CN102080071A - 降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环保技术领域，尤其是一种降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞及其制备方法。该降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞由超顺磁性微球和吸附-键合于其上的固定化细胞组成，超顺磁性微球由Fe3O4磁性微粒和包裹在其表面的壳聚糖和植物废弃物组成，固定化细胞为产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的混合物。该方法同传统的液态菌剂相比，可以减少资源的浪费，并解决传统法废水排放的问题。
Description
技术领域
本发明涉及环保技术领域，尤其是一种降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞及其制备方法。
背景技术
生物质可以理解为由光合作用产生的所有生物有机体的总称，包括植物、农作物、林产物、海产物(各种海草)和城市垃圾(纸张、天然纤维)等。
近年来，农业科技不断提高，农作物产量逐年增长，由此带来的农作物秸秆量亦随之增加；城市绿化飞速发展，城市绿地迅速扩大，植物的生理产物-枯枝落叶(凋落物)大量产生；城市化进程不断加快，人们对纸张的需求不断增加，如商品外包装纸盒、纸袋以及其他纸制品，由此产生大量的城市垃圾。传统观念常常认为生物质垃圾影响卫生、影响景观，于是每年要耗用大量的人力资金对其进行清扫、焚烧，不但污染环境而且给市政市容管理造成很大压力。经研究证明，生物质作为土壤生态系统物质循环和能量流动的重要环节，含有丰富的营养成分，能增加土壤有机质，改良土壤性状，维持生态平衡。因此可利用堆肥技术将生物质肥料化，利用微生物具有氧化和分解有机物的能力，适当调节环境因子，特别是筛选转化效率高、比较专一的菌株，将粗有机质逐步分解转化为腐殖酸等比较稳定的有机肥料。
传统的生物质垃圾微生物降解工艺采用生物质垃圾粉碎、发酵降解、腐熟、干燥造粒等连续进行的工艺，在此工艺中，发酵降解阶段使用的是液态菌剂，发酵完成后，生物质垃圾降解菌剂随发酵液及发酵产物排出系统，不仅造成发酵资源的浪费，而且产生大量废水，增加废水处理难度。
目前，将生物质垃圾降解菌固定化成为解决发酵资源浪费及废水产生的问题；同时，通过磁性内核可顺利将载体与发酵底物进行分离，实现快速、高效、无害化降解的目的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种降解生物质的超顺磁性载体固定化细胞及其制备方法，该方法同传统的液态菌剂相比，可以减少资源的浪费，并解决传统法废水排放的问题。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞，该降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞由超顺磁性微球和吸附-键合于其上的固定化细胞组成，超顺磁性微球由Fe3O4磁性微粒和包裹在其表面的壳聚糖和植物废弃物组成，固定化细胞为产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的混合物。
降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为0.5-1.5进行混合后加入蒸馏水调节pH值至11-12，恒温水浴60-85℃，剧烈搅拌30min-60min，静置0.5-1.5h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取壳聚糖溶液与溶解于硫酸中的植物废弃物按体积比10-8∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶0.5-2；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到有机分散介质中，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为0.8-1.0；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中，在37℃和100rpm条件下吸附键合72-96h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
而且，所述的产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的细胞数比例为1-3∶1-2∶4。
而且，所述的壳聚糖溶液是壳聚糖溶解于体积浓度百分比为2-5％乙酸中形成的，其质量百分比浓度为1-4％。
而且，所述的植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为20-30％。
而且，所述的有机分散介质的组分及重量份数为：液体石蜡：50-75份；斯盘-80：0.5-4份；甲醛：5-10份；正己烷：11-45份。
而且，所述的有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.2-1.5倍。
而且，所述的对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为4-6∶1。
本发明的优点和有益效果是：
1.生物质垃圾降解过程中一般使用液态菌剂，菌剂随发酵液及产品排出系统而消耗，造成发酵过程中菌群浓度低，发酵速度慢，发酵时间长，不但造成资源浪费，还增加了废水排放量和废水处理难度的问题，本发明提出了将发酵菌剂附载于超顺磁性固定化载体上，能够有效解决上述问题，而且实现载体的回收。
2.本发明所制超顺磁性微球是在磁性纳米Fe3O4颗粒表面包裹壳聚糖和植物废弃物的混合物，该超顺磁性载体兼具有磁性粒子和高分子营养源的特点，一方面具有超顺磁性，在外加磁场作用下能够快速从固态产物中分离出来；另一方面可以附载降解菌剂细胞，载体中的植物废弃物作为降解菌剂细胞的营养物质，而壳聚糖具有良好的吸附性、通透性、生物亲和性等成为细胞优良的结合载体。另外，本发明超顺磁性载体固定化细胞具有粒径均匀、磁响应性强、亲和性好、可诱导特异性降解酶等功能。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但本实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。
一种降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞，该降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞由超顺磁性微球和吸附-键合于其上的固定化细胞组成，超顺磁性微球由Fe3O4磁性微粒和包裹在其表面的壳聚糖和植物废弃物组成，固定化细胞为产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的混合物。
实施例1：
一种降解园林垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为0.7进行混合后加入蒸馏水调节pH值至11，恒温水浴60℃，剧烈搅拌30min，静置1h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取质量百分比浓度为1％壳聚糖溶液(壳聚糖溶解于体积浓度百分比为2％乙酸中形成)与溶解于硫酸中的植物废弃物(植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为20％)按体积比10∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶1；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到由50份液体石蜡，1份斯盘-80，5份甲醛和44份正己烷组成的有机分散介质中(有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.2倍)，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉(产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉细胞数比例为1∶1∶4)到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为0.8；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中(对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为4∶1)，在37℃和100rpm条件下吸附键合72h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解园林垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
实施例2：
一种降解秸秆等农作物垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为0.8进行混合后加入蒸馏水调节pH值至12，恒温水浴70℃，剧烈搅拌40min，静置0.5h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取质量百分比浓度为2％壳聚糖溶液(壳聚糖溶解于体积浓度百分比为4％乙酸中形成)与溶解于硫酸中的植物废弃物(植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为25％)按体积比8∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶0.5；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到由60份液体石蜡，0.5份斯盘-80，7份甲醛和32.5份正己烷组成的有机分散介质中(有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.3倍)，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉(产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉细胞数比例为1∶1∶2)到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为0.9；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中(对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为5∶1)，在37℃和100rpm条件下吸附键合84h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解秸秆等农作物垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
实施例3：
一种降解秸秆等农作物垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为1.0进行混合后加入蒸馏水调节pH值至12，恒温水浴85℃，剧烈搅拌60min，静置1.5h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取质量百分比浓度为3％壳聚糖溶液(壳聚糖溶解于体积浓度百分比为5％乙酸中形成)与溶解于硫酸中的植物废弃物(植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为30％)按体积比9∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶1.5；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到由70份液体石蜡，2份斯盘-80，8份甲醛和20份正己烷组成的有机分散介质中(有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.4倍)，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉(产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉细胞数比例为3∶1∶4)到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为1.0；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中(对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为6∶1)，在37℃和100rpm条件下吸附键合96h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解秸秆等农作物垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
实施例4：
一种降解城市垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为1.5进行混合后加入蒸馏水调节pH值至11，恒温水浴80℃，剧烈搅拌50min，静置1h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取质量百分比浓度为4％壳聚糖溶液(壳聚糖溶解于体积浓度百分比为3％乙酸中形成)与溶解于硫酸中的植物废弃物(植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为25％)按体积比9∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶1；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到由75份液体石蜡，4份斯盘-80，10份甲醛和11份正己烷组成的有机分散介质中(有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.5倍)，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉(产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉细胞数比例为2∶1∶4)到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为0.85；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中(对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为5∶1)，在37℃和100rpm条件下吸附键合84h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解城市垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
Claims (8)
1.一种降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞，其特征在于：该降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞由超顺磁性微球和吸附-键合于其上的固定化细胞组成，超顺磁性微球由Fe3O4磁性微粒和包裹在其表面的壳聚糖和植物废弃物组成，固定化细胞为产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的混合物。
2.一种如权利要求1所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
(1)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照Fe3+/Fe2+的摩尔比为0.5-1.5进行混合后加入蒸馏水调节pH值至11-12，恒温水浴60-85℃，剧烈搅拌30min-60min，静置0.5-1.5h，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，经洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性微粒；
(2)取壳聚糖溶液与溶解于硫酸中的植物废弃物按体积比10-8∶1进行混合，同时加入Fe3O4磁性微粒制成磁性载体溶液，其中Fe3O4磁性微粒和壳聚糖的摩尔比为1∶0.5-2；
(3)在搅拌速度为2000rpm的室温条件下将磁性载体溶液逐滴加入到有机分散介质中，升温至40℃并调节pH为9.0不变，充分搅拌10min，再加入甲醛10ml，调节pH为5.0，继续搅拌30min后加入3ml戊二醛，调节pH为9.0，升温至60℃在2000rpm的搅拌速度下反应2h，然后用磁铁收集得到的产物，依次用石油醚、蒸馏水充分洗涤后，用乙醇抽提洗涤，60℃下真空干燥，即得超顺磁性微球；
(4)分别接一环斜面保存的产黄纤维单胞菌、黑曲霉、康宁木霉到20ml液体LB培养基中，于37℃和160rpm条件下摇床培养48h形成菌群细胞悬液；然后将菌群细胞悬液按1％的接种量转入含400ml液体LB培养基的中，于37℃和160rpm条件下摇床培养至对数生长期形成对数生长期菌群细胞悬液，对数生长期菌群细胞悬液OD600为0.8-1.0；
(5)将超顺磁性微球置于对数生长期菌群细胞悬液中，在37℃和100rpm条件下吸附键合72-96h，然后用质量分数1％NaCl溶液洗涤，经磁性分离后得到降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞。
3.根据权利要求2所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的产黄纤维单胞菌、黑曲霉和康宁木霉的细胞数比例为1-3∶1-2∶4。
4.根据权利要求2所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖溶液是壳聚糖溶解于体积浓度百分比为2-5％乙酸中形成的，其质量百分比浓度为1-4％。
5.根据权利要求2所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的植物废弃物和硫酸的质量体积百分比为20-30％。
6.根据权利要求2所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的有机分散介质的组分及重量份数为：液体石蜡：50-75份；斯盘-80：0.5-4份；甲醛：5-10份；正己烷：11-45份。
7.根据权利要求2或6所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的有机分散介质体积为磁性载体溶液体积的1.2-1.5倍。
8.根据权利要求2所述的降解生物质垃圾的超顺磁性载体固定化细胞的制备方法，其特征在于：所述的对数生长期菌群细胞悬液与超顺磁性微球的质量比为4-6∶1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110601 |