CN113768880B - 一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒制备方法。属于纳米材料制备领域，步骤：制备两份溶血磷脂酸水溶液及一份白蛋白水溶液，将一份溶血磷脂酸水溶液与白蛋白水溶液搅拌，得溶血磷脂酸白蛋白溶液；加无水乙醇得白蛋白纳米颗粒悬浮液；制备壳聚糖溶液；制备复合纳米颗粒悬浮液；制备溶血磷脂酸‑透明质酸溶液；将复合纳米颗粒悬浮液离心弃上清，加入溶血磷脂酸‑透明质酸溶液涡旋，得最终反应液；将最终反应液离心弃上清，加去离子水涡旋，冷冻干燥，得保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒。本发明制备出的纳米颗粒粒径为100nm～500nm，且形貌均一、分散型良好，具有良好的生物相容性，对骨再生具有明显的促用。

Description

一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料制备领域，涉及一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒制备方法；具体地，是涉及一种用于促进成骨细胞生长和成骨性能的纳米复合颗粒及其制备方法。
背景技术
溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是多种哺乳动物组织和细胞中甘油脂生物合成中的常见中间体；除了作为代谢中间体，LPA还可以作为有效的脂质介体；研究表明，LPA可用作调节多种细胞功能的关键细胞外信号分子，包括增殖，分化，凋亡，趋化性，细胞形态发生和细胞因子分泌；LPA广泛参与人体组织的多种生理和病理过程，对神经系统发育、血管形成、炎症、伤口愈合和癌症的进展有重要影响；近年来，LPA对骨组织细胞的生物学效应逐渐引起人们的关注；LPA不仅可以干预骨髓间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞等多种骨组织细胞的细胞学行为，而且具有作为生长因子应用于骨组织工程的潜力。
临床上因外伤、感染、肿瘤、等疾病造成的骨缺损给社会和个人带来巨大的经济压力；骨再生是一个动态的链式过程，同时可能存在细菌感染，形成复杂的局部微环境；LPA生物学作用的多样性可能有利于其成骨功能的实现；LPA不仅可以通过调控骨组织细胞促进成骨,还具有促内皮细胞有丝分裂和血管生成的效应,而充足的血供对于骨重建和骨折愈合具有重要意义,所以这种成血管成骨的双重潜能是LPA应用于骨组织工程的优势之一；除此以外,与当前骨组织工程中研究广泛的骨形态发生蛋白-2/7和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等大分子蛋白相比,LPA还具有分子结构小、容易加载和释放、来源广泛、制造成本低廉等优点；但如何在现有工程支架材料的基础上实现LPA的有效控释仍然是LPA应用的一个难点。
有鉴于此，有必要提供一种包裹LPA的纳米复合颗粒的制备方法，以解决骨组织修复工程中LPA有效控释问题；从《白蛋白纳米颗粒的制备研究进展》中可知白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，具有生物相容性好、无免疫原性及可生物降解等特性，是制备纳米颗粒的理想材料；去溶剂化法是在搅拌条件下，用乙醇等脱水剂除去白蛋白的水化膜，暴露其疏水区域，降低白蛋白溶解度，从而将白蛋白析出为纳米颗粒；再通过热变性或化学交联，形成稳定的白蛋白纳米颗粒；最后去除残留的交联剂和有机溶剂，得纯化的白蛋白纳米颗粒；故去溶剂化法是一种简单高效的白蛋白纳米颗粒制备方法；去溶剂法可以将活性分子包裹在白蛋白纳米微球中，起到保护药物活性的作用；同时为了获得更高的载药量，利用壳聚糖和透明质酸的静电作用，在白蛋白纳米微球表面组装一层改性层，从而搭载更多的溶血磷脂酸分子，且透明质酸有利于保持溶血磷脂酸的活性。
发明内容
发明目的：本发明的目的是根据提供的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒制备方法，用以制备可实现在体内支架有效控释的LPA纳米颗粒；该方法简单易行、可控性强，制备出的纳米复合颗粒形貌均一、分散型良好，具有良好的生物相容性，对骨再生具有明显的促进作用。
技术方案：本发明所述的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其具体操作步骤如下：
(1)、制备两份溶血磷脂酸水溶液及一份白蛋白水溶液，待用；
(2)、将其中制备的一份溶血磷脂酸水溶液加入至白蛋白水溶液中进行搅拌，从而得溶血磷脂酸白蛋白溶液；
(3)、以0.5-2ml/min的速度向得到的溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加四倍于其体积的无水乙醇进行搅拌，反应后得到包裹有溶血磷脂酸活性物的白蛋白纳米颗粒悬浮液，搁置待用；
(4)、称取一定量的壳聚糖，加入0.1mg/ml醋酸溶液中进行搅拌，从而得壳聚糖溶液；
(5)、将得到的壳聚糖溶液以0.5-2ml/min的速度滴入至待用的白蛋白纳米颗粒悬浮液中，并进行搅拌，得到表面结合了壳聚糖的复合纳米颗粒悬浮液；
(6)、称取一定量的透明质酸，加入待用的另一份溶血磷脂酸水溶液，从而获得溶血磷脂酸-透明质酸溶液，搁置待用；
(7)、将复合纳米颗粒悬浮液放入离心机中离心后取出，取出后弃掉上清，保留下层颗粒沉淀，加入待用的溶血磷脂酸-透明质酸溶液进行振荡涡旋，从而得最终反应液；
再将最终反应液放入离心机中再次进行离心，后弃上清，加入去离子水进行振荡涡旋，将涡旋后的溶液进行冷冻、干燥，最终得到保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒。
进一步的，在步骤(1)中，所述制备的溶血磷脂酸水溶液的浓度为1-5mg/ml；所述制备的白蛋白水溶液的浓度为10-50mg/ml；
进一步的，在步骤(2)中，所述将一份溶血磷脂酸水溶液加入白蛋白水溶液中进行搅拌的时间为1小时；搅拌速度为300-800r/min。
进一步的，在步骤(3)中，所述向溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加无水乙醇进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min。
进一步的，在步骤(4)中，在所述制备的壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量浓度为0.1～1mg/ml，0.1mg/ml醋酸溶液中醋酸的质量浓度0.1mg/ml；
另，制备的壳聚糖溶液的体积与步骤(3)中得到的纳米颗粒悬浮液的体积相等。
进一步的，在步骤(5)中，所述将壳聚糖溶液滴入至纳米颗粒悬浮液中进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min，搅拌时间为8小时。
进一步的，在步骤(6)中，所述透明质酸的质量浓度为0.1-10mg/ml。
进一步的，在步骤(7)中，在所述离心机进行离心时，所述离心机的转速均为10000-15000r/min，进行离心的时间均为10-30min；进行涡旋的时间均为2-5min。
进一步的，所述制备的保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的尺寸为100nm-500nm。
进一步的，所述制备的保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒包括白蛋白外壳、溶血磷脂酸分子及壳聚糖透明质酸层；其中，所述壳聚糖透明质酸层附着在所述白蛋白外壳的外表面，所述的溶血磷脂酸分子通过壳聚糖透明质酸层嵌入至白蛋白外壳的内部。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明通过BSA蛋白的包裹作用以及壳聚糖透明质酸携载实现LPA的有效释放；且该方法稳定性好，制备过程简单，对设备要求低，易实现产业化。
附图说明
图1是本发明的制备流程图；
图2是本发明中制备纳米颗粒粒径及ZETA电位图；
图3是本发明中BSA包裹LPA纳米颗粒TEM图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明做出进一步说明。
在本发明中所述溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对多种骨组织细胞表现出显著的生物学调控功能，对于骨组织的发育和修复具有重要影响，但直接在骨组织工程支架上搭载LPA往往不能取得最理想的效果，如何包裹LPA在不改变其性质的前提下实现成骨微环境下的有效控释仍是亟待解决的问题。
因此，本发明提供了一种LPA纳米复合颗粒的制备方法，其制备获的LPA纳米复合颗粒不仅实现了LPA的有效包裹，且BSA外壳使得纳米颗粒具有良好的生物相容性，可以在目前工程支架基础上实现LPA的有效控释。
具体的，本发明所述的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其具体操作步骤如下：
(1)、制备两份溶血磷脂酸水溶液及一份白蛋白水溶液，待用；
所述溶血磷脂酸水溶液的制备方法：称取0.4mg溶血磷脂酸粉末加入到100μl去离子水中，摇晃均匀；从而得到溶血磷脂酸水溶液；
所述白蛋白水溶液的制备方法：称取250mg白蛋白粉末加入到5ml去离子水中，搅拌1小时；从而得到白蛋白水溶液；
(2)、将其中制备的一份溶血磷脂酸水溶液加入至白蛋白水溶液中进行搅拌，从而得溶血磷脂酸白蛋白溶液；
(3)、以0.5-2ml/min的速度向得到的溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加四倍于其体积的无水乙醇进行搅拌，反应后得到包裹有溶血磷脂酸活性物的白蛋白纳米颗粒悬浮液(溶血磷脂酸白蛋白溶液已经和乙醇反应生成了纳米颗粒)，搁置待用；
(4)、称取一定量的壳聚糖，加入0.1mg/ml醋酸溶液中进行搅拌，从而得壳聚糖溶液；
(5)、将得到的壳聚糖溶液以0.5-2ml/min的速度滴入至待用的白蛋白纳米颗粒悬浮液中，并进行搅拌，得到表面结合了壳聚糖的复合纳米颗粒悬浮液(所述壳聚糖溶液是做为纳米颗粒表面修饰加入的，相当于壳聚糖附着在白蛋白纳米颗粒的表面，起一个改性作用，同时还有吸附后面另一份溶液中的溶血磷脂酸的作用)；
(6)、称取一定量的透明质酸，加入待用的另一份溶血磷脂酸水溶液，从而获得溶血磷脂酸-透明质酸溶液，搁置待用；
(7)、将复合纳米颗粒悬浮液放入离心机中离心后取出，取出后弃掉上清，保留下层颗粒沉淀，再加入待用的溶血磷脂酸-透明质酸溶液进行振荡涡旋，从而得最终反应液；再将最终反应液放入离心机中再次进行离心，后弃上清，加入去离子水进行振荡涡旋，将涡旋后的溶液进行冷冻、干燥，最终得到保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒。
进一步的，在步骤(1)中，所述制备的溶血磷脂酸水溶液的浓度为1-5mg/ml；所述制备的白蛋白水溶液的浓度为10-50mg/ml；
进一步的，在步骤(2)中，所述将一份溶血磷脂酸水溶液加入白蛋白水溶液中进行搅拌的时间为1小时；搅拌速度为300-800r/min。
进一步的，在步骤(3)中，所述向溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加无水乙醇进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min。
进一步的，在步骤(4)中，在所述制备的壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量浓度为0.1-1mg/ml，0.1mg/ml醋酸溶液中醋酸的质量浓度0.1mg/ml；
另，制备的壳聚糖溶液的体积与步骤(3)中得到的纳米颗粒悬浮液的体积相等。
进一步的，在步骤(5)中，所述将壳聚糖溶液滴入至纳米颗粒悬浮液中进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min，搅拌时间为8小时。
进一步的，在步骤(6)中，所述透明质酸的质量浓度为0.1-10mg/ml。
进一步的，在步骤(7)中，在所述离心机进行离心时，所述离心机的转速均为10000-15000r/min，进行离心的时间均为10-30min；进行涡旋的时间均为2-5min。
进一步的，所述制备的保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的尺寸为100nm-500nm。
进一步的，所述制备的保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒包括白蛋白外壳、溶血磷脂酸分子及壳聚糖透明质酸层；其中，所述壳聚糖透明质酸层附着在所述白蛋白外壳的外表面，所述的溶血磷脂酸分子通过壳聚糖透明质酸层嵌入至白蛋白外壳的内部。
以下结合具体实施案例来对本发明做进一步说明。
实施案例一
称取0.8mg LPA，放入200μl去离子水中，涡旋搅拌，溶解均匀备用；称取250mgBSA，加入5ml去离子水中，磁力搅拌1h，转速400r/min，加入100μl LPA溶液，余下100μl备用，磁力搅拌1h，转速500r/min，使用蠕动泵以1ml/min向混合液中滴加无水乙醇20ml，并不断搅拌，转速500r/min，直至滴加完全；称取25mg壳聚糖，250mg冰乙酸，溶解在25ml去离子水中，磁力搅拌8h，转速800r/min得壳聚糖醋酸溶液；使用蠕动泵以1ml/min向LPA混合液中滴加壳聚糖醋酸溶液25ml，滴完磁力搅拌8h，转速400r/min；将搅拌后的混合液放入离心机，转速12500r/min，离心30min后得离心液；称取0.125g的透明质酸溶于25ml去离子水中，加入余下的100μl的溶血磷脂酸溶液，搅拌1h得溶血磷脂酸-透明质酸溶液；将离心液上清去除，加入溶血磷脂酸-透明质酸溶液，涡旋2min；旋后的溶液以10000r/min离心30min，弃上清，加入去离子水振荡，将得到的混合液冷冻干燥36h，得到产品；
制备的LPA纳米复合颗粒具有壳-核结构，形貌均一、分散型良好，前成骨细胞MC3T3-E1培养结果显示，具有良好成骨性能。
实施案例二
称取0.6mg LPA，放入200μl去离子水中，涡旋搅拌，溶解均匀备用；称取250mgBSA，加入5ml去离子水中，磁力搅拌1h，转速500r/min，加入100μl LPA溶液，余下100μl备用，磁力搅拌1h，转速500r/min，使用蠕动泵以1ml/min向混合液中滴加无水乙醇20ml，并不断搅拌，转速500r/min，直至滴加完全；称取25mg壳聚糖，250mg冰乙酸，溶解在25ml去离子水中，磁力搅拌8h，转速800r/min得壳聚糖醋酸溶液；使用蠕动泵以1ml/min向LPA混合液中滴加壳聚糖醋酸溶液25ml，磁力搅拌8h，转速500r/min；将搅拌后的混合液放入离心机，转速12500r/min，离心30min后得离心液；称取0.125g的透明质酸溶于25ml去离子水中，加入余下的100μl的溶血磷脂酸溶液，搅拌1h得溶血磷脂酸-透明质酸溶液；将离心液上清去除，加入溶血磷脂酸-透明质酸溶液，涡旋2min；旋后的溶液以15000r/min离心10-30min，弃上清，加入去离子水振荡，将得到的混合液冷冻干燥36h，得到产品；
制备的LPA纳米复合颗粒具有壳-核结构，形貌均一、分散型良好，前成骨细胞MC3T3-E1培养结果显示，具有良好成骨性能。
实施案例三
称取1.2mg LPA，放入200μl去离子水中，涡旋搅拌，溶解均匀备用；称取250mgBSA，加入5ml去离子水中，磁力搅拌1h，转速500r/min，加入100μl LPA溶液，余下100μl备用，磁力搅拌1h，转速500r/min，使用蠕动泵以1ml/min向混合液中滴加无水乙醇20ml，并不断搅拌，转速500r/min，直至滴加完全；称取25mg壳聚糖，250mg冰乙酸，溶解在25ml去离子水中，磁力搅拌8h，转速800r/min得壳聚糖醋酸溶液；使用蠕动泵以1ml/min向LPA混合液中滴加壳聚糖醋酸溶液25ml，磁力搅拌8h，转速500r/min；将搅拌后的混合液放入离心机，转速12500r/min，离心30min后得离心液；称取0.125g的透明质酸溶于25ml去离子水中，加入余下的100μl的溶血磷脂酸溶液，搅拌1h得溶血磷脂酸-透明质酸溶液；将离心液上清去除，加入溶血磷脂酸-透明质酸溶液，涡旋2min；旋后的溶液以15000r/min离心10-30min，弃上清，加入去离子水振荡，将得到的混合液冷冻干燥36h，得到产品；
制备的LPA纳米复合颗粒具有壳-核结构，形貌均一、分散型良好，前成骨细胞MC3T3-E1培养结果显示，具有良好成骨性能。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：
(1)、制备两份溶血磷脂酸水溶液及一份白蛋白水溶液，待用；
所述制备的溶血磷脂酸水溶液的浓度为1-5mg/ml；所述制备的白蛋白水溶液的浓度为10-50mg/ml；
(2)、将其中制备的一份溶血磷脂酸水溶液加入至白蛋白水溶液中进行搅拌，从而得溶血磷脂酸白蛋白溶液；
所述将一份溶血磷脂酸水溶液加入白蛋白水溶液中进行搅拌的时间为1小时；搅拌速度为300-800r/min；
(3)、以0.5-2ml/min的速度向得到的溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加四倍于其体积的无水乙醇进行搅拌，反应后得到包裹有溶血磷脂酸活性物的白蛋白纳米颗粒悬浮液，搁置待用；
所述向溶血磷脂酸白蛋白溶液中滴加无水乙醇进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min；
(4)、称取一定量的壳聚糖，加入0.1mg/ml醋酸溶液中进行搅拌，从而得壳聚糖溶液；
在所述制备的壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量浓度为0.1～1mg/ml，0.1mg/ml醋酸溶液中醋酸的质量浓度0.1mg/ml；
制备的壳聚糖溶液的体积与步骤(3)中得到的纳米颗粒悬浮液的体积相等；
(5)、将得到的壳聚糖溶液以0.5-2ml/min的速度滴入至待用的白蛋白纳米颗粒悬浮液中，并进行搅拌，得到表面结合了壳聚糖的复合纳米颗粒悬浮液；
所述将壳聚糖溶液滴入至纳米颗粒悬浮液中进行搅拌的搅拌速度为300-600r/min，搅拌时间为8小时；
(6)、称取一定量的透明质酸，加入待用的另一份溶血磷脂酸水溶液，从而获得溶血磷脂酸-透明质酸溶液，搁置待用；
所述透明质酸的质量浓度为0.1-10mg/ml；
(7)、将复合纳米颗粒悬浮液放入离心机中离心后取出，取出后弃掉上清，保留下层颗粒沉淀，加入待用的溶血磷脂酸-透明质酸溶液进行振荡涡旋，从而得最终反应液；
再将最终反应液放入离心机中再次进行离心，后弃上清，加入去离子水进行振荡涡旋，将涡旋后的溶液进行冷冻、干燥，最终得到保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒；
在所述离心机进行离心时，所述离心机的转速均为10000-15000r/min，进行离心的时间均为10-30min；进行涡旋的时间均为2-5min。
2.根据权利要求1所述的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备的保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的尺寸为100nm-500nm。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
称取0.6mg LPA，放入200μl去离子水中，涡旋搅拌，溶解备用；称取250mg BSA，加入5ml去离子水中，磁力搅拌1h，转速500r/min，加入100μl LPA溶液，余下100μl备用，磁力搅拌1h，转速500r/min，使用蠕动泵以1ml/min向混合液中滴加无水乙醇20ml，搅拌，转速500r/min，直至滴加完全；称取25mg壳聚糖，250mg冰乙酸，溶解在25ml去离子水中，磁力搅拌8h，转速800r/min得壳聚糖醋酸溶液；使用蠕动泵以1ml/min向LPA混合液中滴加壳聚糖醋酸溶液25ml，磁力搅拌8h，转速500r/min；将搅拌后的混合液放入离心机，转速12500r/min，离心30min后得离心液；称取0.125g的透明质酸溶于25ml去离子水中，加入余下的100μl的溶血磷脂酸溶液，搅拌1h得溶血磷脂酸-透明质酸溶液；将离心液上清去除，加入溶血磷脂酸-透明质酸溶液，涡旋2min；旋后的溶液以15000r/min离心10-30min，弃上清，加入去离子水振荡，将得到的混合液冷冻干燥36h，得到产品。
4.根据权利要求1-2任意一项所述的一种保护溶血磷脂酸活性的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
称取1.2mg LPA，放入200μl去离子水中，涡旋搅拌，溶解备用；称取250mg BSA，加入5ml去离子水中，磁力搅拌1h，转速500r/min，加入100μl LPA溶液，余下100μl备用，磁力搅拌1h，转速500r/min，使用蠕动泵以1ml/min向混合液中滴加无水乙醇20ml，并搅拌，转速500r/min，直至滴加完全；称取25mg壳聚糖，250mg冰乙酸，溶解在25ml去离子水中，磁力搅拌8h，转速800r/min得壳聚糖醋酸溶液；使用蠕动泵以1ml/min向LPA混合液中滴加壳聚糖醋酸溶液25ml，磁力搅拌8h，转速500r/min；将搅拌后的混合液放入离心机，转速12500r/min，离心30min后得离心液；称取0.125g的透明质酸溶于25ml去离子水中，加入余下的100μl的溶血磷脂酸溶液，搅拌1h得溶血磷脂酸-透明质酸溶液；将离心液上清去除，加入溶血磷脂酸-透明质酸溶液，涡旋2min；旋后的溶液以15000r/min离心10-30min，弃上清，加入去离子水振荡，将得到的混合液冷冻干燥36h，得到产品。
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