，制备一种卵巢癌细胞膜包裹DNA立方体-阿霉素和大肠杆菌外膜囊泡包裹DNA立方体-卵清蛋白表位多肽的A+B组分混合纳米药物（IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA），其空间结构如图1所示。
优选的上述IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA的制备方法，步骤为：
将NH2-修饰的B14与OVA利用交联剂sulfo-SMCC连接起来，具体方法是将NH2-B14用PBS溶解后与Sulfo-SMCC按照1:10的摩尔比混合，室温下搅拌反应2小时，再用超滤管离心除去多余Sulfo-SMCC，然后将产物与OVA按照1:10的摩尔比，室温下搅拌反应过夜，再用超滤管离心除去多余OVA，即获得B14-OVA。
将cube与B14-OVA按照1:4的摩尔比混匀，从40℃匀速降温历经30分钟到达4℃，该降温过程共循环进行4次，即获得cube-OVA；
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用癌细胞膜和大肠杆菌外膜囊泡分别包裹化疗药物DOX和肿瘤抗原OVA，使其分别精准靶向同源癌细胞和抗原呈递细胞，增效化疗免疫联合治疗卵巢癌，其疗效显著优于非分别精准靶向策略。
2、利用大肠杆菌外膜囊泡包裹肿瘤抗原，既能增强抗原稳定性和抗原呈递细胞的摄取效率，又能作为免疫佐剂，增强免疫激活作用，进而增强抗原特异性T细胞的杀伤作用。
3、利用癌细胞膜包裹DNA立方体-阿霉素，既能增强其对同源癌细胞的靶向性，又能降低非靶细胞如免疫细胞对其的摄取，从而降低化疗药对免疫细胞的毒性。
4、采用DNA纳米结构负载OVA，能精确控制OVA的数量和空间位置，再利用膜包裹后，能增加基于DNA纳米结构的纳米药物的稳定性，增强药效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA的设计和制备示意图。
图2为cube、cube-DOX和cube-OVA的制备和表征。（A）DNA cube的Native-PAGE电泳图；（B）DOX浓度对cube-DOX载药量的影响；（C）DOX浓度对cube-DOX结构稳定性的影响；（D）B14-OVA的Urea PAGE电泳图；（E）cube-OVA的Native-PAGE电泳图；（F）TEM表征图。
图3为IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA的制备和表征。（A）不同质量比（cube-DOX:IM）下制备的IM@cube-DOX的Native-PAGE电泳；（B）不同质量比（cube-OVA: OMVs）下制备的OMV@cube-OVA的Native-PAGE电泳图；（C）包膜前后IM和OMVs的SDS-PAGE电泳图；（D）TEM表征图；（E）仿生DNA纳米药物的粒径和电位图。
图4为ID8细胞对DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX的定性摄取结果图。
图5为ID8细胞对DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX的定量摄取结果图。
图6为DC2.4细胞对DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX的定性摄取结果图。
图7为DC2.4细胞对DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX的定量摄取结果图。
图8为ID8细胞对1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC的定性摄取结果图
图9为ID8细胞对1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC的定量摄取结果图
图10为DC2.4细胞对1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC的定性摄取结果图
图11为DC2.4细胞对1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC的定量摄取结果图
图12为IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA的体外药效。（A）IM@cube-DOX的体外细胞毒性作用；（B）OMV@cube-OVA对DC2.4细胞表面共刺激分子表达水平的影响；（C）OMV@cube-OVA对DC2.4细胞TNF-α和IL-6表达水平的影响。
图13为IM@cube-DOX和OMV@cube-DOX的体内动态分布图。
图14为IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA的体内抗肿瘤治疗结果。（A）治疗结束后的ID8肿瘤照片；（B）治疗期间的瘤体积变化；（C）治疗结束后的瘤重。
图15为治疗后ID8肿瘤组织的H&E染色切片图。
图16为IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA的体内免疫激活作用。（A）肿瘤组织树突细胞活化结果；（B）肿瘤组织CD4+T细胞和CD8+T细胞数量结果。
图17为IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA对血清中促炎细胞因子的影响。
图18为ID8肿瘤组织的免疫组化染色切片图。（A）TNF-α；（B）IL-6。
图19为治疗期间小鼠体重变化（A）单疗法组；（B）联合疗法组。
图20为治疗结束后小鼠脏器组织的H&E染色切片图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料：
缓冲液体系为TAMg（Tris 45mM、MgCl2·6H2O 12.5mM、乙酸20 mM）
DNA链1AB、2BA、3AB、4BA、Cholesterol-A20、B14、OVA多肽的序列如下表：
基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，所述纳米药物包括A组分和B组分，A组分由卵巢癌细胞膜、DNA立方体和化疗药物组成；B组分由大肠杆菌外膜囊泡、DNA立方体和肿瘤抗原分子组成。
优选的，纳米药物中A组分和B组分的质量比为1:1。
上述DNA立方体由长链1AB、2BA、3AB、4BA和短链B14自组装制备得到；其中1AB的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2BA的碱基序列如SEQ ID No.2所示，3AB的碱基序列如SEQ IDNo.3所示，4BA的碱基序列如SEQ ID No.4所示；B14的碱基序列如SEQ ID No.5所示，其5’端修饰有氨基。
上述肿瘤抗原分子与短链B14经交联剂Sulfo-SMCC连接后与DNA立方体相连。
上述化疗药物均匀嵌入在DNA立方体的碱基对之间。
上述卵巢癌细胞膜包裹在载有化疗药物的DNA立方体的外周，大肠杆菌外膜囊泡包裹在连接有肿瘤抗原分子的DNA立方体的外周。
上所述的纳米药物的制备方法，步骤为：
（1）将长链1AB、2BA、3AB、4BA与短链B14按比例混合后，经程序降温处理，获得DNA立方体；
（2）将步骤（1）的DNA立方体与化疗药物恒温震荡反应后，经离心弃上清，得DNA立方体-化疗药物；
（3）将氨基修饰的短链B14与交联剂sulfo-SMCC室温搅拌反应，除去多余的交联剂后所得产物，再与肿瘤抗原分子室温搅拌反应过夜，除去多余的肿瘤抗原分子，即得B14-肿瘤抗原分子，与步骤（1）的DNA立方体按比例混匀后，经升温-降温循环，得DNA立方体-肿瘤抗原分子；
（4）将卵巢癌细胞破碎，通过离心除杂质沉淀，再经高速离心后得到癌细胞膜沉淀；将大肠杆菌菌液经离心后去除菌体，取上清经浓缩后进行超速离心，所得沉淀即为大肠杆菌外膜囊泡；
（5）将步骤（2）的DNA立方体-化疗药物与步骤（4）的癌细胞膜沉淀按比例混合，超声后得卵巢癌细胞膜包裹的DNA立方体-化疗药物，作为制剂的A组分；再将步骤（3）的DNA立方体-肿瘤抗原分子与步骤（4）获得的大肠杆菌外膜囊泡以适当比例混合，超声后，得大肠杆菌外膜囊泡包裹的DNA立方体-肿瘤抗原分子这一纳米制剂，为终制剂的B组分。
上述步骤（1）中长链1AB、2BA、3AB、4BA与短链B14的摩尔比为1:1:1:1:4；程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃。
上述步骤（2）中DNA立方体与化疗药物的摩尔比为1:1000；
上述步骤（3）中氨基修饰的短链B14、肿瘤抗原分子和DNA立方体的摩尔比4:40:1；升温-降温循环的条件为：升温至40 ℃然后30分钟内匀速降温至4℃为单次循环，循环的次数为4次。
上述步骤（5）中DNA立方体-化疗药物与癌细胞膜沉淀的质量比为1:4 ；DNA立方体-肿瘤抗原分子与大肠杆菌外膜囊泡的质量比为1:8。
实施例1
以化疗药-盐酸阿霉素（DOX）、肿瘤抗原分子-卵清白蛋白（OVA）表位肽为例，实际中不限于DOX和OVA肽，具体制备步骤为：
（1）将DNA链1AB、2BA、3AB、4BA、B14按照1:1:1:1:4的比例混合于PCR管中，程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃，合成cube；获得的DNA cube用凝胶电泳表征，结果如图2A可知，随着加入链的增多，结构分子量增加，在凝胶上的电泳速度变慢，加入全部链后，成功构建DNA cube。
（2）将DNA cube与DOX按适当比例混合后，通过震荡反应6小时，将DOX 嵌入DNAcube ，结束后在14000 g，4 ℃条件下离心15分钟，将获得的cube-DOX沉淀用凝胶电泳表征，并测定上清中游离DOX的量。结果如图2B和2C可知，成功构建cube-DOX，DNAcube和DOX的最佳反应比为1:1000。
（3）将DNA cube与OVA多肽连接以获得cube-OVA需要两步：首先，将氨基修饰（NH2-）的短链B14与交联剂Sulfo-SMCC在玻璃瓶中室温搅拌反应2小时，然后用超滤管离心除去多余交联剂（12000 g、10分钟，重复5遍），再与有巯基的OVA多肽（序列如SEQ ID No.6所示）反应，获得B14-OVA，表征结果如2D所示，连接后的B14-OVA移动变慢，表明B14与OVA成功连接。然后，将DNA cube与B14-OVA按照1:4混匀，在30分钟内从40 ℃匀速降温至4 ℃，该降温过程共循环进行4次，即获得cube-OVA。cube-OVA用Native-PAGE电泳表征，表征结果如图2E，由结果可知，cube-OVA条带迁移速率最低，说明成功构建cube-OVA。
（4）裂解卵巢癌细胞ID8后，在700 g，4 ℃条件下离心5分钟，取上清在20000 g，4℃条件下离心10分钟，得到细胞膜沉淀。将大肠杆菌菌液在5000 g，4 ℃条件下离心5分钟去除菌体沉淀，利用截留分子量为100 kDa的超滤管浓缩上清后，在150000 g，4 ℃条件下离心3小时，获得大肠杆菌外膜囊泡沉淀（IM）。
（5）将cube-DOX与IM按1:8质量比混合后，于冰浴中超声3分钟，得到IM@cube-DOX，利用电泳对其进行表征，结果如图3A，随着IM用量的增加，cube-DOX的条带消失，全部滞留在加样孔中，表明成功构建IM@cube-DOX。按照相同方法制备OMV@cube-OVA并对其进行表征，结果如图3B，随着OMVs用量的增加，cube-OVA的条带消失，全部滞留在加样孔中，表明成功构建OMV@cube-OVA。图3C表明包膜前后IM和OMVs中的蛋白可以得到较完整保留，图3D展示了IM和OMVs包裹cube-DOX和cube-OVA前后的形态。图3E显示包膜后制剂的粒径进一步增加。
为充分理解本发明的仿生DNA纳米药物增效抗肿瘤的作用和机制，进行以下抗肿瘤治疗方面的应用实验：
本仿生DNA纳米药物的发明通过两种仿生膜IM和OMVs分别增强DOX和OVA对肿瘤细胞和免疫细胞的靶向性，进而增加DOX对癌细胞的毒性作用和OVA的免疫激活作用，达到增效化疗免疫联合治疗卵巢癌的目的。
应用例1：ID8细胞对IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA的差别摄取作用研究
收集处于对数生长期的ID8细胞，以5×104个/孔的密度铺于24孔板中，待细胞生长至合适密度后，分别加入用细胞培养基稀释的free DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX，DOX终浓度均为2 μM，每组设置1、2、4 h三个时间点。孵育结束后用DAPI染细胞核制作爬片，在荧光共聚焦显微镜下观察各组DOX定性摄取情况。另按照相同方法和分组，孵育结束后用流式细胞仪检测各组DOX定量摄取情况。结果如图4、5，ID8细胞对DOX的摄取量随时间的增加而增加，IM@cube-DOX组DOX摄取速率与游离DOX、cube-DOX无明显差异，表明ID8细胞能较快摄取IM@cube-DOX。
收集处于对数生长期的ID8细胞，以5×104个/孔的密度铺于24孔板中，待细胞生长至合适密度后，分别加入用细胞培养基稀释的1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC，1AB-FITC终浓度均为250nM，每组设置1、2、4 h三个时间点。孵育结束后用DAPI染细胞核制作爬片，在荧光共聚焦显微镜下观察各组制剂定性摄取情况。另按照相同方法和分组，孵育结束后用流式细胞仪检测各组制剂定量摄取情况。结果如图8、9，OMV@cube-OVA组绿色荧光在各个时间点均较弱，表明ID8细胞对OMV@cube-OVA摄取速率较低，摄取速率显著小于cube-OVA-FITC，说明OMVs能减少ID8细胞对cube-OVA的非靶向性摄取。
应用例2：DC2.4细胞对IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA的差别摄取作用研究
收集处于对数生长期的DC2.4细胞，以5×104个/孔的密度铺于24孔板中，待细胞生长至合适密度后，分别加入用细胞培养基稀释的free DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX，DOX终浓度均为2 μM，每组设置1、2、4 h三个时间点。孵育结束后用DAPI染细胞核制作爬片，在荧光共聚焦显微镜下观察各组DOX定性摄取情况。另按照相同方法和分组，孵育结束后用流式细胞仪检测各组DOX定量摄取情况。结果如图6、7，IM@cube-DOX组红色荧光在各个时间点均较弱，表明DC2.4细胞对IM@cube-DOX摄取速率较低，摄取速率显著小于DOX组和cube-DOX组，说明IM能减少DC2.4细胞对cube-DOX的非靶向性摄取。
收集处于对数生长期的DC2.4细胞，以5×104个/孔的密度铺于24孔板中，待细胞生长至合适密度后，分别加入用细胞培养基稀释的1AB-FITC、cube-OVA-FITC和OMV@cube-OVA-FITC，1AB-FITC终浓度均为250nM，每组设置1、2、4 h三个时间点。孵育结束后用DAPI染细胞核制作爬片，在荧光共聚焦显微镜下观察各组制剂定性摄取情况。另按照相同方法和分组，孵育结束后用流式细胞仪检测各组制剂定量摄取情况。结果如图10、11，各组制剂摄取量均随时间的增加而增加。OMV@cube-OVA组在各个时间点荧光强度和摄取量均显著高于1AB-FITC和cube-OVA-FITC。表明OMVs能赋予cube-OVA对DC2.4细胞的靶向性，促进DC2.4细胞对cube-OVA的摄取。
由应用例1-2可知，IM@cube-DOX能有效靶向ID8细胞，减少DC2.4细胞对cube-DOX的非靶摄取。OMV@cube-OVA能有效靶向DC2.4细胞，减少ID8细胞对cube-OVA的非靶摄取。
应用例3：IM@cube-DOX对ID8细胞的毒性作用研究
收集处于对数生长期的ID8细胞，以6×103个/孔的密度铺于96孔板中培养24 h。设置实验组、空白组和调零组，每组5个复孔。实验组分为free DOX、cube-DOX和IM@cube-DOX，各组DOX终浓度分别为0.05 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.5 μM和1 μM。加药后，与细胞分别孵育24 h和48 h后，利用cck-8法检测各组制剂对ID8细胞的毒性作用。结果如图12A，ID8细胞存活率随DOX浓度增加而降低，IM@cube-DOX组细胞存活率与游离DOX组无显著性差异，表明IM@cube-DOX在体外表现出良好的抗癌细胞毒性作用。
应用例4：OMV@cube-OVA对DC2.4细胞的免疫激活作用研究
收集处于对数生长期的DC2.4细胞，以1×105个/孔的密度铺于12孔板中，生长24h后，加入各组药物。药物分组为blank、LPS（1 μg/mL）、free OVA、cube-OVA、OMVs、OMV@cube-OVA，OVA终浓度均为0.062 μg/mL，OMVs终浓度均为22.50 μg/mL。将药物与DC2.4细胞作用24 h后，收集上层培养基，用酶联免疫吸附法测定培养基中TNF-α和IL-6水平。另收集各组细胞，与CD80和MHC-II抗体孵育后，用流式细胞仪检测DC2.4细胞表面CD80和MHC-II表达水平。结果如图12B、C，OMV@cube-DOX组CD80、MHC-II、TNF-α和IL-6表达水平均为最高，表明OMV@cube-OVA对DC2.4细胞的激活作用最强。
应用例5：IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA的体内分布研究
动物模型建立，动物：C57BL/6 雌性小鼠，体重：17~22 g，肿瘤细胞：ID8-OVA细胞。收集生长状态良好的ID8-OVA细胞，消化离心后稀释细胞密度至1×108个/mL，取100 μL接种到小鼠右上肢后方皮下，待肿瘤体积达到100 mm3时，随机分组并采用尾静脉注射给药。药物分组为1AB-cy5.5、DNA cube-cy5.5、IM@cube-DOX-cy5.5、OMV@cube-OVA-cy5.5，各组1AB-cy5.5浓度均为2 μM，给药体积均为150 μL，记录此时为0 h，并分别于2 h、4 h、8 h、12h、24 h采集荧光图像和X-ray图像，观察小鼠体内荧光分布和强度。为进一步确认各组制剂在脏器组织和瘤组织中的分布，给药24 h时后，颈椎脱臼处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织，置于活体成像仪上采集图像。结果如图13，IM和OMVs能分别有效增加cube-DOX和cube-OVA的肿瘤组织靶向作用和滞留时间。
应用例6：IM@cube-DOX和OMV@cube-OVA联用的体内抗肿瘤作用研究
构建荷瘤小鼠模型，待肿瘤体积达到100 mm3时，随机分组并采用尾静脉注射给药。药物分组为Saline、free DOX、cube-DOX、IM@cube-DOX、free OVA、cube-OVA、OMV@cube-OVA、freeDOX+free OVA、cube-DOX+cube-OVA、IM@(cube-DOX+cube-OVA)、OMV@(cube-DOX+cube-OVA) 、IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA，各组阿霉素给药剂量均为2 mg/kg，OVA给药剂量为均为15.50 μg/kg，隔天给药，每次150 μL，共5次，Saline组给同体积生理盐水。最后一次给药结束48 h后，采用眼球取血法，收集小鼠全血血液，颈椎脱臼处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾和瘤组织留存备用，拍照观察各组小鼠瘤体积大小并称量瘤重，取各组小鼠肿瘤组织进行H&E染色。结果如图14、15，IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA组抑瘤率最高，最终瘤体积最小，肿瘤生长速度最慢，肿瘤组织中肿瘤细胞坏死细胞最多，表明其抑制肿瘤生长效果最好，优于共包封非精准靶向组IM@(cube-DOX+cube-OVA)和OMV@(cube-DOX+cube-OVA)。
采用流式细胞术、酶联免疫吸附法和免疫组化染色切片考察各组药物的免疫激活能力。
肿瘤组织流式细胞术检测方法如下：取0.2 g肿瘤组织进行消化，获得肿瘤组织的细胞悬液，计数将细胞悬液稀释成1×107个/mL，取1mL加入CD45、CD11C、CD80、MHC-II抗体，另取1mL细胞悬液加入CD45、CD3、CD4和CD8抗体。抗体孵育结束后，用流式细胞仪检测各组小鼠肿瘤组织中免疫细胞的激活。结果如图16，IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA组树突细胞活化程度最高，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞数量高于其他组，表明其免疫激活效果最好。
收集小鼠全血样本，室温静置1 h后于4 ℃，3000 rpm下离心15 min，收集上清即为各组小鼠血清，采用酶联免疫吸附法，按照试剂盒说明书测定血清中的γ干扰素、TNF-α和IL-6的表达情况。另对肿瘤组织进行包埋、切片、抗体染色，用显微镜观察肿瘤组织中TNF-α和IL-6表达情况。结果如图17、18，IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA组能最有效增加TNF-α、IL-6和IFN-γ的表达，进一步表明IM@cube-DOX+OMV@cube-OVA组刺激机体免疫激活程度最高，与肿瘤治疗效果趋势一致。
记录治疗期间小鼠体重，探究各组制剂对小鼠体重的影响。将心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色，观察组织切片，考察各组制剂对器官组织的毒性。结果如图19、20，各组制剂对小鼠无明显毒副作用，具有良好的体内安全性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，其特征在于：所述纳米药物包括A组分和B组分，A组分由卵巢癌细胞膜、DNA立方体和化疗药物组成；B组分由大肠杆菌外膜囊泡、DNA立方体和肿瘤抗原分子组成。
2.根据权利要求1所述的基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，其特征在于：所述DNA立方体由长链1AB、2BA、3AB、4BA和短链B14自组装制备得到；其中1AB的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2BA的碱基序列如SEQ ID No.2所示，3AB的碱基序列如SEQ ID No.3所示，4BA的碱基序列如SEQ ID No.4所示；B14的碱基序列如SEQ ID No.5所示，其5’端修饰有氨基。
3.根据权利要求2所述的基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，其特征在于：所述肿瘤抗原分子与短链B14经交联剂Sulfo-SMCC连接后与DNA立方体相连。
4.根据权利要求3所述的基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，其特征在于：所述化疗药物均匀嵌入在DNA立方体的碱基对之间。
5.根据权利要求4所述的基于仿生膜的精准靶向治疗卵巢癌的纳米药物，其特征在于：所述卵巢癌细胞膜包裹在载有化疗药物的DNA立方体的外周，大肠杆菌外膜囊泡包裹在连接有肿瘤抗原分子的DNA立方体的外周。
6.权利要求2-5任一项所述的纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤为：
（1）将长链1AB、2BA、3AB、4BA与短链B14按比例混合后，经程序降温处理，获得DNA立方体；
（2）将步骤（1）的DNA立方体与化疗药物恒温震荡反应后，经离心弃上清，得DNA立方体-化疗药物；
（3）将氨基修饰的短链B14与交联剂sulfo-SMCC室温搅拌反应，除去多余的交联剂后所得产物，再与肿瘤抗原分子室温搅拌反应过夜，除去多余的肿瘤抗原分子，即得B14-肿瘤抗原分子，与步骤（1）的DNA立方体按比例混匀后，经升温-降温循环，得DNA立方体-肿瘤抗原分子；
（4）将卵巢癌细胞破碎，通过离心除杂质沉淀，再经高速离心后得到癌细胞膜沉淀；将大肠杆菌菌液经离心后去除菌体，取上清经浓缩后进行超速离心，所得沉淀即为大肠杆菌外膜囊泡；
（5）将步骤（2）的DNA立方体-化疗药物与步骤（4）的癌细胞膜沉淀按比例混合，超声后得卵巢癌细胞膜包裹的DNA立方体-化疗药物，作为制剂的A组分；再将步骤（3）的DNA立方体-肿瘤抗原分子与步骤（4）获得的大肠杆菌外膜囊泡以适当比例混合，超声后，得大肠杆菌外膜囊泡包裹的DNA立方体-肿瘤抗原分子这一纳米制剂，为终制剂的B组分。
7.根据权利要求6所述的纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中长链1AB、2BA、3AB、4BA与短链B14的摩尔比为1:1:1:1:4；程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃。
8.根据权利要求6所述的纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中DNA立方体与化疗药物的反应摩尔比为1:1000。
9.根据权利要求6所述的纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中氨基修饰的短链B14、肿瘤抗原分子和DNA立方体的摩尔比4:40:1；升温-降温循环的条件为：升温至40 ℃然后30分钟内匀速降温至4℃为单次循环，循环的次数为4次。
10.根据权利要求6所述的纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中DNA立方体-化疗药物与癌细胞膜沉淀的质量比为1:4；DNA立方体-肿瘤抗原分子与大肠杆菌外膜囊泡的质量比为1:8。
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