CN110241110A - 利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及应用 - Google Patents

利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及应用，所述制备方法及应用包括：利用多巴胺的聚合反应对四氧化三铁磁性纳米颗粒进行表面修饰，获得固定化载体复合物；对邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行固定，获得固定化菌剂；考察固定化菌剂对邻苯二甲酸二丁酯的降解效率，其可在6d内将1000mg/L的DBP降解完全，相较于未固定化菌株降解效率提高25.68％；在曝气条件下可被磁铁有效吸附回收，并保持99.69％以上的DBP降解活性。本发明方法简单、节能环保，为污水中DBP的降解去除和功能菌剂的回收再利用提供了技术支撑。

Description

利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及 应用
技术领域
本发明涉及邻苯二甲酸二丁酯降解技术领域，具体涉及一种利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及应用。
背景技术
邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)是应用最为广泛的增塑剂，已被美国环境保护局列为优控污染物。人类长期暴露于DBP可导致多发性神经炎、脊髓神经炎和多发性脑神经炎。DBP常用于各类日常用品，包括塑料制品、化妆品、个人护理产品、油漆、杀虫剂和医疗产品，因此，人类生活产生了大量含有DBP的废弃物。由于DBP与聚合物的结合方式为物理结合而非化学结合，因此很容易从废弃物中释放。而DBP具有低水溶性和高辛醇/水分配系数，其在自然环境中相当稳定。目前，DBP已被证明普遍存在于河水、海水、土壤、沉积物和生物群中。
污水是DBP进入环境的一条重要途径。目前城市污水处理厂采用的处理工艺是一级物化处理和二级生物处理，其中二级生物处理主要发生在曝气池内，对有机物的降解去除效果较好。由于生长环境反差大，实验室所获DBP降解菌在实际处理工艺中很难发挥预期降解效果，因此增强功能菌在实际应用中的耐受性和稳定性具有十分重要的意义。
微生物固定化技术是使优势微生物固定在载体上，使其高度密集并保持其生物活性。当微生物固定化技术应用于污水处理中时，可使污水处理系统的专一性、耐受性增强，微生物本身对外部条件的适应范围会变得更宽泛，处理效果更加稳定。因此，可以通过微生物固定化技术来增强功能菌的耐受性和稳定性。相较于常规固定化载体，四氧化三铁纳米粒子具有表面积大，机械强度高，生物兼容性高等特征，而四氧化三铁特有的磁性有助于功能菌的固定、回收分离和重复利用。
发明内容
本发明针对游离邻苯二甲酸二丁酯降解菌在污水处理中的应用问题，提供一种利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法及应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
一种利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法，包括以下步骤：
1)称取四氧化三铁纳米颗粒置于Tris-HCl缓冲液中，超声，再加入多巴胺，反应，用超强磁铁分离复合材料(PD-IONPs)，用无菌水清洗去除未反应的多巴胺，得到聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料；
2)将步骤1)得到的聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料用MSM培养基配制聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，加入到邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液中，摇床固定化后，用超强磁铁进行磁分离，得到固定化菌剂。
步骤1)中，所述的四氧化三铁纳米颗粒和多巴胺的质量比为1：0.7～1.3，进一步优选为1：0.9～1.1，最优选为1：1。
所述的四氧化三铁纳米颗粒的质量、Tris-HCl缓冲液的体积之比为10mg：7～13mL，进一步优选为10mg：9～11mL，最优选为10mg：10mL。
所述的Tris-HCl缓冲液的pH为8～9，进一步优选，所述的Tris-HCl缓冲液的pH8.5，浓度为10mM，即10mmol/L。
超声10～50min，进一步优选，超声20～40min，最优选，超声30min。
所述的反应为在20℃～30℃以100～300rpm摇床混合反应0.25h～1.5h。进一步优选，为在23℃～27℃以150～250rpm摇床混合反应0.25h～1h。最优选，所述的反应在25℃以200rpm摇床混合反应0.25h，当多巴胺修饰反应时间为0.25h时，固定化效率最高。
用无菌水清洗2～3次去除未反应的多巴胺。
步骤2)中，所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液中聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料的浓度为0.5～3mg/mL，进一步优选为0.5～1.5mg/mL，最优选为1mg/mL。
所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液与邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液的体积比为1：8～12，进一步优选为9～11，最优选为1：10。
所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液的OD600为0.450～0.590，进一步优选为0.500～0.540，最优选为0.500。
所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液(即DBP降解菌溶液)的OD600为0.500。OD600是指溶液在600nm波长处的吸光值。
所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液中的邻苯二甲酸二丁酯降解菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为CICC 10910的菌种，该菌种为假单胞菌属(Pseudomonassp.)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保存编号为CICC 10910。
所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液由邻苯二甲酸二丁酯降解菌在MSM培养基中培养活化后得到。
所述的摇床固定化的条件为：0～5℃，100～300rpm，1～3h，进一步优选为0～2℃，100～200rpm，1.5～2.5h，最优选为0℃，150rpm，2h。
所述的MSM培养基以1L计，由以下重量的原料制成：
该MSM培养基的pH＝7.0。
进一步优选，所述的MSM培养基以1L计，由以下重量的原料制成：
该MSM培养基的pH＝7.0。
最优选的，所述的MSM培养基以1L计，由以下重量的原料制成：
该MSM培养基的pH＝7.0。
用超强磁铁进行磁分离后用PBS缓冲液清洗，以去除游离的功能菌。
利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法制备的固定化菌剂特别适合用于在污水中降解邻苯二甲酸二丁酯。
为表征多巴胺对四氧化三铁纳米颗粒的表面修饰效果，本发明用能谱仪分别对四氧化三铁纳米颗粒和多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒进行表面元素扫描。
本发明提供了所述磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌在污水中降解邻苯二甲酸二丁酯的应用。
更进一步的，本发明提供了所述磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的磁性回收效率、降解稳定性考察及在污水处理曝气系统中的模拟应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明利用磁性纳米颗粒对邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行固定化不仅有效提高了目标物的降解效率，还可实现降解菌的此行回收和重复利用，具有明显应用优势。
本发明利用磁性纳米颗粒对邻苯二甲酸二丁酯降解菌相较于未固定化菌株降解效率提高25.68％；固定化菌剂的磁性回收率和重复使用稳定性，其在曝气条件下可被磁铁有效吸附回收，并保持99.69％以上的DBP降解活性，实现降解菌的回收和重复利用。本发明方法简单、节能环保，为污水中DBP的降解去除和功能菌剂的回收再利用提供了技术支撑。
附图说明
图1为最佳固定化条件(时间和溶液)优化结果图；
图2为固定化菌和游离菌的邻苯二甲酸二丁酯降解效率对比图；
图3为固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌降解渗滤液中DBP的效果图；
图4为固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的磁性回收及重复利用稳定性图；
图5为模拟曝气系统中磁铁对邻苯二甲酸二丁酯降解菌的回收效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和技术特色更加明确，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保存编号为CICC10910。
实施例1
(1)聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料的制备及表征
利用多巴胺在弱碱性条件下能够自发团聚形成聚多巴胺膜的特性，将其用于四氧化三铁纳米粒子(IONPs)的表面修饰，具体步骤为：准确称取10mg IONPs，装入20mL锥形瓶中，取10mL Tris-HCl缓冲液(pH为8.5,10mM)于同一个锥形瓶中，超声30min后，称取10mg多巴胺加入其中，室温25℃，200转摇床混合反应t小时，用超强磁铁进行磁分离，用无菌水清洗2～3次去除未反应的多巴胺，得到聚多巴胺修饰的IONPs复合材料；
运用台式扫描电镜的EDS功能，对聚多巴胺修饰前后的四氧化三铁纳米粒子表面进行能谱扫描。被修饰前，四氧化三铁纳米粒子表层Fe和O元素的质量比重较大，分别为38.4和36.6，C元素质量比重仅为25.0；修饰后，C和O的质量比重增大，分别为47.1和36.0，而Fe元素的质量比重降至16.9。表明四氧化三铁纳米颗粒已被多巴胺(分子式C8H11O2N)成功修饰。能谱扫描结果如表1所示。
表1.四氧化三铁纳米颗粒经多巴胺修饰前后的能谱变化
元素编号 元素符号 元素名称 修饰前质量浓度 修饰后质量浓度
6 C 碳 25.0 47.1
8 O 氧 36.6 36.0
26 Fe 铁 38.4 16.9
(2)最佳固定化条件的优化
设定IONPs与多巴胺反应的时间梯度t(t分别为0.25h，0.5h，1h，2h，3h)，得到不同反应时间下的聚多巴胺修饰的IONPs复合材料，分别用去离子水或者MSM培养基(MSM培养基1L：K2HPO4，5.8g；KH2PO4，4.5g；(NH4)2SO4，2.0g；MgCl2，0.16g；CaCl2，0.02g；NaMoO4·2H2O，0.24mg；FeCl3，0.18mg；MnCl2·2H2O，0.15mg；去离子水，余量；pH＝7.0)配制聚多巴胺修饰的IONPs溶液(1mg/mL)，并以体积比1:10比例加入到OD600为0.500的DBP降解菌溶液(DBP降解菌溶液由邻苯二甲酸二丁酯降解菌在MSM培养基中培养活化后得到，邻苯二甲酸二丁酯降解菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为CICC 10910的菌种)中，体积比1:10是指聚多巴胺修饰的IONPs溶液与DBP降解菌溶液的体积比，0℃，150rpm摇床固定化2h后，用超强磁铁进行磁分离，取上清液用紫外分光光度计测定OD600，计算固定化效率，确定最佳固定化效率的条件。
固定化效率(R)公式：R＝(OD0-ODt)/OD0×100％。其中OD0为功能菌的最初浓度；ODt为固定化反应后游离功能菌的浓度。
结果表明，当多巴胺修饰反应时间为0.25h时，固定化效率最高，因此选择0.25h为最佳反应时间；菌体固定化反应溶剂对功能菌的固定化有一定影响，当MSM培养基为溶剂时，降解菌的固定化效率普遍高于以去离子水为溶剂时的固定化效率，因此，选择MSM培养基为固定化反应溶剂。固定化条件优化结果如图1所示。
(3)邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化
根据上述(2)中确定的最佳固定化效率条件，制备聚多巴胺修饰的IONPs溶(1mg/L)，以1:10比例加入到OD600为0.500的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液中，0℃，150rpm摇床固定化2h，用超强磁铁进行磁分离得到固定化细胞，并用PBS缓冲液清洗3次以去除游离的功能菌，得到固定化菌剂。
对比实施例2
将实施例1制得的固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌(即固定化菌剂)应用于降解MSM培养基中的邻苯二甲酸二丁酯，并将其降解效果与未固定化的游离邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行比较，以检测固定化方法对菌体降解有机污染物能力的影响。结果显示，在降解实验的第6天，固定化的降解菌对邻苯二甲酸二丁酯(1g/L)的降解效率为99.69％，DBP被基本降解完全，而未固定化组的降解效率仅为74.01％，表明固定化反应对邻苯二甲酸二丁酯降解菌的DBP降解能力无影响，反而可以提高菌体的降解效率，固定化菌和游离菌的DBP对比降解结果如图2所示。
对比实施例3
采用常规硅藻土吸附固定化的方法对邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行固定，并与实施例1中制得的固定化降解菌(即固定化菌剂)进行DBP降解效率的比较，步骤如下：
(1)硅藻土改性
将硅藻土碾碎过100目筛，将100g硅藻土置于33％硫酸溶液中,80℃恒温浸泡90min；用蒸馏水多次洗涤酸洗后的矿浆至pH呈中性；105℃烘干后，置于250℃马弗炉烘烤2h，取出置于干燥器中备用。
(2)硅藻土吸附固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌
将5g改性硅藻土用5％盐酸浸泡2h，蒸馏水洗至中性；用5％氢氧化钠浸泡载体2h，蒸馏水洗至中性；121℃高压蒸气灭菌20min；将灭菌载体加入DBP降解菌悬液中，30℃水浴振荡30min；静置10min，滤出颗粒物，用生理盐水洗涤、脱除未牢固吸附的DBP降解菌，然后冷冻干燥、备用。
(3)两种固定化方法的降解菌对邻苯二甲酸二丁酯的降解效率比较
将实施例1制得的固定化降解菌和硅藻土吸附固定化降解菌的分别应用于降解MSM培养基中的邻苯二甲酸二丁酯，结果表明，硅藻土吸附固定化的降解菌在降解实验第6天的DBP降解效率为80.25％，虽略高于游离降解菌的降解效率(74.01％)，但远低于磁性纳米颗粒固定化的降解菌降解效率(99.69％)。此外，常规吸附固定化在复杂环境中容易脱吸附，且不具备可回收性。综上，本发明利用磁性纳米颗粒对邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行固定化不仅有效提高了目标物的降解效率，还可实现降解菌的此行回收和重复利用，具有明显应用优势。
实施例4
将实施例1制得的固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌(即固定化菌剂)应用于降解垃圾填埋场渗滤液中的邻苯二甲酸二丁酯，以考察其在污水中的生物降解活性。垃圾填埋场渗滤液的各项指标如表2所示，表明该渗滤液为老龄渗滤液，且含有一定浓度的DBP。
表2.新鲜渗滤液各项参数指标
参数 pH COD BOD TOC TN NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N TP DBP
浓度(mg/L) 7.69 1095 221 398 306 236 43 0.4 0.034
其中，COD是指化学需氧量，BOD是指生化需氧量或生化耗氧量，TOC是指总有机碳，TN指水体中氮元素的总含量，TP是水体中磷元素的总含量。
降解实验结果显示，当渗滤液在溶液中的比例低于50％时，磁性纳米颗粒固定化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌可在6天内将1g/L的DBP完全降解，且降解效率高于在MSM培养基中的降解效率；当在100％渗滤液中进行降解实验时，固定化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌在第10天的DBP降解效率可高达66.4％，表明磁性四氧化三铁固定化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌可有效应用于渗滤液中DBP的降解去除。固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌降解不同浓度垃圾渗滤液中DBP的效果如图3所示。
实施例5
采用连续批次降解实验考察实施例1制得的固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌(即固定化菌剂)在DBP降解中的重复使用稳定性，以未固定化DBP功能菌为对照。在第一批次DBP降解反应结束后，通过磁铁分离固定化DBP降解菌，未固定化DBP降解菌则采用离心的方式分离，将分离的固定化降解菌和未固定化降解菌分别用于下一轮DBP降解反应，连续反应3次，每次反应时间为6天。结果表明，固定化降解菌在重复使用三次之后，其对DBP的降解效率仍可以保持在99.6％以上。固定化降解菌及为固定化降解菌的重复使用稳定性如图4所示。
实施例6
将实施例1制得的固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌(即固定化菌剂)应用于模拟曝气池中，考察曝气池的曝气速率大小会对磁铁吸附固定化功能菌能力的影响。曝气池是污水处理系统中重要的组成部分，也是微生物降解有机物的主要场所。曝气池的曝气操作可能会对磁铁吸附固定化功能菌的效果产生一定影响。因此模拟污水处理中曝气池的工作环境，设置曝气池的曝气速率梯度(60、100、200、300、500、600mL/min)。将OD600为0.150的固定化降解菌投入装置中，当曝气速率稳定后，测定OD600值；然后在烧杯底部放置两块超强磁铁，吸附反应稳定后，测定OD600值，根据体系中游离固定化降解菌的浓度判定曝气速率对磁铁吸附固定化功能菌的影响。
在设定的曝气速率梯度中，磁铁对DBP固定化菌仍有很好的吸附作用。该结果表明在曝气模拟装置中，磁性吸附的强度较高，完全可以避免由曝气环节所导致的功能菌的脱吸附及流失，再次表明磁性纳米离子固定化的DBP降解功能菌可在实际污水处理工艺实现有效的磁性分离回收和再利用。磁性吸附前后模拟曝气池中的固定化降解菌浓度变化如图5所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种利用磁性纳米颗粒固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取四氧化三铁纳米颗粒置于Tris-HCl缓冲液中，超声，再加入多巴胺，反应，用超强磁铁分离复合材料，用无菌水清洗去除未反应的多巴胺，得到聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料；
2)将步骤1)得到的聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料用MSM培养基配制聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，加入到邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液中，摇床固定化后，用超强磁铁进行磁分离，得到固定化菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的四氧化三铁纳米颗粒和多巴胺的质量比为1：0.7～1.3；
所述的四氧化三铁纳米颗粒的质量、Tris-HCl缓冲液的体积之比为10mg：7～13mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为8～9。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的反应为在20℃～30℃以100～300rpm摇床混合反应0.25h～1.5h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液中聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子复合材料的浓度为0.5～3mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液与邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液的体积比为1：8～12。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液的OD600为0.450～0.590；
所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌溶液由邻苯二甲酸二丁酯降解菌在MSM培养基中培养活化后得到。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的摇床固定化的条件为：0～5℃，100～300rpm，1～3h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的MSM培养基以1L计，由以下重量的原料制成：
该MSM培养基的pH＝7.0。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法制备的固定化菌剂在污水中降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
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