本發明提供一種包含非水溶性多糖類之奈米纖維之於黏著性細胞之多樣培養方法論中之作為載體之用途。可將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下供於(1)懸浮培養、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、(3)移植等各種處理。因此，本發明亦可理解為一種黏著性細胞之處理方法，其包括：將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下供於(1)懸浮培養、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、(3)移植等處理。 [黏著性細胞] 細胞係構成動物或植物之最基本之單位，作為其要素，於細胞膜之內部具有細胞質及各種細胞小器官。此時，內包DNA(deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)之核可含有於細胞內部，亦可不含有於細胞內部。 作為動物，並無限定，例如可列舉：魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六腳類、哺乳類等，較佳為哺乳類。作為哺乳類之例，並無限定，可列舉：大鼠、小鼠、兔、土撥鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨、狗、貓、山羊、牛、馬、綿羊、豬、象、狨、松鼠猴、恆河猴、黑猩猩、人類等。作為植物，只要所採集之細胞為能夠進行液體培養者，則無特別限定。例如可列舉：產生天然藥類(例如皂苷、生物鹼類、小檗鹼、莨菪苷、植物固醇等)之植物(例如藥用人參、長春花、茛菪、黃連、顛茄等)、或產生成為化妝品、食品原料之色素或多糖體(例如花青苷、紅花色素、茜草色素、番紅花色素、黃酮類等)之植物(例如藍莓、紅花、西洋茜草、番紅花等)、或產生醫藥品原料之植物等，但並不限定於該等。於本發明中，較佳為使用哺乳類細胞。 於本發明之一實施態樣中，使用黏著性細胞。黏著性細胞係指存活或增殖需要容器壁等支架之細胞。於本發明中，藉由使黏著性細胞附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維，可達成該細胞之良好之懸浮培養、非冷凍狀態下之保存及/或輸送、移植等處理。 作為本發明中使用之黏著性細胞，並無特別限定，例如可列舉：幹細胞、前驅細胞、成體非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等。幹細胞係指兼具複製自身之能力與分化為其他複數個系統之細胞之能力的細胞。作為黏著性幹細胞之例，並不限定於以下，例如可列舉：間葉系幹細胞、神經幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、胰臟幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等成體幹細胞等。所謂間葉系幹細胞係指骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞之全部或具有一些分化能力之幹細胞。間葉系幹細胞係以低頻度存在於骨髓、末梢血、臍帶血、脂肪組織等組織中，可藉由公知方法自該等組織單離。前驅細胞係指處於自上述幹細胞分化為特定之體細胞或生殖細胞之中途階段之細胞。作為黏著性前驅細胞之例，並不限定於以下，例如可列舉：前驅脂肪細胞、前驅心肌細胞、前驅內皮細胞、神經前驅細胞、肝前驅細胞、胰臟前驅細胞、腎臟前驅細胞等。作為黏著性之成體非幹細胞之例，並不限定於以下，例如包含纖維母細胞、骨細胞、骨外皮細胞、角質形成細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、神經膠細胞、神經元、寡樹突膠細胞、小神經膠質、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如平滑肌細胞或骨骼肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞等。初代培養細胞係指接種自活體分離之細胞或組織，處於進行第1次繼代之前的培養狀態之細胞。初代培養細胞例如可為自皮膚、腎臟、脾臟、腎上腺、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臟、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等任意組織採集之細胞。細胞株係指藉由活體外之人為操作而獲得無限增殖能力之細胞。本發明中使用之黏著性細胞較佳為幹細胞或前驅細胞，更佳為間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞。 [奈米纖維] 本發明中使用之奈米纖維係分散於液體培養基中，顯示出使附著於奈米纖維之細胞(較佳為黏著性細胞)懸浮於該液體培養基中之效果者。 本說明書中，奈米纖維係指平均纖維直徑(D)為0.001至1.00 μm之纖維。本發明中使用之奈米纖維之平均纖維直徑較佳為0.005至0.50 μm，更佳為0.01至0.05 μm，進而較佳為0.01至0.02 μm。 本發明中使用之奈米纖維之縱橫比(L/D)係由平均纖維長/平均纖維直徑獲得，並無特別限定，通常為2～500，較佳為5～300，更佳為10～250。 本說明書中，奈米纖維之平均纖維直徑(D)係以如下方式求出。首先，利用日本電子股份有限公司製造之離子清潔器(JIC-410)對應研商事股份有限公司製造之膠棉支持膜實施3分鐘親水化處理，滴加數滴評價對象之奈米纖維分散液(以超純水稀釋)，於室溫下乾燥。利用日立製作所股份有限公司製造之透過型電子顯微鏡(TEM，H-8000)(10,000倍)於加速電壓200 kV下對其進行觀察，使用所獲得之圖像，對標本數：200～250根奈米纖維測量每一根之纖維直徑，將其數量平均值作為平均纖維直徑(D)。 又，平均纖維長(L)係以如下方式求出。藉由純水將評價對象奈米纖維分散液以成為100 ppm之方式進行稀釋，使用超音波洗淨機使奈米纖維均勻地分散。將該奈米纖維分散液流延至預先使用濃硫酸對表面進行親水化處理之矽晶圓上，於110℃下乾燥1小時，作為試樣。使用所獲得之試樣之利用日本電子股份有限公司製造之掃描式電子顯微鏡(SEM，JSM-7400F)(2,000倍)所觀察到之圖像，對標本數：150～250根奈米纖維測量每一根之纖維長，將其數量平均值作為平均纖維長(L)。 於較佳之態樣中，本發明中使用之奈米纖維於與液體培養基混合時，保持一次纖維直徑並且該奈米纖維均勻地分散於該液體中，實質上不提高該液體之黏度，而實質上保持附著於奈米纖維之細胞，具有防止其沈澱之效果。所謂實質上不提高液體之黏度係指液體之黏度不超過8 mPa・s。此時之該液體之黏度(即，下述本發明之培養基組合物之黏度)為8 mPa・s以下，較佳為4 mPa・s以下，更佳為2 mPa・s以下。含有奈米纖維之液體之黏度例如可於25℃條件下使用音叉振動式黏度測定(SV-1A，A＆D Company Ltd.)進行評價。 本發明中使用之奈米纖維係包含非水溶性多糖類者。糖類係指10個以上之單糖類(例如三糖、丁糖、戊醣、己醣、庚醣等)聚合而成之糖聚合物。 作為非水溶性多糖類，可列舉：纖維素、半纖維素等纖維素類；幾丁質、幾丁聚醣等殼質物質等，但並不限定於該等。非水溶性多糖類較佳為幾丁質或幾丁聚醣，更佳為幾丁質。 纖維素係指作為葡萄糖之六員環之D-葡萄哌喃糖進行β-1,4葡萄糖苷鍵結而成之天然高分子化合物。作為原料，例如可使用木材、竹、麻、黃麻、洋麻、棉、農作物/食物殘渣等源自植物之纖維素、或細菌纖維素、剛毛藻(Cladophora)、灰色植物(Glaucocystis)、法囊藻、海鞘纖維素等微生物產生或動物產生之纖維素。源自植物之纖維素係被稱為微纖絲之非常細之纖維進而成為束，按照纖絲、薄片、纖維細胞，階段性地形成高次結構。又，細菌纖維素係自菌細胞分泌之纖維素之微纖絲直接以該粗度形成微細之網狀結構。 於本發明中，棉或細菌纖維素等高純度之纖維素原料可直接使用原料，但除此以外之源自植物之纖維素等較佳為使用經單離、純化者。本發明中較佳地使用之纖維素為棉纖維素、細菌纖維素、牛皮紙漿纖維素、微晶纖維素等。 殼質物質係指選自由幾丁質及幾丁聚醣所組成之群中之1種以上之糖質。構成幾丁質及幾丁聚醣之主要糖單位分別為N-乙醯葡糖胺及葡糖胺，一般而言，N-乙醯葡糖胺之含量較多且對酸性水溶液為難溶性者設為幾丁質，葡糖胺之含量較多且對酸性水溶液為可溶性者設為幾丁聚醣。本說明書中，為方便起見，將N-乙醯葡糖胺占構成糖之比率為50%以上者稱為幾丁質，將未達50%者稱為幾丁聚醣。就達成較高之懸浮作用之觀點而言，N-乙醯葡糖胺占構成幾丁質之糖單位之比率越高越佳。N-乙醯葡糖胺占構成幾丁質之糖單位之比率較佳為80%以上，更佳為90%以上，進而較佳為98%以上，最佳為100%。 作為幾丁質之原料，例如可使用蝦、蟹、昆蟲、貝、蘑菇等較多之生物資源。本發明中使用之幾丁質可為源自蟹殼或蝦殼之幾丁質等具有α型結晶結構之幾丁質，亦可為源自烏賊之骨片之幾丁質等具有β型結晶結構之幾丁質。蟹或蝦之外殼多數情況下作為產業廢棄物處理，就獲取容易並且有效利用之觀點而言作為原料較佳，為了去除作為雜質所含之蛋白質或灰分等，必須進行去蛋白步驟及去灰分步驟。因此，本發明中，較佳為使用已實施去基質處理之純化幾丁質。市售有純化幾丁質。 藉由將含有上述非水溶性多糖類之原料粉碎，可獲得包含該非水溶性多糖類之奈米纖維。粉碎方法並無限定，為了微細化至吻合本發明之目的之下述纖維直徑、纖維長，較佳為高壓均質機、研磨機(石磨機)、或珠磨機等介質攪拌磨機之類的可獲得較強之剪切力之方法。 於該等中，較佳為使用高壓均質機進行微細化，例如較理想為使用如日本專利特開2005-270891號公報或日本專利第5232976號所揭示之濕式粉碎法進行微細化(粉碎化)。具體而言，可藉由使用如下裝置實施，即，其係藉由於高壓下自一對噴嘴分別噴射分散有原料之分散液並使其碰撞而將原料進行粉碎者，且例如為星射系統(Sugino Machine股份有限公司製造之高壓粉碎裝置)或NanoVater(吉田機械興業股份有限公司之高壓粉碎裝置)。 於上述高壓均質機將原料微細化(粉碎化)時，微細化或均質化之程度依存於向高壓均質機之超高壓腔室壓送之壓力、通過超高壓腔室之次數(處理次數)、及水分散液中之原料之濃度。壓送壓力(處理壓力)並無特別限定，通常為50～250 MPa，較佳為150～245 MPa。 又，微細化處理時之水分散液中之原料之濃度並無特別限定，通常為0.1質量%～30質量%，較佳為1質量%～10質量%。微細化(粉碎化)之處理次數並無特別限定，亦取決於上述水分散液中之原料之濃度，於原料之濃度為0.1～1質量%之情形時，以處理次數為10～100次左右充分地微細化，於為1～10質量%時，有需要處理10～1000次左右之情形。 上述微細化處理時之水分散液之黏度並無特別限制，例如於非水溶性多糖類為α幾丁質之情形時，該水分散液之黏度之範圍為1～100 mPa・S，較佳為1～85 mPa・S(基於25℃條件下之音叉振動式黏度測定(SV-1A，A＆D Company Ltd.))。又，微細化處理時之水分散液中之非水溶性多糖類之粒徑亦無特別限制，例如於非水溶性多糖類為α幾丁質之情形時，該水分散液中之α幾丁質之平均粒徑之範圍為0.5～200 μm，較佳為30～150 μm(基於雷射繞射/散射式粒徑分佈測定裝置LA-960(堀場製作所))。 關於奈米纖維之製備方法，記載於WO 2015/111686 A1等中。 [包含奈米纖維之培養基組合物] 本發明中，於將黏著性細胞附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下，將該細胞供於懸浮培養、或非冷凍狀態下之保存及/或輸送之情形時，使用包含該奈米纖維之液狀之培養基組合物(本說明書中，亦稱為本發明之培養基組合物)。 於較佳之態樣中，於本發明之培養基組合物中，包含非水溶性多糖類之奈米纖維均勻地分散，使附著於奈米纖維之黏著性細胞懸浮於該液體培養基中。 本發明中，細胞之懸浮係指細胞對於培養容器不黏著之狀態(非黏著)。進而，於本發明中，於培養、保存、或輸送細胞時，將不伴有對液體培養基組合物之來自外部之壓力或振動或者於該組合物中之振盪、旋轉操作等而使細胞於該液體培養基組合物中均勻地分散且處於懸浮狀態的狀態稱為「懸浮靜置」，將於該狀態下培養細胞及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。作為於「懸浮靜置」下可懸浮之時間，至少為5分鐘以上，較佳為1小時以上、24小時以上、48小時以上、6天以上、21天以上，但只要保持懸浮狀態，則並不限定於該等時間。 於較佳之態樣中，本發明之培養基組合物可於能夠進行細胞之培養、保存或輸送之溫度範圍(例如0～40℃)之至少1點下進行細胞之懸浮靜置。本發明之培養基組合物較佳為可於25～37℃之溫度範圍之至少1點、最佳為於37℃下進行細胞之懸浮靜置。 是否可懸浮靜置例如可藉由如下方式進行評價，即，使聚苯乙烯珠(Size 500-600 μm，Polysciences Inc.製造)均勻地分散於評價對象之培養基組合物中，於25℃下靜置至少5分鐘以上(較佳為24小時以上、48小時以上)，觀察是否維持該細胞之懸浮狀態。 本發明之培養基組合物中之包含非水溶性多糖類之奈米纖維之濃度可以如下方式適當設定，即，於使用該培養基組合物將黏著性細胞供於懸浮培養、非冷凍狀態下之保存或輸送之情形時，可提高該黏著性細胞之存活性、或可使該黏著性細胞懸浮(較佳為懸浮靜置)。例如於幾丁質奈米纖維之情形時，培養基組合物中之幾丁質奈米纖維濃度例如為0.0001%(重量/容量)以上，較佳為0.001%(重量/容量)以上。培養基組合物中之幾丁質奈米纖維濃度之上限值例如為1.0%(重量/容量)以下，較佳為0.1%(重量/容量)以下。 本發明之培養基組合物中所含之培養基可根據所使用之黏著性細胞之種類等而適當選擇，例如於以哺乳類黏著性細胞之培養、保存或輸送為目的之情形時，可將通常用於哺乳類細胞之培養之培養基用作本發明之培養基組合物中所含之培養基。作為哺乳類細胞用培養基，例如可列舉：杜爾貝寇改良伊戈培養基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、鹹F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考依氏5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊戈MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培養基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊思考夫改良杜爾貝寇培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、費雪(Fischer’s)培養基、StemPro34(Invitrogen公司製造)、X-VIVO 10(Cambrex公司製造)、X-VIVO 15(Cambrex公司製造)、HPGM(Cambrex公司製造)、StemSpan H3000(Stem Cell Technology公司製造)、StemSpanSFEM(Stem Cell Technology公司製造)、StemlineII(Sigma-Aldrich公司製造)、QBSF-60(Quality Biological公司製造)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製造)、mTeSR1或2培養基(Stem Cell Technology公司製造)、Sf-900II(Invitrogen公司製造)、Opti-Pro(Invitrogen公司製造)等。 業者亦可視目的於上述培養基中自由地添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。於哺乳類細胞之培養、保存或輸送時，業者亦可視目的將其他化學成分或活體成分組合一種以上而添加。作為可添加至哺乳類細胞用培養基之成分，可列舉：胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞激素、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞黏著分子等。作為可添加至培養基之細胞激素，例如可列舉：介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、單核球群落刺激因子(M-CSF)、顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配體(FL)、白血病細胞抑制因子(LIF)、腫瘤抑制素M(OM)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等，但並不限於該等。 作為可添加至培養基之激素，可列舉：褪黑激素、血清素、甲狀腺素、三碘甲狀腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、抗苗勒氏管激素、脂聯素、腎上腺皮質促素、血管緊張素原及血管緊張素、抗利尿激素、心房利尿鈉肽、降血鈣素、膽囊收縮素、促腎上腺皮質素釋素、紅血球生成素、促卵泡激素、肽胃泌素、飢餓肽、胰高血糖激素、促性腺素釋素、生長素釋素、人類絨毛膜促性腺素、人類胎盤生乳素、生長素、抑制素、胰島素、類胰島素生長因子、瘦體素、黃體促素、黑色素細胞促素、催產素、副甲狀腺激素、泌乳素、胰泌素、生長抑素、血小板生成素、甲狀腺促素、甲狀腺促素釋素、皮質醇、醛固酮、睪固酮、去氫表雄脂酮、雄固烯二酮、二氫睪固酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體素、鈣化三醇、鈣化二醇、前列腺素、白三烯、前列環素、凝血脂素、泌乳素釋素、脂促素、腦利尿鈉肽、神經肽Y、組織胺、內皮素、胰多肽、腎素、及腦素，但並不限於該等。 作為可添加至培養基之增殖因子，可列舉：轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞增殖因子(EGF)、纖維母細胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增殖因子(NGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶連接蛋白I、蛋白酶連接蛋白II、血小板衍生生長因子(PDGF)、膽鹼能分化因子(CDF)、趨化細胞素、Notch配體(Delta1等)、Wnt蛋白質、血管生成素樣蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)等，但並不限於該等。 又，亦可藉由基因重組技術添加使該等細胞激素或增殖因子之胺基酸序列人為地改良而成者。作為其例，可列舉：IL-6/可溶性IL-6受體複合體或Hyper IL-6(IL-6與可溶性IL-6受體之融合蛋白質)等。 作為各種細胞外基質或各種細胞黏著分子之例，可列舉：膠原蛋白I至XIX、纖維黏連蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白-1至12、nitgen、生腱蛋白、血小板反應蛋白、馮威里氏(von Willebrand)因子、骨調素、血纖維蛋白原、各種彈力蛋白、各種蛋白多糖、各種黏附蛋白、橋粒糖蛋白、橋粒芯糖蛋白、各種整合素、E-選滯蛋白、P-選滯蛋白、L-選滯蛋白、免疫球蛋白超家族、基質膠(matrigel)、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、幾丁質、幾丁聚醣、瓊脂糖凝膠(sepharose)、透明質酸、海藻酸凝膠、各種水凝膠，進而可列舉該等之切斷片段等。 作為可添加至培養基之抗生物質之例，可列舉：磺胺製劑、青黴素、苯氧乙基青黴素、二甲氧苯青黴素、苯唑西林、氯噻青黴素、二氯噻青黴素、氟氯噻青黴素、乙氧萘青黴素、胺苄青黴素、青黴素、阿莫西林、環己西林、卡本西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、阿德諾西林(Amdinocillin)、頭孢菌素及其衍生物、歐索林酸、氨氟沙星、替馬沙星、啶酮酸、吡咯酸、環丙沙星、西諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、吡啉酸(Rosaxacin)、氧氟沙星、依諾沙星、吡哌酸、舒貝、克拉維酸、β-溴青黴烷酸、β-氯青黴烷酸、6-乙醯亞甲基-青黴烷酸、頭孢㗁唑(Cephoxazole)、舒他西林(Sultampicillin)、阿迪諾西林(Adinocillin)及舒貝之水合甲醛酯、他唑巴坦、氨曲南、磺醯胺菌素(Sulfazethin)、異磺醯胺菌素(Isosulfazethin)、諾卡菌素(Norcardicin)、間羧基苯基、苯基乙醯胺膦酸甲酯、氯四環素、氧四環素、四環素、去甲基氯四環素、去氧羥四環素、甲烯環素、以及米諾四環素。 於將包含上述非水溶性多糖類之奈米纖維供於使用該培養基組合物將黏著性細胞懸浮培養、於非冷凍狀態下之保存或輸送之情形時，以可提高該黏著性細胞之存活性、或成為可使該黏著性細胞懸浮(較佳為懸浮靜置)之濃度之方式，與適當之液體培養基混合，藉此可製造上述本發明之培養基組合物。 於較佳之態樣中，藉由將包含上述非水溶性多糖類之奈米纖維之生理性水性溶劑中之分散液與液體培養基進行混合而製備本發明之培養基組合物。該分散液亦可被進行殺菌(高壓釜，γ射線殺菌等)。或者，亦可於將該分散液與將粉末培養基溶於水中所製備之液體培養基(培養基之水溶液)混合後進行殺菌而使用。該分散液與液體培養基之殺菌亦可於混合前分別進行。作為水性溶劑之例，可列舉水、二甲基亞碸(DMSO)等，但並不限於該等。作為水性溶劑，較佳為水。亦可於水性溶劑中含有適當之緩衝劑或鹽。上述奈米纖維之分散液作為用以製備本發明之培養基組合物之培養基添加劑有用。 混合比率並無特別限定，奈米纖維之分散液：液體培養基(培養基之水溶液)(體積比)通常為1：99～99：1，較佳為10：90～90：10，更佳為20：80～80：20。 [使用包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞之處理] 本發明提供一種包含非水溶性多糖類之奈米纖維之於黏著性細胞之多樣培養方法論中之作為載體之用途。可將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下供於(1)懸浮培養、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、(3)移植等各種處理。因此，本發明亦可理解為一種黏著性細胞之處理方法，其包括：將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下供於(1)懸浮培養、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、(3)移植等處理。 (1)懸浮培養 藉由將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行培養，可對黏著性細胞進行懸浮培養。該懸浮培養可藉由於上述本發明之培養基組合物中培養黏著性細胞而實施。包含非水溶性多糖類之奈米纖維顯示出使附著於該奈米纖維之細胞懸浮於培養基中之效果(較佳為懸浮靜置之效果)。於本發明之培養基組合物中，由於包含非水溶性多糖類之奈米纖維均勻地分散，故而若於該培養基組合物中培養黏著性細胞，則黏著性細胞會附著於該奈米纖維，並懸浮於該培養基組合物中。藉由該懸浮效果，與單層培養相比，可增加每一定體積之細胞數量而進行培養。又，於先前之伴有旋轉或振盪操作之懸浮培養中，對細胞之剪切力發揮作用，因此有細胞之增殖率或回收率較低、或細胞功能受損之情形，但藉由使用本發明之培養基組合物，可無需振盪等操作而將細胞於分散之狀態下培養，因此可期待無損細胞功能、容易且大量地懸浮培養目標黏著性細胞。又，於在先前之含有凝膠基材之培養基中懸浮培養細胞時，有難以對細胞進行觀察或回收、或回收時損壞其功能之情形，但藉由使用本發明之培養基組合物，可期待對懸浮培養之細胞無損其功能地進行觀察並回收。又，先前之含有凝膠基材之培養基有黏度較高而難以更換培養基之情形，但本發明之培養基組合物由於為低黏度，故而可期待使用移液管或泵等容易地更換培養基。 於使用包含非水溶性多糖類之奈米纖維懸浮培養黏著性細胞之情形時，只要對本發明之培養基組合物添加另外製備之黏著性細胞，以均勻地分散之方式進行混合即可。此時之混合方法並無特別限制，例如可列舉：移液等利用手動之混合、使用攪拌器、旋渦混合器、微量培養盤混合器、振盪機等機器之混合。混合後，可將所獲得之細胞懸浮液於靜置狀態下培養，亦可視需要一面進行旋轉、振盪或攪拌一面培養。該轉數與頻度根據從業者之目的適當設定即可。例如，自繼代培養起回收黏著性細胞，使用適當之細胞解離液進行分散直至成為單一細胞、或接近其之狀態，使經分散之黏著性細胞懸浮於本發明之培養基組合物中，對其進行懸浮培養(較佳為懸浮靜置培養)。 關於培養細胞時之溫度，若為動物細胞，則通常為25至39℃，較佳為33至39℃(例如37℃)。CO
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濃度通常於培養環境中為4至10體積%，較佳為4至6體積%。培養時間根據培養目的適當設定即可。 本發明之培養基組合物中之黏著性細胞之培養可使用通常用於細胞培養之培養缽、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、培養皿、陪替氏培養皿(Petri dish)、組織培養用培養皿、多層培養皿、微量培養盤、微孔培養盤、多層培養盤、多孔培養盤、腔室玻片(chamber slide)、管、托盤、培養袋、轉瓶等培養容器而實施。該等培養容器較理想為細胞低黏著性，以不使附著於奈米纖維之黏著性細胞黏著於培養容器。作為細胞低黏著性培養容器，可使用未對培養容器之表面進行以提高與細胞之黏著性為目的之人工處理(例如利用細胞外基質等進行之塗佈處理)者、或對培養容器之表面進行了以降低與細胞之黏著性為目的之人工處理者。 於需要更換培養基時，只要藉由進行離心或過濾處理而將細胞分離後，將新鮮之培養基或本發明之培養基組合物添加至該細胞即可。或者，只要藉由進行離心或過濾處理而將細胞適當濃縮後，將新鮮之培養基或本發明之培養基組合物添加至該濃縮液即可。例如離心時之重力加速度(G)為100至400 G，進行過濾處理時使用之過濾器之細孔之大小為10 μm至100 μm，但並不限制於該等。 黏著性細胞之培養亦可藉由基於機械控制下，於封閉環境下自動地執行細胞接種、培養基更換、細胞圖像取得、培養細胞回收，一面控制pH值、溫度、氧濃度等一面進行高密度下之培養的生物反應器或自動培養裝置而進行。 (1-1)黏著性細胞之維持或增殖 若將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，則黏著性細胞高效率地增殖，因此該懸浮培養作為黏著性細胞之維持或增殖方法優異。若將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，則黏著性細胞不會僅偏集存在於培養容器之底面，而以三維擴散進行分散，促進增殖。尤其，若使用幾丁質奈米纖維作為奈米纖維，則黏著性細胞附著於幾丁質奈米纖維，以其為支架而大量地增殖，其結果為，增殖之細胞成為於奈米纖維上連結成葡萄串狀之狀態。關於該增殖促進效果，只要於培養基組合物中含有對於使黏著性細胞懸浮(即避免黏著性細胞對培養容器之黏著)充分之濃度之奈米纖維即可，並非必須能夠實現懸浮靜置(即，不伴有來自外部之壓力、振動、振盪、旋轉操作等，細胞於液體培養基組合物中均勻地分散且處於懸浮狀態)。例如於幾丁質奈米纖維之情形時，若為對於表現出懸浮作用充分之0.0001%(重量/容量)以上之濃度，則即便為低於能夠實現穩定之懸浮靜置培養之0.03%(重量/容量)的濃度(例如0.025%(重量/容量)以下、0.02%(重量/容量)以下)，亦發揮增殖促進效果。又，若將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，則可較使該細胞黏著於培養容器之底面而進行單層培養之情形以更高之密度維持並進行增殖。 於將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，使該細胞維持或增殖之情形時，作為用於該懸浮培養之本發明之培養基組合物中所含之培養基，使用可維持該黏著性細胞之性狀並且使該細胞維持或增殖的培養基。關於該培養基，業者可根據黏著性細胞之種類而適當選擇。 於一態樣中，藉由將哺乳動物之幹細胞(例如間葉系幹細胞)或前驅細胞(例如前驅脂肪細胞)於附著於幾丁質奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，可使該細胞維持或增殖。藉由該懸浮培養，可使哺乳動物之幹細胞(例如間葉系幹細胞)或前驅細胞(例如前驅脂肪細胞)維持其性狀(例如分化能力)並且維持或增殖。 於將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養之情形時，無需自培養容器剝離細胞之操作，僅將新鮮之培養基或本發明之培養基組合物添加至該懸浮培養物、或僅將該懸浮培養物之全部或一部分添加至新鮮之培養基或本發明之培養基組合物，即可繼代黏著性細胞。藉由使用該繼代培養方法，無需進行自培養容器剝離細胞之操作即可繼代培養黏著性細胞。又，藉由使用該繼代培養方法，可不進行自培養容器剝離細胞之操作而擴大黏著性細胞之培養規模。作為自培養容器剝離細胞之操作，可列舉利用螯合劑(例如EDTA)及/或蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶)進行之處理。上述繼代培養方法有利於對自培養容器剝離細胞之操作敏感性較高之黏著性細胞(例如因剝離操作而存活性降低之黏著性細胞、因剝離操作而性狀容易變化之黏著性細胞)之繼代培養。作為對自培養容器剝離細胞之操作敏感性較高之黏著性細胞，可列舉幹細胞(例如間葉系幹細胞)、前驅細胞(例如前驅脂肪細胞)、初代培養細胞等，但並不限定於該等。 (1-2)黏著性細胞之分化誘導 於將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養時，藉由於適當之分化誘導條件下進行該懸浮培養，可誘導該黏著性細胞向所期望之細胞之分化。如上所述，若將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，則會促進其增殖，因此藉由於適當之分化誘導條件下進行該懸浮培養，可期待該黏著細胞向所期望之細胞之良好之分化誘導。 分化誘導條件可根據黏著性細胞或所期望之分化細胞之種類而適當設定。業者可藉由將各種公知之分化誘導條件應用於上述懸浮培養，而使特定之黏著性細胞分化為所期望之細胞。例如可藉由將特定之分化誘導因子添加至上述本發明之培養基組合物中，於該分化誘導因子之存在下進行黏著性細胞之懸浮培養，而誘導向所期望之細胞之分化。 作為可應用於本發明之分化誘導條件，並無特別限定，例如可列舉以下。 ・間葉系幹細胞向脂肪細胞之分化：使用異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素及哚美辛作為脂肪細胞分化誘導因子，於該等因子之存在下培養間葉系幹細胞。 ・間葉系幹細胞向骨細胞之分化：使用地塞米松、抗壞血酸及β甘油磷酸作為骨細胞分化誘導因子，於該等因子之存在下培養間葉系幹細胞。 ・間葉系幹細胞向軟骨細胞之分化：使用胰島素、TGF-β3及抗壞血酸作為軟骨細胞分化誘導因子，於該等因子之存在下培養間葉系幹細胞。 關於間葉系幹細胞之脂肪細胞分化、骨細胞分化或軟骨細胞分化之條件，例如記載於以下之論文中。 [1]da Silva Meirelles L, Caplan AI, NardiNB., Stem Cells 2008; 26(9):2287-99. [2]Crisan M, Yap S, CasteillaL, et al., Cell Stem Cell 2008; (3):301-13. [3]Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, et al., Cytother2006; 8(4):315-7. [4]Caplan AI., Cell Stem Cell 2008; 3(3):229-30. ・前驅脂肪細胞向脂肪細胞之分化：使用異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素及哚美辛作為脂肪細胞分化誘導因子，於該等因子之存在下培養前驅脂肪細胞。 關於前驅脂肪細胞向脂肪細胞之分化之條件，例如記載於以下之論文中。 [5]Hutley LJ, Newell FM, et al., Eur J ClinInvest. 2003; 33(7): 574-81. [6]Yin Y, Yuan H, et al.,Mol Endocrinol.2006 ;20(2):268-78. [7]Rival Y, StennevinA, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 ;311(2): 467-75. 此外，以下之分化誘導條件公知，可應用於本發明。 ・自前驅脂肪細胞向骨細胞之分化： [8]Shirakawa K, Maeda S, et al.,Mol Cell Biol. 2006;26(16):6105-16. 分化誘導條件下之黏著性細胞之懸浮培養係進行至出現所期望之分化細胞為止。所期望之分化細胞之出現可藉由調查該細胞之分化標記物之表現等而確認。該懸浮培養之結果為，可以附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態獲得所期望之分化細胞。 於一態樣中，將哺乳動物之間葉系幹細胞於附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態下，於向脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞之分化誘導條件下，進行懸浮培養。藉由進行懸浮培養至出現脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞為止，而獲得脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞。脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞可以附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態獲得。 於一態樣中，將哺乳動物之前驅脂肪細胞於附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態下，於向脂肪細胞之分化誘導條件下，進行懸浮培養。藉由進行懸浮培養至出現脂肪細胞為止，而獲得脂肪細胞。脂肪細胞可以附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態獲得。 (1-3)利用黏著性細胞之液性因子產生 若將黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，則可以較高之密度培養黏著性細胞，又，可使黏著性細胞高效率地增殖，因此該懸浮培養對於利用體外細胞培養之液性因子之產生有用。藉由將產生所期望之液性因子之黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，自培養物(例如培養上清液)單離出目標之液性因子，可獲得該液性因子。作為液性因子，可列舉：抗體、酶(尿激酶等)、激素(胰島素等)、細胞激素(干擾素、介白素、腫瘤壞死因子、群落刺激因子、生長因子等)、疫苗之抗原、其他生理活性物質(蛋白質、肽等)，但並不限定於該等。產生液性因子之細胞包括皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、胰臟細胞、腎細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞等非轉形細胞、或導入編碼該液性因子之基因或參與有用物質之生物合成之基因之轉形細胞。產生所期望之液性因子之細胞較佳為將該液性因子分泌至細胞外之細胞。作為產生液性因子之細胞，具體而言，可列舉導入編碼該液性因子之基因或參與該液性因子之生物合成之基因的HEK293、CHO-K1、BHK-21、MDCK、Vero、HepG2、MCF-7等，但並不限定於該等。重組蛋白質等用於液性因子之產生之細胞為業者所周知，可於本發明之方法中使用該等細胞。培養規模之擴大亦可使用上述(1-1)所記載之黏著性細胞之維持或增殖方法進行。於將液性因子自培養物單離出時，必須自培養物去除細胞，若使用上述懸浮培養，則黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下懸浮於培養基組合物中，因此可藉由離心分離或過濾處理等簡單之方法去除細胞。又，培養基組合物中之奈米纖維亦可藉由離心分離或過濾處理等簡單之方法去除。將液性因子自培養物單離出之方法為業者所周知，例如可應用層析法(例如離子交換層析法、疏水性層析法、親和層析法、逆相層析法等層析法)等生理活性物質之生物化學分離純化方法。 於一態樣中，於將哺乳動物之間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、或脂肪細胞於附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態下進行懸浮培養，自所獲得之培養上清液單離出該等細胞分泌至細胞外之細胞激素或胞外體等有用物質。脂肪細胞可為藉由上述(1-2)之方法自哺乳動物之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞誘導者。 (2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送 黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下顯示出較高之存活性。又，可不將黏著性細胞自支架分離而以較高之密度進行濃縮。因此，包含非水溶性多糖類之奈米纖維可用作用於將黏著性細胞於非冷凍狀態下保存及/或輸送之載體。使用該奈米纖維之黏著性細胞之非冷凍狀態下之保存及/或輸送可藉由如下方式實施，即，使用上述本發明之培養基組合物，於將黏著性細胞以附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態懸浮於該培養基組合物中之狀態下(較佳為於懸浮靜置狀態下)進行保存及/或輸送。 於用於保存及/或輸送之本發明之培養基組合物中，除含有上述組成以外，亦可含有於細胞或組織之非冷凍狀態下之保存時具有細胞延命效果之各種成分。作為該成分，可列舉：糖類(其中，多糖類除外)(例如單糖類、二糖類)、抗氧化劑(例如SOD(Superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)、維生素E或麩胱甘肽)、親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮)、螯合劑(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、甘油等。 於保存及/或輸送時，例如將所期望之黏著性細胞分散於本發明之培養基組合物中，使黏著性細胞附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維，獲得附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞之懸浮液。亦可將上述(1)之懸浮培養之結果所獲得之包含附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞的培養物直接供於保存及/或輸送。又，亦可藉由將上述(1)之懸浮培養之結果所獲得之培養物進行離心分離等，而將附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞進行回收，藉由使其懸浮於適當之液體培養基中，而獲得附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞之懸浮液。懸浮液中之黏著性細胞之濃度並無特別限定，通常為1×10
2
～5×10
6
個/mL，較佳為1×10
4
～1×10
6
個/mL。 於保存及/或輸送時，將上述黏著性細胞之懸浮液放入可密封容器中。作為該容器，可列舉：燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、管、培養袋等，但並不限定於該等。為了避免於保存或輸送中內容物之洩漏或來自外界之細菌等之污染，放入黏著性細胞之懸浮液之容器較佳為予以密封。 關於保存及/或輸送中之溫度，只要維持黏著性細胞之存活，則無特別限定，通常為37℃以下。溫度較低可避免保存及/或輸送中之細胞之存活性之降低，但為了不使細胞冷凍，通常於超過本發明之培養基組合物之融點之溫度下保存及/或輸送。因此，保存及/或輸送中之溫度通常維持為-5～42℃，較佳為1～37℃，更佳為4～32℃，進而較佳為18～30℃。 關於保存及/或輸送之時間，只要為可將對象之黏著性細胞維持為存活狀態之範圍內，則無特別限定，通常為1小時以上且10天以內，較佳為1～8天，更佳為1～3天。於保存及/或輸送期間中，黏著性細胞較佳為於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下，於本發明之培養基組合物中維持懸浮靜置狀態。 若使用本發明之保存或輸送方法，則可不將黏著性細胞自支架分離，而於非冷凍狀態下維持著懸浮狀態進行保存及/或輸送。因此，可將因細胞之冷凍、黏著性細胞自支架之剝離、沈澱而接觸之細胞彼此之凝聚等所導致之損傷抑制為最小限度，於維持原本之功能之狀態下保存及/或輸送黏著性細胞。 於一態樣中，將哺乳動物之間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞以附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態於非冷凍狀態下進行保存及/或輸送。脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞可為藉由上述(1-2)之方法而自哺乳動物之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞誘導者。 於回收保存及/或輸送之黏著性細胞時，亦可利用螯合劑(例如EDTA)及/或蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶)對黏著性細胞進行處理，使黏著性細胞自奈米纖維剝離，又，亦可藉由下述本發明之回收方法，利用適當之分解酶使奈米纖維分解，使黏著性細胞自奈米纖維剝離。亦可於藉由上述(1-1)所記載之方法將於附著於奈米纖維之狀態下保存及/或輸送之黏著性細胞進行懸浮培養後進行回收操作。或者，將附著於奈米纖維之黏著性細胞轉移至細胞黏著性培養器，繼而進行培養。細胞黏著性培養器可為以提高培養器之表面與細胞之黏著性為目的而利用細胞外基質(ECM)等任意之細胞支持用基質塗佈者。作為細胞支持用基質，可列舉：膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏連蛋白、及纖維黏連蛋白以及其等之混合物、例如基質膠等，但並不限定於該等。若於細胞黏著性培養器中培養附著於奈米纖維之黏著性細胞，則黏著性細胞自奈米纖維移動至細胞黏著性培養器之表面，於黏著於該培養器之表面之狀態下增殖。亦可利用螯合劑(例如EDTA)及/或蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶)對黏著於該培養器之表面之細胞進行處理，使其自表面剝離，並進行回收。 (3)移植 如上所述，黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下顯示出較高之存活性。又，可不將黏著性細胞自支架分離，而於維持良好之功能之狀態下以較高之密度進行濃縮。進而，幾丁質等非水溶性多糖類由於為生物降解性，故而若移植至體內，則會分解而消失。因此，包含非水溶性多糖類之奈米纖維可用作用以將黏著性細胞移植至活體內之載體。藉由將有效量之黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下對需要利用該黏著性細胞進行治療之患者進行移植，可治療該患者之疾病或障礙。該疾病或障礙可為由該黏著性細胞之缺失、不足、或功能不全所引起者。例如藉由將有效量之人類黏著性細胞於附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之狀態下對需要利用該黏著性細胞進行治療之人類患者進行移植，可治療該人類患者之疾病或障礙。進行移植之黏著性細胞可為藉由上述(1)之懸浮培養、或上述(2)之非冷凍狀態下之保存及/或輸送而獲得者。 於一態樣中，藉由將哺乳動物之間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞於附著於幾丁聚醣奈米纖維之狀態下對需要利用間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞進行治療之哺乳動物患者進行移植，可治療該患者之疾病或障礙。該疾病或障礙可為由間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞之缺失、不足、或功能不全所引起者。哺乳動物較佳為人類。進行移植之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞可為藉由上述(1-1)之方法進行維持或增殖者。脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞可為藉由上述(1-2)之方法而自哺乳動物之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞誘導者。 [連續處理] 如上所述，包含非水溶性多糖類之奈米纖維可用作間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞等黏著性細胞之(1)懸浮培養(維持或增殖、分化誘導、或液性因子產生)、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、以及(3)移植等各種操作中之共用載體，因此藉由使用包含非水溶性多糖類之奈米纖維，可連續地實施選自(1)懸浮培養((1-1)維持或增殖、(1-2)分化誘導、或(1-3)液性因子產生)、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送、以及(3)移植中之複數種處理。所謂「連續」係指將藉由特定之操作所獲得之附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞維持著該附著狀態而供於下一操作。藉由不將黏著性細胞自支架剝離而連續地進行複數種操作，可於良好之狀態下維持黏著性細胞之存活性及功能。 處理之組合及其順序並無特別限定，可根據目的適當設定。又，亦可連續地、或非連續地進行複數次相同之處理。以下例示處理之組合、及其順序之例，但並不限定於該等。 (a)(1-1)→(2) (b)(1-1)→(2)→(1-1) (c)(1-1)→(2)→(1-2) (d)(1-1)→(2)→(1-1)→(1-2) (e)(1-1)→(2)→(1-2)→(1-1) (f)(1-1)→(2)→(1-1)→(1-2)→(1-1) (g)(1-1)→(1-2)→(2) (h)(1-1)→(1-2)→(1-1)→(2) (i)(1-1)→(1-2)→(2)→(1-1) (j)(1-1)→(1-2)→(1-1)→(2)→(1-1) (k)(1-1)→(1-2) (l)(1-1)→(1-2)→(1-1) (m)於上述(a)～(l)中之任一操作(例如(a)、(b)、(c)或(k))後，連續地進行(3) (n)於上述(a)～(l)中之任一操作(例如(a)、(b)、(c)或(k))後，連續地進行(1-3) 於上述組合中，包含非水溶性多糖類之奈米纖維較佳為幾丁質奈米纖維。於上述(a)及(b)中之操作(1-1)中，維持或增殖之黏著性細胞較佳為哺乳動物之間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞、脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞。於上述(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)及(l)中，於操作(1-2)之前進行之操作(1-1)中，維持或增殖之黏著性細胞較佳為哺乳動物之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞。於上述(e)、(f)、(h)、(i)、(j)及(l)中，於操作(1-2)之後進行之操作(1-1)中，維持或增殖之黏著性細胞為脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞。於上述組合中，操作(1-2)較佳為自哺乳動物之間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞向脂肪細胞、骨細胞或軟骨細胞之分化誘導。 [附著於奈米纖維之黏著性細胞之回收] 本發明提供一種自附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞回收該黏著性細胞之方法，其包括：藉由利用該非水溶性多糖類之分解酶對附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞進行處理而使該奈米纖維分解，使該黏著性細胞自奈米纖維剝離。 一般而言，於將附著於培養容器等之黏著性細胞剝離而回收之情形時，利用螯合劑(例如EDTA)及/或蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶)進行處理，但若進行該處理，則會破壞黏著性細胞之細胞外基質之結構，又，有因螯合劑或蛋白質分解酶對黏著性細胞之直接作用而導致黏著性細胞受到損傷，損壞其存活性或功能之情形。又，於使用螯合劑或蛋白質分解酶回收細胞之情形時，為了去除培養基中所含之二價離子或蛋白質等，必須去除培養基，利用PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝生理鹽水)等將細胞洗浄，該洗淨操作有對細胞造成損傷之情形。尤其，幹細胞(例如間葉系幹細胞)、前驅細胞(例如前驅脂肪細胞)、初代培養細胞等對使用如上所述之螯合劑或蛋白質分解酶之剝離操作之敏感性較高。相對於此，於本發明之回收方法中，使構成黏著性細胞所附著之奈米纖維之非水溶性多糖類分解。因此，將黏著性細胞之細胞外基質之結構之破壞限制為最小限度。又，哺乳動物等之細胞通常不含非水溶性多糖類作為其構成成分，因此即便利用非水溶性多糖類之分解酶對該細胞進行處理，亦將對該細胞之直接影響限制為最小限度。進而，哺乳動物等之培養基通常不含非水溶性多糖類，因此無需利用PBS等之洗淨操作。因此，根據本發明之回收方法，可將對黏著性細胞之損傷抑制為最小限度，並且將黏著性細胞自奈米纖維剝離而回收。 於本發明之回收方法中，對應於非水溶性多糖類之種類而適當選擇其分解酶。例如於使用幾丁質或幾丁聚醣作為非水溶性多糖類之情形時，作為其分解酶，可使用幾丁質酶、幾丁二糖酶、幾丁聚糖酶、β-1,3-葡聚糖酶等。於使用纖維素作為非水溶性多糖類之情形時，作為其分解酶，可使用纖維素酶(內葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)、β-葡萄糖苷酶([β]-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”))。於纖維素原料中含有大量半纖維素之情形時，除纖維素酶以外，較佳為添加木聚糖酶或甘露醇分解酶作為用以使半纖維素分解之酶。亦可組合複數種分解酶而使用。例如於使用幾丁質或幾丁聚醣作為非水溶性多糖類之情形時，作為其分解酶，亦可使用選自由幾丁質酶、幾丁二糖酶、幾丁聚糖酶、及β-1,3-葡聚糖酶所組成之群中之2、3或4種酶之混合物。Yatalase(Takara Bio)係包含幾丁質酶、幾丁二糖酶、幾丁聚糖酶、及β-1,3-葡聚糖酶之混合物，可作為幾丁質或幾丁聚醣之分解酶較佳地用於本發明之回收方法。 例如，對附著於包含非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞之懸浮液添加該非水溶性多糖類之分解酶，將混合物保溫對於黏著性細胞之剝離充分之時間。如上所述，由於該剝離無需螯合劑(EDTA)或蛋白質分解酶(胰蛋白酶、膠原蛋白酶)，故而於一態樣中，不對懸浮液添加螯合劑(EDTA)及/或蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶)，而添加非水溶性多糖類之分解酶。又，由於無需利用PBS等之洗淨操作，故而於一態樣中，不進行用以將懸浮黏著性細胞之介質中之二價離子及/或蛋白質去除(例如將濃度設為1/10以下)之洗淨操作，而向該介質中添加非水溶性多糖類之分解酶。非水溶性多糖類之分解酶之培養溫度通常為20℃～37℃。培養時間亦取決於酶之種類等，通常為5～60分鐘。 若奈米纖維分解，黏著性細胞自奈米纖維剝離，則可藉由對懸浮液進行離心分離而回收剝離之黏著性細胞。 以此方式回收之黏著性細胞可將損傷抑制為最小限度，因此可較佳地用於功能解析或移植等。 例如，於使用包含上述非水溶性多糖類之奈米纖維之黏著性細胞之處理中，亦可於進行(1)懸浮培養((1-1)維持或增殖、(1-2)分化誘導)、(2)非冷凍狀態下之保存及/或輸送之操作後，藉由本發明之回收方法，將黏著性細胞自奈米纖維剝離並回收。亦可於進行上述連續操作(例如(a)～(l))後，藉由本發明之回收方法，將黏著性細胞自奈米纖維剝離並回收。 以下，藉由對本發明之培養基組合物之實施例進行具體敍述，而進一步詳細地說明發明，但本發明並不受該等限定。 實施例 (試驗例1：使用幾丁質奈米纖維之3D培養中之人類前驅脂肪細胞之增殖) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)及去醯化結冷膠(DAG)(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製造)以成為1%(w/v)之方式分別懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.003%(w/v)、0.01%(w/v)、0.03%(w/v))、添加有去醯化結冷膠之培養基組合物(最終濃度：0.015%(w/v)、0.03%(w/v))、及不含上述基材之未添加培養基組合物。繼而，將所培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為33333細胞/mL之方式懸浮於上述各培養基組合物中後，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養10天。對第3、第7、第10天之培養液添加ATP(adenosine-triphosphate，三磷酸腺苷)試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU(Relative Light Unit，相對光單位)值)，減去僅培養基之發光值，算出活細胞之數量(4點之平均值)。 其結果為，若使用添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物培養人類前驅脂肪細胞，則於0.003%(w/v)以上之濃度下確認到細胞增殖作用。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表1。 [表1]
(試驗例2：使用幾丁質奈米纖維之3D培養中之人類脂肪組織源性間葉系幹細胞之增殖) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於作為低血清培養基之間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.001%(w/v)、0.003%(w/v)、0.01%(w/v)、0.03%(w/v))、及不含上述基材之未添加培養基組合物。繼而，將所培養之人類脂肪源性間葉系幹細胞(C-12977，Takara Bio公司製造)以成為13333細胞/mL之方式懸浮於上述各培養基組合物中後，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養10天。對第3、第7、第10天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，算出活細胞之數量(4點之平均值)。 其結果為，若使用添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物培養人類脂肪組織源性間葉系幹細胞，則於0.001%(w/v)以上之濃度下確認到細胞之增殖促進作用。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表2。 [表2]
(試驗例3：黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞之回收) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.03%(w/v))。繼而，將所培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為33333細胞/mL之方式懸浮於上述培養基組合物中後，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養3天，使細胞黏著於幾丁質奈米纖維。 於培養3天後，將含有幾丁質分解酶之Yatalase(Takara Bio製造，T017)以最終濃度成為0.1%(w/v)或0.25%(w/v)之方式添加至各孔中，於37℃下靜置約1小時。其後，將含有幾丁質奈米纖維分解物或人類前驅脂肪細胞之4孔之量之細胞懸浮液回收至15 mL管中，以1500 rpm進行離心。於離心後，去除上清液之培養基成分，將沈澱之人類前驅脂肪細胞懸浮於600 μL之人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中，以150 μL/孔重新接種於96孔平底微量培養盤(Corning公司製造，#3585)，實施照片拍攝。 其結果為，可知若於添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物中培養人類前驅脂肪細胞，則人類前驅脂肪細胞黏著於幾丁質奈米纖維，若使用Yatalase使幾丁質奈米纖維分解，則黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞可以單細胞樣單離出。將Yatalase處理後之細胞之照片示於圖2。 (試驗例4：黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞之回收與重新接種) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.03%(w/v))。繼而，將培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為33333細胞/mL之方式懸浮於上述培養基組合物中，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養3天，使細胞黏著於幾丁質奈米纖維。 於培養3天後，將含有幾丁質分解酶之Yatalase(Takara Bio製造，T017)以最終濃度成為0.1%(w/v)或0.25%(w/v)之方式添加至各孔，於37℃下靜置約1小時。其後，將含有幾丁質奈米纖維分解物或人類前驅脂肪細胞之4孔之量之細胞懸浮液回收至15 mL管中，以1500 rpm進行離心。於離心後，將上清液之培養基成分去除，將所沈澱之人類前驅脂肪細胞懸浮於600 μL之人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中，以150 μL/孔重新接種於96孔平底微量培養盤(Corning公司製造，#3585)，評價細胞增殖與向脂肪細胞之分化誘導之程度。 細胞增殖之評價係使用ATP值之測定法進行。於重新接種後，將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養至最多7天為止。對重新接種後第0、第3、第7天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，算出活細胞之數量(4點之平均值)。 向脂肪細胞之分化係使用脂肪細胞標記物之mRNA(messenger ribonucleic acid，傳訊核糖核酸)表現值進行評價。重新接種細胞，於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養3天。確認細胞對96孔平底微量培養盤之黏著，去除培養基，更換為人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製造)150 μL/孔，進而將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養10天。 於更換為分化培養基時(第0天)與第10天，使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製造)自黏著之細胞提取總RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)。使用PrimeScript
TM
RT Master Mix(Takara Bio公司製造)，於GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)上進行反轉錄反應，由總RNA合成cDNA(complementary deoxyribonucleic acid，互補去氧核糖核酸)。使用將所獲得之各cDNA樣品利用殺菌水稀釋至1/10者作為PCR(polymerase chain reaction，聚合酶連鎖反應)之模板。又，使用分注混合之cDNA作為校準曲線製作用樣品。校準曲線以3倍公比於1/3至1/243之稀釋之定量範圍內設定。PCR係使用各cDNA樣品、校準樣品、Premix Ex Taq
TM
(Takara Bio公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，藉由7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製造)而實施。將PPIA(親環蛋白(cyclophilin)B)之mRNA作為內源性對照組，PPAR γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，過氧化物酶體增殖物活化受體γ) mRNA或脂蛋白脂酶(LPL) mRNA之表現係以PPIA之值進行修正。以下表示所使用之探針(Applied Biosystems公司製造)。 PPIA：HS99999904 PPAR γ：HS011155134 LPL：HS00173425 其結果為，可知若於添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物中培養人類前驅脂肪細胞，則人類前驅脂肪細胞黏著於幾丁質奈米纖維，若使用Yatalase使幾丁質奈米纖維分解，則黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞以單細胞樣單離出。又，經單離之細胞保持於96孔平底微量培養盤上之增殖能力與向脂肪細胞之分化能力。分別將關於細胞增殖評價之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表3，將關於脂肪細胞分化評價之PPAR γ與LPL之mRNA表現值示於表4及表5。 [表3]
[表4]
[表5]
(試驗例5：黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞之分化誘導) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。使用該溶液製備於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.03%(w/v))。繼而，將所培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為33333細胞/mL之方式懸浮於上述培養基組合物中，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養最多14天。 細胞存活性之評價係使用ATP值之測定法進行。對第0、第4、第8、第14天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，算出活細胞之數量(4點之平均值)。 向脂肪細胞之分化係使用脂肪細胞標記物之mRNA表現值進行評價。於人類前驅脂肪細胞對上述培養基組合物之接種時(第0天)與第4、第8及第14天時，使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製造)自細胞懸浮液提取總RNA。使用PrimeScript
TM
RT Master Mix(Takara Bio公司製造)，於GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)上進行反轉錄反應，由總RNA合成cDNA。使用將所獲得之各cDNA樣品利用殺菌水稀釋至1/10者作為PCR之模板。又，使用經分注混合之cDNA作為校準曲線作成用樣品。校準曲線係以3倍公比於1/3至1/243之稀釋之定量範圍內設定。PCR係使用各cDNA樣品、校準樣品、Premix Ex Taq
TM
(Takara Bio公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，藉由7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製造)而實施。以下表示所使用之探針(Applied Biosystems公司製造)。 PPIA：HS99999904 PPAR γ：HS011155134 LPL：HS00173425 FABP4：HS01086177 其結果為，可知若於在培養基組合物中添加有幾丁質奈米纖維之條件下進行向脂肪細胞之分化誘導，則可保持細胞之存活性並且自人類脂肪前驅細胞分化誘導為脂肪細胞樣。將關於細胞存活性之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表6。以將第0天之值設為100%時之相對值之形式表示。將關於脂肪細胞分化評價之PPAR γ、LPL、及FABP4之mRNA表現示於表7、表8及表9。 [表6]
[表7]
[表8]
[表9]
(試驗例6：黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞之輸送試驗) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式分別懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液(或懸浮液)進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.01%(w/v))、及不含幾丁質奈米纖維之未添加培養基組合物。繼而，將所培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為90000細胞/mL之方式懸浮於上述各培養基組合物中後，以5 mL/孔接種於6孔平底超低黏著表面微量培養盤(#3471，Corning公司製造)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養3天。於培養後，將人類前驅脂肪細胞所黏著之幾丁質奈米纖維回收至50 mL管中，進行離心後，對成為顆粒之人類前驅脂肪細胞所黏著之幾丁質奈米纖維添加新的人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)並使其懸浮，轉移至6孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3471)或15 mL管。6孔平底超低黏著表面微量培養盤於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養7天，15 mL管係於25℃培養箱內靜置7天。 將於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內或25℃培養箱內維持7天之黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞與培養基一起重新接種至100 mm培養皿(#430167，Corning製造)，於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下進一步培養7天，利用顯微鏡對自幾丁質奈米纖維遷移、增殖之人類前驅脂肪細胞進行觀察(圖3)。 於利用顯微鏡確認後，將培養基去除，利用PBS(-)(#045-29795，和光純藥製造)對黏著於培養皿之人類前驅脂肪細胞與幾丁質奈米纖維清洗後，添加胰蛋白酶(#CA090K，東洋紡製造)，藉此僅回收人類前驅脂肪細胞。將所回收之人類前驅脂肪細胞懸浮於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)中，以5 mL/孔接種於6孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3471)，培養5天。於培養5天後，將培養基更換為脂肪細胞分化培養基(#CA811D250，東洋紡製造)，進而繼續培養17天，利用顯微鏡觀察向脂肪細胞之分化誘導(圖4)。 其結果為，黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內或25℃培養箱內之任一條件下，均於靜置7天後具有自幾丁質奈米纖維之遷移能力及增殖能力(圖3)，且保持向脂肪細胞之分化能力(圖4)。於使用人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)及含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)之任一培養基之情形時，均可獲得相同之結果。 (試驗例7：黏著於幾丁質奈米纖維之人類脂肪源性間葉系幹細胞之輸送試驗) 將幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot.GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式分別懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液(或懸浮液)進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於ADSC培養基(#C-28009，Takara公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)中添加有幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.01%(w/v))、及不含幾丁質奈米纖維之未添加培養基組合物。繼而，於將所培養之人類脂肪組織源性間葉系幹細胞(#C-12977，Takara公司製造)以成為90000細胞/mL之方式懸浮於上述各培養基組合物中後，以5 mL/孔接種於6孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3471)。將細胞於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養3天。於培養後，將人類脂肪源性間葉系幹細胞所黏著之幾丁質奈米纖維回收至50 mL管中，進行離心後，對成為顆粒之人類脂肪源性間葉系幹細胞所黏著之幾丁質奈米纖維添加新的ADSC培養基(#C-28009，Takara公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)並使其懸浮，轉移至6孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3471)或15 mL管。6孔平底超低黏著表面微量培養盤於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下保溫7天，15 mL管於25℃培養箱內靜置7天。 將於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內或25℃培養箱內維持7天之黏著於幾丁質奈米纖維之人類脂肪源性間葉系幹細胞連同培養基一起重新接種於100 mm培養皿(#430167，Corning製造)，於CO
2
培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下進而培養7天，利用顯微鏡對自幾丁質奈米纖維遷移、增殖之人類脂肪源性間葉系幹細胞進行觀察(圖5)。 於利用顯微鏡確認後，去除培養基，利用PBS(-)(#045-29795，和光純藥製造)對黏著於培養皿之人類脂肪源性間葉系幹細胞與幾丁質奈米纖維清洗後，添加胰蛋白酶(#C-41210，Takara公司製造)，藉此僅回收人類脂肪源性間葉系幹細胞。將回收之人類脂肪源性間葉系幹細胞懸浮於ADSC培養基(#C-28009，Takara公司製造)或含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)中，以5 mL/孔接種於6孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3471)，培養2天。於培養2天後，將培養基更換為脂肪細胞分化培養基(#C-28016，Takara公司製造)，進而繼續培養8天，利用顯微鏡觀察向脂肪細胞之分化誘導(圖6)。 其結果為，黏著於幾丁質奈米纖維之人類脂肪源性間葉系幹細胞於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內或25℃培養箱內之任一條件下，均於靜置7天後具有自幾丁質奈米纖維之遷移能力及增殖能力(圖5)，且保持向脂肪細胞之分化能力(圖6)。於使用ADSC培養基(#C-28009，Takara公司製造)及含有10%FBS(#35-015-CV，Corning製造)之DMEM培養基(#044-29765，和光純藥製造)之任一培養基之情形時，均獲得相同之結果。 根據以上之結果，確立非冷凍條件下之新穎之細胞輸送法，即，於黏著於幾丁質奈米纖維之狀態下輸送細胞，並直接將細胞重新接種於培養皿，使細胞遷移至培養皿上並增殖，利用胰蛋白酶等進行回收。將模型示於圖7。 (試驗例8：使用α幾丁質奈米纖維、β幾丁質奈米纖維、幾丁聚醣奈米纖維之3D培養中之MDCK細胞增殖效果) 將依據WO 2015/111686 A1所製備之α幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。進而將幾丁聚醣奈米纖維及β幾丁質奈米纖維以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由於90℃下一面加熱一面攪拌而使其溶解，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。所使用之奈米纖維係於在200 MPa下通過10次之解纖度條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品1)、於在200 MPa下通過1次之解纖度條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品2)、於在200 MPa下通過10次之解纖度條件下奈米纖維化之幾丁聚醣奈米纖維(樣品3)、於在200 MPa下通過10次之解纖度條件下奈米纖維化之β幾丁質奈米纖維(樣品4)。 製備於無血清培養基KBM220培養基(Kohjin Bio公司製造)中添加有最終濃度0.03%(w/v)之各奈米纖維樣品(1～4)之培養基組合物。繼而，於將所培養之狗腎小管上皮細胞株MDCK(DS Pharma Biomedical公司製造)以成為66666細胞/mL之方式接種至添加有上述各奈米纖維樣品(1～4)之培養基組合物後，以成為30 mL之方式分注至125 mL燒瓶(Thermo Scientific，4115-0125)。各燒瓶於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內於振盪狀態(cfg50 rpm)下持續培養6天。又，於第6天，將各奈米纖維樣品(1～4)及黏著於奈米纖維之MDCK細胞回收至50 mL管中，於離心後(cfg1000 rpm，3分鐘)僅去除培養基。對殘存之各奈米纖維樣品及MDCK細胞添加新的KBM220培養基並使其懸浮後，將懸浮液全部倒回至原來之125 mL燒瓶中，於振盪狀態(cfg50 rpm)下繼續培養。於第9天與第13天亦實施以上之培養基更換操作。 藉由移液使第0、第6、第13、第17天之培養液懸浮，對該細胞懸浮液100 μL添加ATP試劑100 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其進行反應，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，以4點之平均值之形式測定活細胞之數量。 其結果為，若使用含有各奈米纖維樣品(1～4)之培養基組合物將MDCK細胞於125 mL燒瓶中進行培養，則確認到由樣品2之α幾丁質奈米纖維添加所產生之細胞增殖促進作用最強。又，關於樣品1之α幾丁質奈米纖維與樣品3之幾丁聚醣奈米纖維亦確認到細胞增殖促進效果。另一方面，樣品4之β幾丁質奈米纖維之細胞增殖促進作用較弱。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表10。 [表10]
(試驗例9：使用各解纖度條件下之α幾丁質奈米纖維之3D培養中之MDCK細胞增殖效果) 將依據WO 2015/111686 A1所製備之α幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。所使用之α幾丁質奈米纖維係於在200 MPa下通過10次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品1)、於在200 MPa下通過1次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品2)、於在100 MPa下通過1次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品5)、於在200 MPa下通過3次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品6)、於在100 MPa下通過5次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品7)、α幾丁質原料(樣品8)。 製備於無血清培養基KBM220培養基(Kohjin Bio公司製造)中添加有最終濃度0.03%(w/v)之各奈米纖維樣品(1、2、5～8)之培養基組合物、及不含上述基材之未添加培養基組合物(樣品9)。繼而，將所培養之狗腎小管上皮細胞株MDCK(DS Pharma Biomedical公司製造)以成為66666細胞/mL之方式接種至添加有上述各奈米纖維樣品(1、2、5～8)之培養基組合物後，以成為30 mL之方式分注至125 mL燒瓶(Thermo Scientific，4115-0125)。各燒瓶於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內於振盪狀態(cfg50 rpm)下持續培養7天。 藉由移液使第0、第3、第7天之培養液懸浮，對該細胞懸浮液100 μL添加ATP試劑100 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其反應，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，以4點之平均值之形式測定活細胞之數量。 其結果為，若使用包含各奈米纖維樣品(1、2、5～8)之培養基組合物將MDCK細胞於125 mL燒瓶中進行培養，則確認到由樣品5及樣品6之作為低解纖度之α幾丁質奈米纖維添加所產生之細胞增殖促進作用最強。另一方面，未確認到樣品8之α幾丁質原料之細胞增殖促進作用。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表11。 [表11]
(試驗例10：使用各解纖度條件下之α幾丁質奈米纖維之3D培養中之人類脂肪源性間葉系幹細胞之增殖作用) 將依據WO 2015/111686 A1所製備之α幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。所使用之α幾丁質奈米纖維係於在200 MPa下通過10次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品1)、於在200 MPa下通過1次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品2)、於在200 MPa下通過5次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品10)。 製備於間葉系幹細胞增殖培養基2培養基(Takara Bio公司製造)中添加有最終濃度0.001%(w/v)、0.003%、0.01%之各奈米纖維樣品(1、2、10)之培養基組合物、及不含上述基材之未添加培養基組合物(樣品9)。繼而，將所培養之人類骨髓源性間葉系幹細胞(C-12974，Takara Bio公司製造)以成為20000細胞/mL之方式接種至添加有上述幾丁質奈米纖維之培養基組合物或未添加培養基組合物後，以每1孔成為150 μL之方式分注至96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)之孔中。各培養盤於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內於靜置狀態下持續培養10天。對第3、第7、第10天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，以4點之平均值之形式測定活細胞之數量。 其結果為，若使用包含各奈米纖維樣品(1、2、10)之培養基組合物將人類骨髓間葉系細胞於96孔平底超低黏著表面微量培養盤進行培養，則確認到與樣品1相比，由樣品2及樣品10之作為低解纖度之α幾丁質奈米纖維添加所產生之細胞增殖促進作用最強。將各培養中之RLU值(ATP測定、發光強度)示於表12。 [表12]
(試驗例11：使用高解纖度條件下之α幾丁質奈米纖維之3D培養中之MDCK細胞之增殖作用) 將依據WO 2015/111686 A1所製備之α幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。所使用之α幾丁質奈米纖維係於在200 MPa下通過1次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品2)、於在200 MPa下通過20次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品11)、於在200 MPa下通過50次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品12)、於在200 MPa下通過100次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品13)、於在200 MPa下通過200次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品14)。 製備於無血清培養基KBM220培養基(Kohjin Bio公司製造)中添加有最終濃度0.006%(w/v)、0.02%、0.06%之各奈米纖維樣品(2、11-14)之培養基組合物、及不含上述基材之未添加培養基組合物(樣品9)。繼而，將狗腎小管上皮細胞株MDCK(DS Pharma Biomedical公司製造)以成為33333細胞/mL之方式接種至添加有上述幾丁質奈米纖維之培養基組合物或未添加培養基組合物後，以每1孔成為150 μL之方式分注至96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)之孔中。各培養盤於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內於靜置狀態下持續培養6天。對第3、第6天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，以4點之平均值之形式測定活細胞之數量。 其結果為，若使用包含各奈米纖維樣品(2、11-14)之培養基組合物將MDCK細胞於96孔平底超低黏著表面微量培養盤進行培養，則與樣品2相比，由樣品11即作為高解纖度之α幾丁質奈米纖維添加所產生之細胞增殖促進作用較弱。進而經提昇解纖度之樣品(12-14)僅顯示更弱之促進作用。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表13。 [表13]
(試驗例12：黏著於幾丁質奈米纖維之人類前驅脂肪細胞片材之製作) 將製造例1中製備之幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司，Lot. GG30-G30)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。製備於人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製造)中添加有最終濃度0.01%(w/v)之幾丁質奈米纖維之培養基組合物、及不含上述基材之未添加培養基組合物。繼而，將所培養之人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製造)以成為33333細胞/mL之方式接種至添加有上述幾丁質奈米纖維之培養基組合物或未添加培養基組合物後，以每1孔成為150 μL之方式分注至96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)之孔中。各培養盤於CO
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培養箱(37℃，5%CO
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)內於靜置狀態下持續培養10天。於第10天觀察人類前驅脂肪細胞，實施照片拍攝。 其結果為，可知若使用作為本發明之培養基組合物之幾丁質奈米纖維將人類前驅脂肪細胞於96孔平底超低黏著表面微量培養盤上培養10天，則如圖8所示般成為幾丁質奈米纖維與人類前驅脂肪細胞融合之細胞片狀。 (試驗例13：使用幾丁質奈米纖維之3D培養中之人類脂肪組織源性間葉系幹細胞之增殖) 將依據WO 2015/111686 A1所製備之α幾丁質奈米纖維(生質奈米纖維 BiNFi-S 2質量%，Sugino Machine股份有限公司)以成為1%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一面於90℃下加熱一面攪拌而使其分散，於121℃下對該水溶液進行20分鐘高壓釜殺菌。所使用之α幾丁質奈米纖維係於在200 MPa下通過5次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品15)、於在200 MPa下通過20次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品11)、於在200 MPa下通過50次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品12)、於在200 MPa下通過100次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品13)、於在200 MPa下通過200次之條件下奈米纖維化之α幾丁質奈米纖維(樣品14)。製備於作為低血清培養基之間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製造)中添加有各幾丁質奈米纖維之培養基組合物(最終濃度：0.002%(w/v)、0.006%(w/v)、0.02%(w/v))、及不含上述基材之未添加培養基組合物(樣品9)。繼而，將所培養之人類脂肪源性間葉系幹細胞(C-12977，Takara Bio公司製造)以成為13333細胞/mL之方式懸浮於上述各培養基組合物中後，以150 μL/孔接種於96孔平底超低黏著表面微量培養盤(Corning公司製造，#3474)。將細胞於CO
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培養箱(37℃，5%CO
2
)內於靜置狀態下培養10天。對第4、第8、第11天之培養液添加ATP試劑150 μL(CellTiter-Glo
TM
Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫下靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，減去僅培養基之發光值，算出活細胞之數量(4點之平均值)。 其結果為，若使用包含各奈米纖維樣品(15、11-14)之培養基組合物將人類脂肪源性間葉系幹細胞於96孔平底超低黏著表面微量培養盤進行培養，則與樣品15相比，由作為高解纖度之α幾丁質奈米纖維添加(樣品11)所產生之細胞增殖促進作用較弱。進而經提昇解纖度之樣品(12-14)未顯示出明確之增殖促進作用。將各培養中之RLU值(ATP測定，發光強度)示於表14及表15。 [表14]
[表15]
再者，將試驗例8～13中所使用之於各種解纖條件(壓力、壓碎次數)下製備之α幾丁質分散液之物性值(α幾丁質之實測濃度、黏度、中值粒徑、平均粒徑)示於表16。 [表16]
[產業上之可利用性] 包含非水溶性多糖類之奈米纖維可用作間葉系幹細胞、前驅脂肪細胞等黏著性細胞之i)培養、ii)分化誘導、iii)非冷凍條件下之輸送或保存、iv)移植、v)自培養上清液之生理活性物質之回收等各種操作中之共用載體，因此藉由使用本發明之載體，可連續地實施選自上述i)培養、ii)分化誘導、iii)非冷凍條件下之輸送或保存、iv)移植、v)自培養上清液之生理活性物質之回收中之複數種操作。 包括此處所述之日本專利及日本專利申請案說明書在內之所有出版物所記載之內容係藉由引用於此處而以與明確示出其全部內容相同之程度組入至本說明書中者。 (相關申請案之揭示) 本申請案係基於2017年3月30日於日本提出申請之日本專利特願2017-68377及2017年9月11日於日本提出申請之日本專利特願2017-174237，藉由於此處提及而使其等之內容全部包含於本說明書中。