CN115990247A

CN115990247A - 基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物及其制备方法

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Publication number: CN115990247A
Application number: CN202210901074.7A
Authority: CN
Inventors: 张楠; 陈义兵; 孙俊红; 董卓林; 李梦茹
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及肿瘤化疗与免疫联合治疗、纳米自组装体和药物递送系统，特别是指基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物及其制备方法。所述免疫化疗药物包括DNA立方体、位于DNA立方体相对面的胆固醇分子、肿瘤抗原分子及化疗药物。本发明提供的化疗药物（盐酸阿霉素）@DNA立方体‑肿瘤抗原分子（DOX@C2.2‑Ag）可以镶嵌在肿瘤细胞膜上，使Ag作为新的免疫靶点暴露于肿瘤细胞膜表面，重塑肿瘤细胞免疫原性；能靶向递送负载的化疗药至肿瘤细胞；且由于DNA立方体具有中空结构，嵌入细胞膜后，在细胞膜上形成众多纳米孔道，使化疗药更快更多进入肿瘤细胞，增效化疗与免疫联合抗肿瘤的作用。

Description

基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及肿瘤化疗与免疫联合治疗、纳米自组装体和药物递送系统，特别是指基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物及其制备方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类生命健康的主要疾病之一，化疗药是治疗肿瘤最常用的一类药物，但很多化疗药的理化性质不理想，进入细胞效率较低，缺乏对肿瘤组织的靶向性，且易产生耐药。

肿瘤的联合治疗具有增强抗肿瘤疗效、减轻毒副作用、规避单一化疗的耐药性、阻止肿瘤侵袭和转移的优势，化疗和免疫疗法联合治疗就是一种高效的新型联合疗法。目前的抗肿瘤免疫疗法包括免疫检查点抑制剂疗法、CAR-T细胞疗法及肿瘤疫苗疗法等，这些疗法能通过不同机制逆转肿瘤中的免疫抑制，阻止肿瘤细胞的免疫逃逸，增强免疫系统对肿瘤细胞的杀伤等。而目前这些免疫疗法对实体瘤治疗效果较差，如何增强免疫系统对肿瘤组织和细胞的靶向杀伤作用十分关键。

为使联合疗法同时起效，增强其药效和减轻毒副作用，各类载药共递送系统相继出现，如脂质体、胶束、凝胶、DNA载体等。其中，DNA载体具有组织相容性好、易于修饰、结构精准可控等优点，常用作载体递送各类药物并发挥生物调节作用。专利CN 107469088 A公开了一种基于DNA折纸术的精确识别靶向纳米载体，该纳米载体在递送化疗药物的同时，表面修饰具有生物治疗功能的核酸适配体，通过生物治疗与化疗联合治疗，提高了抗肿瘤疗效，且利用DNA载体能精准载药的特点，优化了核酸适配体在DNA纳米载体表面的数量和位置，进一步增强了其抗肿瘤疗效。现实中的肿瘤细胞膜表面存在低表达抗原分子以降低其免疫原性、逃避免疫系统识别和杀伤的特点，因此，针对该特点如何采用DNA纳米自组装体递送药物，重塑肿瘤细胞免疫原性，增效化疗免疫联合抗肿瘤治疗，是本课题要解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物及其制备方法，以抗原标记肿瘤细胞膜重塑免疫原性的同时，向肿瘤细胞靶向递送化疗药，还能增强化疗药的入胞效率，实现高效低毒的新型免疫化疗联合治疗。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，所述免疫化疗药物包括DNA立方体、位于DNA立方体相对面的四个胆固醇分子、四个肿瘤抗原分子及化疗药物。

优选的，位于DNA立方体相对面的胆固醇分子不少于4个、肿瘤抗原分子不少于4个；

进一步的，位于DNA立方体相对面的胆固醇分子有4个、肿瘤抗原分子有4个；

优选的，所述DNA立方体由长链1AB、2BA、3AB、4BA和短链Cholesterol-A20自组装制备得到；其中1AB的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2BA的碱基序列如SEQ ID No.2所示，3AB的碱基序列如SEQ ID No.3所示，4BA的碱基序列如SEQ ID No.4所示；Cholesterol-A20的碱基序列如SEQ ID No.5所示，其5’端修饰有胆固醇。

优选的，所述肿瘤抗原分子为含有表位的抗原肽、蛋白或多糖，其左端修饰有含有巯基的半胱氨酸。

优选的，所述肿瘤抗原分子与DNA短链B14经交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)连接后再与DNA立方体相连，其中短链B14的碱基序列如SEQ ID No.6所示，其5’端修饰有氨基。

优选的，所述化疗药物均匀嵌入在DNA立方体的碱基对之间。

上述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，步骤为：

(1)将DNA链1AB、2BA、3AB、4BA与Cholesterol-A20按1:1:1:1:8的物质的量比例混合，程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃，得DNA立方体(C2.2)；

(2)将氨基修饰NH₂-短链B14与交联剂sulfo-SMCC 25℃恒温震荡反应2小时，经超滤除去多余交联剂后，再与经巯基修饰的肿瘤抗原分子(Ag)在25℃恒温震荡反应8小时反应，经超滤除去多余的肿瘤抗原分子，即得B14-肿瘤抗原分子(B14-Ag)；

(3)将步骤(1)的DNA立方体与步骤(2)的B14-肿瘤抗原分子按1:8的物质的量比，混匀后，以升温至40℃然后30分钟内匀速降温至4℃为单次循环，共循环进行4次，得DNA立方体-肿瘤抗原分子；

(4)将步骤(3)的DNA立方体-肿瘤抗原分子与化疗药物以化疗药物过量的比例恒温反应后，经离心弃上清，得化疗药物@DNA立方体-肿瘤抗原分子。

进一步以盐酸阿霉素为例，实际中不限于盐酸阿霉素，制备一种盐酸阿霉素@DNA纳米结构-Ag(DOX@C2.2-Ag)，其空间结构如图1所示。

优选的上述DOX@C2.2-Ag的制备方法，步骤为：

将NH₂-修饰的B14与-SH修饰的Ag利用交联剂sulfo-SMCC连接起来，具体方法是将NH₂-B14用PBS溶解后与sulfo-SMCC按照1：100的摩尔比混合，在25℃的恒温震荡仪中反应2小时，再用超滤管离心除去多余sulfo-SMCC，然后将产物与Ag按照1：100的摩尔比，在25℃的恒温震荡仪中反应8小时，再用超滤管离心除去多余Ag，即获得B14-Ag。

将C2.2与B14-Ag按照1：8的摩尔比混匀，从40℃匀速降温历经30分钟到达4℃，该降温过程共循环进行4次，即获得C2.2-Ag；

将化疗药溶液与C2.2-Ag以摩尔比1400：1混合，在恒温混匀仪中25℃、1000rpm孵育3小时，离心除去游离DOX，即得DOX@C2.2-Ag沉淀。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种将化疗与免疫治疗联合起来的DNA纳米药物，通过在细胞膜上开孔，加快化疗药进入肿瘤细胞，并以抗原分子标记肿瘤细胞膜，重塑肿瘤细胞免疫原性，提高免疫治疗抗肿瘤效果。

2、以盐酸阿霉素(DOX)为例，本申请制备的DNA立方体-肿瘤抗原分子的载药量为每个碱基对间平均可载3.6个DOX分子，经胆固醇修饰的DNA立方体(C2.2)与细胞膜的亲和力大大增强，C2.2的中空立体骨架、8-10nm的合适尺寸，使DNA立方体镶嵌在细胞膜中，起到细胞膜开孔的作用，此膜孔可使DOX通过此孔更快地进入肿瘤细胞，增强5-FU和卡铂对肿瘤细胞的抑制率。DNA立方体-肿瘤抗原分子(C2.2-Ag)镶嵌于肿瘤细胞膜上，使Ag暴露于肿瘤细胞膜表面，成为肿瘤新增的免疫抗原标志物，有助于免疫系统对肿瘤的识别和杀伤，增强对抗原呈递细胞和杀伤性T细胞的激活效率，实现化疗免疫联合抗肿瘤治疗的目的。

3、与现有DNA递药系统抗肿瘤相比，本发明提供的化疗药物@DNA立方体-肿瘤抗原分子(DOX@C2.2-Ag)可以镶嵌在肿瘤细胞膜上，使Ag作为新的免疫靶点暴露于肿瘤细胞膜表面，重塑肿瘤细胞免疫原性；负载的DOX能靶向递送至肿瘤细胞，且更快进入肿瘤细胞，同时实现化疗与免疫联合抗肿瘤的作用，是一种化疗免疫联合抗肿瘤治疗的新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为化疗药@DNA立方体-Ag的空间结构图(以DOX为模型化疗药，以卵清白蛋白OVA肽为模型抗原肽)。

图2为(A)C2.2的TEM图(箭头指示代表性C2.2结构)；(B)C2.2与C2.2-OVA的Native-PAGE电泳图(泳道1：50bp maker；泳道2：DNA立方体；泳道3：C2.2；泳道4：C2.2-B14；泳道5：C2.2-OVA)；(C)C2.2与DOX@C2.2的Native-PAGE电泳图(泳道1：50bp maker；泳道2：C2.2；泳道3：DOX@C2.2)；(D)DOX荧光与浓度关系的标准曲线图；(E)DOX的起始浓度与C2.2载DOX的量和效率的关系图。

图3为绿色荧光标记的C2.2与MCF-7细胞共孵育后的细胞照片。

图4为绿色荧光标记的C2.2与A549细胞共孵育后的细胞照片。

图5为绿色荧光标记的C2.2与4T1细胞共孵育后的细胞照片。

图6为绿色荧光标记的C2.2-OVA与MCF-7细胞共孵育后的细胞照片。

图7为绿色荧光标记的C2.2-OVA与4T1细胞共孵育后的细胞照片。

图8为激光共聚焦拍摄MCF-7细胞摄取游离DOX、DOX@C2.2、C2.2+DOX的结果图。

图9为激光共聚焦拍摄A549细胞摄取游离DOX、DOX@C2.2、C2.2+DOX的结果图。

图10为激光共聚焦拍摄4T1细胞摄取游离DOX、DOX@C2.2、C2.2+DOX的结果图。

图11为(A)DOX、DOX@C2.2对MCF-7细胞的抑制率结果图；(B)5-FU、C2.2+5-FU对MCF-7细胞的抑制率结果图；(C)卡铂(CBP)、C2.2+卡铂对MCF-7的抑制率结果图；(D)DOX、DOX@C2.2对4T1细胞的抑制率结果图；(E)5-FU、C2.2+5-FU对4T1细胞的抑制率结果图(N＝3)。

图12为流式细胞术检测C2.2-OVA刺激DC2.4细胞活化图。

图13为DOX@C2.2-OVA对4T1肿瘤模型的体内抗肿瘤效果。各组小鼠治疗后的(A)肿瘤照片；(B)肿瘤重量；治疗过程中(C)肿瘤体积的变化趋势图和(D)小鼠体重的变化趋势图(N＝6)。

图14为流式细胞术检测DOX@C2.2-OVA等治疗对小鼠肿瘤组织DC细胞活化图(A)及其统计图(B)；流式细胞术检测DOX@C2.2-OVA等治疗对小鼠肿瘤组织CD8⁺T细胞活化图(C)及其统计图(D)(N＝3)。

图15为免疫组化检测DOX@C2.2-OVA等治疗后小鼠肿瘤组织中(A)TNF-α和(B)IL-6表达量图；(C)各组小鼠肿瘤组织H&E病理切片图。

图16为DOX@C2.2-OVA等治疗后各组小鼠脏器组织H&E病理切片结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料：

缓冲液体系为TAMg(Tris 45mM、MgCl₂·6H₂O 12.5mM、乙酸20mM)

DNA链1AB、2BA、3AB、4BA、Cholesterol-A20、B14、OVA多肽的序列如下表：

实施例

基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，以化疗药-盐酸阿霉素(DOX)、肿瘤抗原分子-卵清白蛋白(OVA)肽为例，实际中不限于DOX和OVA肽，具体制备步骤为：

(1)将DNA链1AB、2BA、3AB、4BA、Cholesterol-A20按照1:1:1:1:8的比例混合于PCR管中，程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃降温到4℃，合成C2.2；获得的C2.2用透射电镜表征，结果如图2A，视野范围内观察到多个粒径10nm左右，具有一定形状的结构，由图可知，成功构建C2.2。

(2)将OVA肽修饰到C2.2以获得C2.2-OVA需要两步骤：

首先，将一条由氨基修饰(NH₂-)的短链B14与交联剂sulfo-SMCC在恒温震荡仪中25℃反应2小时，然后用超滤管离心除多余交联剂(5000g、20分钟，重复5遍)，再与有巯基的OVA多肽(序列如SEQ ID No.7所示)反应，获得B14-OVA。

然后，将C2.2与B14-OVA按照1：8混匀，在30分钟内从40℃匀速降温至4℃，该降温过程共循环进行4次，即获得C2.2-OVA。C2.2以及C2.2-OVA用Native-PAGE电泳表征，表征结果如图2B，由结果可知，随着链的增多，结构分子量增加，在凝胶上的电泳速度变慢，说明成功构建C2.2与C2.2-OVA。

(3)利用DOX可以嵌入DNA双链将DOX与DNA立方体在恒温混匀仪中反应3小时。反应结束后在12000rpm、4℃下离心20min得DOX@C2.2沉淀，弃上清将沉淀重悬后进行Native-PAGE电泳，并以C2.2为基准，观察DOX@C2.2与C2.2电泳结果，结果如图2C，由电泳结果可知，DOX@C2.2与C2.2的电泳条带一致，即C2.2载DOX并离心后，其基本结构不变。

计算DNA立方体载阿霉素的量，步骤如下：

①做DOX标准曲线，将DOX配成浓度为32μM的溶液，再逐一稀释为16μM、8μM、4μM、2μM，做荧光强度与浓度之间的标准曲线，结果如图2D。

②将等量DNA立方体(200nM)分别与等体积不同浓度的DOX在棕色EP管中反应3小时，然后在12000rpm、4℃下离心20min，得到DOX@C2.2沉淀，测量上清中DOX荧光强度，根据图2D中DOX荧光与浓度关系式计算上清中DOX浓度，从而计算C2.2载DOX量，结果如图2E，由结果可知，DOX浓度280μM时，C2.2载药量达到最大，进一步增大DOX浓度，载药量不再升高。经计算每个碱基对间平均可载3.6个DOX分子。

为充分理解本发明的免疫化疗药物在抗肿瘤上发挥的作用，进行以下抗肿瘤治疗方面的应用试验：

阿霉素是目前治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等肿瘤的一线药物，但化疗药存在全身性毒性、易产生耐药的缺点。以阿霉素为例，当阿霉素被机体吸收(或直接入血)后，若阿霉素浓度大，对肿瘤有杀伤作用的同时对正常组织亦有毒性；若浓度小，又易诱导细胞产生耐药。本DNA纳米药物的发明从两个方面来解决此问题，一是针对化疗药方面：DNA立方体可在肿瘤细胞膜上开孔，提高阿霉素分子进入癌细胞的效率；负载阿霉素的DNA立方体可将阿霉素靶向递送至肿瘤细胞膜，不断释放阿霉素。二是采用联合疗法，DNA立方体修饰的OVA肽随其镶嵌到细胞膜上时，为肿瘤细胞增加了免疫抗原标志物，OVA肽成为肿瘤细胞新增的抗原，刺激免疫细胞活化，杀伤肿瘤细胞，发挥免疫治疗的作用。

应用例1：C2.2与MCF-7细胞膜镶嵌作用的研究

将生长良好的MCF-7肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，加入荧光标记的FITC-C2.2(其中1AB链由FITC-1AB链代替)，使得C2.2终浓度为0.1μM，分别在共培养1h、2h、4h、6h、8h、10h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察FITC-C2.2与细胞相互作用结果。结果如图3，由图可知，C2.2(绿色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，其镶嵌作用可达10h以上，说明C2.2上的胆固醇分子与MCF-7细胞膜的高亲和力使得C2.2镶嵌在细胞膜上。

应用例2：C2.2与A549细胞膜镶嵌作用的研究

将生长良好的A549肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，加入荧光标记的FITC-C2.2，使得C2.2终浓度为0.1μM，分别在共培养1h、2h、4h、6h、8h、10h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察FITC-C2.2与细胞相互作用结果。结果如图4，由图可知，C2.2(绿色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，并镶嵌作用可长达10h以上，说明C2.2上的胆固醇分子与A549细胞膜的高亲和力使得C2.2镶嵌在细胞膜上。

应用例3：C2.2与4T1细胞膜镶嵌作用的研究

将生长良好的4T1肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，加入荧光标记的FITC-C2.2，使得C2.2终浓度为0.1μM，分别在共培养1h、2h、4h、6h、8h、10h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察FITC-C2.2与细胞相互作用结果。结果如图5，由图可知，C2.2(绿色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，并镶嵌作用可长达10h以上，说明C2.2上的胆固醇分子与4T1细胞膜的高亲和力使得C2.2镶嵌在细胞膜上。

应用例4：C2.2-OVA与MCF-7细胞膜镶嵌作用的研究

将生长良好的MCF-7肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，加入荧光标记的FITC-C2.2-OVA，使得C2.2-OVA终浓度为0.1μM，分别在共培养2h、4h、6h、8h、10h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察C2.2-OVA与细胞相互作用结果。结果如图6，由图可知，C2.2-OVA(绿色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，并镶嵌作用可长达10h以上，说明C2.2上的胆固醇分子与MCF-7细胞膜的高亲和力使得C2.2镶嵌在细胞膜上。

应用例5：C2.2-OVA与4T1细胞膜镶嵌作用的研究

将生长良好的4T1肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，加入荧光标记的FITC-C2.2-OVA，使得C2.2-OVA终浓度为0.1μM，分别在共培养2h、4h、6h、8h、10h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察C2.2-OVA与细胞相互作用结果。结果如图7，由图可知，C2.2-OVA(绿色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，并镶嵌作用可长达10h以上，说明C2.2上的胆固醇分子与4T1细胞膜的高亲和力使得C2.2镶嵌在细胞膜上。

由应用例1-5可知，C2.2和C2.2-OVA均能与细胞膜相互作用，镶嵌入MCF-7、A549、4T1肿瘤细胞的细胞膜中，且能在细胞膜上停留较长时间。

应用例6：C2.2加速MCF-7细胞摄取DOX的研究

将生长良好的MCF-7肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，分别加入游离DOX、荧光标记的Cy5.5-DOX@C2.2(1AB链由Cy5.5-1AB链代替)、Cy5.5-C2.2+DOX(该组将游离C2.2先于游离DOX 3小时加入细胞中)，使得C2.2终浓度为0.1μM、DOX终浓度为0.5μM，分别在共培养0.5h、1h、2h、4h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察MCF-7细胞对DOX的摄取情况。结果如图8，由图可知，C2.2(黄色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，在0.5h和1h，DOX@C2.2组和C2.2+DOX组的DOX量显著高于游离DOX组，说明C2.2能加速MCF-7细胞摄取DOX。

应用例7：C2.2加速A549细胞摄取DOX的研究

将生长良好的A549肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，分别加入游离DOX、Cy5.5-DOX@C2.2、Cy5.5-C2.2+DOX(该组将游离C2.2先于游离DOX 3小时加入细胞中)，使得C2.2终浓度为0.1μM、DOX终浓度为0.5μM，分别在共培养0.5h、1h、2h、4h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察A549细胞对DOX的摄取情况。结果如图9，由图可知，C2.2(黄色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，在0.5h和1h，DOX@C2.2组和C2.2+DOX组的DOX量显著高于游离DOX组，说明C2.2能加速A549细胞摄取DOX。

应用例8：C2.2加速4T1细胞摄取DOX的研究

将生长良好的4T1肿瘤细胞按5×10⁴个/孔的细胞数铺12孔板，待细胞长到适宜密度后，分别加入游离DOX、Cy5.5-DOX@C2.2、Cy5.5-C2.2+DOX(该组将游离C2.2先于游离DOX3小时加入细胞中)，使得C2.2终浓度为0.1μM、DOX终浓度为0.5μM，分别在共培养0.5h、1h、2h、4h时用DAPI染细胞核制作爬片，用共聚焦显微镜观察4T1细胞对DOX的摄取情况。结果如图10，由图可知，C2.2(黄色荧光)围绕细胞膜的轮廓分布，即C2.2镶嵌在细胞膜上，在0.5h、1h和2h，DOX@C2.2组和C2.2+DOX组的DOX量显著高于游离DOX组，说明C2.2能加速4T1细胞摄取DOX。

由应用例6-8可知，C2.2有加速MCF-7、A549、4T1细胞摄取DOX的作用，说明当C2.2镶嵌在细胞膜时可在细胞膜上形成孔道，加速DOX入胞，或DOX@C2.2与细胞膜相互作用，嵌入细胞膜能加速DOX入胞，进一步说明C2.2对于不同类别细胞系均可加速细胞摄取化疗药物的广泛适用性。

应用例9：C2.2促进化疗药DOX、5-FU、卡铂对MCF-7肿瘤细胞的杀伤作用

将生长良好的MCF-7细胞按5000个/孔的数量铺96孔板后，待细胞生长至适宜密度，按照游离DOX、DOX@C2.2的分组给药，其中DOX浓度为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、3.2μM，给药24h后用CCK-8法测定细胞生存率，结果如图11A，显示游离DOX、DOX@C2.2组对MCF-7细胞的抑制率基本一致。

将生长良好的MCF-7细胞按5000个/孔的数量铺96孔板后，待细胞生长至适宜密度，按照5-FU、C2.2+5-FU(该组将游离C2.2先于游离5-FU 3小时加入细胞中)的分组给药，其中5-FU浓度为10μM、20μM、40μM、80μM、160μM，给药24h后用CCK-8法测定细胞生存率，结果如图11B，显示C2.2+5-FU组对MCF-7细胞的抑制率高于游离5-FU组，推测C2.2镶嵌在细胞膜时，在细胞膜上开孔，加大了5-FU的入胞量，从而增强了5-FU对细胞的杀伤作用。

将生长良好的MCF-7细胞按5000个/孔的数量铺96孔板后，待细胞生长至适宜密度，按照游离卡铂、C2.2+卡铂(该组将游离C2.2先于游离卡铂3小时加入细胞中)的分组给药，其中卡铂浓度为100μM、200μM、300μM、400μM、500μM，给药24h后用CCK-8法测定细胞生存率，结果如图11C，显示C2.2+卡铂组对MCF-7细胞的抑制率高于游离卡铂组，推测C2.2镶嵌在细胞膜时，在细胞膜上开孔，加大了卡铂的入胞量，从而增强了卡铂对细胞的杀伤作用。

应用例10：C2.2促进化疗药DOX、5-FU对4T1肿瘤细胞的杀伤作用

将生长良好的4T1细胞按5000个/孔的数量铺96孔板后，待细胞生长至适宜密度，按照游离DOX、DOX@C2.2的分组给药，其中DOX浓度为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、3.2μM，给药24h后用CCK-8法测定细胞生存率，结果如图11D，显示游离DOX、DOX@C2.2组对4T1细胞的抑制率基本一致。

将生长良好的4T1细胞按5000个/孔的数量铺96孔板后，待细胞生长至适宜密度，按照游离5-FU、C2.2+5-FU(该组将游离C2.2先于游离5-FU 3小时加入细胞中)的分组给药，其中5-FU浓度为10μM、20μM、40μM、80μM、160μM，给药24h后用CCK-8法测定细胞生存率，结果如图11E，显示C2.2+5-FU组对4T1细胞的抑制率高于游离5-FU组，推测C2.2镶嵌在细胞膜时，在细胞膜上开孔，加大了5-FU的入胞量，从而增强了5-FU对细胞的杀伤作用。

由应用例9-10可知，C2.2可增强化疗药5-FU、卡铂对MCF-7细胞的杀伤作用及5-FU对4T1细胞的杀伤作用，表明了C2.2镶嵌在细胞膜上形成的孔道可增加化疗药5-FU、卡铂的入胞量，以发挥更强的杀伤肿瘤细胞作用，更进一步表明了C2.2在细胞膜开孔时增加不同药物入胞(尤其是入胞效率较低的药物)增强药效的广泛适用性。

应用例11：C2.2-OVA肽对DC2.4树突状细胞的免疫激活作用

将生长状态良好的DC2.4细胞，铺12孔板后长到适宜密度后，设置分3组：调零组、对照组即游离OVA组、实验组即C2.2-OVA组，按照分组加入OVA、C2.2-OVA，其中OVA的浓度为0.1μM、0.5μM、1μM，继续培养24h后，弃上清得细胞沉淀用CD80⁺荧光标记抗体分别与调零组、OVA组、C2.2-OVA组避光孵育30分钟，孵育完成后进行离心得细胞沉淀，沉淀重悬后进行流式检测，以调零组为基准，检测对照组与实验组DC2.4细胞的免疫活化程度。结果如图12显示，与游离OVA组相比，C2.2-OVA能更高效地激活DC2.4。

应用例12：动物模型水平评估本发明在抗肿瘤方面的作用

动物模型建立，动物：BALB/C雌性小鼠，体重：18g±2g，肿瘤细胞：4T1细胞。取生长状态良好的4T1细胞消化离心后混悬成浓度1×10⁷个/mL，取100μL接种到小鼠腋窝下方，待肿瘤体积达到100mm³时，随机分组并采用瘤旁注射法给药。

分组为生理盐水组、游离DOX组、游离OVA组、游离DOX+OVA组、C2.2、C2.2-OVA组、DOX@C2.2、DOX@C2.2-OVA组共8组。其中，DOX的浓度为0.4mg/kg，C2.2、C2.2-OVA浓度为2μM，注射体积为100μL。

给药方式为瘤旁注射、两天一次共4次，每天记录小鼠体重、瘤体积。

给药结束第二天剥瘤，测量瘤重，并绘制小鼠肿瘤体积和体重动态图，如图13，由结果可知，各组中DOX@C2.2-OVA组小鼠肿瘤体积较小，瘤重较轻，小鼠体重波动范围小，即本组有较好的抗肿瘤效果，且无明显毒性。

取每组小鼠的肿瘤组织进行流式检测、免疫组化检测以及H&E病理切片染色。

肿瘤组织流式细胞术检测方法如下：取200mg肿瘤组织进行消化，获得肿瘤组织的细胞悬液，计数将细胞悬液稀释成1×10⁷个/mL，取1mL加入抗体FITC-CD45、PE-CD11C、APC-CD80，另取1mL细胞悬液加入抗体FITC-CD45、APC-CD8、BV650-CD4，抗体孵育结束后，上机检测，用流式细胞仪检测不同治疗组中肿瘤微环境内的CD80+DC和CD8+T细胞的数量，如图14，由结果可知DOX@C2.2-OVA组DC活化程度较高，且CD8+T细胞数量也较多，表明本组制剂能高效激活免疫系统，并产生具有肿瘤杀伤作用的T细胞。

对肿瘤组织进行包埋、切片、TNF-α和IL-6抗体染色，用显微镜观测各组免疫组化结果。由结果可知，DOX@C2.2-OVA组TNF-α和IL-6表达量较高，如图15A和15B，表明本组免疫细胞分泌的TNF-α和IL-6因子较多，进一步说明本组肿瘤组织中的免疫激活效率较高。

对肿瘤组织进行包埋、切片、病理染色后在显微镜下进行观测，由结果可知DOX@C2.2-OVA组肿瘤细胞坏死程度较高，如图15C，即抗肿瘤效果较好。

解剖心、肝、脾、肺、肾进行H&E病理切片染色，观察其形态，监测各组制剂对脏器的毒性，如图16，由结果可知，游离DOX组出现心脏和肾脏毒性，其他组无明显毒性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，其特征在于：所述免疫化疗药物包括DNA立方体、位于DNA立方体相对面的胆固醇分子、肿瘤抗原分子及化疗药物。

2. 根据权利要求1所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，其特征在于：所述DNA立方体由DNA链1AB、2BA、3AB、4BA和Cholesterol-A20自组装制备得到；其中1AB的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2BA的碱基序列如SEQ ID No.2所示，3AB的碱基序列如SEQID No.3所示，4BA的碱基序列如SEQ ID No.4所示；Cholesterol-A20的碱基序列如SEQ IDNo.5所示，其5’端修饰有胆固醇。

3.根据权利要求2所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，其特征在于：所述肿瘤抗原分子为含有表位的抗原肽、蛋白或多糖，其左端修饰有含有巯基的半胱氨酸。

4. 根据权利要求3所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，其特征在于：所述肿瘤抗原分子与短链B14经交联剂sulfo-SMCC连接后再与DNA立方体相连，其中短链B14的碱基序列如SEQ ID No.6所示，其5’端修饰有氨基。

5.根据权利要求4所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物，其特征在于：所述化疗药物均匀嵌入在DNA立方体的碱基对之间。

6.权利要求2-5任一项所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，其特征在于，步骤为：

（1）将DNA链1AB、2BA、3AB、4BA与Cholesterol-A20按比例混合，经程序降温后，得DNA立方体；

（2）将NH₂-短链B14与交联剂sulfo-SMCC恒温震荡反应，经超滤除去多余交联剂后所得产物，再与经巯基修饰的肿瘤抗原分子震荡反应，经超滤除去多余的肿瘤抗原分子，即得B14-肿瘤抗原分子；

（3）将步骤（1）的DNA立方体与步骤（2）的B14-肿瘤抗原分子混匀后进行升温-降温循环反应，得DNA立方体-肿瘤抗原分子；

（4）将步骤（3）的DNA立方体-肿瘤抗原分子与化疗药物常温孵育后，经离心弃上清，得化疗药物@DNA立方体-肿瘤抗原分子。

7.根据权利要求6所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中DNA链1AB、2BA、3AB、4BA与Cholesterol-A20的物质的量比为1:1:1:1:8；程序降温的条件为：95℃保持5分钟，然后经30分钟匀速降温至80℃并保持5分钟，再以2分钟/1℃的速度降温至40℃，最后以3分钟/1℃的速度降温到4℃。

8. 根据权利要求6所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中NH₂-短链B14的浓度为100 μM ，交联剂sulfo-SMCC的浓度为10 mM，恒温震荡反应的温度为25℃，时间为2小时；所得产物与肿瘤抗原分子震荡反应的温度为25℃，时间为8小时。

9.根据权利要求6所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中DNA立方体与B14-肿瘤抗原分子的物质的量比为1:8，升温-降温循环反应的条件为以升温至40℃然后30分钟内匀速降温至4℃为单次循环，共循环进行4次。

10. 根据权利要求6所述的基于重塑肿瘤细胞免疫原性策略的免疫化疗药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中DNA立方体-肿瘤抗原分子与化疗药物的摩尔比为1:1400，在恒温混匀仪中 25℃、1000 rpm孵育3小时。