CN114703172A - 一种可控降解的胚胎微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可控降解的胚胎微球及其制备方法，所述微球为球囊状结构，外壳为海藻酸，芯材包含以低分子量的壳聚糖纳米粒子为载体的海藻酸裂解酶和胚胎。该微球可通过海藻酸裂解酶浓度或活力上的梯度差异的调控，来实现海藻酸微球的可控裂解，可以稳定及时的释放胚胎。本发明开发出一种可降解和可注射的胚胎输送系统，其中胚胎释放的时间可以根据特定的应用进行调节，可以使用这种细胞输送方法，允许控制胚胎的释放和产生因子，从而促进胚胎发育，提高胚胎的存活率。本发明制备过程简易快捷，耗时短，投资小，可以转化为机械化批量生产，具有良好的应用前景。

Description

一种可控降解的胚胎微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及胚胎体外培养技术领域，特别的涉及一种可控降解的胚胎微球及其制备方法。
背景技术
人类体外培养的植入前胚胎具有高度可变性和发育潜力的特点。25％的胚胎在体外受精植入后2天移植给患者，容易导致妊娠率低。大约75％的胚胎表现出不同程度的细胞碎裂和不对称。最后，如果胚胎是体外培养的，在第一周就有50％的细胞停滞(MunnéS,Alikani M,Tomkin G,Grifo J,Cohen J.Embryo morphology,developmental rates,andmaternal age are correlated with chromosome abnormalities.Fertility andSterility.1995；64(2):382-391)。植入前胚胎表现出一种自主发育的形式，由卵母细胞提供的产物提供动力，也来自胚胎基因组的激活。尽管存在这种自主性，但植入前的胚胎高度受外部环境因素的影响，在极端情况下，如胚胎培养或核移植，胚胎适应变化的环境条件或染色质重新编程的能力可超过其自身的适应能力，从而导致胚胎异常发育。核移植或培养诱导的影响不仅影响着床和妊娠的建立，还可能延伸到胎儿和出生后的发育，并影响以后生活中疾病的易感性。因此，为了全面保持生育潜力和繁殖性能，对于胚胎提供更具体和丰富的培养条件是非常必要的。
目前，已开发了一种使用藻酸盐水凝胶基质的三维培养系统，该系统可以包裹囊胚，保持囊胚的存活率和囊胚结构，促进可复制的形态变化(Yániz JL,Santolaria P,López-Gatius F.In vitro development of bovine embryos encapsulated in sodiumalginate.J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med.2002；49(8):393-395)。但也有研究观察到被包裹的胚胎比二维培养的胚胎更难孵化(Krentz KJ,Nebel RL,Canseco RS,McGilliard ML.In vitro and in vivo development of mouse morulae encapsulatedin 2％sodium alginate or 0.1％poly-l-lysine.Theriogenology.1993；39(3):655-667)，并且在胚胎移植后应该去除包膜，所以将被包裹的胚胎转移到受体动物的可能性是有限的，限制了上述方法在实际中的应用。因此，若开发出一种可控降解的胚胎微球，既能为早期胚胎培养提供一个良好的环境且减少外界环境影响，又能避免移植前还需去除包膜，为更好地适应胚胎发育的不同阶段具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种可控降解的胚胎微球及其制备方法，解决现有体外胚胎移植早期存在易受子宫内环境影响、难以孵化，导致胚胎的存活率低等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种可控降解的胚胎微球，所述微球为球囊状结构，外壳为海藻酸，芯材包含以低分子量的壳聚糖纳米粒子为载体的海藻酸裂解酶和胚胎。芯材中还可以包括给胚胎提供生长所需的营养物质等。
这样，海藻酸作为主要包埋材料，采用低分子量壳聚糖纳米粒子作为海藻酸裂解酶载体，通过在海藻酸盐微球中掺入的海藻酸裂解酶进行β-消除反应来裂解海藻酸单糖单元之间的β-1,4-糖苷键，生成尿酸产物，从而释放包埋的胚胎，并且可以根据海藻酸裂解酶的活性或浓度的调节，实现海藻酸微球的可控裂解，能实时控制胚胎的释放，以适应胚胎发育的不同阶段。
进一步，所述海藻酸裂解酶浓度为0.3～15U/g；所述海藻酸与壳聚糖纳米粒子的质量比为1～7：0.1～0.7。
进一步，所述壳聚糖纳米粒子的分子量为10kDa～50kDa。经研究发现该范围分子量的壳聚糖在体内比较容易被机体吸收，且在血压、血脂调节方面具有更好的优势。
进一步，所述微球的直径为0.1～2mm。
本发明的另一个目的还在于，提供了一种可控降解的胚胎微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将硫酸钠溶液加入壳聚糖溶液中，于20～25℃下搅拌反应1～6h后，离心分离得到纳米颗粒，然后用Tris缓冲液清洗多次，再加入交联剂，充分振动和摇晃进行交联反应得到交联的壳聚糖纳米粒；
2)将步骤1)制备的交联的壳聚糖纳米粒与游离海藻酸裂解酶溶液在4℃温和搅拌反应24～48h后，离心分离弃上清，然后用Tris缓冲液清洗多次，再将其溶于生理盐水中，得到固定化海藻酸裂解酶溶液；
3)将步骤2)得到的固定化海藻酸裂解酶溶液与海藻酸钠/胚胎悬液充分混合后，然后将所述混合物滴入到交联溶液中，固化反应后，用生理盐水洗涤去除多余的Ca2+，并将其悬浮在添加CaCl2的生理盐水中即所述可控降解的胚胎微球。
进一步，所述硫酸钠与壳聚糖的质量比为1～2:0.1～0.5。
进一步，步骤1)中所述交联剂为双重氮联苯胺、顺丁烯二酸醋、甲基二异氰酸醋、己二酞亚胺酸二甲醋、戊二醛或京尼平；所述交联反应的温度为20～40℃，时间为1～6h，转速为50～200rpm。
进一步，步骤3)中所述海藻酸钠/胚胎悬液与固定化海藻酸裂解酶溶液的料液比为1g:10～60mL。
进一步，步骤3)中所述交联溶液含有75～100mM的CaCl2、9mM葡萄糖和10mM HEPES缓冲液；所述生理盐水中CaCl2的浓度为1.8mM。
进一步，所述离心分离是在0～8℃下8000～12000g处理30～60min。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备胚胎微球采用低分子量壳聚糖纳米粒子来负载海藻酸裂解酶，再通过海藻酸裂解酶浓度或活力上的梯度差异，从而实现海藻酸微球的可控裂解，可以稳定及时的释放胚胎，且无需设计壳层的特定结构。本发明制备胚胎微球能够减缓早期胚胎培养过程中的不利外界刺激，为胚胎体内移植时提供一个良好的适应期，同时胚胎的可控释放，也避免在移植前还需去除包膜，提高胚胎的存活率。本发明为体外胚胎培养移植提供了新思路和理论基础，具有重要研究意义。
2、本发明公开的可控降解的胚胎微球为球囊状结构，海藻酸作为主要包埋材料，采用低分子量壳聚糖纳米粒子作为海藻酸裂解酶载体。通过在海藻酸盐微球中掺入海藻酸裂解酶进行β-消除反应来裂解海藻酸单糖单元之间的β-1,4-糖苷键，生成尿酸产物，从而释放包埋的胚胎。本发明开发出一种可降解和可注射的胚胎输送系统，其中胚胎释放的时间可以根据特定的应用进行调节，可以使用这种细胞输送方法，允许控制胚胎的释放和产生因子，从而促进胚胎发育。
3、本发明制备的胚胎微球是以低分子量的壳聚糖和海藻酸为原料，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒和无免疫原性等优点，制备过程简易快捷，耗时短，投资小，可以转化为机械化批量生产，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的胚胎微球的照片，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3。
图2为本发明制备的胚胎微球的SEM图。
图3为本发明制备的胚胎微球对细胞活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。
Tris缓冲液的配制：称量181.7g的Tris置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，然后用浓盐酸调节pH值至8.0，再将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
壳聚糖溶液：称取一定量的壳聚糖溶于0.35M的醋酸溶液中，使得壳聚糖的质量浓度为0.25％(w/v)。
一、一种可控降解的胚胎微球的制备方法
实施例1
1)取1mL1.4 M硫酸钠溶液加至19mL的壳聚糖溶液(0.25％w/v)，搅拌均匀后，在25℃下以500rpm的搅拌速度反应4h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清得到纳米颗粒，然后用50mL的Tris缓冲液清洗三次。
2)向步骤1)得到的纳米颗粒中加入2％的戊二醛溶液(在同一缓冲液中制备)，然后置于30℃、50rpm转速下反应2h，得到交联的壳聚糖纳米粒。
3)将步骤2)得到的交联的壳聚糖纳米粒与1mL游离海藻酸裂解酶溶液在4℃下温和搅拌36h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清，然后用50mM的Tris缓冲液清洗多次，直到检测不出海藻酸裂解酶为止，再将其溶于生理盐水中，使海藻酸裂解酶活性为5U/g，冷冻干燥后得到固定化海藻酸裂解酶溶液。
4)将海藻酸钠/胚胎悬液和步骤3)制得的固定化海藻酸裂解酶溶液按料液比为1:10(g/mL)充分混合，然后将上述混合物滴入到交联溶液(交联溶液含有75mM的CaCl2，9.0mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液)中，固化反应10min，再用0.9％(w/v)的生理盐水洗涤以去除多余的Ca2+，并将其悬浮在含有1.8mM CaCl2的生理盐水中，即得到所述可控降解的胚胎微球。
实施例2
1)取1mL1.4 M硫酸钠溶液加至19mL的壳聚糖溶液(0.25％w/v)，搅拌均匀后，在25℃下以500rpm的搅拌速度反应4h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清得到纳米颗粒，然后用50mL的Tris缓冲液清洗三次。
2)向步骤1)得到的纳米颗粒中加入2％的戊二醛溶液(在同一缓冲液中制备)，然后置于30℃、50rpm转速下反应2h，得到交联的壳聚糖纳米粒。
3)将步骤2)得到的交联的壳聚糖纳米粒与2mL游离海藻酸裂解酶溶液在4℃下温和搅拌36h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清，然后用50mM的Tris缓冲液清洗多次，直到检测不出海藻酸裂解酶为止，再将其溶于生理盐水中，使海藻酸裂解酶活性为10U/g，冷冻干燥后得到固定化海藻酸裂解酶溶液。
4)将海藻酸钠/胚胎悬液和步骤3)制得的固定化海藻酸裂解酶溶液按料液比为1:10(g/mL)充分混合，然后将上述混合物滴入到交联溶液(交联溶液含有75mM的CaCl2，9.0mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液)中，固化反应10min，再用0.9％(w/v)的生理盐水洗涤以去除多余的Ca2+，并将其悬浮在含有1.8mM CaCl2的生理盐水中，即得到所述可控降解的胚胎微球。
实施例3
1)取1mL1.4 M硫酸钠溶液加至19mL的壳聚糖溶液(0.25％w/v)，搅拌均匀后，在25℃下以500rpm的搅拌速度反应4h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清得到纳米颗粒，然后用50mL的Tris缓冲液清洗三次。
2)向步骤1)得到的纳米颗粒中加入2％的戊二醛溶液(在同一缓冲液中制备)，然后置于30℃、50rpm转速下反应2h，得到交联的壳聚糖纳米粒。
3)将步骤2)得到的交联的壳聚糖纳米粒与3mL游离海藻酸裂解酶溶液在4℃下温和搅拌36h，再在4℃下12000g离心分离30min，弃上清，然后用50mM的Tris缓冲液清洗多次，直到检测不出海藻酸裂解酶为止，再将其溶于生理盐水中，使海藻酸裂解酶活性为15U/g，冷冻干燥后得到固定化海藻酸裂解酶溶液。
4)将海藻酸钠/胚胎悬液和步骤3)制得的固定化海藻酸裂解酶溶液按料液比为1:10(g/mL)充分混合，然后将上述混合物滴入到交联溶液(交联溶液含有75mM的CaCl2，9.0mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液)中，固化反应10min，再用0.9％(w/v)的生理盐水洗涤以去除多余的Ca2+，并将其悬浮在含有1.8mM CaCl2的生理盐水中，即得到所述可控降解的胚胎微球。
实施例4
将实施例1中的胚胎悬液替换为Hepg2细胞悬液进行试验，其它步骤相同。
二、性能验证
1、取实施例1～3制备的胚胎微球进行观察，结果如图1所示，从图中可以看出，本发明所制备的微球形态相对规整，微球直径均在2mm左右。
2、将本发明制备的胚胎微球在电子显微镜下观察，结果如图2所示，从图中可以看出，微球的表面并不光滑，褶皱区域也不均匀，这可能与微球内部水分蒸发有关。
3、采用FDA/PI染色试剂盒检测实施例4制备的微球对包埋的Hepg2细胞在活性上的影响，结果如图3所示，实验结果表明被测Hepg2细胞在本发明的胚胎微球中能够良好的粘附和生长。同样胚胎作为多细胞结构在本发明的胚胎微球中也能良好的粘附和生长，说明本发明的胚胎微球可以为胚胎的生长发育提供良好的微环境，促进胚胎发育。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可控降解的胚胎微球，其特征在于，所述微球为球囊状结构，外壳为海藻酸，芯材包括以低分子量的壳聚糖纳米粒子为载体的海藻酸裂解酶和胚胎。
2.根据权利要求1所述可控降解的胚胎微球，其特征在于，所述海藻酸裂解酶浓度为0.3～15U/g；所述海藻酸与壳聚糖纳米粒子的质量比为1～7：0.1～0.7。
3.根据权利要求1所述可控降解的胚胎微球，其特征在于，所述壳聚糖纳米粒子的分子量为10kDa～50kDa。
4.根据权利要求1所述可控降解的胚胎微球，其特征在于，所述微球的直径为0.1～2mm。
5.一种如权利要求1～4任一项所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将硫酸钠溶液加入壳聚糖溶液中，于20～25℃下搅拌反应1～6h后，离心分离得到纳米颗粒，然后用Tris缓冲液清洗多次，再加入交联剂，充分振动和摇晃进行交联反应得到交联的壳聚糖纳米粒；
2)将步骤1)制备的交联的壳聚糖纳米粒与游离海藻酸裂解酶溶液在4℃温和搅拌反应24～48h后，离心分离弃上清，然后用Tris缓冲液清洗多次，再将其溶于生理盐水中，得到固定化海藻酸裂解酶溶液；
3)将步骤2)得到的固定化海藻酸裂解酶溶液与海藻酸钠/胚胎悬液充分混合得到混合物，然后将所述混合物滴入到交联溶液中，固化反应后，用生理盐水洗涤去除多余的Ca2+，并将其悬浮在添加CaCl2的生理盐水中即所述可控降解的胚胎微球。
6.根据权利要求5所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，所述硫酸钠与壳聚糖的质量比为1～2:0.1～0.5。
7.根据权利要求5所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述交联剂为双重氮联苯胺、顺丁烯二酸醋、甲基二异氰酸醋、己二酞亚胺酸二甲醋、戊二醛或京尼平；所述交联反应的温度为20～40℃，时间为1～6h，转速为50～200rpm。
8.根据权利要求5所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述海藻酸钠/胚胎悬液与固定化海藻酸裂解酶溶液的料液比为1g:10～60mL。
9.根据权利要求5所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述交联溶液含有75～100mM的CaCl2、9mM葡萄糖和10mM HEPES缓冲液；所述生理盐水中CaCl2的浓度为1.8mM。
10.根据权利要求5所述可控降解的胚胎微球的制备方法，其特征在于，所述离心分离是在0～8℃下8000～12000g处理30～60min。
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RANDOLPH S. ASHTON等: "Scaffolds based on degradable alginate hydrogels and poly(lactide-co-glycolide) microspheres for stem cell culture", 《BIOMATERIALS》, vol. 28, no. 36, pages 5518, XP022308850, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2007.08.038 *
SHANGYONG LI等: "Enhancing the Thermo-Stability and Anti-Biofilm Activity of Alginate Lyase by Immobilization on Low MolecularWeight Chitosan Nanoparticles", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCE》, vol. 20, no. 18, pages 1 - 14 *

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