CN105624141A - 一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法及其在降解氯代酚中的应用 - Google Patents

一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法及其在降解氯代酚中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法及其在降解氯代酚中的应用，本发明通过高效磁性细胞包埋固定化方法来降解氯代酚。采用卡拉胶等固定化材质添加Fe3O4磁性颗粒的固定化方法不仅降低了传统的固定化过程的传质阻力，是固定化细胞的降解速率高于常规固定化方法；而且由于材质中含有磁性颗粒，可以用外加磁场非常方便的回收固定化细胞，重复利用固定化细胞，从而显著增加该方法的经济竞争力。本发明中所述的方法在氯代酚废水处理过程中具有巨大的应用潜力。

Description

一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法及其在降解氯代酚中的应用
技术领域
本发明属于应用微生物与环境工程技术领域，涉及一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法及其在降解氯代酚中的应用。
背景技术
氯代酚类化合物是合成有毒有机物中的一大类，对许多微生物具有抑制毒害作用，在环境中难以被微生物分解，属于难降解有机物。此类化合物是美国环保局（EPA）重点控制的129种优先污染物（prioritypollutions）之一，我国也将其列在重点污染物的黑名单之中。氯代酚类化合物在化工、农药、医药、造纸、防腐剂等工业中得到广泛应用，同时也导致了严重的环境问题。其中2-氯代酚、4-氯代酚和2,3-二氯代酚是较为常见的污染物。它们常作为木材的防腐剂、除草剂、杀菌剂、溶剂以及热交换过程中的工业生产废弃物而释放到环境中，对水体和土壤造成了很大的危害。对于有毒有机物的污染控制，生物处理技术由于成本较低，降解彻底等特点而受到人们的青睐。由于氯代酚类化合物具有杀菌作用，它们更难于被生物降解，因此氯代酚的微生物降解收到重视。
国内外已有许多氯代酚类化合物微生物降解的研究报道。但是由于氯代酚对微生物的毒性，使用游离的微生物细胞降解氯代酚存在降解效率不高，生物催化剂失活的缺陷。
相比较游离细胞，使用固定化的细胞降解氯代酚可以提高生物催化剂的耐受性，并且固定化细胞可以重复利用，可以提高生物处理的经济性。进而，纳米磁性颗粒可以增加固定化颗粒的比表面积，更有利于生物催化剂接触底物，因此采用纳米磁性颗粒固定化细胞，可以解决常规固定化细胞存在的物质传输障碍的问题，具有较广阔的应用前景。
发明内容
为了解决上述现有技术中采用游离的微生物细胞降解氯代酚存在降解效率不高、生物催化剂失活等问题，本发明研究了一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法。
本发明还提供了所述得到的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用。
本发明技术方案如下：
一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：将苯胺降解菌接种于M65培养基中，28℃恒温培养24h，然后4000r/min离心10min，收集菌丝细胞，再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤两次，分散于水中，制得苯胺降解菌细胞悬液，备用；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：从下述a）和b）中任选一种方法：
a）将琼脂糖或卡拉胶加热至完全溶化，50℃保温加入步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液和Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，降温至4℃，得固体混合物，将该混合物切割为3mm×3mm的均匀颗粒，然后将颗粒置于质量分数为3％氯化钾水溶液中固定2h，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌；
步骤a）中，所述琼脂糖或卡拉胶与苯胺降解菌细胞悬液质量比为3：1。
b）将质量百分数为1%的结冷胶水溶液或质量百分数为2%的海藻酸钠水溶液与步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液按体积比1:1混合，并加入Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，然后均匀滴加至质量分数为2%的氯化钙水溶液中，固定2h，生成球状颗粒，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌；
步骤1）中，所述苯胺降解菌细胞悬液OD600=300。
步骤1）中，所述培养基为M65培养基，其成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和10g/L的麦芽提取物，培养基pH7.2。
步骤2）中，所述Fe3O4纳米磁性颗粒加入浓度为3～12g/L，优选9g/L。
所述的苯胺降解菌为玫瑰色红球菌DSM6263（RhodococcusrhodochrousDSM6263）购自德国菌种保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH）
本发明方法制备得到的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用，所述氯代酚为2-氯代酚、4-氯代酚或2,3-二氯代酚。
所述纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用，方法为：
1）制备纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌；
2）向氯代酚样品中加入步骤1）制备的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，于180rpm、28℃摇床中，反应21～24h，至氯代酚充分降解。
上述应用，步骤2）中，所述氯代酚样品为0.25mM的氯代酚－磷酸缓冲液；
上述应用，步骤2）中，所述纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌加入量为湿重14g/L；
上述应用中，纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后可回收，回收处理方式为：通过磁铁吸附回收纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，将其放置于M65培养基中活化30min，取出后再用去离子水洗涤2遍。
上述应用中，纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌可至少回收重复使用7批次。
本发明的有益效果为：
采用纳米磁性颗粒固定化高效苯胺降解菌，固定化的细胞可以高效的降解2-氯代酚，4-氯代酚和2,3-二氯代酚。降解浓度高，速度快。同时由于固定化材质中含有磁性颗粒，可以方便的用外部磁场从水体中回收固定化细胞，极大的方便的生物催化剂的回收和再利用，有利于降低生物处理成本，在氯代酚废水处理过程中具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为不同材质固定化的细胞对2-氯代酚的降解情况；
图2为不同材质固定化的细胞对4-氯代酚的降解情况；
图3为不同材质固定化的细胞对2,3-二氯代酚的降解情况；
图4为添加不同浓度Fe3O4磁性颗粒的固定化细胞对2-氯代酚的降解情况；
图5为重复利用磁性固定化的细胞对2-氯代酚的降解情况。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：将苯胺降解菌接种于成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和10g/L的麦芽提取物、pH7.2的M65培养基中，28℃恒温培养24h，然后4000r/min离心10min，收集菌丝细胞，再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤两次，分散于水中，制得苯胺降解菌细胞悬液，OD600=300，备用；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：将卡拉胶加热至完全溶化，50℃保温并按质量比为3：1加入步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液和浓度为9g/L的Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，降温至4℃，得固体混合物，将该混合物切割为尺寸3mm×3mm的均匀的颗粒，然后将颗粒置于质量分数为3％氯化钾水溶液中固定2h，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌。
实施例1苯胺降解菌为玫瑰色红球菌DSM6263（RhodococcusrhodochrousDSM6263）购自德国菌种保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH），下同。
实施例2
一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：同实施例1；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：将琼脂糖加热至完全溶化，50℃保温并按质量比为3：1加入步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液和浓度为6g/L的Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，降温至4℃，得固体混合物，将该混合物切割为尺寸3mm×3mm的均匀的颗粒，然后将颗粒置于质量分数为3％氯化钾水溶液中固定2h，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌。
实施例3
一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：同实施例1；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：将质量百分数为1%的结冷胶水溶液与步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液按体积比1:1混合，并加入浓度为3g/L的Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，用移液管均匀滴至质量分数为2%的氯化钙水溶液中，固定2h，生成球状颗粒，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌。
实施例4
一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：同实施例1；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：将质量百分数为2%的海藻酸钠水溶液与步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液按体积比1:1混合，并加入浓度为12g/L的Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，用移液管均匀滴至质量分数为2%的氯化钙水溶液中，固定2h,生成球状颗粒，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌。
实施例5
本发明方法制备得到的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用，方法为：
1）制备纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，方法同实施例1；
2）向含有2-氯代酚的样品（样品为0.25mM的氯代酚－磷酸缓冲液）中加入步骤1）制备的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌加入量为14g湿重/L，然后于180rpm、28℃摇床中，反应24h，至氯代酚充分降解。
纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后回收，回收处理方式为：通过磁铁吸附回收纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，将其放置于M65培养基中活化30min，取出后再用去离子水洗涤2遍。
实施例6
本发明方法制备得到的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用，方法为：
1）制备纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，方法同实施例3；
2）向含有2-氯代酚、4-氯代酚和2,3-二氯代酚的样品（样品为0.25mM的氯代酚－磷酸缓冲液）中加入步骤1）制备的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌加入湿重为14g/L，然后于180rpm、28℃摇床中，反应21h，至氯代酚充分降解。
纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后回收，回收处理方式为：通过磁铁吸附回收纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，将其放置于M65培养基中活化30min，取出后再用去离子水洗涤2遍。再次用于降解氯代酚，回收后纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌可重复使用7批次。
验证试验：
1、固定化材质的选择
分别采用固定化材质：卡拉胶、琼脂糖、海藻酸钠和结冷胶与死细胞及游离的活细胞对照，由不同材质固定化的细胞对2-氯代酚（如图1所示）、4-氯代酚（如图2所示）和2,3-二氯代酚（如图3所示）降解情况可知，使用上述固定化材质对氯代酚均有较好的降解，其中使用卡拉胶固定化的细胞降解效果最好。
2、Fe3O4磁性颗粒浓度
添加不同的Fe3O4磁性颗粒，浓度为3g/L、6g/L、9g/L、12g/L的加量，以不添加Fe3O4磁性颗粒（非磁性固定化细胞）为对照，如图4所示，Fe3O4磁性颗粒添加量为9g/L时，固定化细胞对2-氯代酚（选择2-氯代酚的原因为该化合物降解速率最慢）的降解速度最快。最佳的Fe3O4磁性颗粒添加量为9g/L。
3、重复利用磁性固定化细胞
在最佳的条件下，磁性固定化的细胞可以高效的降解2-氯代酚，如图5所示，固定化的细胞可以反复的使用至少6次。并且在前6批次的使用过程中，固定化的细胞均保持了较高的降解能力。在6批次的降解过程中，共计1.5mM的2-氯代酚被完全降解，显示了本发明技术在含氯代酚废水处理中的巨大潜力和经济性。

Claims (10)

1.一种纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备方法，其特征在于，步骤包括：
1）制备苯胺降解菌细胞悬液：将苯胺降解菌接种于M65培养基中，28℃恒温培养24h，然后4000r/min离心10min，收集菌丝细胞，再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤两次，分散于水中，制得苯胺降解菌细胞悬液，备用；
2）纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌的制备：从下述a）和b）中任选一种方法：
a）将琼脂糖或卡拉胶加热至完全溶化，50℃保温加入步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液和Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，降温至4℃，得固体混合物，将该混合物切割为3mm×3mm的均匀颗粒，然后将颗粒置于质量分数为3％氯化钾水溶液中固定2h，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌；
b）将质量百分数为1%的结冷胶水溶液或质量百分数为2%的海藻酸钠水溶液与步骤1）的苯胺降解菌细胞悬液按体积比1:1混合，并加入Fe3O4纳米磁性颗粒，混合均匀，然后均匀滴加至质量分数为2%的氯化钙水溶液中，固定2h，生成球状颗粒，制得纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述苯胺降解菌细胞悬液OD600=300；所述培养基为M65培养基，其成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和10g/L的麦芽提取物，培养基pH7.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述琼脂糖或卡拉胶与苯胺降解菌细胞悬液质量比为3：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述Fe3O4纳米磁性颗粒加入浓度为3～12g/L，优选9g/L。
5.权利要求1～4任一权利要求制备得到的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的应用，其特征在于：所述氯代酚为2-氯代酚、4-氯代酚或2,3-二氯代酚。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，方法为：
1）制备纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌；
2）向氯代酚样品中加入步骤1）制备的纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，于180rpm、28℃摇床中，反应21～24h，至氯代酚充分降解。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中，所述氯代酚样品为0.25mM的氯代酚－磷酸缓冲液。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中，所述纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌加入量为湿重14g/L。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后可回收，回收处理方式为：通过磁铁吸附回收纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌，将其放置于M65培养基中活化30min，取出后再用去离子水洗涤2遍。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：纳米磁性颗粒固定化苯胺降解菌可至少回收重复使用7批次。
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