BR112020013131A2 - Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória - Google Patents

Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória Download PDF

Info

Publication number
BR112020013131A2
BR112020013131A2 BR112020013131-8A BR112020013131A BR112020013131A2 BR 112020013131 A2 BR112020013131 A2 BR 112020013131A2 BR 112020013131 A BR112020013131 A BR 112020013131A BR 112020013131 A2 BR112020013131 A2 BR 112020013131A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
fact
composition according
cell
exosomes
composition
Prior art date
Application number
BR112020013131-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Nuruddeen D. Lewis
Yu Zhou
Sriram Sathyanarayanan
John D. Kulman
Douglas E. Williams
Leonid A. Gaydukov
Ke Xu
Shelly Martin
Original Assignee
Codiak Biosciences, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Codiak Biosciences, Inc. filed Critical Codiak Biosciences, Inc.
Publication of BR112020013131A2 publication Critical patent/BR112020013131A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

a presente invenção refere-se a vesículas extracelulares compreendendo um componente imunomodulador. também são fornecidos métodos para produzir as vesículas extracelulares e métodos para usar as vesículas extracelulares para tratar câncer, gvhd e doenças autoimunes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXOS- SOMOS PARA IMUNO-ONCOLOGIA E TERAPIA ANTI-INFLA- MATÓRIA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Nº 62/723. 267, apresentado em 27 de agosto de 2018; e 62/ 611. 140, arquivado em 28 de dezembro de 2017, cada um dos quais é incorpo- rado por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A invenção refere-se a composições para interagir e modu- lar o sistema imunológico humano, métodos para fazer as composi- ções e métodos para usar as composições para tratar câncer, GvHD e doenças autoimunes.
FUNDAMENTOS
[003] A imunoterapia é o tratamento da doença induzindo, melho- rando ou suprimindo a resposta imune. A imunoterapia pode estimular o próprio sistema imunológico do paciente a atacar as células cancerí- genas. A imunoterapia contra o câncer geralmente tem menos efeitos colaterais do que as terapias tradicionais contra o câncer, como quimi- oterapia e radioterapia. A imunoterapia anti-inflamatória pode regular de modo decrescente o sistema imunológico do paciente para o trata- mento de doenças autoimunes e doença de enxerto contra hospedeiro (GvHD). O que é necessário são métodos aprimorados para entregar moléculas imunomoduladoras às células e tecidos do corpo.
SUMÁRIO
[004] Como veículos de entrega de fármaco, as vesículas extra- celulares oferecem muitas vantagens sobre os métodos tradicionais de entrega de fármaco, especialmente para terapia genética. A entrega sistêmica de vesículas extracelulares resulta na distribuição destas nanopartículas lipídicas para vários tecidos. Estudos demonstraram que as vesículas extracelulares podem interagir com várias células en- volvidas na modulação do sistema imunológico humano. Vesículas ex- tracelulares que são selecionadas, enriquecidas ou geneticamente modificadas para entregar moléculas terapêuticas para ativar, suprimir ou influenciar o sistema imunológico humano podem ser terapêuticas potentes para o câncer e outras doenças relacionadas ao sistema imunológico.
[005] São fornecidas aqui composições que compreendem vesí- culas extracelulares selecionadas, enriquecidas ou geneticamente modificadas com componentes imunomoduladores que podem regular de modo crescente ou regular de modo decrescente o sistema imuno- lógico humano, estimulando o sistema imunológico do paciente a combater o câncer ou suprimindo o sistema imunológico do paciente para aliviar os sintomas de GvHD e doenças autoimunes.
[006] Também são fornecidos métodos de produção e utilização de vesículas extracelulares para modular o sistema imunológico hu- mano.
[007] Por conseguinte, em um primeiro aspecto, é aqui fornecida uma composição compreendendo: uma vesícula extracelular compre- endendo uma membrana celular que liga um volume fechado, a mem- brana celular tendo uma superfície interna e uma superfície externa; e um primeiro componente imunomodulador associado à membrana ce- lular ou fechado dentro do volume fechado.
[008] Em várias modalidades, o primeiro componente imunomo- dulador é um inibidor para um regulador negativo do ponto de verifica- ção ou um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador nega- tivo do ponto de verificação. Em algumas destas modalidades, o regu- lador de ponto de verificação negativo é selecionado do grupo que consiste em: proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de morte celular programada (PD-1), gene 3 ativado por lin-
fócitos (LAG -3), proteína 3 contendo mucina da imunoglobulina de células T (TIM-3), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunoreceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TIGIT), supressor de lg do domí- nio V da ativação de células T ( VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor semelhante a imunoglobulina de células assassinas (KIR), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), CD20, CD39 e CD73.
[009] Em várias modalidades, o primeiro componente imunomo- dulador é um ativador para uma molécula coestimuladora positiva ou um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coestimula- dora positiva. Em algumas modalidades, a molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília do receptor de TNF. Em algu- mas destas modalidades, o membro da superfamília do receptor de TNF é selecionado do grupo que consiste em:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1I, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP e XEDAR. Em algumas modalidades, o ativador para uma molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília TNF. Em algumas destas modalidades, o membro da superfamília TNF é selecionado do grupo que consiste em: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TLIA, CD27L, Siva, CD153, ligante 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, ABRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-A4, ligante GITR e EDA-2. Em certas modalidades, o membro da superfamília TNF é CD40L. Em certas modalidades, o membro da su- perfamília TNF é CD27L. Em certas modalidades, o membro da super- família TNF é OX40L.
[0010] Em algumas modalidades, a molécula coestimuladora posi- tiva é uma molécula coestimuladora da superfamília CD28. Em algu- mas destas modalidades, a molécula coestimuladora da superfamília CD28 é ICOS ou CD28. Em algumas modalidades, o ativador de uma molécula coestimuladora positiva é ICOSL, CD80 ou CD86. Em certas modalidades, o ativador de uma molécula coestimuladora positiva é CD80.
[0011] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é uma citocina ou um parceiro de ligação de uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é selecionada do grupo consis- tindo em:I1L-2, IL-7, 11-10, 11-12 e I1L-15. Em certas modalidades, a ci- tocina é IL-7. Em certa modalidade, a citocina é I1L-12. Em certas mo- dalidades, a citocina é IL-15.
[0012] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um receptor de células T (TCR), um correceptor de célu- las T, um complexo principal de histocompatibilidade (MHC), um antí- geno leucocitário humano (HLA) ou um derivado do mesmo.
[0013] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um ativador de um receptor ou correceptor de células T. Em certas modalidades, o ativador de um receptor ou correceptor de células T é um ativador de CD3, opcionalmente um anticorpo agonista de CD3.
[0014] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o antí- geno tumoral é selecionado do grupo que consiste em: alfa- fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno epi- telial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antígeno associado ao melanoma (MAGE), pro- teína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo can- ceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de referência. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de um indi- víduo.
[0015] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um agonista ou antagonista de um alvo ou atividade sele- cionada.
[0016] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno.
[0017] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é um polinucleotídeo. Em algumas destas modalidades, o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: um mRNA, um miRNA, um siRNA, um RNA antissenso, um ShRNA, um IncRNA e um dsDNA.
[0018] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é uma proteína, um peptídeo, um glicolipídeo ou uma glico- proteína.
[0019] Em algumas modalidades, o primeiro componente imuno- modulador é expresso como uma proteína de fusão exibida na superfí- cie externa da referida vesícula extracelular. Em algumas modalida- des, a proteína de fusão compreende PTGFRN ou um fragmento ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência da proteína de fusão é SEQ ID NO:3.
[0020] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é um exossomo. Em algumas outras modalidades, a vesícula extracelular é uma nanovesícula.
[0021] Em certas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0022] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular compre- ende adicionalmente um segundo componente imunomodulador.
[0023] Em várias modalidades, o segundo componente imunomo-
dulador é um inibidor para um regulador negativo do ponto de verifica- ção ou um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador nega- tivo do ponto de verificação. Em algumas destas modalidades, o regu- lador de ponto de verificação negativo é selecionado do grupo que consiste em: proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de morte celular programada (PD-1), gene 3 ativado por lin- fócitos (LAG -3), proteína 3 contendo mucina da imunoglobulina de células T (TIM-3), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunoreceptor de células T com domínios lg e ITIM (TIGIT), supressor de lg do domí- nio V da ativação de células T ( VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor semelhante a imunoglobulina de células assassinas (KIR), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), CD20, CD39 e CD73.
[0024] Em várias modalidades, o segundo componente imunomo- dulador é um ativador para uma molécula coestimuladora positiva ou um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coestimula- dora positiva. Em algumas modalidades, a molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília do receptor de TNF. Em algu- mas destas modalidades, o membro da superfamília do receptor de TNF é selecionado do grupo que consiste em:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1I, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP e XEDAR. Em algumas modalidades, o ativador para uma molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília TNF. Em algumas destas modalidades, o membro da superfamília TNF é selecionado do grupo que consiste em: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TLIA, CD27L, Siva, CD153, ligante 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, ABRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-A4, ligante GITR e EDA-2. Em certas modalidades, o membro da superfamília TNF é CD40L. Em certas modalidades, o membro da su-
perfamília TNF é CD27L. Em certas modalidades, o membro da super- família TNF é OX40L.
[0025] Em algumas modalidades, a molécula coestimuladora posi- tiva é uma molécula coestimuladora da superfamília CD28. Em algu- mas destas modalidades, a molécula coestimuladora da superfamília CD28 é ICOS ou CD28. Em algumas modalidades, o ativador de uma molécula coestimuladora positiva é ICOSL, CD80 ou CD86. Em certas modalidades, o ativador de uma molécula coestimuladora positiva é CDB80.
[0026] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é uma citocina ou um parceiro de ligação de uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é selecionada do grupo consis- tindo em:IL-2, IL-7, I1L-10, 11-12 e 11-15. Em certas modalidades, a ci- tocina é IL-7. Em certa modalidade, a citocina é I1L-12. Em certa moda- lidade, a citocina é IL-15.
[0027] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um receptor de células T (TCR), um correceptor de célu- las T, um complexo principal de histocompatibilidade (MHC), um antí- geno leucocitário humano (HLA) ou um derivado do mesmo.
[0028] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um ativador de um receptor ou correceptor de células T. Em certas modalidades, o ativador de um receptor ou correceptor de células T é um ativador de CD3, opcionalmente um anticorpo agonista de CD3.
[0029] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o antí- geno tumoral é selecionado do grupo que consiste em: alfa- fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno epi- telial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antígeno associado ao melanoma (MAGE), pro-
teína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo can- ceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de referência. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de um indi- víduo.
[0030] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um agonista ou antagonista de um alvo ou atividade sele- cionada.
[0031] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno.
[0032] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é um polinucleotídeo. Em algumas destas modalidades, o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: um mRNA, um miRNA, um siRNA, um RNA antissenso, um sShRNA, um IncRNA e um dsDNA.
[0033] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é uma proteína, um peptídeo, um glicolipídeo ou uma glico- proteína.
[0034] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é expresso como uma proteína de fusão exibida na superfi- cie externa da referida vesícula extracelular. Em algumas modalida- des, a proteína de fusão compreende PTGFRN ou um fragmento ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência da referida proteína de fusão é SEQ ID NO:3.
[0035] Em algumas modalidades, o segundo componente imuno- modulador é diferente do referido primeiro componente imunomodula-
dor.
[0036] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular compre- ende adicionalmente um terceiro componente imunomodulador. Em algumas modalidades, o terceiro componente imunomodulador é dife- rente dos referidos primeiro e segundo componentes imunomodulado- res.
[0037] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um método de produção da composição. Em algumas modalidades, o método com- preende modificar uma célula produtora com o primeiro, segundo e/ou terceiro componentes imunomoduladores; obter a vesícula extracelular da célula produtora; e opcionalmente isolar as vesículas extracelulares obtidas. Em algumas outras modalidades, o método compreende a obtenção da vesícula extracelular a partir de uma célula produtora; iso- lar as vesículas extracelulares obtidas; e modificar a vesícula extrace- lular isolada com o primeiro, segundo e / ou terceiro componentes imunomoduladores. Em certas modalidades, o método compreende ainda formular as vesículas extracelulares isoladas em uma composi- ção farmacêutica.
[0038] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um método de tra- tamento de câncer em um indivíduo. O método compreende adminis- trar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi- ção, em que a composição é capaz de regular de modo crescente uma resposta imune no indivíduo, melhorando, assim, o alvejamento do tumor do sistema imunológico do indivíduo.
[0039] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um método de tra- tamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD) em um in- divíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz da composição, em que a composição é capaz de regular de modo decrescente uma resposta imune no indiví- duo, aliviando, assim, os sintomas de GvHD.
[0040] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um método de tra- tamento de câncer em um indivíduo. O método compreende adminis- trar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi- ção, em que a composição é capaz de regular de modo decrescente uma resposta imune no indivíduo, suprimindo, assim, a atividade imu- ne do indivíduo.
[0041] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um método de tra- tamento ou prevenção de câncer em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efi- caz da composição compreendendo um antígeno tumoral, em que a composição é capaz de potencializar uma resposta imune ao antígeno tumoral, melhorando, deste modo, a resposta imune do indivíduo ao câncer.
[0042] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é seleciona- do do grupo que consiste em: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carci- noembrionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antígeno associ- ado ao melanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo canceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF.
[0043] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de referência. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de um indi- víduo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0044] As Figuras 1A e 1B mostram um curso no tempo de ca- mundongos injetados com exossomos radiomarcados. A Figura 1A mostra a via de administração intravenosa. A Figura 1B mostra a via de administração intraperitoneal.
[0045] A Figura 2 é uma quantificação da distribuição de exosso- mos em diferentes tecidos de camundongo após administração intra- venosa e intraperitoneal de exossomos radiomarcados.
[0046] As Figuras 3A e 3B mostram os efeitos da ativação de cé- lulas B em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dois doadores humanos após incubação com exossomos que expres- sam CD40L.
[0047] As Figuras 4A e 4B mostram os efeitos da ativação de cé- lulas B de células B purificadas de dois doadores humanos após incu- bação com exossomos que expressam CD40L.
[0048] A Figura 5A é um esquema de uma linhagem celular repór- ter CD40. A Figura 5B mostra a ativação dependente da concentração de uma linhagem celular repórter CD40 tratada com um anticorpo agonístico anti-CD40 ou CD40L humano recombinante. A Figura 5C mostra os efeitos de exossomos que expressam CD40L em uma |i- nhagem celular repórter de CD40.
[0049] As Figuras 6A e 6B mostram os efeitos da ativação de cé- lulas T em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) com exossomos que expressam CD80. A Figura 6A mostra o efeito de exossomos que expressam CD80 no número de células T CD8*. A Fi- gura 6B mostra o efeito de exossomos que expressam CD80 no nú- mero de células T CD4*.
[0050] As Figuras 7A e 7B mostram os efeitos de exossomos que expressam CD80 na expressão de IFNy em PBMCs humanas.
[0051] As Figuras 8A e 8B mostram os efeitos de exossomos que expressam CD27L na expressão de IFNy em PBMCs humanas de dois doadores.
[0052] As Figuras 9A e 9B mostram os efeitos de exossomos que expressam CD27L na expressão de IL-2 em PBMCs humanas de dois doadores.
[0053] As Figuras 10A e 10B mostram os efeitos dos exossomos que expressam OX40L na expressão de IFNy em PBMCs humanas de dois doadores.
[0054] As Figuras 11A e 11B mostram os efeitos de exossomos que expressam OX40L na expressão de IL-2 em PBMCs humanas de dois doadores.
[0055] A Figura 12A é um esquema de uma linhagem celular re- pórter OX40. A Figura 12B mostra a ativação dependente da concen- tração de uma linhagem celular repórter OX40 tratada com um anti- corpo agonístico anti-OX40 ou OX40L humano recombinante. A Figu- ra 12C mostra os efeitos de exossomos que expressam OX40L em uma linhagem celular repórter OX40.
[0056] As Figuras 13A e 13B mostram os efeitos de exossomos que expressam IL-7 em combinação com um anticorpo anti-CD3 na expressão de IFNy em PBMCs humanas.
[0057] A Figura 14A é um esquema de uma linhagem celular re- pórter de receptor de IL-7. A Figura 14B mostra a ativação dependen- te da concentração de uma linhagem celular repórter de receptor de IL-7 tratada com IL-7 humana recombinante. A Figura 14C mostra os efeitos de exossomos que expressam IL-7 em uma linhagem celular repórter de receptor de IL-7.
[0058] As Figuras 15A e 15B mostram os efeitos de exossomos que expressam IL-7 na proliferação de células T em camundongos in vivo conforme medido pela incorporação de EdU. A Figura 15A mos- tra os efeitos dos exossomos que expressam IL-7 nas células T CD8 +. A Figura 15B mostra os efeitos dos exossomos que expressam IL-7 na célula T CD8 + de memória.
[0059] As Figuras 16A e 16B mostram os efeitos de exossomos que expressam IL-7 na proliferação de células T em camundongos in vivo conforme medido pela positividade para CD71. A Figura 16A mostra os efeitos dos exossomos que expressam IL-7 nas células T CD8 +. A Figura 16B mostra os efeitos dos exossomos que expres- sam IL-7 na célula T CD8 + de memória.
[0060] A Figura 17A mostra um esquema de uma proteína de fu- são PTGFRN / IL-7 expressa em alta densidade na superfície de um exossomo e variantes da proteína de fusão. A Figura 17B é a se- quência da proteína de fusão PTGFRN / IL-7 otimizada.
[0061] A Figura 18A é uma Western blot mostrando a expressão relativa de diferentes proteínas de fusão de IL-7 na superfície de exos- somos purificados. A Figura 18B mostra os efeitos de exossomos que expressam IL-7 na regulação decrescente do receptor de IL-7 como um modelo de ativação de células T mediada por IL-7.
[0062] A Figura 19A mostra os efeitos dos exossomos de scFv anti-CD3 na ativação de células T em PBMCs. A Figura 19B mostra os efeitos de exossomos de scFv anti-CD3 na ativação de células B em PBMCs.
[0063] A Figura 20A mostra os efeitos de exossomos de scFab anti-CD3 na ativação de células T em PBMCs. A Figura 20B mostra os efeitos de exossomos de scFv anti-CD3 na ativação de células B em PBMCs.
[0064] A Figura21A é um histograma mostrando a extensão da ativação das células T após o tratamento com exossomos de scFv an- ti-CD3. A Figura 21B é um histograma mostrando a extensão da ati- vação das células B após o tratamento com exossomos de scFv anti- CDB3.
[0065] A Figura 22A mostra os efeitos dos exossomos de scFab anti-CD3 na ativação de células T em um ensaio de ativação de placa revestida, em comparação com o anticorpo anti-CD3 solúvel ou o anti-
corpo anti-CD3 de placa revestida. A Figura 22B é um gráfico de bar- ras quantificando os resultados de um experimento separado realizado como na Figura 22A.
[0066] A Figura 23A mostra um esquema de uma proteína de fu- são de comprimento total PTGFRN / IL-12. A Figura 23B mostra um esquema de uma proteína de fusão PTGFRN / IL-12 encurtada.
[0067] A Figura 24A mostra os efeitos da IL-12 humana recombi- nante ou dos exossomos que superexpressam o IFNy indutor de PTGFRN-IL-12 de comprimento total ou curto em PBMCs humanas. À Figura 24B é uma tabela que resume a potência dos exossomos con- tendo IL-12 e IL-12 recombinante.
[0068] A Figura 25 mostra os efeitos dos exossomos de IL-12- PTGFRN e IL-12 recombinante na redução do crescimento de tumores em um modelo murino de melanoma.
[0069] A Figura 26A mostra as curvas de crescimento do tumor para cada um dos camundongos portadores de tumor mostrados na Figura 25 tratados com PBS. A Figura 26B mostra as curvas de cres- cimento do tumor para cada um dos camundongos portadores de tu- mor mostrados na Figura 25 tratados com IL-12 recombinante. A Figu- ra 26C mostra as curvas de crescimento do tumor para cada um dos camundongos portadores de tumor mostrados na Figura 25 tratados com exossomos de |L-12-PTGFRN.
[0070] A Figura 27 mostra imagens de todos os camundongos portadores de tumor B16F10 no estudo de eficácia mostrado na Figura
25.
[0071] A Figura 28 mostra as curvas de sobrevivência dos ca- mundongos portadores de tumor B16F10 mostrados na Figura 25.
[0072] A Figura 29A mostra os níveis de expressão do gene IFNy em tumores de camundongos tratados com exossomos de |L-12- PTGFRN, PBS ou rllL-12. A Figura 29B mostra os níveis de expres-
são do gene CXCL9 em tumores de camundongos tratados com exos- somos de IL-12-PTGFRN, PBS, ril-12. A Figura 29C mostra os ní- veis de expressão do gene CXCL10 em tumores de camundongos tra- tados com exossomos de IL-12-PTGFRN, PBS, rlL-12. A Figura 29D mostra os níveis de expressão do gene TGFB em tumores de camun- dongos tratados com exossomos de IL-12-PTGFRN, PBS ou rliL-12.
[0073] A Figura 30 mostra a porcentagem de células T esplênicas CD8 + positivas para IFNy em camundongos portadores de tumor tra- tados com exossomos de IL-12-PTGFRN, PBS ou rlL-12.
[0074] A Figura 31A mostra um esquema de um PTGFRN de comprimento total fundido com um monômero de IFNy. A Figura 31B mostra um esquema de um PTGFRN de comprimento total fundido com um dímero em tandem de IFNy.
[0075] A Figura 32 mostra os resultados da análise PAGE de exossomos de PTGFRN IFNy de dímero em tandem (td) e monoméri- cos (m) e humanos purificados.
[0076] A Figura 33 mostra a expressão de PD-L1 de monócito após adição de exossomos nativos (WT), exossomos de IFNy mono- mérico PTGFRN (m-IFNy-PTGFRN) e exossomos de IFNy PTGFRN de dímero em tandem (td-IFNy-PTGFRN), respectivamente. A ativa- ção de PD-L1 induzida por LPS foi usada como controle positivo.
[0077] A Figura 34 mostra os esquemas das proteínas de fusão / IL-15Ra fundidas ao domínio transmembranar de PDGFR.
[0078] A Figura 35 mostra a ativação de células NK medida pela porcentagem de células NK CD69 positivas após a adição de exosso- mos de IL-15 de pDisplay.
[0079] A Figura 36A mostra os esquemas de IL-15 fundida com PTGFRN de comprimento total e IL-15 N72D fundida com PTGFRN de comprimento total. A Figura 36B mostra blotting Western de IL-15 fundida com PTGFRN de comprimento total e IL-15 N72D fundida com
PTGFRN de comprimento total.
[0080] A Figura 37 mostra a ativação de células NK medida pela porcentagem de células NK CD69 positivas após a adição de I|L-15 fundida a PTGFRN de comprimento total e IL-15 N72D fundida a PTGFRN de comprimento completo.
[0081] A Figura 38 mostra os esquemas do fragmento de anticor- po anti-CD3 fundido com a região transmembranar de PDGFR (exoCD3-PD), um PTGFRN de comprimento total (exoCD3 longo) e um fragmento de PTGFRN (exoCD3 curto), respectivamente.
[0082] A Figura 39 mostra os resultados da interferometria de bio- camada (BLI) após a adição de exossomos nativos (WT), exossomos com fragmento de anticorpo anti-CD3 fundido à região transmembra- nar PDGFR (pDisplay), exossomos com fragmento de anticorpo anti- CD3 fundido PTGFRN de comprimento total (FL PTGFRN) e exosso- mos com fragmento de anticorpo anti-CD3 fundido com um fragmento de PTGFRN (PTGFRN curto), respectivamente.
[0083] A Figura 40A mostra a ativação de células T CD4 + medida pela porcentagem de células T CD4 + CD69 positivas após a adição do fragmento de anticorpo anti-CD3. A Figura 40B mostra a ativação de células T CD4 + medida pela porcentagem de células T CD4 + CD69 positivas após a adição de exossomos nativos (exoNativo) e exossomos com fragmento de anticorpo anti-CD3 fundido a um frag- mento de PTGFRN (exoCD3 Curto), respectivamente.
[0084] A Figura 41 mostra os esquemas das proteínas de fusão CD40L-GFP PTGFRN e a ECsopara cada construto no ensaio de ati- vação de células B medido pela positividade de CD69 nas células B.
[0085] A Figura 42A mostra a ativação de células B medida pela porcentagem de células B positivas para CD69 após a adição de exossomos nativos, exossomos com construtos de CD40L-PTGFRN triméricos pOB-527 e exossomos com construtos de CD40L-PTGFRN triméricos pCB-766, respectivamente. A Figura 42B mostra a ativação de células B medida pela porcentagem de células B positivas para CD69 após a adição de exossomos com construtos de CD40L- PTGFRN triméricos pCB-527 e pCB-766, respectivamente, em compa- ração com CD40L correspondente à concentração.
[0086] A Figura 43A mostra a ativação de células B no doador 1 medido pela porcentagem de células B positivas para CD69 após a adição de exossomos com construtos de CD40L-PTGFRN triméricos, pCB-527. A Figura 43B mostra a ativação de células B no doador 2 medida pela porcentagem de células B positivas para CD69 após a adição de exossomos com construtos de CD40L-PTGFRN triméricos, pCB-527.
[0087] A Figura 44A mostra a análise FACS de exossomos nati- vos isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marca- dos com anticorpos fluorescentes contra IL-12 e CD40L. A Figura 44B mostra a análise FACS de exossomos nativos isolados com mi- croesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anticorpos flu- orescentes contra CD81 e CD40L.
[0088] A Figura 45A mostra a análise FACS de exossomos duplos geneticamente modificados duplamente de PTGFRN-CD40L / IL-12 isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anticorpo fluorescente contra CD81. A Figura 45B mostra a aná- lise FACS de exossomos geneticamente modificados duplamente de PTGFRN-CD40L / IL-12 isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anticorpos fluorescentes contra I|L-12 e CDA40L.
[0089] A Figura 46A mostra a análise FACS de exossomos gene- ticamente modificados duplamente de PTGFRN-CD40L / 11-12 isola- dos com microesferas decoradas com anti-IL-12 e marcados com anti- corpos fluorescentes contra IL-12 e CD40L. A Figura 46B mostra a análise FACS de exossomos duplos geneticamente modificados du- plamente de PTGFRN-CD40L / IL-12 isolados com microesferas deco- radas com anti-IL-12 e marcados com anticorpo fluorescente contra CD81.
[0090] A Figura 47A mostra a resposta de IFNy nas PBMCs hu- manas do doador 1 após a adição de IL-12 recombinante, I1L-12 re- combinante misturada com exossomos recombinantes de CD40L, PTGFRN-IL-12, exossomos PTGFRN-CD40L / IL-12 duplamente posi- tivos e uma mistura dos exossomos PTGFRN-IL-12 e exossomos PTGFRN-CD40L, respectivamente. A Figura 47B mostra a resposta de IFNy nas PBMCs humanas do doador 2 após a adição de IL-12 re- combinante, IL-12 recombinante misturada com exossomos recombi- nantes de CD40L, PTGFRN-IL-12, exossomos PTGFRN-CDA40L / IL- 12 duplamente positivos e uma mistura dos exossomos PTGFRN-IL- 12 e exossomos PTGFRN-CD40L, respectivamente.
[0091] A Figura 48 mostraECso da resposta de IFNy em PBMCs humanas do doador 1 e do doador 2 após a adição de IL-12 recombi- nante, 11-12 recombinante misturada com os exossomos recombinan- tes de CD40L, PTGFRN-IL-12, exossomos PTGFRN-CDA40L / IL-12 duplamente positivos e uma mistura de exossomos PTGFRN-IL-12 e exossomos PTGFRN-CDA40L, respectivamente.
[0092] A Figura 49A mostra a ativação de células B nas PBMCs humanas do doador 1 após a adição de CD40L, |L-12 recombinante misturada com CD40L recombinante, exossomos PTGFRN-CD40L, exossomos PTGFRN-CD40L / IL-12 duplamente positivos e uma mis- tura dos exossomos PTGFRN-IL-12 e exossomos PTGFRN-CD40L, respectivamente. A Figura 49B mostra a ativação de células B nas PBMCs humanas do doador 2 após a adição de CD40L recombinante, IL-12 recombinante misturada com CD40L recombinante, exossomos PTGFRN-CD40L, exossomos PTGFRN-CDA40L / IL-12 duplamente po-
sitivos e uma mistura dos exossomos PTGFRN-IL-12 e exossomos PTGFRN-CDA40L, respectivamente.
[0093] A Figura 50 mostraECso da resposta de IFNy em PBMCs humanas do doador 1 e do doador 2 após a adição de CD40L recom- binante, 11-12 recombinante misturada com os CD40L recombinante, exossomos PTGFRN-CD40L, exossomos PTGFRN-CD40L / 11-12 du- plamente positivos e uma mistura de exossomos PTGFRN-IL-12 e exossomos PTGFRN-CDA40L, respectivamente.
[0094] A Figura 51A mostra a análise FACS de exossomos gene- ticamente modificados triplamente de PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-IL-12 e marcados com anticorpos fluorescentes contra IL-12 e CD40L. A Figura 51B mostra a análise FACS de exossomos geneticamente modificados triplos PTGFRN-CDA40L/IL-12/FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-IL-12 e marcados com anticorpos fluorescentes contra IL-12 e FLT3L. A Figura 51C mostra a análise FACS de exossomos triplos geneticamente modificados PTGFRN-CDA40L / IL-12 / FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-IL-12 e marcados com anticor- pos fluorescentes contra CD40L e FLT3L.
[0095] A Figura 52A mostra a análise FACS de exossomos triplos geneticamente modificados de PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anti- corpos fluorescentes contra |L-12 e CD40L. A Figura 52B mostra a análise FACS de exossomos triplos geneticamente modificados PTG- FRN-CD40L/IL-12/FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anticorpos fluorescentes contra I|L-12 e FLT3L. A Figura 52C mostra a análise FACS de exossomos triplos geneticamente modificados PTGFRN-CD40L / IL-12 / FLT3L isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e marcados com anti- corpos fluorescentes contra CD40L e FLT3L.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0096] São divulgadas aqui vesículas extracelulares capazes de modular o sistema imunológico humano. Também são fornecidos mé- todos para produzir as vesículas extracelulares e métodos para usar estas vesículas extracelulares para tratar o câncer e outras doenças relacionadas ao sistema imunológico.
[0097] Antes da presente invenção ser descrita mais detalhada- mente, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a deter- minadas modalidades descritas, como tal, é claro, podem variar. Tam- bém se deve= entender que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexas.
[0098] Onde uma faixa de valores é proporcionada, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior da faixa e qualquer outro valor estabelecido ou inter- veniente nesta faixa estabelecida está englobado na invenção. Os limi- tes superior e inferior destas faixas menores podem ser independen- temente incluídos nas faixas menores e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na gama estabelecida. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídas na invenção.
[0099] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significa- do conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais simila- res ou equivalentes para os descritos neste documento também po- dem ser usados na prática ou teste da presente invenção, materiais e métodos ilustrativos representativos agora são descritos.
[00100] Todas as publicações e patentes citadas nesta especifica- ção neste documento são incorporadas por referência, como se cada publicação individual ou patente foram especificamente e individual- mente indicada para serem incorporadas por referência e é incorpora- da a adendo por referência a divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em relação ao qual as publicações são citadas.
[00101] Isto deve ser observado que como usado neste documento e na reivindicação acrescentada, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referência plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. É observado, adicionalmente, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para a utilização de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindi- cação, ou utilização de uma limitação "negativa".
[00102] Assim como pode ser aparente aos versados na técnica ao ler esta divulgação, cada uma das modalidades individuais descrito e ilustrado neste documento tem componentes discretos e recursos que podem ser prontamente separados ou combinados com as caracterís- ticas de qualquer uma das outras várias modalidades sem partir do escopo ou o sentido da presente invenção. Pode efetuar-se qualquer método recitado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.
[00103] Na descrição adicional da invenção em questão, os siste- mas em questão para uso na prática dos métodos em questão serão discutidos em mais detalhes, seguidos por uma revisão dos métodos associados.
[00104] Como usado aqui, o termo "vesícula extracelular" se refe- re a uma vesícula derivada de célula que compreende uma membrana que envolve um espaço interno. As vesículas extracelulares compre- endem todas as vesículas ligadas à membrana que têm um diâmetro menor que a célula da qual são derivadas. Geralmente as vesículas extracelulares variam em diâmetro de 20 nm a 1000 nm e podem compreender várias cargas macromoleculares dentro do espaço inter- no, exibidas na superfície externa da vesícula extracelular e / ou abrangendo a membrana. A carga pode compreender ácidos nuclei- cos, proteínas, carboidratos, lipídios, moléculas pequenas e / ou com- binações dos mesmos. A título de exemplo e sem limitação, as vesícu- las extracelulares incluem corpos apoptóticos, fragmentos de células, vesículas derivadas de células por manipulação direta ou indireta, (por exemplo, por extrusão em série ou tratamento com soluções alcali- nas), organelas vesiculadas e vesículas produzidas por células vivas (por exemplo, por brotamento direto da membrana plasmática ou fusão do endossoma tardio com a membrana plasmática). As vesículas ex- tracelulares podem ser derivadas de um organismo vivo ou morto, te- cidos ou órgãos explantados e / ou células cultivadas.
[00105] Como usado aqui, o termo "exossomo" se refere a uma pequena vesícula derivada de célula (entre 20 e 300 nm de diâmetro, mais preferencialmente 40 a 200 nm de diâmetro) que compreende uma membrana que envolve um espaço interno e que é gerada a partir da célula por brotamento direto da membrana plasmática ou pela fu- são do endossoma tardio com a membrana plasmática. O exossomo é uma espécie de vesícula extracelular. O exossomo compreende lipí- deo ou ácido graxo e polipeptídeo e, opcionalmente, compreende uma carga útil, (por exemplo, um agente terapêutico), um receptor, (por exemplo, uma porção química de alvejamento), um polinucleotídeo, (por exemplo, um ácido nucleico, RNA ou DNA), um açúcar, (por exemplo, um açúcar simples, polissacarídeo ou glicano) ou outras mo- léculas. O exossomo pode ser derivado de uma célula produtora e iso-
lado da célula produtora com base em seu tamanho, densidade, pa- râmetros bioquímicos ou uma combinação dos mesmos.
[00106] Como usado aqui, o termo "nanovesícula" se refere a uma pequena vesícula derivada de célula (entre 20 e 250 nm de diâmetro, mais preferencialmente 30 a 150 nm de diâmetro) compreendendo uma membrana que envolve um espaço interno e que é gerada a partir da célula por manipulação direta ou indireta, de modo que a nanovesí- cula não seja produzida pela célula produtora sem a manipulação. Manipulações apropriadas da célula produtora incluem, mas sem limi- tações, extrusão em série, tratamento com soluções alcalinas, sonica- ção ou combinações das mesmas. A produção de nanovesículas po- de, em alguns casos, resultar na destruição da célula produtora. Prefe- rencialmente, as populações de nanovesículas estão substancialmente livres de vesículas que são derivadas de células produtoras por meio de brotamento direto da membrana plasmática ou fusão do endosso- ma tardio com a membrana plasmática. A nanovesícula é uma espécie de vesícula extracelular. A nanovesícula compreende lipídeo ou ácido graxo e polipeptídeo e, opcionalmente, compreende uma carga útil, (por exemplo, um agente terapêutico), um receptor, (por exemplo, uma porção química de alvejamento), um polinucleotídeo, (por exemplo, um ácido nucleico, RNA ou DNA), um açúcar, (por exemplo, um açúcar simples, polissacarídeo ou glicano) ou outras moléculas. A nanovesí- cula, uma vez derivada de uma célula produtora de acordo com a ma- nipulação, pode ser isolada da célula produtora com base em seu ta- manho, densidade, parâmetros bioquímicos ou uma combinação dos mesmos.
[00107] O termo "entrega de vesícula extracelular" ou "entrega de vesículas extracelulares" se refere à administração e localização de vesículas extracelulares para alvejar tecidos, células e / ou órgãos do indivíduo. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador pode ser entregue ao citoplasma de uma célula-alvo. Em outras moda- lidades, o componente imunomodulador é entregue à membrana da célula-alvo. Em algumas modalidades, a membrana da vesícula extra- celular se funde com uma membrana de uma célula-alvo.
[00108] “Como usado aqui, o termo "célula produtora" se refere a qualquer célula a partir da qual uma vesícula extracelular pode ser iso- lada. Uma célula produtora é uma célula que serve como fonte para a vesícula extracelular. Uma célula produtora pode compartilhar um componente de proteína, lipídio, açúcar ou ácido nucleico com a vesí- cula extracelular. Em algumas modalidades, a célula produtora é uma célula modificada ou sintética. Em algumas modalidades, a célula pro- dutora é uma célula cultivada ou isolada. Em certas modalidades, a célula produtora é uma linhagem celular. Em certas outras modalida- des, a célula produtora é uma célula primária. Em algumas modalida- des particulares, a célula produtora é uma célula imune.
[00109] "Membrana", como utilizado aqui, é uma camada-limite que separa um espaço interno de um espaço externo compreendendo um ou mais compostos biológicos, tipicamente lipídios e opcionalmen- te polipeptídeos e / ou carboidratos. Em algumas modalidades, a membrana compreende lipídios e ácidos graxos. Em algumas modali- dades, a membrana compreende fosfolipídios, glicolipídios, ácidos graxos, esfingolípidos, fosfoglicerídeos, esteróis, colesteróis e fosfati- dilserinas. Em algumas destas modalidades, a membrana compreende ainda um ou mais polipeptídeos e / ou um ou mais polissacarídeos, como o glicano. A vesícula extracelular compreende uma membrana como aqui definido.
[00110] Como usado no presente documento, o termo "componen- te de imunomodulação" se refere a um agente terapêutico que atua em um alvo, (por exemplo, uma célula-alvo) que é contatado com a vesícula extracelular e regula o sistema imunológico. O componente imunomodulador que pode ser introduzido em uma vesícula extracelu- lar e / ou em uma célula produtora inclui agentes terapêuticos, tais como moduladores de inibidores de ponto de verificação ou ligantes de inibidores de ponto de verificação, antígenos de superfície e seus deri- vados, citocinas e seus derivados. O componente imunomodulador também pode incluir um agonista, um antagonista, um anticorpo e um fragmento de ligação ao antígeno ou um polinucleotídeo, como siRNA, MIRNA, IncRNA e DNA.
[00111] O termo "receptor" se refere a uma molécula que direciona a vesícula extracelular para um alvo e / ou promove a interação da ve- sícula extracelular com o alvo no indivíduo. Em algumas modalidades, o receptor é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o receptor é capaz de aumentar a concentração do componente imunomodulador no tecido do indivíduo. Exemplos de receptores incluem, mas sem limi- tações, exemplos listados na Tabela 3.
[00112] O termo "alvo" se refere a uma célula, um patógeno, um metabólito, um complexo polipeptídico ou qualquer molécula ou estru- tura que resida em um tecido ou circula no sistema circulatório ou sis- tema linfático do indivíduo, como uma célula imune ou uma célula can- cerosa. Exemplos de alvos incluem, mas não estão limitados a, exem- plos listados na Tabela 4.
[00113] Um "agente terapêutico" ou "molécula terapêutica" inclui um composto ou molécula que, quando presente em uma quantidade eficaz, produz um efeito terapêutico, efeito farmacológico e / ou fisioló- gico desejado em um indivíduo em necessidade do mesmo. O mesmo inclui qualquer composto, por exemplo, um fármaco de molécula pe- quena ou um agente biológico, (por exemplo, um fármaco polipeptídico ou um fármaco de ácido nucleico) que, quando administrado a um in- divíduo, tem um efeito mensurável ou transmissível sobre o indivíduo, por exemplo, alivia ou diminui um sintoma de uma doença, distúrbio ou afecção.
[00114] “Como usado aqui, o termo "anticorpo" abrange uma imu- noglobulina, seja natural ou produzida de modo parcial ou totalmente sintético, e seus fragmentos. O termo também abrange qualquer prote- ína tendo um domínio de ligação que é homólogo a um domínio de li- gação de imunoglobulina. "Anticorpo" inclui adicionalmente um poli- peptídeo compreendendo uma região de estrutura de um gene de imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos que se ligam especifica- mente e reconhecem um antígeno. O uso do termo anticorpo deve in- cluir anticorpos inteiros, anticorpos policlonais, monoclonais e recom- binantes e seus fragmentos, além de incluir anticorpos de cadeia úni- ca, anticorpos humanizados, anticorpos murinos, quiméricos, anticor- pos monoclonais camundongo-humanos, camundongo-primatas, pri- mata-humanos, anticorpos anti-idiotipo, fragmentos de anticorpos, co- mo, por exemplo, scFv, (scFv)2, Fab, Fab 'e F (ab')2a, F (ab1)2, Fv, dAb e fragmentos de Fd, diacorpos e polipeptídeos relacionados a anticor- pos. O anticorpo inclui anticorpos biespecíficos e anticorpos multies- pecíficos, desde que exibam a atividade ou função biológica desejada.
[00115] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" aqui utilizado se refere a fragmentos de uma imunoglobulina intacta e a qualquer parte de um polipeptídeo incluindo regiões de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno. Por exemplo, o fragmento de ligação ao antígeno pode ser um fragmento F (ab ')2, um fragmento Fab', um fragmento Fab, um fragmento Fv ou um fragmento scFv, mas não está limitado aos mesmos. Um fragmento Fab possui um sítio de ligação ao antígeno e contém as regiões variáveis de uma cadeia leve e uma cadeia pesada, a região constante da cadeia leve e a primeira região constante CH1 da cadeia pesada. Um fragmento Fab' difere de um fragmento Fab, pois o fragmento Fab' inclui adicio- nalmente a região de dobradiça da cadeia pesada, incluindo pelo me-
nos um resíduo de cisteína no terminal C da região CH1 da cadeia pe- sada. O fragmento F (ab ') é produzido de modo que os resíduos de cisteína do fragmento Fab' sejam unidos por uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça. Um fragmento Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que possui apenas regiões variáveis da cadeia pesada e regi- ões variáveis da cadeia leve, e uma técnica recombinante para produ- zir o fragmento Fv é bem conhecida na técnica. Os fragmentos de Fv de duas cadeias podem ter uma estrutura na qual as regiões variáveis da cadeia pesada estão ligadas às regiões variáveis da cadeia leve por uma ligação não covalente. Os fragmentos de Fv de cadeia única (scFv) geralmente podem ter uma estrutura de dímero, como nos fra- gmentos de Fv de duas cadeias nas quais regiões variáveis de cadeia pesada estão ligadas covalentemente a regiões variáveis de cadeia leve por meio de um aglutinante peptídico ou regiões variáveis de ca- deia pesada e leve estão diretamente ligadas uma à outra no seu ter- minal C. O fragmento de ligação ao antígeno pode ser obtido usando uma protease (por exemplo, um anticorpo inteiro é digerido com papa- íÍna para obter fragmentos Fab e digerido com pepsina para obter fra- gmentos F(ab'):) e pode ser preparado por uma técnica genética re- combinante. Um fragmento de dAb consiste em um domínio VH. As moléculas de anticorpo de cadeia única podem compreender um polí- mero com inúmeras moléculas individuais, por exemplo, dímero, tríme- ro ou outros polímeros.
[00116] A frase "molécula de ácido nucleico" se refere a um po- límero de fita simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas. O mesmo inclui DNA cromossômico e plasmídeos de autorreplicação, vetores, MRNA, tRNA, siRNA, miRNA, etc. A mo- lécula de ácido nucleico pode ser recombinante e polipeptídeos exó- genos podem ser expressos quando o ácido nucleico é introduzido em uma célula.
[00117] O termo "agonista" se refere a uma molécula que se liga a um receptor e ativa o receptor para produzir uma resposta biológica. Os receptores podem ser ativados por um agonista endógeno ou exó- geno. Exemplos não limitativos de agonista endógeno incluem hormô- nios e neurotransmissores. Exemplos não limitativos de agonista exó- geno incluem fármacos. O agonista pode ser um agonista completo, parcial ou inverso.
[00118] O termo "antagonista" se refere a uma molécula que blo- queia ou amortece uma resposta mediada por agonista, em vez de provocar a própria resposta biológica ao se ligar a um receptor. Muitos antagonistas atingem sua potência competindo com ligantes ou subs- tratos endógenos em locais de ligação estruturalmente definidos nos receptores. Exemplos não limitativos de antagonistas incluem bloque- adores alfa, betabloqueadores e bloqueadores dos canais de cálcio. O antagonista pode ser um antagonista competitivo, não competitivo ou não competitivo.
[00119] “Como aqui utilizado, o termo "um fragmento" de uma pro- teína se refere a uma proteína que é deletada no terminal Ne /ou C em comparação com a proteína que ocorre naturalmente. De prefe- rência, um fragmento de transportador PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 ou ATP mantém a capacidade de ser alvejado especificamente para exossomos. Este fragmento também é chamado de "fragmento funcional". A possibilidade de um fragmento ser um fragmento funcional neste sentido pode ser avaliada por qual- quer método conhecido na técnica para determinar o conteúdo de pro- teínas dos exossomos, incluindo Western Blots, análise FACS e fu- sões dos fragmentos com proteínas autofluorescentes como, por exemplo, GFP. Em uma modalidade específica, o fragmento de trans- portador PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGAA4, SLC3A?2, ATP retém pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%
da capacidade do transportador PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 ou ATP de ocorrência natural para ser especificamente alvejado a exossomos.
[00120] Como usado aqui, o termo "variante" de uma proteína se refere a uma proteína que compartilha uma certa identidade de se- quência de aminoácidos com outra proteína após o alinhamento por um método conhecido na técnica. Uma variante de uma proteína pode incluir uma substituição, inserção, exclusão, mudança de quadro ou rearranjo em outra proteína. Em uma modalidade específica, a varian- te é uma variante com pelo menos 70% de identidade para o transpor- tador PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A?2, ATP ou um fragmento de PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, Transportador ITGA4, SLC3A2 ou ATP. Em algumas modali- dades variantes ou variantes de fragmentos de PTGFRN compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de se- quência com PTGFRN de acordo com a SEQ ID NO:1 ou com um fra- gmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de BSG compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com BSG de acordo com a SEQ ID NO:9 ou com um fragmento funcional do mes- mo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de IGSF2 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com IGSF2 de acordo com a SEQ ID NO:34 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em algumas moda- lidades variantes ou variantes de fragmentos de IGSF3 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de se- quência com IGSF3 de acordo com a SEQ ID NO:20 ou com um frag- mento funcional do mesmo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de IGSF8 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com IGSF8 de acordo com a SEQ ID NO:14 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmen- tos de ITGB1 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ITGB1 de acordo com a SEQ ID NO:21 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas moda- lidades variantes ou variantes de fragmentos de ITGA4 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de se- quência com ITGA4 de acordo com a SEQ ID NO:22 ou com um frag- mento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de SLC3A2 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com SLC3A?2 de acordo com a SEQ ID NO:23 ou com um fragmento funci- onal do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP1A1compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP1A1 de acor- do com a SEQ ID NO:24 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP1A2 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP1A2 de acordo com a SEQ ID NO:25 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP1A3 com- partilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identida- de de sequência com ATP1A3 de acordo com a SEQ ID NO:26 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades va- riantes ou variantes de fragmentos de ATP1A4 compartilham pelo me- nos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP1A4 de acordo com a SEQ ID NO:27 ou com um fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP1B3 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP1B3 de acor-
do com a SEQ ID NO:28 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP1B2 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP1B2 de acordo com a SEQ ID NO:29 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP2B2 com- partilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identida- de de sequência com ATP2B2 de acordo com a SEQ ID NO:30 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades va- riantes ou variantes de fragmentos de ATP2B3 compartilham pelo me- nos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP2B3 de acordo com a SEQ ID NO:31 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades variantes ou variantes de fragmentos de ATP2B4 compartilham pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com ATP2B4 de acor- do com a SEQ ID NO:32 ou com um fragmento funcional do mesmo. Em cada um dos casos acima, é preferido que a variante ou variante de um fragmento retenha a capacidade de ser especificamente alveja- da para exossomos.
[00121] Os métodos de alinhamento de sequências para compara- ção são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman e Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pe- arson e Lipman, Methods in Mol. Biol. 24:307-31 (1988); Higgins e Sharp, gene 73:15 237-44 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989) Corpet et ai., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et ai., Comp. Appl. Biosci. 8:155-65 (1992); e Pearson et ai., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [Altschul 20 et al., J!. Mol. Biol. 215:403-10 (1990) J está disponível em várias fontes, incluindo o Centro Nacional de Informa-
ções Biológicas (NBCI, Bethesda, Maryland) e na Internet, para uso em conexão com os programas de análise de sequência blastp, blasm, blastx, tblastn e tblastk. O BLAST e uma descrição de como determi- nar a identificação da sequência usando o programa podem ser aces- sados no site oficial do NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia — National Center for Biotechnology Information) no NIH (Instituto Nacional de Saúde — National Institute of Health).
[00122] A recitação de qualquer proteína aqui fornecida abrange uma variante funcional da proteína. O termo "variante funcional" de uma proteína se refere a uma variante da proteína que retém a capa- cidade de ser alvejada especificamente para exossomos.
[00123] “Como usado aqui, o termo "composição farmacêutica" se refere a um ou mais dos compostos aqui descritos, como, por exem- plo, uma vesícula extracelular misturada ou mesclada com, ou sus- pensa em um ou mais outros componentes químicos, como carreado- res e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Um objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de preparações de vesículas extracelulares a um indivíduo. O termo "farmaceuticamente aceitável" e variações gramaticais do mesmo se referem a composi- ções, carreadores, diluentes e reagentes capazes de administrar a ou sobre um indivíduo sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis em um grau que proíba a administração da composição. O termo "ex- cipiente" ou "carreador" se refere a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administra- ção de um composto. O termo "carreador farmaceuticamente aceitá- vel" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do governo federal dos EUA ou listados na Farmacopeia dos EUA para uso em animais, incluindo seres humanos, assim como qualquer carreador ou diluente que não causa irritação significativa a um indivíduo e não re-
voga a atividade biológica e as propriedades do composto administra- do. Incluídos estão excipientes e carreadores que são úteis na prepa- ração de uma composição farmacêutica e são geralmente seguros, não tóxicos e desejáveis.
[00124] “Conforme usado aqui, os termos "isolar," "isolado" e "iso- lamento" ou "purificar" "purificado" e "purificação", assim como "ex- traído" e "extração" são usados de forma intercambiável e se referem ao estado de uma preparação, por exemplo, uma pluralidade de quan- tidade e / ou concentração conhecida ou desconhecida) de vesículas extracelulares desejadas, que foram submetidas a um ou mais proces- sos de purificação, por exemplo, uma seleção ou um enriquecimento da preparação de vesícula extracelular desejada. Em algumas modali- dades, isolar ou purificar como aqui utilizado é o processo de remoção, remoção parcial (por exemplo, uma fração) das vesículas extracelula- res de uma amostra contendo células produtoras. Em algumas moda- lidades, uma composição de vesícula extracelular isolada não possui atividade indesejável detectável ou, alternativamente, o nível ou quan- tidade da atividade indesejada é igual ou inferior a um nível ou quanti- dade aceitável. Em outras modalidades, uma composição de vesícula extracelular isolada tem uma quantidade e / ou concentração das vesí- culas extracelulares desejadas em ou acima de uma quantidade e / ou concentração aceitáveis. Em outras modalidades, a composição de vesícula extracelular isolada é enriquecida em comparação com o ma- terial de partida (por exemplo, preparações de células produtoras) a partir do qual a composição é obtida. Este enriquecimento pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999%, 99,9999% ou superior a 99,9999% em comparação com o material de partida. Em algumas modalidades, as preparações isoladas de vesículas extracelulares es- tão substancialmente livres de produtos biológicos residuais. Em al-
gumas modalidades, as preparações isoladas de vesícula extracelular são 100% livres, 99% livres, 98% livres, 97% livres, 96% livres ou 95% livres de qualquer matéria biológica contaminante. Os produtos bioló- gicos residuais podem incluir materiais abióticos (incluindo produtos químicos) ou ácidos nucleicos, proteínas, lipídios ou metabolitos inde- sejados. Substancialmente livre de produtos biológicos residuais tam- bém pode significar que a composição da vesícula extracelular não contém células produtoras detectáveis e que apenas as vesículas ex- tracelulares são detectáveis.
[00125] Os termos "administração", "administração"; e suas vari- antes se referem à introdução de uma composição, como uma vesícu- la extracelular ou agente em um indivíduo e incluem a introdução si- multânea e sequencial de uma composição ou agente. A introdução de uma composição ou agente em um indivíduo é por qualquer via ade- quada, incluindo oral, pulmonar, intranasal, parenteral (intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea), retal, intra- linfática, intratecal, intratumoral, periocular ou tópica. A administração inclui autoadministração e administração por terceiros. Uma via de administração adequada permite que a composição ou o agente de- sempenhe a função pretendida. Por exemplo, se uma via adequada é intravenosa, a composição é administrada através da introdução da composição ou agente na veia do indivíduo.
[00126] Conforme usado aqui, o termo "modular", "modulação", "modificar" e / ou "modulador" geralmente se refere à capacidade de alterar, aumentando ou diminuindo, por exemplo, promovendo / es- timulando / regulando de modo crescente ou promovendo direta ou indiretamente interferir / inibir / regular de modo decrescente uma con- centração, nível, expressão, função ou comportamento específico, como, por exemplo, atuar como antagonista ou agonista. Em alguns casos, um modulador pode aumentar e / ou diminuir uma certa con-
centração, nível, atividade ou função em relação a um controle ou em relação ao nível médio de atividade que geralmente seria esperado ou em relação a um nível de atividade de controle.
[00127] Otermo "quantidade suficiente"; significa uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, uma quantida- de suficiente para modular uma condição no sujeito.
[00128] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que é eficaz para melhorar um sintoma de uma doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma "quantidade profilaticamente eficaz", pois a profilaxia pode ser considerada terapia.
[00129] Como aqui utilizado, o termo "substancialmente" ou "substancial" se refere, por exemplo, à presença, nível ou concentra- ção de uma entidade em um espaço específico, o efeito de uma enti- dade em outra entidade ou o efeito de um tratamento. Por exemplo, uma atividade, nível ou concentração de uma entidade aumenta subs- tancialmente se o aumento for 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1000 vezes dobre em relação a uma linha de base. Uma atividade, nível ou concentração de uma entidade também é aumentada substancialmente se o aumento for de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,, 90%, 100%, 200% ou 500% em relação a uma linha de base.
[00130] O termo "in vivo" se refere a processos que ocorrem em um organismo vivo.
[00131] O termo "mamífero", conforme usado aqui, inclui humanos e mamíferos não humanos.
[00132] As abreviações usadas neste aplicativo incluem o seguinte: "MRNA" se refere ao RNA mensageiro, "miRNA" se refere a microR- NA, "siRNA" se refere a pequeno RNA interferente, "RNA antissen- so" se refere a RNA de fita simples que é complementar a um mRNA, "ShRNA" se refere a RNA pequeno ou curto, "LncRNA" se refere ao
RNA longo não codificante e "dsDNA" se refere ao DNA de fita dupla.
COMPOSIÇÕES
[00133] Aspectos do indivíduo da divulgação incluem uma composi- ção capaz de regular o sistema imunológico. A composição compre- ende uma vesícula extracelular compreendendo uma membrana celu- lar e um componente imunomodulador associado à membrana celular ou fechado dentro do volume fechado ligado à membrana.
A VESÍCULA EXTRACELULAR
[00134] Em várias modalidades, a composição compreende uma vesícula extracelular. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é uma vesícula derivada de células que compreende uma membrana que envolve um espaço interno.
[00135] Em várias modalidades, a vesícula extracelular pode ser uma vesícula ligada à membrana que tem um diâmetro menor que a célula da qual é derivada. Em algumas modalidades, a vesícula extra- celular tem uma dimensão mais longa entre cerca de 20-1000 nm, co- mo entre cerca de 20-100 nm, 20-200 nm, 20-300 nm, 20-400 nm, 20- 500 nm, 20-600 nm, 20-700 nm, 20-800 nm, 20-900 nm, 30-100 nm, 30-200 nm, 30-300 nm, 30-400 nm, 30-500 nm, 30-600 nm, 30-700 nm, 30-800 nm, 30-900 nm, 40-100 nm, 40-200 nm, 40-300 nm, 40- 400 nm, 40-500 nm, 40-600 nm, 40-700 nm, 40-800 nm, 40-900 nm, 50-150 nm, 50-500 nm, 50-750 nm, 100-200 nm, 100-500 nm ou 500- 1000 nm.
[00136] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é um exossomo. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é uma na- novesícula. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é um corpo apoptótico. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é um frag- mento de célula. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é uma vesícula derivada da célula por manipulação direta ou indireta. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é uma organela vesi-
culada. Em várias modalidades, a vesícula extracelular é uma vesícula produzida por células vivas.
[00137] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é deriva- da de um organismo vivo. Em algumas modalidades, a vesícula extra- celular é derivada de um organismo morto. Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é derivada de um tecido explantado. Em algu- mas modalidades, a vesícula extracelular é derivada de um órgão ex- plantado. Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é derivada de células cultivadas. Em algumas destas modalidades, quando a ve- sícula extracelular é gerada em um sistema de cultura de células, a vesícula extracelular é ainda mais isolada (por exemplo, separando a vesícula extracelular das células cultivadas). A separação pode ser alcançada por sedimentação. Por exemplo, a vesícula extracelular po- de ter uma densidade específica entre 0,5 e 2,0, 0,6 e 1,0, 0,7 e 1,0, 0,8 e 1,0, 0,9 6 1,0, 1,06 1,1, 1,1 e 1,2, 1,26 1,3, 14 e 1,5, 1,0e 1,5, 1,5 e 2,0 1,0 e 2,0 kg/m?. A separação também pode ser alcançada por purificação por afinidade. Por exemplo, a vesícula extracelular po- de ser purificada pela ligação de uma população compreendendo ve- sículas extracelulares a uma resina, compreendendo a referida resina uma pluralidade de ligantes que possuem afinidade específica para uma ou mais proteínas-alvo na superfície da vesícula extracelular. As proteínas-alvo podem ser uma tetraspanina (por exemplo, CD63, CD81, CD9), um membro da superfamília de proteínas / imunoglobuli- nas EWI (por exemplo, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), uma integrina (por exemplo, ITGB1, ITGA4), uma proteína transportadora de ATP (por exemplo, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc. A proteína- alvo pode adicionalmente ser o componente imunomodulador que é exibido na superfície dos exossomos.
[00138] Em várias modalidades, a vesícula extracelular compreen-
de lipídios ou ácidos graxos e polipeptídeos. Em certas modalidades, a vesícula extracelular compreende ainda um açúcar. Em certas modali- dades, a vesícula extracelular compreende ainda um polinucleotídeo.
[00139] Em várias modalidades, a membrana da vesícula extracelu- lar compreende uma superfície interna e uma superfície externa e en- volve um espaço interno. Em algumas modalidades, a vesícula extra- celular compreende ainda uma carga útil. Em certas modalidades, a carga útil é envolta dentro do espaço interno. Em certas modalidades, a carga útil é exibida na superfície externa da vesícula extracelular. Em certas modalidades, a carga útil está abrangendo a membrana da vesícula extracelular. Em várias modalidades, a carga útil compreende ácidos nucleicos, proteínas, carboidratos, lipídios, moléculas pequenas e / ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a vesícu- la extracelular compreende ainda um receptor.
O EXOSSOMO
[00140] Em várias modalidades, a vesícula extracelular é um exos- somo. Em certas modalidades, o exossomo é uma pequena vesícula ligada à membrana secretada pelas células produtoras.
[00141] Em algumas modalidades, o exossomo da célula produtora tem uma dimensão mais longa entre cerca de 20 a 300 nm, como en- tre cerca de 20 a 290 nm, 20 a 280 nm, 20 a 270 nm, , 20 a 260 nm, a 250 nm, 20 a 240 nm, 20 a 230 nm, 20 a 220 nm, 20 a 210 nm, 20 a 200 nm, 20 a 190 nm, 20 a 180 nm, 20 a 170 nm, 20 a 160 nm, 20 a 150 nm, 20 a 140 nm, 20 a 130 nm, 20 a 120 nm, 20 a 110 nm, 20 a 100 nm, 20 a 90 nm, 20 a 80 nm, 20 a 70 nm, 20 a 60 nm, 20 a 50 nm, 20 a 40 nm, 20 a 30 nm, 30 a 300 nm, 30 a 290 nm, 30 a 280 nm, 30 a 270 nm, 30 a 260 nm, 30 a 250 nm, 30 a 240 nm, 30 a 230 nm, 30 a 220 nm, 30 a 210 nm, 30 a 200 nm, 30 a 190 nm, 30 a 180 nm, 30 a 170 nm, 30 a 160 nm, 30 a 150 nm, 30 a 140 nm, 30 a 130 nm, 30 a 120 nm, 30 a 110 nm, 30 a 100 nm, 30 a 90 nm, 30 a 80 nm,
a 70 nm, 30 a 60 nm, 30 a 50 nm, 30 a 40 nm, 40 a 300 nm, 40 a 290 nm, 40 a 280 nm, 40 a 270 nm, 40 a 260 nm, 40 a 250 nm, 40 a 240 nm, 40 a 230 nm, 40 a 220 nm, 40 a 210 nm, 40 a 200 nm, 40 a 190 nm, 40 a 180 nm, 40 a 170 nm, 40 a 160 nm, 40 a 150 nm, 40 a 140 nm, 40 a 130 nm, 40 a 120 nm, 40 a 110 nm, 40 a 100 nm, 40 à 90 nm, 40 a 80 nm, 40 a 70 nm, 40 a 60 nm, 40 a 50 nm, 50 a 300 nm, 50 a 290 nm, 50 a 280 nm, 50 a 270 nm, 50 a 260 nm, 50 a 250 nm, 50 a 240 nm, 50 a 230 nm, 50 a 220 nm, 50 a 210 nm, 50 a 200 nm, 50 a 190 nm, 50 a 180 nm, 50 a 170 nm, 50 a 160 nm, 50 a 150 nm, 50 a 140 nm, 50 a 130 nm, 50 a 120 nm, 50 a 110 nm, 50 a 100 nm, 50 a 90 nm, 50 a 80 nm, 50 a 70 nm, 50 a 60 nm, 60 a 300 nm, 60 a 290 nm, 60 a 280 nm, 60 a 270 nm, 60 a 260 nm, 60 a 250 nm, 60 a 240 nm, 60 a 230 nm, 60 a 220 nm, 60 a 210 nm, 60 a 200 nm, 60 a 190 nm, 60 a 180 nm, 60 a 170 nm, 60 a 160 nm, 60 a 150 nm, 60 a 140 nm, 60 a 130 nm, 60 a 120 nm, 60 a 110 nm, 60 a 100 nm, 60 a 90 nm, 60 a 80 nm, 60 a 70 nm, 70 a 300 nm, 70 a 290 nm, 70 a 280 nm, 70 a 270 nm, 70 a 260 nm, 70 a 250 nm, 70 a 240 nm, 70 a 230 nm, 70 a 220 nm, 70 a 210 nm, 70 a 200 nm, 70 a 190 nm, 70 a 180 nm, 70 a 170 nm, 70 a 160 nm, 70 a 150 nm, 70 a 140 nm, 70 a 130 nm, 70 a 120 nm, 70 a 110 nm, 70 a 100 nm, 70 a 90 nm, 70 a 80 nm, 80 a 300 nm, 80 a 290 nm, 80 a 280 nm, 80 a 270 nm, 80 a 260 nm, 80 a 250 nm, 80 a 240 nm, 80 a 230 nm, 80 a 220 nm, 80 a 210 nm, 80 a 200 nm, 80 a 190 nm, 80 a 180 nm, 80 a 170 nm, 80 a 160 nm, 80 a 150 nm, 80 a 140 nm, 80 a 130 nm, 80 a 120 nm, 80 a 110 nm, 80 a 100 n m, 80 a 90 nm, 90 a 300 nm, 90 a 290 nm, 90 a 280 nm, 90 a 270 nm, 90 a 260 nm, 90 a 250 nm, 90 a 240 nm, 90 a 230 nm, 90 a 220 nm, 90 a 210 nm, 90 a 200 nm, 90 a 190 nm, 90 a 180 nm, 90 a 170 nm, 90 a 160 nm, 90 a 150 nm, 90 a 140 nm, 90 a 130 nm, 90 a 120 nm, 90 a 110 nm, 90 a 100 nm, 100 a 300 nm, 110 a 290 nm, 120 a 280 nm, 130 a 270 nm, 140 a 260 nm, 150 a 250 nm, 160 a 240 nm,
170 a 230 nm, 180 a 220 nm ou 190 a 210 nm.
[00142] Em modalidades particularmente preferidas, o exossomo da célula produtora aqui descrita tem uma dimensão mais longa entre cerca de 30 a 100 nm. Noutra modalidade preferida, o exossomo da célula produtora tem uma dimensão mais longa entre cerca de 20 a 300 nm. Noutra modalidade preferida, o exossomo da célula produtora tem uma dimensão mais longa entre cerca de 40 a 200 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreen- de uma população em que 90% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 20 a 300 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreende uma população em que 95% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 20 a 300 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreen- de uma população em que 99% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 20 a 300 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreende uma população em que 90% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 40 a 200 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreen- de uma população em que 95% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 40 a 200 nm. Noutra modalidade, uma população dos exossomos aqui descritos compreende uma população em que 99% dos exossomos têm uma dimensão mais longa 40 a 200 nm. Noutras modalidades preferidas, o tamanho do exossomo ou população de exossomos aqui descritos é medido de acordo com os métodos descri- tos, infra.
[00143] Em algumas modalidades, o exossomo é gerado por uma célula produtora. Em algumas modalidades, a membrana do exosso- mo compreende uma ou mais moléculas derivadas da célula produto- ra. Em algumas modalidades, o exossomo é gerado em um sistema de cultura de células e isolado (por exemplo, separando o exossomo da célula produtora). A separação pode ser alcançada por sedimentação. Por exemplo, o exossomo pode ter uma densidade específica entre 0,5 a 2,0, 0,6 a 1,0, 0,7 a 1,0, 0,8 a 1,0, 0,9 a 1,0, 1,0 a 1,1, 1,1 a 1,2, 1,2a 1,3, 1,4 a 1,5, 1,0 a 1,5, 1,5a 2,0 e 1,0 a 2,0 kg/m?. A separação também pode ser alcançada por purificação por afinidade. Por exem- plo, a vesícula extracelular pode ser purificada pela ligação de uma população compreendendo vesículas extracelulares a uma resina, compreendendo a referida resina uma pluralidade de ligantes que pos- suem afinidade específica para uma ou mais proteínas-alvo na super- fície da vesícula extracelular. A uma ou mais proteínas-alvo podem ser uma tetraspanina (por exemplo, CD63, CD81, CD9), um membro da superfamília de proteínas / imunoglobulinas EWI (por exemplo, PTG- FRN, IGSF8 e/ou IGSF3), uma integrina (por exemplo, ITGB1 e/ou ITGA4), uma proteína transportadora de ATP (por exemplo, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3 e/ou ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc. A proteína-alvo pode adici- onalmente ser o componente imunomodulador que é exibido na super- fície dos exossomos.
[00144] Em algumas modalidades, a membrana do exossomo com- preende uma superfície interna e uma superfície externa. Em certas modalidades, a superfície interior é voltada para o núcleo interno do exossomo. Em certas modalidades, a superfície externa pode estar em contato com o endossoma, os corpos multivesiculares ou a membrana | citoplasma de uma célula produtora ou de uma célula-alvo.
[00145] Em algumas modalidades, o exossomo compreende lipídios e ácidos graxos. Em algumas modalidades, o exossomo compreende fosfolipídios, glicolipídios, ácidos graxos, esfingolípidos, fosfogliceríi- deos, esteróis, colesteróis e fosfatidilserinas. Em algumas modalida- des, o lipídio e o ácido graxo podem ser um ou mais daqueles listados na Tabela 1.
[00146] Em certas modalidades, o exossomo compreende uma bi- camada lipídica composta por um folheto interno e um folheto externo. A composição do folheto interno e externo pode ser determinada por ensaios de distribuição transcamada conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Kuypers et al. Biohim Biophys Acta 1985 819: 170. Em al- gumas modalidades, a composição do folheto externo está entre apro- ximadamente 70 a 90% de fosfolípidos de colina, entre aproximada- mente O a 15% de fosfolípidos ácidos e entre aproximadamente 5 a 30% de fosfatidiletanolamina. Em algumas modalidades, a composição do folheto interno está entre aproximadamente 15 a 40% de fosfolípi- dos de colina, entre aproximadamente 10 a 50% de fosfolípidos ácidos e entre aproximadamente 30 a 60% de fosfatidiletanolamina.
[00147] Em algumas modalidades, a membrana do exossomo com- preende ainda um ou mais polipeptídeos. Em certas modalidades, o exossomo compreende um ou mais polipeptídeos selecionados da lis- ta a seguir, incluindo, mas sem limitações, espectrina, polipeptídeo semelhante a miosina, banda 3, SLC4A1, actina, polipeptídeo seme- lhante a actina, gliceraldeído 3-P desidrogenase (G3PD) , tetraspani- nas (por exemplo, CD63, CD81 e / ou CD9), Alix e TSG101, integrinas (por exemplo, ITGB1 e / ou ITGA4), selectinas, CR1, TNFRI, enzimas proteolíticas, proteínas ou histonas ligadas a glicosilfosfatidilinosito! (GPI), proteína EWI / membros da superfamília de imunoglobulina (e.
9. , PTGFRN, IGSF8 e / ou IGSF3), proteínas transportadoras de ATP (por exemplo, ATP1IA1, ATP1IA2, ATP1IA3S, ATP1IA4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3 e/ou ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc. Em algumas modalidades, o exossomo compreende pelo menos um polipeptídeo selecionado da Tabela 2.
[00148] Em algumas modalidades, o exossomo compreende poli- peptídeos em sua superfície. Em algumas modalidades, o exossomo é modificado para conter o um ou mais polipeptídeos. Em algumas mo-
dalidades, a célula produtora é modificada para conter um ou mais po- lipeptídeos. Em algumas modalidades, a célula produtora naturalmente contém os um ou mais polipeptídeos e os exossomos derivados deles também contêm os polipeptídeos. Os níveis de qualquer marcador de superfície desejado podem ser modificados diretamente no exossomo (por exemplo, colocando o complexo em contato com polipeptídeos produzidos de forma recombinante para provocar inserção ou conju- gação na membrana do complexo). Alternativamente ou além disso, os níveis de qualquer marcador de superfície desejado podem ser modifi- cados diretamente na célula produtora (por exemplo, colocando o complexo em contato com polipeptídeos produzidos de forma recom- binante para provocar inserção ou conjugação na membrana da célu- la). Alternativamente, a célula produtora pode ser modificada através da transdução de um ácido nucleico exógeno na célula produtora para expressar um marcador de superfície desejado. O marcador de super- fície já pode estar naturalmente presente na célula produtora, caso em que o construto exógeno pode levar à superexpressão do marcador e aumento da concentração do marcador na célula produtora ou sobre ela. Alternativamente, um marcador de superfície expresso natural- mente pode ser removido da célula produtora (por exemplo, induzindo o silenciamento de genes na célula produtora). Os polipeptídeos po- dem conferir diferentes funcionalidades ao exossomo (por exemplo, capacidades específicas de alvejamento, funções de entrega (por exemplo, moléculas de fusão), funções enzimáticas, meia-vida aumen- tada ou diminuída in vivo, etc.). Em algumas modalidades, os polipep- tídeos incluem, mas não estão limitados a, CD47, CD55, CD49, CD40, CD133, CDB59, glipican-1, CD9, CD63, CD81, integrinas, selectinas, lectinas e caderinas.
[00149] Em modalidades específicas, os exossomos compreendem um ou mais polipeptídeos em sua superfície, em que os referidos poli-
peptídeos são selecionados a partir de um grupo de proteínas que foi recentemente identificado como sendo enriquecido na superfície dos exossomos (descrito em detalhes no Pedido de Patente nº U. S. 62/
550. 543, que é aqui incorporado a título de referência na sua totalida- de). Este grupo de polipeptídeos inclui regulador negativo do receptor de prostaglandina F2 (PTGFRN); basigina (BSG); membro 3 da super- família da imunoglobulina (IGSF3); membro 8 da superfamília da imu- noglobulina (IGSF8); integrina beta-1 (ITGB1); integrina alfa-4 (ITGA4); Cadeia pesada de antígeno de superfície celular 4F2 (SLC3A2); e uma classe de proteínas transportadoras de ATP (ATP1IA1, ATP1A?2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4)).
[00150] Em algumas modalidades, a membrana do exossomo com- preende ainda um ou mais polissacarídeos, como o glicano.
[00151] Em algumas modalidades, o exossomo entrega a carga útil (agente terapêutico) a um alvo. A carga útil é um agente terapêutico que atua em um alvo (por exemplo, uma célula -alvo) que é contatada com o exossomo. O contato pode ocorrer in vitro ou em um indivíduo. As cargas úteis que podem ser introduzidas em um exossomo e / ou em uma célula produtora incluem agentes terapêuticos, como nucleo- tídeos (por exemplo, nucleotídeos compreendendo uma porção quími- ca detectável ou uma toxina ou que interrompe a transcrição), ácidos nucleicos (por exemplo, moléculas de DNA ou mMRNA que codificam um polipeptídeo, como uma enzima, ou moléculas de RNA que possu- em função reguladora, como mIRNA, dsDNA, IncRKNA ou siRNA), ami- noácidos (por exemplo, aminoácidos compreendendo uma porção química detectável ou uma toxina que atrapalha a tradução), polipeptí- deos (por exemplo, enzimas) , lipídios, carboidratos e moléculas pe- quenas (por exemplo, fármacos e toxinas de moléculas pequenas).
[00152] O exossomo pode interagir com a célula-alvo por meio de fusão de membrana e entregar cargas úteis (por exemplo, agentes te-
rapêuticos) em uma composição de exossomo à superfície ou cito- plasma de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, a fusão de membrana ocorre entre o exossomo e a membrana plasmática de uma célula-alvo. Em outras modalidades, a fusão de membrana ocorre en- tre o exossomo e uma membrana endossômica de uma célula-alvo.
[00153] Em algumas modalidades, o exossomo compreende um polipeptídeo receptor. O polipeptídeo receptor pode ser sintético. Em algumas modalidades, o polipeptídeo receptor é introduzido na célula produtora (por exemplo, um ácido nucleico exógeno que codifica o po- lipeptídeo receptor é introduzido na célula produtora) ou um polipeptí- deo receptor recombinante que é produzido fora da célula produtora (por exemplo, sintetizado por um sistema de expressão de proteínas). Em algumas modalidades, o polipeptídeo receptor (por exemplo, um polipeptídeo produzido de forma recombinante) é introduzido direta- mente no exossomo (por exemplo, depois que o exossomo é isolado da célula produtora). Em algumas modalidades, o polipeptídeo recep- tor pode estar na superfície dos exossomos. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo receptor é capaz de alvejar o exossomo para um alvo específico (por exemplo, um alvo como um patógeno, um metabó- lito, um complexo polipeptídico ou uma célula, como uma célula não funcional ou célula cancerígena) que circula no sistema circulatório do indivíduo, como o sangue, ou um alvo que reside em um tecido (como um tecido doente).
[00154] Em algumas modalidades, o exossomo é sintético. Por exemplo, o exossomo pode compreender uma carga útil, como, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico, ácido nucleico (como DNA ou RNA) ou outro polinucleotídeo, polissacarídeo ou glicano, lipídio ou ácido graxo, molécula ou toxina biológica grande, pequena, de modo que o exossomo não esteja ocorrendo naturalmente. Em algumas mo- dalidades, o exossomo é modificado (por exemplo, introduzindo uma carga útil ou modificando o conteúdo do complexo, como alterando o conteúdo de proteína, lipídio ou glicano da membrana). Por exemplo, os exossomos são primeiro isolados de uma célula produtora e depois modificados conforme desejado, gerando assim exossomos sintéticos. Em algumas modalidades, a célula produtora é modificada. Por exem- plo, um ácido nucleico exógeno, um polipeptídeo exógeno ou molécula pequena ou toxina podem ser introduzidos na célula produtora. Alter- nativamente ou além disso, a célula produtora pode, de outro modo, ser modificada (por exemplo, modificando o teor celular ou da mem- brana, como alterando o teor de lipídio ou glicano da membrana celu- lar). Os exossomos gerados a partir das células produtoras modifica- das compreendem uma ou mais das modificações da célula produtora. O processo produz exossomos sintéticos. Em algumas modalidades, tanto a célula produtora quanto o exossomo isolado da célula produto- ra são modificados como aqui descrito.
NANOVESÍCULA
[00155] Em várias modalidades, a vesícula extracelular é uma na- novesícula. Em certas modalidades, a nanovesícula é uma vesícula pequena derivada de célula que compreende uma membrana que en- volve um espaço interno e que é gerada a partir da célula por manipu- lação direta ou indireta, de modo que a nanovesícula não seja produ- zida pela célula sem a manipulação. Manipulações apropriadas da cé- lula incluem, mas sem limitações, extrusão em série, tratamento com soluções alcalinas, sonicação ou combinações dos mesmos e podem, em alguns casos, resultar na destruição da célula produtora.
[00156] Em várias modalidades, a nanovesícula tem uma dimensão mais longa entre cerca de 20 a 250 nm, como entre cerca de 20 a 100 nm, 20 a 150 nm, 20 a 200 nm, 30 a 100 nm, 30 a 150 nm, 30 a 200 nm, 30 a 250 nm, 40 a 100 nm, 40 a 150 nm, 40 a 200 nm, 40 a 250 nm, 50 a 100 nm, 50 a 150 nm, 50 a 200 nm, 50 a 250 nm, 100 a 200 nm ou 150 a 250 nm.
[00157] Em várias modalidades, a nanovesícula é derivada de uma célula produtora. Em certas modalidades, a nanovesícula é gerada a partir de uma célula produtora por manipulação direta ou indireta. Ma- nipulações apropriadas incluem, mas sem limitações, extrusão em sé- rie, tratamento com soluções alcalinas, sonicação ou combinações das mesmas. Em algumas destas modalidades, a manipulação pode resul- tar na destruição da célula produtora. Em algumas modalidades prefe- ridas, a população da nanovesícula é substancialmente livre de vesí- culas que são derivadas de células produtoras por meio de brotamento direto da membrana plasmática ou fusão do endossoma tardio com a membrana plasmática.
[00158] Em algumas modalidades, a nanovesícula é isolada da cé- lula produtora com base em seu tamanho, densidade, parâmetros bio- químicos ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o isolamento pode ser alcançado por sedimentação. Por exemplo, a na- novesícula pode ter uma densidade específica entre 0,5 a 2,0, 0,6 a 1,0, 0,7 a 1,0, 0,8 a 1,0, 0,9 a 1,0, 1,0 a 1,1, 1,1 a 1,2, 1,2a 1,3, 14 a 1,5, 1,0 a 1,5, 1,5a 2,0 € 1,0 a 2,0 kg/m?.
[00159] Em várias modalidades, a nanovesícula compreende lipí- dios ou ácidos graxos e polipeptídeos. Em certas modalidades, a na- novesícula compreende ainda um açúcar. Em certas modalidades, a nanovesícula compreende ainda um polinucleotídeo. Em algumas mo- dalidades, a nanovesícula compreende ainda um receptor. Em algu- mas modalidades, a nanovesícula compreende ainda uma carga útil. Em algumas destas modalidades, a carga útil compreende ácidos nu- cleicos, proteínas, carboidratos, lipídios, moléculas pequenas e / ou combinações dos mesmos.
O COMPONENTE IMUNOMODULADOR
[00160] Em várias modalidades, a composição compreende ainda um componente imunomodulador.
[00161] Em algumas modalidades, o composto de imunomodulação é uma proteína que é expressa como uma proteína de fusão de tradu- ção para uma proteína de superfície do exossomo, de modo que a re- ferida proteína seja retida na superfície do exossomo. Em certas mo- dalidades, o composto imunomodulador é uma proteína de membrana. Em certas modalidades, o composto de imunomodulação é uma prote- ína solúvel. Em algumas modalidades, a proteína de superfície do exossomo é uma tetraspanina (por exemplo, CD63, CD81, CD9), um membro da superfamília da imunoglobulina / proteína EWI (por exem- plo, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), uma integrina (por exemplo, ITGB1, ITGA4), uma proteína transportadora de ATP (por exemplo, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc ou um fragmento ou variante dos mesmos.
[00162] Em algumas modalidades, o composto de imunomodulação é uma proteína solúvel que é expressa como uma proteína de fusão de tradução para uma proteína de superfície do exossomo, de modo que a referida proteína solúvel seja retida na superfície do exossomo. Em algumas modalidades, a proteína de superfície do exossomo é uma tetraspanina (por exemplo, CD63, CD81, CD9), um membro da superfamília da imunoglobulina / proteína EWI (por exemplo, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), uma integrina (por exemplo, ITGB1, ITGA4), uma pro- teína transportadora de ATP (por exemplo, ATP1IA1I, ATP1A?2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc ou um fragmento ou variante dos mesmos.
[00163] Em certas modalidades, o componente imunomodulador possui atividade antitumoral. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador regula a resposta imune inata. Em algumas destas modalidades, o componente imunomodulador tem como alvo as célu-
las assassinas naturais. Em algumas outras modalidades, o compo- nente imunomodulador regula a resposta imune adaptativa. Em algu- mas destas modalidades, o componente imunomodulador tem como alvo as células T citotóxicas.
[00164] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é expresso na célula produtora em sua forma completa. Em outras modalidades, o componente imunomodulador é expresso como uma proteína de fusão de tradução para uma proteína de superfície do exossomo, o que resulta em um nível mais alto de expressão da por- ção biologicamente ativa do composto de imunomodulação na superfí- cie do exossomo. Em algumas modalidades, o composto de imuno- modulação é uma proteína solúvel que é expressa como uma proteína de fusão de tradução para uma proteína de superfície do exossomo, de modo que a referida proteína solúvel seja retida na superfície do exossomo. Em algumas modalidades, a proteína de superfície do exossomo é uma tetraspanina (por exemplo, CD63, CD81, CD9), um membro da superfamília da imunoglobulina / proteína EWI (por exem- plo, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), uma integrina (por exemplo, ITGB1, ITGA4), uma proteína transportadora de ATP (por exemplo, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG ou CD98hc ou um fragmento ou variante dos mesmos.
[00165] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor para um regulador de ponto de verificação negativo. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador de ponto de verificação negativo.
[00166] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor da proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4). Em algumas destas modalidades, o inibidor de CTLA-4 é um anticorpo monoclonal de CTLA-4. Em certas modalidades, o inibidor é um frag- mento de um anticorpo monoclonal de CTLA-4. Em certas modalida- des, o fragmento de anticorpo é um scFv, (scFv)2, Fab, Fab' e F(ab', F(ab1)2, Fv, dAb ou Fd de um anticorpo monoclonal de CTLA4. Em certas modalidades, o inibidor é um nanocorpo, um anticorpo biespecií- fico ou um anticorpo multiespecífico contra CTLA-4. Em algumas mo- dalidades específicas, o anticorpo monoclonal é ipilimumab. Em algu- mas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal é tremelimu- mab.
[00167] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor da proteína 1 de morte celular programada (PD-1). Em cer- tas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor do |li- gante de morte programada 1 (PD-L1). Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor do ligante de morte pro- gramada 2 (PD-L2). Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1, PD- L1 ou PD-L2 é um anticorpo monoclonal de PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em certas modalidades, o inibidor é um fragmento de um anticorpo monoclonal de PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em certas modalidades, o fra- gmento de anticorpo é um scFv, (scFv)2, Fab, Fab' e F(ab')2, F(ab1) >, Fv, dAb ou Fd de um anticorpo monoclonal de PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em certas modalidades, o inibidor é um nanocorpo, um anticorpo bies- pecífico ou um anticorpo multiespecífico contra PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal é nivo- lumab. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal é pembrolizumab. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal é pidilizumab. Em algumas modalidades específicas, o an- ticorpo monoclonal é atezolizumab. Em algumas modalidades especí- ficas, o anticorpo monoclional é avelumab.
[00168] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor do gene 3 ativado por linfócitos (LAG3). Em algumas des-
tas modalidades, o inibidor de LAG3 é um anticorpo monoclonal de LAG3.
[00169] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor da proteína 3 contendo mucina da imunoglobulina de célu- las T (TIM-3). Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor do atenuador de linfócitos B e T (BTLA). Em certas mo- dalidades, o componente imunomodulador é um inibidor do imunorre- ceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TIGIT). Em certas modali- dades, o componente imunomodulador é um inibidor do supressor de Ig do domínio V da ativação de células T (VISTA). Em certas modali- dades, o componente imunomodulador é um inibidor do receptor A2a de adenosina (A2aR). Em certas modalidades, o componente imuno- modulador é um inibidor do receptor do tipo imunoglobulina das célu- las assassinas (KIR). Em certas modalidades, o componente imuno- modulador é um inibidor da indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor de CD20, CD39 ou CD73.
[00170] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador para uma molécula coestimuladora positiva. Em algu- mas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coestimuladora positiva.
[00171] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de um membro da superfamília do receptor de TNF. Em algumas destas modalidades, o membro da superfamília do receptor de TNF é selecionado do grupo que consiste em:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1I, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP e XEDAR. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um membro da superfamília de TNF. Em certas modalidades, o membro da superfamília TNF é selecionado do grupo que consiste em: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligante 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, ABRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT, ligante GITR e EDA-2.
[00172] Em algumas modalidades, o ativador de um membro da superfamília do receptor de TNF é expresso como uma proteína mo- nomérica. Em algumas modalidades, o ativador de um membro da su- perfamília do receptor de TNF é expresso como proteínas triméricas. Em algumas modalidades, o membro da superfamília do receptor de TNF é expresso como uma proteína monomérica. Em algumas moda- lidades, o membro da superfamília do receptor de TNF é expresso como proteínas triméricas.
[00173] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador do Membro 4 da Superfamília do Receptor TNF (OX40). Em algumas destas modalidades, o ativador de OX40 é um anticorpo agonista de OX40. Em algumas destas modalidades, o ativador de OXA40 é o ligante OX40 (OX40L).
[00174] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de CD27. Em algumas destas modalidades, o ativador de CD27 é um anticorpo agonista de CD27. Em algumas dessas modali- dades, o ativador do CD27 é o ligante CD27 (CD27L).
[00175] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de CD40. Em algumas destas modalidades, o ativador de CD40 é um anticorpo agonista de CD40. Em algumas dessas modali- dades, o ativador do CD40 é o ligante CD40 (CD40L). Em algumas modalidades, o CD40L é CD40L monomérico. Em algumas modalida- des, o CD40L é CDA40L trimérico.
[00176] Em algumas modalidades, o CD40L trimérico é fundido a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o CDA40L trimérico é fundido ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, CD40L trimérico é expresso como uma proteína de fusão para PTGFRN, em que o polipeptídeo tem a sequência da SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:20.
[00177] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador da proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorti- coide (GITR). Em algumas destas modalidades, o ativador de GITR é um anticorpo agonista de GITR. Em algumas destas modalidades, o ativador de GITR é um ligante natural de GITR.
[00178] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de 4-1BB. Em algumas destas modalidades, o ativador de 4-1BB é um anticorpo agonista de 4-1BB. Em algumas destas modali- dades, o ativador de 4-1BB é um ligante natural de 4-1BB.
[00179] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é o receptor Fas (Fas). Em algumas destas modalidades, o receptor Fas é exibido na superfície da vesícula extracelular. Em algumas ou- tras modalidades, o componente imunomodulador é o ligante Fas (FasL). Em algumas destas modalidades, o ligante Fas é exibido na superfície da vesícula extracelular. Em certas modalidades, o compo- nente imunomodulador é um anticorpo do receptor Fas. Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um anticorpo do ligan- te Fas.
[00180] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de uma molécula coestimuladora da superfamília CD28. Em certas modalidades, a molécula coestimuladora da superfamília CD28 é ICOS ou CD28. Em certas modalidades, o componente imu- nomodulador é ICOSL, CD80 ou CD86.
[00181] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador do coestimulador de células T induzível (ICOS). Em algu- mas destas modalidades, o ativador de ICOS é um anticorpo agonista de ICOS. Em algumas outras destas modalidades, o ativador do ICOS é o ligante ICOS (ICOSL).
[00182] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de CD28. Em algumas destas modalidades, o ativador de CD28 é um anticorpo agonista de CD28. Em algumas destas modali- dades, o ativador de CD28 é um ligante natural de CD28. Em certas modalidades, o ligante de CD28 é CD80.
[00183] Em certas modalidades, a composição compreende um ini- bidor para um regulador de ponto de verificação negativo ou um inibi- dor para um parceiro de ligação de um regulador de ponto de verifica- ção negativo e um ativador para uma molécula coestimuladora positiva ou um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coesti- muladora positiva.
[00184] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é uma citocina so- lúvel que foi translacionalmente fundida com uma proteína de superfí- cie do exossomo ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, a citocina é interleucina 2 (IL-2). Em algumas modalidades, a citocina é a interleucina 7 (IL-7). Em algumas modalidades, a citocina é inter- leucina 12 (IL-12). Em algumas modalidades, a citocina é a interleuci- na 15 (IL-15).
[00185] Em certas modalidades, a citocina é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, a IL-7 é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o IL- 7 é fundido ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, IL-7 é expresso como uma proteína de fu- são para PTGFRN, em que o polipeptídeo tem a sequência da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
[00186] Em certas modalidades, a citocina é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, a 11-12 é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o
IL-12 é fundido ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mes- mo. Em algumas modalidades, I|L-12 é expresso como uma proteína de fusão para PTGFRN, em que o polipeptídeo tem a sequência da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6.
[00187] Em certas modalidades, a citocina é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, a IL-15 é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o IL-15 é fundido ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mes- mo. Em algumas modalidades, IL-15 é expresso como uma proteína de fusão para PTGFRN, em que o polipeptídeo tem a sequência da SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:16.
[00188] Em algumas modalidades, a citocina é um interferon (IFN). Em certas modalidades, o interferon é fundida a PTGFRN ou um frag- mento do mesmo. Em certas modalidades, o interferon é interferon y (IFNy). Em algumas modalidades, a IL-15 é fundida a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o IFNy é fundido ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas mo- dalidades, IFNy é expresso como uma proteína de fusão para PTG- FRN, em que o polipeptídeo tem a sequência da SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8.
[00189] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um receptor de células T (TCR) ou um derivado do mesmo. Em cer- tas modalidades, o componente imunomodulador é uma cadeia a de TCR ou um derivado da mesma. Em certas modalidades, o componen- te imunomodulador é uma cadeia B de TCR ou um derivado da mes- ma. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um correceptor da célula T ou um derivado do mesmo.
[00190] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um antígeno tumoral. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em: alfa-fetoproteína (AFP), antí-
geno carcinoembrionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antíge- no associado ao melanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CDA4, CD8, CD45, CD80, CDB86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), li- gante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa- folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo canceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF.
[00191] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno carcinoembrionário (CEA). Em certas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno de tumor epitelial (ETA).
[00192] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é uma mucina. Em algumas destas modalidades, a mucina é uma mucina secretada. Em algumas outras destas modalidades, a mucina é uma mucina transmembranar. Em modalidades específicas, o antígeno tumoral é a mucina 1 (MUC1). Em modalidades específicas, o antígeno tumoral é Tn-MUC1. Em modalidades específicas, o antígeno tumoral é mucina 16 (MUC16).
[00193] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno associado ao melanoma (MAGE). Em algumas destas modalidades, o MAGE é um MAGE tipo |. Em algumas outras destas modalidades, o MAGE é um MAGE tipo Il. Em modalidades específicas, o MAGE tipo | é o MAGE-A2. Em modalidades específicas, o MAGE tipo | é MAGE- AA.
[00194] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é alfa- fetoproteína (AFP). Em certas modalidades, o antígeno tumoral é a proteína tumoral p53 (p53). Em certas modalidades, o antígeno tumo- ral é a tirosinase. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é uma proteína relacionada à tirosinase (TRP). Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é o ligante de morte programada 1 (PD-L1) ou o li-
gante de morte programada 2 (PD-L2). Em várias modalidades, o antí- geno tumoral é selecionado do grupo que consiste em CD4, CD8, CD45, CD80 e CD86.
[00195] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um derivado do mes- mo. Em algumas modalidades, o CAR se liga a um ou mais dentre do alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antígeno associado ao melanoma (MAGE), pro- teína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo can- ceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF.
[00196] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de um receptor ou correceptor de células T. Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um ativador de CD3. Em certas modalidades, o ativador é um fragmento de um anticorpo monoclonal de CD3. Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo é um scFv, (scFv)2, Fab, Fab' e F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb ou Fd de um anticorpo monoclonal contra CD3. Em certas modalidades, o ativador é um nanocorpo, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multies- pecífico contra CD3. Em algumas modalidades, o fragmento de anti- corpo anti-CD3 é fundido a PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo anti-CD3 é fundido ao terminal N de PTGFRN ou um fragmento do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o fragmento de anticorpo anti-CD3 é expresso como uma proteína de fusão para PTGFRN, em que o polipeptídeo tem a se- quência da SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:21. Em certas modalidades,
o componente imunomodulador é um ativador de CD28. Em certas modalidades, o inibidor é um fragmento de um anticorpo monoclilonal de CD28. Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo é um scFv, (scFv)2, Fab, Fab' e F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb ou Fd de um anti- corpo monocilonal de CD28. Em certas modalidades, o inibidor é um nanocorpo, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico contra CD28.
[00197] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) ou um deriva- do do mesmo. Em algumas destas modalidades, o componente imu- nomodulador é um MHC classe | ou um derivado do mesmo. Em al- gumas destas modalidades, o componente imunomodulador é um MHC classe Il ou um derivado do mesmo. Em algumas dessas moda- lidades, o componente imunomodulador é um MHC classe Ill ou um derivado do mesmo.
[00198] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um antígeno leucocitário humano (HLA) ou um derivado do mesmo. Em algumas destas modalidades, o componente imunomodulador é um HLA-A, HLA-B, HLA-C ou um derivado do mesmo. Em algumas destas modalidades, o componente imunomodulador é um HLA-E, HLA-F, HLA-G ou um derivado do mesmo. Em algumas destas moda- lidades, o componente imunomodulador é um HLA-DP, HLA-DQ, HLA- DR ou um derivado do mesmo.
[00199] Em várias modalidades, o componente imunomodulador pode ser um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um polissacarídeo, um lipídio, uma molécula pequena ou uma toxina.
[00200] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador pode ser uma proteína, um peptídeo, um glicolipídeo ou uma glicopro- teina.
[00201] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um agonista. Em algumas destas modalidades, o agonista é um ago- nista endógeno, como um hormônio ou um neurotransmissor. Em al- gumas outras destas modalidades, o agonista é um agonista exógeno, como um fármaco. Em algumas modalidades, o agonista é um agonis- ta físico, que pode criar uma resposta agonista sem se ligar ao recep- tor. Em algumas modalidades, o agonista é um superagonista, que pode produzir uma resposta máxima maior que o agonista endógeno. Em certas modalidades, o agonista é um agonista completo com eficá- cia total no receptor. Em certas outras modalidades, o agonista é um agonista parcial tendo apenas eficácia parcial no receptor em relação a um agonista completo. Em algumas modalidades, o agonista é um agonista inverso que pode inibir a atividade constitutiva do receptor. Em algumas modalidades, o agonista é um coagonista que trabalha com outros coagonistas para produzir um efeito no receptor. Em certas modalidades, o agonista é um agonista irreversível que se liga perma- nentemente a um receptor através da formação de ligação covalente. Em certas modalidades, o agonista é agonista seletivo para um tipo específico de receptor.
[00202] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um antagonista. Em algumas destas modalidades, o antagonista é um antagonista competitivo, que se liga de forma reversível ao receptor no mesmo sítio de ligação que o ligante ou agonista endógeno sem ativar o receptor. O antagonista competitivo pode afetar a quantidade de agonista necessária para alcançar uma resposta máxima. Em algumas outras destas modalidades, o antagonista é um antagonista não com- petítivo, que se liga a um sítio ativo do receptor ou a um sítio alostérico do receptor. O antagonista não competitivo pode reduzir a magnitude da resposta máxima que pode ser alcançada por qualquer quantidade de agonista. Em algumas outras modalidades, o antagonista é um an- tagonista não competitivo, que requer a ativação do receptor por um agonista antes de sua ligação a um sítio de ligação alostérico separa- do.
[00203] Em várias modalidades, o componente imunomodulador compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno. O componente imunomodulador pode ser uma proteína de comprimento completo ou um fragmento da mesma. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de fontes naturais ou produzido de modo parcial ou totalmente sintético. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas destas modalida- des, o anticorpo monoclilonal é um anticorpo de IgG. Em certas modali- dades, o anticorpo monoclonal é um IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo policlonal. Em certas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é selecio- nado dentre Fab, Fab' e F(ab')a, F(ab1)2, Fv, dAb e Fd. Em certas mo- dalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento scFv ou (scFv)2. Em certas outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um Nanobodyº (anticorpo de domínio único). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao an- tígeno é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico.
[00204] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de liga- ção ao antígeno é totalmente humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é humanizado. Em al- gumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é quimérico. Em algumas destas modalidades, o anticorpo quimérico tem domínios da região V não humanos e domínios da região C hu- manos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é não humano, como murino ou veterinário.
[00205] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é um polinucleotídeo. Em algumas destas modalidades, o polinucleotí- deo inclui, mas não está limitado a, um mMRNA, um miRNA, um siRNA,
um RNA antissenso, um sShRNA, um IncRNA e um dsDNA. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA (por exemplo, um MRNA, um miRNA, um siRNA, um RNA antissenso, um ShRNA ou um INncRNA). Em algumas destas modalidades, quando o polinucleotídeo é um mRNA, ele pode ser traduzido em um polipeptídeo desejado. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é uma molécula de microRNA (MIRNA) ou pré-miRNA. Em algumas destas modalidades, o miRNA é entregue ao citoplasma da célula-alvo, de modo que a molécula de MIRNA possa silenciar um mMRNA nativo na célula-alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA pequeno interferente (siR- NA) ou um RNA em formato de grampo curto (ShRNA) capaz de inter- ferir com a expressão de um oncogene ou outros polipeptídeos desre- guladores. Em algumas destas modalidades, o siRNA é entregue ao citoplasma da célula-alvo, de modo que a molécula de siRNA possa silenciar um mRNA nativo na célula-alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA antissenso que é complementar a um MRNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA longo não codificante (IncºRNA) capaz de regular a expressão gênica e mo- dular doenças. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um DNA que pode ser transcrito em um RNA. Em algumas destas modalidades, o RNA transcrito pode ser traduzido em um polipeptídeo desejado.
[00206] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é uma proteína, um peptídeo, um glicolipídeo ou uma glicoproteína.
[00207] Em várias modalidades, a composição compreende dois ou mais componentes imunomoduladores mencionados acima, incluindo misturas, fusões, combinações e conjugados de átomos, moléculas, etc. Em algumas modalidades, a composição compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze compo- nentes imunomoduladores diferentes associados à membrana ou fe- chados dentro do volume fechado da referida vesícula extracelular. Em certas modalidades, a composição compreende um ácido nucleico combinado com um polipeptídeo. Em certas modalidades, a composi- ção compreende dois ou mais polipeptídeos conjugados entre si. Em certas modalidades, a composição compreende uma proteína conju- gada a uma molécula biologicamente ativa. Em algumas destas moda- lidades, a molécula biologicamente ativa é um pró-fármaco.
[00208] Em algumas modalidades, a composição compreende dois componentes imunomoduladores diferentes associados à membrana ou fechados dentro do volume fechado da referida vesícula extracelu- lar. Em certas modalidades, os dois componentes imunomoduladores diferentes são I1L-12 e CD40L. Em algumas modalidades, o CD40L e IL-12 são fundidos a PTGFRN ou um fragmento do mesmo, respecti- vamente. Em algumas modalidades, o CD40L e IL-12 são fundidos ao terminal N do PTGFRN ou um fragmento do mesmo, respectivamente. Em algumas modalidades, o CD40L e IL-12 são expressos como pro- teínas de fusão para PTGFRN, em que os polipeptídeos têm as se- quências da SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:3, respectivamente.
[00209] Em algumas modalidades, a composição compreende três componentes imunomoduladores diferentes associados à membrana ou fechados dentro do volume fechado da referida vesícula extracelu- lar. Em certas modalidades, os dois componentes imunomoduladores diferentes são I1L-12, CD40L e ligante de tirosina quinase 3 tipo FMS (FLT3L). Em algumas modalidades, o CD40L, IL-12 e FLT3L são fun- didos a PTGFRN ou um fragmento do mesmo, respectivamente. Em algumas modalidades, o CD40L, I1L-12 e FLT3L são fundidos ao termi- nal N do PTGFRN ou um fragmento do mesmo, respectivamente. Em algumas modalidades, o CD40L, IL-12 e FLT3L são expressos como proteínas de fusão para PTGFRN, em que os polipeptídeos têm as se- quências da SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:3 e a SEQ ID NO:22, respec- tivamente.
A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[00210] As composições farmacêuticas geralmente compreendem uma pluralidade de vesículas extracelulares e um excipiente ou carre- ador farmaceuticamente aceitável em uma forma adequada para ad- ministração a um indivíduo. Excipientes e carreadores farmaceutica- mente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição parti- cular sendo administrada, bem como pelo método particular usado pa- ra administrar a composição. Por conseguinte, existe uma grande vari- edade de formulações adequadas de composições farmacêuticas compreendendo uma pluralidade de vesículas extracelulares. (Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21º ed. (2005)). As composições farmacêuticas são ge- ralmente formuladas estéreis e em total conformidade com todos os regulamentos das Boas Práticas de Fabricação (GMP) da Administra- ção de Alimentos e Fármacos dos Estados Unidos (U. S. Food and Drug Administration).
[00211] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais agentes terapêuticos e a vesícula extracelu- lar aqui descrita. Em algumas modalidades, as vesículas extracelula- res são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos sepa- rados, em que a coadministração inclui a administração do agente te- rapêutico separado antes, depois ou concorrente da administração das vesículas extracelulares.
[00212] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem excipien- tes que são geralmente seguros, não tóxicos e desejáveis, incluindo excipientes aceitáveis para uso veterinário, bem como para uso farma- cêutico humano.
[00213] Os exemplos de carreadores ou diluentes incluem, porém sem limitação, água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana a 5%. A utilização de tais meios e compostos para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhe- cida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou compos- to convencional é incompatível com as vesículas extracelulares aqui descritas, é contemplado seu uso nas composições. Agentes terapêu- ticos suplementares também podem ser incorporados nas composi- ções. Tipicamente, uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. As vesículas extracelulares podem ser administradas por via parentérica, tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intradérmica, transdérmi- ca, retal, intracraniana, intraperitoneal, intranasal, intratumoral, intra- muscular ou como inalantes. Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreendendo vesículas extracelulares é administrada por via intravenosa, por exemplo, por injeção. As vesículas extracelula- res podem opcionalmente ser administradas em combinação com ou- tros agentes terapêuticos que são pelo menos parcialmente eficazes no tratamento da doença, distúrbio ou afecção para a qual as vesícu- las extracelulares são destinadas.
[00214] As soluções ou suspensões podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; compostos antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; compostos quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracé- tico (EDTA); tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e com- postos para o ajuste da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dex- trose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação pode ser contida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.
[00215] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá-
vel incluem soluções aquosas estéreis (se solúveis em água) ou dis- persões e pós estéreis. Para a administração intravenosa, carreadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Ccremophor EL'TY (BASF, Parsippany, N. J.) ou solução salina tamponada com fos- fato (PBS). A composição é geralmente estéril e fluida na medida em que existe fácil seringabilidade. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglico| e polietilenoglico! líquido e similares) e suas misturas apropriadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pe- la manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de disper- são e pela utilização de tensoativos. O impedimento da ação de micro- organismos pode ser alcançado por vários compostos antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido as- córbico, timerossal e semelhantes. Se desejado, compostos isotôni- cos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol e clore- to de sódio, podem ser adicionados à composição. A absorção prolon- gada das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão, na composição, de um composto que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00216] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas in- corporando as vesículas extracelulares em uma quantidade eficaz e em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredien- tes aqui enumerados, conforme desejado. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando as vesículas extracelulares em um veí- culo estéril que contém um meio de dispersão básico e quaisquer ou- tros ingredientes desejados. No caso de pós estéreis para a prepara- ção de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada anteriormente estéril dos mesmos. As vesículas extra- celulares podem ser administradas na forma de uma injeção de depó- sito ou preparação de implante que pode ser formulada de maneira a permitir uma liberação sustentada ou pulsátil das vesículas extracelu- lares.
[00217] A administração sistêmica de composições compreendendo vesículas extracelulares também pode ser por meios transmucosos. Para a administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetran- tes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, pa- ra administração transmucosal, derivados do ácido fusídico, detergen- tes, e sais biliares. A administração transmucosa pode ser realizada através do uso, por exemplo, de aspersões nasais.
[00218] Em certas modalidades, a composição farmacêutica com- preendendo vesículas extracelulares é administrada por via intraveno- sa em um indivíduo que se beneficiaria da composição farmacêutica. Em certas outras modalidades, a composição é administrada ao sis- tema linfático, por exemplo, por injeção intralinfática ou por injeção in- tranodal (ver, por exemplo, Senti et al, PNAS 105 (46):17908 (2008)), ou por injeção intramuscular, por administração subcutânea, por inje- ção intratumoral, por injeção direta no timo ou no fígado.
[00219] Em certas modalidades, a composição farmacêutica com- preendendo vesículas extracelulares é administrada como uma sus- pensão líquida. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como uma formulação que é capaz de formar um depósi- to após a administração. Em certas modalidades preferidas, o depósito libera lentamente as vesículas extracelulares na circulação ou perma- nece na forma de depósito.
[00220] Tipicamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis são altamente purificadas para estarem livres de contaminantes, são biocompatíveis e não são tóxicas e são adequadas para administração a um indivíduo. Se a água for um constituinte do carreador, a água é altamente purificada e processada para estar livre de contaminantes, por exemplo, endotoxinas.
[00221] O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, metil celulose, benzoato de metil-hidróxi, benzoato de propil-hidróxi, talco, estearato de magnésio e / ou óleo mineral, mas sem limitações. A composição farmacêutica pode ainda incluir um lubrificante, um agente umectante, um adoçante, um intensificador de sabor, um agente emulsificante, um agente de suspensão e / ou um conservante.
[00222] As composições farmacêuticas aqui descritas compreen- dem as vesículas extracelulares aqui descritas e, opcionalmente, um agente farmaceuticamente ativo ou terapêutico. O agente terapêutico pode ser um agente biológico, um agente de molécula pequena ou um agente de ácido nucleico.
[00223] São fornecidas formas de dosagem que compreendem uma composição farmacêutica compreendendo as vesículas extracelulares aqui descritas. Em algumas modalidades, a forma de dosagem é for- mulada como uma suspensão líquida para injeção intravenosa. Em algumas modalidades, a forma de dosagem é formulada como uma suspensão líquida para injeção intratumoral.
[00224] Em certas modalidades, a preparação de vesículas extrace- lulares é sujeita a radiação, por exemplo, raios X, raios gama, partícu- las beta, partículas alfa, nêutrons, prótons, núcleos elementares, raios UV, a fim de danificar os ácidos nucleicos competentes para replica- ção residual.
[00225] Em certas modalidades, a preparação de vesículas extrace-
lulares é sujeita a irradiação gama usando uma dose de irradiação de mais de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais de 100 kGy.
[00226] Em certas modalidades, a preparação de vesículas extrace- lulares é sujeita à irradiação de raios X usando uma dose de irradiação de mais de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 ou superior a 10000 mSv.
MÉTODOS
[00227] Aspectos da presente divulgação também incluem métodos de produção da composição compreendendo a vesícula extracelular e o componente imunomodulador. Em algumas modalidades, o método compreende: obter a vesícula extracelular da célula produtora, em que a célula produtora contém naturalmente o componente imunomodula- dor; e opcionalmente isolar a vesícula extracelular obtida. Em algumas modalidades, o método compreende: modificar uma célula produtora com o componente imunomodulador; obter a vesícula extracelular a partir da célula produtora modificada; e opcionalmente isolar as vesí- culas extracelulares obtidas. Em algumas outras modalidades, o mé- todo compreende: obter a vesícula extracelular de uma célula produto- ra; isolar as vesículas extracelulares obtidas; e modificar a vesícula extracelular isolada com o componente imunomodulador. Em certas modalidades, o método compreende ainda formular as vesículas ex- tracelulares isoladas em uma composição farmacêutica.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES MÉTODOS DE MODIFICAÇÃO DA CÉLULA PRODUTORA COM O COMPONENTE IMUNOMODULADOR
[00228] Em várias modalidades, o método compreende a modifica- ção de uma célula produtora com o componente imunomodulador.
[00229] A célula produtora pode ser uma linhagem celular de mamí-
fero, uma linhagem celular de planta, uma linhagem celular de inseto, uma linhagem celular de fungos ou uma linhagem celular procariótica. Em certas modalidades, a célula produtora é uma linhagem celular de mamífero. As linhagens celulares de mamíferos incluem, entre outras, uma linhagem celular de rim embrionário humano (HEK), uma linha- gem celular de ovário de hamster chinês (CHO), uma linhagem celular HT-1080, uma linhagem celular HeLa, uma linhagem celular PERC-6, uma linhagem celular CEVEC, uma linhagem celular fibroblástica, li- nhagem celular amniócita, uma linhagem celular epitelial e uma linha- gem celular mesenquimal de células-tronco (MSC). Em algumas mo- dalidades preferidas, a linhagem celular de mamíferos pode ser célu- las HEK-293, células de fibroblastos de prepúcio humano BJ, células de fibroblastos de fHDF, células precursoras neuronais AGE. HNº, cé- lulas de amniócitos de CAPº, células-tronco mesenquimais adiposas ou células RPTEC / TERT1. A célula produtora também pode ser uma célula primária. Em várias modalidades, a célula primária pode ser uma célula primária de mamífero, uma célula primária de planta, uma célula primária de inseto, uma célula primária de fungos ou uma célula procariótica primária.
[00230] Em certas modalidades preferidas, a célula produtora é uma célula imune, como uma célula dendrítica, uma célula T, uma cé- lula B, uma célula assassina natural (célula NK), uma célula apresen- tadora de antígeno, um macrófago, uma célula T auxiliar ou uma célula T reguladora (célula Treg).
[00231] Em várias modalidades, o componente imunomodulador pode ser expresso em uma célula produtora a partir de um transgene ou mRNA introduzido na célula produtora por transfecção, transdução viral, eletroporação, extrusão, sonicação, fusão celular ou outros mé- todos conhecidos pelos versados na técnica.
[00232] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por transfecção. Em algumas modali- dades, o componente imunomodulador pode ser introduzido em célu- las produtoras adequadas usando macromoléculas sintéticas, como lipídios e polímeros catiônicos (Papapetrou et al, Gene Therapy 12:8118-S8130 (2005)). Em algumas modalidades, os lipídios catiôni- cos formam complexos com o componente imunomodulador através de interações de carga. Em algumas destas modalidades, os comple- xos carregados positivamente se ligam à superfície celular carregada negativamente e são absorvidos pela célula por endocitose. Em algu- mas outras modalidades, um polímero catiônico pode ser usado para transfectar células produtoras. Em algumas destas modalidades, o po- límero catiônico é polietilenimina (PEI). Em certas modalidades, produ- tos químicos como fosfato de cálcio, ciclodextrina ou polibreno, podem ser usados para introduzir o componente imunomodulador nas células produtoras. O componente imunomodulador também pode ser introdu- zido em uma célula produtora usando um método físico, como trans- fecção mediada por partículas, "arma de genes", biolística ou tecnolo- gia de bombardeio de partículas (Papapetrou et a/.,, Gene Therapy 12:8118-S130 (2005)). Um gene repórter como, por exemplo, beta- galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase, luciferase ou proteína verde fluorescente pode ser usado para avaliar a eficiência da trans- fecção da célula produtora.
[00233] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por transdução viral. Vários vírus po- dem ser usados como veículos de transferência de genes, incluindo o vírus da leucemia murina moloney (MMLV), adenovírus, vírus adeno- associado (AAV), vírus do herpes simplex (HSV), lentivírus e espuma- vírus. Os veículos de transferência de genes mediados por vírus com- preendem vetores baseados em vírus de DNA, como adenovírus, vírus adenoassociado e vírus da herpes, bem como vetores baseados em retrovirais.
[00234] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por eletroporação. A eletroporação cria poros transitórios na membrana celular, permitindo a introdução de várias moléculas na célula. Em algumas modalidades, o DNA e o RNA, bem como os agentes terapêuticos polipeptídicos e não polipep- tídicos, podem ser introduzidos na célula produtora por eletroporação.
[00235] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por microinjeção. Em algumas modali- dades, uma micropipeta de vidro pode ser usada para injetar o com- ponente imunomodulador na célula produtora no nível microscópico.
[00236] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por extrusão.
[00237] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por sonicação. Em algumas modalida- des, a célula produtora é exposta a ondas sonoras de alta intensidade, causando ruptura transitória da membrana celular, permitindo o carre- gamento de um componente imunomodulador.
[00238] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por fusão celular. Em algumas modali- dades, o componente imunomodulador é introduzido por fusão elétrica de células. Em algumas outras modalidades, o polietileno glicol (PEG) é usado para fundir as células produtoras. Em algumas outras modali- dades, o vírus sendai é usado para fundir as células produtoras.
[00239] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por lise hipotônica. Em algumas des- tas modalidades, a célula produtora é exposta a um tampão de baixa força iônica, fazendo com que exploda, permitindo o carregamento de um componente imunomodulador. Em algumas modalidades alternati- vas, a diálise controlada contra uma solução hipotônica é usada para inchar a célula produtora e criar poros na membrana da célula produto- ra. A célula produtora é subsequentemente exposta a condições que permitem vedar novamente a membrana.
[00240] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por tratamento com detergente. Em certas modalidades, a célula produtora é tratada com um detergente suave que compromete transitoriamente a membrana da célula produ- tora criando poros que permitem o carregamento de um componente imunomodulador. Depois que as células produtoras são carregadas, o detergente é lavado, revedando a membrana.
[00241] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por endocitose mediada por receptor. Em certas modalidades, as células produtoras têm um receptor de su- perfície que mediante a ligação do componente imunomodulador induz a internalização do receptor e do componente imunomodulador asso- ciado.
[00242] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na célula produtora por filtração. Em certas modalidades, as células produtoras e o componente imunomodulador podem ser forçados através de um filtro de tamanho de poro menor que a célula produtora, causando ruptura transitória da membrana de célula produ- tora e permitindo que o componente imunomodulador entre na célula produtora.
[00243] Em algumas modalidades, a célula produtora é submetida a vários ciclos de congelamento e descongelamento, resultando em rup- tura da membrana celular, permitindo o carregamento de um compo- nente imunomodulador.
MÉTODOS DE MODIFICAÇÃO DA VESÍCULA EXTRACELULAR COM O COMPONENTE IMUNOMODULADOR
[00244] Em várias modalidades alternativas, o componente imuno-
modulador é introduzido diretamente nas vesículas extracelulares após o isolamento das vesículas extracelulares.
[00245] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por transfecção. Em algumas mo- dalidades, o componente imunomodulador pode ser introduzido nas vesículas extracelulares usando macromoléculas sintéticas, como lipí- dios e polímeros catiônicos (Papapetrou et a/., Gene Therapy 12:8118- S8S130 (2005)). Em certas modalidades, produtos químicos como fosfato de cálcio, ciclodextrina ou polibreno, podem ser usados para introduzir o componente imunomodulador nas vesículas extracelulares.
[00246] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por eletroporação. Em algumas modalidades, as vesículas extracelulares são expostas a um campo elétrico que causa orifícios transitórios na membrana da vesícula ex- tracelular, permitindo o carregamento de um componente imunomodu- lador.
[00247] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por microinjeção. Em algumas modalidades, uma micropipeta de vidro pode ser usada para injetar o componente imunomodulador diretamente na vesícula extracelular no nível microscópico.
[00248] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por extrusão.
[00249] Em certas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por sonicação. Em algumas mo- dalidades, vesículas extracelulares são expostas a ondas sonoras de alta intensidade, causando ruptura transitória da membrana da vesícu- la extracelular, permitindo o carregamento de um componente imuno- modulador.
[00250] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador
T4/176 pode ser conjugado com a superfície da vesícula extracelular. A con- jugação pode ser alcançada química ou enzimaticamente por métodos conhecidos na técnica.
[00251] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular compre- ende um componente imunomodulador que é quimicamente conjuga- do. A conjugação química pode ser realizada por ligação covalente do componente imunomodulador a outra molécula, com ou sem o uso de um aglutinante. A formação de tais conjugados é da competência dos técnicos e são conhecidas várias técnicas para realizar a conjugação, com a escolha da técnica particular sendo guiada pelos materiais a serem conjugados. Em certas modalidades, os polipeptídeos são con- jugados com a vesícula extracelular. Em certas outras modalidades, não polipeptídeos, como lipídios, carboidratos, ácidos nucleicos e mo- léculas pequenas, são conjugados com a vesícula extracelular.
[00252] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por lise hipotônica. Em algumas destas modalidades, as vesículas extracelulares são expostas a um tampão de baixa força iônica, fazendo com que explodam, permitindo O carregamento de um componente imunomodulador. Em algumas modalidades alternativas, a diálise controlada contra uma solução hi- potônica é usada para inchar a vesícula extracelular e criar poros na membrana da vesícula extracelular. A vesícula extracelular é subse- quentemente exposta a condições que permitem vedar novamente a membrana.
[00253] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por tratamento com detergente. Em certas modalidades, as vesículas extracelulares são tratadas com um detergente suave que compromete transitoriamente a membrana da vesícula extracelular, criando poros que permitem o carregamento de um componente imunomodulador. Após as vesículas extracelulares serem carregadas, o detergente é lavado, revedando a membrana.
[00254] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por endocitose mediada por re- ceptor. Em certas modalidades, as vesículas extracelulares têm um receptor de superfície que, mediante a ligação do componente imuno- modulador, induz a internalização do receptor e do componente imu- nomodulador associado.
[00255] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por disparo mecânico. Em certas modalidades, vesículas extracelulares podem ser bombardeadas com um componente imunomodulador ligado a uma partícula pesada ou carregada, como microcarreadores de ouro. Em algumas destas mo- dalidades, a partícula pode ser acelerada mecânica ou eletricamente, de modo que atravesse a membrana da vesícula extracelular.
[00256] Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é introduzido na vesícula extracelular por filtração. Em certas modali- dades, as vesículas extracelulares e o componente imunomodulador podem ser forçados através de um filtro de tamanho de poro menor que a vesícula extracelular, causando ruptura transitória da membrana da vesícula extracelular e permitindo que o componente imunomodu- lador entre na vesícula extracelular.
[00257] Em algumas modalidades, as vesículas extracelulares são submetidas a vários ciclos de congelamento e descongelamento, re- sultando em ruptura da membrana da vesícula extracelular, permitindo o carregamento de um componente imunomodulador. MÉTODOS DE ISOLAMENTO DAS VESÍCULAS EXTRACELULA-
RES
[00258] As vesículas extracelulares podem ser isoladas das células produtoras. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é liberada pela célula produtora no meio de cultura celular. É contemplado que todas as maneiras conhecidas de isolamento de vesículas extracelula- res são consideradas adequadas para uso no presente documento. Por exemplo, propriedades físicas de vesículas extracelulares podem ser empregadas para separá-las de um meio ou outro material de fon- te, incluindo a separação com base na carga elétrica (por exemplo, separação eletroforética), tamanho (por exemplo, filtração, peneiração molecular, etc.), densidade (por exemplo, centrifugação regular ou gradiente), constante de Svedberg (por exemplo, sedimentação com ou sem força externa, etc.). Alternativa ou adicionalmente, o isolamen- to pode ser baseado numa ou mais propriedades biológicas e incluir métodos que podem empregar marcadores de superfície (por exem- plo, para precipitação, ligação reversível à fase sólida, separação FACS, ligação a ligante específico, ligação a ligante não específico, purificação por afinidade etc.).
[00259] O isolamento e o enriquecimento podem ser feitos de ma- neira geral e não seletiva, tipicamente incluindo centrifugação em sé- rie. Alternativamente, o isolamento e o enriquecimento podem ser fei- tos de uma maneira mais específica e seletiva, como o uso de vesícula extracelular ou marcadores de superfície específicos de célula produ- tora. Por exemplo, marcadores de superfície específicos podem ser usados em imunoprecipitação, classificação FACS, purificação por afi- nidade e separação magnética com ligantes ligados a microesferas.
[00260] Em algumas modalidades, cromatografia de exclusão de tamanho pode ser usada para isolar as vesículas extracelulares. As técnicas de cromatografia de exclusão por tamanho são conhecidas na técnica. Técnicas exemplificativas e não limitantes são fornecidas no presente documento. Em algumas modalidades, uma fração de volu- me vazio é isolada e compreende as vesículas extracelulares de inte- resse. Além disso, em algumas modalidades, as vesículas extracelula- res podem ser ainda mais isoladas após a separação cromatográfica
TTIINT6 por técnicas de centrifugação (de uma ou mais frações de cromatogra- fia), como é geralmente conhecido na técnica. Em algumas modalida- des, por exemplo, a centrifugação em gradiente de densidade pode ser utilizada para isolar ainda mais as vesículas extracelulares. Em certas modalidades, pode ser desejável separar adicionalmente as ve- sículas extracelulares derivadas de células produtoras de vesículas extracelulares de outra origem. Por exemplo, as vesículas extracelula- res derivadas de células produtoras podem ser separadas das vesícu- las extracelulares não derivadas de células produtoras por captura imunossorvente utilizando um anticorpo de antígeno específico para a célula produtora.
[00261] Em algumas modalidades, o isolamento de vesículas extra- celulares pode envolver combinações de métodos que incluem, mas não se limitam a centrifugação diferencial, filtração por membrana ba- seada em tamanho, imunoprecipitação, classificação FACS e separa- ção magnética. MÉTODOS DE MEDIÇÃO DO TAMANHO DAS VESÍCULAS EX-
TRACELULARES
[00262] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos com- preendem a medição do tamanho de vesículas extracelulares e / ou populações de vesículas extracelulares. Geralmente, o tamanho da vesícula extracelular é medido como a maior dimensão mensurável. Geralmente, a maior dimensão mensurável de uma vesícula extracelu- lar também é referida como seu diâmetro.
[00263] O tamanho da vesícula extracelular pode ser medido usan- do o espalhamento dinâmico de luz (DLS) e / ou espalhamento de luz multiangular (MALS). Os métodos de utilização do DLS e / ou MALS para medir o tamanho das vesículas extracelulares são conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem o ensaio de rastreamento de nanopartículas (NTA, por exemplo, usando um dispositivo de rastrea-
mento de nanopartículas Malvern NanoSight NS300). Numa modalida- de específica, o tamanho da vesícula extracelular é determinado usando um Malvern NanoSight NS300. Em algumas modalidades, as vesículas extracelulares descritas aqui têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight NS300). Em outras modalidades, as vesículas extracelulares descritas aqui têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight NS300). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 300 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight NS300). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 95% das vesículas extracelula- res têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight NS300). Em outras modalidades, as populações de vesículas extrace- lulares descritas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Mal- vern NanoSight NS300). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight NS300). Em outras modali- dades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas com- preendem uma população, em que 95% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Malvern NanoSight
NS300). Em outras modalidades, as populações de vesículas extrace- lulares descritas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo NTA (por exemplo, usando um Mal- vern NanoSight NS300).
[00264] O tamanho da vesícula extracelular pode ser medido usan- do detecção de pulso resistivo ajustável (TRPS). Numa modalidade específica, o tamanho da vesícula extracelular conforme medido por TRPS é determinado usando um iZON qNANO Gold. Em algumas modalidades, as vesículas extracelulares descritas aqui têm uma di- mensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido por TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras moda- lidades, as vesículas extracelulares aqui descritas têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido por TRPS (por exemplo, um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as popula- ções de vesículas extracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimen- são mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas compreen- dem uma população, em que 95% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelula- res têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as populações de vesículas ex- tracelulares aqui descritas compreendem uma população, em que 95% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold). Em outras modalidades, as populações de ve- sículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido pelo TRPS (por exemplo, usando um iZON qNano Gold).
[00265] O tamanho das vesículas extracelulares pode ser medido usando microscopia de elétron. Em algumas modalidades, o método de microscopia de elétron usado para medir o tamanho da vesícula extracelular é a microscopia de elétron de transmissão. Numa modali- dade específica, o microscópio de elétron de transmissão usado para medir o tamanho da vesícula extracelular é um Tecnai "M G? Spirit Bi- OTWIN. Os métodos para medir o tamanho da vesícula extracelular usando um microscópio de elétron são bem conhecidos pelos versa- dos na técnica e qualquer destes métodos podem ser apropriados pa- ra medir o tamanho da vesícula extracelular. Em algumas modalida- des, as vesículas extracelulares descritas aqui têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido por um micros- cópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredura Tecnai'y G? Spirit BioTWIN). Em outras modalidades, as vesículas extracelulares aqui descritas têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm conforme medido por um microscópio de elé- tron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredu- ra Tecnai "mM G? Spirit BIOTWIN). Em outras modalidades, as popula- ções de vesículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimen-
são mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio eletrônico de varredura Tecnai!y G? Spirit BioTWIN )JEm outras moda- lidades, as populações de vesículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 95% das vesículas extracelula- res têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredura Tecnai "'M G? Spirit BIOTWIN JEm outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares descri- tas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 20 a 300 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredura Tecnai "" G? Spirit BioTWIN )JEm outras modalidades, as populações de vesículas extra- celulares descritas aqui compreendem uma população, em que 90% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio eletrônico de varredura Tec- nai'y G? Spirit BioTWIN). Em outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 95% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredura Tecnai "mM G? Spirit BioTWIN )JEm outras modalidades, as populações de vesículas extracelulares descritas aqui compreendem uma população, em que 99% das vesículas extracelulares têm uma dimensão mais longa de cerca de 40 a 200 nm, conforme medido por um microscópio de elétron de varredura (por exemplo, um microscópio de elétron de varredura Tecnaity G? Spirit BIoTWIN).
MÉTODOS DE TRATAMENTO DE CÂNCER, GVHD E DOENÇA AU- TOIMUNE
[00266] Além disto, são fornecidos no presente documento, méto- dos de tratamento de câncer, doença do enxerto contra hospedeiro (GvHD) e doença autoimune em um indivíduo.
[00267] Em várias modalidades, a composição é administrada a um indivíduo com câncer. Em algumas destas modalidades, a composição pode regular de modo crescente uma resposta imune e melhorar o al- vejamento do tumor do sistema imunológico do indivíduo. Em algumas modalidades, o câncer sendo tratado é caracterizado pela infiltração de leucócitos (células T, células B, macrófagos, células dendríticas, monócitos) no microambiente do tumor ou os chamados "tumores quentes" ou "tumores inflamatórios". Em algumas modalidades, o câncer sendo tratado é caracterizado por baixos níveis ou níveis inde- tectáveis de infiltração de leucócitos no microambiente tumoral, ou os chamados "tumores frios" ou "tumores não inflamatórios". Em algu- mas modalidades, a composição é administrada em uma quantidade e por um tempo suficiente para converter um "tumor frio" em um "tumor quente", isto é, a referida administração resulta na infiltração de leucó- citos (como células T) no microambiente de tumor.
[00268] Em algumas modalidades, a composição compreendendo uma vesícula extracelular e um componente imunomodulador é admi- nistrada a um indivíduo como uma vacina contra o câncer. Em algu- mas destas modalidades, a composição é administrada a um indivíduo como uma vacina personalizada contra o câncer. Em algumas modali- dades, o componente imunomodulador é um antígeno tumoral ou um peptídeo derivado de um antígeno tumoral. Os exemplos adequados de antígenos tumorais incluem: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno car- cinoembrionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Th-MUC1, mucina 16 (MUC16) , tirosinase, antígeno associ- ado ao melanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CD4, CD8,
CD45, CD80, CD86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno do testículo canceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de refe- rência. Em certas modalidades, o antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma do indivíduo que recebe a composição.
[00269] Os cânceres que podem ser tratados com a composição incluem, mas sem limitações, aos cânceres listados na Tabela 5.
[00270] Em certas modalidades, a composição é administrada a um indivíduo com doença de enxerto contra hospedeiro (GvHD). Em al- gumas destas modalidades, a composição pode regular de modo de- crescente uma resposta imune e aliviar os sintomas de GvHD. Em al- gumas modalidades específicas, a composição alivia os sintomas de GvHD através da ativação da sinalização apoptótica. Em certas moda- lidades, a composição para o tratamento de GvHD compreende o |li- gante Fas (FasL). Em algumas destas modalidades, o FasL é expres- so na superfície da vesícula extracelular.
[00271] Em várias modalidades, a composição é administrada a um indivíduo com uma doença autoimune. Em algumas destas modalida- des, a composição pode regular de modo decrescente uma resposta imune e suprimir a atividade imune do indivíduo.
[00272] As doenças autoimunes incluem, mas sem limitações, es- clerose múltipla, neurite periférica, síndrome de Sjógren, artrite reuma- toide, alopecia, pancreatite autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Devic (neuromielite óptica), glo- merulonefrite, nefropatia de IgA, vasculites variadas, esclerodermia, diabetes, arterite, vitiligo, colite ulcerosa, síndrome do intestino irritá- vel, psoríase, uveite e lúpus eritematoso sistêmico.
[00273] Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intravenosa ao sistema circulatório do indivíduo. Em algumas modalidades, a composição é infundida em líquido adequado e admi- nistrada em uma veia do indivíduo.
[00274] Em algumas modalidades, a composição é administrada intra-arterialmente ao sistema circulatório do indivíduo. Em algumas modalidades, a composição é infundida em líquido adequado e admi- nistrada em uma artéria do indivíduo.
[00275] Em algumas modalidades, a composição é administrada ao indivíduo por administração intratecal. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma injeção no canal espinhal ou no espaço subaracnoideo, de modo que atinja o líquido cefalorra- quidiano (LCR).
[00276] Em algumas modalidades, a composição é administrada intratumoralmente em um ou mais tumores do indivíduo.
[00277] Em algumas modalidades, a composição é administrada ao indivíduo por administração intranasal. Em algumas modalidades, a composição pode ser insuflada através do nariz em uma forma de ad- ministração tópica ou administração sistêmica. Em certas modalida- des, a composição é administrada como aspersão nasal.
[00278] Em algumas modalidades, a composição é administrada ao indivíduo por administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, a composição é infundida em líquido adequado e injetada no peritônio do indivíduo. Em algumas modalidades, a referida administração intra- peritoneal resulta na distribuição da composição (por exemplo, as ve- sículas extracelulares na composição) para os linfáticos. Em algumas modalidades, a referida administração intraperitoneal resulta na distri- buição da composição (por exemplo, as vesículas extracelulares na composição) para o timo, baço e / ou medula óssea. Em algumas mo- dalidades, a referida administração intraperitoneal resulta na distribui-
ção da composição (por exemplo, as vesículas extracelulares na com- posição) para um ou mais linfonodos. Em algumas modalidades, a re- ferida administração intraperitoneal resulta na distribuição da composi- ção (por exemplo, as vesículas extracelulares na composição) para um ou mais dentre os linfonodos cervicais, linfonodos inguinais, linfonodos mediastinais ou linfonodos esternais. Em algumas modalidades, a re- ferida administração intraperitoneal resulta na distribuição da composi- ção (por exemplo, as vesículas extracelulares na composição) para o pâncreas.
[00279] Em algumas modalidades, a composição é administrada ao indivíduo por administração periocular. Em algumas modalidades, a composição é injetada nos tecidos perioculares. A administração peri- ocular de fármacos inclui as vias de administração subconjuntival, sub Tenon anterior, sub Tenon posterior e retrobulbar.
[00280] Em algumas modalidades, a composição é administrada no mesmo indivíduo por várias vias de administração. Em algumas moda- lidades, as referidas múltiplas vias de administração compreendem administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intratecal, administração intranasal, administração intratumoral, admi- nistração intraperitoneal e / ou periocular. Numa modalidade preferida, as referidas múltiplas vias de administração compreendem administra- ção intravenosa e administração intraperitoneal.
[00281] Em certas modalidades, a dosagem das vesículas extrace- lulares está entre 1 ng a 10 ng, 10 ng a 100 ng, 100 ng a 1 vo, 1 uga ug, 5 ug a 10 ug, 10 ug a 50 ug, 50 ug a 75 ug, 75 pg a 100 ug, 100 ug a 150 ug, 150 ug a 200 ug, 200 ug a 300 ug, 300 ug a 500 ug, 500 ug a a 1 mg ou 1 mg a 10 mg.
[00282] As composições podem ser administradas uma vez ao indi- víduo. Alternativamente, múltiplas administrações podem ser realiza- das durante um período de tempo. Por exemplo, duas, três, quatro,
cinco ou mais administrações podem ser dadas ao indivíduo. Em al- gumas modalidades, as administrações podem ser dadas conforme necessário, por exemplo, enquanto os sintomas associados à doença, distúrbio ou afecção persistirem. Em algumas modalidades, adminis- trações repetidas podem ser indicadas pelo restante da vida do indiví- duo. Os períodos de tratamento podem variar e podem ser, por exem- plo, não mais que um ano, seis meses, três meses, dois meses, um mês, duas semanas, uma semana, três dias, dois dias ou não mais que um dia.
[00283] Em certas modalidades, doses de vesículas extracelulares são administradas em intervalos como uma vez ao dia, em dias inter- calados, uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez por mês ou duas vezes por mês.
[00284] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a uma frequência suficiente para aumentar efetivamente a concentração do componente imunomodulador na célula ou tecido- alvo acima de um nível que está associado a um sintoma da doença, distúrbio ou afecção.
[00285] Em algumas modalidades, as composições são administra- das pelo menos duas vezes durante um período de tratamento, de modo que a doença, distúrbio ou afecção seja tratada ou um sintoma da mesma seja melhorado. Em algumas modalidades, as composições são administradas pelo menos duas vezes durante um período de tra- tamento, de modo que a doença, distúrbio ou afecção seja tratada ou um sintoma da mesma seja evitado. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada um número suficiente de ve- zes durante um período de tratamento, de modo que uma quantidade suficiente de componente imunomodulador seja entregue à célula ou tecido-alvo durante o período de tratamento. Em algumas modalida- des, a composição farmacêutica é administrada um número suficiente de vezes durante um período de tratamento, de modo que uma quan- tidade suficiente de componente imunomodulador seja entregue à cé- lula ou tecido-alvo durante o período de tratamento, de modo que um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou afecção sejam evitados, di- minuídos, melhorados ou retardados. Em algumas modalidades, au- mentar a concentração do componente imunomodulador na célula ou tecido- alvo inclui aumentar o pico de concentração, enquanto em ou- tras inclui aumentar a concentração média. Em algumas modalidades, um aumento substancial durante o período de tratamento pode ser de- terminado pela comparação de um período de pré-tratamento ou pós- tratamento no indivíduo, ou comparando medições feitas em uma po- pulação submetida a tratamento com uma população de controle não tratada correspondente.
[00286] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada um número suficiente de vezes por período de tratamen- to, de modo que a concentração do componente imunomodulador na célula ou tecido-alvo seja aumentada por pelo menos cerca de uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses ou mais que seis meses. Em algumas modalidades, a composição farmacêuti- ca é administrada um número suficiente de vezes por período de tra- tamento, de modo que a concentração do componente imunomodula- dor na célula ou tecido-alvo seja aumentada por um período de tempo pelo menos durante o período de tratamento.
[00287] Em algumas modalidades, o intervalo de tempo entre admi- nistrações repetidas dentro de um período de tratamento não é maior que o período em que o número de vesículas extracelulares em circu- lação é reduzido para menos de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% do número de vesículas extracelulares presentes em a composição farmacêutica administrada.
[00288] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda uma ou múltiplas doses de vesículas extracelulares não terapêuticas antes da injeção de uma dose terapêutica adequada de vesículas ex- tracelulares que abrigam um agente terapêutico. Em certas modalida- des, a vesícula extracelular não terapêutica é administrada separada- mente e em uma dosagem diferente das vesículas extracelulares tera- pêuticas. Em certas modalidades, a dosagem da vesícula extracelular não terapêutica é maior que a dosagem da vesícula extracelular tera- pêutica. Em certas outras modalidades, a dosagem da vesícula extra- celular não terapêutica é menor que a dosagem da vesícula extracelu- lar terapêutica. Em certas modalidades, a dosagem da vesícula extra- celular não terapêutica é a mesma que a vesícula extracelular terapêu- tica. Em várias modalidades, os métodos de vesículas extracelulares não terapêuticas antes da injeção de uma dose adequada de vesículas extracelulares terapêuticas reduzem a atualização das vesículas ex- tracelulares terapêuticas no fígado, pulmão e / ou baço.
[00289] “Uma quantidade eficaz da composição é fornecida com ba- se, pelo menos em parte, no tecido-alvo, tipo de célula-alvo, meios de administração, características físicas da vesícula extracelular (por exemplo, tamanho e, em alguns casos, a extensão das moléculas a serem entregues) e outros determinantes. Em geral, uma quantidade eficaz da composição fornece resposta celular eficiente da célula-alvo. O aumento da eficiência pode ser demonstrado pelo aumento da transfecção de células (isto é, a porcentagem de células transfectadas com os constituintes da vesícula extracelular), aumento da resposta celular ou redução da resposta imune inata do indivíduo hospedeiro.
[00290] A dosagem e a frequência da administração das vesículas extracelulares e composições farmacêuticas das mesmas podem ser determinadas, por exemplo, pelo médico assistente com base em vá-
rios fatores, como a gravidade da doença, idade do paciente, sexo e dieta, gravidade de qualquer inflamação, tempo de administração e outros fatores clínicos. Num exemplo, uma administração intravenosa é iniciada em uma dose que é minimamente eficaz e a dose é aumen- tada ao longo de um período de tempo pré-selecionado até que um efeito positivo seja observado. Posteriormente, aumentos incrementais na dosagem são feitos limitando os níveis que produzem um aumento correspondente no efeito, levando em consideração quaisquer efeitos adversos que possam aparecer.
EXEMPLOS
[00291] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a pro- porcionar aos elementos de habilidade comum na técnica uma divul- gação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços para garantir a precisão com relação aos números usados (por exem- plo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios expe- rimentais devem ser considerados. Salvo indicado de outra forma, as partes são partes em peso, peso molecular é a massa molecular mé- dia de peso, temperatura é em graus Celsius e pressão é atmosférica ou próxima. Abreviações padrão podem ser usadas, por exemplo, bp, par (es) de base; kb, kilobase (s); pl, picolitros; s ou segundo, segundo (s); min, minuto (s); h ou h, hora (s); aa, aminoácido (s); nt, nucleotídeo (s); e similar.
[00292] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, métodos convencionais de química de proteí- nas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro das habilidades da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Consultar, por exemplo, T. E. Creighton, Pro-
teins:Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Com- pany, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc. , current addition); Sambrook, et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2º Edição, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds. , Academic Press, Inc. ;Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 21º Edição (Easton, Pennsylvania:Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3º Ed. (Ple- num Press) Volumes A e B (1992).
MÉTODOS PURIFICAÇÃO DE EXOSSOMOS
[00293] O meio de cultura condicionado foi coletado e centrifugado a 300 a 800 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para remover células e detritos grandes. O sobrenadante do meio foi, então, suple- mentado com 1000 U / L Benzonaseº e incubado a 37 º C por 1 hora em banho de água. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 16. 000 xg por 30 minutos a 4 º C para remover detritos celulares residuais e outros contaminantes grandes. O sobrenadante foi, então, ultracen- trifugado a 133. 900 xg durante 3 horas a 4 º C para peletizar os exos- somos. O sobrenadante foi descartado e qualquer meio residual foi aspirado do fundo do tubo. O pélete foi ressuspenso em 200 a 1000 ul de PBS (-Ca-Mg).
[00294] Para enriquecer ainda mais as populações de exossomos, o pélete foi processado por meio de purificação por gradiente de den- sidade (sacarose ou Optiprep'"). Para purificação do gradiente de sacarose, o pélete de exossomo foi disposto em camadas sobre um gradiente de sacarose, conforme definido na Tabela 6 abaixo: TABELA 6, GRADIENTE DE DENSIDADE DE SACAROSE: lho (%) toque (mL)
lho (%) toque (mL)
[00295] O gradiente foi girado a 200. 000 xg por 16 horas a 4 º C em um tubo Ultra-Clear de 12 mL (344059) colocado em um rotor SW 41 Ti para separar a fração do exossomo.
[00296] A camada do exossomo foi removida suavemente da ca- mada superior e diluída em — 32,5 mL de PBS em um tubo Ultra-Clear de 38,5 mL (344058) e novamente ultracentrifugada a 133. 900 xg por 3 horas a 4 º C para peletizar os exossomos purificados. O pélete re- sultante foi ressuspenso em um volume mínimo de PBS (- 200 uL) e armazenado a 4º C.
[00297] Para o gradiente Optiprep "“, um gradiente estéril de três camadas foi preparado com volumes iguais de 10%, 30% e 45% de Optiprep em um tubo de 12 mL Ultra-Clear (344059) para um rotor SW 41 Ti. O pélete foi adicionado ao gradiente Optiprep "“ e ultracentrifu- gado a 200. 000 xg por 16 horas a 4 º C para separar a fração do exossomo. A camada do exossomo foi então cuidadosamente coleta- da do topo — 3 mL do tubo.
[00298] A fração de exossomo foi diluída em — 32 mL de PBS em um tubo Ultra-Clear de 38,5 mL (344058) e ultracentrifugada a 133. 900 xg por 3 horas a 4 º C para peletizar os exossomos purificados. Os exossomos peletizados foram então ressuspensos em um volume mí- nimo de PBS (- 200 uL) e armazenados a 4º C. EXEMPLO 1: EXOSSOMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS PA- RA EXIBIR UM ANTICORPO REGULADOR DE PONTO DE VERIFI-
CAÇÃO IMUNE
[00299] “Uma linhagem celular de rim embrionário humano (HEK) é cultivada até alta densidade, e os exossomos resultantes são isolados do meio de cultura de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica (por exemplo, os métodos aqui descritos). Os exossomos geneticamente modificados com anticorpo de proteína 4 (CTLA-4) as- sociado a linfócitos T citotóxicos são preparados por conjugação quíi- mica de acordo com as técnicas conhecidas na técnica. Os exosso- mos modificados com o anticorpo CTLA4 são selecionados por citome- tria de fluxo. Ao mesmo tempo, exossomos não modificados são isola- dos de acordo com os mesmos métodos-padrão.
[00300] As duas populações de exossomos são marcadas com um rastreador radioativo, e 150 ug de cada preparação são injetados em camundongos vivos (por exemplo, modelo de melanoma de camun- dongo). Os camundongos que recebem os exossomos que exibem o anticorpo CTLA-4 ou os exossomos não modificados são monitorados continuamente por 30 minutos e novamente em intervalos de quatro horas por PET / CT de animal inteiro. Imagens de animais inteiros permitem rastreamento em tempo real e de alta resolução de exosso- mos identificados para vários tecidos.
[00301] 150 ug de cada população de exossomo são injetados em dois coortes de camundongos por via intravenosa sem identificação primeiro com um rastreador radioativo. Os camundongos são submeti- dos à eutanásia cinco semanas após a administração. As amostras de tumor são coletadas e analisadas por imuno-histoquímica e PCR em tempo real. EXEMPLO 2: EXOSSOMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS PA-
RA EXIBIR O LIGANTE FAS
[00302] As células apresentadoras de antígeno humano são trans- fectadas com um plasmídeo que codifica um marcador selecionável resistente à puromicina e o ligante Fas. As células transfectadas são tratadas com puromicina e as colônias resistentes são selecionadas e submetidas a ensaio quanto à expressão da superfície do ligante Fas por citometria de fluxo. As células que expressam o ligante Fas está-
veis são cultivadas a alta concentração, e os exossomos resultantes são isolados do meio de cultura de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica (por exemplo, os métodos aqui descritos). Ao mesmo tempo, as células produtoras não transfectadas são culti- vadas e os exossomos resultantes são isolados de acordo com os mesmos métodos-padrão.
[00303] As duas populações de exossomos são marcadas com um rastreador radioativo, e 150 ug de cada preparação são injetados em camundongos vivos (por exemplo, modelo de GvHD de camundongo). Os camundongos que recebem os exossomos derivados de células não modificadas ou os exossomos derivados de células que expres- sam o ligante Fas são monitorados continuamente por 30 minutos e novamente em intervalos de quatro horas por PET / CT de animal in- teiro. Imagens de animais inteiros permitem rastreamento em tempo real e de alta resolução de exossomos identificados para vários teci- dos.
[00304] As populações de exossomos purificadas de células produ- toras não modificadas e células produtoras geneticamente modificadas para expressar o ligante Fas são purificadas de acordo com os méto- dos aqui descritos. 150 ug de cada população de exossomo são inje- tados em duas coortes de camundongos sem identificação primeiro com um rastreador radioativo. Os animais de ambas as coortes são submetidos à eutanásia três a cinco semanas após a administração para análise imuno-histoquímica e PCR em tempo real. EXEMPLO 3: ABSORÇÃO LINFÁTICA DE EXOSSOMOS APÓS
ADMINISTRAÇÃO INTRAPERITONEAL
[00305] Para determinar a biodistribuição de exossomos purificados in vivo, foi realizado o seguinte experimento:
[00306] O meio de cultura condicionado das células 293T foi cole- tado e centrifugado a 300 a 800 xg por 5 minutos em temperatura am-
biente para remover células e detritos grandes. O sobrenadante do meio foi, então, suplementado com 1000 U / L Benzonase*º e incubado a 37 º C por 1 hora em banho de água. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 16. 000 xg por 30 minutos a 4 º C para remover detritos celulares residuais e outros contaminantes grandes. O sobrenadante foi, então, ultracentrifugado a 133. 900 xg durante 3 horas a 4 º C para peletizar os exossomos. O sobrenadante foi descartado e o meio resi- dual foi aspirado do fundo do tubo. O pélete foi, então, ressuspenso em 200 a 1000 ul de PBS (-Ca-Mg).
[00307] Para enriquecer adicionalmente as populações de exosso- mos, o pélete foi processado por meio de purificação por gradiente de densidade de sacarose, conforme definido na Tabela 6.
[00308] O gradiente foi girado a 200. 000 xg por 16 horas a 4º C em um tubo Ultra-Clear de 12 mL (344059) colocado em um rotor SW 41 Ti para separar a fração do exossomo.
[00309] A camada do exossomo foi removida suavemente da ca- mada superior e diluída em — 32,5 mL de PBS em um tubo Ultra-Clear de 38,5 mL (344058) e novamente ultracentrifugada a 133. 900 xg por 3 horas a 4 º C para peletizar os exossomos purificados. O pélete re- sultante foi ressuspenso em um volume mínimo de PBS (- 200 uL) e armazenado a 4º C.
[00310] Para radiomarcar os exossomos purificados para imagino- logia in vivo, 1xX10 ** exossomos purificados em 100 uL foram diluídos com HEPES (200 uL, 0,1M, pH 8,5) e conjugados com p-SCN-Bn-DFO (5 ug) por uma hora a 37 º C seguido de incubação de um dia para o outro a 4 º C, separadamente. Os exossomos DFO foram incubados com 897Zr (7,5mCi) diluídos em HEPES (100 ul, IM, pH 7,3) por uma hora a 37 º C e purificados em uma coluna qEv. Isso resultou em um rendimento total (0,4 mCi de exossomos 89Zr-DFO em até 0,8 mL de PBS) a 100 uCi/1x10*º exossomos. O controle de qualidade (HPLC) foi realizado antes da liberação para garantir > 95% de RCP. ESTABILIDADE /N VITRO
[00311] Os exossomos (20 uCi/2x10º) foram incubados à tempera- tura ambiente em: a. Tampão De formulação b. Soro de camundongo (10% v/v de solução de exossomo em soro, se possível)
[00312] 2 horas após o início da incubação, soluções foram injeta- das em HPLC para determinar a estabilidade do rastreador.
IMAGINOLOGIA IN VIVO
[00313] Os camundongos (SKH-1, n = 8, idade de 5 a 8 semanas) foram randomizados em dois grupos, pesados e injetados (com o se- gundo grupo injetado imediatamente após o término da varredura di- nâmica do primeiro grupo) com 1x10ºº%/g de exossomos para proporci- onar uma dose radioativa mínima de 100 uCi / camundongo. O grupo 1 foi injetado por via intravenosa (IV) enquanto o grupo 2 foi injetado por via intraperitoneal (IP).
[00314] Os camundongos recebem uma PET / CT de corpo inteiro em um hotel de 4 camundongos, usando o seguinte agendamento: 1h dinâmica (5x60, 5x180, 8x300 segundos) e imaginologia estática em 4h (20 min), 24h (quinta-feira, 20 min) e 48h (sexta-feira, 30 min). Ca- da ponto no tempo de imaginologia foi seguido por CT para referência anatômica.
[00315] Após o último momento de imaginologia, os camundongos foram submetidos à eutanásia e os seguintes órgãos foram coletados, pesados e contados no contador gama:sangue, pulmão (um), fígado (lobo), baço, pâncreas, rim (um), fígado, cólon e órgãos adicionais de alta absorção.
[00316] Os órgãos foram deixados em decomposição por 2 a 3 dias se as contagens fossem extremamente altas e contadas novamente.
TABELA 7 Grupo (nº e [Rastreador Via dej Imaginologia | Pontos no tem- tipo do ca- inje- po de imagino- mundongo) ção logia ºexossomo PET / CT de cor- " o de estática 1 (n=4, SKH-| s Zr-DFO po inteiro usando | , IV às 4h e 24h 1) (100 uCi, < um hotel de 4 , 200 yuL) camundongos (20min) 48h p o (30min) 89 1h dinâmica se- exossomo PET / CT de cor- uida de estática 2 (n=4, SKH-| s Zr-DFO po inteiro usando 9 a : às 4h e 24h 1) (100 uCi, < um hotel de 4 (20min) 48h 200 yuL) camundongos (30min)
RESULTADOS
[00317] As duas coortes de camundongos tratados foram submeti- dos à imaginologia 4 horas, 24 horas e 48 horas após o tratamento. À imaginologia de PET / CT de corpo inteiro revelou entrega robusta aos fígados de todos os camundongos do grupo 1 tratado IV (Figura 1A) e uma distribuição não sobreposta distinta para os camundongos no grupo 2 tratado IP (Figura 1B). Os órgãos foram dissecados e analisa- dos por contador radiográfico gama, que revelou absorção significativa de fígado e baço em camundongos tratados |V (Figura 2). Em contras- te, para os camundongos tratados IP, a absorção foi observada princi- palmente no pâncreas, baço, timo e linfonodos, com absorção adicio- nal no fígado e ovários. Estes resultados demonstram que diferentes vias de administração resultam em perfis de biodistribuição substanci- almente diferentes. É importante ressaltar que a administração IP le- vou a uma absorção significativa nos linfáticos, sugerindo que a admi- nistração IP pode ser uma via de administração adequada para atingir células imunes. EXEMPLO 4: ATIVAÇÃO DE CÉLULAS B POR EXOSSOMOS GE- NETICAMENTE MODIFICADOS DE CD40L
[00318] “CD40L é um membro da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) expressa principalmente nas células T. O receptor CD40L, CDA40, é expresso em células apresentadoras de antígeno, incluindo macrófagos, células dendríticas e células B. A sinalização através do CD40 ativa as células B e induz uma resposta específica ao antígeno. A ativação da via CD40, portanto, tem implicações no de- senvolvimento da imunidade antitumoral em uma ampla gama de tipos de tumores. Para determinar se os exossomos geneticamente modifi- cados poderiam ser gerados para induzir um efeito imunológico espe- cífico, foram gerados exossomos a partir de células HEK293SF trans- fectadas com um plasmídeo contendo CD40L humano de comprimen- to total. As células transfectadas foram colocadas sob seleção de pu- romicina e as populações de células resistentes foram cultivadas a alta densidade. Os exossomos resultantes foram coletados do meio de cul- tura condicionado e purificados sobre um gradiente Optiprep "M como descrito acima. Exossomos de células HEK293SF não modificadas também foram isolados para serem utilizados como controle. As célu- las mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) foram dis- postas em placas a 150. 000 células por poço de uma placa de 96 po- ços e incubadas com exossomos CD40L purificados ou exossomos nativos durante a noite a 37 ºC. Uma amostra de PBMCs foi incubada com 1 ug / mL de CD40L-Fc recombinante solúvel como controle posi- tivo. Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, os exossomos CD40L ati- varam células B de maneira dependente da dose, conforme medido pela expressão de CD69 em duas amostras de doadores diferentes. Os exossomos nativos falharam em induzir a ativação das células B. É importante ressaltar que o nível de ativação das células B pelos exos- somos CD40L foi comparável à ativação causada pelo CD40L-Fc.
[00319] Para determinar se a ativação de células B mediada por exossomo observada foi devida à ativação direta de células B ou atra-
vés de células imunes de ação trans, um experimento semelhante foi realizado usando células B humanas purificadas. 50. 000 células B humanas purificadas foram dispostas em placas em uma placa de 96 poços e incubadas com exossomos CD40L, exossomos nativos ou CD40L-Fc. Uma amostra de exossomos de CDA40L de alta concentra- ção foi submetida a um ciclo de congelamento e descongelamento (CD40L-EVs [F / T]) e testada também quanto à ativação de células B. Como mostrado nas Figuras 4A e 4B, os exossomos CD40L ativaram células B purificadas de dois doadores em uma extensão semelhante à CD40L-Fc. Os exossomos nativos falharam ao ativar as células B, enquanto as amostras de congelamento e descongelamento de exos- somos CD40L ativaram com êxito as células B, indicando que o efeito dos exossomos CD40L é mediado diretamente pelas células B e que a presença de CD40L é suficiente para as a ativação de células B. Além disto, os exossomos geneticamente modificados permanecem estáveis e ativos por pelo menos um ciclo de congelamento e descongelamen- to.
[00320] Para validar ainda mais os exossomos CD40L, um sistema repórter foi usado para medir a atividade dos exossomos geneticamen- te modificados. A ativação da via CD40 resulta na ativação de NF-KB. Usando uma linhagem celular U2OS modificada geneticamente para superexpressar CD40 em sua superfície e conter um repórter de lucife- rase a jusante do promotor NF-KB (Promega Corporation), a ativação do CDA40 foi confirmada através da incubação das células na presença de um anticorpo anti-CD40 agonístico (BioLegend , Inc. ) reticulado com um anticorpo anti-Fc (Jackson ImmunoResearch, Inc. ) ou CD40L humano recombinante (ACROBiosystems) reticulado com um anticor- po anti-lgG (Jackson ImmunoResearch, Inc. )(Figuras 5A e 5B). Os exossomos geneticamente modificados CD40L foram incubados com as células geneticamente modificadas e resultaram em um aumento robusto da atividade da luciferase comparável aos efeitos do anti- CD40 + anti-Fc. É importante ressaltar que os exossomos genetica- mente modificados não exigiram um anticorpo de reticulação, demons- trando que o CD40L na superfície dos exossomos pode formar tríme- ros de CD40L funcionais suficientes para ativar o CD40. EXEMPLO 5: ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T POR EXOSSOMOS DE CD80 GENETICAMENTE MODIFICADOS
[00321] O CDB80 é expresso em células apresentadoras de antígeno e se liga a CD28 e CTLAH na superfície das células T. A estimulação por CD80 (e CD86) através de CD28 e CTLA+ ativa as células T du- rante o início de uma resposta imune. Para determinar se os exosso- mos poderiam ser geneticamente modificados para ativar as células T, os exossomos contendo CD80 foram gerados por transfecção e sele- ção de células HEK293SF, conforme descrito no Exemplo 4. Para vali- dar a atividade dos exossomos CD80, as PBMCs humanas foram dis- postas em placas em 150. 000 células por poço de uma placa de 96 poços e incubadas com (i) exossomos CD80 purificados e anticorpo anti-CD3, (ii) exossomos nativos e anticorpo anti-CD3, (iii) anticorpo anti-CD3 sozinho, ou (iv) uma combinação de anticorpos anti-CD28 e anti-CD3. As amostras foram incubadas a 37 ºC por três dias e subme- tidas a ensaios quanto à contagem de células T para células T CD4* (Figura 6A) e células T CD8* (Figura 6B). Os exossomos CD80 ativa- ram as células T de maneira dependente da dose e em uma extensão comparável ao controle positivo dos anticorpos CD3 e CD28. Por outro lado, os exossomos nativos não tiveram efeito na proliferação de célu- las T.
[00322] Para confirmar que os exossomos CD80 induzem uma ati- vação funcional das células T, os níveis de IFNy foram medidos por AIlphaLISA em PBMCs incubadas com exossomos nativos e exosso- mos CD80 com anticorpo anti-CD3 adicional. Como mostrado na Figu-
ra 7A, houve um aumento dependente da dose nos níveis de IFNy pa- ra os exossomos CD80, mas não para os exossomos nativos. Como mostrado na Figura 7B, as maiores concentrações de exossomos CD80 resultaram em maiores níveis de IFNy do que qualquer outra condição, incluindo o controle positivo (anti-CD28 / anti-CD3). Estes resultados demonstram que os exossomos podem ser geneticamente modificados com atividade específica que resulta na ativação de célu- las imunes.
EXEMPLO 6: PRODUÇÃO PRÓ-INFLAMATÓRIA DE CITOCINAS PELOS EXOSSOMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS CD27L E OX40L
[00323] CD27L(CD70)e OX40L são membros da superfamília TNF e se ligam a receptores cognatos (CD27 e OX40, respectivamente) nas células T. CD27L é expresso por certas populações de células T e B, enquanto OX40L é expresso por certas populações de células apresentadoras de antígeno. A sinalização através de CD27 ou OXA40, portanto, tem implicações na imuno-oncologia, especificamente como um método de ativação de células T anérgicas. Para determinar se os exossomos poderiam ser geneticamente modificados para induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias em PBMCs, os exossomos contendo CD27L e OX40L foram gerados por transfecção e seleção de células HEK293SF, como descrito no Exemplo 4. Para validar a ativi- dade dos exossomos CD27L, as PBMCs humanas foram dispostas em placas em uma placa de 96 poços e incubadas com exossomos CD27L purificados e anticorpo anti-CD3, exossomos nativos e anticor- po anti-CD3, anticorpo anti-CD3 sozinho ou uma combinação de anti- corpos anti-CD28 e anti-CD3. As amostras foram incubadas a 37 C por dois dias e submetidas a ensaio quanto à produção de interferon gama (IFNy) (Figuras 8A e 8B) e produção de IL-2 (figuras 9A e 9B) em dois doadores diferentes. Os exossomos CD27L induziram a produção de
IFNy e IL-2 de maneira dependente da dose e em extensão compará- vel a (Doador 1) ou significativamente maior que (Doador 2) o controle positivo dos anticorpos CD3 e CD28. Em contraste, os exossomos na- tivos não tiveram efeito na produção de IFNy ou IL-2. Da mesma for- ma, os exossomos OX40L foram suficientes para induzir a produção de IFNy e IL-2 em dois doadores diferentes em uma extensão seme- lhante ou maior (Figuras 10A e 10B e Figuras 11A e 11B).
[00324] Para validar ainda mais os exossomos CD40L, um sistema repórter foi usado para medir a atividade dos exossomos geneticamen- te modificados. A ativação da via OX40 resulta na ativação de NF-KB. Usando uma linhagem celular de célula T modificada geneticamente para superexpressar OX40 em sua superfície e conter um repórter de luciferase a jusante do promotor NF-KB (Promega Corporation), a ati- vação do OXA40 foi confirmada através da incubação das células na presença de um anticorpo anti-OX40 agonístico (BioLegend , Inc. ) re- ticulado com um anticorpo anti-Fc (Jackson ImmunoResearch, Inc. ) ou OX40 humano recombinante (ACROBIiosystems) reticulado com um anticorpo anti-lgG (Jackson ImmunoResearch, Inc. ) (Figuras 12A e 12B). O anticorpo anti-OX40L reticulado com anti-lgG falhou ao ativar as células repórter, enquanto o OX40L recombinante reticulado com anti-Fc levou a uma ativação robusta do gene repórter (Figura 12B). Surpreendentemente, os exossomos OX40L geneticamente modifica- dos induziram a expressão do gene repórter em maior extensão do que o anticorpo anti-OX40 ou o OX40L recombinante (Figura 12C). É importante ressaltar que os exossomos geneticamente modificados não exigiram um anticorpo de reticulação, demonstrando que o OX40 na superfície dos exossomos pode formar trímeros de OX40L funcio- nais suficientes para ativar o OX40. EXEMPLO 7: ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T POR EXOSSOMOS GE- NETICAMENTE MODIFICADOS DE IL-7
[00325] AIL-7é uma citocina envolvida na proliferação de células B e células T e tem implicações na imunoterapia. Especificamente, a IL-7 pode ativar células T e induzir uma resposta de antígeno tumoral em tumores que são pouco infiltrados por leucócitos ou em microambien- tes tumorais que induziram anergia de células T. A sinalização de I|L-7 através do receptor heterodimérico de IL-7 induz a sinalização de inter- feron gama (IFNy), que pode melhorar a resposta de antígeno especí- fico do tumor pelas células T. Para determinar se os exossomos pode- riam ser geneticamente modificados para induzir a ativação de células T, os exossomos contendo IL-7 foram gerados por transfecção e sele- ção de células HEK293SF com o plasmídeo pDisplay "“ (ThermoFis- her) que codifica uma fusão de IL-7 e receptor de PDGF. Os exosso- mos geneticamente modificados foram purificados como descrito nos Métodos. Para validar a atividade dos exossomos IL-7, as PBMCs hu- manas foram dispostas em placa em uma placa de 96 poços e incuba- das com exossomos IL-7 purificados e anticorpo anti-CD3, exossomos nativos e anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD3 sozinho ou uma com- binação de anticorpos anti-CD28 e anti-CD3. As amostras foram incu- badas a 37 ºC por dois dias e submetidas a ensaio quanto ao IFNy (Figuras 13A e 13B). Os exossomos de IL-7 em combinação com anti- corpo anti-CD3 induziram a produção de IFNy de pico a uma extensão maior do que o anti-CD3 sozinho (Figura 13A). Adicionalmente, os exossomos de IL-7 induziram IFNy de maneira dependente da dose e em uma extensão comparável ao controle positivo dos anticorpos CD3 e CD28. Em contraste, os exossomos nativos não tiveram efeito na produção de IFNy (Figura 13B).
[00326] O receptor de IL-7 é um complexo heterodimérico consis- tindo em IL-7R e IL-2RG, que formam um complexo ternário na pre- sença de IL-7 e induz sinalização a jusante através da via JAK/ STAT, resultando em proliferação celular. Um ensaio baseado em célula sin-
tética foi usado para medir a sinalização de IL-7 através do receptor de IL-7 para avaliar a atividade funcional de exossomos de IL-7 geneti- camente modificados (DiscoverX Corporation) (Figura 14A). A IL-7 humana recombinante (rhlL-7) foi suficiente para aumentar a sinaliza- ção através do receptor de IL-7 (Figura 14B), e os exossomos de IL-7 geneticamente modificados foram capazes de induzir a sinalização através do receptor de IL-7, enquanto os exossomos nativos não fo- ram (Figura 14C). Estes dados demonstram que os exossomos que expressam IL-7 são suficientes para induzir a sinalização através do receptor de /L-7 in vitro.
[00327] Para determinar se os efeitos dos exossomos de IL-7 ob- servados in vitro podem ser recapitulados em um modelo in vivo, os exossomos de IL-7 foram administrados a camundongos C57BL / 6. Uma coorte de 20 camundongos foi separada nos seguintes grupos:(1) PBS, (2) IL-7 humano recombinante (rhlL-7), (3) exossomos genetica- mente modificados por IL-7 e (4) exossomos nativos não modificados. Cinco camundongos em cada grupo foram injetados intraperitoneal- mente (IP) com 1 mg de EdU e PBS, 1x10** exossomos nativos ou IL- 7 ou 10 ug de rhll-7 uma vez ao dia por três dias. Os camundongos foram sacrificados, os baços foram isolados e os níveis de EdU foram medidos nas células esplênicas por citometria de fluxo. Como mostra- do na Figura 15A, as células T CD8 + com porcentagem positiva au- mentaram significativamente nos camundongos do exossomo |L-7 e nos camundongos rhlL-7 em comparação com as coortes de controle. Embora a contagem de células T nos camundongos de exossomo |IL-7 fosse menor que a coorte rhlL-7, estima-se que houvesse cinco vezes menos moléculas de IL-7 administradas na coorte do exossomo |IL-7 (dados não mostrados). Uma tendência semelhante foi observada para as células T CD8 + Memory, medindo os níveis do marcador de me- mória CD45RO (Figura 15B).
[00328] “Como uma abordagem ortogonal, os níveis de CD71 (re- ceptor Transferrina) foram medidos em células esplênicas isoladas de camundongos tratados com exossomo. O CD71 é necessário para a proliferação e os níveis de CD71 se correlacionam com o número de células T. Conforme mostrado nas Figuras 15A e 15B, os números de células T CD8 + e células T CD-8 + Memory seguiram a mesma ten- dência observada nas Figuras 16A e 16B. Juntos, estes dados de- monstram que os exossomos geneticamente modificados podem indu- zir um efeito específico da célula imune in vivo e que esta ativação po- de ser mais potente por molécula em comparação com os agonistas recombinantes.
EXEMPLO 8: FUSÃO DE IL-7 PARA ARCABOUÇO PROPRIETÁ-
RIOS APRIMORA ATIVIDADE ESPECÍFICA
[00329] Para aumentar a atividade dos exossomos geneticamente modificados por IL-7, a sequência de IL-7 foi fundida com uma porção truncada de PTGFRN, uma proteína transmembranar inovadora de exossomo que é altamente expressa na superfície dos exossomos HEK293SF. A IL-7 foi expressa como uma fusão de tradução a mon- tante de um fragmento curto de PTGFRN que abrange a região antes do domínio IgV mais terminal C, do domínio transmembranar e do do- mínio intracelular do PTGFRN, bem como de um marcador FLAG. Uma série de construtos de expressão foi gerada através da introdu- ção de uma série de quatro deleções de aminoácidos entre |L-7 e PTGFRN (Figura 17A). Os construtos resultantes foram numerados de pX-1 a pX-4 (sequência completa de pX-4 mostrada na Figura 17B). Como mostrado pela análise de Western blot usando um anticorpo an- ti-IL-7, os construtos de pX-3 e pX-4 apresentaram os mais altos níveis de expressão. O nível de expressão de IL-7 na cadeia principal de PTGFRN foi drasticamente mais alto que o pDisplay-IlL-7, que foi usa- do no Exemplo 7 (Figura 18A). O aumento da expressão de IL-7 suge-
riu que essas proteínas de fusão inovadoras poderiam induzir um nível muito maior de ativação de células T mediada por IL-7. Para determi- nar a potência das fusões de PTGFRN-IL-7, foi realizado um modelo in vitro de ativação de células T. Com a ativação das células T mediada por IL-7, os níveis do receptor de IL-7 (IL-7R) diminuem de maneira dependente da dose dentro de 24 horas (Ghawazi et a/., Inmunol Cell Biol. Fevereiro de 2013;91(2):149-58). Assim, os níveis de IL-7R fo- ram monitorados após a incubação de PBMCs com vários exossomos geneticamente modificados por IL-7. Como mostrado na Figura 18B, OS exossomos nativos falharam em reduzir os níveis de IL-7R, enquan- to os exossomos pDisplay-IL-7 (IL-7-pD) reduziram os níveis de IL-7R apenas em doses altas. Em contraste, os exossomos PTGFRN-IL-7 (IL-7-pX3 a pX4) reduziram completamente os níveis de IL-7R em do- ses muito mais baixas, demonstrando uma potência aumentada destes exossomos geneticamente modificados. Como uma medida de IC50, os exossomos PTGFRN-IL-7 foram 20 a 76 vezes mais potentes que os exossomos IL-7-pD (Tabela 2), demonstrando que o aumento da densidade de ligantes é suficiente para aumentar a potência biológica. Além disto, estes resultados demonstram que truncamentos especifi- cos de PTGFRN podem ser arcabouços ideais para uso na modifica- ção genética de exossomos terapêuticos. TABELA 8 EXEMPLO 9: EXOSSOMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS COM FRAGMENTOS DE ANTICORPO ANTI-CD3
[00330] Como mostrado nos exemplos anteriores, os exossomos podem ser geneticamente modificados para superexpressar sequên- cias endógenas funcionais de proteínas imunomoduladoras. Para de-
terminar se os agonistas sintéticos podem ser geneticamente modifi- cados na superfície dos exossomos, os anticorpos anti-CD-3 foram expressos como fusões a pDisplay, como descrito no Exemplo 4, ou no domínio transmembranar de CD80. As PBMCs humanas foram dis- postas em placa em uma placa de 96 poços a 100. 000 células por po- ço e incubadas durante a noite com exossomos geneticamente modifi- cados para expressar um Fv anti-CD3 de cadeia única (scFv) (Figuras 19A e 19B) ou Fab de cadeia única (scFab) (Figuras 20A e 20B). Co- mo controle positivo, as PBMCs foram incubadas com o ativador ImmunoCult "" de CD3/CD28 (Stem Cell Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Na presença de coestimulação anti-CD28, todos os exossomos geneticamente modificados induziram a ativação de células T (Figuras 19A e 20A) e de células B (Figuras 19B e 20B) comparáveis ao controle positivo, enquanto os controles de exosso- mos não modificados geneticamente, não. Para medir os efeitos dos exossomos anti-CD3 nas populações de células imunes, as células T e B foram submetidas a ensaio quanto à positividade para CD69 por ci- tometria de fluxo. Como mostrado na Figura 21A, as PBMCs incuba- das com exossomos que expressam scFv anti-CD3 fundidos ao domí- nio transmembranar de CD80 levaram à ativação de — 40% das célu- las T. Efeitos semelhantes foram observados para a ativação de célu- las B (Figura 21B).
[00331] Para determinar se a ativação de células T mediada por exossomo anti-CD-3 foi devida à ativação direta de células T ou atra- vés de células imunes de ação trans, foi medida a ativação de células T purificadas. 100. 000 células T humanas purificadas foram dispostas em placa em formato de 96 poços em poços pré-revestidos com um anticorpo não-alvejante ou exossomos anti-CD3 na presença ou na ausência de anticorpo anti-CD28, ou em poços que foram incubados com exossomos anti-CD3 na presença ou ausência de anticorpo anti-
CD28. Como mostrado na Figura 22A, os exossomos anti-CD3 scFv solúveis e de placa revestida ativaram células T na presença de anti- corpo anti-CD28, conforme medido pela expressão de CD69. Como mostrado na Figura 22B, o anticorpo anti-CD3 de placa revestida na presença de células T ativadas por anticorpo anti-CD28 na mesma ex- tensão que o scFv anti-CD3 de placa revestida na presença de anti- corpo anti-CD28. Surpreendentemente, enquanto o anticorpo anti-CD3 solúvel na presença de anticorpo anti-CD28 foi suficiente para ativar — 30% das células T, os exossomos solúveis de scFv anti-CD3 na pre- sença de anticorpo anti-CD28 ativaram uma proporção significativa- mente maior de células T, demonstrando que os exossomos geneti- camente modificados para superexpressar um fragmento de anticorpo podem induzir níveis mais altos de ativação das células T em compa- ração com o anticorpo solúvel. Juntos, estes resultados demonstram que os exossomos podem ser geneticamente modificados para supe- rexpressar fragmentos de anticorpos com atividade funcional contra tipos celulares específicos.
EXEMPLO 10: OS EXOSSOMOS DE IL-12-PTGFRN TÊM ATIVIDA- DE IMUNOMODULADORA POTENTE IN VITRO E IN VIVO.
[00332] AlL-12é uma citocina imunoestimuladora potente produzi- da por células apresentadoras de antígeno em resposta a infecção e outra estimulação antigênica. A produção de IL-12 por células dendríti- cas ativadas, macrófagos e neutrófilos induz a produção de IFNy pelas células T tanto CD8 + quanto CD4 + e induz efeitos citotóxicos das cé- lulas assassinas naturais (NK). O impacto combinado da secreção de IL-12 no microambiente do tumor resulta na secreção de citocinas Th1 incluindo IFNy, levando à morte de células tumorais, reprogramação de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs) e efeitos anti- angiogênicos. Os efeitos antitumorais mediados por I1L-12 resultam em uma resposta duradoura das células T e imunidade antitumoral em vá-
rios modelos animais. A IL-12 foi previamente testada como um agente de imunoterapia em humanos, mas resultou em toxicidade significativa em pacientes com carcinoma de células renais, apesar de uma indu- ção detectável de uma resposta robusta de IFNy (Leonard et a/l., Blo- od. 1 de outubro de 1997; 90 (7): 2541-8). Os exossomos, portanto, podem representar uma modalidade de entrega ideal para I1L-12 devi- do à alta concentração local da citocina e à farmacologia retida no tu- mor presumida.
[00333] AIL-12 consiste em dois domínios, p35 e p40. O dímero de IL-12 humano foi codificado como uma proteína de fusão para PTG- FRN de comprimento total (Figura 23A, construto 871, SEQ ID NO:3) ou um fragmento encurtado de PTGFRN que permite a exibição de superfície de alta densidade (Figura 23B, construto 873, SEQ |ID NO:5), e os construtos foram expressos de maneira estável nas célu- las HEK293SF. As linhas celulares estáveis foram cultivadas em meios quimicamente definidos e os exossomos do sobrenadante de cultura foram purificados sobre um gradiente Optiprep "'M como descrito nos Métodos. A quantidade de proteína de IL-12 na superfície dos exos- somos foi medida por ELISA e correspondida à concentração de rlL-12 para todos os estudos funcionais. Os exossomos de hlL-12-PTGFRN purificados, de comprimento completo e curtos, ou hlL-12 recombinan- te (rhlL-12; BioLegend, Nº de Catálogo 573004) foram titulados em PBMCs humanas na presença de um anticorpo anti-CD3 de concen- tração subideal para induzir expressão de IFNy. O rhIL-12 resultou em expressão robusta de IFNy com uma EC 5º de 0,029 ng /ml, que foi comparável ao IL12-PTGFRN de comprimento total, sendo ambos — 10x mais potentes que o IL12-PTGFRN curto (Figuras 24A-B). Estes resultados sugerem que a IL-12 exibida no arcabouço de PTGFRN de comprimento total pode ser um reagente imunomodulador mais poten- te do que o construto de PTGFRN curto.
[00334] As proteínas IL-12 humanas e de camundongo não reagem de maneira cruzada, e os dados in vitro mostrados na Figura 24 suge- rem que o mIL-12 fundido ao PTGFRN de comprimento total seria mais potente do que o uso do arcabouço curto de PTGFRN. Para de- terminar a potência dos exossomos de mlL-12-PTGFRN em um mode- lo in vivo de câncer, os camundongos C57BL / 6 foram implantados subcutaneamente com 1x10º células de melanoma murino B16F10 (n = 5 camundongos por grupo). Nos dias 5, 6 e 7 após a inoculação do tumor, os animais foram injetados intratumoralmente com PBS, 0,2 ug de IL-12 murina recombinante (mIL12; BioLegend, Nº de Catálogo 577004) ou 1x10*! exossomos exibindo IL-12-PTGFRN de comprimen- to total (mIL12-Exossomos; SEQ ID NO:4). Os animais foram sacrifi- cados uma vez que o volume do tumor atingiu 2. 000 mm?. Como mos- trado nas Figuras 25 a 27, os tumores no grupo PBS cresceram rapi- damente, enquanto os tumores nos grupos rmlL12 e mIL12-Exo foram drasticamente reduzidos (- 65 a 80% de redução no volume). É impor- tante ressaltar que, no dia 16, os tumores no grupo mIL12-Exo eram menores do que aqueles no grupo rmlL12, demonstrando eficácia su- perior da IL-12 quando exibidos na superfície dos exossomos em comparação com a citocina solúvel. Havia também uma vantagem de sobrevivência para os grupos tratados com IL-12 em comparação com os grupos tratados com PBS (Figura 28).
[00335] Para entender a vantagem mecanicista dos exossomos |L- 12-PTGFRN sobre rmlL12, a expressão do gene Th1 foi perfilada nos tumores dos grupos de controle e tratados. O IFNy (Figura 29A), os quimioatraentes de células T CXCL9 (Figura 29B) e CXCL10 (Figura 29C) e TGFB (Figura 29D) aumentaram nos grupos tratados com IL-12 em comparação com o grupo de controle. Na maioria dos casos, os sinais de citocinas foram maiores nos animais tratados com mIL12-Exo em comparação com rmlL-12. Os níveis de IFNy nas células T CD8 + esplênicas foram medidos por citometria de fluxo, e os camundongos tratados com Exo-mIL-12 mostraram sinal significativamente maior do que o grupo PBS ou o grupo rmIiL-12 (Figura 30). Juntos, esses dados demonstram que a IL-12 exibida na superfície de um exossomo repre- senta uma estratégia imunomoduladora nova e potente que promove a ativação robusta das células T in vitro e pode ser usada para obter efeitos antitumorais potentes em um modelo agressivo de melanoma murino na Vivo. Mecanisticamente, os exossomos da IL-12 mostram superioridade sobre riL-12 e, portanto, representam uma modalidade terapêutica diferenciada inovadora na imunoterapia contra o câncer. EXEMPLO 11: EXOSSOMOS QUE EXIBEM INTERFERON GAMA
SÃO POTENTES ATIVADORES DE CÉLULA IMUNE
[00336] O interferon gama (IFNy) é uma citocina envolvida na pre- paração de respostas imunes inatas e adaptativas. Este é expresso a partir de uma variedade de tipos de células em resposta a numerosos sinais incluindo I1L-12, e é suficiente para ativar células NK, conduzir a apresentação de antígenos em células apresentadoras de antígenos e promover a ativação e invasão de leucócitos. O IFNy é naturalmente expresso como um homodímero e é secretado como um fator solúvel. Os exossomos que expressam IFNy foram gerados por transfecção estável de células HEK293SF com PTGFRN de comprimento total fundido a IFNy monomérico ou dimérico humano e de camundongo (Figuras 31A e 31B, respectivamente). Os exossomos de culturas de células em suspensão foram purificados como descrito acima e anali- sados por PAGE. Os exossomos de PTGFRN IFNy monoméricos (m) e de dímero em tandem (td) foram expressos nos pesos moleculares previstos (pontas de seta) em níveis comparáveis (Figura 32). Os exossomos purificados foram analisados por ELISA e comparados com uma curva padrão usando IFNy recombinante (Biolegend, Nº de Catálogo 570206) para calcular o número de moléculas de IFNy por exossomo. Os resultados na Tabela 9 mostram o número de molécu- las de IFNy em cada um dos quatro tipos de exossomos purificados. Notavelmente, os exossomos do IFNy PTGFRN do dímero em tandem contêm pelo menos duas vezes mais moléculas de IFNy que os exos- somos de IFNy PTGFRN monoméricos, sugerindo que os exossomos do dímero em tandem estão expressando adequadamente os constru- tos de IFNy dimérico. TABELA 9
[00337] Os exossomos humanos de PTGFRN-IFNy monoméricos e de dímero em tandem foram incubados com PBMCs humanos por 24 horas em concentrações crescentes. A ativação de monócitos foi me- dida pela expressão de PD-L1, uma proteína de superfície a jusante induzida por sinalização de IFNy. Como mostrado na Figura 33, os exossomos HEK293SF (WT) nativos falharam em induzir a expressão de PD-L1, enquanto os IFNy PTGFRN exossomos tanto monoméricos quanto de dímero em tandem induziram o PD-L1 de maneira depen- dente da dose, com maior ativação pelos exossomos IFNy PTGFRN de dímero em tandem. A ativação de PD-L1 mediada por exossomo foi comparável à ativação induzida por LPS (Figura 33). Estes dados de- monstram que uma citocina solúvel, no formato monomérico ou dimé- rico, pode ser funcionalmente expressa na superfície de um exossomo e induzir a ativação da célula imune. A utilização de exossomos que expressam IFNy em imuno-oncologia pode ser útil para a indução de respostas de células NK e T contra células tumorais. EXEMPLO 12: EXOSSOMOS QUE EXPRESSAM IL-15 INDUZEM A
ATIVAÇÃO DE CÉLULA NK
[00338] A interleucina 15 (IL-15) é uma citocina produzida por célu- las mononucleares após infecção patogênica.
A IL-15 pode ser secre- tada como uma proteína solúvel ou apresentada como uma proteína ancorada na membrana dimérica ligada a IL-15Ra.
A IL-15 ativa célu- las NK e células T e está implicada como uma molécula terapêutica potencial em imuno-oncologia e outras terapias de intervenção imune.
Os exossomos que expressam IL-15 foram produzidos por transfecção estável de células HEK293SF com plasmídeos de expressão que codi- ficam o domínio transmembranar de PDGFR (pDisplay) fundido a pro- teínas de fusão de IL-15/IL-15Ra (Figura 34). Os exossomos foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de densidade Opti- prep "M como descrito nos Métodos acima.
Os exossomos purificados foram incubados com PBMCs humanos por 24 horas e a ativação das células NK foi medida como porcentagem positiva para CD69 por ci- tometria de fluxo.
Nenhum dos exossomos de IL-15 de pDisplay indu- ziu a ativação de células NK em doses de até 10º exossomos por célu- la da cultura PBMC (Figura 35; número de construto do exossomo, como na Figura 34). Para investigar se era necessária uma exibição de IL-15 de maior densidade para induzir a ativação de célula NK, as células HEK293SF foram transfectadas de maneira estável com um plasmídeo de expressão que codifica IL-15 fundido a PTGFRN de ta- manho total.
Além disto, as células HEK293SF foram transfectadas de maneira estável com um plasmídeo de expressão que codifica uma IL- mais potente fundida com PTGFRN de tamanho completo (IL-15 N72D, conforme descrito em J.
Immunol. 15 de setembro de 2009; 183 (6): 3598-607; Figura 36A). A expressão foi confirmada por Wes- tern blotting anticPTGFRN (Figura 36B). Os níveis de |L-15 foram quantificados por ELISA (R&D Systems, Nº de Catálogo D1500), nor- malizados para IL-15 recombinante (Biolegend, Nº de Catálogo 570302). Os exossomas de I|L-15 PTGFGN foram adicionados a duas culturas independentes de PBMC durante a noite e comparados com IL-15 recombinante correspondente à concentração. Todas as três fon- tes de IL-15 induziram a ativação de células NK em PBMCs de uma maneira dependente da dose, medida pela porcentagem de células NK positivas para CD69. Além disso, todos os construtos foram compará- veis entre si entre os dois doadores, demonstrando eficácia comparati- va significativa (Figura 37; número de construto de exossoma como na Figura 36). Esses dados demonstram que a IL-15 pode ser exibida de maneira ativa e potente na superfície dos exossomos, mas isso requer altos níveis de expressão, como os conferidos pelo PTGFRN. EXEMPLO 13: EXOSSOMOS QUE EXIBEM FRAGMENTOS DE AN- TICORPO ANTI-CD-3 EM UM ARCABOUÇO DE PTGFRN ATIVAM
CÉLULAS T
[00339] Os resultados no Exemplo 9 demonstram que exossomos que exibem fragmentos de anticorpo anti-CD3 podem ativar células T. Para determinar se o arcabouço de PTGFRN suporta esta atividade, os fragmentos de anticorpo anti-CD3 (variantes de OKT3) foram fundi- dos com a região transmembranar de PDGFR (exoCD3-PD), PTGFRN de comprimento total (exoCD3 longo) ou um fragmento de PTGFRN (exoCD3 curto) e expressos de maneira estável nas células HEK293SF (Figura 38). A ligação de exossomo foi confirmada por in- terferometria de biocamada (BLI) usando um Octet& RED96 (Pall). Um fragmento de CD3 foi ligado à sonda de BLI (Figura 39, ii), lavado (Fi- gura 39, iii) e os construtos de exossomo foram adicionados (Figura 39, iv). Os exossomos das células HEK293SF de WT não se ligaram à sonda de BLI, mas todos os construtos geneticamente modificados o fizeram. Ambos os fragmentos de PTGFRN se ligaram à sonda com uma maior afinidade e permaneceram ligados de forma estável (Figura 39, v). Exossomos de exibição anti-CD3 foram testados quanto à ativi- dade in vitro. A ativação das células T foi medida pela positividade do
CD69 nas células T CD4 +, conforme medido por citometria de fluxo. Em contraste com os exossomos nativos não modificados (exoNativo), os exossomos com anti-CD3 fundidos ao fragmento de PTGFRN (exoCD3 curto) foram eficazes na ativação in vitro de células T CD4 + (Figura 40).
EXEMPLO 14: EXOSSOMOS COM CD40L SÃO POTENTES ATIVA-
DORES DE CÉLULAS B
[00340] O ligante CD40 (CD40L) é um ligante da superfamília de necrose tumoral (TNFSF) que se liga ao receptor de CD40 coestimu- lador, que é altamente expresso em células B e em outras células apresentadoras de antígeno. A ativação celular mediada pelo ligante de TNFSF exige a formação de complexos ligantes triméricos que se formam na superfície celular e se ligam a receptores cognatos. Para investigar se os exossomos exibindo diferentes conformações de CD40L em sua superfície eram suficientes para ativar as células B, mais de 40 construtos diferentes de expressão de CD40L foram proje- tados e transfectados individualmente em células HEK293SF. CD40L foi expresso como uma fusão ao domínio transmembranar de PDGFR, PTGFRN de tamanho total e um fragmento curto de domínio único de PTGFRN (Figura 41A, inferior). As fusões de CD40L-GFP PTGFRN foram expressas como um monômero (pCB-518 a pCB-526) ou como um trímero forçado (pCB-607 e pCB-527) (Figura 41A, inferior). Para promover a trimerização de CD40L monomérico, foram projetados construtos que expressavam uma fusão com domínios de multimeriza- ção de TRAF2 (pCB-521 a pCB-523) ou Colágeno XV (pCB-524 a pCB-526). Entre os construtos monoméricos de CD40L, pCB- 518/521/524 continham sequências de tronco N-terminais de compri- mento total a partir de CD40L endógeno; pCB-519/522/525 continham uma sequência de tronco N-terminal truncada a partir de CD40L endó- geno; e pCB-520/523/526 continham apenas a porção solúvel de
CD40L. Cada uma das populações de exossomos geneticamente mo- dificados foi incubada com células B purificadas, isoladas do sangue periférico humano usando o Coquetel de Enriquecimento de Células B Humanas RosetteSep "“ (Stemcell Technologies nº 15064) e a ativa- ção das células B foi medida pela positividade de CD69 nas células B por citometria de fluxo. A ECso para cada um dos construtos foi calcu- lada em função da concentração de partículas da cultura de células e é plotada no gráfico mostrado na Figura 41, superior. Curiosamente, todos os construtos de CD40L monoméricos tiveram potência modes- ta, enquanto os construtos triméricos foram pelo menos dez vezes mais potentes que os monômeros (Figura 41, superior). Estes resulta- dos demonstram que o CD40L monomérico é um ativador insatisfató- rio de células B quando apresentado na superfície dos exossomos, mas que o CDA40L trimérico forçado pode induzir uma ativação robusta das células B. Além disto, foi demonstrado que o PTGFRN forma es- truturas diméricas (PCT / US2018 / 048026), sugerindo que estruturas multiméricas de ordem superior podem estar se formando na superfí- cie do exossomo para promover adicionalmente o engate do alvo e a ativação da célula imune.
[00341] Os resultados mostrados na Figura 41, todos, empregaram exossomos contendo GFP luminal fundidos ao terminal C do PTGFRN. Com o objetivo de gerar um exossomo de CD40L sem etiqueta, o mesmo construto de CD40L-PTGFRN trimérico que o construto princi- pal de pCB-527, mas desprovido do GFP C-terminal, foi expresso de maneira estável nas células HEK293SF (pCB-766). A concentração absoluta de CD40L na superfície dos exossomos geneticamente modi- ficados foi quantificada usando ELISA (R&D Systems, nº de Catálogo, DCDLA40), como mostrado na Tabela 10 abaixo.
TABELA 10
[00342] Os exossomos purificados de CD40L-PTGFRN foram tes- tados em ensaios de ativação de células B, como descrito acima, em comparação com CD40L humano recombinante de concentração cor- respondente (Biolegend, Nº de Catálogo 591702). Os exossomos CD40L sem etiqueta e contendo GFP foram ativadores de células B comparáveis quando medidos como uma função do número de partí- culas ou concentração de CD40L (Figura 42A), e ambas as prepara- ções de exossomos foram mais potentes que o CD40L correspondente à concentração (Figura 42B). Exossomos nativos e não modificados geneticamente das células HEK293SF falharam ao ativar as células B, demonstrando que os construtos triméricos de CD40L geneticamente modificados na superfície do exossomo foram suficientes para ativar potentemente as células B.
[00343] Uma modalidade alternativa para agonizar CD40 e ativar células B é usar um anticorpo agonístico reticulado com um anticorpo secundário. Para comparar a potência dos exossomos que expressam CD40L triméricos com um anticorpo CD40L agonístico, as culturas de PBMC foram incubadas com 2ug / ml de anticorpo anti-CD40L (Biole- gend&O; Clone 5C3) com um anticorpo secundário de reticulação (Jackson Immuno Research, nº de catálogo 115 -006-071). A ativação máxima de células B é mostrada como a linha pontilhada nas Figuras 43A e 43B. Os exossomos pCB-527 (CD40L-GFP trimérico de PTG- FRN) induziram uma ativação máxima de células B maior do que o an- ticorpo agonístico reticulado em dois agrupamentos de PBMC de doa- dores independentes (Figuras 43A e 43B), demonstrando a superiori- dade dos exossomos CD40L triméricos na ativação de células imunes. EXEMPLO 15: EXIBIÇÃO SIMULTÂNEA DE MÚLTIPLAS MOLÉCU-
LAS DE IMUNO-ONCOLOGIA EM EXOSSOMOS INDIVIDUAIS
[00344] Os exemplos anteriores demonstram que proteínas modu- ladoras imunológicas individuais podem ser exibidas na superfície de um exossomo e induzir alterações funcionais em um ou mais tipos de células imunes. Em certas aplicações, pode ser necessário o uso de exossomos geneticamente modificados de modo combinatório, isto é, um exossomo contendo mais de uma molécula na superfície do exos- somo, cada qual capaz de sinalizar uma via celular imune distinta. As células HEK293SF foram transfectadas de forma estável com um plasmídeo que expressa proteínas de fusão tanto PTGFRN-IL-12 quanto PTGFRN-CDA40L. Os exossomos foram isolados e purificados conforme descrito acima. Exossomos de células HEK293SF não modi- ficadas foram utilizados como controles negativos.
[00345] Para demonstrar o carregamento simultâneo de diferentes ligantes, foi desenvolvido um ensaio de cocoloração de tração para baixo: REAGENTES:
[00346] Dynabeads (Reagente de Isolamento / Detecção de Exos- somo-Estreptavidina para Termofisher, Nº de Catálogo 10608D):1x107 microesferas/mL, 50% de pasta fluida
[00347] “Tampão de isolamento:0,5% de BSA / PBS (1: 4 de 2% de BSA)
[00348] “Tampão de bloqueio:2% de BSA / PBS (1gr / 5OmL, filtro)
[00349] eLavaras microesferas de 0,5 ml com 0,5 ml de tampão de isolamento e ressuspender em 0,5 ml! de tampão de isolamento
[00350] e Adicionar lug de anticorpo de captura biotinilado (2,2 ul de estoque a 0,5ug / ul)
[00351] e1hderotação, RT
[00352] e Lavar 500u!l de tampão de isolamento
[00353] e Ressuspender em tampão de bloqueio de 500ul, 10 min de rotação RT
[00354] e Incubar em 500JUl de tampão de isolamento (1x10?microesferas/mL, 50% de pasta fluida)
[00355] e Armazenar ad4” C A. CAPTURA E FLUXO DE EXOSSOMOS
[00356] 1x10º microesferas por amostra (10 ul de microesferas, 20! de pasta fluida)
[00357] 50.000 exossomos por microesfera; 5x10º exossomos por amostra (1,2x10º exossomos/uL de estoque)
[00358] Sul de cada anticorpo de detecção identificada fluorescen- temente para fluxo
[00359] Misturar 5x10º exossomos + 204! de pasta fluida de Dyna- beads + 0,7 ml de 0,1% de BSA / PBS PROCEDIMENTO:
[00360] 1. 120 ul de microesferas de pasta fluida, remover sobre- nadante, adicionar 0,7 ml de tampão de bloqueio, misturar, girar 10 min RT, remover sobrenadante
[00361] 2. Suspender as microesferas em 0,7 ml de tampão de iso- lamento + 25,2 ul de exossomos, girar ON a 4 ºC
[00362] 3. Dia seguinte: rotação rápida de exossomos e microesfe- ras,5s
[00363] 4. Colocaro tubo no ímã, remover sobrenadante
[00364] 5. Bloqueioem700yul, 10 min de rotação RT
[00365] 6. Colocaro tubo no ímã, remover sobrenadante
[00366] 7. Ressuspender em tampão de isolamento a 600ul!:6 x 100ul! por tubo
[00367] 8. Adicionar 1ul de anticorpo de detecção identificado, mis- turar, incubar 30 min a 4 ºC no escuro
[00368] 9 Girar2mina500g, remover sobrenadante
[00369] 10. Lavar 2x tampão de isolamento
[00370] 11. Ressuspender no tampão de isolamento a 200yl, exe- cutar o fluxo.
[00371] Os exossomos nativos foram isolados com microesferas decoradas com anti-CD40L e anticorpos fluorescentes marcados con- tra IL-12 e CD40L (Figura 44A) ou CD81, um marcador de exossomo presente em exossomos nativos e geneticamente modificados e CDA40L (Figura 44B). As microesferas de CD40L não puxaram para baixo nenhum dos exossomos nativos, uma vez que nenhum sinal flu- orescente foi detectado para IL-12, CD40L ou CD81. Em contraste, os exossomos duplos geneticamente modificados de PTGFRN-CD40L / IL-12 foram incubados com microesferas anti-CD40L e isolados como acima. A coloração para CD81 (Figura 45A), IL-12 ou CD40L (Figura 45B) foi detectada com os exossomos geneticamente modificados (mais de 97% das microesferas contadas), indicando que o isolamento mediado por CD40L também poderia isolar os exossomos de IL-12. Da mesma forma, as microesferas decoradas com anti-IL-12 foram incu- badas com os exossomos geneticamente modificados por IL-12 / CDA40L e coradas para IL-12, CD40L e CD81. Mais de 98% de todas as microesferas foram positivas para CD40L e I|L-12 ou para CD81 (Figuras 46A e 46B), demonstrando que os exossomos continham |IL- 12 e CD40L em sua superfície.
[00372] A concentração de IL-12 e CD40L foi quantificada por ELI- SA (Número de Catálogo Abcam ab119517) para testar os exossomos geneticamente modificados quanto à potência in vitro. Concentrações iguais de 11-12 recombinante, 11-12 recombinante misturada com exossomos recombinantes de CD40L, PTGFRN-IL-12, exossomos PTGFRN-CD40L / IL-12 duplamente positivos ou uma mistura de exossomos PTGFRN-IL-12 e PTGFRN-CD40L foram adicionados exossomos a PBMCs humanas em concentrações crescentes (rhlL-12 - BioLegend, Nº de Catálogo 573004; rhnCD40L - Biolegend, Nº de Ca-
tálogo 591702). As células foram coestimuladas com anticorpo anti- CD3 e a produção de IFNy foi medida por (PerkinElmer, Nº de Catálo- go AL217C). Como mostrado nas Figuras 47A e 47B, todas as prepa- rações de exossomas contendo IL-12 provocaram uma resposta de IFNy comparável às citocinas recombinantes. O cálculo do EC50 para as várias condições revelou que a IL-12 associada ao exossomo foi mais potente do que a I|L-12 correspondente à concentração, expressa individual ou combinatoriamente na superfície do exossomo (Figura 48). Resultados semelhantes foram alcançados com CD40L recombi- nante e exossomos de CD40L simples ou duplamente modificados ge- neticamente no contexto da ativação de células B (Figuras 49A e B). Novamente, os exossomos geneticamente modificados por CD40L fo- ram mais potentes que as citocinas recombinantes solúveis e, neste caso, os exossomos duplamente modificados geneticamente foram o construto mais potente testado no ensaio (Figura 50).
[00373] Para explorar ainda mais a possibilidade de exossomos de exibição combinatória da superfície, as células HEK293SF foram transfectadas de maneira estável com três construtos independentes que expressam proteínas de fusão PTGFRN-IL-12, PTGFRN-CD40L ou PTGFRN-FLT3L. Os exossomos foram purificados e isolados pelos métodos de microesferas de afinidade, como descrito acima, mas também foram interrogados quanto à presença de FLT3L de superfície usando um anticorpo conjugado anti-FLT3L-PE. Os exossomos isola- dos com microesferas anti-IL-12 foram duplamente positivos para IL- 12 e CD40L (Figura 51A), IL-12 e FLT3L (Figura 51B) e CD40L e FLT3L (Figura 51C). Os exossomos isolados com microesferas anti- CD40L foram duplamente positivos para IL-12 e CD40L (Figura 52A), I1L-12 e FLT3L (Figura 52B) e CD40L e FLT3L (Figura 52C), confir- mando que exossomos individuais expressavam cada um dos três imunomoduladores ligantes. Estes resultados demonstram que os exossomos imunomoduladores modificados geneticamente de modo múltiplo são uma modalidade terapêutica viável e que são compará- veis ou mais potentes que as citocinas solúveis na ativação das célu- las imunes.
[00374] Embora a invenção exposta acima tenha sido descrita em detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de com- preensão, é facilmente perceptível aos versados na técnica à luz dos ensinamentos desta divulgação que certas alterações e modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito ou do escopo das reivindi- cações anexas.
[00375] Neste sentido, o exposto anteriormente ilustra meramente os princípios da invenção. Será percebido que os versados na técnica serão capazes de planejar vários arranjos que, embora não explicita- mente descritos ou mostrados neste documento, incorporam os princí- pios da invenção e estão incluídos dentro de seu espírito e escopo. Além disto, todos os exemplos e a linguagem condicional aqui citada destinam-se principalmente a ajudar o leitor a entender os princípios da invenção, sem limitação a tais exemplos e condições especifica- mente recitados. Além disto, todas as declarações neste documento que relatam princípios, aspectos e modalidades da invenção, bem co- mo seus exemplos específicos, se destinam a abranger equivalentes estruturais e funcionais dos mesmos. Além disto, pretende-se que tais equivalentes incluam tanto os equivalentes conhecidos atualmente quanto os equivalentes desenvolvidos no futuro, isto é, quaisquer ele- mentos desenvolvidos que realizam a mesma função, independente- mente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a estar limitado às modalidades exemplares mostradas e des- critas no presente documento. Preferivelmente, o escopo e o espírito da presente invenção estão incorporados pelas reivindicações anexas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS >SEQ ID NO:1
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLL DSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNS TGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSL KEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSAGGGGSDYKDDDD KGGGGSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDV SWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEF LLQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWOQKEAEIHSKPVFITVK MDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRER
RRLMSMEMD >SEQ ID NO:2
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLL DSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNS TGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSL KEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSAGGGGSGGGESG PIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHS FGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQVHGS EDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEI/HSKPVFITVKMDVLNAF KYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSM
EMD >hIL-12-PTGFRN; 871 (SEQ ID NO:3) MCHQQLVISW — FSLVFLASPL — VAIWELKKDV — YVVELDWYPD
APGEMVVLTC DTPEEDGITW — TLDOSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG .IWSTDILKDA KEPKNKTFLR — CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR “GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVAGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG SGGGSGGGGS GGGGSGGGSG GRNLPVATPD PGMFPCLHHS QNLLRAVSNM LQKARQTLEF YPCTSEEIDH EDITKDKTST VEACLPLELT KNESCLNSRE TSFITNGSCL ASRKTSFMMA LCLSSIVYEDL —“KMYQVEFKTM NAKLLMDPKR —QIFLDQNMLA VIDELMQALN FNSETVPQKS SLEEPDFYKT KIKLCILLHA FRIRAVTIDR VMSYLNASSA GGGGSGGGGS RVVRVPTATL VRVVGTELVI PCNVSDYDGP SEQNFDWSFS SLGSSFVELA —STWEVGFPAQ LYQERLORGE ILLRRTANDA VELHIKNVQP SDQGHYKCST PSTDATVOGN YEDTVQVKVL ADSLHVGPSA RPPPSLSLRE GEPFELRCTA —ASASPLHTHL —ALLWEVHRGP —ARRSVLALTH EGRFHPGLGY EQRYHSGDVR LDTVGSDAYR LSVSRALSAD QGSYRCIVSE WIAEQGNWOQE IQEKAVEVAT VVIQPSVLRA AVPKNVSVAE GKELDLTCNI TTDRADDVRP EVTWSFSRMP — DSTLPGSRVL —ARLDRDSLVH —SSPHVALSHV DARSYHLLVR DVSKENSGYY YCHVSLWAPG HNRSWHKVAE AVSSPAGVGV TWLEPDYQVY LNASKVPGFA —DDPTELACRV VDTKSGEANV RFTVSWYYRM NRRSDNVVTS ELLAVMDGDW —“TLKYGERSKQ RAQDGDFIFS KEHTDTFNFR IQORTTEEDRG NYYCVWVSAWT — KORNNSWVKS KDVFSKPVNI FWALEDSVLV VKARQPKPFF AAGNTFEMTC — KVSSKNIKSP RYSVLIMAEK PVGDLSSPNE TKYIISLDQD SVVKLENWTD ASRVDGVVLE KVQEDEFRYR MYQTQVSDAG LYRCMVTAWS PVRGSLWREA — ATSLSNPIEI DFQTSGPIFN ASVHSDTPSV IRGDLIKLFC ITVEGAALD —PDDMAFDVSW —FAVHSFGLDK —APVLLSSLDR KGIVTTSRRD WKSDLSLERV —SVLEFLLOVH —GSEDQDFGNY YCSVTPWVKS PTGSWQKEAE IHSKPVFITV KMDVLNAFKY PLLIGVGLST VIGLLSCLIG
YCSSHWCCKK EVOQETRRERR RLMSMEMD * >mlL-12-PTGFRN; 872 (SEQ ID NO:4) MCPQKLTISW — FAIVLLVSPL — MAMWELEKDV — YVWVEVDWTPD
APGETVNLTC DTPEEDDITW. — TSDQORHGVIG — SGKTLTITVK EFLDAGQYTC HKGGETLSHS HLLLHKKENG IWSTEILKNF KNKTFLKCEA — PNYSGRFTCS WLVORNMDLK FNIKSSSSSP —DSRAVTCGMA SLSAEKVTLD QRDYEKYSVS CQEDVTCPTA EETLPIELAL EARQQNKYEN YSTSFFIRDI IKPDPPKNLQ MKPLKNSQVE VSWEYPDSWS TPHSYFSLKF FVRIORKKEK MKETEEGCNQ KGAFLVEKTS TEVQCKGGNV CVQOAQDRYYN SSCSKWACVP CRVRSGGSGG GSGGGGGSCGGÇ GSGGGSGGRV IPVSGPARCL SQOSRNLLKTT DDMVKTAREK LKHYSCTAED IDHEDITRDQ TSTLKTCLPL ELHKNESCLA TRETSSTTRG SCLPPQKTSL MMTLCLGSIY — EDLKMYQTEF — QAINAALQNH NHQQIILDKG MLVAIDELMQ SLNHNGETLR — QOKPPVGEADP — YRVKMKLCIL —LHAFSTRVVT INRVMGYLSS ASAGGGGSCGG —GGSRVVRVPT ATLVRVWVGTE LVIPCNVSDY DGPSEQNFDW SFSSLGSSFV —ELASTWEVGF PAQLYQERLAQ —RGEILLRRTA NDAVELHIKN VQAQPSDAGHYK CSTPSTDATIV QGNYEDTVOQV KVLADSLHVG PSARPPPSLS LREGEPFELR — CTAASASPLH —THLALLWEVH —RGPARRSVLA LTHEGRFHPG LGYEQRYHSG É DVRLDTVGSD AYRLSVSRAL SADQGSYRCI VSEWIAEQGN WQEIQEKAVE — VATVVIQPSV — LRAAVPKNVS — VAEGKELDLT CNITTDRADD VRPEVTWSFS ——RMPDSTLPGS RVLARLDRDS LVHSSPHVAL SHVDARSYHL LVRDVSKENS — GYYYCHVSLW —APGHNRSWHK VAEAVSSPAG VGVTWLEPDY QVYLNASKVP — GFADDPTELA —CRVVDTKSGE ANVRFTVSWY YRMNRRSDNV VTSELLAVMD —“GDWTLKYGER SKQRAQDGDF IFSKEHTDTF NFRIQRTTEE DRGNYYCVWS AWTKORNNSW VKSKDVFSKP VNIFWALEDS VLVVKARQPK PFFAAGNTFE — MTCKVSSKNI —KSPRYSVLIM —AEKPVGDLSS PNETKYIISL DQDSVVKLEN WTDASRVDGV VLEKVQEDEF RYRMYQTOVS DAGLYRCMVT AWSPVRGSLW — REAATSLSNP IEIDFATSGP —IFNASVHSDT PSVIRGDLIK LFCIITVEGA — ALDPDDMAFD — VSWFAVHSFG LDKAPVLLSS LDRKGIVTTS RRDWKSDLSL ERVSVLEFLL QVHGSEDQDF GNYYCSVTPW VKSPTGSWQK EAEIHSKPVF ITVKMDVLNA FKYPLLIGVG LSTVIGLLSC
LIGYCSSHWC CKKEVQETRR ERRRLMSMEM D * >hIL-12-PTGFRN curto; 873 (SEQ ID NO:5) MCHQQLVISW. — FSLVFLASPL — VAIWELKKDV — YVVELDWYPD
APGEMVVLTC DTPEEDGITW — TLDOSSEVLG É SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG INVSTDILKDQ — KEPKNKTFLR — CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR —“GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVAGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG SGGGSGGGGS GGGGSGGGSGÇ GRNLPVATPD PGMFPCLHHS QNLLRAVSNM LQKARQTLEF YPCTSEEIDH EDITKDKTST VEACLPLELT KNESCLNSRE TSFITNGSCL ASRKTSFMMA LCLSSIVYEDL —“KMYQVEFKTM NAKLLMDPKR —QIFLDAQNMLA VIDELMQALN FNSETVPQKS SLEEPDFYKT KIKLCILLHA FRIRAVTIDR VMSYLNASSA GGGGSGCGGGGS GPIFNASVHS DTPSVIRGDL IKLFCIITVE GAALDPDDMA FDVSWFAVHS — FGLDKAPVLL —SSLDRKGIVT TSRRDWKSDL SLERVSVLEF LLAVHGSEDQ “DFGNYYCSVT PWVKSPTGSW QKEAEIHSKP VFITVKMDVL NAFKYPLLIG VGLSTVIGLL SCLIGYCSSH WECCKKEVQET
RRERRRLMSM EMD * >mlL-12-PTGFRN curto; 874 (SEQ ID NO:6) MCPQKLTISW — FAIVLLVSPL — MAMWELEKDV — YVWVEVDWTPD
APGETVNLTC DTPEEDDITW. — TSDQORHGVIG — SGKTLTITVK EFLDAGQYTC HKGGETLSHS HLLLHKKENG IWSTEILKNF KNKTFLKCEA — PNYSGRFTCS WLVORNMDLK FNIKSSSSSP —DSRAVTCGMA SLSAEKVTLD QRDYEKYSVS CQEDVTCPTA EETLPIELAL EARQQNKYEN YSTSFFIRDI IKPDPPKNLQ MKPLKNSQVE VSWEYPDSWS TPHSYFSLKF FVRIORKKEK MKETEEGCNQ KGAFLVEKTS TEVQCKGGNV CVOAQDRYYN SSCSKWACVP CRVRSGGSGG GSGGGGGSGCGGGÇ GSGGGSGGRV IPVSGPARCL SOQOSRNLLKTT DDMVKTAREK LKHYSCTAED IDHEDITRDQ TSTLKTCLPL ELHKNESCLA TRETSSTTRG SCLPPQKTSL MMTLCLGSIY —“EDLKMYQTEF — QAINAALQNH NHQQIILDKG MLVAIDELMQ SLNHNGETLR — QOKPPVGEADP — YRVKMKLCIL LHAFSTRVVT INRVMGYLSS ASAGGGGSGG GGSGPIFNAS VHSDTPSVIR GDLIKLFCII TVEGAALDPD DMAFDVSWFA VHSFGLDKAP VLLSSLDRKG IVTTSRRDWK SDLSLERVSV LEFLLQOVHGS ——“EDQDFGNYYC SVTPWVKSPT GSWQKEAEIH SKPVFITVKM DVLNAFKYPL LIGVGLSTVI GLLSCLIGYC SSHWCCKKEV
QETRRERRRL MSMEMD * SEQ ID NO: monômero 7 PTGFRN IFN gama
MGRLASRPLLLALLSLALCRGQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADN GTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDOQSIQKSVETIK EDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVORKAIHELIQVMAELS PAAKTGSAGGGGSGGGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYD GPSEQNFDWSFSSLGSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEILLR RTANDAVELHIKNVQPSDQGHYKCSTPSTDATVQGNYEDTVQVKVL ADSLHVGPSARPPPSLSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVH RGPARRSVLALTHEGRFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSV SRALSADQGSYRCIVSEWIAEQGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRA AVPKNVSVAEGKELDLTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGS RVLARLDRDSLVHSSPHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCH VSLWAPGHNRSWHKVAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPG FADDPTELACRVVDTKSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLA VMDGDWTLKYGERSKQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQORTTEEDRG NYYCVVSAWTKQRNNSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQP KPFFAAGNTFEMTCKVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYI SLDQDSVVKLENWTDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAG LYRCMVTAWSPVRGSLWREAATSLSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDT PSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLS SLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQOVHGSEDQDFGNYYCS VTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTV
IGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO:8 dímero PTGFRN IFN gama
MGRLASRPLLLALLSLALCRGQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADN GTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDOQSIQKSVETIK EDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELS PAAKTGGSGGSGGSGGSGCGQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGT LFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKED MNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVOQRKAIHELIQVMAELSPA AKTGSAGGGGSGGGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGP SEQNFDWSFSSLGSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEILLRRTA NDAVELHIKNVQPSDQGHYKCSTPSTDATVQGNYEDTVQVKVLADS LHVGPSARPPPSLSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGP ARRSVLALTHEGRFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRA LSADQGSYRCIVSEWIAEQGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVP KNVSVAEGKELDLTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVL ARLDRDSLVHSSPHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSL WAPGHNRSWHKVAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFAD DPTELACRVVDTKSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMD GDWTLKYGERSKQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQORTTEEDRGNYY CVVSAWTKQRNNSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPF FAAGNTFEMTCKVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLD QDSVVKLENWTDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYR CMVTAWSPVRGSLWREAATSLSNPIEIDFOTSGPIFNASVHSDTPSVI RGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLD RKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQOVHGSEDQDFGNYYCSVTP WVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGL
LSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO: monômero de 9 PTGFRN IFN gama de camundongo
MGRLASRPLLLALLSLALCRGRHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKS LFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHL ITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESS LRSAGGGGSGGGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSE QNFDWSFSSLGSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQORGEILLRRTAN DAVELHIKNVQPSDQGHYKCSTPSTDATVAQGNYEDTVQVKVLADSL HVGPSARPPPSLSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPA RRSVLALTHEGRFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRAL SADQGSYRCIVSEWIAE QGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPK NVSVAEGKELDLTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLA RLDRDSLVHSSPHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLW APGHNRSWHKVAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADD PTELACRVVDTKSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDG DWTLKYGERSKQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYC VVSAWTKQRNNSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFF AAGNTFEMTCKVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLD QDSVVKLENWTDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYR CMVTAWSPVRGSLWREAATSLSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDTPSVI RGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLD RKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQVHGSEDQDFGNYYCSVTP WVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGL
LSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO: dímero de camundongo de 10 PTGFRN IFN gama
MGRLASRPLLLALLSLALCRGRHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKS LFLDIWRNWQKDGDMKILQASQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHL ITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESS LRGSGGSGGSGGSGHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWR NWOQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSN SKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRSAGG GGSGGGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWS FSSLGSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIK NVAQPSDAQGHYKCSTPSTDATVAGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARP PPSLSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALT HEGRFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSY RCIVSEWIAEQGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEG KELDLTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSL VHSSPHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRS WHKVAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRV VDTKSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYG ERSKQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYCVVSAWTK QRNNSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFE MTCKVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLE NWTDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSP VRGSLWREAATSLSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCI ITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSR RDWKSDLSLERVSVLEFLLQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGS WQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCS
SHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO:11 I1L-15 441
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKS YSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRD PALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATT AAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASAS HQPPGVYPQGHSDTTGGSGEGGSGGEGSCGSGESGESGSGGSNWVN VISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLES GDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLOSF VHIVQMFINTSSADYKDDDDKFEGGGGSGGGGSAVGQDTQEVIVVYP
HSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMAINWQKKPRSGLLTGRT SEQ ID NO:12 I1L-15 442
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGHHHHHHITCPPPMSVEH ADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTT PSLKCIRDPALVHQORPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPS SNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKN WELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGGSGGGGSTLDPRSFLLR NPNDKYEPFWEDEEKNESGGGGSGGGSGGSNWVNVISDLKKIEDLI QSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVE NLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINT SSADYKDDDDKFEGGGGSGGGGSAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVI
SAILALVVLTIISLIILIMANWOQKKPRSGLLTGRT SEQ ID NO:13 |L-15 443
METDTLLLWVLLLWVPGSTGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTE SDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSN GNVTESGCKECEELEEKNIKEFLOSFVHIVQMFINTSGGSGGGSCGG GSGGGGSGGGSGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSG FKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPST VTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSK SPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHS DTTSADYKDDDDKFEGGGGSGGGGSAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVV VISAILALVVLTIISLIILIMLNWQKKPRSGLLTGRT
SEQ ID NO:14 IL-15 444
METDTLLLWVLLLWVPGSTGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTE SDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSN GNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQOSFVHIVQMFINTSDYKDDDDKGG SGGGSGGGGSTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGGGGSG GGSGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSS LTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQ PESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEIS SHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTSAFEGG GGSGGGGSAVGQDTQAEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIML
WQKKPRSGLLTGRTHHHHHH SEQ ID NO:15 IL-15 1009
METDTLLLWVLLLWVPGSTGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTE SDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSN GNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQOSFVHIVQMFINTSGGSSGSGSGS TGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAG ASSGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLT ECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPE SLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSH ESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTSAGGGGSG GGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWSFSSL GSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIKNVQ PSDQGHYKCSTPSTDATVAGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARPPPS LSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALTHEG RFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSYRCIV SEWIAEQGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEGKELD LTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSLVHSS PHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRSWHK VAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRVVDT KSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYGERS KQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYCVVSAWTKQRN NSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFEMTC KVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLENW TDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSPVR GSLWREAATSLSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIIT VEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRD WKSDLSLERVSVLEFLLQOVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSW QKEAEI!HSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSH
WCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO:16 IL-15 1010
METDTLLLWVLLLWVPGSTGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTE SDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSN GNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQOSFVHIVQMFINTSGGSSGSGSGS TGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSCGSGGGSAGGTATAG ASSGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLT ECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHORPAPPSTVTTAGVTPQPE SLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSH ESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTSAGGGGSG GGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWSFSSL GSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIKNVQ PSDQGHYKCSTPSTDATVAGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARPPPS LSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALTHEG RFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSYRCIV SEWIAEQGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEGKELD LTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSLVHSS PHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRSWHK VAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRVVDT KSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYGERS KQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYCVVSAWTKQRN NSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFEMTC KVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLENW TDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSPVR GSLWREAATSLSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIIT VEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRD WKSDLSLERVSVLEFLLQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSW QKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSH
WCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD SEQ ID NO:17 pDisplay-anti-CD3
MKIICLALVALLLTAQPAMAEIVLTQOSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQAQRSNWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGG SSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSCEGGÇE SAGGTATAGASSGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSG YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGSAVGADTA
EVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMIWOKKPRDYKDDDDK SEQ ID NO:18 PTGFRN-anti-CD3
MKIICLALVALLLTAQPAMAEIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLSSPVTKSFNRGECGG SSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGCGSCGGGÇ SAGGTATAGASSGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSG YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTGGSGGGSGGGESGSGGESGGGESGGSRVVRVPTA TLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWSFSSLGSSFVELASTWEV GFPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIKNVQPSDQGHYKCSTPS TDATVQGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARPPPSLSLREGEPFELRCT AASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALTHEGRFHPGLGYEQRYH SGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSYRCIVSEWIAEQGNWOQEI QEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEGKELDLTCNITTDRADDVR PEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSLVHSSPHVALSHVDARSY HLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRSWHKVAEAVSSPAGVGV TWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRVVDTKSGEANVRFTVSW YYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYGERSKQRAQDGDFIFSKE HTDTFNFRIQORTTEEDRGNYYCVVSAWTKQRNNSWVKSKDVFSKPV NIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFEMTCKVSSKNIKSPRYSVLI MAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLENWTDASRVDGVVLEKVQ EDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSPVRGSLWREAATSLSNPIE IDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVS WFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFL LQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKM DVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERR RLMSMEMDTGGSGGSVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSG EGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIED GSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTAQSKLSKDPNEKRDHMV
LLEFVTAAGITLGMDELYKDYKDDDDK SEQ ID NO:19 PTGFRN CD40L tímero camundongo
METDTLLLWVLLLWVPGSTGMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVL QWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPS SQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFEL QAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGSGGSGGSGGSGMAR GDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQL TVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAA NTHSSSQLCEQQASVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSS FGLLKLGSGGSGGSGGSGMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQ WAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSS QRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQ AGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLSAGGGGSGGGGSRVVRV PTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWSFSSLGSSFVELAST WEVGFPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIKNVQPSDQGHYKC STPSTDATVAQGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARPPPSLSLREGEPFE LRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALTHEGRFHPGLGYE QRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSYRCIVSEWIAEQGN WQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEGKELDLTCNITTDRA DDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSLVHSSPHVALSHVD ARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRSWHKVAEAVSSPA GVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRVVDTKSGEANVRF TVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYGERSKQRAQDGDF IFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYCVVSAWTKQRNNSWVKSKDV FSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFEMTCKVSSKNIKSP RYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLENWTDASRVDGVV LEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSPVRGSLWREAATS LSNPIEIDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDD MAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERV SVLEFLLQOVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPV FITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQET
RRERRRLMSMEMD SEQ ID NO:20 PTGFRN CD40L trímero humano
METDTLLLWVLLLWVPGSTGMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQ WAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASS QAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQP GASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGSGGSGGSGCECSGMQAKGD QNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVK RQGLYYIYAQVTFCESNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTH SSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLL KLGSGGSGESGGS GMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEK GYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFI ASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASV FVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLSAGGGGSGGGGSRVVRVPTATL VRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFDWSFSSLGSSFVELASTWEVG FPAQLYQERLQRGEILLRRTANDAVELHIKNVQPSDQGHYKCSTPST DATVAQGNYEDTVQVKVLADSLHVGPSARPPPSLSLREGEPFELRCT AASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVLALTHEGRFHPGLGYEQRYH SGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADQGSYRCIVSEWIAEQGNWQEI QEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVAEGKELDLTCNITTDRADDVR PEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRDSLVHSSPHVALSHVDARSY HLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHNRSWHKVAEAVSSPAGVGV TWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELACRVVDTKSGEANVRFTVSW YYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLKYGERSKQRAQDGDFIFSKE HTDTFNFRIQORTTEEDRGNYYCVVSAWTKQRNNSWVKSKDVFSKPV NIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNTFEMTCKVSSKNIKSPRYSVLI MAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVKLENWTDASRVDGVVLEKVQ EDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAWSPVRGSLWREAATSLSNPIE IDFQTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVS WFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFL LQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKM DVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERR RLMSMEMD
SEQ ID NO:21 PTGFRN curto-anti-CD3
MKIICLALVALLLTAQPAMAEIVLTQOSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGG SSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSCGGGGSCGGGÇ SAGGTATAGASSGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSG YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTGGSGGGSGEGGGSGEGESGGGSGGSGPIFNASV HSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKA PVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQOVHGSEDQDFG NYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGV GLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMDTGGS GGSVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTL KFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEG YVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGH KLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNT PIGDGPVLLPDNHYLSTAOSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGM
DELYKDYKDDDDK SEQ ID NO:22 FLT3L-PTGFRN
MTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSGTQDCSFQHSPISSDFAVKIREL SDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSK MQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVAL KPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPTAPQPPSA GGGGSCGGGGSRVVRVPTATLVRVVGTELVIPCNVSDYDGPSEQNFD WSFSSLGSSFVELASTWEVGFPAQLYQERLQRGEI/LLRRTANDAVEL HIKNVQPSDQGHYKCSTPSTDATVQGNYEDTVQVKVLADSLHVGPS ARPPPSLSLREGEPFELRCTAASASPLHTHLALLWEVHRGPARRSVL ALTHEGRFHPGLGYEQRYHSGDVRLDTVGSDAYRLSVSRALSADOQG SYRCIVSEWIAE QGNWQEIQEKAVEVATVVIQPSVLRAAVPKNVSVA EGKELDLTCNITTDRADDVRPEVTWSFSRMPDSTLPGSRVLARLDRD SLVHSSPHVALSHVDARSYHLLVRDVSKENSGYYYCHVSLWAPGHN RSWHKVAEAVSSPAGVGVTWLEPDYQVYLNASKVPGFADDPTELAC RVVDTKSGEANVRFTVSWYYRMNRRSDNVVTSELLAVMDGDWTLK YGERSKQRAQDGDFIFSKEHTDTFNFRIQRTTEEDRGNYYCVVSAW TKQRNNSWVKSKDVFSKPVNIFWALEDSVLVVKARQPKPFFAAGNT FEMTCKVSSKNIKSPRYSVLIMAEKPVGDLSSPNETKYIISLDQDSVVK LENWTDASRVDGVVLEKVQEDEFRYRMYQTQVSDAGLYRCMVTAW SPVRGSLWREAATSLSNPIEIDFQOTSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKL FCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTT SRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQOVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPT GSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGY CSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD TABELAS
C nsPeoasaP [aPovIo RAE
PTPRo — [acres — [eme — [MP UBE2V1 emo Neo oem
Cao fes pano
PEBRT [BA [eram —sRaN
[ram — | maRvELDE | stecALNACS |
Not EE forem — [Promo er rem reta
CPA fem BT
AGE [PTANS | roca Rover AA [fan vamee PTARO | fe ue — rocraaso TMB
EE — MARAGPT fom = [rabo — es war TnFRSAZA
Proteínas de repetição de Fibronectinas | Liases Ankyrin Anticorpos Receptores de Polipeptídeos Nanocorpos complemento ligados a GP! Aptâmeros Peptídeos cícli- | HEAT repetir Ácidos Nuclei- cos proteínas cos ARM repetir DARPINS Hidrolases Polipeptídeos proteínas carboidratos | DNAses Quinase Fragmentos va- riáveis de cadeia única (scFv) Receptores de | Enzimas Lipoproteínas Proteínas de re- superfície celu- petição de tetra- lar tricopeptídeo Inibidor de C1 | Proteína de liga- | CR3 Fator | ção C4 Receptor de CD59 CR4 Fator de restri- cadeia beta C3 ção homólogo C3aR CR1 Fator de acele- | Proteína de co- ração de de- fator de mem- caimento (DAF)| brana (MCP) | Eneimas triacilglicerol| li- | ácido biliar-CoA feruloil esterase | fosfatidato fos- pase hidrolase fatase (S)-metilmalonil- | bis(2-etil-hexil) | formol-CoA hi- | fosfatidilglicero- CoA Hidrolase | ftalato esterase | drolase fosfatase [proteína carre- | fosfatase de frutose- fosfatidilinositol adora de bisfosfoglicera- | bisfosfatase desacilase acillfosfodiestera| to se
[fosforilase] fos- | éster carboxí- | fumarilacetoa- | fosfodiesterase fatase lico hidrolases — cetase | 1,4-lactonase carboximetile- — fusarinina-C or- | fosfoglicerato nobutenolidase | nitinesterase fosfatase 11-cis-retinil- celulose- galactolipase fosfoglicolato palmitato Hidro- | polissulfatase fosfatase lase 1-alquil-2- cefalosporina-C | gluconolacto- fosfoinositida acetilglicerofos- | desacetilase nase fosfolipase C focololina Este- rase 2'-hidroxibifenil- | cerebrosídeo- glicose-1- Fosfolipase A1 2-sulfonato de sulfatase fosfatase dessulfinase Lactonase de 2- | cetraxato benzi-| glicose-6- fosfolipase A2 pirona-4,6- lesterase fosfatase dicarboxilato Nucleotidase de | hidrogenase de | glutationa tioles-| fosfolipase C 3', 5'-bifosfato clorogenato terase Hidrolase de 3- | clorofilase glicerol-1- Fosfolipase D hidroxi- fosfatase isobutiliri-CoA 3'-nucleotidase | Colinesterase — glicerol-2- hidrolase de fosfatase fosfonoacetal- deído 3-ox0adipato colina-sulfatase | glicerofosfocolo-| hidrolase de enol-lactonase lina fosfodieste- | fosfonoacetato rase 3-fitase hidrolase de co-| Glicosidases, hidrolase de loil-CoA i.e, enzimas que| fosfonopiruvato hidrolisam os compostos O e S-glicosil
Tioesterase de | condro-4- glicosulfatase fosfoproteína 4-hidroxibenzoil- | sulfatase fosfatase CoA Esterase de 4- | condro-6- Glicosilases Hidrolases de metiloxaloaceta- | sulfatase diéster fosfórico to 4-fitase citrato-liase de- | histidinol- Hidrolases de sacetilase fosfatase monoéster fos- fóricas 4- esterase de co- | lipase sensível | Hidrolases de piridoxolacto- caína a hormônios triéster fosfóri- nase cas B'-nucleotidase | cutinase Hidrolisando fosfoserina fos- compostos de | fatase N-glicosilo Desacetilase de | ciclamato sulfo- | Hidrolisando despolimerase 6-acetilglucose | hidrolase compostos de | de poli (3- N-glicosilo hidroxibutirato) 6- Endopeptidases, hidroxiacilgluta- | despolimerase Fosfogliconolac- | de cisteína tiona hidrolase | de poli (3- tonase hidroxioctanoa- to) esterase de a- Carboxipepti- hidrolase do esterase de po- aminoácido dases do tipo dímero de hi- lineuridina- cisteína droxibutirato aldeído hidrolases de a- | D- hidroximetilglu- | metilesterase amino-acil- arabinonolacto- | taril-CoA hidro- | de proteína- peptídeo nase lase glutamato acetoacetil-CoA | anel A lacto- iduronato-2- N-acil- hidrolase nase de desoxi-| sulfatase homoserina limonato lactonase que extingue o quo- rum acetoxibutinilbi- | dGTPase fosfatase de esterase de re- tiofeno desaceti- inositol-fosfato | tinil-palmitato lase esterase aceti- | di- esterase de Serina desidra- lajmalina hidrocumarina — hormônio juvenil) tase ou serina hidrolase hidroximetil transferase acetilalquilglice- | Dipeptidases quinureninase | Endopeptida- rol acetil- ses serinas hidrolase Acetilcolineste- | Dipeptídeo hi- | L- serina- rase drolases arabinonolacto- | etanolamina- nase fosfato fosfodi- esterase acetil-CoA hidro-| Dipeptidil- limonina-anel-D-| Carboxipepti- lase peptidases e lactonase dases do tipo tripeptidil- serina peptidases Acetilesterase Hidrolases di- | lipase da lipo- S- fosfóricas- proteína formilglutationa monoéster hidrolase hidrolase de dissulfogluco- | L-ramnono-1,4- | O- acetilpiruvato samina-6- lactonase acetilesterase sulfatase de sialato acetilsalicilato dodecanoil- Lisofosfolipase | esterase de si- desacetilase [proteína carre- napina adora de acil] hidrolase acetilxilan este- | Endodesoxirri- | manitol-1- Endodesoxirri- rase bonucleases fosfatase bonucleases produtoras de específicas de 3"- sítio: a cliva- fosfomonoéste- gem não é es- res pecífica quanto à sequência
Fosfatase ácida | Endodesoxirri- | Metalocarboxi- | Endodesoxirri- bonucleases peptidases bonucleases produtoras de específicas de 5- sítio, específi- fosfomonoéste- cas para bases res alteradas.
Agindo sobre Endopeptidases, Metaloendopep-| Endodesoxirri- anidridos ácidos | de mecanismo | tidases. bonucleases para catalisar o | catalítico des- específicas de movimento conhecido sítio: a cliva- transmembranar gem é especiífi- de substâncias ca quanto à sequência Agindo sobre Endorribonu- metilfosfotiogli- | esfingomielina anidridos ácidos | cleases produ- | cerato fosfatase | fosfodiesterase para facilitar o toras de 3'- movimento celu- | fosfomonoéste- lar e subcelular | res Agindo sobre Endorribonu- metilumbeliferi- | S- GTP para facili- | cleases produ- | lacetato desace-| succinilglutatio- tar o movimento | toras de 5'- tilase na hidrolase celular e subce- | fosfomonoéste- lular res Atuação nas li- | Endoribonu- monoterpeno e- | esteróide- gações fósforo- | cleases ativas | lactona hidro- lactonase nitrogênio com ácidos ri- | lase bo- ou desoxir- ribonucleicos e produzem 3'- fosfomonoéste- res
Atuação em |i- Endoribonu- N- esterase este- gações enxofre- | cleases que acetilgalacto- rol nitrogênio são ativas com | samina-4-
ácidos ribo- ou | sulfatase desoxirribonu-
cleicos e pro-
duzem 5'-
fosfomonoéste-
res actinomicina lac-| Enzimas que N- esteril-sulfatase tonase agem sobre acetilgalacto-
ácidos anidri- samina-6-
dos sulfatase hidrolase de Enzimas Atu- Desacetilase de | succinil-CoA acilcarnitina ando em liga- N- hidrolase ções carbono- acetilgalacto-
carbono saminoglicano hidrolase de acil-| Enzimas que N- Sacarose- CoA agem nas liga- | acetilglucosa- fosfato fosfa-
ções carbono- | mina-6- tase nitrogênio, ex- | sulfatase ceto nas liga-
ções peptídicas lipase de acilgli- | Enzimas que N- fosfatase de cerol atuam nas liga- - sulfoglucosami- | açúcar ções carbono- | na sulfohidro-
fósforo lase aciloxiacil hidro- | Enzimas que oleoil-[proteína | Hidrolases de lase atuam nas liga- | carreadora de | éster sulfúrico ções carbono- acil] hidrolase enxofre hidrolase de Enzimas atuan- | Peptidases tanase acilpiruvato do em ligações | ômega de éter
ADAMTS13 Enzimas que orselinato- Hidrolases de atuam nas liga- | depsídeo hidro- | tioéster ções de halo- lase genetos Adenosina de- Enzimas que oxaloacetase Hidrolases de saminase atuam nas liga- tioéter e trial- ções peptídicas quilsulfônio (peptidases) adenilil- [gluta- | Enzimas que palmitoil [proteí- | Endopeptida- mato - amônia atuam nas liga- | na] hidrolase ses de treonina ligase] hidrolase | ções fósforo- nitrogênio Hidrolase de ca- | Enzimas de palmitoil-CoA timidina fosfori- deia média-acil- | atuação em li- | hidrolase lase CoA dependente| gações enxofre- de ADP nitrogênio Hidrolase de ca- | Enzimas que pectinesterase | trealose- deia curta-acil- | atuam nas liga- fosfatase CoA dependente| ções enxofre- de ADP enxofre ADP- Éter hidrolases. | Peptidil peptí- triacetato- fosfoglicerato deo hidrolases | lactonase fosfatase Fosfatase alcali-| Exodesoxirribo- | Peptidil- Hidrolases tri- na nucleases pro- | aminoácido hi- | fosfóricas- dutoras de 5- | drolases monoéster fosfomonoéste- res hidrolase de to- | Exonucleases Peptidil- Tritionato hidro-| dos os trans- que são ativas | aminoácido hi- | lase retinil-palmitato | com os ácidos | drolases ou aci-
ribo- ou deso- laminoácido hi-
xirribonucleicos | drolases e produzem 3';-
fosfomonoéste-
res aminoacil-RNA | Exonucleases Peptidil- tropinesterase hidrolase que são ativas | dipeptidases com ácidos ri-
bo- ou desoxir-
ribonucleicos e produzem 5';-
fosfomonoéste-
res Aminopeptida- | Exorribonuclea-| fenilacetil-CoA | Ubiquitina tio- ses ses produtoras | hidrolase lesterase de 3';-
fosfomonoéste-
res arilesterase Exorribonuclea-, Fenilalanina UDP-
ses produtoras | amônia liase sulfoquinovose de 5';- sintase fosfomonoéste-
res. arilsulfatase Fator IX Fenilalanina Hi- | uricase droxilase (PAH) Endopeptidases | éster-etil-acil- | floretina hidro- | éster de cera aspárticas graxo sintase lase hidrolase b-dicetona hidrolase forbol-diéster xilono-1,4- hidrolase lactonase
Vírus Células Detritos celula- res
Lipopolissaca-| Proteína de inva- | Intermedilisina | Proteína efeto- rídeos são celular ra secretada sptP Zona de toxi- | Enterotoxina da Proteína de in- | Seeligeriolisina na occludens | cólera vasão sipA Proteína de Protease de ciste-| Componente de| Protease serina polimerização | ína toxina lota la de actina RickA Proteína de Toxina distensora | Ivanolisina Toxina Shiga polimerização | citoletal de actina RickA Adenosina Citolisina LepB Esfingomieli- monofosfato- nase proteína trans- ferase vopS adenilato- Fator necrosante Fator Letal Estafilocinase ciclase citotóxico Adenilato ci- | Citotoxina Leucotoxina Estreptoqui- clase ExoY nase Componente | Toxina dermone- | Listeriolisina Estreptolisina enzimático da | crótica ADP- ribosiltransfe- rase
Aerolisina Deubiquitinase Colagenase Estreptopaína microbiana Toxina alfa Toxina da difteria | Autotransporte | Suilisina de proteína de membrana ex- terna IlcsA Alveolisina Entero-hemolisina | Leucocidina F | Superantígeno de Panton- Valentine Alveolisina Enterotoxina Perfringolisina | Efetor secreta- do T3SS EspF Antrolisina O | Inibidor da dife- Toxina de co- | Toxina tetânica renciação celular | queluche epidérmica Proteína de Exoenzima fosfolipase Tir ativação do complexo Arp2 / 3 rickA Toxina binária | Exotoxina Ativador de TolC de ADP- plasminogênio ribosiltransfe- rase CDT Neurotoxina | fator de trocado | Pneumolisina | Toxina da sín- botulínica nucleotídeo G drome do cho- que tóxico Toxina C2, Fator de troca de | Antígeno prote-| Carboxipepti- componente Il | nucleotídeos de tor dase de zinco guanina sopE CagA Enterotoxina está- | proteína cinase | Carboxipepti- vel em calor dase de zinco Adenilato ci- | Autotransportador | Pirolisina Peptidase de- clase sensível | de serina endo- pendente de Zn à calmodulina | peptidase especií- fica para IgA
Fator inibidor | fosfatase de inosi-| Toxina de RTX do ciclo celu- | tol-fosfato lar Células tumo- | lipídeo de densi- | Triglicerídeos | Ácidos Graxos rais circulan- | dade muito baixa tes (VLDL) Metástases Lipoproteína de al-- quilomícrons Colesterol ta densidade Células Euca- | lipoproteína de apolipoproteínas riontes baixa densidade Leucemia lin- | Câncer colorretal| Macroglobuline- | Blastoma pleu- foblástica mia, Waldenstrôm, ropulmonar na aguda (ALL) infância Leucemia Craniofaringioma| câncer de mama | Gravidez e mieloide agu- | na Infância masculino câncer de da (AML) mama Carcinoma linfoma cutâneo | Histiocitoma fi- Linfoma do Adrenocortical| de células t broso maligno do | Sistema Ner- osso e osteossar-| voso Central coma (SNC) Sarcoma de | Carcinoma Duc- | Melanoma câncer de Kaposi relaci- | tal /n Situ (DCIS) próstata onado à AIDS Linfoma rela- | Tumores Embri- | Carcinoma de cé-| Cânceres ra- cionado à onais na Infância | lulas Merkel ros
AIDS trial
Câncer de Ependimoma, In-| Câncer de pesco-| carcinoma de apêndice fância ço escamoso me-| célula renal tastático com primário oculto Astrocitomas | Câncer epitelial | Carcinoma do tra-| Pélvis renal e na Infância to da linha média | ureter, câncer envolvendo o ge- | de células ne NUT transicionais Tumor teratoi- | câncer de esôfa- | Gravidez molar retinoblastoma de/rabdoide go atípico na in- fância carcinoma de | Estesioneu- Câncer de boca e| Rabdomios- célula basal roblastoma, In- orofaringe sarcoma fância Câncer do du-| Sarcoma de Síndromes de Câncer de to biliar Ewing Neoplasia Endó- | glândula sali- crina Múltipla na | var Infância câncer de be- | Tumor extrago- | Mieloma múlti- Sarcoma xiga nal de células plo/neoplasia de germinativas células plasmáti- cas Câncer nos Câncer extra- Micose fungoide | Cânceres se- ossos hepático do duto cundários biliar Câncer intes- | Câncer de olho | Síndromes Mielo-| Síndrome de tinal displásicas Sézary Glioma da Câncer de vesí- | Neoplasias mi- Câncer de pele) Haste Cere- cula biliar elodisplási- bral na Infân- cas/mieloprolifera cia tivas Tumores ce- | câncer gástrico | Distúrbios Mielo- | Câncer de pele rebrais proliferativos (não melano- Crônicos ma)
câncer de Tumor Carcinoi- | Câncer de cavi- | Câncer de mama de Gastrointesti- | dade nasal e seio| Pulmão de Cé- nal paranasal lulas Peque- nas Tumores Tumor de células| câncer nasofarín-| Câncer de In- Brônquicos na) germinativas geo testino Delga- Infância do Leucemia de | Tumores trofo- neuroblastoma Sarcoma de Burkitt blásticos gesta- tecidos moles cionais (GTT) Câncer de glioma Linfoma Não Ho- | Carcinoma de primário des- dakin células Esca- conhecido mosas Câncer se es- | Leucemia de cé- | câncer de pulmão, Câncer esca- palhou para lulas peludas de célula não pe- | moso do pes- OS OSSOS quena coço com pri- mário oculto, metastático Câncer se es- | câncer de cabe- | Câncer esofágico | Câncer de es- palhou para o | ça e pescoço tômago (gás- cérebro trico) Câncer se es- | Câncer de Cora- | câncer oral Câncer de es- palhou para o | ção, Infância tômago fígado Câncer se es- | Câncer Hepato- | Câncer de cavi- | Linfoma cutâ- palhou para celular (Fígado) | dade oral neo de células os pulmões T - vide Micose) fungoide e síndrome de Sézary Tumor Carci- | Histiocitose, cé- | Câncer de Orofa- | Câncer de tes- noide lula de Lange- ringe tículo rhans
Carcinoma de | Linfoma de Hod- | Osteossarcoma | Câncer de Primário Des- | gkin (câncer ósseo) garganta conhecido Tumores car- | câncer hipofarín- | Osteossarcoma e | Timoma e díacos (cora- | geo histiocitoma fibro-| Carcinoma ção) na infân- so maligno Tímico cia Tumor teratoi-| Melanoma Intra- | câncer de ovário | câncer de tire- de/rabdoide ocular oide atípico do sis- tema nervoso central na in- fância Tumores Em- | Tumores de célu-, Câncer Pancreá- | Câncer de cé- brionais do las das ilhotas, tico lulas de transi- Sistema Ner- | tumores neuro- ção da pelve voso Central, | endócrinos pan- renal e do ure- Infância creáticos ter Sistema ner- | câncer renal Tumores neuro- | Câncer primá- voso central endócrinos pan- | rio desconhe- creáticos (tumo- | cido res de células das) ilhotas) câncer cervi- | Histiocitose das | Papilomatose na | Ureter e pelve cal células de Lan- | Infância renal, câncer gerhans de células transicionais Cordoma, In- | câncer de laringe, Paraganglioma Câncer uretral fância coriocarcino- | Leucemia Câncer de Parati-| Câncer Uterino ma reoide Endometrial leucemia lin- | Câncer de lábio | Câncer peniano | Sarcoma uteri- focítica crôni- | e cavidade oral no ca (CLL)
Leucemia Câncer de fígado| Câncer de faringe| Câncer vaginal mieloide crô- nica (CML) Distúrbios mi- | Carcinoma lobu- |! Feocromocitoma | Câncer vulvar eloproliferati- | lar in situ (LCIS) vos crônicos câncer de có- | Tumor potencial | Tumor da hipófise] Macroglobuli- lon maligno baixo nemia de Wal- denstróm Linfoma câncer de pul- Neoplasia de cé- | Tumor de mão lulas plasmáti- Wilms; cas/mieloma múl- tiplo

Claims (83)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de: uma vesícula extracelular compreendendo uma membrana celular que liga um volume fechado, a referida membrana celular tendo uma superfície interna e uma superfície externa; e um primeiro componente imunomodulador associado à re- ferida membrana celular ou fechado dentro do referido volume fecha- do.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodula- dor é um inibidor para um regulador negativo do ponto de verificação ou um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador negativo do ponto de verificação.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizada pelo fato de que o regulador de ponto de verificação negativo é selecionado do grupo que consiste em: proteína 4 associada a linfóci- tos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de morte celular programada (PD-1), gene 3 ativado por linfócitos (LAG -3), proteína 3 contendo mucina da imunoglobulina de células T (TIM-3), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunoreceptor de células T com domínios lg e ITIM (TI- GIT), supressor de Ig do domínio V da ativação de células T ( VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor semelhante a imunoglo- bulina de células assassinas (KIR), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) , CD20, CD39 e CD73.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodula- dor é um ativador para uma molécula coestimuladora positiva ou um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coestimuladora positiva.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília do receptor de TNF.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizada pelo fato de que o referido membro da superfamília do receptor de TNF é selecionado do grupo que consiste em:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1I, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP e XEDAR.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coesti- muladora positiva é um membro da superfamília de TNF.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizada pelo fato de que o referido membro da superfamília de TNF é selecionado do grupo que consiste em: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TLIA, CD27L, Siva, CD153, ligante 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT, ligante GITR e EDA-2.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracte- rizada pelo fato de que o referido membro da superfamília TNF é CDA40L.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracte- rizada pelo fato de que o referido membro da superfamília de TNF é CD27L.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracte- rizada pelo fato de que o referido membro da superfamília TNF é OXA40L.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora positiva é uma molécula coestimuladora da superfamília CD28.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, carac- terizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora da super- família CD28 é ICOS ou CD28.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coesti- muladora positiva é ICOSL, CD80 ou CD86.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coes- timuladora positiva é CD80.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodula- dor é uma citocina ou um parceiro de ligação de uma citocina.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em:1L-2, IL-7, I1L-10, 11-12 e I1L-15.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é IL-7.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é 11-12.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizada pelo fato de que a citocina referida é IL-15.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o primeiro componente imunomodulador é um receptor de células T (TCR), um correceptor de células T, um comple- xo principal de histocompatibilidade (MHC), um antígeno leucocitário humano (HLA) ou um derivado do mesmo.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodula- dor é um ativador de um receptor ou correceptor de células T.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador de um receptor ou corre- ceptor de células T é um ativador de CD3, opcionalmente um anticorpo agonista de CD3.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodula- dor é um antígeno tumoral.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, carac- terizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoem- brionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirosinase, antígeno associado ao me- lanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CDB86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte pro- gramada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antí- geno do testículo canceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de referência.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é uma se- quência de genoma de um indivíduo.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro componente imuno- modulador é um agonista ou um antagonista.
29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodulador é um anticorpo ou um fragmento de |i-
gação ao antígeno.
30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações | a 27, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodulador é um polinucleotídeo.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: um mMRNA, um miRNA, um siRNA, um RNA antissenso, um ShRNA, um IncRNA e um dsDNA.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro componente imuno- modulador é uma proteína, um peptídeo, um glicolipídeo ou uma glico- proteína.
33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro componente imunomodulador é expresso como uma proteína de fusão exibida na superfície externa da referida vesícula extracelular.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, carac- terizada pelo fato de que a referida proteína de fusão compreende PTGFRN ou um fragmento ou uma variante do mesmo.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, carac- terizada pelo fato de que a sequência da referida proteína de fusão é SEQ ID NO:3.
36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que a referida vesícula ex- tracelular é um exossomo.
37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que a referida vesícula ex- tracelular é uma nanovesícula.
38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
39. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 38, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular compreende adicionalmente um segundo componente imunomodula- dor.
40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodu- lador é um inibidor para um regulador negativo do ponto de verificação ou um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador negativo do ponto de verificação.
41. Composição, de acordo com a reivindicação 40, carac- terizada pelo fato de que o regulador de ponto de verificação negativo é selecionado do grupo que consiste em: proteína 4 associada a linfó- citos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de morte celular programada (PD-1), gene 3 ativado por linfócitos (LAG -3), proteína 3 contendo mucina da imunoglobulina de células T (TIM-3), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunoreceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TI- GIT), supressor de Ig do domínio V da ativação de células T ( VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor semelhante a imunoglo- bulina de células assassinas (KIR), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), CD20, CD39 e CD73.
42. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodu- lador é um ativador para uma molécula coestimuladora positiva ou um ativador para um parceiro de ligação de uma molécula coestimuladora positiva.
43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora positiva é um membro da superfamília do receptor de TNF.
44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, carac-
terizada pelo fato de que o referido membro da superfamília do recep- tor de TNF é selecionado do grupo que consiste em:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1I, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP e XEDAR.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coes- timuladora positiva é um membro da superfamília de TNF.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, carac- terizada pelo fato de que o referido membro da superfamília de TNF é selecionado do grupo que consiste em: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TLIA, CD27L, Siva, CD153, ligante 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT, ligante GITR e EDA-2.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que o referido membro da superfamília TNF é CDA40L.
48. Composição, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que o referido membro da superfamília de TNF é CD27L.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizada pelo fato de que o referido membro da superfamília TNF é OXA40L.
50. Composição, de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora positiva é uma molécula coestimuladora da superfamília CD28.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, carac- terizada pelo fato de que a referida molécula coestimuladora da super- família CD28 é ICOS ou CD28.
52. Composição, de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coes- timuladora positiva é ICOSL, CD80 ou CD86.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 52, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador para uma molécula coes- timuladora positiva é CD80.
54. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodu- lador é uma citocina ou um parceiro de ligação de uma citocina.
55. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em:1L-2, IL-7, I1L-10, 11-12 e I1L-15.
56. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é IL-7.
57. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a referida citocina é 11-12.
58. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a citocina referida é IL-15.
59. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o segundo componente imunomodulador é um receptor de células T (TCR), um correceptor de células T, um complexo principal de histocompatibilidade (MHC), um antígeno leuco- citário humano (HLA) ou um derivado do mesmo.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodu- lador é um ativador de um receptor ou correceptor de células T.
61. Composição, de acordo com a reivindicação 60, carac- terizada pelo fato de que o referido ativador de um receptor ou corre- ceptor de células T é um ativador de CD3, opcionalmente um anticorpo agonista de CD3.
62. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodu- lador é um antígeno tumoral.
63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoem- brionário (CEA), antígeno epitelial de tumor (ETA), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirosinase, antígeno associado ao me- lanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CDB86, ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte pro- gramada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, Mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antí- geno do testículo canceroso, MART-1 gp100 e ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF.
64. Composição, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é derivado de uma sequência de genoma de referência.
65. Composição, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno tumoral é uma se- quência de genoma de um indivíduo.
66. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 65, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é um agonista ou um antagonista.
67. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 65, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é um anticorpo ou um fragmento de |i- gação ao antígeno.
68. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 65, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é um polinucleotídeo.
69. Composição, de acordo com a reivindicação 68, carac- terizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: um mMRNA, um miRNA, um siRNA, um RNA antissenso, um ShRNA, um IncRNA e um dsDNA.
70 Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 39 a 65, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é uma proteína, um peptídeo, um glico- lipídeo ou uma glicoproteína.
71. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 70, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é expresso como uma proteína de fusão exibida na superfície externa da referida vesícula extracelular.
72. Composição, de acordo com a reivindicação 71, carac- terizada pelo fato de que a referida proteína de fusão compreende PTGFRN ou um fragmento ou uma variante do mesmo.
73. Composição, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizada pelo fato de que a sequência da referida proteína de fusão é SEQ ID NO:3.
74. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 73, caracterizada pelo fato de que o referido segundo componente imunomodulador é diferente do referido primeiro compo- nente imunomodulador.
75. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 39 a 74, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelu- lar compreende adicionalmente um segundo componente imunomodu- lador.
76. Composição, de acordo com a reivindicação 75, carac- terizada pelo fato de que o referido terceiro componente imunomodu- lador é diferente do referido primeiro e segundo componentes imuno- moduladores.
77. Método para produzir a referida composição, como de- finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende: modificar uma célula produtora com os referidos primeiro, segundo e / ou terceiro componentes imunomoduladores; obter a referida vesícula extracelular a partir da referida cé- lula produtora; e isolar opcionalmente as referidas vesículas extracelulares obtidas.
78. Método para produzir a referida composição, como de- finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende: obter a referida vesícula extracelular a partir da referida cé- lula produtora; isolar as referidas vesículas extracelulares obtidas; e modificar a referida vesícula extracelular isolada com os referidos primeiro, segundo e / ou terceiro componentes imunomodu- ladores.
79. Método, de acordo com a reivindicação 77 ou 78, ca- racterizado pelo fato de que compreende ainda a formulação das refe- ridas vesículas extracelulares isoladas em uma composição farmacêu- tica.
80. Método para tratamento de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao referido sujeito uma quantidade terapeutica- mente eficaz da referida composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, em que a referida composição é capaz de regular de modo crescente uma resposta imune no referido indivíduo, melhorando, assim, o alvejamento do tumor do sistema imunológico do referido indivíduo.
81. Método para tratar a doença de enxerto contra hospe- deiro (GvHD) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que com- preende: administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuti- camente eficaz da referida composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, em que a referida composição é capaz de regular de modo decrescente uma resposta imune no referido indi- víduo, aliviando, assim, os sintomas de GvHD.
82. Método para tratar uma doença autoimune em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuti- camente eficaz da referida composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, em que a referida composição é capaz de regular de modo decrescente uma resposta imune no referido indi- víduo, suprimindo, assim, a atividade imune do referido indivíduo.
83. Método para tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuti- camente eficaz da referida composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 27, em que a referida composição é ca- paz de potencializar uma resposta imune ao referido antígeno tumoral, melhorando, assim, a resposta imune do referido indivíduo ao câncer.
BR112020013131-8A 2017-12-28 2018-12-28 Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória BR112020013131A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762611140P 2017-12-28 2017-12-28
US62/611,140 2017-12-28
US201862723267P 2018-08-27 2018-08-27
US62/723,267 2018-08-27
PCT/US2018/068062 WO2019133934A2 (en) 2017-12-28 2018-12-28 Exosomes for immuno-oncology and anti-inflammatory therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020013131A2 true BR112020013131A2 (pt) 2020-12-08

Family

ID=67058801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020013131-8A BR112020013131A2 (pt) 2017-12-28 2018-12-28 Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10723782B2 (pt)
EP (1) EP3731849A4 (pt)
JP (2) JP7507090B2 (pt)
KR (1) KR20200108275A (pt)
CN (1) CN111655271A (pt)
AU (1) AU2018394238A1 (pt)
BR (1) BR112020013131A2 (pt)
CA (1) CA3085471A1 (pt)
CL (1) CL2020001691A1 (pt)
CO (1) CO2020009091A2 (pt)
EA (1) EA202091134A1 (pt)
IL (1) IL275600A (pt)
MX (1) MX2020006672A (pt)
PH (1) PH12020550805A1 (pt)
SG (1) SG11202005049QA (pt)
WO (1) WO2019133934A2 (pt)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200037353A (ko) 2017-08-07 2020-04-08 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼
BR112020013131A2 (pt) 2017-12-28 2020-12-08 Codiak Biosciences, Inc. Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória
CA3093856A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Immuno-exosomes and methods of use thereof
CN112218621A (zh) 2018-04-10 2021-01-12 西北大学 包含基于靶向亲和域的膜蛋白的胞外囊泡
EP3979993A4 (en) * 2019-06-04 2023-07-05 Thomas Jefferson University EXTRACELLULAR VESICLES OF OLIGODENDROCYTES FOR THE THERAPY OF MULTIPLE SCLEROSIS
WO2021003425A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Codiak Biosciences, Inc. Methods of inducing hematopoiesis
AU2020355240A1 (en) * 2019-09-25 2022-04-21 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle compositions
EP4034150A1 (en) 2019-09-25 2022-08-03 Codiak BioSciences, Inc. Sting agonist comprising exosomes combined with il-12 displaying exosomes for treating a tumour
WO2021076808A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 Cornell University Methods for detecting and inhibiting brain metastasis
WO2021146616A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Codiak Biosciences, Inc. Cholesterol assays for quantifying extracellular vesicles
EP3858332A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bottom-up assembly of synthetic extracellular vesicles
WO2021159016A1 (en) * 2020-02-05 2021-08-12 Diadem Biotherapeutics Inc. Artificial synapses
KR102688170B1 (ko) * 2020-02-10 2024-07-24 주식회사 엑소스템텍 광 절단성 단백질을 포함하는 엑소좀 및 이의 이용
WO2021231425A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 Strm.Bio Incorporated Compositions and methods related to megakaryocyte-derived extracellular vesicles
KR102341138B1 (ko) * 2020-05-31 2021-12-21 주식회사 엑소코바이오 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법
MX2022016224A (es) 2020-06-24 2023-02-23 Chameleon Biosciences Inc Vesiculas extracelulares con inmunomoduladores.
JP2023538077A (ja) * 2020-08-17 2023-09-06 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド がんの治療方法
US20230355716A1 (en) * 2020-09-04 2023-11-09 Daegu Gyeongbuk Institute Of Science And Technology Method for screening immunogenic anticancer activity cytokine, and composition for preventing or treating cancer disease, comprising il-15 as active ingredient
US20240060983A1 (en) * 2020-12-22 2024-02-22 Verily Life Sciences Llc Methods for assaying target proteins on extracellular vesicles in plasma
CN112646781B (zh) * 2020-12-25 2023-07-25 广东省人民医院 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用
CN113040877B (zh) * 2021-03-11 2022-07-22 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种基于筋膜间隙理念治疗腹部疾病的输注外泌体系统
CN113462645B (zh) * 2021-03-26 2023-11-28 上海瑞开投资管理有限公司 包含nk细胞和植物来源的外泌体的组合物、其用途及包含其的产品
WO2022215078A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-13 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Modified cannabinoids and uses thereof
WO2022250880A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
EP4373506A1 (en) 2021-07-20 2024-05-29 AGS Therapeutics SAS Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses
WO2023021150A1 (en) * 2021-08-18 2023-02-23 Universität Duisburg-Essen A biomarker indicating the therapeutic efficacy of extracellular vesicle (ev)-preparations
CN113866413B (zh) * 2021-09-29 2023-05-30 上海市同济医院 一种结直肠癌诊断标志物及其应用
WO2023144127A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses
CN114561347A (zh) * 2022-02-25 2022-05-31 和携科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞的培养基和培养方法
WO2023195570A1 (ko) * 2022-04-08 2023-10-12 이왕재바이오연구소 주식회사 슈퍼옥시드 디스무타아제를 포함하는 항암 조성물
CN114807023B (zh) * 2022-04-29 2024-03-15 中山大学·深圳 一种细胞膜囊泡及其制备方法与应用
CN114763533B (zh) * 2022-05-17 2024-02-23 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体
WO2023229366A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Shiftbio Co., Ltd. Surface-engineered extracellular vesicles and therapeutic uses thereof
WO2023232976A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
CN115047186B (zh) * 2022-06-15 2023-02-14 暨南大学 一种外泌体检测方法
EP4309660A1 (en) 2022-07-18 2024-01-24 Lietuvos Sveikatos Mokslu Universitetas Extracellular vesicles and particles from immune cells for providing anticancer activity
WO2024088808A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof
CN117018217B (zh) * 2023-10-10 2024-01-30 天津外泌体科技有限公司 Gnai2作为细胞外囊泡支架蛋白的应用、细胞外囊泡及其制备方法和应用
CN118340915A (zh) * 2024-06-13 2024-07-16 北京恩泽康泰生物科技有限公司 一种细胞因子装载系统及制备方法和应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747660A (en) 1995-11-06 1998-05-05 The University Of Colorado Nucleic acid encoding prostaglandin F2α receptor regulatory protein
MXPA02012198A (es) 2000-06-09 2004-08-19 Teni Boulikas Encapsulacion de polinucleotidos y drogas en liposomas objetivos.
IL160142A0 (en) * 2001-08-17 2004-06-20 Anosys Inc Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes
US20040049010A1 (en) 2001-10-26 2004-03-11 Warren Bridget A Transmembrane proteins
US7803906B2 (en) 2002-03-22 2010-09-28 Gene Signal International Sa Composition comprising an angiogenesis related protein
EP1945754B1 (en) 2005-10-31 2014-07-23 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
JP5713325B2 (ja) * 2009-04-17 2015-05-07 アイシス イノヴェイション リミテッド 遺伝物質の送達用の組成物
AU2011316477A1 (en) 2010-10-11 2013-05-02 Medsaic Pty Ltd Assay for disease detection
WO2013043569A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Vical Incorporated Synergistic anti-tumor efficacy using alloantigen combination immunotherapy
US9777042B2 (en) 2011-12-15 2017-10-03 Morehouse School Of Medicine Method of purifying HIV/SIV Nef from exosomal fusion proteins
EP2687219A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-22 Universität Duisburg-Essen Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSCs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions
AU2013347838A1 (en) 2012-11-26 2015-06-11 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
AU2014231770B2 (en) 2013-03-13 2020-01-30 The University Of Queensland A method of isolating cells for therapy and prophylaxis
WO2015038075A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Agency For Science, Technology And Research Method
KR20150043937A (ko) 2013-10-15 2015-04-23 삼성전자주식회사 개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법
US9921223B2 (en) * 2013-12-04 2018-03-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Analysis of genomic DNA, RNA, and proteins in exosomes for diagnosis and theranosis
US20150174166A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Compositions for Cellular Restoration and Methods of Making and Using Same
US10772911B2 (en) * 2013-12-20 2020-09-15 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Cell free compositions for cellular restoration and methods of making and using same
ES2939760T3 (es) * 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
JP2017536096A (ja) 2014-10-09 2017-12-07 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤由来の接着細胞エクソソームおよびそれらの使用
AU2015339447B2 (en) * 2014-10-27 2021-08-12 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for natural killer cells
WO2016077639A2 (en) 2014-11-12 2016-05-19 VL27, Inc. Nanovesicular therapies
WO2016149358A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Duncan Ross Method of treatment comprising membrane-enclosed vesicle
US10427129B2 (en) 2015-04-17 2019-10-01 LLT International (Ireland) Ltd. Systems and methods for facilitating reactions in gases using shockwaves produced in a supersonic gaseous vortex
WO2016168680A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Exocyte Therapeutics Pte Ltd. Method for developing exosome-based vaccines
WO2016187717A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
KR102386735B1 (ko) * 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
CN108883138A (zh) 2015-12-30 2018-11-23 加利福利亚大学董事会 增强细胞衍生的囊泡的生产和分离的方法
KR20180122433A (ko) 2016-03-15 2018-11-12 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 치료용 막 소포
US20190125848A1 (en) * 2016-03-30 2019-05-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Dendritic cell-extracellular vesicle fusions and methods of using same
US20180128833A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-10 Metaclipse Therapeutics Corporation Methods of treating with tumor membrane vesicle-based immunotherapy and predicting therapeutic response thereto
WO2018226758A2 (en) 2017-06-05 2018-12-13 The Regents Of The University Of California Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles and treatment of inflammation and neurological damage
KR20240033086A (ko) 2017-08-25 2024-03-12 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 막 단백질을 사용한 치료용 엑소좀의 제조
BR112020013131A2 (pt) 2017-12-28 2020-12-08 Codiak Biosciences, Inc. Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019133934A3 (en) 2019-08-29
US20190202892A1 (en) 2019-07-04
IL275600A (en) 2020-08-31
US12030924B2 (en) 2024-07-09
WO2019133934A2 (en) 2019-07-04
CN111655271A (zh) 2020-09-11
MX2020006672A (es) 2020-08-31
JP2021508691A (ja) 2021-03-11
CO2020009091A2 (es) 2020-12-21
EA202091134A1 (ru) 2020-11-20
AU2018394238A1 (en) 2020-06-18
US20200407419A1 (en) 2020-12-31
KR20200108275A (ko) 2020-09-17
EP3731849A2 (en) 2020-11-04
EP3731849A4 (en) 2021-12-01
CL2020001691A1 (es) 2020-11-13
CA3085471A1 (en) 2019-07-04
US20240010705A1 (en) 2024-01-11
PH12020550805A1 (en) 2021-05-31
US10723782B2 (en) 2020-07-28
JP7507090B2 (ja) 2024-06-27
JP2023133470A (ja) 2023-09-22
SG11202005049QA (en) 2020-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020013131A2 (pt) Exossomos para imuno-oncologia e terapia anti-inflamatória
US11013764B2 (en) Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
JP2023171899A (ja) Ｓｔｉｎｇアゴニストを含む細胞外小胞
KR20200120624A (ko) 대식세포 분극화를 위한 방법 및 조성물
CN114072157A (zh) 工程化的嵌合融合蛋白组合物及其使用方法
US20230181758A1 (en) Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof
JP2023541931A (ja) 細胞への標的化送達のための薬剤および方法
IL298279A (en) Immune cells with increased function
KR20220094221A (ko) 종양의 치료를 위한 il-12 디스플레잉 엑소좀과 조합된 sting 효능제 포함 엑소좀
IL292355A (en) Compositions and methods for in vitro activation and expansion of serial killer t-cell populations and passive vaccination of a cancer patient with tumor cell-killing cells
CA3090659A1 (en) Modulation of p62 and sting activity
CN114901304A (zh) 涉及经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的治疗
JP2022519275A (ja) エクソソーム操作のための膜タンパク質足場
US20230220068A1 (en) Anti-transferrin extracellular vesicles
AU2018308982A1 (en) Methods and compositions for the treatment of cancer
CN113874389A (zh) 用于特异性活化免疫效应细胞的白介素-2受体(il2r)和白介素-2(il2)变体
WO2023145961A1 (ja) ＩＧＦ１Ｒを標的とするｐｒｅ－ｐｒｏ前駆体型キメラ抗原受容体発現細胞
CN116916940A (zh) 工程化嵌合融合蛋白组合物及其使用方法
JP2023527067A (ja) 免疫調節複合体および治療のためのその使用
WO2023172989A2 (en) Epo receptor agonists and antagonists
KR20230132806A (ko) 키메라 표적 인자 수용체

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]