CN105126169A - 一种同种异体骨骨粉及其制备方法与应用 - Google Patents

一种同种异体骨骨粉及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种同种异体骨骨粉及其制备方法与应用，所提供的同种异体骨骨粉的钙含量小于30wt％，具有粒径小、钙质低等特点。使用来源更加广泛、大小不限的同种异体骨在制备过程中，粉碎后的同种异体骨经酶促反应脱细胞并与表面活性剂孵育洗涤后更易去除抗原物质、降低同种异体骨的免疫排斥反应，对骨基质中骨诱导成分的活性影响小；孵育洗涤过程与脱钙过程选用的溶剂反应相对温和。以该同种异体骨骨粉为主体的生物材料，初始形成凝胶状组合物，更适合修复复杂形状的骨缺损，同时生物材料中的其他材料与骨基质中的骨诱导成分协同作用，增强成骨能力及促软骨修复能力。

Description

一种同种异体骨骨粉及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及但不限于生物材料领域。
背景技术
创伤、骨肿瘤、感染、先天性骨缺损等原因引起的大段骨缺损是临床修复重建外科常见而又棘手的问题。对于临床骨缺损的患者,自体骨移植作为最佳选择可以避免传染性疾病的传播和移植后严重的免疫反应。
然而，供区并发症的发生以及自体骨的形态和大小常与受区缺损不一致使得自体骨移植在骨领域中受到一定限制。同种异体骨作为自体骨的替代选择可用于骨领域中。
目前，涉及同种异体骨的相关文献如下：CN200610122058.9、CN200710107105.7以及CN201010231771.3等。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请的一个目的是提供一种同种异体骨骨粉。
本申请的另一个目的是提供一种制造同种异体骨骨粉的方法。
本申请的又一个目的是提供一种包含本申请实施例的同种异体骨骨粉的凝胶组合物。
本申请的又一个目的是提供一种同种异体骨生物凝胶材料的制备方法。
本申请的又一个目的是提供一种同种异体骨生物凝胶材料。
本申请的又一个目的是提供本申请实施例的同种异体骨骨粉的用途。
本申请中所提及的钙含量是指以氧化钙计的同种异体骨骨粉中的钙的重量百分比。
在一个方面，本申请的一个实施方式提供了一种同种异体骨骨粉，其中，所述同种异体骨骨粉以氧化钙的形式的钙含量小于30wt％。
在以上或其他的实施方式中，同种异体骨骨粉的粒径可在30微米至100微米的范围内。
在另一个方面，本申请的一个实施方式提供了一种同种异体骨骨粉的制备方法，所述方法包括以下任意顺序的步骤：粉碎同种异体骨；将粉碎的同种异体骨与核酸酶进行酶促反应；将粉碎的同种异体骨与洗涤剂，任选地螯合剂进行孵育洗涤；任选地将粉碎的同种异体骨用螯合剂进行脱钙处理；以及研磨脱钙处理后的同种异体骨，以使所制得的同种异体骨骨粉以氧化钙的形式的钙含量小于30％。
在以上或其他的实施方式中，所述方法还可包括在所述研磨步骤前的每个步骤完成之后，将所述粉碎的同种异体骨漂洗的步骤。
在以上或其他的实施方式中，在所述研磨步骤中，可以将所述脱钙处理后的同种异体骨烘干并研磨成粒径为30微米-100微米的同种异体骨骨粉。
在以上或其他的实施方式中，所述同种异体骨的粉碎步骤可包括：将同种异体骨粉碎成骨片或骨颗粒，任选地将所述骨片或骨颗粒与液氮加到粉碎机中粉碎。
在以上或其他的实施方式中，所述核酸酶可选自脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶中的一种或更多种。
在以上或其他的实施方式中，所述酶促反应可在25℃-60℃的温度下进行，优选地，可在37℃的温度下进行。
在以上或其他的实施方式中，所述洗涤剂可包括表面活性剂，所述表面活性剂可选自聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠、月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、椰油酸二乙醇酰胺、三乙醇胺皂、硫酸化蓖麻油、二辛基琥珀酸磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠，甘胆酸钠中的一种或更多种。
在以上或其他的实施方式中，所述螯合剂可选自二氨基乙烷四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、水解聚马来酸酐、富马酸中的一种或更多种。
在以上或其他的实施方式中，所述同种异体骨可以是来源于捐献骨组织、废弃骨组织以及市售同种骨组织中的一种或更多种。
在本申请的一个具体实施方式中，提供了一种制备同种异体骨骨粉的方法，所述方法如下：
获取同种异体硬骨、软骨；
将同种异体硬骨、软骨与液氮共同加入粉碎机中粉碎；
将粉碎后的同种异体硬骨、软骨碎片用蒸馏水漂洗，离心后弃掉上层液体；
将同种异体硬骨、软骨碎片与核酸酶在25℃-60℃下进行酶促反应孵育2-96小时；
酶促反应结束后，用蒸馏水漂洗并离心，弃上清液，重复2-3次；
将洗净后的同种异体硬骨、软骨碎片与表面活性剂在0℃-42℃下洗涤孵育6-96小时；
在孵育结束后，用蒸馏水漂洗并离心，弃上清液，重复2-3次；
将洗净后的同种异体骨、软骨碎片与螯合剂反应12-168小时；
用蒸馏水漂洗并离心，弃上清液，重复2-3次；
将洗净后的同种异体硬骨、软骨碎片在20-100℃下烘干；
使用组织粉碎机将烘干后的同种异体硬骨、软骨碎片磨成粒径大小约30-100微米的同种异体骨骨粉。
在另一个方面，本申请的一个实施方式提供了一种凝胶组合物，包括如上所述的同种异体骨骨粉或如上所述方法制得的同种异体骨骨粉、水溶性生物材料粉末、赋形剂以及水。
所述同种异体骨骨粉、所述可溶性生物材料粉末、所述赋形剂以及所述水的用量可为：基于每100质量份水，所述同种异体骨骨粉为1-50重量份，所述可溶性生物材料粉末为1-100重量份，所述赋形剂为0.01-40重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述凝胶组合物的凝胶黏稠度可为1000-3000mPa·s。
在以上或其他的实施方式中，所述同种异体骨骨粉的用量基于每100重量份水可为5-50重量份、或10-50重量份、或20-50重量份、25-50重量份、30-50重量份、40-50重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述赋形剂可以是光引发剂，所述光引发剂的用量可以是基于每100重量份水的0.05-40重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述光引发剂的用量可以是基于每100重量份水的0.05重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述赋形剂可以是光交联剂，所述光交联剂的用量可以是基于每100重量份水的5-40重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述赋形剂为光交联剂，所述光交联剂的用量可以是基于每100重量份水的30重量份。
在以上或其他的实施方式中，所述水溶性生物材料粉末可以是水溶性的且可具有黏稠度的材料粉末，其可包括促进细胞分化的材料粉末。
在以上或其他的实施方式中，所述促进细胞分化的材料粉末可选自羟基磷灰石、海藻酸钠、透明质酸、糖胺聚糖、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素钠、羟丙基纤维素钠、I型胶原、泊洛沙姆及卵磷脂壳聚糖及其衍生物如，壳聚糖盐酸盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖硫酸酯中的一种或更多种。
在以上或其他的实施方式中，所述赋形剂能够使凝胶保持稳定结构，改善其弹性模量及力学强度，其可选自聚乙二醇双丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、樟脑醌、杂蒽酮衍生物、二苯甲酮衍生物、苯偶酰衍生物、羟基苯基酮衍生物、硫代硫酸烷基酯盐、稠环芳烃衍生物、聚硅烷衍生物、酰基膦酸盐类化合物、偶氮型光引发剂、金属配合物、氯化钙、泊洛沙姆、二羟苯丙氨酸及丝素蛋白中的一种或更多种。
在另一个方面，本申请的一个实施方式提供了一种同种异体骨生物凝胶材料的制备方法，包括：将如上所述的凝胶组合物中所述同种异体骨骨粉、所述水溶性生物材料粉末以及所述赋形剂混匀，并与水配制为凝胶，进行交联，得到同种异体骨生物凝胶材料。
在以上或其他的实施方式中，在进行交联的步骤中，可通过在如紫外光波长250-420nm或可见光400-800nm照射下进行交联。
在另一个方面，本申请的一个实施方式提供了一种根据上述的同种异体骨凝胶材料的制备方法制得的同种异体骨生物凝胶材料。
在另一个方面，本申请的一个实施方式提供了如上所述的同种异体骨骨粉、由如上同种异体骨骨粉的制备方法制得的同种异体骨骨粉、如上所述的凝胶组合物、或者如上所述的同种异体骨生物凝胶材料在制备用于治疗骨缺损的骨替代材料中的用途。
同种异体骨的优点在于其具有天然的骨结构，有利于宿主骨组织的爬行替代与新生骨的形成。
本申请的实施方式提供的同种异体骨骨粉具有粒径小、抗原性低、钙质低等特点，其可在骨科领域广泛应用。使用来源更加广泛、大小不限的同种异体骨在制备过程中，粉碎后的同种异体骨经酶促反应脱细胞并与含有表面活性剂的洗涤剂孵育洗涤后更易于去除抗原物质、降低同种异体骨的免疫排斥反应；对骨基质中骨诱导成分的活性影响小；孵育洗涤过程与脱钙过程选用的溶剂反应相对温和。以该同种异体骨骨粉为主体的生物材料，初始形成凝胶状组合物，更适合修复复杂形状的骨缺损并更好地填充缺损部位；同时生物材料中的其他材料与骨基质中的骨诱导成分协同作用，增强成骨能力及促软骨修复能力。
在阅读并理解了附图和具体实施方式后，可以明白其他方面。
附图说明
附图是用来提供对本申请实施例的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本申请实施例，但并不构成对本申请实施例的限制。在附图中：
图1是本申请实施例1所得的兔骨骨粉的肉眼观察图；
图2是本申请实施例1所得的兔骨骨粉的电镜图；
图3是包含本申请实施例1所得的兔骨骨粉的凝胶组合物的肉眼观察图；
图4是使用包含本申请实施例1所得的兔骨骨粉的凝胶组合物进行三维打印后的生物支架结构图片；
图5-7是使用本申请应用实施例2所得的生物支架结构扫描电子显微镜图片，分别为不同视野下孔隙大小的显示；
图8-9是使用本申请应用实施例4的样品材料1-2进行大鼠颅骨缺损修复，六周后修复处的CT三维重建图像。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明实施例所用到的试剂、原料均为市售商品，所用到的仪器均为常规市售仪器。在不同的实施例中，相同的试剂来源相同。
配置/合成以下化学试剂：
pH为8的EDTA螯合剂：使用EDTA(E9884，SigmaAldrich,USA)按照常规方法配置pH为8的EDTA螯合剂，备用；
pH为7.2的EDTA螯合剂：使用EDTA(E9884，SigmaAldrich,USA)按照常规方法配置pH为7.2的EDTA螯合剂，备用；
氯化钙溶液：将无水氯化钙固体与蒸馏水按照20g:100ml的比例，配置氯化钙溶液，备用；
二羟苯丙氨酸粉末：按照实验室常规方法合成，备用。
实施例1
1、取新西兰大白兔四肢长骨36根，将长骨剪成骨片，洗净后与液氮共同加入螺旋式粉碎机中粉碎。
2、将粉碎后的兔骨碎片用蒸馏水洗净，在3000rpm/min下离心5分钟后弃掉上层液体。
3、将DNA水解酶(D4527,SigmaAldrich,USA)与RNA水解酶(R5503，SigmaAldrich,USA)分别按照0.006wt％与0.02wt％溶于无菌磷酸盐缓冲液(无菌PBS)中配置成溶液，与步骤2中所得的兔骨碎片在37℃下进行酶促反应，孵育2-3小时。
4、酶促反应结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min速度下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
5、用无菌PBS按体积配置含1％的Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，X100，SigmaAldrich,USA)洗涤液和含1％的pH为8的EDTA螯合剂的混合溶液，与步骤4中所得的兔骨碎片在4℃下孵育12小时。
6、孵育洗涤结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
7、按体积配置含15％的pH为7.2的EDTA螯合剂的溶液，将步骤6中所得的兔骨碎片与此EDTA螯合剂溶液进行脱钙反应24小时。
8、在4℃下，用蒸馏水漂洗并在2500-3000rpm/min下离心5分钟，弃上清液，重复3次。
9、将步骤8中所得兔骨碎片在37℃下烘干，并使用组织粉碎机将烘干后的碎片磨成粒径大小约30-100微米的兔骨粉末。
实施例1制得的兔骨骨粉如图1所示。
实施例2
1、取新西兰大白兔四肢长骨36根，将长骨剪成骨片并用蒸馏水洗净。
2、用无菌PBS按体积配置含1％的Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，X100，SigmaAldrich,USA)洗涤液和含1％的pH为8的EDTA螯合剂的混合溶液，与步骤1中所得兔骨碎片在4℃下孵育72小时。
3、将步骤2中所得的骨片用蒸馏水彻底漂洗2-3次。
4、按体积配置含15％的pH为7.2的EDTA螯合剂的溶液，将步骤3中所得的兔骨碎片与此EDTA螯合剂溶液进行脱钙反应120小时。
5、将步骤4中所得的骨片用蒸馏水彻底漂洗2-3次。
6、将DNA水解酶(D4527,SigmaAldrich,USA)与RNA水解酶(R5503，SigmaAldrich,USA)分别按照0.006wt％与0.02wt％溶于无菌磷酸盐缓冲液(无菌PBS)中配置成溶液，与步骤5中所得的兔骨碎片在37℃下进行酶促反应，孵育48小时。
7、酶促反应结束后，将骨片用蒸馏水彻底漂洗2-3次。
8、将步骤7中所得的兔骨碎片在37℃下烘干，并使用组织粉碎机将烘干后的碎片磨成粒径大小约30-100微米的兔骨粉末。
实施例3
1、取小型猪四肢长骨8根，将长骨剪成骨片，洗净后与液氮共同加入螺旋式粉碎机中粉碎。
2、将粉碎后的猪骨碎片用蒸馏水洗净，在3000rpm/min下离心5分钟后弃掉上层液体。
3、将DNA水解酶(D4527,SigmaAldrich,USA)与RNA水解酶(R5503，SigmaAldrich,USA)分别按照0.006wt％与0.02wt％溶于无菌磷酸盐缓冲液(无菌PBS)中配置成溶液，与步骤2中的猪骨碎片在37℃下进行酶促反应，孵育2-3小时。
4、酶促反应结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
5、用无菌PBS按体积配置计含1％的Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，X100，SigmaAldrich,USA)洗涤液和含1％的pH为8的EDTA螯合剂的混合溶液，与步骤4中所得的猪骨碎片在4℃下孵育12小时。
6、孵育洗涤结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
7、按体积配置含15％的pH为7.2的EDTA螯合剂的溶液，将步骤6中所得的猪骨碎片与此EDTA螯合剂溶液进行脱钙反应24小时。
8、在4℃下，用蒸馏水漂洗并在2500-3000rpm/min下离心5分钟，弃上清液，重复3次。
9、将步骤8中所得猪骨碎片在37℃下烘干，并使用组织粉碎机将烘干后的碎片磨成粒径大小约30-100微米的猪骨粉末。
实施例4
1、取人工髋关节或膝关节置换术后的废弃人骨片400g，刮去软骨层后剪碎并洗净，随后与液氮共同加入螺旋式粉碎机中粉碎。
2、将粉碎后的人骨碎片用蒸馏水洗净，在3000rpm/min下离心5分钟后弃掉上层液体。
3、将DNA水解酶(D4527,SigmaAldrich,USA)与RNA水解酶(R5503，SigmaAldrich,USA)分别按照0.006wt％与0.02wt％溶于无菌磷酸盐缓冲液(无菌PBS)中配置成溶液，与步骤2所得的人骨碎片在37℃下进行酶促反应，孵育2-3小时。
4、酶促反应结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
5、用无菌PBS按体积配置含1％的Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，X100，SigmaAldrich,USA)洗涤液和含1％的pH为8的EDTA螯合剂的混合溶液，与步骤4中所得的人骨碎片在4℃下孵育12小时。
6、孵育洗涤结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
7、按体积配置含15％的pH为7.2的EDTA螯合剂的溶液，将步骤6中所得的人骨碎片与此EDTA螯合剂溶液进行脱钙反应24小时。
8、在4℃下，用蒸馏水漂洗并在2500-3000rpm/min下离心5分钟，弃上清液，重复3次。
9、将步骤8中所得的人骨碎片在37℃下烘干，并使用组织粉碎机将烘干后的碎片磨成粒径大小约30-100微米的人骨粉末。
实施例5
本实施例使用的是实施例4步骤1中刮去的软骨层。
1、取人软骨20g剪碎并洗净后与液氮共同加入螺旋式粉碎机中粉碎。
2、将粉碎后的人软骨碎片用蒸馏水洗净，在3000rpm/min下离心5分钟后弃掉上层液体。
3、将DNA水解酶(D4527,SigmaAldrich,USA)与RNA水解酶(R5503，SigmaAldrich,USA)分别按照0.006wt％与0.02wt％溶于无菌磷酸盐缓冲液(无菌PBS)中配置成溶液，与步骤2所得的人软骨碎片在37℃下进行酶促反应，孵育2-3小时。
4、酶促反应结束后，用蒸馏水漂洗并在500-2000rpm/min下离心5分钟后，弃掉上清液，重复此步骤2-3次。
5、用无菌PBS按体积配置含1％的Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，X100，SigmaAldrich,USA)洗涤液和含1％的pH为8的EDTA螯合剂的混合溶液，与步骤4中所得的人软骨碎片在4℃下孵育12小时。
6、孵育洗涤结束后，在4℃下，用蒸馏水漂洗并在2500-3000rpm/min下离心5分钟，弃上清液，重复3次。
7、将步骤6中所得的人软骨碎片在37℃下烘干，并使用组织粉碎机将烘干后的碎片磨成粒径大小约30-100微米的人软骨粉末。
测试例1
使用扫描电子显微镜(日本日立集团，型号：S-3400NII)对上述实施例1中制得的同种异体骨骨粉的粒径和孔径进行表征，所得到的扫描电镜图如图2所示。并使用X射线荧光光谱仪(瑞士ARL公司，型号：ARL-9800)对上述实施例1中制得的同种异体骨骨粉中的钙含量、磷含量进行测量，数据如下：
粒径：30-100微米；
孔径：10-30微米；
钙含量：测得未经处理的大白兔四肢长骨原料中CaO含量为34.64％，经实施例2处理的骨粉中CaO含量为28.46％；
磷含量：测得未经处理的大白兔四肢长骨原料中P2O5含量为26.31％，经实施例2处理的骨粉中P2O5含量为22.48％。
采用相同方法对实施例2-5制得的骨粉的粒径和钙含量进行表征，所测得的粒径均在30至100微米，钙含量(以氧化钙计)小于30wt％。
应用实施例1
1、将50g的实施例1中获得的兔骨粉末与10g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)溶于100ml的蒸馏水中，再加入30g的聚乙二醇双丙烯酸酯(455008,SigmaAldrich,USA)和5g的Irgacure2959光引发剂，将以上成分混匀制得凝胶组合物，所制得的凝胶组合物如图3所示。
2.使用三维打印机将凝胶组合物打印成具有三维空间结构的生物支架，打印过程中辅以波长为365nm，光强为120mW/cm2的紫外光照射，以辅助固化。
3、打印结束后将支架结构置于氯化钙溶液交联5分钟，以增强生物支架结构强度及生物相容性。所得到的生物支架如图4所示。
使用扫描电子显微镜(日本日立集团、型号：S-3400NII)对所得到的生物支架的显微结构进行表征，不同视野下的扫描电镜图如图5-7所示。
应用实施例2
1、将10g的实施例1中获得的兔骨粉末、10g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)以及5g的二羟苯丙氨酸粉末溶于100ml的蒸馏水中，再加入30g的聚乙二醇双丙烯酸酯(455008,SigmaAldrich,USA)和5g的Irgacure2959光引发剂，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、使用三维打印机将凝胶组合物打印成具有三维空间结构的生物支架，打印过程中辅以波长为365nm，光强为120mW/cm2的紫外光照射以辅助固化。
3、将50g的实施例1中获得的兔骨粉末与6g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
4、将步骤3所得的凝胶组合物灌注于步骤2制得的生物支架结构中。
5、将步骤4中所得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟，得到所需的生物凝胶材料。
应用实施例3
1、将50g的实施例1中获得的兔骨粉末与6g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中所得的凝胶灌注于PCL支架中。
3、将步骤2中获得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟。
应用实施例4
1、取20g的实施例1中获得的兔骨粉末，与6g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)溶于100ml的蒸馏水中混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中所得的凝胶组合物分别灌注于相同的PCL支架中。
3、将步骤2中获得的结构材料分别置于相同的氯化钙溶液中交联5分钟，得到最终的样品材料1。
用与上述同样的步骤制备样品材料2，区别仅在于：在步骤1中，未使用实施例1中获得的兔骨粉末来制备凝胶组合物，即仅将6g的海藻酸钠粉末(A2033,SigmaAldrich,USA)溶于100ml的蒸馏水中制得凝胶组合物，从而制备并得到样品材料2。
将本应用实施例中制得的两个样品材料应用于大鼠(SD大鼠、雄性、体重250g，购于上海斯莱克实验动物有限公司)的颅骨缺损修复中，并在6周后进行CT检测，通过图8-9的两张CT三维重建图像，可以看到图8中有显著的骨长入，而图9中未看到有显著的骨长入、还有明显的缺损。
应用实施例5
1、将20g的实施例1中获得的兔骨粉末与28g的透明质酸粉末溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中获得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟。
应用实施例6
1、将40g的实施例1中获得的兔骨粉末与30g的羧甲基壳聚糖粉末溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中获得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟。
应用实施例7
将20g的实施例1中获得的兔骨粉末与40g的泊洛沙姆粉末(既作为可溶性生物材料，又作为赋形剂)溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀，进行交联，制得结构材料。
应用实施例8
1、将20g的实施例1中获得的兔骨粉末、10g的海藻酸钠粉末以及5g的市售纳米羟基磷灰石粉末溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中获得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟。
应用实施例9
1、将50g的实施例1中获得的兔骨粉末与10g的海藻酸钠粉末溶于100ml的蒸馏水中，将以上成分混匀制得凝胶组合物。
2、将步骤1中获得的结构材料置于氯化钙溶液中交联5分钟。
3、将步骤2中获得的结构材料置于四甲基乙二胺溶液中交联12小时。
4、将步骤3中所得的交联产物用蒸馏水冲洗3-5次，彻底洗去交联液。
在此处所述的本申请实施例方法的组合物、操作和配置上可以进行变动，而不背离如权利要求中所限定的本申请的原理和范围。虽然可以许多不同形式来使本申请具体化，但是此处详细描述本申请的一些实施方案。本公开内容是本申请的原理的示例，且并不规定为使本申请限于所示的具体实施方案。此外，本申请包括此处所述的各种实施方案的一些或全部的任意可能的组合。在本申请中或在任一个引用的专利、引用的专利申请或其它引用的资料中任何地方所提及的所有专利、专利申请和其它引用资料据此通过引用以其整体并入。
以上公开内容规定为说明性的而不是穷尽性的。对于本领域技术人员来说，本说明书将暗示许多变化和可选择方案。所有这些可选择方案和变化规定为被包括在本权利要求的范围内，其中术语“包括”意思是“包括，但不限于”。本领域技术人员应认识到此处所述的实施方案的其它等效变换，这些等效变换也规定为由本权利要求所包括。
在此完成了对本申请可选择的实施方案的描述。本领域技术人员可认识到此处所述的实施方案的其它等效变换，这些等效变换规定为由附于本文的权利要求所包括。

Claims (20)

1.一种同种异体骨骨粉，其中，所述同种异体骨骨粉以氧化钙计的钙含量小于30wt％。
2.如权利要求1所述的同种异体骨骨粉，其中，所述同种异体骨骨粉的粒径在30至100微米的范围内。
3.一种同种异体骨骨粉的制备方法，所述方法包括以下任意顺序的步骤：粉碎同种异体骨；将粉碎的同种异体骨与核酸酶进行酶促反应；将粉碎的同种异体骨与洗涤剂，任选地螯合剂进行孵育洗涤；任选地将粉碎的同种异体骨用螯合剂进行脱钙处理；以及研磨脱钙处理后的同种异体骨，以使所制得的同种异体骨骨粉以氧化钙的形式的钙含量小于30％。
4.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括在所述研磨步骤前的每个步骤完成之后，将所述粉碎的同种异体骨漂洗的步骤。
5.如权利要求3所述的方法，在所述研磨步骤中，将所述脱钙处理后的同种异体骨烘干并研磨成粒径为30-100微米的同种异体骨骨粉。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述同种异体骨的粉碎步骤包括：将同种异体骨粉碎成骨片或骨颗粒，任选地将所述骨片或骨颗粒与液氮加到粉碎机中粉碎。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶选自脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶中的一种或更多种。
8.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述酶促反应在25℃-60℃的温度下进行，优选地，在37℃的温度下进行。
9.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述洗涤剂包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠、月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、椰油酸二乙醇酰胺、三乙醇胺皂、硫酸化蓖麻油、二辛基琥珀酸磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠，甘胆酸钠中的一种或更多种。
10.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自二氨基乙烷四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、水解聚马来酸酐、富马酸中的一种或更多种。
11.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述同种异体骨来源于捐献骨组织、废弃骨组织以及市售同种骨组织中的一种或更多种。
12.一种凝胶组合物，包括如权利要求1-2中任一项所述的同种异体骨骨粉或如权利要求3-11任一项所述方法制得的同种异体骨骨粉、水溶性生物材料粉末、赋形剂以及水。
13.如权利要求12所述的凝胶组合物，其中，所述同种异体骨骨粉、所述可溶性生物材料粉末、所述赋形剂以及所述水的用量为：基于每100重量份的水，所述同种异体骨骨粉为1-50重量份，所述可溶性生物材料粉末为1-100重量份，所述赋形剂为0.01-40重量份。
14.如权利要求12或13所述的凝胶组合物，其中，所述水溶性生物材料粉末是水溶性的且具有黏稠度的材料粉末，其包括促进细胞分化的材料粉末。
15.如权利要求14所述的凝胶组合物，其中，所述促进细胞分化的材料粉末选自羟基磷灰石、海藻酸钠、透明质酸、糖胺聚糖、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素钠、羟丙基纤维素钠、I型胶原、泊洛沙姆及卵磷脂壳聚糖及其衍生物如，壳聚糖盐酸盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖硫酸酯中的一种或更多种。
16.如权利要求12或13所述的凝胶组合物，其中所述赋形剂选自聚乙二醇双丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、樟脑醌、杂蒽酮衍生物、二苯甲酮衍生物、苯偶酰衍生物、羟基苯基酮衍生物、硫代硫酸烷基酯盐、稠环芳烃衍生物、聚硅烷衍生物、酰基膦酸盐类化合物、偶氮型光引发剂、金属配合物、氯化钙、泊洛沙姆、二羟苯丙氨酸及丝素蛋白中的一种或更多种。
17.一种同种异体骨生物凝胶材料的制备方法，包括：将如权利要求12-16中任一项所述的凝胶组合物中所述同种异体骨骨粉、所述水溶性生物材料粉末以及所述赋形剂混匀，并与水配制为凝胶，进行交联，得到同种异体骨生物凝胶材料。
18.如权利要求17所述的方法，其中，在进行所述交联的步骤中，通过在紫外光波长250-420nm或可见光400-800nm照射下进行交联。
19.一种根据权利要求17或18所述的同种异体骨凝胶材料的制备方法制得的同种异体骨生物凝胶材料。
20.如权利要求1-2中任一项所述的同种异体骨骨粉、如权利要求3-11任一项所述方法制得的同种异体骨骨粉、如权利要求12-16任一项所述的凝胶组合物、或者如权利要求19所述的同种异体骨生物凝胶材料在制备用于治疗骨缺损的骨替代材料中的用途。
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