CN110934851B - 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents

靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110934851B
CN110934851B CN201911149582.9A CN201911149582A CN110934851B CN 110934851 B CN110934851 B CN 110934851B CN 201911149582 A CN201911149582 A CN 201911149582A CN 110934851 B CN110934851 B CN 110934851B
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
polypeptide
alpha
spion
ctnf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911149582.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110934851A (zh
Inventor
饶磊
庄满娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201911149582.9A priority Critical patent/CN110934851B/zh
Publication of CN110934851A publication Critical patent/CN110934851A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110934851B publication Critical patent/CN110934851B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Abstract

本发明提供一种靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法，构建了一个具有主动靶向性能的纳米传递系统(CTNF‑α‑exosome‑SPION)。通过基因工程融合多肽分布到外泌体表面，并通过转铁蛋白与外泌体上的转铁蛋白受体的结合将SPION连接到外泌体上。在外加磁场的帮助下，SPION的主动靶向性使负载药物获得了更高的局部浓度。另外融合蛋白的亲脂性，通过外泌体的递送，更多与分布在细胞表面的受体结合，增强激活活性。该载药系统能够将多肽药物递送病灶部位细胞表面多肽受体所在位置，进而提高多肽药物靶向性和激活活性。

Description

靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料、基因工程领域，具体涉及一种具有靶向细胞膜作用的外泌体纳米载药系统及其制备方法。
背景技术
近年来，外科手术和多药化疗的进展改善了患者的手术结果和生活质量。然而，大多数临床抗癌药物由于对正常细胞有毒性，且缺乏靶向性，其治疗效果存在显著副作用。纳米生物材料的出现为癌症药物治疗开辟了新的前景。利用纳米材料系统的协同增效治疗可以显著降低抗癌药物的剂量，减轻毒副作用，增加靶向药物的递送。
肿瘤坏死因子是最早用于癌症治疗的细胞因子,肿瘤坏死因子显著抑制肿瘤血管生成以及癌细胞增殖。但天然肿瘤坏死因子的稳定性差，分布广泛，缺乏靶向性，使其临床应用的抗癌潜力受到系统性毒性的限制，人们尝试通过被动靶向、融合蛋白等来降低它的全身毒性。在生物技术和纳米技术发展的推动下，纳米医学在癌症治疗、诊断和细胞成像方面的应用取得了巨大的成就。因此，开发一个有高效针对性的纳米传输系统，有效地递送治疗药物是一个有前景的方向。理想的给药系统应该是安全有效的，具有最佳的生物利用度，减轻毒性和免疫原性。近年来的研究表明，外泌体具有较低的免疫原性和较高的耐受性，是理想的药物和基因传递载体，与现有的载体递送系统相比具有诸多优势。
外泌体(exosome)是存在于真核生物液体，如血液、尿液和细胞培养基中的纳米级膜泡。外泌体具有关键的纳米颗粒特性，如增强的通透性和被动靶向(EPR)效应，可被动富集在肿瘤组织。外泌体由脂质双分子层组成，在其表面暴露各种跨膜蛋白的胞外结构域。它们的特殊来源使外泌体能够通过细胞间的转运参与细胞间的通讯。因此，外泌体可以作为有效的纳米递送载体，递送干扰RNA和microRNAs或化疗药物到达目标组织细胞内，以改善癌症的治疗。但通常，各种细胞因子的受体分布在细胞表面，而将大部分细胞因子递送到细胞内，无法提高肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法，该载药系统能够将多肽药物递送病灶部位细胞表面多肽受体所在位置，进而提高多肽药物靶向性和激活活性。
本发明的主要构思是：通过基因工程融合多肽分布到外泌体中，并通过转铁蛋白与外泌体上的转铁蛋白受体的结合将SPION连接到外泌体上，构建一个具有主动靶向性能的纳米传递系统(CTNF-α-exosome-SPION)。在外加磁场的帮助下，SPION的主动靶向性使负载药物获得了更好的局部浓度。另外融合蛋白的亲脂性，通过外泌体的递送，更多与分布在细胞表面的受体结合，增强激活活性。
重组载体质粒转染的细胞可以产生外泌体，外泌体的膜上可分布质粒表达的蛋白。此外，来自间充质干细胞的外泌体已被证明具有高生产力和低免疫原性，是构建稳定表达细胞系的良好细胞系。
超顺磁纳米铁(SPION)因其超顺磁性，用于药物靶向既能有效保持载体分散性又可实现主动靶向，通过外部磁场定向到所需的区域。SPION的稳定性是在生物介质中防止结块的必要条件。羧基化壳聚糖(CS)是一种有效和常见的材料，修饰SPION增加其稳定性，并具有良好生物相容性。
本发明提供的靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统，包括负载亲脂性融合多肽的外泌体和超顺磁纳米铁，所述融合多肽通过基因工程融合多肽药物与穿膜肽得到，并通过穿膜肽的亲脂性分布到外泌体膜表面；所述超顺磁纳米铁分布在外泌体表面，通过转铁蛋白与外泌体表面的转铁蛋白受体结合而连接到外泌体上；超顺磁纳米铁在外部磁场作用使外泌体载体具有靶向能力。
本发明提供的靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统的制备方法包括以下步骤：
(1)构建重组质粒
采用重叠PCR技术，将肿瘤坏死因子TNF-α胞外段序列用柔性七肽与穿膜肽CPP序列连接融合，构建融合蛋白基因；所述连接是设计两对引物进行连接，TNF-α胞外段序列用引物F1和R1扩增逆转录的cDNA，CPP序列用引物F2和R2进行扩增，通过重叠PCR技术，使用引物F2和R1将TNF-α胞外段基因与CPP的N端连接；对融合蛋白基因和质粒pIREsneo3-CTNF-α分别进行Nhe I和BamH I双酶切，限制性酶切位点Nhe I和BamH I分别通过引物设计引入引物F1和引物R2，通过引物导入融合蛋白基因，构建可表达CTNF-α的重组质粒；
(2)构建负载多肽的外泌体CTNF-α-exosome
使用Lipofectamine 2000负载重组质粒，转染间充质干细胞MSC，将细胞在细胞培养皿中培养3天后，当融合达到80％时，收集含有外泌体的细胞培养上清液，用PBS缓冲液透析24h，然后离心除去细胞，上层清液再次离心，通过过滤膜过滤去除死细胞和细胞碎片，得到含有负载多肽的外泌体CTNF-α-exosome的滤液；
(3)将超顺磁纳米铁作为靶头与负载多肽外泌体结合
将含CTNF-α-exosome滤液与转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁(Tf-SPION)溶液按照外泌体：转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁的质量比为(5～20):1的比例混合，在3～5℃孵育7～9h，经磁分离去除上清液，用PBS缓冲液洗涤，得到靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统(CTNF-α-exosome-SPION)。
进一步地，所述转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁通过以下方法制备：
(1)羧基化壳聚糖修饰的超顺磁纳米铁的制备
将FeCl3溶液和FeCl2溶液按照Fe3+和Fe2+的摩尔比为1:(1.7～1.8)混合，然后加入羧基化壳聚糖搅拌均匀，羧基化壳聚糖的加入量使其在体系中的终浓度为0-0.64mg/mL，搅拌均匀，调节pH值9～10，置于70～90℃的水浴中0.5～8h，然后蒸馏水透析48小时以上进行脱盐，获得壳聚糖稳定的超顺磁纳米铁(CS-SPION)；
(2)转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁制备
按照将CS-SPION、碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHS)按照摩尔比1:2:3混合均匀，其中，CS-SPION的摩尔量以超顺磁纳米铁(SPION)的摩尔计，在室温下孵化1～1.5h，然后加入2-巯基乙醇终止反应，经磁分离后用PBS缓冲液重悬；然后添加CS-SPION质量的5％～10％的转铁蛋白(Tf)混合均匀，在3～5℃下孵育5～7h，经磁分离纯化，PBS缓冲液洗涤三次，得到转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁(Tf-SPION)，于2～5℃储存；
进一步地，所述磁分离方法是：将磁铁置于容器底部吸，通过磁铁与待分离体系中的纳米铁的相互吸引，将体系分为下层沉淀和上层清液体，然后去掉上清液实现分离纯化。
进一步地，调节pH是采用氨水调节。
进一步地，所述碳二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
本发明所述方法中，各引物序列如下表：
Figure BDA0002283164540000031
Figure BDA0002283164540000041
TNF-α胞外段序列(序列表编号5)：
FPRDLSLISPLAQAVTNPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
穿膜肽序列(序列表编号6)：
KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明将多肽靶向病灶部位细胞表面多肽受体所在位置。通过重叠PCR技术，将多肽与穿膜肽融合在一起，同时将可表达融合多肽的表达质粒转染间充质干细胞，通过融合多肽的亲脂性将多肽更多分布在细胞表面，在形成外泌体时，更多融合多肽分布在外泌体表面，从而与病灶部位细胞膜表面的受体结合，有利于提高治疗效果。
2.本发明赋予外泌体载体靶向性。通过羧基化壳聚糖稳定SPION，通过化学偶联的方式将SPION与转铁蛋白连接，形成表面富含转铁蛋白的SPION。由于外泌体表面富含转铁蛋白受体，通过转铁蛋白与受体之间的结合，将SPION锚定在外泌体上，赋予外泌体磁靶向性能，可通过外部磁场控制实现目标组织富集，进而实现对体内主动靶向。
3.本发明所述载药系统对多肽药物具有稳定作用，可有效提高多肽药物在血液循环系统中的稳定性，进而提高药物半衰期，改善治疗效果。
4.本发明所述载药系统负载多肽药物具有亲脂性，并可实现靶向性，有效提高多肽药物在目标组织的药物浓度，同时促使药物分布到细胞膜，接近受体所在位置，提高激活效应。
附图说明
图1是本发明所述载药系统构建示意图。
图2是实施例1的CTNF-α-exosome-SPION中外泌体标志性蛋白和负载多肽的蛋白质免疫印迹检测结果。
图3是实施例1的CTNF-α-exosome-SPION透射电镜图片。
图4是CTNF-α-exosome-SPION负载蛋白在血清中中稳定性检测结果图。
图5是TNF-α(多肽药物)、CTNF-α-exosome-SPION，CTNF-α-exosome-SPION/MF的促肿瘤细胞凋亡活性。
图6是TNF-α-exosome-SPION(多肽药物与外泌体复合物)与CTNF-α-exosome-SPION在穿膜肽介导下靶向细胞膜蛋白质免疫印迹检测。
图7为TNF-α、CTNF-α-exosome-SPION，CTNF-α-exosome-SPION/MF对实体瘤生长的影响。
图8为TNF-α、CTNF-α-exosome-SPION，CTNF-α-exosome-SPION/MF对小鼠的体重影响。
图9是TNF-α、CTNF-α-exosome-SPION，CTNF-α-exosome-SPION/MF对正常组织的毒性检测。
具体实施方式
以下实施案例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
以下实施例和实验中，CTNF-α-exosome-SPION/MF表示实施例1制备的CTNF-α-exosome-SPION在添加外部磁场条件下。
实施例1载药系统的制备
首先采用外泌体负载多肽药物，采用基因工程法完成外泌体对多肽药物的负载，然后将负载多肽的外泌体与转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁结合，具体步骤如下：
(1)构建重组质粒
采用重叠PCR技术，将肿瘤坏死因子TNF-α胞外段序列(用逆转录PCR提取)用柔性七肽与穿膜肽CPP序列连接融合，构建融合蛋白基因；所述连接是设计两对引物进行连接，TNF-α胞外段序列用引物F1和R1扩增逆转录的cDNA，CPP序列用引物F2和R2进行扩增，通过重叠PCR技术，使用引物F2和R1将TNF-α胞外段基因与CPP的N端连接；对融合蛋白基因和质粒pIREsneo3-CTNF-α分别进行Nhe I和BamH I双酶切，限制性酶切位点Nhe I和BamH I分别通过引物设计引入引物F1和引物R2，通过引物导入融合蛋白基因，构建可表达CTNF-α的重组质粒；
(2)构建负载多肽的外泌体CTNF-α-exosome
使用Lipofectamine 2000负载重组质粒，转染间充质干细胞MSC，将细胞在在细胞培养皿(10厘米)培养3天后，当融合达到80％时，收集30mL含有外泌体的细胞培养上清液，用PBS透析24h，然后以200×g离心5min，除去细胞，上层清液然后离心机在12000g×45分钟，通过0.22μm过滤器过滤去除死细胞和细胞碎片，得到的上层清液中含有CTNF-α-exosome；
(3)制备CS-SPION：将Fe3+浓度为2.5mol/L的FeCl3溶液与Fe2+浓度为2.5mol/L的FeCl2溶液按4:7混合，调节pH为5.5，加入羧基化壳聚糖CS 0-0.64mg/mL，搅拌均匀，用氨水调节pH值9～10。然后将混合物置于75℃的水浴中1.5h，随后用蒸馏水透析48小时进行脱盐，以获得直径10nm以下壳聚糖稳定的纳米铁CS-SPION。
(4)制备Tf-SPION：将200μL浓度1mg/mL的CS-SPION溶液，与EDC、NHS按照CS-SPION：EDC：NHS的摩尔比1:2:3混合均匀后再室温下孵化1h，然后加入5μL 2-巯基乙醇终止反应，激活CS-SPION被磁分离并重悬在200μLPBS缓冲液中。然后添加10μg转铁蛋白(Tf)混合，在低温的环境下孵育6小时以上，最后采用磁分离纯化，即将磁铁放在瓶底，Tf-SPION被吸引到底部后，去掉上清，再用PBS洗涤三次，得到Tf-SPION，4℃储存。
(5)将超顺磁纳米铁SPION作为靶头与负载多肽外泌体结合：将含CTNF-α-exosome滤液与Tf-SPION溶液按10:1比例混合，在4℃孵育8h。经磁分离得到CTNF-α-exosome-SPION，PBS溶液洗涤三次，得到超顺磁纳米铁修饰的多肽药物外泌体纳米载药系统(负载多肽载体复合物)CTNF-α-exosome-SPION，4℃保存备用。
实验1 CTNF-α-exosome-SPION的表征
1.exosome负载药物检测
将实施例1中制备的CTNF-α-exosome-SPION与未转染质粒细胞制备的exosome-SPION用免疫印迹法检测负载药物。
未转染质粒细胞制备的exosome-SPION的制备方法：
间充质干细胞，在细胞培养皿(10厘米)培养3天后，当融合达到80％时，收集30mL含有外泌体的细胞培养上清液，用PBS透析24h，然后以200×g离心5min，除去细胞。上层清液采用离心机在12000g离心力下离心45分钟，然后通过0.22-μm滤器过滤去除死细胞和细胞碎片，得到含有exosome的上层清液，混合200μL Tf-SPION(0.5mg/mL)，4℃孵化4h.通过磁分离得到exosome-SPION。
结果见图2，载有融合蛋白基因的重组质粒在宿主细胞中实现表达，并成功分布到该细胞分泌的外泌体中。未转染质粒细胞制备的exosome-SPION未检测到负载的融合蛋白CTNF-α，说明通过重组质粒在宿主细胞的表达，成功将TNF-α负载到载体exosome-SPION上。
2.透射电镜观察
透射电镜结果如图3所示，本发明制备的负载多肽药物的载体复合物CTNF-α-exosome-SPION与SPION成功偶联，分布良好。图中细节显示分布在外泌体上的可分辨纳米铁颗粒，证实CTNF-α-exosome-SPION的成功构建。
实验2载药系统CTNF-α-exosome-SPION对多肽药物的稳定性影响检测
检测方法：药物在血清里，加入时溶液TNF-α浓度55μg/ml，37℃孵育，隔天取样，酶联免疫吸附测定法检测TNF-α含量。
通过对本CTNF-α-exosome-SPION中多肽的稳定性检测结果如图4。在37℃，血清环境，多肽装载在外泌体载体中明显减慢多肽的降解速度，说明载体对负载的多肽药物具有良好的保护作用，能够提高药物稳定性，有助于提高其治疗效果。
实验3多肽药物肿瘤杀伤力的检测
实验方法：将人黑色素瘤细胞A375以0.5×104cells/well的密度播种在96孔板中，培养24小时后，添加梯度浓度药物TNF-α、CTNF-α-exosome-SPION、CTNF-α-exosome-SPION/MF再培养24h。之后，每孔细胞换成100μL MTT(0.5mg/mL)孵育，在37℃孵育4h，每30分钟摇动一次96孔板。100μL甲醇添加到每个培养孔，直到所有晶体溶解。采用多功能酶标仪测量490nm处的吸光度，比较各孔细胞活性。
结果见图5，通过孵育人黑色素瘤细胞A375，CTNF-α-exosome-SPION在外加磁场作用下，显著降低肿瘤细胞的细胞活性，对肿瘤细胞的杀伤效果优于TNF-α和CTNF-α-exosome-SPION不加磁场的情况。
实验4 CTNF-α-exosome-SPION对多肽药物细胞膜靶向递送的考察
实验方法：将TNF-α采用电穿孔法负载到exosome-SPION，构建TNF-α并未分布到膜上的TNF-α-exosome-SPION，以便与TNF-α分布到膜上的CTNF-α-exosome-SPION比较。
采用电穿孔法完成exosome-SPION对多肽药物的包载的方法为：将多肽药物溶液与外泌体溶液按多肽药物与外泌体的质量比1:3混合搅拌，在电压300V，脉冲宽度150ms条件下一次脉冲完成电穿孔载药，然后在37℃下孵育30min，确保外泌体的质膜完全恢复，得到负载多肽药物外泌体TNF-α-exosome-SPION。
采用免疫共沉淀方法检测TNF-α-exosome-SPION与CTNF-α-exosome-SPION对细胞膜受体TNFRI的结合能力。A375以1×105cells/well细胞密度在6孔板培养48h。随后TNF-α-exosome-SPION与CTNF-α-exosome-SPION以2.5nmol/L浓度孵育细胞1h.随后提取每孔全蛋白，以TNFRI为内参，检测与TNFRI结合的TNF-α。
SPION结合的负载多肽药物的纳米载体复合物在外加磁场作用下，将多肽靶向细胞膜的检测。作为对照，通过电穿孔法多肽被加载到偶联SPION的外泌体中构建TNF-α-exosome-SPION。
结果见图6，CTNF-α-exosome-SPION的膜结构上比TNF-α-exosome-SPION的膜结构上负载有更多的多肽。两种不同方式负载多肽药物的载体分别孵育细胞，提取细胞膜上的受体TNFR I，免疫共沉淀实验表明，CTNF-α-exosome-SPION孵育细胞上结合有更多TNF-α，说明CTNF-α-exosome-SPION促进更多TNF-α与受体TNFR I结合。
实验5 CTNF-α-exosome-SPION对实体瘤生长的影响
构建体内黑色素瘤实体瘤模型，进一步调查负载多肽药物的纳米载体CTNF-α-exosome-SPION对肿瘤生长的影响。
实验方法：将6周龄BALB/c雌性小鼠模型安置在一个可调节温度和照明的环境中(25±2℃,12小时亮/暗循环)，适应性饲养1周后，用小鼠进行下一步实验。将B16F10细胞(2.0×106cells/mouse)植入小鼠右侧背部区域，植入后5天，选取肿瘤大小约100mm3的小鼠为模型小鼠，随机分为4组，每组6只。分别对每组小鼠每隔三天分别静脉等剂量注射生理盐水(对照)、TNF-α、CTNF-α-exosome-SPION、CTNF-α-exosome-SPION(其中两组均注射CTNF-α-exosome-SPION，方便后续考察加和不加外部磁场下的情况)，每次注射剂量以TNF-α计5mg/kg体重。所有动物于种植B16F10细胞后第25天称量体重，安乐死后，取肿瘤组织测量肿瘤重量。
结果如图7所示，CTNF-α-exosome-SPION在外部磁场作用下具有更好的肿瘤抑制效果，表明其良好的靶向性能。同时，相比TNF-α，CTNF-α-exosome-SPION由于具有被动靶向(EPR)效应以及更好的稳定性而具更好的肿瘤抑制效果。
实验6 CTNF-α-exosome-SPION对小鼠的毒性作用考察
实验方法：
本实验方法与实验5中描述的小鼠处理方法一致，在安乐死小鼠之前，称量各组小鼠体重。
结果如图8所示，CTNF-α-exosome-SPION在外部磁场条件下对小鼠体重影响最小，小鼠体重与对照最为接近，而单纯多肽与不加磁场条件下的CTNF-α-exosome-SPION小鼠体重下降明显，说明通过外部磁场作用使CTNF-α-exosome-SPION靶向组织，减少了药物的毒副作用。
实验7 CTNF-α-exosome-SPION处理正常小鼠后各组织的病理变化考察
考察CTNF-α-exosome-SPION在外部磁场条件下对小鼠主要组织器官的毒性作用。
实验方法：本实验分组与实验5分组一样，实验方法与实验5中描述的小鼠处理方法一致。小鼠组织标本(肿瘤、心脏、肝脏、脾脏和肾脏)用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。组织样本被加工成5μm厚切片，进行HE染色。
结果如图8所示，CTNF-α-exosome-SPION/MF组各主要组织并未发现明显毒性作用，表明负载多肽药物的纳米载体CTNF-α-exosome-SPION/MF在外部磁场条件下更多分布到肿瘤组织，正常组织分布较少，多肽的毒性副作用显著减低。CTNF-α-exosome-SPION组肝脏出现炎症细胞浸润，肺毛细血管充血，肺壁不规则增厚，脾出现大量炎性与坏死细胞。表明exosome-SPION对TNF-α的保护可增加其药效，同时影响细胞毒性，但磁场MF的控制减少了正常组织的药物分布，因此减少了对正常组织的毒性。
序列表
<110> 饶磊
<120> 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法
<141> 2019-11-21
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cggctagctt ccccagggac ctctctct 28
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gtctcccacc aggtctcctt gccggagccg gagccgccgc cgcctcacag ggcaatgatc 60
ccaaag 66
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctttgggatc attgccctgt gaggcggcgg cggctccggc tccggcaagg agacctggtg 60
ggagacb 67
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgggatccct cgacaaaagc aattccaagg g 31
<210> 5
<211> 155
<212> PRT
<213> 人体()
<400> 5
Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn
20 25 30
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
35 40 45
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
50 55 60
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
85 90 95
Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp
100 105 110
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
115 120 125
Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
130 135 140
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人体()
<400> 6
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人体()
<400> 7
gccggagccg gagccgccgc cgcc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人体()
<400> 8
ggcggcggcg gctccggctc cggc 24

Claims (6)

1.一种靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统，其特征在于，包括负载亲脂性融合多肽的外泌体和超顺磁纳米铁，所述融合多肽为通过基因工程融合多肽药物肿瘤坏死因子TNF-α与穿膜肽CPP得到的CTNF-α，并通过穿膜肽的亲脂性分布到外泌体膜表面；所述超顺磁纳米铁分布在外泌体表面，通过转铁蛋白与外泌体表面的转铁蛋白受体结合而连接到外泌体上；超顺磁纳米铁在外部磁场作用使外泌体载体具有靶向能力。
2.靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建重组质粒
采用重叠PCR技术，将肿瘤坏死因子TNF-α胞外段序列用柔性七肽与穿膜肽CPP序列连接融合，构建融合蛋白基因；所述连接是设计两对引物进行连接，TNF-α胞外段序列用引物F1和R1扩增逆转录的cDNA，CPP序列用引物F2和R2进行扩增，通过重叠PCR技术，使用引物F2和R1将TNF-α胞外段基因与CPP的N端连接；对融合蛋白基因和质粒pIREsneo3-CTNF-α分别进行Nhe I和BamH I双酶切，限制性酶切位点Nhe I和BamH I分别通过引物设计引入引物F1和引物R2，通过引物导入融合蛋白基因，构建可表达CTNF-α的重组质粒；
(2)构建负载多肽的外泌体CTNF-α-exosome
使用Lipofectamine 2000负载重组质粒，转染间充质干细胞MSC，将细胞在细胞培养皿中培养3天后，当融合达到80％时，收集含有外泌体的细胞培养上清液，用PBS缓冲液透析24h，然后离心除去细胞，上层清液再次离心，通过过滤膜过滤去除死细胞和细胞碎片，得到含有负载多肽的外泌体载体CTNF-α-exosome的滤液；
(3)将超顺磁纳米铁作为靶头与负载多肽外泌体结合
将含CTNF-α-exosome滤液与转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁溶液按照外泌体：转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁的质量比为(5～20):1的比例混合，在3～5℃孵育7～9h，经磁分离去除上清液，用PBS缓冲液洗涤，得到靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁通过以下方法制备：
(1)羧基化壳聚糖修饰的超顺磁纳米铁CS-SPION的制备
将FeCl 3 溶液和FeCl 2 溶液按照Fe 3+ 和Fe 2+ 的摩尔比为1:(1.7～1.8)混合，然后加入羧基化壳聚糖搅拌均匀，羧基化壳聚糖的加入量使其在体系中的终浓度为0～0.64mg/mL，搅拌均匀，调节pH值9～10，置于70～90℃的水浴中0.5～8h，然后蒸馏水透析48小时以上进行脱盐，获得壳聚糖稳定的超顺磁纳米铁；
(2)转铁蛋白修饰的超顺磁纳米铁制备
按照将CS-SPION、碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐按照摩尔比1:2:3混合均匀，其中，CS-SPION的摩尔量以超顺磁纳米铁的摩尔计，在室温下孵化1～1.5h，然后加入2-巯基乙醇终止反应，经磁分离后用PBS缓冲液重悬；然后添加CS-SPION质量的5％～10％的转铁蛋白混合均匀，在3～5℃下孵育5～7h，经磁分离纯化，PBS缓冲液洗涤，得到转铁蛋白修饰的超顺磁纳米。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述磁分离方法是：将磁铁置于容器底部吸，通过磁铁与待分离体系中的纳米铁的相互吸引，将体系分为下层沉淀和上层清液体，然后去掉上清液实现分离纯化。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，调节pH是采用氨水调节。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述碳二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
CN201911149582.9A 2019-11-21 2019-11-21 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法 Active CN110934851B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911149582.9A CN110934851B (zh) 2019-11-21 2019-11-21 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911149582.9A CN110934851B (zh) 2019-11-21 2019-11-21 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110934851A CN110934851A (zh) 2020-03-31
CN110934851B true CN110934851B (zh) 2021-09-28

Family

ID=69907225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911149582.9A Active CN110934851B (zh) 2019-11-21 2019-11-21 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110934851B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113679850B (zh) * 2020-05-19 2023-05-19 首都医科大学附属北京天坛医院 一种被靶向修饰且装载有药物的外泌体及其制备方法和应用
CN111569082B (zh) * 2020-06-11 2021-12-24 四川大学 一种包载蛋白多肽类药物外泌体的口服递送系统
CN114874990A (zh) * 2021-02-05 2022-08-09 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种功能化外泌体及其制备方法和应用
CN113041358B (zh) * 2021-03-26 2022-09-06 江苏大学 一种超顺磁修饰中性粒细胞外泌体仿生囊泡药物递送生物制剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109293745A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 暨南大学 一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用
CN109432434A (zh) * 2018-11-12 2019-03-08 南京市第二医院（江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心） 一种靶向复合外泌体及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10702581B2 (en) * 2015-05-04 2020-07-07 Ilias Biologics Inc. Compositions containing protein loaded exosome and methods for preparing and delivering the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109293745A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 暨南大学 一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用
CN109432434A (zh) * 2018-11-12 2019-03-08 南京市第二医院（江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心） 一种靶向复合外泌体及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Hybrid System for Magnetic Hyperthermia and Drug Delivery: SPION Functionalized by Curcumin Conjugate;Dorota Lachowicz等;《Materials》;20181127;第1-17页 *
NRP-1 targeted and cargo-loaded exosomes facilitate simultaneous imaging and therapy of glioma in vitro and in vivo;Gang Jia等;《Biomaterials》;20180621(第178期);第302-316页 *
间充质干细胞来源的外泌体通过TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制高糖诱导的成纤维细胞转分化;兰蓓蓓等;《中国细胞生物学学报》;20170527;第39卷(第7期);第916-925页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110934851A (zh) 2020-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110934851B (zh) 靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法
Zhuang et al. SPION decorated exosome delivery of TNF-α to cancer cell membranes through magnetism
EP2673001B1 (en) Nts-polyplex nanoparticles system for gene therapy of cancer
CN108175759B (zh) 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
CN109529046B (zh) 一种靶向线粒体的自组装蛋白质纳米颗粒的制备与应用
US20050202075A1 (en) Delivery of genes encoding short hairpin RNA using receptor-specific nanocontainers
CN102596179A (zh) 脂质体组合物及其用途
Yang et al. Magainin II modified polydiacetylene micelles for cancer therapy
Huang et al. Systemic and tumor-targeted delivery of siRNA by cyclic NGR and iso DGR motif-containing peptides
Noguchi et al. Effects of lyophilization of arginine-rich cell-penetrating peptide-modified extracellular vesicles on intracellular delivery
CN117384859B (zh) 一种树突状细胞来源的外泌体的制备方法及应用
WO2014058179A2 (ko) 저밀도 지단백질 유사 나노입자 및 이를 포함하는 간 표적 진단 및 치료용 조성물
CN111035769A (zh) 超顺磁纳米铁修饰的外泌体载药纳米系统及其制备和血糖响应方法
CN113105556B (zh) 一种修饰erk多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子及其制备方法和应用
US20210180089A1 (en) Nanoparticles for transfection
CN115814108A (zh) 一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法
CN108383912A (zh) 人工融合蛋白及其用途
CN114874990A (zh) 一种功能化外泌体及其制备方法和应用
Tuttolomondo et al. Magnetic nanoparticles for nucleic acid delivery: Magnetofection, gene therapy and vaccines
JP6778923B2 (ja) 薬剤送達用複合体
CN117402831B (zh) 规模化、定制化的树突状细胞外泌体在抗肿瘤中的应用
CN114081965B (zh) 一种外泌体递送载体及其制备方法、应用
Mentkowski et al. Surface engineering enhances the therapeutic potential of extracellular vesicles following acute myocardial infarction
KR102274877B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
CN113214353B (zh) 两亲性寡肽结构物质

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant