JP2007512857A - 三次元の哺乳動物卵巣上皮性卵細胞の調製方法及び生物適合性マトリックスにおける卵胞培養システム - Google Patents

Abstract

【課題】新規な三次元の哺乳動物卵巣上皮性卵細胞の調製方法及び生物適合性マトリックスにおける卵胞培養システムを提供することを課題とする。
【手段】生体外で三次元構造に自己組織化することができ、生体内で観察される生物学的機能と類似するような生物学的機能を呈する哺乳動物の幹細胞，卵胞細胞，配偶子，卵胞又は哺乳動物の胚を被包し固定させるための方法が開示されている。そのカプセルは、幹細胞，卵胞細胞，配偶子，卵胞又は哺乳動物の胚及び（又は）生物適合性及び（又は）生物分解性ポリマーを含む核と、内面及び（又は）外面及び（又は）両面において任意に橋かけされ、第二の又はそれ以上の細胞種を任意に媒体化している、アルギン酸の二価又は三価金属イオン塩によって作られた半透性膜とにより構成されている。この方法を用いて調製及び培養された細胞と濾胞は、これらの細胞構造，形質膜，核膜，細胞質小器官，体細胞核又は配偶子及び胚の特徴であるペプチド，プロテイン，抗体，ホルモン，ホルモン前駆体，代謝産物，異化代謝産物の生体外及び（又は）生体内の生成のために用いられる。

Description

本発明は、生体外及び生体内の双方において臓器，組織又は生物学的物質を調製するために様々なタイプの細胞又は濾胞を含んだ半透性膜カプセルに関するものである。

最近数年間、免疫抑制剤の使用に頼ることなく、細胞，組織又は組織の一部を生体内に移植するという目的で、半透性で生体適合性を有する活き細胞膜内に被包させるための好適な新技術に関する研究が大きな関心事となってきている（Ｕｌｕｄａｇ等、２０００）。現在、分離させた活き細胞の培養は、温度と湿度の適切な条件を維持させながら、適切な培養皿上の液状培地内又は単一層上で主に実施されている。細胞はそれの組織の特定の細胞外基質を失っているので、上記方法の双方共、非常に限定された態様で、生体全体の複雑性をシュミレートするだけである。細胞外基質が存在しない場合には、培養の最中に、とりわけ、細胞が好ましくない基質と接着することや、養素の供給が不十分であることや、二次元成長の状態に起因して、細胞の形態及び生物化学的・機能的特性が頻繁に変化する（Ｓｉｔｔｉｎｇｅｒ等、１９９６）。自然環境においては、細胞は、細胞の機能性の調節に精力的な役割を果たす、タンパク質と多糖類との複雑なネットワークによって構成された複雑な三次元システムの中に見出される（Ｌｉ、１９９８）。それ故、生体外で細胞や組織の成長を達成するためには、生理学的に見出される細胞外基質に近似し、細胞の三次元的な組織化を可能にする細胞外基質を生成することが不可欠である。活き組織の中に見出される構造と潜在的に類似するそのような構造は、細胞が集合して能力及び機能性が喪失した細胞塊となることを防止することができる。

分離させた細胞を生体外で成長させるのを可能にするために、多くの製作者は異なった種類のポリマー基マトリックス（足場）を利用している。そのようなマトリックスは、高い多孔度を有し、生体内で見られるのと同様な生存と機能性とを補償するように、十分な数の細胞の配位と成長にとって好適な付着サイトを提供することができる（ＳｈａｐｉｒｏとCｏｈｅｎ、１９９７）。細胞の十分な成長を達成させるためには、適切な機械的特性を備えた生体適合性材料（ＫｕｏとMa、２００１）にて構成しなければならないポリマー足場が構造上均一性を持っていることが必要である。

三次元培養システムを達成するための別の試みとしては、半透性膜で区画された人工の細胞外基質の内部に活き細胞の固体群を入れて閉じ込めて細胞を外部環境から隔離させる細胞の被包方法がある。カプセル内の細胞外基質は、細胞が自己組織化して生体内の組織と機能的に類似した構造のものになるために重要である。

ポリマー材料によって構成されて、タンパク質，酵素又は細胞を被包するのに好適な人工細胞システムを得ることに成功したのはＣｈａｎｇであった（Ｃｈａｎｇ、１９６４）。当初の応用の一つは、糖尿病の処置用のアルジネートカプセルでのすい臓細胞の媒体化（ｖｅｈｉｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）である。細胞又は組織をアルギン酸ナトリウムに懸濁させ、そのような懸濁液を、カルシウムイオンのような、二価カチオンを含む溶液中に押し出した。そのイオンは、ポリマーの重合と懸濁液の剛性マトリックス（ビード）への変態を生じさせる。引き続いてポリ−エル−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）の溶液による処理を介して、カプセルの表面に永久的な半透性膜が形成され、その多孔度は、ポリ−エル−リジンの分子量及び濃度並びに用いられるアルジネートの濃度及び種類に応じて調整することができる（Ｄｅ Ｖｏｓ等、１９９３）。

最近、Ｍａｕｃｈａｍｐ等（１９９８）は、分離したブタの甲状腺上皮性卵細胞がＩ型コラーゲンマトリックスに付着することが可能であるならば、その甲状腺上皮性卵細胞は有機化して偽性濾胞になることを発見した。そのような構造は、単一層での細胞培養では得られない。

重合体膜の十分な透過性（カットオフ）は、被包された活き細胞が生存し及び自己組織化するためには不可欠である。理想的な膜は、細胞が生存するために重要な分子の侵入を可能にし、分泌物質や細胞の新陳代謝からの老廃物を除去することを可能にするものでなければならず（Ｃｏｌｔｏｎ、１９９６）、更に、最終的に免疫隔離の状態になって、生体の免疫応答のエフェクターが細胞環境内に侵入することを防止するものでなければならない。

正確な分子カットオフで、半透性膜は細胞分泌物，異化代謝産物及び代謝産物の拡散を可能にする。それ故、膜の透過性及び選択性は、このようなタイプのシステムの開発において、第一の重大な局面を提示することとなる。耐破損性と弾性との双方の点から、カプセルの適切な機械的特性，寸法分布及び表面特性は不可欠である。

原基卵胞は、上皮細胞に類似した単層の扁平細胞によって特徴付けられる構造体であり、そのような細胞は、濾胞の成熟過程において、立方体状になり、分割を開始して、外膜細胞と、内膜細胞と、顆粒膜細胞とに分化する。グラーフ卵胞を生じさせるもととなる生体内での成熟の全期間中に、顆粒膜細胞は、アンドロゲンとプロゲステロンを基質として用いる芳香族酵素系を介してエストロゲンを主に生成することができる。排卵過程に続いて、顆粒膜細胞は形態学的且つ機能的に分化して、プロゲステロン生合成に向かって進展する。

最近、特にブタの精子用の新規な活き細胞被包技術が開発された（ＥＰ０９２２４５１）。二価イオンを精液物質に添加し、そのような懸濁液をアルギン酸ナトリウムの水溶液中に押し出す。アルジネート溶液と接触した時に、二価イオンが、外表面に向かって拡散して、細胞懸濁液の周りにアルジネートのゲル化が引き起こされる。そのようなカプセルは、例えば、プロタミンのようなポリアミンを用いて橋かけされた外側面を有するようにして、膜の機械的特性及び透過性を変えることができる。

他の被包技術及びマイクロ被包技術に対するこの技術の利点としては、処理工程を削減することができて、含められた細胞が機能性及び構造に悪影響を及ぼす何らかの化学的又は物理的応力に晒されることがないという点を挙げることができる。

発明の詳細な説明

今日までのところ、哺乳動物の卵巣上皮性卵細胞又は卵胞を被包することに関する文献の中では何等の試みも報告されていない。ヒトのみならず、ウシ科，ウマ科，ヤギ科，ブタ科，イヌ科，ネコ科，ウサギ科，マウス，ラット及び一般の実験種の卵胞及び顆粒膜細胞、好ましくは、ブタ科及びウシ科の卵胞及び顆粒膜細胞を用いて培養することに関しては、適切に培養された時に、そのような細胞が生体内で産出することができるホルモン又はタンパク質及び（又は）生物学的活性物質と類似したホルモン又はタンパク質及び生物学的活性物質を産出することに、特に興味深いものがある。それらの生理学的に生み出される物質は、卵母細胞の成熟に貢献する。

本発明は、内面及び（又は）外面及び（又は）内面及び外面の双方が任意に橋かけされたアルギン酸の二価又は三価金属塩の膜内に被包される生体適合性マトリックスにおける、哺乳動物の成長の様々な過程における卵巣卵胞細胞，成熟した及び未成熟な配偶子，胚及び卵巣卵胞のための被包技術に関するものである。上述した細胞種以外に、様々な起源の幹細胞をカプセル内で媒体化させることができる。実際に、後者は、原基卵胞を構成する顆粒膜細胞に類似した形態学的及び機能的特質を示す。更に、遺伝学的に変更された雄性及び雌性体細胞、例えば、すい臓及び甲状腺細胞をカプセル内で媒体化させることができる。細胞，組織又は臓器の部分，組織又は臓器，配偶子又は胚が被包されるのを実験温度で待ちながら保存し、又は、冷却，冷凍，冷却保存又は冷凍乾燥によって保存することができる。

カプセル内で媒体化された細胞は、生体外では自己調整して、生体内での臓器と機能的に類似した組織及び多細胞構造体の生体外での成長を可能にする三次元の濾胞状柔組織又は胞状構造体となる。

その細胞構造体は、現在、他の細胞培養技術では生体外で再現することのできない生物学的機能を示す。そのカプセル構造は、細胞外基質と、基底膜として作用する半透性膜とが存在することにより特徴付けられ且つ生理学的に見出される小繁殖圏（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に類似した小繁殖圏の確保を可能にする。

この方法によって達成される細胞培養は、ペプチド，タンパク質及びホルモンの生成、薬剤，ホルモン及びホルモン前駆体の生物学的検定、薬剤の効能評価，化学的及び薬理学的物質の毒性及び奇形遺伝性の評価、卵細胞の生体外生成の向上、実験的な濾胞及び胚の培養及び共同培養の向上、生殖生物工学の応用にとって有益である。更に、そのような細胞培養は、ホルモンの型の置換療法として個体に導入することができる。実際に、カプセル内に媒体化された人工組織を取り囲んでいる重合体フィルム（即ち、カプセルをコーティングしている膜）は、免疫抑制剤の使用を避けることを可能にする免疫保護バリアを構成する。

特に、被包された哺乳動物の卵巣の上皮性卵細胞及び卵胞は、生体内で作られるのと同様に、プロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）を作り出すことができる。

カプセルは、哺乳動物の幹細胞，卵巣の上皮性卵細胞，配偶子，胚又は卵胞及び（又は）生物適合性及び（又は）生分解性ポリマーを含む核と、
例えば、アルギン酸のような生物適合性及び生分解性ポリマーの二価又は三価金属塩によって構成され、内面及び（又は）外面及び（又は）両面が任意に橋かけされ、第二の細胞基型を任意に媒体化している半透性膜により実質的に構成されている。

その核内では、前記細胞がゼラチン状の培地に懸濁されている。

臓器又は組織は、ウシ科，ウマ科，ヤギ科，ウサギ科，ブタ科，イヌ科，ネコ科，齧歯動物又は場合によってはヒトのような様々な哺乳動物から、好ましくは、ブタ科及びウシ科から切除される。そのような切除は、屠殺の時に、バイオプシー物質を切除する間に又は外科手術をしながら実施することができるが、家畜類に関しては通常の屠殺の際に行うのが好ましい。対象にする組織又は臓器、好ましくは、雌生殖腺を切除する。

対象とする臓器が卵巣である場合には、それを適切に除去して、当業者に知られているように、生理的溶液中で洗浄する。

濾胞内の体細胞及び配偶子を、当業者に知られているように、吸引、濾胞液の遠心分離又は細胞内マトリックスの消化によって組織から分離させる。遠心分離に続いて、細胞沈渣を、培養培地内に繰り返し通過させることにより洗浄して、表面に浮いている物質を除去してから回収する。沈渣の細胞濃度は、マクラーチャンバー（Ｍａｋｌｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）又はバーカーチャンバー（Ｂｕｒｋｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて直接計算することにより、又は、サイトフルオリメトリー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によって、又は、半自動式細胞カウンター及び自動式細胞カウンターを用いることによって、測定する。

分離した細胞は、それが被包されるまで培地又は保持媒体に懸濁させ、当業者に知られているように、室温と−２００℃の間の温度と、４０％と１００％の間の湿度の環境において保存させることができる。

培地又は保持媒体としては、生理的溶液（生理食塩液），ブドウ糖溶液（ｇｌｕｃｏｓａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ），イーグル基礎培地（ＢＭＥ）及びその誘導体，Ｈａｎｋｓ塩類溶液及びその誘導体，組織培養培地１９９（ＴＣＭ１９９）及びその誘導体，リン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）及びその誘導体，Ｋｒｅｂｓ塩類溶液及びその誘導体，ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びその誘導体，トリスバッファー培地（ＴＢＭ）及びその誘導体，タイロード塩類溶液及びその誘導体，モディファイド精子洗浄培地及びその誘導体，モディファイドヒュウマンチューバル液，モディファイドＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地，アップグレーデッド Ｂ２ ＩＮＲＡ培地，Ｂ２ ＩＮＲＡ Ｍｅｎｅｚｏ培地，アップグレーデッドＢ９倍地及び当業者によって特に用いられているその他の様々な培養培地を用いることができるが、当業界における専門家によってよく知られているようにＴＣＭ １９９及びその誘導体を用いることが好ましい。

本発明に依れば、培養培地又は濾胞液に懸濁された細胞は、人工細胞外基質を構成している親水性ポリマーを含む培養培地に希釈してもよい。細胞沈渣希釈溶液とポリマー溶液の割合は、１：０．０５と１：２００の間にすることができ、１：０．１と１：１００の間が好ましい。

本発明に係るカプセルの核の人工細胞外基質を構成しているポリマー材料は、グルカン，スクレログルカン（ｓｃｌｅｒｏｇｌｕｃａｎ），マンナン，ガラクトマンナン（ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ），ゲラン（ｇｅｌｌａｎ），カラジーナン，ペクチン，ポリアンハイドライド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ），ポリアミノアシッド（ｐｏｌｙａｍｉｎｏａｃｉｄ），ポリアミン，キサンタン（ｘａｎｔｈａｎ），セルロース及びその誘導体，カルボキシメチルセルロース，エチルセルロース，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ポリビニルアルコール，カルボキシビニルポリマー，スターチ，コラーゲン，キチン，チトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ），アルギン酸及びヒアルロン酸から成るグループから選択するのが好ましい。当業者に知られているように性質に応じて適切なｐＨ値で水溶液の状態にあるそのようなポリマーは、通常は総カプセル重量の０．０１％と９０％の間の濃度で用いられるが、０．５％と５０％の間の濃度で用いるのが好ましい。好ましくは、様々な粘度、通常８００ｃＰと１２００ｃＰとの間の粘度を有するキサンタンガムが人工細胞外基質として用いられる。

本発明に係るカプセル膜は、一般に、カルシウム，バリウム，ストロンチウム，亜鉛のような二価金属のアルジネート，アルミニューム，鉄及びクロムのような三価金属のアルジネートによって構成されている。

本発明に係るカプセルを調製する時に、１ｍｍｏｌ／１と５００ｍｍｏｌ／１の間、好ましくは５ｍｍｏｌ／１と２００ｍｍｏｌ／１の間のカチオン濃度を確保するべく、細胞懸濁液に二価又は三価イオンを、好ましくは溶解した塩化物又は硫酸塩として添加する。押し出された細胞懸濁液とアルジネート溶液の体積比は、１：１と１：２５０との間、好ましくは１：１５と１：５０の間にする。

次に、細胞懸濁液を、５０μｍと５０００μｍとの間の寸法を有する押出し機、オリフィス，ノズル又はニードル、好ましくは３００μｍと２０００μｍとの間の内径を有するニードルを介して、１０と２００ｒｐｍの間の速度、好ましくは、２０と１００ｒｐｍの間の速度で攪拌された状態に維持された培地のアルギン酸ナトリウム溶液中に押出す。本発明に係るカプセルを調製する際に用いられるアルジネートは、２％水溶液中で、２５℃で２００ｃＰと２０００ｃＰとの間の粘度を有している。溶液中のアルジネート濃度は、０．０１％と５％ｗ／ｖの間であるが、好ましくは、０．１％と１％の間である。

押し出された細胞懸濁液中に二価又は三価イオンが存在することにより、小滴の界面にアルジネートのゲル化が誘発され、カプセルが結果的に完成されることによりゼラチン状膜が生成される。

そのような作用は５℃と４０℃の間の温度、好ましくは、２０〜３０℃の温度で実行され、自動又は半自動マイクロエンカプセレータ（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）又は蠕動性ポンプ又はピストンポンプ或いは手動シリンジ或いはその他の適切な装置を用いて、１分間に１０と２５０個の間、好ましくは１分間に６０個の滴りを生み出すような速度で押出しを実行する。

カプセルは、例えば、好ましくは、０．０１％と５％ｗ／ｖの間の濃度で溶解したプロタミン硫酸塩又はリン酸塩、好ましくは０．０１％と５％ｗ／ｖの間の濃度で溶解して１０００ Ｄａと８０００００ Ｄａの間の分子量を有するポリ−エル−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、０．０１％〜５％ｗ／ｖの濃度のポリビニルアミン及び０．０１％と５％ｗ／ｖの間の濃度で１５０００ Ｄａと１，０００，０００ Ｄａの間の分子量を有するシトサンのような、ポリアミン基橋かけ剤を用いたアルジネートの界面重合によって橋かけさせることができる。

橋かけ反応は、５℃と４０℃の間の温度、好ましくは、２５℃で、１分と１２０分の間、好ましくは、３分と３０分の間の時間で実施する。この処置によって、ゼラチン状膜が橋かけされたアルジネートの半透性剛性膜に変えられる。そのカプセルは、橋かけされた膜を有し、濾過によって回収し、洗浄し、当業者によって知られた適切な保持媒体に懸濁させる。

厚さが３００μｍと５０００μｍとの間の膜を備えた、０．５と３０ｍｍの間の寸法、好ましくは、２と１０ｍｍの間の寸法を有する回転楕円面状のカプセルが得られる。生成されたカプセルの重量は、５ｍｇと２００ｍｇの間、好ましくは２０ｍｇと１００ｍｇの間である。

培地に懸濁されたそのカプセルは、当業者に知られているように、コントロールされた雰囲気中で任意に、−２００℃と４０℃の間の温度、好ましくは４℃と４０℃の間の温度、より好ましくは３８．５℃で保存される。

使い捨て可能な、予め調製され且つプリパッケージされた手段を用いて、単一又は複数調製のために、予め調製され、予め測定され且つプリパッケージされた原材料からカプセルを調製してもよい。

従って、本発明の別の目的は、本発明によるカプセルを調製するためのキット（ｋｉｔ）を提供することにあり、このキットは、予め調製され、予め測定され且つプリパッケージされた原材料と、関連する使い捨て可能な、無菌又は非無菌又は滅菌可能な材料とを含んでいる。カプセルの調製は、当業者に知られた技術に従って新たに除去され及び（又は）適切に保存された細胞，組織，組織部分，臓器，臓器部分，細胞核，配偶子及び胚をカプセル内に媒体化させることにより実施することができる。

細胞核，組織，臓器又はその部分，配偶子又は胚を含んだカプセルを、別の細胞核，組織，臓器又はその部分，配偶子又は胚と共に、適切な培養培地において共同培養（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）して、生理的環境をシュミレーションする条件下で、細胞核，組織，臓器又はその部分，配偶子及び胚の成長を促進させるようにしてもよい。

特定の生成物及び（又は）特定の生物学的活性物質を生合成するには、そのような条件下において行うのが好都合である。そのようなインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）及び（又は）共同インキュベーションは、被包された生物学的構造体が、ホルモン，代謝産物，異化代謝産物及びその他の生物学的活性物質を生成させることを可能にする。

その被包された構造体によって生み出され又は分泌され、合成された代謝産物，異化代謝産物及び生物学的活性物質は、培養培地から回収し及び（又は）吸引することにより培養培地内から回収し、或いは、当業者に知られた別の技術を用いて除去するようにできる。

その代謝産物，異化代謝産物及び分泌物は、当業者によって知られているように、三次元被膜培養システムを取り返しのつかないように傷付けることなく、抽出、洗浄及び適切に特徴付けることができる。

その生成物は、他の培地内培養システム及び（又は）生体外及び（又は）生体内システムにおける他の細胞，組織，臓器，配偶子及び胚の発育，成長，成熟及び機能を調整させるために、直接に又は洗浄或いは濃縮後に利用することができる。

同様に、公知の技術に従って、成長の様々な段階における配偶子及び胚に加えて細胞核，自系又は異形の組織又は臓器又はその部分を、三次元被膜培養システムを取り返しのつかないように傷付けることなく、カプセル内に射出、顕微射出（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔ）及び注入することができる。

細胞核，組織又は臓器又はその部分，配偶子及び胚は、当業者に知られた手段及び技術を用いて、三次元被膜培養システムを取り返しのつかないように傷付けることなく、前調整時に、カプセルから吸引又は除去することができる。後述する実施例は、本発明に係るカプセル調製方法を説明するために例示的に示したものにすぎない。

［実施例１］ウシの顆粒膜細胞の被包と三次元培養
１ａ）細胞の調製
発情周期の様々な段階における卵巣を、生後１６〜１８ヶ月以上のウシから、通常の屠殺の最中に摘出し、当業者に知られているように、３０℃の温度の生理溶液で洗浄する。卵巣内の２〜６ｍｍの直径を有する濾胞を確認し、それから顆粒膜細胞を含んだ濾胞液を、シリンジを用いて吸引する。こうして得られた細胞懸濁液を遠心分離機にかけ、１０ｍｌのＴＣＭ１９９倍地＋１０％のウシ胎児血清（ｓｅｒｕｍ）＋１％のペニシリン／ストレプトマイシンで二度洗浄する。遠心分離機にかけた後に、細胞沈渣を確保し、それの細胞濃度を、マクラーチャンバーを用いた直接計算によって測定する。

１ｂ）被包
その細胞沈渣を、Ｅａｒｌｅ塩，エル−グルタミン及び重炭酸ナトリウムを含有したＴＣＭ１９９培養培地（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）における０．５％のキサンタンガムの溶液（Ｓａｔｉａｘａｎｅ（登録商標）、ＳＫＷ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フランス）に希釈する。尚、細胞沈渣とキサンタンガム溶液の体積比は、１：３である。細胞懸濁液を確保し、それに、バリウムイオンの最終濃度が２０ｍｍｏｌ／１まで、飽和バリウム塩化物溶液を添加する。その結果得られた懸濁液を、ニードル（２６ＧＸ１／２秒，０．４５Ｘ１３ｍｍ）を介して、磁気攪拌機を用いて攪拌された状態にされた培養培地における０．５％ｗ／ｖの中間粘度（３５００ｃＰ）アルギン酸ナトリウム溶液中に押出す。細胞懸濁液とアルギン酸ナトリウム溶液の体積比は、１：２５である。その押出しは、２５℃の温度で、シリンジを介して滴るように実施する。バリウムイオンはアルギン酸ナトリウムと反応して、３０'以内に押し出された各滴りの界面にバリウムアルジネート膜を形成する。確保されたカプセルを濾過によって収集し、培養培地で二度洗浄し、同培地のアリコートに懸濁させる。次に、Ｅａｒｌｅ塩，エル−グルタミン，重炭酸ナトリウムを含むＴＣＭ１９９培養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１％のプロタミン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミラノ、イタリア）の溶液を用いて、２５℃の温度で３０分間、そのカプセルを外表面において橋かけさせる。

顆粒膜細胞の固体群が、人工の細胞外基質における、橋かけしたカプセルの内部に見られる。

２ｍｍと１０ｍｍの間の寸法と２０ｍｇと１００ｍｇの間の重量を有する回転楕円面状のカプセルが得られる。こうして生成されたカプセルは、特定の制御された環境のインキュベータ内で通常の実験条件下で、凍結乾燥，冷却，冷凍又は低温保存法によって保存することができる。

１ｃ）三次元細胞培養
カプセルを、ウシ胎児血清（１０％）と、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）と、３−１７アンドロステネディオーネ（３−１７ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ）（１００ｎｇ／μｌ）とを含む６００μｌ培養培地（ＴＣＭ１９９）に懸濁された無菌細胞培養プレートウェル中に置く。

カプセルを含んだプレートを５％ＣＯ_２、９０％の湿度、３８．５℃の温度で、６日間インキュベータ内に維持させる。

４８時間毎に、各ウェル（ｗｅｌｌ）から、細胞メタボリック生成物を含む培地のサンプルを採取する。そのサンプルを−２０℃より低い温度で、エッペンドルフチューブ内で迅速に冷凍させる。

カプセルを含んだウエル内で、同じサンプルに関する培養を続けることで、培養培地が同じ体積の新たな培地によって取り替えられる。

従って、プロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）の生成の点で、ステロイドを合成する機能を、ウエルから採取した培地の各サンプルにおいてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって評価した。

その結果は、黄体化指数として当業者において知られているＰ４とＥ２の比として表現される。

［表１］カプセルで培養されたウシ顆粒膜細胞の黄体化指数（Ｐ４／Ｅ２），標準偏差及びサンプル数

表１において報告した結果から、全培養期間を通じて両ホルモンの生成によって、細胞の生命力が被包された細胞において維持されていることが推論される。被包された細胞は、生体内で排卵前に濾胞において観察される低量のプロゲステロンを生じさせる。

それは、被包された細胞の黄体化が低減していることを示し、それは、生体内で見られる濾胞構造に極めて類似した濾胞構造においてのみ起こり得る。

その結果の分析により得られた情報は、本発明の方法によって被包されるウシ顆粒膜細胞が、生体内におけるステロイド機能と類似し且つ三次元細胞培養法によってのみ得られるステロイド機能を発揮するものであることを示している。

［参考例１］
平行して、単一層内で細胞培養を実施した。この場合においても、プロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）の生成の点からステロイド合成機能を評価した。ウエルから回収した培地のサンプルにおけるそのようなホルモンの濃度を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて評価した。

非被包細胞を、被包された細胞の培養のために用いた６００μｌの培養培地を含んだウエルプレートにおける単一層内で成熟させ培養させる。

被包された細胞に関して述べたのと同様に、単一層の細胞を含んだプレートを５％ＣＯ_２、９０％の湿度、３８．５℃の温度で、６日間インキュベータ内に維持させる。

４８時間毎に、各ウェルから、細胞メタボリック生成物を含む培地のサンプルを採取する。そのサンプルを−２０℃より低い温度で、エッペンドルフチューブ内で冷凍させる。単一層で培養された細胞を含むウェルから、培養培地を完全に取り除いて、同じサンプルに関する培養を続けることで、培養培地が新たな培地と取り替えられる。得られた結果を表２において報告する。

［表２］ 単一層で培養されたウシ顆粒膜細胞の黄体化指数（Ｐ４／Ｅ２），標準偏差及びサンプル数

図１には、単一層で培養されたウシ顆粒膜細胞とカプセルで培養されたウシ顆粒膜細胞の黄体化指数が、培養時間の関数として示されている。

図１に示した結果から、全培養周期の間に両ホルモンの生成によって、細胞の生命力が両培養技術によって維持されていることが推論される。

単一層で培養された細胞によって合成されたプロゲステロンに関しては、その濃度が培養の６日目にかなり増加していることが観察される。この増加は、細胞の顕著な黄体化を示すものである。

そのような増加は、生体内で排卵前に濾胞において観察される低量のプロゲステロンを生じさせる被包された細胞に関してはあまり明らかではない。

それは、被包された細胞の黄体化が低減していることを示し、それは、生体内で見られる濾胞構造に極めて類似した濾胞様構造においてのみ起こり得る。

［実施例２］ブタ顆粒膜細胞の被包と三次元培養
２ａ）細胞の調製
発情周期の様々な段階における卵巣を、生後６〜１１ヶ月以上の被検体から、通常の屠殺の最中に摘出し、当業者に知られているように、３０℃の温度の生理溶剤で洗浄する。卵巣内の２〜６ｍｍの直径を有する濾胞を確認し、それから顆粒膜細胞を含んだ濾胞液を、シリンジを用いて吸引する。こうして得られた細胞懸濁液を遠心分離機にかけ、１０ｍｌのＴＣＭ１９９倍地＋１０％のウシ胎児血清＋１％のペニシリン／ストレプトマイシンで二度洗浄する。遠心分離機にかけた後に、細胞沈渣を確保し、それの細胞濃度を、マクラーチャンバーを用いた直接計算によって測定する。

２ｂ）被包
その細胞沈渣を、Ｅａｒｌｅ塩，エル−グルタミン及び重炭酸ナトリウムを含有したＴＣＭ１９９培養培地（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）における０．５％のキサンタンガム溶液（Ｓａｔｉａｘａｎｅ（登録商標）、ＳＫＷ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フランス）に希釈する。尚、細胞沈渣とキサンタンガム溶液の体積比は、１：３である。細胞懸濁液を確保し、それに、バリウムイオンの最終濃度が２０ｍｍｏｌ／１まで、飽和バリウム塩化物溶液を添加する。その結果生じた懸濁液を、ニードル（２６ＧＸ１／２秒，０．４５Ｘ１３ｍｍ）を介して、磁気攪拌機（３０ｒｐｍ）を用いて攪拌された状態にされた、培養培地における０．５％ｗ／ｖの中間粘度（３５００ｃＰ）アルギン酸ナトリウム溶液中に押し出す。細胞懸濁液とアルギン酸ナトリウム溶液の体積比は、１：２５である。その押出しは、２５℃の温度で、シリンジを介して滴るように実施する。バリウムイオンはアルギン酸ナトリウムと反応して、３０'以内に押出された各滴りの界面にバリウムアルジネート膜を形成する。カプセルを確保し、濾過によって収集して、培養培地で二度洗浄し、同培地のアリコートに懸濁させる。次に、Ｅａｒｌｅ塩，エル−グルタミン，重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＴＣＭ１９９培養培地で１％のプロタミン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミラノ、イタリア）の溶液を用いて、２５℃の温度で３０分間、そのカプセルを外表面において橋かけさせる。

顆粒膜細胞の固体群が、人工の細胞外基質における、橋かけされたカプセルの内部に見られる。

２ｍｍと１０ｍｍの間の寸法と２０ｍｇと１００ｍｇの間の重量を有する回転楕円面状のカプセルが得られる。そのようにして生成されたカプセルは、特定の制御された環境のインキュベータ内で通常の実験条件下で、凍結乾燥，冷却，冷凍又は低温保存法によって保存することができる。

２ｃ）三次元細胞培養
カプセルを、６００μｌ培養培地（ウシ胎児血清（１０％）と、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）と、３−１７アンドロステネディオーネ（３−１７ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ）（１００ｎｇ／μｌ）とを含有するＴＣＭ１９９）に懸濁された無菌細胞培養プレートウェル中に置く。

カプセルを含んだプレートを５％ＣＯ_２、９０％の湿度、３８．５℃の温度で、６日間インキュベータ内に維持させる。

４８時間毎に、各ウエルから、細胞メタボリック生成物を含む培地のサンプルを採取する。そのサンプルを−２０℃より低い温度で、エッペンドルフチューブ内で迅速に冷凍させる。

カプセルを含んだウエル内では、同じサンプルに関する培養を続けることで、培養培地が同じ体積の新たな培地によって取り替えられる。

従って、プロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）の生成の点においてステロイド合成機能を、ウエルから採取した培地の各サンプルにおいてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって評価した。

その結果は、黄体化指数として当業者において知られているＰ４とＥ２の比として表現される。

［表３］カプセルで培養されたブタ顆粒膜細胞の黄体化指数（Ｐ４／Ｅ２），標準偏差及びサンプル数

表３において報告した結果から、全培養周期を通じて両ホルモンの生成によって、細胞の生命力が被包された細胞において維持されていることが推論される。被包された細胞は、生体内で排卵前に濾胞において観察される低量のプロゲステロンを生じさせる。

それは、被包された細胞の黄体化が低減していることを示し、それは、生体内で見られる濾胞構造に極めて類似した濾胞構造においてのみ起こる。

［参考例２］
平行して、単一層内で細胞培養を実施した。この場合においても、プロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）の生成の点においてステロイド合成機能を評価した。ウエルから回収した培地のサンプルにおけるそのようなホルモンの濃度を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて評価した。

非被包細胞を、被包された細胞の培養のために用いた６００μｌの培養培地を含んだウエルプレートにおける単一層内で成熟させ培養させる。被包された細胞に関して述べたのと同様に、単一層の細胞を含んだプレートを５％ＣＯ_２、９０％の湿度、３８．５℃の温度で、６日間インキュベータ内に維持させる。

４８時間毎に、各ウエルから、細胞メタボリック生成物を含む培地のサンプルを採取する。そのサンプルを−２０℃より低い温度で、エッペンドルフチューブ内で冷凍させる。単一層で培養された細胞を含むウエルから、培養培地を完全に取り除いて、同じサンプルに関する培養を続けることで、培養培地が新たな培地によって取り替えられる。得られた結果を表４において報告する。

［表４］単一層で培養されたブタ顆粒膜細胞の黄体化指数（Ｐ４／Ｅ２），標準偏差及びサンプル数

図２には、単一層で培養されたブタ顆粒膜細胞とカプセルで培養されたブタ顆粒膜細胞の黄体化指数が、培養時間の関数として示されている。

その結果の分析により得られた情報は、本発明の方法によって被包されたブタ顆粒膜細胞が、生体内におけるステロイド機能と類似し且つ三次元細胞培養法によってのみ得られるステロイド機能を発揮するものであることを示している。

単一層で培養されたウシ顆粒膜細胞とカプセルで培養されたウシ顆粒膜細胞の黄体化指数を培養時間の関数として示した図である。 単一層で培養されたブタ顆粒膜細胞とカプセルで培養されたブタ顆粒膜細胞の黄体化指数を培養時間の関数として示した図である。

Claims (50)

1. アルギン酸の二価又は三価金属イオン塩の外膜と、内部核とを有し、前記内部核が、幹細胞の懸濁液，遺伝子学的に変化させられた雄性及び雌性体細胞，卵胞細胞，配偶子，卵巣卵胞，哺乳動物の胚及び（又は）人工細胞外基質を構成する生物適合性及び（又は）生物分解性ポリマーを含んでいるカプセル。
2. 前記細胞がゼラチン状培地に懸濁されている、請求項１に記載のカプセル。
3. 前記幹細胞，遺伝子学的に変化させられた雄性及び雌性体細胞，卵胞細胞，卵巣卵胞，配偶子及び哺乳動物の胚が、全哺乳動物生体に存在する臓器に機能的に類似した組織及び多細胞構造の生体外での成長を可能にする三次元柔組織濾胞又は胞状組織に生体外で自動組織化されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のカプセル。
4. 前記幹細胞，遺伝子学的に変化させられた雄性及び雌性体細胞，卵胞細胞，卵巣卵胞，配偶子及び哺乳動物の胚が、全ての生体中に見出される臓器と機能的に類似し、前記構造が生体内で生成することができる量と類似した量のプロゲステロン（Ｐ４）と１７β−エストラジオール（Ｅ２）のようなホルモン及びその他の生物学的活性物質を合成し分泌することができることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカプセル。
5. 前記アルジネート膜がゼラチン状で生物侵食可能であり、内面及び（又は）外面及び（又は）両面において橋かけされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカプセル。
6. 前記アルジネート膜が、プロタミン硫酸塩又はリン酸塩，ポリ−エル−リジン ブロモハイドレイト，ポリビニルアミン又はシトサンから選択された橋かけ剤を用いて橋かけされていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカプセル。
7. 外膜が、カルシウム，バリウム，ストロンチウム及び亜鉛から選択された二価金属アルジネート又はアルミニウム，鉄及びクロムから選択された三価金属から構成されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカプセル。
8. 前記アルジネート膜が、第二の又はそれ以上の細胞種を含んでいることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のカプセル。
9. 前記アルジネート膜が、卵胞細胞，少なくとも一つの配偶子，少なくとも一つの卵巣細胞及び少なくとも一つの哺乳動物の胚を含んでいることを特徴とする、請求項８に記載のカプセル。
10. 前記アルジネート膜が、成長の様々な段階における雌性配偶子を少なくとも一つ含んでいることを特徴とする、請求項８に記載のカプセル。
11. 前記生物適合性及び（又は）生物分解性ポリマーが、グルカン，スクレログルカン，マンナン，ガラクトマンナン，ゲラン，カラジーナン，ペクチン，ポリアンハイドライド，ポリアミノアシッド，ポリアミン，キサンタン，セルロース及びその誘導体，カルボキシメチルセルロース，エチルセルロース，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ポリビニルアルコール，カルボキシビニルポリマー，スターチ，アルファー，ベータ，ガンマーシクロデキストリン，通常のデキストリン誘導体，コラーゲン，キチン，チトサン，アルギン酸及びヒアルロン酸から成るグループから選択される親水性ポリマーであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のカプセル。
12. 水溶液の前記ポリマーが、総カプセル重量の０．０１％と９０％の間の濃度で存在していることを特徴とする、請求項１１に記載のカプセル。
13. 水溶液の前記ポリマーが、総カプセル重量の０．５％と５０％の間の濃度で存在していることを特徴とする、請求項１１に記載のカプセル。
14. 前記カプセル核の人工細胞外基質を構成している前記親水性ポリマー材料が、８００と１２００ｃＰの間の粘度を有するキサンタンガムであることを特徴とする、請求項１２に記載のカプセル。
15. 前記カプセルが、厚さが３００μｍと５０００μｍの間の膜を備え、０．５ｍｍと３０ｍｍの間の直径を有していることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のカプセル。
16. 前記カプセルが、２ｍｍと１０ｍｍの間の直径を有していることを特徴とする、請求項１５に記載のカプセル。
17. 前記カプセルが、５ｍｇと２００ｍｇの間の重量を有していることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のカプセル。
18. 前記カプセルが、２０ｍｇと１００ｍｇの間の重量を有していることを特徴とする、請求項１７に記載のカプセル。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のカプセルを調製するためのキットであって、単一及び（又は）複数調製のための使い捨て可能な、無菌又は非無菌又は滅菌可能な予め調製され且つプリパッケージされた手段を有しているキット。
20. 個別の予め測定されたパッケージ内に二価又は三価イオンの塩とアルカリ金属アルジネートを含む、請求項１９に記載のキット。
21. グルカン，スクレログルカン，マンナン，ガラクトマンナン，ゲラン，カラジーナン，ペクチン，ポリアンハイドライド，ポリアミノアシッド，ポリアミン，キサンタン，セルロース及びその誘導体，カルボキシメチルセルロース，エチルセルロース，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ポリビニルアルコール，カルボキシビニルポリマー，スターチ，アルファー，ベータ，ガンマーシクロデキストリン，通常のデキストリン誘導体，コラーゲン，キチン，チトサン，アルギン酸及びヒアルロン酸から成るグループから選択される生物適合性及び（又は）生物分解性の親水性ポリマーを更に含んでいる、請求項２０に記載のキット。
22. プロタミン硫酸塩又はリン酸塩，ポリ−エル−リジン ブロモハイドレイト，ポリビニルアミン又はシトサンから選択された橋かけ剤を更に含んでいる、請求項２０又は２１に記載のキット。
23. 生理的溶液（生理食塩液），ブドウ糖溶液，イーグル基礎培地（ＢＭＥ）及びその誘導体，Ｈａｎｋｓ塩類溶液及びその誘導体，組織培養培地１９９（ＴＣＭ１９９）及びその誘導体，リン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）及びその誘導体，Ｋｒｅｂｓ塩類溶液及びその誘導体，ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びその誘導体，トリスバッファー培地（ＴＢＭ）及びその誘導体，タイロード塩類溶液及びその誘導体，モディファイド精子洗浄培地及びその誘導体，モディファイドヒュウマンチューバル液，モディファイドＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地，アップグレーデッド Ｂ２ ＩＮＲＡ培地，Ｂ２ ＩＮＲＡ Ｍｅｎｅｚｏ培地，アップグレーデッドＢ９倍地から選択された培養培地を更に含んでいる、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のキット。
24. 無菌，非無菌又は滅菌可能なノズル，ニードル又はシリンジのような押出しデバイスを更に含んでいる、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のキット。
25. 前記二価又は三価イオン塩が、カルシウム，バリウム，ストロンチウム，亜鉛，アルミニウム，鉄又はクロムの塩から選択されている、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のキット。
26. 前記アルジネートが、アルギン酸ナトリウムである、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のキット。
27. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のカプセルの調整方法であって、
    ａ）前記細胞を、生物適合性及び（又は）生物分解性の親水性ポリマーを任意に含有している培養培地又は適切な生物学的液に懸濁させる工程と、
    ｂ）得られた懸濁液に、イオン濃度が１と５００ｍｍｏｌ／１の間になるまで二価又は三価のイオン塩を添加する工程と、
    ｃ）５０μｍと５０００μｍの間の寸法を有する押出し機、オリフィス，ノズル又はニードルを介して、１０と２００ｒｐｍの間の速度で攪拌された状態にされた０．０１％と５％ ｗ／ｖの間の濃度を有する培地のアルカリ金属アルジネート溶液中に前記細胞懸濁液を押出す工程と、
    ｄ）そのようにして生成されたカプセルを、５℃と４０℃の間の温度で、１分と１２０分の間の時間、請求項５に記載の橋かけ剤を用いたアルジネートの界面重合を介して任意に橋かけさせる工程とを含んでいるカプセルの調製方法。
28. 濾過によって前記カプセルを回収する工程と、前記カプセルを洗浄して培養培地に懸濁させる工程とを更に含んでいる、請求項２７に記載の方法。
29. 前記カプセルを、実験培養条件下で、又は凍結乾燥，冷凍又は低温保存法によって保存する工程を更に含んでいる、請求項２７に記載の方法。
30. 新たに切除され又は適切に保存された細胞，組織，組織の部分，臓器，臓器の部分，細胞核，配偶子及び胚を前記カプセル内で媒体化させる工程を更に含んでいる、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記媒体化工程が、新たに切除され又は適切に保存された成長の様々な過程における細胞，組織，組織の部分，臓器，臓器の部分，細胞核，配偶子及び胚を前記カプセル内に射出又は顕微射出させる工程を含んでいる、請求項３０に記載の方法。
32. 前記カプセルを細胞核，組織，臓器又はその部分，配偶子及び胚と共に適切な培養培地内でインキュベートする工程を更に含んでいる、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. いずれかの発育段階中に、細胞核，組織又は臓器又はそれの部分，配偶子，胚又はそれらによって生成される物質を何らかの手段又は技術を用いて吸引又は除去する工程を更に含んでいる、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. ホルモン，代謝産物，異化代謝産物，その他の生物学的活性物質のような生成される物質を押出し，洗浄，特徴付けを連続して行う工程を更に含んでいる、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 工程（ａ）において、前記二価又は三価イオンが、５と２００ｍｍｏｌ／１の間の濃度のカルシウム，バリウム，ストロンチウム，亜鉛，アルミニウム，鉄又はクロム塩化物又は硫化物である、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 工程（ａ）において用いられる前記培養培地が、人工細胞外基質を構成している生体適合性及び（又は）生物分解性ポリマーを任意に含んでいる、生理的溶液（生理食塩液），ブドウ糖溶液，イーグル基礎培地（ＢＭＥ）及びその誘導体，Ｈａｎｋｓ塩類溶液及びその誘導体，組織培養培地１９９（ＴＣＭ１９９）及びその誘導体，リン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）及びその誘導体，Ｋｒｅｂｓ塩類溶液及びその誘導体，ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びその誘導体，トリスバッファー培地（ＴＢＭ）及びその誘導体，タイロード塩類溶液及びその誘導体，モディファイド精子洗浄培地及びその誘導体，モディファイドヒュウマンチューバル液，モディファイドＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地，アップグレーデッド Ｂ２ ＩＮＲＡ培地，Ｂ２ ＩＮＲＡ Ｍｅｎｅｚｏ培地，アップグレーデッドＢ９倍地から選択されている、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 工程（ａ）において用いられる培地が、人工細胞外基質を構成する親水性ポリマーを含んだ、ＴＣＭ１９９及びその誘導体である、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 工程（ａ）において、細胞沈渣希釈液／ポリマー溶液の体積比が、１：０．０５と１：２００の間である、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 細胞沈渣希釈液／ポリマー溶液の体積比が、１：０．１と１：１００の間である、請求項３８に記載の方法。
40. 工程（ｃ）において、押出された細胞懸濁液とアルジネート溶液との体積比が、１：１と１：２５０の間である、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 工程（ｃ）において、押出しを、１分間に１０個〜２５０個の滴りを生み出すような速度で、自動又は半自動マイクロエンカプセレータ又は蠕動性ポンプ又はピストンポンプ或いは手動シリンジを用いて実行する、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 工程（ｃ）において、自動又は半自動マイクロエンカプセレータ又は蠕動性ポンプ又はピストンポンプ或いは手動シリンジを用いて実行される押出しが、１分間に６０個の滴りを生み出すような速度で実施される、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
43. 工程（ｃ）において、細胞懸濁液の押出しを、３００μｍと２０００μｍの間の内径を有するニードルを用いて実施する、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
44. 工程（ｃ）において、アルジネート溶液が、２０と１００ｒｐｍの間の速度で攪拌された状態に維持され、０．１％と１％ｗ／ｖの間の濃度を有している、請求項２７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 工程（ｃ）において、押出しされた細胞懸濁液とアルジネート溶液の体積比が、１：１５と１：５０の間である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. ２％水溶液で２５℃の温度のアルギネートが、２００ｃＰと２００００ｃＰの間の粘度を有している、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 工程（ａ），（ｂ）及び（ｃ）が、５℃と４０℃の間の温度で実施される、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 工程（ａ），（ｂ）及び（ｃ）が、２０℃と３０℃の間の温度で実施される、請求項２７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 工程（ｄ）が、５℃と４０℃の間の温度で、１分と１２０分の間の時間で実施される、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
50. 工程（ｄ）が、２０℃と３０℃の間の温度で、３分と３０分の間の時間で実施される、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
    
    

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